DK168794B1

DK168794B1 - Hybridinterferonpolypeptid, fremgangsmåde til fremstilling deraf, farmaceutisk præparat med indhold deraf, hybridvektor indeholdende en DNA sekvens som koder for hybridinterferonpolypeptidet, samt vært transformeret med en ekspressionsvektor indeholdende DNA sekvensen

Info

Publication number: DK168794B1
Application number: DK272986A
Authority: DK
Inventors: Franqois Meyer; Albert Hinnen; Andreas Meister; Markus Gerhard Gruetter; Sefik Alkan
Original assignee: Ciba Geigy Ag
Priority date: 1985-06-11
Filing date: 1986-06-10
Publication date: 1994-06-13
Also published as: DK272986A; CA1285507C; NO862313D0; PT82736B; DK272986D0; NZ216485A; FI862461A0; HU203255B; US4885166A; IL79085A; JPH0655759B2; HUT41846A; KR920002267B1; SG25195G; AU598196B2; AU5849986A; EP0205404A3; EP0205404B1; HK99895A; NO175602B

Description

i DK 168794 B1

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte hybrid-interferonpolypeptider, en mikrobiologisk fremgangsmåde til fremstilling deraf ved dyrkning af værtsceller 5 transformeret ved hjælp af rekombinant DNA teknologi, farmaceutiske præparater indeholdende disse hybridinter-feronpolypeptider til behandling af virussygdomme og neoplastiske sygdomme, en hybridvektor og en mikroorganismevært indeholdende hybridvektoren.

10 Interferonerne, der i det følgende betegnes "IFNs", er en familie af polypeptider, som udskilles af mange forskellige eukaryote celler, når disse har været udsat for forskellige mitogener og vira. På baggrund af deres kemiske og biologiske egenskaber er interferonerne blevet klas-15 sificeret i tre grupper: IFN-or, IFN-0 og IFN-γ. IFN-α- og -β-gener udtrykkes hovedsagelig i celler behandlet med vira, virusbestanddele og dobbeltstrenget RNA. IFN-γ derimod dannes som respons på mitogener.

En genfamilie, som omfatter mindst 15 uallele gener, koder 20 for human IFN-α. Human IFN-/3 og human IFN-γ indkodes af enkelte gener. Det primære IFN-α-translationsprodukt indeholder 189 aminosyrer (med undtagelse af IFN-a-2, som indeholder 188 aminosyrer), hvorfra et signalpeptid på 23 aminosyrer fjernes ved modifikation efter transla-25 tionen. Human IFN-/3 og human IFN-γ består af henholdsvis 187 og 186 aminosyrer, hvorfra henholdsvis 21 og 20 aminosyrer, som udgør signalpeptiderne fjernes. Aminosyre-sekvenshomologien blandt IFN-a-undertyper er 80-85%, hvorimod homologien mellem IFN-/3 og IFN-α er ca. 30-40%.

30 IFN-γ udviser kun enkelte aminosyrehomologier med IFN-a svarende til 12% identiske rester.

IFNs udviser antiviral, immunomodulerende samt cytotoksisk virkning. Det er blevet påvist, at IFN-a-undertyper, f.eks. IFN-a-2 og IFN-a-1, har forskellige målcellespeci-35 ficiteter. Den antivirale virkning af IFN-a-2 og IFN-a-1 DK 168794 B1 2 er omtrentlig den samme på kvægceller (MDBK), men IFN-a-2 er syv gange så virksom som IFN-α-Ι på humane (WISH) celler og har en 30 gange så lav virkning som IFN-α-Ι ved 5 beskyttelse af museceller (L 929), jævnfør M. Streuli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 2848 (1981). Indikationen for, at den antivirale virkning af medlemmerne af den multigene IFN-a-familie varierer i omfang og specificitet er blevet bekræftet af resultater opnået med nogle 10 IFN-α "hybrider" (jævnfør EP-patentskrift nr.32.134 og US-patentskrift nr. 4.414.50). Disse "hybrider" er blevet dannet ved spaltning af to gener, som koder for inter-feron-a-undertyper, med restriktionsenzymet PvuII (eller i to tilfælde med Bglll) og krydsligatering af de dannede 15 fragmenter, således at den DNA sekvens, som koder for aminoterminaldelen af ét IFN-gen bindes til den DNA sekvens, som koder for carboxyterminaldelen af det andet IFN-gen. Selv om disse hybridinterferoner er forskellige med hensyn til målcellespecificitet sammenlignet med 20 udgangs interferonerne, er det ikke påvist, at der forekommer nogen attenuering eller nogen begrænsning af nogle af de tre interferonvirkninger. En sådan attenuering eller begrænsning kan være ønskelig, f.eks. ved klinisk anvendelse, hvor man ønsker at fokusere interferonterapi på et 25 specifikt problem, såsom virusinfektioner, uden at der er mulighed for komplicerende faktorer, som skyldes andre virkninger ved det anvendte interferon.

Det er formålet med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe hidtil ukendte hybridinterferoner eller hybrid-30 interferonpolypeptider, som udviser mere specifikke biologiske virkninger, som skyldes den selektive eller fremherskende aktivering af kun nogle af de interferon-inducerede biokemiske reaktioner, og/eller hvori nogle af de uønskede bivirkninger ved naturlige interferoner, som 35 begrænser deres anvendelse, såsom influenzalignende symptomer, f.eks. feber, hovedpine og mathed, gastro-intestinale forstyrrelser, sænkning af blodtrykket og tab DK 168794 B1 3 af hår undgås eller formindskes.

Hybridinterferonpolypeptiderne ifølge opfindelsen er afledt af human lymphoblastoidinterferon LyIFN-a-2 med 5 sekvensen

CYS ASP LEU PRO GLN THR HIS SER LEU GLY ASN ARG ARG ALA LEU ILE LEU

LEU ALA GLN MET ARG ARG ILE SER PRO PHE SER CYS LEU LYS ASP ARG HIS

ASP PHE GLU PHE PRO GLN GLU GLU PHE ASP ASP LYS GLN PHE GLN LYS ALA

GLN ALA ILE SER VAL LEU HIS GLU MET ILE GLN GLN THR PHE ASN LEU PHE

SER THR LYS ASP SER SER ALA ALA LEU ASP GLU THR LEU LEU ASP GLU PHE

TYR ILE GLU LEU ASP GLN GLN LEU ASN ASP LEU GLU SER CYS VAL MET GLN

GLU VAL GLY VAL ILE GLU SER PRO LEU MET TYR GLU ASP SER ILE LEU ALA

VAL ARG LYS TYR PHE GLN ARG ILE THR LEU TYR LEU THR GLU LYS LYS TYR

SER SER CYS ALA TRP GLU VAL VAL ARG ALA GLU ILE MET ARG SER PHE SER

LEU SER ILE ASN LEU GLN LYS ARG LEU LYS SER LYS GLU

og human lymphoblastoidinterferon LyIFN-a-3 med sekvensen

CYS ASP LEU PRO GLU THR HIS SER LEU ASP ASN ARG ARG THR LEU MET LEU

LEU ALA GLN MET SER ARG ILE SER PRO SER SER CYS LEU MET ASP ARG HIS

ASP PHE GLY PHE PRO GLN GLU GLU PHE ASP GLY ASN GLN PHE GLN LYS ALA

PRO ALA ILE SER VAL LEU HIS GLU LEU ILE GLN GLN ILE PHE ASN LEU PHE

THR THR LYS ASP SER SER ALA ALA TRP ASP GLU ASP LEU LEU ASP LYS PHE

CYS THR GLU LEU TYR GLN GLN LEU ASN ASP LEU GLU ALA CYS VAL MET GLN

GLU GLU ARG VAL GLY GLU THR PRO LEU MET ASN ALA ASP SER ILE LEU ALA

VAL LYS LYS TYR PHE ARG ARG ILE THR LEU TYR LEU THR GLU LYS LYS TYR

SER PRO CYS ALA TRP GLU VAL VAL ARG ALA GLU ILE MET ARG SER LEU SER

LEU SER THR ASN LEU GLN GLU ARG LEU ARG ARG LYS GLU

Disse interferoner samt fremgangsmåder til deres frem-10 stilling er beskrevet i beskrivelsen til europæisk patentansøgning nr. 76.489. LyIFN-a-2 er beslægtet med (men ikke identisk med) human leukocytinterferon LeIF-aB, jævnfør US-patentskrift nr. 4.414.150 og har en specifik virkning på primære kalvenyreceller og på humane embryo-15 niske forhudsceller (HEF, begge inficeret med vesikulær DK 168794 B1 4 stomatitis virus) på henholdsvis 1,85·108 IE/mg og 2,45*108 IE/mg. LyIFN-a-3 er beslægtet med (men ikke identisk med) human leukocytinterferon LeIF-aD, jævnfør 5 US-patentskrift nr. 4.414.150, og har en specifik virkning på kalveceller og HEF-celler (som ovenfor) på henholdsvis 1,32*108 IE/mg og 3,7*108 IE/mg. Endvidere har LyIFN-a-3 en større temperaturstabilitet og lavere antiproliferativ virkning end LyIFN-a-2.

10 Det er et særligt formål med opfindelsen at tilvejebringe LyIFN-a-2/a-3-hybridpolypeptider, som kombinerer den høje antivirale virkning og/eller den større antiproliferative virkning på humane celler af LyIFN-a-2 med den større temperaturstabilitet af LyIFN-a-3.

15 Hybridinterferonpolypeptidet ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved, at det har en aminosyresekvens sammensat af to til fire under sekvenser, som med hensyn til aminosyre-identitet og -antal svarer til undersekvenser af humane lymfoblastoide interferoner LyIFN-a-2 og LyIFN-a-3, hvor 20 hybridinterferonpolypeptidet er valgt blandt et polypeptid med en aminosyresekvens bestående af aminosyrer 1 til 150 af LyIFN-a-2 (B1B2B3) og aminosyrer 151 til 166 af LyIFN-a-3(D4), et polypeptid med en aminosyresekvens bestående af aminosyrer 1 til 92 af LyIFN-a-2(B1B2), 25 aminosyrer 93 til 150 af LyIFN-a-3(D3) og aminosyrer 151 til 166 af LyIFN-a-2 (B4) og et polypeptid med en aminosyresekvens bestående af aminosyrer 1 til 60 af LyIFN-a-2(Bi), aminosyrer 61 til 92 af LyIFN-a-3(D2), aminosyrer 93 til 150 af LyIFN-a-2 (B3) eller af 30 LyIFN-a-3(D3) og aminosyrer 151 til 166 af LyIFN-a-2(B4) eller LyIFN-a-3(D4).

I det følgende skal der ved hybridinterferonpolypeptid også forstås hybridinterferon og omvendt.

DK 168794 Bl 5 Særligt foretrukne hybridinterferonpolypeptider ifølge opfindelsen er hybridinterferonpolypeptidet HB]B2B3D4M med formlen

CYS ASP LEU PRO GLN THR HIS SER LEU GLY ASN ARG ARG ALA LEU ILE LEU LEU ALA GLN MET ARG ARG ILE SER PRO PHE SER CYS LEU LYS ASP ARG HIS ASP PHE GLU PHE PRO GLN GLU GLU PHE ASP ASP LYS GLN PHE GLN LYS ALA GLN ALA ILE SER VAL LEU HIS GLU MET ILE GLN GLN THR PHE ASN LEU PHE SER THR LYS ASP SER SER ALA ALA LEU ASP GLU THR LEU LEU ASP GLU PHE TYR ILE GLU LEU ASP GLN GLN LEU ASN ASP LEU GLU SER CYS VAL MET GLN GLU VAL GLY VAL ILE GLU SER PRO LEU MET TYR GLU ASP SER ILE LEU ALA VAL ARG LYS TYR PHE GLN ARG ILE THR LEU TYR LEU THR GLU LYS LYS TYR SER SER CYS ALA TRP GLU VAL VAL ARG ALA GLU ILE MET ARG SER LEU SER LEU SER THR ASN LEU GLN GLU ARG LEU ARG ARG LYS GLU

(I) , hybridinterferonpolypeptid "B1B2B3B4" med formlen

CYS ASP LEU PRO GLN THR HIS SER LEU GLY ASN ARG ARG ALA LEU ILE LEU LEU ALA GLN MET ARG ARG ILE SER PRO PHE SER CYS LEU LYS ASP ARG HIS ASP PHE GLU PHE PRO GLN GLU GLU PHE ASP ASP LYS GLN PHE GLN LYS ALA GLN ALA ILE SER VAL LEU HIS GLU MET ILE GLN GLN THR PHE ASN LEU PHE SER THR LYS ASP SER SER ALA ALA LEU ASP GLU THR LEU LEU ASP GLU PHE TYR ILE GLU LEU ASP GLN GLN LEU ASN ASP LEU GLU ALA CYS VAL MET GLN GLU GLU ARG VAL GLY GLU THR PRO LEU MET ASN ALA ASP SER ILE LEU ALA VAL LYS LYS TYR PHE ARG ARG ILE THR LEU TYR LEU THR GLU LYS LYS TYR SER PRO CYS ALA TRP GLU VAL VAL ARG ALA GLU ILE MET ARG SER PHE SER LEU SER ILE ASN LEU GLN LYS ARG LEU LYS SER LYS GLU

(II) , DK 168794 B1 6 hybridinterferonpolypeptid "B1D2B3D4" med formlen

CYS ASP LEU PRO GLN THR HIS SER LEU GLY ASN ARG ARG ALA LEU ILE LEU

LEU ALA GLN MET ARG ARG ILE SER PRO PHE SER CYS LEU LYS ASP ARG HIS

ASP PHE GLU PHE PRO GLN GLU GLU PHE ASP ASP LYS GLN PHE GLN LYS ALA

GLN ALA ILE SER VAL LEU HIS GLU MET ILE GLN GLN ILE PHE ASN LEU PHE

THR THR LYS ASP SER SER ALA ALA TRP ASP GLU ASP LEU LEU ASP LYS PHE

CYS THR GLU LEU TYR GLN GLN LEU ASN ASP LEU GLU SER CYS VAL MET GLN

GLU VAL GLY VAL ILE GLU SER PRO LEU MET TYR GLU ASP SER ILE LEU ALA

VAL ARG LYS TYR PHE GLN ARG ILE THR LEU TYR LEU THR GLU LYS LYS TYR

SER SER CYS ALA TRP GLU VAL VAL ARG ALA GLU ILE MET ARG SER LEU SER

LEU SER THR ASN LEU GLN GLU ARG LEU ARG ARG LYS GLU

(III) , hybridinterferonpolypeptid "B1D2D3B4" med formlen

CYS ASP LEU PRO GLN THR HIS SER LEU GLY ASN ARG ARG ALA LEU ILE LEU

LEU ALA GLN MET ARG ARG ILE SER PRO PHE SER CYS LEU LYS ASP ARG HIS

ASP PHE GLU PHE PRO GLN GLU GLU PHE ASP ASP LYS GLN PHE GLN LYS ALA

GLN ALA ILE SER VAL LEU HIS GLU MET ILE GLN GLN ILE PHE ASN LEU PHE

THR THR LYS ASP SER SER ALA ALA TRP ASP GLU ASP LEU LEU ASP LYS PHE

CYS THR GLU LEU TYR GLN GLN LEU ASN ASP LEU GLU ALA CYS VAL MET GLN

GLU GLU ARG VAL GLY GLU THR PRO LEU MET ASN ALA ASP SER ILE LEU ALA

VAL LYS LYS TYR PHE ARG ARG ILE THR LEU TYR LEU THR GLU LYS LYS TYR

SER PRO CYS ALA TRP GLU VAL VAL ARG ALA GLU ILE MET ARG SER PHE SER

LEU SER ILE ASN LEU GLN LYS ARG LEU LYS SER LYS GLU

(IV) , DK 168794 B1 7 hybridinterferonpolypeptid "B1D2D3D4" med formlen

CYS ASP LEU PRO GLN THR HIS SER LEU GLY ASN ARG ARG ALA LEU ILE LEU

LEU ALA GLN MET ARG ARG ILE SER PRO PHE SER CYS LEU LYS ASP ARG HIS

ASP PHE GLU PHE PRO GLN GLU GLU PHE ASP ASP LYS GLN PHE GLN LYS ALA

GLN ALA ILE SER VAL LEU HIS GLU MET ILE GLN GLN ILE PHE ASN LEU PHE

THR THR LYS ASP SER SER ALA ALA TRP ASP GLU ASP LEU LEU ASP LYS PHE

CYS THR GLU LEU TYR GLN GLN LEU ASN ASP LEU GLU ALA CYS VAL MET GLN

GLU GLU ARG VAL GLY GLU THR PRO LEU MET ASN ALA ASP SER ILE LEU ALA

VAL LYS LYS TYR PHE ARG ARG ILE THR LEU TYR LEU THR GLU LYS LYS TYR

SER PRO CYS ALA TRP GLU VAL VAL ARG ALA GLU ILE MET ARG SER LEU SER

LEU SER THR ASN LEU GLN GLU ARG LEU ARG ARG LYS GLU

(V) , og hybridinterferonpolypeptid "B3D2B3B4" med formlen

CYS ASP LEU PRO GLN THR HIS SER LEU GLY ASN ARG ARG ALA LEU ILE LEU

LEU ALA GLN MET ARG ARG ILE SER PRO PHE SER CYS LEU LYS ASP ARG HIS

ASP PHE GLU PHE PRO GLN GLU GLU PHE ASP ASP LYS GLN PHE GLN LYS ALA

GLN ALA ILE SER VAL LEU HIS GLU MET ILE GLN GLN ILE PHE ASN LEU PHE

THR THR LYS ASP SER SER ALA ALA TRP ASP GLU ASP LEU LEU ASP LYS PHE

CYS THR GLU LEU TYR GLN GLN LEU ASN ASP LEU GLU SER CYS VAL MET GLN

GLU VAL GLY VAL ILE GLU SER PRO LEU MET TYR GLU ASP SER ILE LEU ALA

VAL ARG LYS TYR PHE GLN ARG ILE THR LEU TYR LEU THR GLU LYS LYS TYR

SER SER CYS ALA TRP GLU VAL VAL ARG ALA GLU ILE MET ARG SER PHE SER

LEU SER ILE ASN LEU GLN LYS ARG LEU LYS SER LYS GLU

(VI) .

DK 168794 B1 8

De mest foretrukne hybridinterferonpolypeptider ifølge opfindelsen er "B1D2D3D4" (V) og "B]B2D3B4H (II).

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at 5 værtsceller transformeret med en hybridvektor, som indeholder en DNA-sekvens, der koder for hybridinterferonet, dyrkes, og at hybridinterferonpolypeptidet isoleres.

Den rekombinant DNA-teknik, der anvendes til fremstilling af de transformerede værtsceller omfatter eksempelvis 10 følgende trin: a) fremstilling af en DNA, som indeholder strukturgenet, der koder for hybridinterferonet, ved in vitro rekombination af de bindingssteder, som svarer til aminosyreme henholdsvis 60, 92 og 150, i interferoner LyIFN-a-2 og 15 LyIFN-a-3 eller ved kemisk DNA-syntese og inkorporering af det dannede DNA i en passende ekspressionvektor, b) overføring af den dannede hybridvektor, som bærer hybrid IFN strukturgenet, til en recipientvært, og c) selektering af transformede værter fra ikke-trans-20 formerede værter, sædvanligvis ved dyrkning under sådanne betingelser, hvor kun de transformerede værter overlever.

De transformerede værter dyrkes derpå under betingelser, som tillader ekspression af hybrid IFN strukturgenet, og det udtrykte hybrid IFN isoleres.

25 Fremgangsmåden forklares nærmere i den efterfølgende detailbeskrivelse og under henvisning til tegningen, hvor fig. 1 er en sammenligning af aminosyresekvenserne for modent LyIFN-a-2 og LyIFN-a-3, hvor der kun er anført de aminosyrer i LyIFN-a-3, 30 som er forskellige fra de tilsvarende amino syrer i LyIFN-a-2, idet aminosyresekvensen for LyIFN-ct-3 i øvrigt er identisk med DK 168794 B1 9 aminosyresekvensen for LyIFN-a-2, fig. 2 viser nucleotidsekvenserne for de kodende områder og dele af de 3’ekstracistroniske 5 områder af LyIFN-a-2 og LyIFN-a-3, hvor ATG-translationsstartkodonerne, termine-ringstripletterne og passende restriktions-steder er understreget. De kodende tripletter er nummereret.

10 fig. 3 viser restriktionskortene for de små

Hindlll-PstI segmenter af plasmider pBR(AP)/LyIFN-a-2 og pBR(AP)/LyIFN-a-3, hvor det hvide bånd (LyIFN-a-3) og det sorte bånd (LyIFN-a-2) afgrænser de kodende 15 regioner af de modne IFNs, og hvor der nederst er vist opdelingen af primærstrukturen for IFN polypeptid (165 aminosyrer) i fire afsnit, idet tallene i parentes angiver antallet af aminosyrerester, hvormed 20 IFN-a-2 og IFN-a-3 afviger fra hinanden i hvert enkelt afsnit, og fig. 4 og 5 viser radioaktiviteten bundet til bærerperlerne som funktion af mængden af IFN-a-2 i testopløsningen, bestemt ved en sandwich 25 RIA.

