JPH05308973A - ハイブリドインターフェロン遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 新規なインターフェロン誘導体をコードする
遺伝子を提供する。 【構成】 ＬｙＩＦＮ−α−２のアミノ酸１〜１５０と
ＬｙＩＦＮ−α−３のアミノ酸１５１〜１６６とから成
るアミノ酸配列を有するポリペプチド、ＬｙＩＦＮ−α
−２のアミノ酸１〜９２とＬｙＩＦＮ−α−３のアミノ
酸９３〜１５０とＬｙＩＦＮ−α−２のアミノ酸１５１
〜１６６とから成るアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド、及びＬｙＩＦＮ−α−２のアミノ酸１〜６０とＬｙ
ＩＦＮ−α−３のアミノ酸６１〜９２とＬｙＩＦＮ−α
−２又はＬｙＩＦＮ−α−３のアミノ酸９３〜１５０と
ＬｙＩＦＮ−α−２又はＬｙＩＦＮ−α−３のアミノ酸
１５１〜１６６とから成るアミノ酸配列を有するポリペ
プチドから成る群から選択されるハイブリドインターフ
ェロンポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含んで成
るハイブリドベクター。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、新規なハイブリドイ
ンターフェロンをコードする組換ＤＮＡを含んで成るハ
イブリドベクター、及びそれにより形質転換された大腸
菌及び酵母宿主に関する。

【０００２】

【従来の技術】インターフェロン（ＩＦＮ）は、種々の
マイトジエン及びウイルスに暴露された後に多くの種類
の真核細胞により分泌されるポリペプチドの一群であ
る。インターフェロンはそれらの化学的性質及び生物学
的性質により３つの群、すなわちＩＦＮ−α，ＩＦＮ−
β、及びＩＦＮ−γに分類されている。ＩＦＮ−α及び
−βの遺伝子は、ウイルス、ウイルス成分、及び２本鎖
ＲＮＡにより処理された細胞中で優先的に発現される。
他方、ＩＦＮ−γはマイトジエンに反応して合成され
る。

【０００３】ヒトＩＦＮ−αは１５個以上の非−対立遺
伝子から成る一群の遺伝子によりコードされる。ヒトＩ
ＦＮ−β及びヒトＩＦＮ−γはそれぞれ１個の遺伝によ
りコードされる。ＩＦＮ−αの一次翻訳生成物は１８９
個のアミノ酸から成り（但し、ＩＦＮ−α₂ は１８８個
のアミノ酸から成る）、これらのアミノ酸から２３個の
アミノ酸から成るシグナルペプチドが翻訳後変形により
除去される。

【０００４】ヒトＩＦＮ−β及びヒトＩＦＮ−γはそれ
ぞれ１８７個及び１８６個のアミノ酸から成り、これら
のアミノ酸からシグナルペプチドを構成する２１個又は
２０個のアミノ酸が除去される。ＩＦＮ−αのサブタイ
プ間のアミノ酸配列の相同性は８０〜８５％であり、他
方ＩＦＮ−βとＩＦＮ−αとの間の相同性は約３０〜４
０％である。ＩＦＮ−γとＩＦＮ−αとは１２％の同一
残基に対応するわずかなアミノ酸の相同性を示す。

【０００５】ＩＦＮは抗ウイルス活性、免疫調節活性及
び細胞変性活性を示す。ＩＦＮ−αのサブタイプ（例え
ばＩＦＮ−α₂ 、ＩＦＮ−α₁ ）は異る標的細胞特異性
を示すことが証明されている。ＩＦＮ−α₂ 及びＩＦＮ
−α₁ の抗ウイルス活性はウシ（ＭＤＢＫ）細胞に対し
てはおよそ同じであるが、ヒト（ＷＩＳＨ）細胞に対し
てはＩＦＮ−α₂ がＩＦＮ−α₁ に比べて７倍効果的で
あり、そしてマウス（Ｌ９２９）細胞の保護については
ＩＦＮ−α₂ の活性はＩＦＮ−α₁ のそれの３０分の１
である〔 M.Streuli等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 78,
2848 (1981) 〕。

【０００６】多遺伝子ＩＦＮ−α群の構成員はそれらの
抗ウイルス活性の程度及び特異性を異にするという証拠
が幾つかのＩＦＮ−α“ハイブリド”から得られた結果
により確認されている (ＥＰ３２１３４，ＵＳ４，４１
４，１５０を参照のこと）。これらの“ハイブリド”は
インターフェロン−αのサブタイプをコードする２つの
遺伝子を制限酵素ＰｖｕII（又は、２つのケースにおい
てはＢｇｌII）により開裂せしめ、そして得られた断片
を交差連結して、１つのＩＦＮ遺伝子のアミノ末端部分
をコードするＤＮＡ配列を他方のＩＦＮ遺伝子のカルボ
キシ末端部分をコードするＤＮＡ配列に融合せしめるこ
とにより造成された。