1. Fremstilling af hybridvektorer, som indeholder et hybrid IFN strukturgen cDNA'erne for humane interferon-a-undertyper a-2 og a-3 er blevet klonet i Escherichia coli, der i det følgende for-30 kortes E.coli. Plasmid pBR(AP)/LyIFN-a-2 og pBR(AP)/ LyIFN-a-3 omfatter således indsat Hindlll-PstI (eller EcoRI-PstI) DNA (insert), som indeholder de kodende områder af LyIFN-a-2 og LyIFN-a-3 under kontrol af Ø-lactamasepromoteren, jævnfør beskrivelsen til europæisk 35 patentansøgning nr. 76.489. Restriktionskortet for de indsatte dele er vist i fig. 3. Det ses let, at generne har DK 168794 B1 10 nogle fælles restriktionssteder (lokaliseret i stillingerne 60, 92 og 150 i IFN arainosyresekvenserne), som fordelagtigt kan anvendes til at danne nye gener, som 5 koder for hybridinterferoner med fordelagtige biologiske og/eller fysiske egenskaber.

Rekombinanter (enkelte eller flere ombytninger) mellem LyIFN-a-2- og LyIFN-a-3-gener kan dannes ved in vitro rekombination ved PvuII-bindingsstedet (position 92) 10 og/eller ved Sau3A-bindingsstederne (positionerne 60 og 150). Da interferonernes primærstruktur således kan opdeles i fire afsnit (første afsnit = aminosyrer 1-60, andet afsnit = aminosyrer 61-92, tredje afsnit = aminosyrer 93-150 og fjerde afsnit = aminosyrer 151-166, se 15 fig. 3), kan hybridinterferoneme ifølge opfindelsen betegnes ved hjælp af fire bogstaver, hvor hvert bogstav indicerer det tilstedeværende afsnit. Således betegnes eksempelvis hybridinterferon (I), der er sammensat af afsnittene 1 til 3 af interferon LyIFN-a-2 ("B", LyIFN-a-2 20 er beslægtet med IFN-aB, se ovenfor) og afsnit 4 af LyIFN-a-3 ("D", LyIFN-a-3 er beslægtet med IFN-otD, se ovenfor), "B1B2B3D4".

For at lette fremstillingen af det ønskede hybridinterferon skal DNA-indsætningsdelene, som indeholder områ-25 derne, der koder for henholdsvis LyIFN-a-2 og LyIFN-a-3, modificeres på en sådan måde, at restriktionsbindingsstederne Hindlll (eller EcoRI), PvuII og PstI med hensyn til genligatering er entydige for dem. Det fremgår af fig.

3, at der er et yderligere PvuII-bindingssted i det 3’ 30 ekstracistroniske område i genet, som koder for LyIFN-a-2. Dette bindingssted kan let fjernes f.eks. ved partiel spaltning af en hybridvektor, som indeholder området, der koder for LyIFN-a-2, med PvuII, ligatering af det dannede lineariserede DNA til en linker, som indeholder en DNA 35 sekvens, der genkendes ved hjælp af restriktions-endonucleasen PstI, spaltning med PstI, genligatering af DK 168794 B1 11 spaltestykkerne ved lav DNA koncentration og selektering for plasmider, f.eks. ved restriktionsanalyse, som har den ønskede modifikation, nemlig et afkortet 3' ekstra-5 cistronisk område med elimineret PvuII-bindingssted. På analog måde modificeres vektorer, som anvendes til at klone IFN-gener, fordelagtigt således, at restriktions-bindingsstederne Hindlll, PvuII og PstI er entydige for dem.

10 Hybridvektoren ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at den indeholder en DNA sekvens, der koder for et hybrid-interferonpolypeptid ifølge opfindelsen. Hybridvektoren er operativt bundet til en ekspressionskontrolsekvens.

Vektoren udvælges afhængigt af de værtsceller, som tænkes 15 anvendt til transformation. Som eksempler på egnede værter kan nævnes mikroorganismer, som mangler eller har et ringe indhold af restriktionsenzymer eller modifikationsenzymer, såsom gær, f.eks. Saccharomyces cerevisiae, og bakteriestammer, især stammer af Escherichia coli, f.eks.

20 E. coli X1776, E. coli HB101, E. coli W3110, E. coli HB101/LM1035, E. coli JA221 eller E. coli K12 stamme 294, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas, Haemophilus, Streptococcus og andre og endvidere celler fra højere organismer, især etablerede 25 humane eller animalske cellelinier. Som værtsmikroorganisme foretrækkes de ovenfor anførte Escherichia coli-stammer f.eks. E. coli HB101 og E. coli JA221, og endvidere Saccharomyces cerevisiae.

Principielt er alle vektorer, som kopierer og udtrykker 30 hybrid IFN generne i den valgte vært, egnede. Som eksempler på vektorer, der er egnede til ekspressionen af hybridinterferonerne i en Escherichia coli stamme kan nævnes bacteriophager, f.eks. derivater af λ-bacterio-phager, eller plasmider, såsom især plasmidet ColEl og 35 dets derivater, f.eks. pMB9, pSF2124, pBR317 eller pBR322.

DK 168794 B1 12

De foretrukne vektorer ifølge opfindelsen er afledt af plasmid pBR322. Egnede vektorer indeholder et komplet replicon og et markeringsgen, som tillader selektering og 5 identificering af de værter, som er transformeret med ekspressionsplasmiderne på basis af en phenotypisk egenskab. Egnede markeringsgener bibringer værten f.eks. resistens over for tungmetaller, antibiotika og lignende. Endvidere indeholder foretrukne vektorer ifølge opfin-10 delsen uden for replicon- og markeringsgenområderne, genkendelsessekvenser for restriktionsnucleaser, således at hybrid I FN genet og, om hensigtsmæssigt, ekspressionskontrolsekvensen kan indsættes ved disse bindingssteder.

Den foretrukne vektor, plasmid pBR322, indeholder en 15 intakt replicon, markeringsgener, som tilvejebringer resistens over for tetracyclin og ampicillin (tetR og ampR) og en række entydige genkaldelsesbindingssteder for restriktionsendonucleaser, f.eks. PstI (spalter i ampR genet, hvorimod tetR genet forbliver intakt), BamHI, 20 Hindlll og Sall (spalter alle i tetR genet, hvorimod ampR genet forbliver intakt), Nrul og EcoRI.

Der kan anvendes adskillige ekspressionskontrolsekvenser til at regulere genekspressionen. Der anvendes især ekspressionskontrolsekvenser for stærkt udtrykte gener fra 25 værtsorganismen, som skal transformeres. I tilfælde af pBR322 som hybridvektoren og Escherichia coli som værtsmikroorganismen er ekspressionskontrolsekvenserne (som bl.a. indeholder promotor- og ribosomalbindingsstedet) for lactoseoperonet, tryptophanoperonet, arabinoseoperonet og 30 lignende, /3-lactamasegenet, de tilsvarende sekvenser af phag X N genet eller phag fd-coatproteingenet og andre egnede. Selv om plasmidet pBR322 allerede indeholder promotoren for /3-lactamasegenet (|3-lac-gen) skal de andre ekspressionskontrolsekvenser indføres i plasmidet.

35 Vektorer, som er egnede til replikation og ekspression i gær, indeholder en gærreplikationsstart og en selektiv DK 168794 B1 13 genetisk markør for gær. Hybridvektorer, som indeholder en gærreplikationsstart, feks. kromosomalt autonomt replikerende segment (ars), tilbageholdes ekstrakromo-5 somalt i gærcellen efter transformationen og kopieres eller repliceres autonomt. Endvidere kan der anvendes hybridvektorer, som indeholder sekvenser, der er homologe med gær 2μ plasmid DNA’et. Sådanne hybridvektorer integreres ved rekombination i 2 μ pi asmider, som allerede 10 findes i cellen, eller kopieres autonomt. 2μ Sekvenser er særligt egnede til plasmider med en høj transformations-frekvens og tillader høje kopital. Den foretrukne gærvektor ifølge opfindelsen er plasmid pJDB207.

Egnede markeringsgener eller markørgener for gær er især 15 sådanne, som bibringer værten resistens mod antibiotika, eller i tilfælde af auxotrofe gærmutanter, gener, som komplementerer læsioner hos værten. Tilsvarende gener bibringer eksempelvis resistens mod antibiotikummet cycloheximid eller tilvejebringer protrofi i en auxotrof 20 gærmutant, f.eks. URA3, LEU2, HIS3 eller, især, TRP1-genet. Gærhybridvektorer indeholder endvidere fortrinsvis en replikationsstart og et markeringsgen for en bakterievært, især Escherichia coli, således at dannelsen og kloningen af hybridvektorerne og deres intermediator kan 25 foregå i en bakterievært.

Ekspressionskontrolsekvenser, som er egnede til ekspression i gær, er f.eks. ekspressionskontrolsekvenser kraftigt udtrykte gærgener. Der kan således anvendes promotorerne for TRPl-genet, ADHI eller ADHII-genet, sur 30 phosphatase (PH03 eller PH05)-genet, isocytochromgenet eller en promotor, som indgår i den glycolytiske reaktionsrække, f.eks. promotoren for enolase, glyceraldehyd- 3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH), 3-phosphoglycerat-kinase (PGK), hexokinase, pyruvatdecarboxylase, phospho-35 fructo-kinase, glucose-6-phosphatisomerase, 3-phospho-glyceratmutase-, pyruvatkinase-, triosephosphatiso- DK 168794 Bl 14 merase-, phosphoglucoseisomerase- og glucokinasegenerne. Foretrukne vektorer ifølge opfindelsen indeholder promotorer med transskriptionskontrol, f.eks. promoto-5 rerne for PH05-, ADHII og CAPDH-geneme, som igen kan kobles til eller fra ved at variere vækstbetingelserne.

F.eks. kan PH05-promotoren frakobles eller tilkobles alene ved at forøge eller formindske koncentrationen af uorganisk phosphat i mediet.

10 Promotorer til anvendelse i pattedyrceller er f.eks. viruspromotorer, såsom HTLV, SV40, vaccinia promotor og lignende.

Promotoren er operativt bundet til kodningsområdet således, at der sikres effektiv ekspression af hybridinter-15 feronet. Ved én udførelsesform for opfindelsen er promotoren bundet direkte til kodningsområdet for modent hybrid I FN med et translationsstartsignal (ATG) indsat ved samlingen. Et foretrukket område til sammenføjning af promotoren med hybrid IFN kodningsområdet er mellem hoved 20 mRNA starten og ATG'en for genet, som naturligt er bundet til promotoren.

Ved en anden udførelsesform for opfindelsen, især når gær anvendes som værtsmikroorganismen, indeholder konstruktionen en signalsekvens. Egnede signalsekvenser er sådan-25 ne, der er naturligt bundet til den anvendte promotor. Der kan eksempelvis anvendes PH05 signalsekvensen samt signalsekvensen for gærinvertase- eller a-faktor-generne.

Der foretrækkes de kombinationer, som tillader en præcis spaltning mellem signalsekvensen og aminosyresekvensen for 30 det modne hybrid IFN. Andre sekvenser, såsom pro- eller spacer-sekvenser, som eventuelt kan bære specifikke processignaler, kan også være indeholdt i konstruktionerne for at lette præcis eller nøjagtig bearbejdning af pre-cursormolekyler. Der kan eventuelt dannes kondenserede 35 proteiner, som indeholder interne processignaler, som DK 168794 B1 15 tillader rigtig modning in vivo eller in vitro.

Fortrinsvis indeholder hybridvektorerne ifølge opfindelsen også 3'-flankeringssekvensen for et gen, som inde-5 holder de rigtige signaler til transskriptionsterminering og polyadenylering. Egnede 3'-flankeringssekvenser er f.eks. flankeringssekvenser for genet, der er naturligt bundet til den anvendte promotor. I tilfælde af gær anvendt som værtsmikroorganisme og anvendelse af PH05-10 promotoren som ekspressionskontrolsekvens, er 3'-flankeringssekvensen fortrinsvis 3'-flankeringssekvensen for PH05-genet.

En foretrukken udførelsesform for hybridvektoren ifølge opfindelsen kan kopiere og foretage phenotypisk selektion 15 i en værtsstamme, der indeholder en promotor og en DNA sekvens, som koder for enhver af de hidtil ukendte hybridinterferoner, idet DNA sekvensen er anbragt sammen med transskriptionsstart- og -termineringssignaler samt translationsstart- og -stopsignaler i hybridvektorerne 20 under kontrol af promotoren, således at den i en transformeret vært er udtrykt til at producere et hybridinter-feronpolypeptid ifølge opfindelsen.

Hybridvektoreme ifølge opfindelsen kan fremstilles ved in vitro ligatering af egnede stykker af de områder, som ko-25 der for LyIFN-a-2 og LyIFN-a-3, og indsætning af det dannede hybrid IFN gen i en egnet vektor eller ved ligatering af et særligt IFN DNA segment i et lineariseret vektor DNA, som i forvejen indeholder de øvrige afsnit på en sådan måde, at genet, der koder for det ønskede hybrid-30 interferon, dannes. Det foretrækkes, at DNA afsnittet, som tilvejebringer aminoterminalsekvensen, allerede er indføjet i ekspressionskontrolsekvensen.

Egnede afsnit eller stykker af LyIFN-ce-2- og LyIFN-a-3-kodningsområderne fås især fra de foretrukne startvek- DK 168794 B1 16 torer ifølge opfindelsen, nemlig de pBR322-afledte plas-mider pAM2 og pAM21. Plasmidet pAM2 indeholder en Hindlll-Pstl indsætningsdel med LyIFN-a-3-kodningsområdet under 5 kontrol af Ø-lactamasepromotoren. Vektordelen af plasmid pAM2 er resistent mod PvuII. Plasmidet pAM2l indeholder en indsat HindIII-PstI-del med LyIFN-a-2“kodningsområdet med et entydigt PvuII bindingssted i stilling 92 og under kontrol af Ø-lactamasepromotoren. Vektordelen af plasmid 10 p21 er ligeledes resistent over for PvuII.

Specielt fremstilles genet, som koder for hybridinterferon "B1B2B3D4", ved ligatering af det store Pstl-PvuII-frag-ment af plasmid pAM21, det lille Sau3A-PvuII-fragment af plasmid pAM21 og det lille Sau3A-PstI-fragment af plasmid 15 pAM2- Denne konstruktion fører til et plasmid (pJC344), som indeholder hybridinterferon "B1B2B3D4" kodningsområdet under kontrol af Ø-lactamasepromotoren. På tilsvarende måde fremstilles genet, som koder for hybridinterferon "B1B2D3B4", ved ligatering af det store PvuII-Pstl-frag-20 ment af plasmid pAM21, det lille Sau3A-PvuII-fragment af plasmid pAM2 og det lille Sau3A-PstI-fragment af plasmid pAM21. Denne konstruktion resulterer i et plasmid (pJC342), som indeholder hybridinterferon "B1B2D3B4" kodningsområdet under kontrol af 0-1actamasepromotoren.

25 Genet, som koder for hybridinterferon "B1D2D3D4", kan fremstilles ved ligatering af det lille HindIII-Sau3A-fragment af plasmid pAM21, det lille Sau3A-PvuII-fragment af plasmid pAM2 og det store PvuII-Hindlll-fragment af plasmid pAM2. Denne konstruktion resulterer i et plasmid 30 (pAM94), som indeholder hybridinterferon "31020304" kod ningsområdet under kontrol af 0-1actamasepromotoren. På tilsvarende måde fremstilles genet, som koder for hybridinterferon ,,BiD2B3B4n, ved ligatering af det lille HindIII-Sau3A-fragment af plasmid pAM21, det lille Sau3A-35 PvuII-fragment af plasmid pAM2 oæg det store Pvull-HindIII-fragment af plasmid pAM21. Denne konstruktion resulterer i et plasmid (pAM90), som indeholder hybrid- DK 168794 Bl 17 interferon "B1D2B3B4" kodningsområdet under kontrol af /5-lactamasepromotoren. PI asmider, som indeholder hybridinterferon "B1D2B3D4" kodningsområdet, f.eks. plasmid 5 pDMl, eller hybridinterferon "B1D2D3B4" kodningsområdet, f.eks. plasmid pDM2, kan fremstilles på tilsvarende måde. Disse plasmider er egnede til kopiering og ekspression af hybrid-IFN-generne i E. coli. Om ønsket kan DNA indsætningsdelen, som koder for en vilkårlig af disse hybrid-10 interferoner, udskæres af det tilsvarende plasmid og indsættes i et andet vektor-DNA. På denne måde kan der dannes plasmider, som indeholder hybridinterferon-kodningsområdet under kontrol af en promotor, som er forskellig fra /S-lactamasepromotoren, og/eller som 15 muliggør, at genet udtrykkes i en vært, som er forskellig fra E. coli.

Fremstillingen af DNA indeholdende strukturgenet for et vilkårligt af de omtalte hybridinterferoner kan også gennemføres ved hjælp af kemisk syntese. Egnede fremgangs-20 måder til fremstillingen af DNA er summarisk beskrevet af S.A. Narang, Tetrahedron 39, 3 (1983). De kendte synteseteknikker tillader fremstillingen af polynucleotider med længder på 20 baser i godt udbytte, høj renhed og i løbet af relativ kort tid. Passende beskyttede nucleotider bin-25 des til hinanden ved hjælp af phosphodiestermetoden, jævnfør K.L. Agarwal et al., Angew. Chem 84, 489 (1972), eller den endnu mere effektive phosphotriestermetode, jævnfør C.B. Reese, Tetrahedron 34, 3143 (1972), eller phosphittriestermetoden, jævnfør R.L. Letsinger et al., 30 J. Am. Chem. Soc. 98, 3655 (1976). Det er muligt at forenkle fremstillingen af oligonucleotiderne og poly-nucleotiderne ved hjælp af fastfasemetoden, ved hvilken nucleotidkæderne bindes til en egnet polymer. Itakura et al., J. Am. Chem. Soc. 103, 706 (1981) anvender trinucleo-35 tider bundet ved hjælp af phosphotriestermetoden i fast-fasesyntesen i stedet for de enkelte nucleotider, og disse kan således kondenseres på kort tid og med gode udbytter DK 168794 B1 18 til f.eks. polynucleotid med 31 baser. Det aktuelle dobbelstrengede DNA kan opbygges enzymatisk ud fra kemisk fremstillede korte afsnit. Til dette formål anvender 5 Khorana et al., J. Biol. Chem. 251, 565 (1976) overlappende polynucleotidsekvenser fra begge DNA-strenge, som sammenholdes i det korrekte arrangement ved baseparring og derpå bindes kemisk ved hjælp af enzymet DNA-ligase. En anden mulighed er i hvert enkelt tilfælde 10 at inkubere en polynucleotidsekvens fra de to DNA-strenge med et kort overlappende segment eller afsnit i nærværelse af de fire nødvendige deoxynucleosidtriphosphater med en DNA-polymerase, f.eks. DNA-polymerase I, et Klenow fragment af polymerase I eller T4-DNA-polymerase, eller med 15 AMV (avian myeloblastosis virus) omvendt transskriptase.

De to polynucleotidsekvenser holdes derved sammen i det korrekte arrangement ved baseparring og suppleres med de nødvendige nucleotider ved hjælp af enzymet til dannelse af et komplet dobbeltstrenget DNA, jævnfør S.A. Narang et 20 al., Anal. Biochem. 121, 356 (1982). Itakura et al., J. Biol. Chem. 257, 9226 (1982) har beskrevet, hvorledes man på grundlag af dette princip kan bygge et segment med en længde på 132 basepar af det human leukocytinterferon -<*2-gen i nærværelse af DNA-polymerase I (Klenow fragment) 25 ud fra 4 kemisk fremstillede fragmenter med en baselængde på 39 til 42, idet man opnår en besparelse på 40% i kemisk syntese sammenlignet med fremgangsmåden, hvor man kun bruger ligase. En egnet fremgangsmåde til fremstilling af DNA'erne ifølge opfindelsen er eksempelvis beskrevet i 30 beskrivelsen til europæisk patentansøgning nr. 146.785.

Det kemisk syntetiserede DNA, som indeholder strukturgenet for et vilkårligt af hybridinterferoneme ifølge opfindelsen, kan indsættes i et vektor DNA, som indeholder en ekspressionskontrolsekvens, på en sådan måde, at ekspres-35 sionskontrolsekvensen regulerer ekspressionen af genet.

DK 168794 B1 19 2. Transformation af værtscellerne

Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstilling af en transformeret vært, ved hvilken en vært transfor-5 meres med en ekspressionsvektor, der indeholder en DNA sekvens, som koder for en vilkårlig af hybridinterferonerne ifølge opfindelsen, og som reguleres ved hjælp af en ekspressionskontrolsekvens.

Eksempler på egnede værter af de ovennævnte mikroorga-10 nismer, såsom stammer af Saccharomyces cerivisiae,

Bacillus subtilis og Escherichia coli. Transformeringen med ekspressionspiasmiderne ifølge opfindelsen gennemføres f.eks. som beskrevet i litteraturen, således for Saccharomyces cerevisiae af A. Hinnen et al., Proc. Natl.

15 Acad. Sci. USA 75, 1929 (1978), for Bacillus subtilis af Anagnostopoulos et al., J. Bacteriol. 81, 741 (1961) og for Escherichia coli af M. Mandel et al., J. Mol. Biol.

53, 159 (1970).

I overensstemmelse hermed omfatter transformations- 20 proceduren for E. coli celler forbehandling med Ca2+ af cellerne, således at de kan optage DNA, og inkubering med hybridvektoren. Cellerne overføres til et selektivt vækstmedium, som tillader adskillelse af de transformerede celler fra modercellerne. Celler, som ikke indeholder 25 vektoren, vil ikke overleve i et sådant medium. Transformationen af gær omfatter f.eks. trinnene (1) enzymatisk fjernelse af gærcellevæggen ved hjælp af glycosidaser, (2) behandling af de dannede spheroplastere med vektoren i nærværelse af polyethylenglycol og Ca2+-ioner og (3) 30 regenerering af cellevæggen ved indlejring af spheroplasterne i agar. Fortrinsvis fremstilles regenererings agar en på en sådan måde, at det er muligt at opnå regenerering og selektion af de transformerede celler på samme tid.

DK 168794 B1 20 Værten ifølge opfindelsen transformeret med en ekspressionsvektor er ejendommelig ved, at ekspressionsvektoren indeholder en DNA sekvens, som koder for et hybrid-5 interferonpolypeptid ifølge opfindelsen.

3. Dyrkning af de transformerede værtsceller og isolering af det udtrykte hybridinteferon

Ved fremgangsmåden til fremstilling af hybridinterferon-polypeptiderne ifølge opfindelsen dyrkes værtsceller 10 transformeret med en hybridvektor, som indeholder en DNA sekvens, der koder for en vilkårlig af hybridinterferon-polypeptidet, som derpå isoleres.

De transformerede værtsceller dyrkes under anvendelse af i og for sig kendte fremgangsmåder i et flydende medium, som 15 indeholder assimilerbare kilder for carbon, nitrogen og uorganiske salte.

Forskellige carbonkilder kan anvendes til dyrkning af de transformerede værtsceller ifølge opfindelsen. Som eksempler på foretrukne carbonkilder kan nævnes assimi-20 lerbare kulhydrater, såsom glucose, maltose, mannitol eller lactose, eller et acetat, som kan anvendes enten alene eller i egnede blandinger. Som eksempler på egnede nitrogenkilder kan nævnes aminosyrer, såsom casaminosyrer, peptider og proteiner samt deres nedbrydningsprodukter, 25 såsom trypton, pepton eller kødekstrakter, samt endvidere gærekstrakter, maltekstrakt og tillige ammoniumsalte, f.eks. ammoniumchlorid, ammoniumsulfat eller ammoniumnitrat, som kan anvendes enten alene eller i egnede blandinger. Uorganiske salte, som også kan anvendes, er 30 f.eks. sulfater, chlorider, phosphater og carbonater af natrium, kalium, magnesium og calcium.

Mediet indeholder endvidere f.eks. vækstfremmende stoffer, såsom sporelementer, f.eks. jern, zink, mangan og lignen- DK 168794 Bl 21 de, og fortrinsvis stoffer, som udøver et selektionstryk og forhindrer vækst af celler, som har mistet ekspressionspi asmidet. Eksempelvis sættes således ampicillin til 5 mediet, hvis ekspressionsplasmidet indeholder et ampR-gen.

En sådan tilsætning af antibiotiske stoffer har også den virkning, at kontaminerende antibiotikafølsomme mikroorganismer ødelægges. Hvis en gærstamme, som er auxotrof, f.eks. med hensyn til en essentiel aminosyre anvendes som 10 værtsorganisme, indeholder plasmidet fortrinsvis et gen, som koder for et enzym, som komplementerer værtsdefekten. Dyrkning af gærstamme gennemføres i et minimalmedium, som mangler denne aminosyre.

Dyrkningen gennemføres under i og for sig kendte frem-15 gangsmåder. Dyrkningsbetingelserne, såsom temperatur, pH-værdi i mediet og fermenteringstiden, vælges således, at der opnås et maksimalt indhold af hybridinterferon. En E. coli stamme eller gærstamme dyrkes således fortrinsvis under aerobe betingelser ved submers dyrkning med ryst-20 ning eller omrøring ved en temperatur på fra ca. 20 til ca. 40°C, fortrinsvis ca. 30°C, og en pH-værdi på 4-8, fortrinsvis en pH-værdi på ca. 7, i fra ca. 4 til ca.

30 timer, fortrinsvis indtil maksimale udbytter af hybridinterferonet er opnået.

• 25 Det har overraskende vist sig, at maksimumkoncentrationerne af hybridinterferonerne ifølge opfindelsen, f.eks. af hybridinterferoner "Bi^DøB^j", "B2D2B3D4", "B1D2D3D4" og B1D2B3B4", kan opnås i råekstrakter af f.eks. transformeret gær dyrket under standardbetingel-30 ser, er udtalt højere end koncentrationerne af inter-feron-a-2 og hybridinterferoner "B1B2D3D4" og D1D2B3B4", som er nært beslægtede med hybridinterferoner "BD" og "DB", som er kendt fra US-patentskrift nr. 4.414.150.

Når celletætheden har nået en tilstrækkelig høj værdi, 35 afbrydes dyrkningen, og hybridinterferonet frigøres fra DK 168794 Bl 22 værtscellerne. Til dette formål nedbrydes cellerne, f.eks. ved behandling med et detergent, f.eks. SDS eller triton, eller de lyseres med lysozym, som virker på lignende måde.

5 Hvis gær anvendes som værtsorganisme, kan cellevæggen fjernes ved enzymatisk nedbrydning med en glucosidase. Eventuelt kan der i stedet for eller yderligere anvendes mekaniske kræfter, såsom forskydningskræfter, f.eks. X-presse, fransk presse, Dynomølle, eller omrystning med 10 glasperler eller aluminiumoxid eller skiftevis frysning f.eks. i flydende nitrogen, og optøning, f.eks. til 30-40°C, samt ultralydsbehandling til oplukning af cellerne. Den fremkomne blanding, som indeholder proteiner, nucleinsyrer og andre cellebestanddele, opkoncentreres med 15 hensyn til proteiner, herunder hybridinterferon, på i og for sig kendt måde efter centrifugering. Således fjernes eksempelvis størsteparten af ikke-bestanddelene ved poly-ethyleniminbehandling, og proteinerne, herunder hybridinterferon, fældes, f.eks. ved mætning af opløsningen med 20 ammoniumsulfat eller med andre salte. Bakterieproteiner kan også fældes ved syrning med eddikesyre, f.eks. 0,1%, pH 4-5. Andre rensningstrin indbefatter f.eks. ultrafiltrering, diafiltrering, gelelektroforese, kromatografiske fremgangsmåder, såsom ionbytterkromatografi, størrelses-25 udelukkelseskromatografi, HPLC, HPLC med omvendt fase og lignende, adskillelse af bestanddelene i blandingen efter molekylstørrelse ved hjælp af en egnet "SephadexM<S)-søjle, dialyse, affinitetskromatografi, f.eks. antistofaffinitetskromatografi, specielt monoklonalt antistofaffini-30 tetskromatografi, og andre kendte metoder, især sådanne, som anvendes inden for dette område.

Det har overraskende vist sig, at hybridinterferon-polypeptiderae ifølge opfindelsen har en større temperaturstabilitet end interferon LyIFN-a-2 og 35 hybridinterferonpolypeptid "BiBgDsD^'. Således er den temperatur, ved hvilken 50% af den antivirale virkning går tabt (temperaturstigning i IFN-opløsninger med l°C/min.) DK 168794 B1 23 er 62,8°C i tilfælde af LyIFN-a-2 og 63°C i tilfælde af hybridinterferonpolypeptid "B1B2D3D4", medens de tilsvarende værdier for f.eks. hybridinterferonpoly-5 peptider "B1D2D3D4% "BP2B3B4", "BP2B3D4" og ^030384-er henholdsvis 65°C, 64,7°C, 65,3°C og 64,2°C.

Hybridinterferonernes biologiske egenskaber og farmaceutiske formuleringer

Hybridinterferonerne ifølge opfindelsen har interessante 10 biologiske egenskaber, som gør dem egnede til anvendelse som værdifulde farmaceutika.

De farmaceutiske præparater ifølge opfindelsen er ejendommelige ved, at de indeholder en terapeutisk virksom mængde af et hybridinterferonpolypeptid ifølge opfindel-15 sen.

Hybridinterferonpolypeptiderne ifølge opfindelsen udmærker sig ved en meget kraftig antiviral virkning på pattedyrceller, såsom kvægceller og især humane celler. De antivirale koncentrationer bestemt som reduktionen af 20 cytopatisk virkning ved fremgangsmåden ifølge S. Rubinstein et al., J. Virol 37, 755 (1981) under anvendelse af vesikulær stomatitis virus (VSV) som vække-virus på kvægceller (MDBK) og humane celler (WISH), er anført i følgende tabel 1.

Tabel 1 DK 168794 B1 24

Antiviralkoncentration af hybridinterferoner under anvendelse af VSV som vække-virus.

interferon specifik virkning/ing protein kvæg menneske •'BiDzDaD«," 1,25*10» 1,3*10» "BiDaBaBi," 1,25*10» 1,3*10» wBiB2D3Bu" 9,5*107 >2*10» "BiDaBaD*” 1,9*10» 7,7*107 5 "BiDaDaB^·' 7,2*107 3,8* 10y "BiBgBaO^” 1,05*10» 8*107 ’’DiDaBaB^* (DB) 8,5*107 3,3*10» ”BiB2D3Di»” (BD) 1,15*10» 2,33*10» a-2 ("B") 1,05*10» 2,13*10» a-3 ("D") 5,5*107 6,7*10»

Den antivirale virkning af hybridinterferonerne ifølge opfindelsen er således ikke begrænsede til menneskeceller men er uforanderlig interspecifik. De antivirale virkninger af hybridinterferoner "B1D2D3D4", "B2D2B3B4", 10 "B1B2D3B4", "BiD2B3D4" og B3B2B3D4" på humane celler er således sammenlignelige med hensyn til grad med stam-interferon a-2 og hybridinterferon "B1B2D3D4", som er nært beslægtet med hybridinterferon "BD” beskrevet i US-patentskrift nr. 4.414.150 men klart bedre end stam-15 interferon a-3 (med en faktor 10-30) og en reference-hybridinterferon "D1D2B3B4" (med en faktor 230-600).

Bortset fra den generelle antivirale virkning på humane celler bevirker hybridinterferonerne ifølge opfindelsen et mere specifikt respons fra målceller. Forskellige intra-20 cellulære enzymer induceres således ved indvirkning af interferon. Blandt disse enzymer er (2'-5') oligoiso-adenylatsyntetase ("2-5 A syntetase"), som danner (2'5') DK 168794 B1 25 bundne oligonucleotider, og disse aktiverer Igen en latent endoribonuclease, som spalter viral mRNA. Det har overraskende vist sig, at hybrldlnterferoneme Ifølge 5 opfindelsen, såsom "B1D2D3D4", "B1D2B3B4, "Β]Β2Β3θ4" og "B1B2D3B4", er særligt aktive med hensyn til at fremkalde 2-5 A syntetaseaktivitet i humane celler. Således fremkalder 103 enheder/ml hybridinterferoner "B3D2D3D4", "b1d2b3®4"^ "b1b2b3d4" °9 "B2B2D3B4" en forøgelse på hen-10 holdsvis 17,5 gange, 11,4 gange, 8,5 gange og 9,6 gange af 2-5 A syntetaseaktiviteten i Daudiceller sammenlignet med en forøgelse på henholdsvis 5,6, 3,9, 4,0 og 4,3 ved indvirkning af staminterferoner a-2 og a-3 og reference-hybridinterferoner "BiB2D3D4" og "D1D2B3B4".

15 Endvidere udviser hybridinterferonerne ifølge opfindelsen antiproliferative virkninger. Den antiproliferative virkning kan bestemmes på følgende måde: interferonhol-dige opløsninger inkuberes med 5·10^ Daudiceller pr. ml i 2 ml RPMI-medium indeholdende 10% føtal kalveserum.

20 Celleformeringen bestemmes efter 3 dages inkubering ved optælling af levende celler i et hæmocytometer under anvendelse af Trypanblåt eksklusionstesten. Koncentrationen af hybridinferon "B1D2D3D4", "B1D2B3B4", "B1B2B3D4\ "B1B2D3B4m, "B2.D2B3D4" og "B1D2D3B4", som er 25 nødvendig for at fremkalde en 50%'s hæmning af Daudicelle-multiplikationen, er således henholdsvis ca. 4, 4, 1,3, 1,3, 4 og 4 enheder /ml, dvs. omtrent ækvivalent med stam-interferon a-2 og referencehybridinterferon "B1B2D3D4" (ca. 1,3 enheder/ml) og bedre end staminterferon a-3 (ca.

30 20 enheder/ml) og referencehybridinterferon "D2D2B3B4" (ca. 400 enheder/ml).

Den antiproliferative virkning mod humane cancere kan også påvises in vivo. Forskellige cancere af human oprindelse, såsom brystcancer, tyktarmscancer, lungecancer, livmoder-35 cancer og melanoma er således blevet propageret i nøgne mus. Små fragmenter af de propagerede tumorer isoleres og DK 168794 Bl 26 implanteres ved hjælp af en trokar under venalkapslen hos (Balb/c x DBA/2)Fi (CDF^) -mus. I FN indgives intramuskulært i to daglige doser på fra 5*10^ til 5·10? IE/kg/injektion 5 på dag 1 til 5 (indgiftsdag: dag 0). På den sjette dag aflives dyrene, sluttumorstørrelserne måles og sammenlignes med begyndelsestumorstørrelserne (inden IFN-behand-ling) og tumorstørrelserne hos ubehandlede kontrolmus. Ved behandling med hybridinterferonerne ifølge opfindelsen, 10 f.eks. "B1D2D3D4" og "B1B2D3B4", iagttages en væsentlig og signifikant hæmning af tumorvæksten og delvis regression af tumorer. Overraskende har hybridinterferonerne en bedre antiproliferativ virkning end staminter-feroner a-2 og a-3 samt i forhold til hybridinterferoner 15 "BXB2D3D4" og ^^26384-.

De omhandlede hybridinterferoners antivirale og antiproliferative egenskaber gør dem nyttige til behandling af virusinfektioner, såsom influenza eller andre luftvej svirusinfektioner, herpesvirusinfektioner, rabies- og 20 hepatitisinfektion samt neoplastiske sygdomme, såsom melanoma, nyrecancer og hårcelleleukæmi, hos dyr og mennesker, eventuelt i kombination med andre antivirale midler eller antitumormidler, fortrinsvis i form af farmaceutiske præparater, som indeholder en terapeutisk 25 effektiv mængde af den aktive bestanddel, eventuelt sammen med eller i blanding med uorganiske eller organiske, faste eller flydende, farmaceutisk acceptable bærestoffer, som fortrinsvis er egnede til parenteral indgift.

Parenterale præparater er især injektionsvæsker, som er 30 virksomme på forskellig måde, f.eks. ved intravenøs, intramuskulær, intraperitoneal, intranasal, intradermal eller subkutan indgift. Sådanne væsker er fortrinsvis isotoniske vandige opløsninger eller suspensioner, som kan fremstilles inden brugen, f.eks. ud fra lyofiliserede 35 præparater, som indeholder den aktive bestanddel alene eller sammen med et farmaceutisk acceptabelt bærestof. De DK 168794 B1 27 farmaceutiske præparater kan være steriliserede og/eller indeholde hjælpestoffer, f.eks. konserveringsmidler, stabiliseringsmidler, fugtemidler og/eller emulgerings-5 midler, opløselighedsfremmende stoffer, salte til regulering af det osmotiske tryk og/eller puffere. De farmaceutiske præparater ifølge opfindelsen, der om ønsket kan indeholde andre farmakologisk værdifulde stoffer, fremstilles på i og for sig kendt måde, f.eks. ved hjælp af 10 konventionelle opløsnings- eller lyofiliseringsfrem-gangsmåder, og de indeholder fra ca. 0,1 til 100%, især fra ca. 1 til ca. 50%, i tilfælde af lyofilisater op til 100% af den aktive bestanddel. Det er bemærkelsesværdigt, at hybridinterferonerne ifølge opfindelsen, såsom 15 ,,BiD2D3D4", kan lyofiliseres og genopløses uden noget som helst virkningstab. I modsætning hertil giver lyofilise-rede præparater af staminterferonerne a-2 og a-3 uklare opløsninger med en udtalt formindskelse af virkningen. Sidstnævnte interferoner kan derfor kun opbevares i form 20 af pufrede opløsninger.

Indgiftsmåden og dosis vælges i hvert enkelt tilfælde af en læge under hensyntagen til patientens specielle forhold, den pågældende sygdom og sygdomstilstanden. Eksempelvis behandles virusinfektioner sædvanligvis med en 25 daglig dosis eller to daglige doser fra nogle få dage op til nogle få uger, hvorimod behandling af neoplasmer typisk omfatter en daglig eller flere daglige doser i et tidsrum på fra uger til måneder. Der kan anvendes den samme daglige dosiskoncentration, som anvendes ved 30 konventionel interferonterapi, dvs. ca. 10^ til 10? enheder.

Monoklonale antistoffer for interferonhybriderne

Det er desuden formålet med opfindelsen at tilvejebringe et hidtil ukendt monoklonalt antistof mod IFN-α med høj 35 affinitet til adskillige undertyper af IFN-α, herunder DK 168794 B1 28 IFNa-hybrider, og lav affinitet til andre undertyper af IFN-α, samt hybridoms aceller, som udskiller det mono-klonale antistof.

5 Det hidtil ukendte monoklonale antistof er ejendommeligt ved, at det har en høj affinitet til IFNa/B, D, F og beslægtede undertyper, jævnfør D.V. Goeddel et al.. Nature 290, 20 (1981), samt hybrider af disse undertyper, især hybridinterferonerne ifølge opfindelsen, men lav affinitet 10 til f.eks. IFNa/A-undertype.

Det monoklonale antistof har betegnelsen 144 BS. Dette monoklonale antistof udskilles af hybridomacellelinien med betegnelsen 144 BS 22-6-19. Derivater af dette monoklonale antistof er f.eks. antistoffragmenter, radioaktivt mærkede 15 monoklonale antistoffer og konjugater af det monoklonale antistof med enzymer eller lignende.

Fragmenter af det monoklonale antistof ifølge opfindelsen er f.eks. Fab-, Fab'- eller F(ab'^-fragmenter, som bibeholder deres specificitet for de antigene determi-20 nanter, dvs. som bevarer det karakteristiske bindingsmønster for det monoklonale stamantistof til human IFNa og IFNa-hybridundertyper.

Radioaktivt mærkede monoklonale antistoffer indeholder f.eks. radioaktivt iod (123^ 125jr 131j)r radioaktivt 25 carbon (^C), radioaktivt svovl (35s), radioaktivt tritium (3h) eller lignende. Der foretrækkes monoklonale antistoffer mærket med radioaktivt iod.

Antistofkonjugater er eksempelvis konjugater af det monoklonale antistof eller fragmenter deraf med enzymer, 30 såsom peberodsperoxidase, alkalisk phosphase, (S-D-galacto-sidase, glucoseoxidase, glucoamylase, carboanhydrase, acetylcholinesterase, lysozym, malatdehydrogenase eller glucose-6-phosphatdehydrogenase, eller med avidin eller DK 168794 B1 29 biotin. I sådanne konjugater er antistoffet bundet direkte ti enzymet eller ved hjælp af en såkaldt "spacer"- eller "linker"-gruppe. Der foretrækkes konjugater af det 5 monoklonale antistof med enzymerne peberrodsperoxidase eller alkalisk phosphatase.

Det monoklonale antistof ifølge opfindelsen er karakteriseret ved dets bindingsevne til polypeptider, som hører til forskellige undertyper af human IFNa. Bindingsevnen 10 bestemmes f.eks. ved den såkaldte kombinerede immuno-precipiteringsbioanalyse som beskrevet af S.S. Alkan et al. i "Protides of the biological fluids", udgiver H. Peeters, Pergamon Press, bind 30, side 495-498 (1983).

Ved denne analyse inkuberes en IFNa-holdig opløsning med 15 det monoklonale antistof, som skal testes, de bundne og ikke-bundne monoklonale antistoffer fældes ved tilsætning af et polyklonalt serum, som binder alle de testede antistoffer, immunbundfaldet isoleres og genopløses i sur opløsning, og det derved frigjorte IFNa bestemmes ved en 20 klassisk bioanalyse baseret på den antivirale virkning af IFNa.

Det er overraskende, at det monoklonale antistof ifølge opfindelsen har stærk binding til IFNa-undertyper B, D, F og til hybrider deraf, også i IFNa-undertyper C og J, men 25 har lav affinitet til IFNa-undertype A, som er en undertype, der bindes af alle andre kendte monoklonale antistoffer, der genkender mere end tre IFNa-undertyper, dvs. antistoffer med bred undertypegenkendelse, såsom det monoklonale antistof NK2, jævnfør D. Secher et al., Nature 30 285, 446 (1980), de monoklonale antistoffer EBI-1, 2 og 3 beskrevet i europæisk patentansøgning nr. 119.476 eller det monoklonale antistof LO-22 beskrevet i patentansøgning WO 84/03106.

Sammenlignet med det monoklonale antistof YOK beskrevet i 35 patentansøgning WO 84/03105, der er specifik for IFNa- DK 168794 B1 30 undertype D, udviser det monoklonale antistof ifølge opfindelsen en overraskende bred specificitet, især mod IFNa-undertyper B og F, som ikke bindes af antistoffet 5 YOK.

Det monoklonale antistof ifølge opfindelsen med betegnelsen 144 BS hører til immunoglobulinklassen IgGiK (Kappa) bestemt ved velkendte fremgangsmåder, f.eks. immunodiffusionsouchterlonyteknikken under anvendelse af 10 klassespecifikt andet antistof.

Det monoklonale antistof ifølge opfindelsen og derivater deraf fremstilles ved anvendelse af i og for sig kendte fremgangsmåder karakteriseret ved, at hybridomacellelinien 144 BS 22-6-19 15 a) dyrkes in vitro, og det monoklonale antistof isoleres fra kultursupernatanten, eller b) propageres in vivo i et egnet pattedyr, og det monoklonale antistof udvindes fra pattedyrets legemsvæsker, og, om ønsket, 20 c) det opnåede monoklonale antistof omdannes til et derivat deraf.