【０００７】これらのハイブリドインターフェロンは、
親インターフェロンに比べて標的細胞特異性における変
化を示すが、３種類のインターフェロン活性のいずれか
のなんらかの減少又はなんらかの制限が存在することは
証明されなかった。このような減少又は制限は、例え
ば、投与されたインターフェロンの他の活性によりもた
らされる因子を併発する可能性を伴わないでウイルス感
染のごとき特定の問題にインターフェロン療法を集中す
ることが望ましい臨床的適用において、好ましいであろ
う。

【０００８】

【発明の目的】従って、この発明の１つの目的は、イン
ターフェロンにより誘発される生化学的経路の幾つかの
みの選択的又は優先的活性化により生ずる一層特異的な
生物学的活性を示し、そして天然インターフェロンのそ
の使用を制限する不所望の副作用、例えばインフルエン
ザ様症状（例えば、発熱、頭痛及び疲労）、胃腸不全、
血圧の低下及び脱毛が排除され又は低減されている新規
なハイブリドインターフェロンをコードする遺伝子系を
提供する。

【０００９】

【発明の概要】この発明の遺伝子がコードするハイブリ
ドインターフェロンは、次の配列：

【化１】 を有する、ヒト−リンポブラストイドインターフェロン
ＬｙＩＦＮ−α−２と、

【００１０】次の配列：

【化２】 を有するヒト−リンポブラストイドインターフェロンＬ
ｙＩＦＮ−α−３とに由来する。

【００１１】これらのインターフェロン及びその製造方
法は、ヨーロッパ特許出願 No.７６，４８９に記載され
ている。ＬｙＩＦＮ−α−２はヒト白血球インターフェ
ロンＬｅＩＦ−αＢ（米国特許 No.４，４１４，１５０
を参照のこと）と近縁であり（しかしそれと同一ではな
い）、そして一次ウシ腎細胞及びヒト胎児包皮細胞（Ｈ
ＥＦ）（それぞれ水疱性口内炎ウイルスに感染したも
の）に対してそれぞれ１．８５×１０⁸ IU／mg及び２．
４５×１０⁸ IU／mgの比活性を有する。

【００１２】ＬｙＩＦＮ−α−３はヒト白血球インター
フェロンＬｅＩＦ−αＤ（米国特許No.４，４１４，１
５０を参照のこと）に近縁であり（しかしそれと同一で
はない）、そしてウシの細胞及びＨＥＦ細胞（前記と同
様）に対してそれぞれ１．３２×１０⁸ IU／mg及び３．
７×１０⁶ IU／mgの比活性を有する。さらに、ＬｙＩＦ
Ｎ−α−３はＬｙＩＦＮ−α−２に比べて高い熱安定性
及び低い抗増殖活性を有する。

【００１３】この発明の特定の目的は、ヒトの細胞に対
するＬｙＩＦＮ−α−２の高い抗ウイルス力価及び／又
は高い抗増殖活性と、ＬｙＩＦＮ−α−３の高い熱安定
性を併せ持つＬｙＩＦＮ−α−２／α−３ハイブリドポ
リペプチドを提供することである。

【００１４】この発明は特に、ヒト−リンポブラストイ
ドインターフェロンＬｙＩＦＮ−α−２及びＬｙＩＦＮ
−α−３のサブ配列にアミノ酸の同一性及び数において
対応する２〜４個のサブ配列から成るアミノ酸配列を有
するハイブリドインターフェロンポリペプチドに関し、
このハイブリドインターフェロンポリペプチドは、Ｌｙ
ＩＦＮ−α−２のアミノ酸１〜１５０とＬｙＩＦＮ−α
−３のアミノ酸１５１〜１６６とから成るアミノ酸配列
を有するポリペプチド、ＬｙＩＦＮ−α−２のアミノ酸
１〜９２とＬｙＩＦＮ−α−３のアミノ酸９３〜１５０
とＬｙＩＦＮ−α−２のアミノ酸１５１〜１６６とから
成るアミノ酸配列を有するポリペプチド、及びＬｙＩＦ
Ｎ−α−２のアミノ酸１〜６０とＬｙＩＦＮ−α−３の
アミノ酸６１〜９２とＬｙＩＦＮ−α−２又はＬｙＩＦ
Ｎ−α−３のアミノ酸９３〜１５０とＬｙＩＦＮ−α−
２又はＬｙＩＦＮ−α−３のアミノ酸１５１〜１６６と
から成るアミノ酸配列を有するポリペプチドから成る群
から選択される。