Egnede dyrkningsmedier til in vitro-dyrkningen ifølge fremgangsmåde a) er standarddyrkningsmedier, såsom Dulbecco's Modified Eagle Medium eller RPMI 1640 Medium, 25 eventuelt suppleret med pattedyrserum, f.eks. føtalt kalveserum. Isoleringen af det monoklonale antistof gennemføres ved fældning af proteinet indeholdt i kul-tursupernatanterne med ammoniumsulfat eller lignende, hvorpå immunoglobulinet renses ved anvendelse af kroma-30 tografiske standardmetoder, såsom gelfiltrering, ion-bytterkromatografi, kromatografi på DEAE-cellulose eller immunoaffinitetskromatografi.

Der kan opnås store mængder af det ønskede monoklonale antistof ved propageringen af hybridomacellelinien ifølge DK 168794 B1 31 fremgangsmåde b). Cellekloner Injiceres til syngeniske pattedyr, hvilket fremkalder vækst af antistofproducerende tumorer. Efter en til tre ugers forløb udvindes det øn-5 skede monoklonale antistof fra pattedyrenes legemsvæsker. Eksempelvis foretages intraperitoneal injektion af hybri-domacellelinien, som er udvundet fra Balb/c-mus, i Balb/c-mus, som eventuelt er forbehandlet med et carbonhydrid, såsom pristan, og efter en eller to ugers forløb opsamles 10 ascitesvæske fra disse mus. Det monoklonale antistof isoleres fra legemsvæskerne på i og for sig kendt måde, f.eks. ved fældning af proteinet med ammoniumsulfat eller lignende, hvorefter immunoglobulinet renses ved anvendelse af kromatografiske standardmetoder, f.eks. gelfiltrering, 15 ionbytterkromatografi, kromatografi på DEAE-cellulose eller immunoaffinitetskromatografi.

Fragmenter af det monoklonale antistof, f.eks. Fab-, Fab'-eller F(ab’^-fragmenter, som bibeholder deres specificitet over for antigene determinanter af IFNa-under-20 typerne, kan fremstilles ud fra det monoklonale antistof fremstillet ifølge fremgangsmåde a) eller b) på i og for sig kendt måde, f.eks. ved nedbrydning med enzymer, såsom pepsin eller papain og/eller spaltning af disulfidbin-dinger ved kemisk reduktion. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Monoklonale antistoffer mærket med radioaktivt iod frem 2 stilles ved anvendelse af kendte ioderingsfremgangsmåder, 3 f.eks. ved mærkning af det monoklonale antistof med 4 radioaktivt natrium- eller kaliumiodid og et kemisk 5

oxidationsmiddel, såsom natriumhypochlorit, chloramin T

6 eller lignende, eller et enzymatisk oxidationsmiddel, 7 såsom lactoperoxidase, glucoseoxidase og glucose. Radio 8 aktivt mærkede monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen 9 kan også fremstilles ved at sætte radioaktivt mærkede 10 næringsstoffer til dyrkningsmediet, som anvendes ved in 11 vitro-dyrkningen i trin a). Sådanne mærkede næringsstoffer indeholder f.eks. radioaktivt carbon (14C), radioaktivt DK 168794 B1 32 tritium (3H), radiaktivt svovl (1S) eller lignende og kan eksempelvis være L-(14C)-leucin, L-(3H)-leucin eller L-(3^S)-methionin.

5 Konjugater af de monoklonale antistoffer fremstilles under anvendelse af kendte fremgangsmåder, f.eks. ved at omsætte det monoklonale antistof fremstillet ifølge fremgangsmåde a) eller b) eller et fragment deraf fremstillet som beskrevet ovenfor med et enzym i 10 nærværelse af et koblingsmiddel, f.eks. glutaraldehyd, periodat, N,N,-o-phenylendimaleimid, N-(m-maleimido-benzoyloxy)-succinimid, N-(3-(2 *-pyridyldithio)-propion- oxy)-succinimid, N-ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)- carbodiimid eller lignende. Konjugater med avidin 15 fremstilles på tilsvarende måde. Konjugater med biotin fremstilles f.eks. ved omsætning af det monoklonale antistof med en aktiveret ester af biotin, såsom biotin-N-hydroxysuccinimidesteren.

Hybridomacellelinien med betegnelsen 144 BS 22-6-19 er 20 deponeret den 14. marts 1985 i "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes", Institut Pasteur, Paris, under deponeringsnummeret 1-424. Denne hybridomacelle-linie er en hybrid af musemyelomacellelinien Sp2/0-Agl4 og af en B lymfocyt fra milten af en Balb/c-mus 25 immuniseret med naturligt human IFNa. Den er en stabil cellelinie, som udskiller det monoklonale antistof med betegnelsen 144 BS. Cellelinien kan opbevares i kultur eller dybfryses i flydende nitrogen eller genaktiveres ved optøning. 2 3 4 5 6 7 2

Hybridomacellelinien, som udskiller det monoklonale 3 antistof 144 BS, kan fremstilles ved, at Balb/c-mus 4 immuniseres med et naturligt humant IFNa, antistof 5 producerende miltceller fra musen sammensmeltes med celler 6 af myelomacellelinien Sp2/0-Agl4, de ved sammensmelt- 7 ningen dannede hybridceller klones, og en celleklon, som DK 168794 B1 33 udskiller det ønskede antistof udvælges.

Immuniseringen af musene gennemføres f.eks. ved injektion af naturlig human IFNa 2-4 gange parenteralt, såsom intra-5 peritonealt og/eller subkutant, med intervaller på 10 til 40 dage i mængder på fra ca. 10^ IE til ca. 10^ IE. Injektionsvæskerne indeholder eventuelt et adjuvans, som stimulerer lymfocytproduktionen, såsom komplet eller ukomplet Freund's adjuvans.

10 Antistofproducerende miltceller udtages to til fem dage efter den afsluttende "booster"-injektion, og de fusioneres med myelomacellelinien Sp2/0-Agl4 i nærværelse af en fusionspromotor. Anvendelige fusionspromotorer er f.eks. Sendai-virus eller andre paramyxovira, eventuelt på 15 UV-inaktiveret form, calciumioner, overfladeaktive lipi-der, såsom lysolecithin, eller polyethylenglycol. Fortrinsvis fusioneres myelomacellerne med et 3-20 gange så stort overskud af miltceller fra immuniserede mus i en opløsning, som indeholder fra ca. 30 til ca. 60% poly-20 ethylenglycol med en molekylvægt på 1000-4000.

Efter fusionen resuspenderes cellerne og dyrkes i selektivt HAT-medium. På denne måde overlever kun hybridoma-celler, da de kombinerer evnen til vækst og formering in vitro, arvet fra myelomacellerne med de manglende HGPRT-25 eller TK-gener, som er nødvendige for overlevelsen i HAT-mediet, arvet fra de anstistofproducerende miltceller fra de immuniserede mus.

Egnede dyrkningsmedier til formeringen af hybridoma-cellerne er standarddyrkningsmedier, såsom Dulbecco's 30 Modified Eagle Medium, minimum essential medium, RPMI 1640 medium og lignende medier, eventuelt tilsat serum, f.eks.

10-15% føtalt kalveserum. Fortrinsvis tilsættes fødeceller ved begyndelsen af cellevæksten, f.eks. normale perito-neale exsudatceller fra mus, miltceller, knoglemarvsmakro- DK 168794 B1 34 fager eller lignende. Dyrkningsmedierne tilsættes selektivt HAT-medium med regelmæssige mellemrum for at forhindre, at normale myelomaceller overvokser hybridomaceller-5 ne.

Supernatanterne fra hybridomacellekulturerne screenes for det ønskede monoklonale antistof, fortrinsvis ved hjælp af en kombineret immunoprecipitationsbioanalyse eller en radioimmunoanalyse. Positive hybridomaceller klones, 10 f.eks. ved begrænsningsfortynding, fortrinsvis to eller flere gange. De klonede cellelinier kan fryses på konventionel måde.

Det monoklonale antistof og/eller dets derivater er nyttige til den kvalitative og kvantitative bestemmelse 15 og/eller rensning af humane IFNa-undertyper fra naturlige kilder eller fremstillet ved hjælp af rekombinant DNA teknik og af humanhybrid IFNs, især sådanne, som er omfattet af den foreliggende opfindelse.

Det monoklonale antistof eller et derivat deraf, såsom et 20 enzymkonjugat eller et radioaktivt derivat, kan anvendes til en hvilken som helst af de kendte immunoanalyser, som er baseret på den gensidige bindingsvirkning mellem den antigene determinant, f.eks. af et polypeptid med IFNa aktivitet, og det monoklonale antistof. Som eksempler på 25 sådanne analyser kan nævnes radioimmunoanalyser, enzym-immunoanalyser, immunofluorescensanalyser, latexaggluti-nationsanalyser og hemagglutinationsanalyser. Sådanne immunoanalyser er nyttige f.eks. til måling af fremstillingen og rensningen af IFNa fra naturlige kilder 30 eller fra gensplejsede mikroorganismer og af hybrid IFNa proteiner samt til den kvalitative og kvantitative bestemmelse af IFNa og hybrid IFNa i biologiske væsker, f.eks. fra patienter, som behandles med IFNa, eller som har behov for en sådan behandling.

DK 168794 B1 35

Det monoklonale antistof kan anvendes som sådant eller i form af et radioaktivt mærket derivat ved en radio-immunoanalyse (RIA). Der kan anvendes en vilkårlig af de 5 kendte modifikationer af en RIA, f.eks. en RIA i homogen fase, RIA i fast fase eller heterogen RIA, enkelt RIA eller dobbelt (sandwich) RIA med direkte eller indirekte (kompetitiv) bestemmelse af IFNa. Der foretrækkes en sandwich RIA, hvori en egnet bærer, f.eks. plastoverfladen 10 af en mikrotiterplade eller af et reagensglas, feks. af polystyren, polypropylen eller polyvinylchlorid, gas eller plastperler, filtrerpapir eller dextran, cellulose-acetat eller nitrocelluloseplader eller lignende, overtrækkes med et monoklonalt antistof, som er specifikt 15 for en I FNa-under type, ved simpel adsorption eller eventuelt efter aktivering af bærerén, f.eks. med glutaraldehyd eller cyanbromid, hvorpå der inkuberes med testopløsningen og en opløsning af et monoklonalt antistof, som er radioaktivt mærket med *25χt <3et opløste 20 monoklonale antistof, som genkender en anden epitop af IFNa-undertypen end det bærebundne monoklonale antistof, og mængden af IFNa eller hybrid IFNa bestemmes ved måling af radioaktiviteten bundet til bæreren. En sådan fore-trukken radioimmunoanalyse er enten det bærerbundne anti-25 stof eller det radioaktivt mærkede antistof det monoklonale antistof eller et derivat deraf som beskrevet ovenfor, idet det andet antistof er et monoklonalt antistof mod IFNa, som falder uden for omfanget af den foreliggende opfindelse, eller et polyklonalt antistof, 30 eventuelt i form af et radioaktivt mærket derivat.

Især foretrækkes en sandwichradioimmunoanalyse som beskrevet ovenfor, hvor det monoklonale antistof er bundet til en perle, f.eks. en polystyrenperle, hvorpå den overtrukne perle inkuberes ved en test med standard-35 opløsning indeholdende IFNa eller hybrid IFNa og til sidst fremkaldes med et radioaktivt mærket monoklonalt antistof, som genkender en anden IFNa epitop.

DK 168794 B1 36 I fig. 4 og 5 angives radioaktiviteten bundet til bærerperlen som funktion af mængden af IFNa-2-polypeptid, som hører til IFNa/B-undertypen, i en forsøgsopløsning, som 5 kan måles med en sandwich RIA, der beskrives mere detaljeret i beskrivelsens specielle del. Følsomheden af RIA'en muliggør en hurtig, pålidelig og kvantitativ bestemmelse af 150-5000 IE/ml af IFN-a-2-undertype eller så lidt som IE/ml af IFN-a-2-undertype, hvis der vælges en mere 10 tidsrøvende metode. Lignende resultater opnås ved en sandwich RIA til påvisning af polypeptider, som hører til andre IFNa-undertyper, f.eks. IFNa/D-undertype eller IFNa-F-undertype, og især af hybridinterferonerne ifølge opfindelsen.

15 Det monoklonale antistof kan anvendes som sådant eller i form af et enzymkonjugeret derivat i en enzymimmuno-analyse. Sådanne immunoanalyser omfatter testmetoder, ved hvilke der anvendes et enzymmærket monoklonalt antistof-derivat ifølge opfindelsen, i og for sig kendte enzym-20 mærkede antistoffer, som genkender og binder epitoperne i anti-IFNa-antistoffet ifølge opfindelsen eller andre anti-IFNa-antistoffer.

Der foretrækkes en ELISA (enzymbundet immunoadsorbent analyse), hvori et bærestof som beskrevet ovenfor for et 25 RIA overtrækkes med det monoklonale antistof ifølge opfindelsen, inkuberes med en forsøgsopløsning indeholdende IFNa og derpå med et polyklonalt serum til IFNa, f.eks. fåreserum, hvorpå til sidst de bundne antistoffer fra det polyklonale serum fremkaldes ved hjælp af enzym-30 mærkede antistoffer, som genkender dem og binder sig til dem, og mængden af det bundne IFNa fastlægges ved en enzymsubstratreaktion. Et sådant enzymmærket antistof er f.eks. en phosphatase-mærket ged-anti-får-immunoglobulin.

Der foretrækkes endvidere en ELISA, hvori en bærer over-35 trukket med monoklonalt antistof, som er specifikt for en DK 168794 Bt 37 IFNa-undertype, inkuberes med en forsøgsopløsning indeholdende IFNa og med en opløsning af et monoklonalt antistof, som er konjugeret med et enzym, idet det opløste 5 monoklonale antistof genkender en anden epitop af IFNa-undertypen end det er tilfældet med det bærerbundne monoklonale antistof. Ved en enzymsubstratreaktion som eksempelvis fremkalder en farveændring, og som kan iagttages med det blotte øje eller med optiske måleinstrumen-10 ter, kan man måle mængden af bundet enzym, som er proportional med mængden af IFNa eller IFNa hybrid-undertype i forsøgsopløsningen.

Især foretrækkes en enzymimmunoanalyse, der kaldes immuno-prikanalyse, ved hvilken analyse- eller standardopløs-15 ninger indeholdende IFNa eller hybrid IFNor afsættes i form af pletter på en mikroporøs bærer med høj indre affinitet til polypeptider, f.eks. nitrocellulose, hvorpå bæreren indeholdende en eller flere prikker af de iFNa-holdige prøver, inkuberes i en opløsning af det omhandlede mono-20 klonale antistof, derpå i en opløsning af et enzymmærket andet antistof, som genkender og binder det omhandlede monoklonale antistof, og til sidst i en opløsning af et enzymsubstrat, som fører til et påviseligt signal, f.eks. et farvet stof. Et sådant enzymmærket andet antistof er 25 f.eks. kaninantimuseinununoglobulin konjugeret med peberrodsperoxidase, som kan fremkaldes med et egnet enzymsubstrat, såsom 4-chlor-l-naphthol eller lignende.

Anvendelsen ifølge opfindelsen af det monoklonale antistof og derivater deraf som beskrevet ovenfor til den kvalita-30 tive og kvantitative bestemmelse af IFNa-undertyper eller hybrid IFNa omfatter også andre i og for sig kendte immunoanalyser, feks. immunofluorescenstests, hvor der anvendes antistofkonjugater eller antigenkonjugater med fluorescerende stoffer, latexagglutination med antistof-35 overtrukne eller antigenovertrukne latexpartikler eller hemagglutination med antistofovertrukne eller antigen- DK 168794 B1 38 overtruken røde blodlegemer eller lignende.

Testudstyr til den kvalitative og kvantitative bestemmelse af IFNa-undertyper og hybrid IFNa ifølge opfin-5 delsen indeholdende det monoklonale antistof 144 BS og/eller et derivat deraf, og eventuelt, andre monoklonale eller polyklonale antistoffer over for human IFNa og/eller hj ælpestoffer.

Testudstyr til en radioimmunoanalyse indeholder f.eks. en 10 egnet bærer, som ikke er overtrukket eller overtrukket med et monoklonalt antifstof over for IFNa, eventuelt frysetørrede eller koncentrerede opløsninger af et monoklonalt eller polyklonalt antistof mod IFNa og/eller et radioaktivt mærket derivat deraf, hvor mindst én af de mono-15 klonale antistoffer overtrukket på bæreren i opløsning eller i radioaktiv mærket form er det omhandlede monoklonale antistof, standardopløsninger af human IFNa, pufferopløsninger og, eventuelt, polypeptider og detergenter til forebyggelse af ikke-specifik adsorption 20 og aggregatdannelse, pipetter, reaktionsbeholdere, justeringskurver og lignende.

Testudstyr til en enzymimmunoanalyse indeholder f.eks. en egnet bærer, eventuelle frysetørrede eller koncentrerede opløsninger af et monoklonalt og/eller et polyklonalt 25 antistof mod IFNa og af et enzymmærket monoklonalt eller polyklonalt antistof mod IFNa eller mod et første antistof, som genkender IFNa, hvori mindst enten det monoklonale antistof mod IFNa eller det enzymmærkede antistofderivat mod IFNa er det omhandlede monoklonale 30 antistof eller et derivat deraf, enzymsubstrater på fast eller opløst form, standardopløsninger af human IFNa, pufferopløsninger og eventuelt polypeptider og detergenter, pipetter, reaktionsbeholdere, kalibreringskurver, farveskalakort og lignende.

DK 168794 B1 39 IFNa fra naturlige kilder eller IFNa-undertyper eller polypeptider beslægtet med IFNa, såsom hybridinterfe-ronpolypeptiderne ifølge opfindelsen, kan renses ved 5 immunoaffinitetskromatografi ved hjælp af det omhandlede monoklonale antistof. Det monoklonale antistof eller et fragment deraf bindes til en egnet bærer af organisk eller uorganisk natur, såsom tværbundet agarose, dextran eller polyacrylamid på passende funktionaliseret form, eventuelt 10 efter aktivering, under anvendelse af i og for sig almene kendte metoder. Eksempelvis suspenderes en bærer, som indeholder aktiverede esterfunktioner i en vandig pufferopløsning, som blandes med en opløsning af det monoklonale antistof eller et fragment deraf, hvorpå blandingen 15 filtreres, resuspenderes og vaskes til fjernelse af overskud af monoklonalt antistof, hvorpå der foretages behandling med en opløsning af irrelevante proteiner for at blokere frie reaktionsdygtige stillinger på bæreren. Denne antistofbelagte bærer anvendes til selektiv binding af 20 humane IFNa-undertyper, f.eks. IFNa/B-, IFNa/D- og IFNa/F-undertyper og beslægtede polypeptider, såsom hybridinter-feronpolypeptiderne ifølge opfindelsen, på glycosyleret eller ikke-glycosyleret form. Til dette formål suspenderes bærematerialet i et egnet vandigt opløsningsmiddel, f.eks.

25 en saltopløsning, såsom natriumchloridopløsning, eller en pufferopløsning, såsom phosphatpufret natriumchloridopløsning, NaHC03~opløsning eller 3-(N-morpholino)-propansulfonsyreopløsning, hvorpå opløsningen bringes i kontakt med opløsningen indeholdende IFNa, f.eks. sættes 30 til en kromatografisøjle, hvorpå opløsningen indeholdende IFNa tilsættes og pumpes gennem bærematerialet, om ønsket under tryk. Ikke-bundne proteiner og andre urenheder bortvaskes med vandige opløsninger, f.eks. pufferopløsninger i et pH-område fra ca. 5 til ca. 9 og/eller 35 saltopløsninger, f.eks. natriumchloridopløsning. Det IFNa, som er bundet til antistoffet på bærematerialet, elueres med egnede vandige opløsninger, f.eks. pufferopløsninger i et pH-område fra ca. 2 til ca. 5, såsom glycinpuffer eller DK 168794 B1 40 ci trinsyre, eller pH-gradienter med forskellig sammen-sætning eller saltopløsninger, f.eks. koncentreret NH4SCN-opløsning. Eluatet, som indeholder IFNa, neutra-5 liseres eventuelt, og det rensede IFNa isoleres derfra på kendt måde.

Opfindelsen forklares nærmere i de efterfølgende eksempler, hvor der anvendes følgende forkortelser: DDT 1,4-dithiothreitol 10 TNE opløsning indeholdende 50 mM Tris*Hel

pH 7,5, 100 mM NaCl, 2 mM EDTA

Tri s tri s - (hydroxymethyl) - aminome than EDTA ethylendiamintetraeddikesyre TE opløsning indeholdende 10 mM tris,

15 50 μΜ EDTA

N-medium medium indeholdende bacto-trypton (10 g,

Difco), gærekstrakt (1 g, Difco), glucose (1 g), NaCl (8 g),

CaCl2*2H20 (249 mg) pr. liter opløsning 20 TBE opløsning indeholdende 89 mM tris, 89 mM bor syre, 2 mM EDTA BSA kvægserumalbumin HAT hypoxanthin/aminopterin/thymidin

Ig immunoglobulin 25 IE internationale enheder (af interferon aktivet ) MAb monoklonalt antistof PBS phosphatpufret saltopløsning SDS-PAGE natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgel- 30 elektroforese

Del I: Dannelse og kloning af interferon g-2/a-3-hybrider i Escherichia coli

Alle de i det følgende beskrevne hybridinterferonprotein-kodningssekvenser er operativt bundet til β-lactamase- DK 168794 B1 41 promotoren, klonet 1 et ekspressionspiasmid afledt af pBR322 og transformeret til E.coli HB101.

Eksempel 1 5 Dannelse af PvuII resistente vektorer bærende DNA sekvenser af de lymphoblastoide IFNs ct-2 og a-3 pBR322 skæres med PvuII (Biolabs), og det lineære DNA ligateres til en [ 32P ]-BclI-linker [ d(ATGTGTGATCACACAT) fremstillet ved hjælp af fastfasephosphotriestermetoden, 10 jævnfør H. Rink et al.. Nucleic Acids Research 12, 6369 (1984) ] på følgende måde:

Det begrænsede plasmid DNA (1 μgr ca. 0,7 pmol ender) ligateres til 32P-mærket BClI-linker DNA (ca. 40 pmol ender) i et reaktionsrumfang på 50 μΐ indeholdende 20 mM 15 Tris-Hcl pH 7,8, 10 mM MgCl2/ 10 mM DTT, 0,5 mM rATP og 40 Ε/μ1 T4 DNA ligase (Biolabs). Efter 2-3 timers inku-bering ved 15°C ekstraheres den vandige fase med et tilsvarende rumfang phenol/chloroform, og DNA'et fældes ved tilsætning af 1/9 rumfang 10 x TNE, 2,5 rumfang ethanol og 20 henstand natten over ved -20°C. DNA kuglen resuspenderes i 50 μΐ TE pH 8,0, og der centrifugeres gennem en 5-23% saccharosegradient (50 mM Tris-HCl pH 8,0/1 mM EDTA) i en Kontron TST 60 rotor i 4 timer ved 58000 omdrejninger pr. minut og 15°C. Gradienten fraktioneres fra top til bund, 25 og radioaktiviteten måles i hver fraktion ved Cerenkov tælling. Interessante fraktioner hældes sammen, og DNA’et fældes med TNE og ethanol. DNA kuglen resuspenderes i restriktionspuffer og spaltes med BC1I, hvorpå der igen fældes efter ekstraktion af den vandige fase med phenol/ 30 chloroform. Dette lineære DNA bringes derpå atter på cirkelform ved en koncentration på 5 pg/ml under betingelser, som er identiske roed de betingelser, der er beskrevet for 1inker-ligateringen.

DK 168794 Bl 42

Det ligaterede DNA skæres med enzymerne Hindlll, PvuII (til fjernelse af resterende intakt pBR322) og PstI, og det Hindlll-PstI fragment (3600 bp + linker) indeholdende 5 replikationsudgangspunktet og ampR genet isoleres ved saccharosegradientcentrifugering.

Hindlll-PstI inserter fra CG-pBR(AP)/LyIFN-a-2 (1160 bp) og fra CG-pBR(AP)/LyIFN-a-3 (1020 bp) (europæisk patentansøgning nr. 76.489) opnået ved saccharosegradient-10 centrifugering ligateres hver for sig til det ovenfor fremstillede DNA, hvorved der fås plasmider pAM4 og pAM2, som indeholder henholdsvis LyIFN-a-2- og LyIFN-G!-3-kod-ningsområderne, under kontrol af Ø-lactamasepromotoren.

Ligateret DNA anvendes direkte til transformering af 15 kompetente E. coli celler på følgende måde: DNA ligateringsblandingen (eller dele deraf) overføres til 150 μΐ 15 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM CaCl2, 10 mM MgCl2, 10 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, og der tilsættes 50 μΐ af den CaCl2-behandlede recipient E. coli HB101. Blandingen holdes ved 20 0°C i 20 minutter, hvorpå den opvarmes til 42°C i 2 minut ter, og efter afkøling til stuetemperatur tilsættes 1 ml N-medium. Inkuberingen fortsættes ved 37°C i 1 time (rystebord, 250 omdrejninger pr. minut), hvorefter 600 μλ anbringes på plader af McConkey-agar (Difco) indeholdende 25 tetracyclin (10 jig/ml). Petriskålene inkuberes ved 37°C i 16-18 timer, når der kan iagttages bakteriekolonier.

Plasmid DNA udvindes fra transformanterne på følgende måde: 10 ml N-medium indeholdende tetracyclin (10 jig/ml) inokuleres med en transformantkoloni, og de enkelte kul-30 turer omrystes ved 37°C (rystebord, 150-300 omdrejninger pr. minut), indtil der opnås en optisk tæthed på 0,9-1,1 (650 nm). Cellerne høstes og resuspenderes i et lige så stort rumfang N-medium, som indeholder tetracyclin (10 /ig/ml) og chloramphenicol (80 ftg/ml). Inkuberingen 35 fortsættes ved 37°C i yderligere 18 timer til forøgelse af DK 168794 B1 43 antallet af plasmidkopier pr. celle. Bakterierne høstes, og bakteriekuglen resuspenderes i 50 mM Tris-HCl pH 8 (10 ml pr. gram våd cellevægt), og der tilsættes lysozym 5 (Sigma) til en slutkoncentration på 2 mg/ml. Efter 10 minutter ved 0°C indstilles opløsningen på 50 mM EDTA, efter 10 minutter ved 0°C tilsættes Triton X 100 til en slutkoncentration på 0,8%, og det udfældede materiale henstår ved 0°C i 1 time, hvorpå der centrifugeres i en 10 Sorvall SS-34 rotor i 30 minutter ved 18000 omdrejninger pr. minut. Efter ekstraktion af den klare supernatant med phenol efterfulgt af to ekstraktioner med chloroform tilsættes RNase A (Sigma) til en slutkoncentration på 256 μg/ml, og opløsningen inkuberes ved 37°C i 1 time. Til 15 fjernelse af RNA tilsættes NaCl (slutkoncentration 1 M) og polyethylenglycol 6000 (slutkoncentration 7,5%), og præparatet opbevares ved -10°C i 2 timer, hvorefter der centrifugeres i 10 minutter ved 10000 omdrejninger pr. minut og 0°C i en Sorvall SS-34 rotor. Kuglerne resuspen-20 deres i 200 μΐ TNE, hvorpå der atter ekstraheres med phenol/chloroform (1:1) inden genfældning (ved tilsætning af 500 μΐ ethanol, 5 minutter ved -80°C, 10 minutter i Eppendorf centrifuge). DNA kuglerne resuspenderes i 20-40 μΐ TE. Typiske udbytter opnået på denne måde er ca.

25 20 μg plasmid DNA.

De fremstillede plasmid DNA'er (pAM4 og pAM2) underkastes restriktionsenzymanalyse, som bekræfter strukturen af pAM4 og pAM2.

Eksempel 2 30 Eliminering af det 3' ekstracistroniske PvuII sted fra PAM4

Til forskel fra pAM2 (a-3), indeholder pAM4 (a-2) stadig to PvuII steder, jævnfør fig. 3. For at lette dannelsen af hybrid IFN gener ved PvuII stedet i IFN kodningsområdet, DK 168794 B1 44 elimineres det andet PvuII sted i det ekstracistroniske område.

Denne modifikation af plasmid ρΆΜ4 er i alt væsentligt en 5 sletning af den 3' ekstracistroniske IFN a-2 cDNA sekvens mellem PstI og det 3' ekstracistroniske PvuII sted, jævnfør fig. 3. pAM4 spaltes partielt med PvuII [ 5 jig pAM4 i 50 mM NaCl, 6 mM MgCl2, 6 mM 2-mercaptoethanol, 10 mM Tris*HCl pH 7,5, 1 Ε/μς PvuII (Biolabs) tilsættes, spalt-10 ning i 5 minutter ved 37°C, som afbrydes ved phenol-ekstraktion] og ligateres til [32p ]-pstI linker (Collaborative Research, fremgangsmåde som beskrevet i eksempel 1). DNA blandingen transformeres til E. coli HB101 som ovenfor og piasmiderne fra 16 kolonier screenes ved 15 restriktionsenzymanalyse under anvendelse af PstI, PvuII og Hindlll for tilstedeværelse af en sletning med den korrekte størrelse (246 bp). Blandt de 16 screenede kolonier er tre ikke-modificerede pAM4, én er en multimer, fem har en stor sletning (620 bp) og syv bærer den ønskede 20 lille sletning (246 bp). En klon med en afkortet IFN a-2 insert (Hindlll-PstI lille fragment nu 907 bp) udvælges og betegnes pAM21.

Eksempel 3

Dannelse af Pvu hybrider med overkrydsningssteder ved 25 aminosyre 92

Plasmider pAM2 (a-3) og pAM21 (a-2) skæres hver for sig med HinduI og PvuII, hvilket bevirker en afskæring af DNA fragmenter (521 bp), som indeholder β-lactamasepromotorsekvenserne og de N-terminale halvdele af IFN generne (som 30 koder for aminosyrer 1-92). De store og små fragmenter (henholdsvis ca. 4Kb og 521 bp) adskilles ved saccharosegradientcentrifugering, og de store fragmenter dephosphoryleres ved behandling med 1 Mg DNA fragmenter i 50 μΐ 50 mM Tris pH 8 med 1 enhed alkalisk kalvephosphata- DK 168794 B1 45 se pr. 10 pmol 5' ender i 30 minutter ved 37°C. Hybrid IFN "BiB2D3D4" og "D1D2B3B4" gener dannes ved ligatering af de egnede store og små DNA fragmenter beskrevet ovenfor 5 [stort Hindlll-PvuII fragment (~ 4Kb) fra pAM2 ligateres til lille Hindlll-PvuII fragment(521 bp) fra pAM21 resulterer i type B1B2D3D4 I FN, osv. ]. Ligateringen gennemføres i rumfang på 10 /il, som indeholder 20 mM Tris*HCl pH 7,8, 10 mM MgCl2, 10mM DTT, 0,5 mM rATP, 40Ε/μ1 T4 DNA 10 ligase (Biolabs) og ca. 500 ng store DNA fragmenter og 20-40 ng små DNA fragmenter. Efter 5 timer ved 15°C anvendes 5 /il af ligateringsblandingerne til transformation af E. coli HB101 som beskrevet ovenfor, hvorved man opnår ca. 1000 transformerede kolonier pr. blanding. Der 15 udvælges tre kolonier af hver, plasmid DNA'et isoleres og analyseres med enzymerne Hindi11, PvuII, EcoRI, Tagl og Pstl. Der udvælges to kolonier, som indeholder plasmid DNA'er af den forventede struktur [pAM 27 (hBiB2D3D4") og pAM 33 ("D^B^") ].

20 Eksempel 4

Dannelse af hybrid IFN gener overkrydset ved aminosyre 150

Plasmider pAM2 (a-3) og pAM21 (a-2) spaltes hver for sig med PvuII og Pstl. DNA fragmenterne adskilles ved saccharosegradientcentrifugering i PvuII-Pstl store frag-25 menter (ca. 4Kb, indkoder de N-terminale 92 aminosyrer i IFNs a-2 og a-3), og PvuII-Pstl små fragmenter (længde på henholdsvis 386 og 495 bp, indkoder C-terminaler i IFNs a-2 og a-3). I et andet trin foretages 32p-mærkning af de rensede PvuII-Pstl små fragmenter fra pAM2 og pAM21 hver 30 for sig på følgende måde: DNA fragmenterne (~ 1 /ig) opløses hver for sig i 50 /il 50 mM Tris-HcL pH 8,0 og desphosphoryleres ved behandling med 1 E/10 pmol 5' ender alkalisk phosphatase i 30 minutter ved 37°C. Enzymet inaktiveres ved inkubering i 1 time DK 168794 B1 46 ved 65°C, og DNA'et renses ved adsorption og eluering fra DEAE-cellulose og fældes i ethanol. DNA'et phosphoryleres i et reaktionsomfang på 20 μΐ indeholdende 50 mM Tris-HCl 5 pH 9,5/10 mM MgCl2 (5 mM DTT, 30-40 μΐ lyofiliseret γ-[32ρ]-ΑΤΡ (Amersham, 6000 Ci/mmol, 1 mCi/ml) og 0,5 Ε/μ1 T4 kinase (P.L. Biochemicals). Efter 20 minutters forløb ved 37°C afbrydes reaktionen ved tilsætning af EDTA til 10 mM. Et overskud (~ 4 /tg) af det tilsvarende ube-10 handlede DNA fragment tilsættes derpå, og opløsningen eks-traheres med phenol æog chloroform. DNA adskilles fra resterende 7-[32p ]-ATP ved kromatografi på "Sephadex"® G-50 i TNE. De udelukkede topfraktioner, som måles ved hjælp af Cerenkov-tælling, hældes sammen og fældes med ethanol.

15 De 32p_mærjte(3e Pvull-PstI små fragmenter nedbrydes hver for sig fuldstændigt med Sau3A, og det begrænsede DNA isoleres ved elektroforese i en 6%'s polyacrylamidgel under anvendelse af TBE som løbende puffer. Fra gelen isoleres 4 DNA fragmenter svarende til PvuII-Sau3A (hver 20 på 172 bp, koder for aminosyrer 93 til 150 i IFNs a-2 og a-3) og til Sau3A-PstI (henholdsvis 214 bp og 323 bp, koder for aminosyrer 151 til 166 i IFNs a-2 og a-3).

Ved genligatering af 3 passende fragmenter (se tabel 2), dannes 4 hybrid IFN-typer med overkrydsning ved aminosyre 25 150. De tilsvarende plasmider rekonstrueres i en række trin. I en første ligateringsreaktion ligateres ækvimolære mængder PvuII-Sau3A- og Sau3A-PstI-DNA fragmenter i 10 μΐ ligateringspuffer indeholdende 20 mM Tris*HCl pH 7,8, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,5 mM rATP og 40 enheder/μΐ T4 30 DNA ligase i 3-6 timer ved 15°C (resulterer i concatemert DNA). Efter nedbrydning med en Pvull-PstI og ekstraktion med phenol/chloroform (1:1), tilsættes et overskud af det passende Pvull-PstI stort fragment [ dephosphoryleret: typisk 1 μg DNA i 50 μΐ 50 mM Tris*HCl pH 8 (ca. 0,6 pmol 35 5' ender) behandlet med 0,06 enheder alkalisk kalve- phosphatase i 30 minutter ved 37°C], og DNA'et ligateres DK 168794 B1 47 igen. E. coli HB101 transformeres og 4 kloner, som bærer DNA med den forventede struktur bestemt ved restriktionsanalyse (Pvull, Sau3A, Tagl og EcoRI), udtages. Klonerne 5 betegnes E. coli HB101 pJC334, pJC337, pJC342 og PJC344, jævnfør tabel 2.

Tabel 2

Oprindelse for DNA fragmenter anvendt til dannelse af hybrid IFNs med overkrydsning ved aminosyre 150. I pa-10 renteserne er anført IFN-typen og afsnittet af a-IFN indkodet på fragmenterne.

•Dannet Klon- og ligerede DNA. fragmenter (længde) hybrid plasmid-

IFN betegn PvuII-Pstl PvuII-Sau3A Sau3A-PstI

type nelse <ca. 4Kb) (170 bp) (210 bp, a-2) (320 bp, a-3) "DiDiDjB^" pJC334 AM2(e-31_92> Aa2(a-393_150) Am21(«-2l51_166) "DjOzBaDu*' pJC337 ^2(0-3^) Am21(a-293_150) Am2(a-3151 16fi) "BiBzDiBi," »JC342 AM21(.-2,.,,,) 4.2(.-3,3.,3,,) ^«^ISl-HS» ”B,BZB3D,·' PJC344 AM21(«-2,.92) 4.21(.-2,3.,53)4.2(.-3,5,.,33)

Eksempel 5

Dannelse af hybrid IFN gener med overkrydsning ved amino-15 syre 60

Dannelse af disse hybrid IFN gener gennemføres på praktisk taget samme måde som beskrevet i eksempel 4.

Plasmider pAM2 (a-3) og pAM21 (a-2) skæres hver for sig med HindiII og Pvull, og fragmenterne isoleres ved 20 saccharosegradientcentrifugering. Hindlll-PvuII små fragmenter (521 bp, indeholdende /3-1 acpromotorområdet og indkoder de N-terminale 92 aminosyrer i IFNs a-2 og a-3) DK 168794 B1 48 mærkes med 32p 0g nedbrydes partielt med Sau3A (0,5 enheder enzym pr. μg DNA, 5 minutter ved 37°C, reaktion afbrydes ved phenolekstraktion). Den dannede fragment-5 blanding adskilles ved elektroforese i 6%'s polyacryl-amidgeler, og der ekstraheres 4 fragmenter (to 424 bp HindIII-Sau3A fragmenter og to 97 bp Sau3A-PvuII-frag-menter) fra gelen. Religatering af 3 passende fragmenter med den trinvise metode beskrevet i eksempel 4 (se tabel 10 3), og transformering til E. coli HB101 resulterer i trans forman ter af kun 2 af de forventede 4 konstruktioner: pAM65 ("D1B2D3D4") og pAM90 (MB1D2B3B4”).

Tabel 3:

Oprindelse af DNA fragmenter anvendt til dannelsen af to 15 hybrid I FN gener overkrydset ved aminosyre 61. I parenteserne anføres IFN typen og afsnittet af alFN indkodet på fragmenterne.

Dannet Klon- og DNA fragment type (længde) hybrid plasmid

IFN beteg- HindIII-Sau3A Sau3A-PvuII Hindlll-PvuII

type nelse (424 bp) (97 bp) (ca. 4Kb) D1B2D3D4 pAM65 Am2(a-3j_gj) Am21(a-2g2_92) ^^““^93-166^

BiD2B3Bj, pAM90 Ab21(«-21-61) Am2(o-362_92) AH21(ct-293_166)

Til dannelse af de andre to hybrid IFN gener overkrydset 20 ved aminosyre 61 skæres plasmideme pAM65 og pAM90 hver for sig med Hindlll og Pvull, og de små Hindlll-PvuII DNA fragmenter (521 bp) isoleres efter elektroforese i agaro-segeler. Ligatering af Hindlll-PvuII lille fragment af pAM90 med Hindlll-PvuII stort fragment af pAM2 resulterer 25 i pAM94 (B1D2D3D4), og ligatering af det lille Hindlll-PvuII fragment af pAM65 med Hindlll-PvuII stort fragment af pAM21 giver plasmid pAM76 (D1B2B3B4). Strukturen af de DK 168794 B1 49 ovenfor anførte 4 plasmid DNA’er bekræftes ved restriktionsenzymanalyse.

De pågældende kloner betegnes E. coli HB101 pAM65, pAM90, 5 pAM94 og pAM76.

Del II: Dannelse og kloning af interferon α-2/α-3 hybrider i Saccharomyces cerevisiae

Alle de i det følgende beskrevne hybridinterferonprotein-kodningssekvenser bindes til PH05-promotoren og PH05-10 transskriptionstermineringssignalerne, klones i gær 2 μ vektoren pJDB207 og transformeres til gærstamme

Saccharomyces cerevisiae GRF18.

Eksempel 6

Dannelse af ekspressionsplasmid p3lRT (Δ72) 15 Plasmid pJDB207=IF2()Δ72 (europæisk patentansøgning nr. 100.561) nedbrydes med Hindlll og EcoRl, og et 470 bp fragment indeholdende carboxylterminalenden af interferon a-2 og PH05-transskriptionstermineringssignaler isoleres ved agarosegelelektroforese og elekroeluering [R. Yang et 20 al., Methods Enzym. 68, 176 (1979)] under anvendelse af Micro-Collodion poser (Sartorius, Gfittingen, Forbundsrepublikken Tyskland). Plasmid p3lR (jævnfør europæisk patentansøgning nr. 100.561) nedbrydes med Hindlll og EcoRl og 4,1 kb vektordelen isoleres under anvendelse af 25 den samme teknik. Efter ligatering af 200 ng vektor og insert DNA under anvendelse af E. coli T4 DNA ligase og transformation af E. coli HB101 til ampicillinresistens, isoleres et plasmid med betegnelsen p3lRT(A72) indeholdende PH05-promotoren, C-terminalenden af interferon a-2 30 og PH05-transskriptionstermineringssignaler, og dets struktur bekræftes ved restriktionsanalyse.

DK 168794 B1 50

Eksempel 7

Dannelse af plasmider pJDB207 PH05/IFN AMI04, AMI14 og AM119 5 PH05-ekspressionspiasmid p31RT(A72) (se eksempel 6) nedbrydes med EcoRI og Xhol, og de forskudte 3' ender udfyldes med dCTP, dGTP, dATP og dTTP under anvendelse af Klenow fragmentet af DNA polymerase I fra E. coli. De korte ender desphosphoryleres med alkalisk phosphatase fra 10 bakterier. Plasmider pJC334, pAM90 og pJC337 (eksempel 4 og 5) nedbrydes med Tagl (pJC334 og pAM90) eller med Taql og EcoRI (pJC337), og de forskudte 3’ ender udfyldes med de tilsvarende deoxynucleotider som beskrevet ovenfor. DNA fragmenter på ca. 560 basepar isoleres ved agarosegel-15 elektroforese og elektroeluering under anvendelse af Micro-Collodion-poser som ovenfor. Ligatering af 200 ng fremstillet vektordel af plasmid p31RT(A72) og 200 ng eluerede DNA fragmenter under anvendelse af T4 DNA ligase og transformering af E. coli HB101 til ampicillinresistens 20 fører til plasmider henholdsvis p31R/IFN AM104 (indeholdende hybridinterferon "D1D2D3B4" kodningssekvensen), p31R I FN AM119 (indeholdende hybridinterferon "B1D2B3B4" kodningssekvensen) og p3lR IFN AM114 (indeholdende hybridinterferon "D1D2B3D4" kodningssekvensen). Ved 25 skæring af disse plasmider med BamHI og Hindlll isoleres et DNA fragment på ca. 1300 bp med konfigurationen PH05-promotor - IFN proteinkodningssekvens - PH05-trans-skriptionstermineringssignal ved agarosegelelektroforese og elektroeluering. Dette fragment klones mellem Hindlll-30 og BamHI-steder i plasmid pJDB207. Plasmiderne transformeres til gærstamme GRF18 til Leu+ (jævnfør europæisk patentansøgning 100.561, se også eksempel 14). De dannede kloner betegnes som Saccharomyces cerevisiae (GRF18/ pJDB207 PH05/IFN AM104, GRF18/pJDB207 PH05/IFN AM114 og 35 GRFl8/pJDB207 PH05/IFN AM119.

DK 168794 B1 51

Eksempel 8

Dannelse af plasmid pJDB207 PH05/IFN AM129

Plasmid pAM94 (eksempel 5) skæres fuldstændigt med Tagl og 5 delvis (i nærværelse af 10 ng/ml ethidiumbromid) med EcoRI. Et DNA fragment på ca. 580 bp isoleres ved agarose-gelelektroforese og elektroeluering og ligateres til EcoRI og Xhol afskæringsdelen, renset på gel, vektordel af plasmid p31RT(A72) (se eksempel 6). Efter transformering 10 af E. coli HB101 til ampicillinresistens isoleres plas-midet p3lR PH05/IFN AM129. Dette plasmid indeholdende interferon "BlD2D3D4" kodningsområdet nedbrydes med Hindlll og BamHI, og 1300 bp DNA fragmentet ligateres til pJDB207 som beskrevet i eksempel 7. Plasmidet transfor-15 meres til gærstamme GRF 18 som beskrevet ovenfor. Den dannede klon betegnes Saccharomyces cerevisiae GRF18/ PJDB207 PH05/IFN AM129.

Eksempel 9

Dannelse af plasmider PJDB207 PH05/IFN AM106, AM110 og 20 AMI12

Plasmider pJDB207 PH05 IFN/AM104, AM114 og AM129 (se eksempel 7 og 8) spaltes med BamHI og PvuII, og 6,8 Kb vektordelene indeholdende de pågældende C-terminale ender af interferonkodningsområderne isoleres ved agarosegel-25 ektroforese og elektroeluering. På tilsvarende måde spaltes plasmid pJDB207R/(a-2)^72 (europæisk patentansøgning nr. 100.561) med BamHI og PvuII, og der isoleres et DNA fragment på 800 bp. Ved ligatering af de tilsvarende fragmenter og transformation af E. coli HB101 30 fås plasmider pJDB207 PH05/IFN AM106 (indeholdende hybridinterferon "B3B2B3D4" kodningsområdet), AM112 (indeholdende hybridinterferon ”21820364” kodningsområdet) og AM110 (indeholdende hybridinterferon "B1B2D3D4" kod- DK 168794 B1 52 ningsområdet). Gærstamme GRF18 transformeres sædvanligvis . De dannede kloner betegnes Saccharomyces cerevisiae GRF18 pJDB207 PH05/IFN AM106, pJDB207 PH05/IFN AM112 og 5 pJDB207 PH05/IFN AM110.

Eksempel 10

Dannelse af plasmider pJDB207 PH05/IFN DM 1 og DM 2

Plasmid pJDB207 PH05/IFN AM119 (eksempel 7) spaltes med Hindlll og Bglll og 7,5 Kb vektordelen indeholdende 10 N-terminalendeme af interferonkodningsområdet isoleres ved agarosegelelektroforese og elektroeluering. På tilsvarende måde spaltes plasmider pJDB207 PH05/1FN ΆΜ114 og PJDB207 PH05/IFN AM104 (se eksempel 7) hver for sig med det samme enzym, og der isoleres DNA fragmenter på ca.

15 600 bp indeholdende C-terminalenden af interferonkod ningsområdet. Tilsvarende fragmenter ligateres med T4 DNA ligase. Efter transformering af E. coli HB101 fås plasmider pJDB207 PH05/IFN DM1 indeholdende hybridinterferon ’'B1D2B3D4" kodningsområdet og pJDB207 PH05/IFN DM2 inde-20 holdende hybridinterferon "B1D2D3B4" kodningsområdet. Gærstamme GRF 18 transformeres som beskrevet ovenfor. De dannede kloner betegnes Saccharomyces cerevisiae GRF18 pJDB207 PH05/IFN DM1 og Saccharomyces cerevisiae GRF18 PJDB207 PH05/IFN DM2.

25 Eksempel 11

Dannelse af plasmid pJDB207 PH05/IFN HRi43

Plasmid pJDB207R/IF(α-2)Δ72 (europæisk patentansøgning nr. 100.561) nedbrydes med BamHI og PvuII, og der isoleres et DNA fragment på 6,8 kb. Ligeledes nedbrydes plasmid 30 pJDB207R/IF(a-3) (europæisk patentansøgning nr. 100.561) med det samme enzym, og der isoleres et DNA fragment på 800 bp. Ligatering af de to DNA fragmenter og transfor- DK 168794 B1 53 mation af E. coli HB101 celler til ampicillinresistens giver plasmid pJDB207 PH05/IFN HRi43 indeholdende hybridinterferon "01025384” kodningsområdet. Gærstamme 5 GRF18 transformeres som beskrevet ovenfor. De dannede kloner betegnes som Saccharomyces cerevisiae GRF18 pJDB207 PH05/IFN HRi43.

Eksempel 12

Transformation af Saccharomyces cerlvisiae GRF18 og 10 Induktion af interferondannelse

Plasmid pJDB207 PH05/IFN AM129 ("62020304") indføres i

Saccharomyces cerevisiae stamme GRF18 (or, his 3-11, his 3-15, leu 2-3, leu 2-112, can1*) analogt med fremgangsmåden beskrevet af Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 15 75, 1929 (1978). Et μς plasmid DNA sættes til 100 μΐ af en sfæroplastsuspension, og blandingen behandles med poly-ethylenglycol. Sfæroplasterne blandes med 10 ml regenereringsagar og anbringes på gærminimalmediumplader uden leucin. Efter inkubering i 3 dage ved 30°C, fås ca.

20 1000 transformerede celler.

En enkelt gærkoloni fra gærtransformationspladerne (med betegnelsen Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207 PH05/ I FN AM129) anbringes i 10 ml gærminimalmedium i en 100 ml Er lenmeyer kolbe, og dyrkes ved 30°C og 200 omdrejninger 25 pr. minut i 24 timer til en tæthed på ca. 2-3xl07 celler pr. ml. Cellerne vaskes én gang med 20 ml lav-Ρχ minimalmedium (som "Difco yeast minimal medium without amino acids" tilsat 20 g/1 glucose men fremstillet ud fra bestanddelene i overensstemmelse med Oifcos recept (Oifco 30 Manual, Difco Laboratories, Detroit, USA), idet der dog anvendes 0,03 g/1 KH2PO4 plus 1 g KC1 i stedet for 1 g/1 KH2PO4). Tre ml af de suspenderede celler anvendes til inokulering af henholdsvis 300 ml lav-Ρχ minimalmedium og 300 ml normalt minimalmedium i 1000 ml Er lenmeyer kolber.

DK 168794 B1 54

Inkuberingen gennemføres ved 30°C og 160 omdrejninger pr. minut. Indføring af PH05-promotoren efterfølges af måling af forekomsten af sur phosphataseaktivitet i hele celler 5 som beskrevet, jævnfør Tohe et al., J. Bacteriol. 113, 727 (1973). Cellerne dyrkes til ca. 1-2x10? celler/ml (26-30 timers inkubation).

Eksempel 13

Fremstilling af gærcelleekstrakter og bestemmelse af 10 interferontiteren

Celler fra 300 ml kulturmediet (se eksempel 12) med en tæthed på 1-2x10? pr. ml isoleres ved centrifugering i en Sorvall GSA rotor i 5 minutter ved 8000 omdrejninger pr. minut ved 4°C. Cellerne vaskes én gang med 100 ml H2O, 15 resuspenderes i 6 ml iskold lyceringsbl ånding (0,1 M kaliumphosphatpuffer pH 7,4, 1% (r/r) Triton X-100,0.0001M PMSF (Merck)) og overføres til et 30 ml corex-rør. Suspensionen centrifugeres igen i 5 minutter i en Sorvall SS-34 rotor ved 8000 omdrejninger pr. minut og 4°C og 20 resuspenderes i 3 ml lyceringsblanding ved 0°C. Til cellerne sættes 4 g glasperler (0,4 mm i diameter), og suspensionen rystes på en hvirvelblander (Scientific Instruments Inc., USA) under fuld hastighed i 30 sekunder, hvorpå der afkøles i 1 minut i et isbad. Denne rysteprocedure 25 gentages 5-10 gange, indtil mere end 90% af cellerne er nedbrudt (kontrol under lysmikroskop). Cellerester og glasperler fjernes fra den dannede opløsning ved centrifugering i 10 minutter ved 8000 omdrejninger pr. minut ved 4°C i en Sorvall HB-4 rotor. Supernatanten overføres til 30 Eppendorf rør, fryses i flydende nitrogen og opbevares ved -60°C. Interferonaktiviteten bestemmes under anvendelse af fremgangsmåden ifølge S. Rubinstein et al., J. Virol 37, 755 (1981) til at være 7·10^ enheder/ml celleekstrakt.

På analog måde som beskrevet ovenfor i eksempel 12 og 13 DK 168794 B1 55 transformeres Saccharomyces cerevisiae stamme GRF18 med plasmider pJDB207 PH05/IFN AMI19 ("B1D2B3B4")r AM106 ("BXB2B3D4”), AM112 ("3^0384"), DM1 (-63.028304-), DM2 5 ("BJD2D3B4"), AM110 (-B3.B2D3D4-) og HR143 ("02028384"). De dannede stammer dyrkes. Cellerne høstes, og interferon-titeren bestemmes som ovenfor. Der opnås følgende IFN-titere: S. cerevisiae GRF18/pJDB207 PH05/IFN AM119: 5»109 ^enh./ml S. cerevisiae GRF18/pJDB207 PH05/IFN AM106: 7·107 erih./ml S. cerevisiae GRF18/pJDB207 PH05/IFN AM112: 2»108 erih./ml S. cerevisiae GRF18/pJDB207 PH05/IFN DM1 : 3·109 erih.fml S. cerevisiae GRF18/pJDB207 PH05/IFN DM2 : 5»109 eriti./al S. cerevisiae GRF18/pJDB207 PH05/IFN AMI10: 3·108 erih./ml S. cerevisiae GRF18/pJDB207 PH05/IFN HR143: 1·109 enh./ml 10 Under de samme betingelser giver Saccharomyces cerevisiae stammer GRF18/pJDB207R/IF (a-2) og /IF (α-3) titra på henholdsvis 1*10^ og 3*10^ enheder/ml.

Eksempel 14

Fremstilling af hybridinterferon "BtD^D^Da" ved hjælp af 15 transformerede gærceller i 30 liter målestok Gærstamme GRF18, som bærer plasmidet pJDB207 PH05/IFN AMI29, der indkoder genet for hybridinterferon "B2D2D3D4" efter (downstream) sur phosphatase promotoren PH05 ud-stryges på overfladen af en agarkultur af YNB medium.

20 Pladen inkuberes ved 30°C, indtil der konstateres sammenflydende vækst. En steril podenål anvendes til at overføre en del af overfladekulturen til en rystekolbe, som indeholder forkulturmediet IFN/21, der indeholder DK 168794 B1 56 Gærekstrakt (Difco) 10,0 g L-asparagin*H20 6,6 g KH2PO4 1,0 g 5 MgS04*7H20 1,9 g L-histidin 0,02 g D-glucose (monohydrat) 33,0 g pr. liter deioniseret vand 500 ml kolben har en enkelt prelplade og indeholder 100 10 ml medium. Mediet fremstilles under anvendelse af deioniseret vand og har en pH-værdi på ca. 6,0. Glucosen steriliseres separat. Efter inokulering inkuberes den første forkultur i 24 timer ved 30°C på en orbital rysteborer med en vandring på 5 cm og en hastighed på 250 15 omdrejninger pr. minut. Den første forkulturkolbe giver podemateriale til de efterfølgende forkulturkolber. Disse kolber tilføres podemateriale i en mængde på 1% r/r. Mediet og inkuberingsbetingelserne er identiske med de ved den første forkultur anvendte. En tilstrækkelig mængde 20 kolber fra det andet forkulturtrin hældes sammen til dannelse af et 1% r/r podemateriale til 30 1 dyrkningsbeholderen (3 kolber pr. dyrkningsbeholder). Produktionsdyrkningsbeholderen har et driftsrumfang på 30 1, indeholder fire prelplader og en enkelt seksbladet 25 pladeturbineomrører med en diameter på 115 mm. Omrørings-hastigheden er 600 omdrejninger pr. minut, og luft tilføres i en mængde på 1 r/r/minut, idet der opretholdes et overtryk på 0,3 bar. Fermenteringstemperaturen er 30°C. Fermenteringsbeholderen steriliseres med mediet 1FN/23 30 indeholdende Gærekstrakt (Difco) 2,0 g L-asparagin-I^O 6,6 g

MgS04*7H20 1,0 g L-histidin 0,02 g 35 D-glucose (monohydrat) 33,0 g pr. liter deioniseret vand DK 168794 Bl 57 idet glucose steriliseres separat og tilsættes til et slutrumfang på 30 1.

Efter inokulering reguleres pH-værdien under fermente-5 ringen ved tilsætning af natriumhydroxid, således at pH-værdien ikke synker under 6,0. Fermenteringen varer ca. 18 timer eller indtil der er opnået maksimalt udbytte af interferon.

Den optiske tæthed, som er et hensigtsmæssigt udtryk for 10 gærens vækst, opnår en værdi mellem 6 og 7 OD-enheder. Glucosen er stort set men ikke fuldstændigt forbrugt og der er induceret sur phosphataseaktivitet samtidig med produktionen af interferon.

Interferontiteren kan måles i råekstrakter fremstillet ved 15 mekanisk oplukning af cellerne i laboratoriet og er 7 · 10^ enheder/1 celleekstrakt. Proteinindholdet i den rå ekstrakt er ca. 1 mg/ml.

Ved afslutningen af fermenteringen kan dyrkningsvæsken om nødvendigt afkøles til 10°C, inden den høstes, og hybrid-20 interferonet udvindes.

30 1 dyrkningsvæske med pH-værdi 6,0 afkøles til 10°C, og cellerne isoleres ved hjælp af en "Sharpies"® centrifuge.

Den klare supernatant indeholder ingen I FN aktivitet. Den fremkomne cellemasse indstilles med Buffer X (2 iM Tris 25 pH 8,0, 5 mM EDTA, 0,5 M NaCl, 20 μΜ phenylmethyl-sulfony 1 fluorid) til 1400 ml og har en pH-værdi på 8,0. Efter afkøling til 5-10°C ledes suspensionen gennem en "DYNO"©-mølle (type KDL Pilot, 0,6 1) forsynet med poly-urethanomrørerskiver og 500 glasperler med en diameter på 30 0,5-0,75 mm og med en omrøringshastighed på 3000 omdrej ninger pr. minut og en fødehastighed på 10 1/time, hvorved celler oplukkes. Suspensionen har pH-værdien 8. Suspensionen indeholdende de oplukkede celler klares ved DK 168794 B1 58 centrifugering. Centrifugeringen foretages i en Sorvall 6SA rotor ved 12000 omdrejninger pr. minut ved 4°C i 20 minutter.

5 Stammen Saccharomyces cerevisiae GRF18, som bærer et af piasmiderne pJDB207 PH05/IFN AM119, AM106, AM112, DM1 og DM2, kan dyrkes, og en klaret opløsning indeholdende det tilsvarende hybridinterferon kan fremstilles på analog måde.

10 Eksempel 15

Fremstilling af ekstrakter af E. coli stamme HB101/pAM94 og bestemmelse af IFN aktivitet E. coli stamme HB101/pAM94 dyrkes til en optisk tæthed på 8 ved 650 ran i 1 liter M 9 medium indeholdende 0,4% cas-15 aminosyrer og 2% glucose. Cellerne bundfældes og resus-penderes i puffer (16 g celler i 160 ml puffer) indeholdende 0,1 M Tris-HCl pH 8,0, 0,5 M NaCl, 5 mM EDTA og 100 fiM PMSF. Der tilsættes lysozym til en slutkoncen-tration på 1 mg/ml. Opløsningen anbringes derefter på is i 20 30 minutter. Cellerne i denne suspension åbnes under anvendelse af en "Sorvall Omnimix" med en afsætning på tre gange i 60 sekunder. Suspensionen indeholdende de oplukkede celler klares ved centrifugering i en Sorvall 6SA rotor ved 12000 omdrejninger pr. minut ved 4°C i 20 mi-25 nutter. Supematanten analyseres for IFN aktivitet under anvendelse af den ovenfor anførte fremgangsmåde af S. Rubinstein et al.

Der findes en IFN aktivitet på 5*107 enheder/ml celleekstrakt.

30 På tilsvarende måde dyrkes E. coli stammer HB101/pAM90, pJC344 og pJC342, og interferontitrene bestemmes som ovenfor til henholdvis 5*10®, 5*107 og 5*10® enheder/ml

Eksempel 16 DK 168794 B1 59 celleekstrakt.

Fremstilling af hybridomaceller a) Kilde for immunogen: En prøve af halvrenset naturlig 5 human leukocyt IFN (IFNa) leveret af Dr. K. Cantell (Helsinki) med en specifik aktivitet på 13 x 10® IE pr. mg protein anvendes til immuniseringerne.

b) Immuniseringsmetode: Syv Balb/c hunmus (dyrefarm Sisseln, Schweiz) med en alder på 10-14 uger immuniseres 10 ved injektion i de fire trædepuder med 4 x 105 IE af IFNa (eksempel 16a) emulgeret i komplet Freund's adjuvans (Difco). En yderligere injektion på 4 x 105 IE af IFNa i inkomplet Freund's adjuvans gives på dag 30, og en såkaldt "booster" injektion (i.p.) på 6 x 10® IE af IFNa i 15 PBS gives på dag 60. Tre dage senere udtages miltene til fusionen.

c) Cellefusion: Alle fusionseksperimenterne gennemføres under anvendelse af fremgangsmåden ifølge 6. Kdhler og C. Milstein, Nature 256, 495 (1975), under anvendelse af 20 den ikke-sekreterende Sp 2/0-Agl4 myelomalinie, jævnfør M. Shulman, C.D. Wilde og 6. Kdhler, Nature 276, 269 (1978). 10® miltceller blandes med 10? myelomaceller i nærværelse af 1 ml 50%'s polyethylenglycol (PEG 1500, Serva). Efter vaskning resuspenderes cellerne i 48 ml 25 Dulbecco's standard minimum essential medium (Gibco nr. 0422501) 3x10® normale museperitonealexsudatceller pr.

fusion tilsættes som fødeceller. Cellerne fordeles i 48 x 1 ml costarhuller og fodres 3 gange pr. uge med standard HAT selektionsmedium i 3-6 uger. Når væksten af 30 hybridomacellerne bliver synlig, screenes supematanterne ved anvendelse af en kombineret immunofældning-bioanalyse (eksempel 19). Ud af i alt 221 hybridomaer findes 10 hy-bridomaer, som producerer anti-IFNa antistoffer. Hybri- DK 168794 B1 60 domacellerne klones ved begrænsningsfortynding i mikro-titerplader mindst én gang. Hybridoma 144 BS udvælges til yderligere undersøgelser, da den er særlig stabil og ud-5 skiller store mængder immunoglobulin.

Eksempel 17

Isolering og rensning af monoklonalt antistof 8-10 uger gamle Balb/c mus (dyrefarm Sisseln, Schweiz) forbehandles intraperitonealt med 0,3 ml pristan 10 (Aldrich). 2-3 uger senere foretages intraperitoneal inokulering af 2-5x10^ klonede hybridomaceller og 0,2 ml pristan. Efter 8-10 dages forløb opsamles ascitesvæske, som centrifugeres ved 800 x G og opbevares ved -20°C.

Optøet ascitesvæske centrifugeres ved 50000 x G i 60 mi-15 nutter. Et fedtlag, som flyder på overfladen fjernes omhyggeligt, og proteinkoncentrationen indstilles til en koncentration på 10-12 mg/ml. Råt immunoglobulin fældes ved dråbevis tilsætning af 0,9 rumfangækvivalenter mættet ammoniumsulfatopløsning ved 0°C, bundfaldet opløses i 20 20 mM Tris-HCl/50 mM NaCl (pH 7,,9) og dialyseres mod den samme puffer. Der opnås en immunoglobulinfraktion ved DEAE-D52 cellulose (Whatman) kromatografi under anvendelse af et puffergradientsystem af 20 mM Tris-HCl/25-400 mM NaCl, pH 7,9. Immunoglobulinet fældes igen med ammonium-25 sulfat og opløses i PBS ved en koncentration på 10 mg/ml.

Ved natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) konstateres en renhedskvalitet på mere end 95% for de monoklonale antistoffer 144 BS.

DK 168794 B1

Eksempel 18 61

Bestemmelse af klasse og underklasse for monoklonale antistoffer.

5 Klassen og underklassen for monoklonale antistoffer dannet af klonede hybridomaceller bestemmes ved den kendte agar-gelimmunodiffusionsteknik ifølge Ouchterlony under anvendelse af klasse- og underklassespecifikke kaninantistoffer (Bionetics). Resultaterne bekræftes ved hjælp af en 10 enzymimmunoanalyse (ELISA) på følgende måde. Mikrotiter-plader overtrækkes med 1 #tg pr. hul af et kaninimmuno-globulinpræparat af et klasse- eller underklassespecifikt serum (Bionetics) i 50 μΐ PBS.

Pladens fri bindingskapacitet mættes med en puffer af 1%

15 kvægserumalbumin i PBS indeholdende 0,2% NaN$ (v/r), pH

7,4. 100 μΐ prøver indeholdende monoklonale antistoffer inkuberes i hullerne ved 37°C i 1 time. Pladerne vaskes med PBS, hvorpå de inkuberes ved 37°C i 1 time med et phosphatasekonjugeret kaninimmunoglobulinpræparat med 20 samme specificitet som anvendt til overtrækning af pladerne. Det fikserede enzym fremkaldes ved inkubering (37°C, 30 minutter) med en opløsning af enzymsubstratet p-nitrophenylphosphat (1 rog/ml i diethanolaminpuffer 10% indeholdende 0,5 mM MgCl2 og 0,02% (v/r) NaN3, pH 9,8) og 25 måling af den optiske tæthed ved 405 nm. De monoklonale antistoffer 144 BS hører til klassen IgGiK (Kappa).

Eksempel 19

Kombineret immunofældningsbioanalyse 50 μΐ rå naturlige humane leukocyt IFN- eller rekombinant 30 IFNa-polypeptider (eksempel 20a) (10^ IE/ml) blandes med lige så store mængder testopløsning, f.eks. dyrknings-supernatanterne af hybridomas eller PBS opløsninger af DK 168794 B1 62 rensede monoklonale antistoffer, og der inkuberes ved 37°C i 2 timer i mikroglas (Eppendorf 3810). Derpå tilsættes 50 μΐ fortitreret kanin-antimuse-Ig-antistof (Nordic), og 5 blandingen inkuberes ved 37°C i 1 time og derefter ved 4°C i 16 timer, hvorved fri og IFN-bundne monoklonale antistoffer danner immunkomplekser. Rørene centrifugeres ved 12000 omdrejninger pr. minut ved 4°C i 5 minutter. Immunbundfaldet vaskes én gang med 1 ml kold pufret natrium-10 chloridopløsning (pH 7,2), hvorpå det opløses i 200 μΐ puf ret natriumchloridopløsning pH 2,2. Den derved frigjorte I FN aktivitet bestemmes ved hjælp af en standard-bioanalyse ifølge J.A. Armstrong, Appl. Microbiol. 21, 723 (1971). Inhibering af den cytopatiske virkning af Mengo 15 virus (400 plaquedannende enheder pr. hul) påvises ved anvendelse af Hep 2 celler (3 x 104 celler pr. hul) i mikrotiterplader.

Eksempel 20

Bestemmelse af interferonspecificitet 20 a) Kilde for rekombinant IFNa polypeptider; LylFN-a-l-, LyIFN-a-2- og LYIFN-a-3-polypeptider, som er beslægtet med henholdsvis IFNaF, iFNaB og IFNaD, er beskrevet i beskrivelsen til europæisk patentansøgning nr. 76.489. IFNaA og IFNaJ er leveret af Dr. J. Davies (Biogen, Geneve) og 25 professor C. Weissmann (Zurich's universitet, Schweiz), og IFNaC er leveret af Weizmann Institute of Science, Department of Virology, Rehovot, Israel.

b) Kilde for monoklonale antistoffer til IFN anvendt til sammenligning; Monoklonale antistoffer 1K2 og 2K2 frem-30 stilles som beskrevet i beskrivelsen til GB-patent nr. 2.108.510. MAb NK2 og YOK leveres af Celltech (Berkshire), IY-1 og IY-2 af Inter-Yeda (Israel), S-l, S-2, S-3 og S-4 af Dr. C. Favre, UNICET, Dardilly (Frankrig) og MAb 1/24 af M. Aguet, Ziirich's universitet (Schweiz).

DK 168794 Bl 63 c) Reaktivitetsbestemmelse for de forskellige monoklonale antistoffer til IFNa-undertyperne gennemføres under anvendelse af den kombinerede immunofældningsbioanalyse i 5 eksempel 19 og tandemradioimmunoanalysen beskrevet af D.S. Secher, Nature 290, 501 (1981). Resultaterne er samlet i tabel 4.

De monoklonale antistoffer 144 BS, 1K2 og 2K2 reagerer ikke med human IFN/3 (Rentschler, Laupheim, Vesttyskland) 10 eller human IFNy (Bio Science, Emmenbrdcke, Schweiz).

Tabel 4

Immunofældning ved hjælp af MAb1 s af rekombinant IFNa-undertyper IFNa undertyper

Monoklonale A «-2 C o-3 a-1 J

antistoffer 144 BS + ++++ +++ ++++ +++ ++ 1K2 +++ - +++ + +++ 2K2 ++++ - +++ ++++ ++ +++ NK2 ++++ ++++ - ++ ++++ YOK + - ++++ - +++ S-l +++ + ++++ ++ + S-2 +++ - - - - S-3 +++ ++++ - ++ ++++ S-4 ++++ - + ++++ IY-1 ++ +++ - ++ IY-2 ++++ - + +++ 1/24 ++++ ++++ - ++ +++ ++++ 100 % binding +++ 75 % binding ++ 50 % binding + 25 % binding + 10 % binding - 0 % binding blank binding ikke bestemt (omtrentlige værdier) DK 168794 B1 64

Resultaterne i tabel 4 viser, at det monoklonale antistof 144 BS udviser et entydigt bindingsmønster. Først og fremmest skal bemærkes den lave binding til IFNaA og den ef-5 fektive binding til IFN-o-2-, IFN-a-3- og IFN-α-Ι poly-peptider.

Endvidere muliggør resultaterne i tabel 4 epitopanalysen, som er vist skematisk i tabel 5.

Tabel 5 10 Epitopanalyse af rekombinant IFNa-undertyper

Epitop genkendt af monnklonalt antistof rekoribinant 144 BS 1R2 NK2.S-3 YOK S-l S-2 S-4, IFNa undertype 2K2 ΙΥ-1,Ι/24 IY-2

A X-XX-XX-X-X-X-XX

β-2 XX-XX-x- 0-3 XX-XX-XX-XX-

0-1 X-X-X-X-X

J X-X-XX-XX-----XX

Det fremgår af analysen i tabel 5, at epitopkombinationen for hver IFNa-undertype er entydig. Endvidere gør analysen det muligt at forudsige egnede par monoklonale antistoffer 15 til bestemmelsen af specifikke undertyper af IFNa med udelukkelse af andre undertyper i en tandemimmunanalyse. Eksempelvis vil kombinationen af det monoklonale antistof 144 BS med en vilkårlig af MAb'erne NK2, S-3, IY-1 eller 1/24 være nyttig til påvisning af IFNaB uden interferens 20 fra IFNaD, og kombinationen af MAb 144 BS med MAb YOK til påvisning af IFNaD i nærværelse af IFNaB.

Eksempel 21 DK 168794 Bl 65

Fremstilling af immunoadsorbentsøjle

En ml af lej ret "Affi-gel"® 10 (Bio-Rad) opløst til 17 mg 5 monoklonalt antistof 144 BS i overensstemmelse med producentens anvisninger: "Affi-gel"® 10 vaskes på et sintret glasfilter først med kold destilleret vand og derpå med 0,1 M NaHC03-opløsning pH 8,0 (koblingspuffer). En suspension af 50% gel i koblingspuffer overføres til et 10 plastrør, blandes med et lige så stort rumfang renset monoklonal antistofopløsning og roteres i 4 timer ved stuetemperatur. Efter kobling vaskes gelen med koblingspuffer og behandles med 0,1 ml 1 M ethanolamin-HCl (pH

8,0) i 1-2 timer ved stuetemperatur til blokering af 15 steder, som ikke har reageret. Gelen vaskes med PBS i nærværelse af 10 mM NaNø og opbevares deri ved 4°C.

Eksempel 22

Rensning af rekombinant IFWor ved immunoaffinitets-kromatografi 20 En suspension af oplukkde E. coli celler, som producerer rekombinant IFNa, f.eks. E. coli HB101/pAM94 (jævnfør eksempel 15), klares ved centrifugering i en Sorvall 6 SA rotor ved 12000 omdrejninger pr. minut ved 4°C i 20 minutter. Til supernatanten sættes polyethylenimin ("Polyimin 25 P"®, Fluka, pH 8,0) til en slutkoncentration på 0,25% (v/r). Opløsningen omrøres i 1 time, hvorefter den centrifugeres. Den dannede pellet kastes bort, og supernatanten indstilles på 65%'s mætning med fast ammoniumsulfat. Blandingen omrøres i 1 time, hvorpå den centri-30 fugeres. Supernatanten hældes bort, og den dannede pellet suspenderes i en tiendedel rumfang (15-20 ml) PBS (pH 7,2). Opløsningen dialyseres natten over mod PBS indeholdende 0,02% NaNø.

DK 168794 B1 66

Den dialyserede opløsning blandes med 1 ml af immuno-affinitetsgelen fremstillet i eksempel 21. Denne blanding omrøres forsigtigt i 1 time, hvorpå den pakkes til en 5 søjle, der vaskes med 5 søjlerumfang PBS, 5 søjlerumfang PBS indeholdende 0,5 M NaCl og 0,2% "Triton X-100"® og 5 søjlerumfang PBS i nævnte rækkefølge. Eventuelt pakkes immunoaffinitetsgelen først til en søjle, hvorpå den dialyserede opløsning tilsættes i toppen, hvorefter der 10 vaskes som beskrevet ovenfor. Rekombinant hybrid IFNa ("B1D2D3D4") elueres med en sur puffer pH 2,5 indeholdende 0,1 M citronsyre og 0,3 M NaCl. De aktive IFN fraktioner neutraliseres med 1 M Tris, dialyseres mod PBS og koncentreres til ca. 0,1 mg/ml protein under anvendelse af ul-15 trafiltreringsfladtlagsmembraner XM10 (Amicon Corp.).

Den maksimale kapacitet af immunoadsorbentsøjlen fremstillet i eksempel 21 indeholdende 17 mg monoklonalt antistof 144 BS er ca. 1,2 mg af hver af IFN-a-2 og IFN-a-3 polypeptider, mindst 0,8 mg polypeptid af typen 20 IFN-a-1, 1,15 mg hybridinterferon "B1B2D3B4", 1,25 mg hybridinterferon "B1D2B3B4", 1,25 mg hybridinterferon "B1D2D3D4", 0,44 mg hybridinterferon "BjB2B3D4h, 1,6 mg hybridinterferon "B1D2B3D4", 1,6 mg hybridinterferon "B1D2D3B4"' 1/15 mg hybridinterferon "B3B2D3D4" og 1,25 mg 25 hybridinterferon"DiD2B3B4M. Immunoabsorbentgelen kan anvendes ved op til 50 adskillelser uden væsentligt tab af kapacitet. Polypeptider af rekombinanttypen IFN-a-2, IFN-a-3 og IFN-a-1 og hybridinterferoner renset ved denne fremgangsmåde er homogene ved SDS-PAGE.

30 Eksempel 23

Immunoprikanalyse (Immunodot analysis)

Immunoprikanalyse gennemføres under anvendelse af fremgangsmåden ifølge R. Hawkes et al., Anal. Biochem 119, 142 (1982). Prøver, som indeholder naturlige interferoner DK 168794 B1 67 eller rekomblnantinterferoner, afsættes som prikker på nitrocelluloseark i forskellige koncentrationer. Prikkerne lufttørres, og nitrocellulosens restbindingskapacitet 5 blokeres ved inkubering i Tris puffer (0,15 M NaCl, 0,01 M Tris-HCl, pH 7,6), som indeholder 10% hesteserum. Nitrocellulosestrimlerne inkuberes derpå med en opløsning af monoklonalt antistof 144 BS (23 pg/ml), og strimler fremstillet på tilsvarende måde inkuberes enten med en 10 opløsning af monoklonalt antistof 2K2 (30 μg/ml) til sammenligning, en opløsning af et normalt museimmuno-globulin (fortynding 1:100) som negativ kontrol eller en opløsning af et polyklonalt anti-humant interferon-a-museserum (Enzo, fortynding 1:1000) som positiv kontrol.

15 Efter vaskning behandles alle strimlerne med kanin-antimuse-immunoglobulin mærket med peroxidase (Nordic, fortynding 1:400), og det bundne andet antistof fremkaldes med et peroxidasesubstrat, nemlig 4-chlor-l-naphthol.

Det monoklonale antistof farver polypeptider af IFNaD 20 typen, såsom IFN-a-3, i koncentrationer ned til 0,4 ng pr. prik og polypeptider af IFNaB typen, såsom IFN-a-2, ned til 10 ng pr. prik, hvorimod MAb 2K2 kun genkender polypeptider af IFNaD typen (4 ng pr. prik).

Eksempel 24 25 Perle-radioimmunotandemanalyse a) Radioaktiv mærkning af monoklonalt antistof 144 BS med 12$!: 0,1 mg monoklonalt antistof 144 BS ioderes med 125I natriumiodid (1 mC) og chloramin T under anvendelse af standardfremgangsmåden ifølge F.C. Greenwood et al., 30 Biochem. J. 89, 114 (1963). Reaktionsproduktet renses med en ionbytterkolonne "Bio-Rad"® AG 1x8, og aktiviteten standardiseres til 4 x 105 cpm/ml ved fortynding med PBS. Ioderingen af monoklonalt antistof 2K2 gennemføres på tilsvarende måde. De monoklonale antistoffer YOK og NK2 DK 168794 B1 68 forhandles på radioaktivt mærket form af Celltech.

b) Kobling af monoklonalt antistof 144 BS til macroperler: Polystyrenperler (diameter 6,3 mm, Spherotech AG, Ziirich) 5 inkuberes ved 4°C i 16 timer ved forsigtig rystning i en opløsning af 1 mg/ml MAb 144 BS i en koblingspuffer af PBS indeholdende 5 mM EDTA og 0,1% NaN3 (pH 8) i forholdet 20 perler pr. 10 ml opløsning. De overtrukne perler overføres derefter til en blokeringspuffer af PBS indeholdende 10% 10 hesteserum og 0,1% NaNg og opbevares deri ved 4°C indtil anvendelse, i det mindste i 24 timer.

Koblingen af andre MAb'er gennemføres på tilsvarende måde.

c) Analysemetode: Plastrør (Falcon, 5 ml) overtrækkes med 0,5 ml blokeringspuffer af PBS indeholdende 10% hesteserum 15 og 0,1% NaN3 natten over. Pufferen fjernes ved opsugning, og 0,2 ml af en IFN-holdig testopløsning eller standardopløsning i blokeringspuffer sættes direkte til bunden af røret. En MAb-koblet og blokeret perle fremstillet som beskrevet i eksempel 24b) tørres kortvarigt på en ren 20 renseserviet og overføres forsigtigt uden skumdannelse til røret, som indeholder IFN-opløsningen. Perlen inkuberes i 4-6 timer ved stuetemperatur med forsigtig rystning. IFN-opløsningen fjernes ved opsugning, og hver enkelt perle vaskes tre gange med 2 ml blokeringspuffer. Derefter inku-25 beres perlen i 0,2 ml af et 125I-mærket andet antistof (eksempel 24a) svarende til 80 x 102 cpm i 16 timer ved 4°C, vaskes tre gange med PBS og overføres til et nyt rør med henblik på tælling.

I tabel 6 er anført resultaterne opnået med standard-30 opløsninger af IFN-a-3- og IFN-a-2-polypeptider opnået med forskellige kombinationer af fastfase (perlekoblet) første antistof og -mærket andet antistof.

Tabel 6 DK 168794 B1 69

Udvælgelse af egnet monoklonal antistofkombination til IFN-g-2 og IFN-a-3 polypeptidanalyse

Fastfase radioaktivt mærket'' cpm pr» 103 lE/al fundet- antistof andet antistof - IFN-a-3 IFN-a-2 5 144 BS 2K2 113 105 144 BS 144 BS 103 58 144 BS YOK 16793 313 144 BS NK2 78 3733 2K2 144 BS 52 2 polyclonal 144 BS 1572 546

Polyclonal: Perlekoblet, polyklonalt fåre-anti-IFNa antistof fra Celltech.

De bedste resultater opnås med kombinationen af MAb 144 BS med MAb YOK til påvisning af IFN-a-3 og med kombinationen 10 af MAb 144 BS med MAb NK2 til påvisning af IFN-a-2.

Fig. 4 viser resultaterne af kvantitative titreringsforsøg med kombinationen af MAb 144 BS koblet til den faste fase og MAb NK2 på radioaktivt mærket form. Analyserne giver lineære resultater fra 1 til 5000 IE/ml (2 pg/ml til 15 10 ng/ml) af polypeptider af IFNaB typen. Forskelle i titreringskurver for polypeptider af typen IFN-a-2 og "Standard aB" (fra Celltech) skyldes variationer i bio-analysemålinger af de to IFN-præparater.

Tilsvarende resultater opnås i kvantitative forsøg til 20 måling af polypeptider af IFNaD typen med kombinationen af MAb 144 BS koblet til den faste fase og MAb YOK på radioaktivt mærket form. Analyserne giver pålidelige resultater ned til 1 IE/ml (2 pg/ml) polypeptider af typen IFNaD. Kombinationen af MAb 144 BS koblet til den faste fase og DK 168794 B1 70 MAb NK2 kan også anvendes til bestemmelse af polypeptider af typen IFNaF.

d) Afkortet analysemetode (samtidig analyse): Under an-5 vendelse af den almene fremgangsmåde beskrevet i eksempel 24c) inkuberes den MAb-koblede perle i 3 timer ved stuetemperatur med testopløsningen (0,1 ml) og det radioaktivt mærkede antistof (0,1 ml) på samme tid, idet man udelader de mellemliggende vaskninger.

10 Fig. 5 viser, at den afkortede samtidige analyse kan anvendes under opnåelse af pålidelige resultater til den hurtige screening af prøver af polypeptid af typen IFNaB, såsom IFN-or-2, indeholdende 150 IE/ml eller mere, men er betydelig mindre følsom end analysen i eksempel 24c).

15 bg = baggrund e) Analysesæt til perle-radloimmunotandemanalyse: Et analysesæt til den i eksempel 24c) beskrevne analyse indeholder følgende: 100 plastrør Falcon 5 ml 20 100 polystyrenperler 6,3 mm overtrukket med mono- klonalt antistof 144 BS i PBS indeholdende 10% hesteserum og 0,1% NaNø 20 ml _mærke·!;; monoklonalt antistof YOK med en specifik aktivitet på 4x105 cpm/ml 25 20 ml 125i-mærket monoklonalt antistof NK2 med en specifik aktivitet på 4x10^ cpm/ml 2 ml IFN-a-l-standardopløsning indeholdende 104 IE/ml 2 ml IFN-a-2-standardopløsning indeholdende 30 104 IE/ml 2 ml IFN-ct-3-standardopløsning indeholdende 104 IE/ml 1000 ml PBS indeholdende 10% hesteserum og 0,1% NaN3 j usteringskurve DK 168794 B1

Eksempel 25 71

Bnzymlmmunoanalyse (ELISA) a) Mærkning af monoklonalt antistof 144 BS med alkalisk 5 phosphatase: 1,4 mg MAb 144 BS i 1,4 ml PBS kobles i 2 timer med en opløsning, som indeholder 5 mg alkalisk phosphatase (SIGMA P6774, type VII-T) under anvendelse af standardfremgangsmåden ifølge Voller et al.. Bull. World Health Organ. 53, 55 (1976) under anvendelse af glutar-10 aldehyd (0,2% r/r). Konjugatet overføres til 5 ml Tris puffer 0,05 M pH 8,0, indeholdende 1 mmol MgCl2, 1% BSA og 0,02% NaN3. Opløsningen opbevares på et mørkt sted ved 40C.

b) Analysemetode: Polypropylenmikrotiterplader (Dynatech

15 Labs. Inc.) overtrækkes i et tidsrum på 2 timer ved 37°C

og natten over ved 4°C med 150 /ti af en opløsning af det monoklonale antistof NK2 (Celltech, 10 /tg/ml) i en puffer pH 8,6 (carbonatpuf ret 0,9%'s natriumchloridopløsning indeholdende 0,02% natriumazid). Pladerne vaskes fem gange 20 med PBS, og de tilbageblevne proteinreaktive steder mættes ved inkubering i 1 time ved 37°C med 250 μΐ af en puffer med pH 7,4 (0,2% gelatine og 0,2% NaN3 i PBS). Plader overtrukket på denne måde kan opbevares ved 4°C i denne puffer i nogle få dage.

25 50 μΐ af en række fortynding af en testopløsning eller en standardopløsning indeholdende IFNa-undertyper, 50 μΐ puffer pH 7,4 og 50 μΐ af en opløsning af det phosphatase-mærkede antistof 144 BS (eksempel 25a), som er blevet fortyndet i forholdet 1:100 med puffer pH 7,4, blandes og 30 inkuberes i hullerne i mikrotiterpladerne i 2 timer ved 37°C og i 30 minutter ved 4°C. Pladerne vaskes fem gange med PBS, hvorpå de inkuberes i 30 minutter ved 37°C med 150 μΐ af en opløsning af p-nitrophenylphosphat (1 mg/ml i 10% diethanolaminpuffer, 0,5 mM MgCl2, pH 9,8). Ved måling DK 168794 Bl 72 af den optiske tæthed ved 405 ran bestemmes mængden af frigjort p-nitrophenol, som er proportional med mængden af den bundne enzymphosphatase og følgelig proportional med 5 mængden af IFNa-undertypen i testopløsningen.

Denne analysemetode kan anvendes til bestemmelse af polypeptider af typen IFNceB, såsom IFN-a-2, eller IFNaF.

Til bestemmelse af polypeptider af typen IFNaD, såsom IFN-a-3, overtrækkes mikrotiterpladen med det monoklonale 10 antistof YOK (Celltech) i stedet for NK2.

Der opnås lignende resultater, når mikrotiterpladerne overtrækkes med MAb 144 BS og henholdsvis phosphatase-koblet MAb'er NK2 og YOK anvendes som andet antistof.

c) Analysesæt til ELISA: Et analysesæt til analysemetoden 15 beskrevet i eksempel 25b) indeholder følgende: polypropylenmikrotiterplader, 20 ml monoklonalt antistof NK2 (10 /ig/ml) i carbonat-pufret natriumchloridopløsning (0,9% NaCl, 0,42% NaHC03, 0,0072% Na2C03, 0,02% NaN3) 20 1 ml alkalisk phosphatasekoblet MAb 144 BS (eksempel 10.1, 0,3 mg antistof pr. ml) i Tris puffer (0,05 Μ, 1 mM MgCl2, 1% BSA, 0,02% NaN3, pH 8,0) 2 ml standardopløsning af IFN-α-Ι indeholdende 104 IE/ml 25 2 ml standardopløsning af IFN-a-2 indeholdende 104 IE/ml 2 ml standardopløsning af IFN-a-3 indeholdende 104 IE/ml 300 ml PBS * 30 300 ml puffer pH 7,4 (0,2% gelatine og 0,2% NaN3 i PBS) 50 ml p-nitrophenylphosphat (1 mg/ml) i diethanolamin-puffer (10%, 0,5 mM MgCl2, 0,02% NaN3, indstillet til pH 8,9 med HC1) j usteringskurve 35 farveintensitetsskala

Eksempel 26 DK 168794 B1 73

Rensning af hybridinterferoner under anvendelse af fældningsfremgangsmåder og kromatografiske fremgangsmåder 5 11 interferon "Bj^DsD^-holdig opløsning klaret ved centrifugering (se eksempel 13-15) syrnes under anvendelse af 2 M HC1, indtil opløsningen har en pH-værdi på 2,2. Opløsningen omrøres i 1 time ved 4°C, og det udfældede protein isoleres ved centrifugering (GSA rotor Sorvall ved 10 12000 omdrejninger pr. minut ved 4°C i 20 minutter). Den dannede pellet kastes bort, og supernatanten indstilles på 30%'s mætning med fast ammoniumsulfat. Denne opløsning omrøres i 1 time ved 4°C, hvorpå den centrifugeres. Supernatanten indeholdende interferonet dialyseres derpå mod 15 0,1 M NH4HCO3 ved pH 8,2. Der findes en interferonaktivi tet på ca. 108 iE/ml.

En søjle indeholdende 50 ml chelaterings Sepharose 6B (Pharmacia) påsat med Cu2+-ioner i overensstemmelse med producentens vejledning ækvilibreres under anvendelse af 20 250 ml 0,05 M natriumacetat pH 7,0 og 0,5 M NaCl. 200 ml dialyseret opløsning (se ovenfor) sættes til søjlen ved 4°C. Søjlen vaskes med 150 ml ækvilibreringspuffer. Elue-ring af bundet interferon gennemføres under anvendelse af en lineær gradient af 25 250 ml 0,05 M natriumacetat pH 7,0 og 0,5 M NaCl 250 ml 0,05 M natriumacetat pH 2,8 og 0,5 M NaCl hvorpå der vaskes med 150ml 0,05 M natriumacetat pH 2,8 og 0,5 M NaCl.

De aktive interferonfraktioner hældes sammen og dialyseres 30 mod 0,05 M Tris*HCl puffer pH 8,0. Interferonaktiviteten i den dialyserede opløsning er ca. 108 IE/ml. Den maksimale kapacitet af søjlen er ca. 75 mg interferon "B1D2D3D4".

En søjle indeholdende 50 ml Q-Sepharose anionbytter DK 168794 B1 74 (Pharmacia) ækvilibreres under anvendelse af 250 ml 0,05 M Tris*HCl puffer pH 8,0. 100 ml af den ovenfor beskrevne dialyserede interferonholdige opløsning sættes til søjlen 5 ved stuetemperatur. Søjlen vaskes derpå med 50 ml ækvili-breringspuffer. Bundet interferon elueres under anvendelse af en lineær gradient på 0 til 0,7 M NaCl i 200 ml 0,05 Tris»HCl pH 8,0.

Det rene interferon elueres ved ca. 0,3 M NaCl. De aktive 10 fraktioner udviser et enkelt bånd med en tilsyneladende molekylvægt på 19000 ved analyse på SDS polyacryl amidgeler. Den maksimale kapacitet af anionbyttersøjlen er ca.

50 mg hybridinterferon "B1D2D3D4".

Analogt med den ovenfor beskrevne fremgangsmåde kan der 15 foretages rensning af hybridinterferonerne , "B1.D2B3D4-, "B1D2D3B4\ "B1B2B3D4" og "B1B2D3B4M.

Eksempel 27

Lyofllisering af hybridinterferon "ΒτΡ^Ρ^Ρ,ι"

Interferon "BiD2D3D4" renset enten ved immunoaffinitets-20 kromatografi under anvendelse af monoklonalt antistof 144 BS eller ved konventionel kromatograferingsteknik (se eksempel 26) dialyseres mod 0,5 M NH4HC03, hvorpå der lyofiliseres. Små rumfang vand sættes to gange til den lyofiliserede prøve til fuldstændig fjernelse af NH4HC03.

25 Derefter genlyofiliseres opløsningen.

Rekonstituering af interferon "B1D2D3D4"-opløsning gennemføres på følgende måde: 0,5 M NH4HC03 pH 8,2 sættes til den lyofiliserede prøve til opnåelse af en interferonkoncentration på ca. 0,1 mg/ml. Det genopløste interferon 30 har en specifik antiviral aktivitet på 2 »10® IE/mg, som er identisk med den tilsvarende værdi inden lyofiliseringen.

Eksempel 28 DK 168794 B1 75

Fysiskkemisk karakterisering af hybridinterferoner

Hybridinterferonerne ifølge opfindelsen og staminter-5 feronerne underkastes polyacrylamid-SDS-gelelektroforese under anvendelse af fremgangsmåden beskrevet af Laemmli, jævnfør Nature 227, 680 (1970). De tilsyneladende molekylvægte for hybridinterferonerne angivet i kilo-Daltons (kD) er anført i tabel 7. I tabel 7 er endvidere anført 10 det isoelektriske punkt (pi) for hybridinterferonerne bestemt under anvendelse af LK5 polyacrylamidgeler indeholdende "Ampholine"®.

Tabel 7

Tilsyneladende molekylvægt og isoelektrisk punkt for 15 hybridinterferoner ifn Tilsyneladende molekylvægt ρχ a-2 27000 5,2 o-3 20000 5f2 B1B2D3D4 27000 5-6 (diffuse)

DiD2B3Bu 20000 5,0 B1B2B3D1, 27000 5,2 B}B2D3Bi» 26000 5-6 (diffuse) B1D2D3D4 19000 5,4 B1D2B3D1, 20000 5,6

BiD2D3Bi» 20000 5,5 B1D2B3B1» 20000 5,4

Aminosyresekvensen for hybridinterferonerne ifølge opfindelsen bestemmes under anvendelse af et protein-sekvensbestemmelsesapparat 470 A fra Applied Biosystems 20 eller under anvendelse af et sekvensbestemmelsesapparat 890 C Beckman. I begge tilfælde foretages automatiseret Edman nedbrydning. Den fundne struktur er i fuldstændig DK 168794 B1 76 overensstemmelse med den forventede. Den N-terminale aminosyre er cystein.

Eksempel 29 5 Hybridinterferoners virkning på (2*-5') oligoisoadenylat-syntetaseaktivitetsniveauet i Daudi celler

Daudi celler podes med 2 x 105 celler pr. ml på RPMI 1640 medium med 10%'s føtalt kalveserum indeholdende hybridinterferonerne "B1B2B3D4", "B1D2B3B4", BiD2D3D4H og

10 "BlB2D3B4" i de anførte koncentrationer (se tabel 8). Efter 24 timers behandling centrifugeres 5 x 10^ celler pr. prøve (9000 omdrejninger pr. minut), og cellerne resuspenderes i 500 μΐ kold lyseringspuffer (20 mM

4-(2-hydroxyethyl)-l-piperazinethansulfonsyre-puffer pH 15 7,5, 5 mM MgCl2, 120 mM KC1, 7 mM dithiothreitol, 10% glycerol, 0,5% Nonidet P 40), og der inkuberes i 2 minutter på is. Derpå centrifugeres prøverne (9000 omdrejninger pr. minut, 8 minutter, 4°C), og supernatanterne udtages og analyseres for (2'-5')-oligoisoadenylat-20 syntetaseaktivitet på følgende måde:

Supernatanten blandes med 50 μΐ poly(ri)·(rC) agarose (P-L Biochemicals) i 15 minutter ved 30°C hvorefter det ikke-adsorberede materiale fjernes ved centrifugering. Det poly(rl)·(rC)-adsorberede materiale inkuberes med 2,5 mM 25 (a32p) ATP, 400 Ci-mmol (Amersham International) i 20 ti mer ved 30°C, behandles med bakteriel alkalisk phosphatase (Sigma) og elueres derpå fra en søjle af surt aluminiumoxid (Sigma) (300 μΐ) med 3,0 ml 1 M glycin-HCl-puffer pH 2,0 som beskrevet af Merlin et al. Analyt.

30 Biochem. 110, 190 (1981). Resultaterne anført i tabel 8 er udtrykt som det antal gange (2'-5’)-oligoisoadenylat-syntetaseaktiviteten er forøget i interferonbehandlede celler i forhold til enzymaktiviteten i ubehandlede kon- DK 168794 B1 77 trolceller (gennemsnitsaktivitet 51,6 ± 8,7 pmol/time/10® celler).

Tabel 8

Borøgelse af (2'-5') (A) synthetase-aktivitet 5

Ipmol ATP irikorporereVtime/103 celler] IFN koncentration 1 10 100 1000 t enh./hll__ 5 IFN «-2 ("B") 3,6 4,0 5,7 5/6 o-3 ("D") 2,2 3,2 3,2 3/9 "BiBaDaDit" 3,4 3,2 4,6 4,0 "D1D2B3B4" 2,6 2,1 4,8 4/3 "BiBaBaDi," 9,4 8,4 10,0 8/5 "B1D2B3BU" 5,6 5,7 7/8 11/4 "B1D2D3D1*" 5,8 8,9 12,1 17/5 "B1B2D3B*" 5,6 7,0 9,1 9/6

Eksempel 30

Farmaceutiske præparater (parenteral indgift) 2 mg hybridinterferon "B1D2D3D4" med en specifik aktivitet på 1,3*10® enheder/mg på humane WISH celler opløses i 10 30 ml 5 N human serumalbumin. Den dannede opløsning ledes gennem et bakteriologisk filter, og den filtrerede opløsning hældes portionsvis under aseptiske betingelser i 100 hætteglas, som hver indeholder 2,6*10® enheder ren hybridinterferon. Hætteglassene, der er egnede til paren-15 teral indgift, opbevares fortrinsvis i kulden, f.eks. ved -20°C.

På tilsvarende måde kan der fremstilles hætteglas indeholdende 5,2*10® eller 1,04*10? enheder under anvendelse af henholdsvis 4 eller 8 mg hybridinterferon.

20 På analog måde kan der fremstilles hætteglas indeholdende hybridinterferon ""Βιι^Ι^Β^, Hb1b2d3b4"/ *B1D2B3D4", "B1D2D3B4" eller "B1B2B3D4" (specifikke aktiviteter på henholdsvis 1,28*10®, 2*10®, 7,7*107, 3,8*10? og 8*10?).

Claims

1. Hybridinterferonpolypeptid, kendetegnet ved, at det har en aminosyresekvens sammensat af to til fire undersekvenser, som med hensyn til aminosyreidentitet og 5 -antal svarer til undersekvenser af humane lymfoblastoide interferoner LyIFN-a-2 og LyIFN-a-3, hvor hybridinter- feronpolypeptidet er valgt blandt et polypeptid med en aminosyresekvens bestående af aminosyrer 1 til 150 af LyIFN-a-2 (B1B2B3) og aminosyrer 151 til 166 af

2. Hybridinterferonpolypeptid ifølge krav 1, kende-20 tegnet ved, at det er hybridinterferonpolypeptid ,,BiB2B3D4" med formlen CYS ASP LEU PRO GLN THR HIS SER LEU GLY ASN ARG ARG ALA LEU ILE LEU LEU ALA GLN MET ARG ARG ILE SER PRO PHE SER CYS LEU LYS ASP ARG HIS ASP PHE GLU PHE PRO GLN GLU GLU PHE ASP ASP LYS GLN PHE GLN LYS ALA GLN ALA ILE SER VAL LEU HIS GLU MET ILE GLN GLN THR PHE ASN LEU PHE SER THR LYS ASP SER SER ALA ALA LEU ASP GLU THR LEU LEU ASP GLU PHE TYR ILE GLU LEU ASP GLN GLN LEU ASN ASP LEU GLU SER CYS VAL MET GLN GLU VAL GLY VAL ILE GLU SER PRO LEU MET TYR GLU ASP SER ILE LEU ALA VAL ARG LYS TYR PHE GLN ARG ILE THR LEU TYR LEU THR GLU LYS LYS TYR SER SER CYS ALA TRP GLU VAL VAL ARG ALA GLU ILE MET ARG SER LEU SER LEU SER THR ASN LEU GLN GLU ARG LEU ARG ARG LYS GLU DK 168794 Bl 79

3. Hybridinterferonpolypeptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er hybridinterferonpolypeptid "B1B2D3B4" med formlen CYS ASP LEU PRO GLN THR HIS SER LEU GLY ASN ARG ARG ALA LEU ILE LEU LEU ALA GLN MET ARG ARG ILE SER PRO PHE SER CYS LEU LYS ASP ARG HIS ASP PHE GLU PHE PRO GLN GLU GLU PHE ASP ASP LYS GLN PHE GLN LYS ALA GLN ALA ILE SER VAL LEU HIS GLU MET ILE GLN GLN THR PHE ASN LEU PHE E SER THR LYS ASP SER SER ALA ALA LEU ASP GLU THR LEU LEU ASP GLU PHE o TYR ILE GLU LEU ASP GLN GLN LEU ASN ASP LEU GLU ALA CYS VAL MET GLN GLU GLU ARG VAL GLY GLU THR PRO LEU MET ASN ALA ASP SER ILE LEU ALA VAL LYS LYS TYR PHE ARG ARG ILE THR LEU TYR LEU THR GLU LYS LYS TYR SER PRO CYS ALA TRP GLU VAL VAL ARG ALA GLU ILE MET ARG SER PHE SER LEU SER ILE ASN LEU GLN LYS ARG LEU LYS SER LYS GLU

4. Hybridinterferonpolypeptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er hybridinterferonpolypeptid m®1^2®3^4" me<* formlen CYS ASP LEU PRO GLN THR HIS SER LEU GLY ASN ARG ARG ALA LEU ILE LEU LEU ALA GLN MET ARG ARG ILE SER PRO PHE SER CYS LEU LYS ASP ARG HIS ASP PHE GLU PHE PRO GLN GLU GLU PHE ASP ASP LYS GLN PHE GLN LYS. ALA GLN ALA ILE SER VAL LEU HIS GLU MET ILE GLN GLN ILE PHE ASN LEU PHE THR THR LYS ASP SER SER ALA ALA TRP ASP GLU ASP LEU LEU ASP LYS PHE CYS THR GLU LEU TYR GLN GLN LEU ASN ASP LEU GLU SER CYS VAL MET GLN GLU VAL GLY VAL ILE GLU SER PRO LEU MET TYR GLU ASP SER ILE LEU ALA VAL ARG LYS TYR PHE GLN ARG ILE THR LEU TYR LEU THR GLU LYS LYS TYR SER SER CYS ALA TRP GLU VAL VAL ARG ALA GLU ILE MET ARG SER LEU SER LEU SER THR ASN LEU GLN GLU ARG LEU ARG ARG LYS GLU DK 168794 B1 80

5 CYS THR GLU LEU TYR GLN GLN LEU ASN ASP LEU GLU ALA CYS VAL MET GLN GLU GLU ARG VAL GLY GLU THR PRO LEU MET ASN ALA ASP SER ILE LEU ALA VAL LYS LYS TYR PHE ARG ARG ILE THR LEU TYR LEU THR GLU LYS LYS TYR SER PRO CYS ALA TRP GLU VAL VAL ARG ALA GLU ILE MET ARG SER PHE SER LEU SER ILE ASN LEU GLN LYS ARG LEU LYS SER LYS GLU

5. Hybridinterferonpolypeptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er hybridinterferonpolypeptid hB],D2D3B4" med formlen CYS ASP LEO PRO GLN THR HIS SER LEU GLY ASN ARG ARG ALA LEU ILE LEU LEU ALA GLN MET ARG ARG ILE SER PRO PHE SER CYS LEU LYS ASP ARG HIS ASP PHE GLU PHE PRO GLN GLU GLU PHE ASP ASP LYS GLN PHE GLN LYS ALA GLN ALA ILE SER VAL LEU HIS GLU MET ILE GLN GLN ILE PHE ASN LEU PHE THR THR LYS ASP SER SER ALA ALA TRP ASP GLU ASP LEU LEU ASP LYS PHE

6. Hybridinterferonpolypeptid ifølge krav 1, kende- tegnet_ved, at det er hybridinterferonpolypeptid "B1B2D3D4" me<3 formlen CYS ASP LEU PRO GLN THR HIS SER LEU GLY ASN ARG ARG ALA LEU ILE LEU LEU ALA GLN MET ARG ARG ILE SER PRO PHE SER CYS LEU LYS ASP ARG HIS ASP PHE GLU PHE PRO GLN GLU GLU PHE ASP ASP LYS GLN PHE GLN LYS ALA GLN ALA ILE SER VAL LEU HIS GLU MET ILE GLN GLN ILE PHE ASN LEU PHE THR THR LYS ASP SER SER ALA ALA TRP ASP GLU ASP LEU LEU ASP LYS PHE CYS THR GLU LEU TYR GLN GLN LEU ASN ASP LEU GLU ALA CYS VAL MET GLN GLU GLU ARG VAL GLY GLU THR PRO LEU MET ASN ALA ASP SER ILE LEU ALA VAL LYS LYS TYR PHE ARG ARG ILE THR LEU TYR LEU THR GLU LYS LYS TYR SER PRO CYS ALA TRP GLU VAL VAL ARG ALA GLU ILE MET ARG SER LEU SER LEU SER THR ASN LEU GLN GLU ARG LEU ARG ARG LYS GLU > 81 DK 168794 B1

7. Hybridinterferonpolypeptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er hybridinterferonpolypeptid "B1D2B3B4" med formlen CYS ASP LEU PRO GLN THR HIS SER LEU GLY ASN ARG ARG ALA LEU ILE LEU LEU ALA GLN MET ARG ARG ILE SER PRO PHE SER CYS LEU LYS ASP ARG HIS ASP PHE GLU PHE PRO GLN GLU GLU PHE ASP ASP LYS GLN PHE GLN LYS ALA GLN ALA ILE SER VAL LEU HIS GLU MET ILE GLN GLN ILE PHE ASN LEU PHE THR THR LYS ASP SER SER ALA ALA TRP ASP GLU ASP LEU LEU ASP LYS PHE CYS THR GLU LEU TYR GLN GLN LEU ASN ASP LEU GLU SER CYS VAL MET GLN 5 GLU VAL GLY VAL ILE GLU SER PRO LEU MET TYR GLU ASP SER ILE LEU ALA VAL ARG LYS TYR PHE GLN ARG ILE THR LEU TYR LEU THR GLU LYS LYS TYR SER SER CYS ALA TRP GLU VAL VAL ARG ALA GLU ILE MET ARG SER PHE SER LEU SER ILE ASN LEU GLN LYS ARG LEU LYS SER LYS GLU

8. Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved, at det indeholder en terapeutisk virksom mængde af et hybridinterferonpolypeptid ifølge krav 1.

9. Fremgangsmåde til fremstilling af et hybrid-10 interferonpolypeptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at værtsceller transformeret med en hybridvektor, som indeholder en DNA sekvens, der koder for hybridinterferon-polypeptidet dyrkes, og at hybridinterferonpolypeptidet isoleres.

10. Hybridvektor, kendetegnet ved, at den indeholder en DNA sekvens som koder for et hybridinterferonpolypeptid ifølge krav 1.

10 LyIFN-a-3(D4), et polypeptid med en aminosyresekvens bestående af aminosyrer 1 til 92 af LyIFN-a-2 (B3B2), aminosyrer 93 til 150 af LyIFN-a-3 (D3) og aminosyrer 151 til 166 af LyIFN-a-2 (B4) og et polypeptid med en aminosyresekvens bestående af aminosyrer 1 til 60 af

15 LyIFN-a-2 (Bi), aminosyrer 61 til 92 af LyIFN-a-3(D2), aminosyrer 93 til 150 af LyIFN-or-2(B3) eller af LyIFN-a-3 (D3) og aminosyrer 151 til 166 af LyIFN-a-2(B4) eller LyIFN-a-3(D4).

11. Vært transformeret med en ekspressionsvektor, kendetegnet ved, at ekspressionsvektoren indeholder en DNA 20 sekvens, som koder for et hybridinterferonpolypeptid ifølge krav 1.