【００１５】

【具体的な説明】さらに具体的には、この発明のＤＮＡ
がコードしているハイブリドインターフェロンは、次の
式（Ｉ）：

【化３】 で表わされるハイブリドインターフェロン“Ｂ₁ Ｂ₂ Ｂ
₃ Ｄ₄ ”；

【００１６】次の式（II）：

【化４】 で表わされるハイブリドインターフェロン“Ｂ₁ Ｂ₂ Ｄ
₃ Ｂ₄ ”；

【００１７】次の式（III)：

【化５】 で表わされるハイブリドインターフェロン“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｂ
₃ Ｄ₄ ”；

【００１８】次の式（IV) ：

【化６】 で表わされるハイブリドインターフェロン“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｄ
₃ Ｂ₄ ”；

【００１９】次の式（Ｖ) ：

【化７】 で表わされるハイブリドインターフェロン“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｄ
₃ Ｄ₄ ”；及び、

【００２０】次の式（VI) ：

【化８】 で表わされるハイブリドインターフェロン“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｂ
₃ Ｂ₄ ”；に関する。

【００２１】この発明の最も好ましいハイブリドインタ
ーフェロンは“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｄ₃ Ｄ₄ ”（Ｖ）、及び“Ｂ₁
Ｂ₂ Ｄ₃ Ｂ₄ ”（II）である。

【００２２】この発明のハイブリドインターフェロン
は、例えば次の段階： （ａ）インターフェロンＬｙＩＦＮ−α−２及びＬｙＩ
ＦＮ−α−３のそれぞれアミノ酸６０、アミノ酸９２及
びアミノ酸１５０に相当する位置におけるインビトロ組
換によるか、又は化学的ＤＮＡ合成により前記インター
フェロンをコードする構造遺伝子を含んで成るＤＮＡを
調製し、そしてこの得られたＤＮＡを適当な発現ベクタ
ーに導入し； （ｂ）ハイブリドＩＦＮ構造遺伝子を担持する得られた
ハイブリドベクターを受容体宿主に移し；

【００２３】（ｃ）通常、形質転換された宿主のみが生
存する条件下で培養することにより未形質転換宿主から
形質転換宿主を選択し； （ｄ）該形質転換された宿主を前記ハイブリドＩＦＮ構
造遺伝子の発現を許容する条件下で培養し；そして、 （ｅ）発現されたハイブリドＩＦＮを単離する；ことを
含んで成る組換ＤＮＡ技法により製造することができ
る。適用される方法は、以下の詳細な記載及び添付図面
により一層明らかになるであろう。

【００２４】１．ハイブリドＩＦＮ構造遺伝子を含有す
るハイブリドベクターの調製 ヒト−インターフェロン−α−サブタイプα−２及びα
−３のｃＤＮＡはＥ．コリ（E.coli）中にクローン化さ
れている。すなわち、プラスミドｐＢＲ（ＡＰ）／Ｌｙ
ＩＦＮ−α−２及びｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩＦＮ−α−
３は、β−ラクタマーゼプロモーターの制御のもとにＬ
ｙＩＦＮ−α−２及びＬｙＩＦＮ−α−３のコード領域
を含有するＨｉｎｄIII −ＰｓｔＩ（又はＥ₁₀ＲＩ−Ｐ
ｓｔＩ）ＤＮＡ挿入部を含有する（ヨーロッパ特許出願
No.７６，４８９を参照のこと）。

【００２５】この挿入部の制限地図を図４に示す。これ
らの遺伝子は幾つかの共通の制限部位を共有し（ＩＦＮ
アミノ酸配列の６０位、９２位及び１５０位に位置す
る）、これらを、好都合な生物学的及び／又は物理的性
質を有するハイブリドインターフェロンをコードする新
規な遺伝子を造成するために便利に使用することができ
ることが容易にわかる。

【００２６】従って、ＬｙＩＦＮ−α−２遺伝子及びＬ
ｙＩＦＮ−α−３遺伝子の間の組換体（１又は複数の交
換）を、ＰｖｕII部位（９２位）及び／又はＳａｕ３Ａ
部位（６０位及び１５０位）におけるインビトロ組換に
よって生じさせることができる。インターフェロンの一
次構造を４個のセクション（アミノ酸１−６０の第１セ
クション、アミノ酸６１−９２の第２セクション、アミ
ノ酸９３−１５０の第３セクション、及びアミノ酸１５
１−１６６の第４セクション、図４を参照のこと）に分
けることができるから、それぞれがこれらのセクション
の１つを示す４個の文字によりこの発明のハイブリドイ
ンターフェロンを命名することができる。

【００２７】従って例えば、インターフェロンＬｙＩＦ
Ｎ−α−２（前記のようにＩＦＮ−αＢに金縁であるの
で“Ｂ”とする）のセクション１〜３とＬｙＩＦＮ−α
−３（前記のようにＩＦＮ−αＤに近縁であるので
“Ｄ”とする）のセクション４とから成るハイブリドイ
ンターフェロン（Ｉ）はＩＦＮ“Ｂ₁ Ｂ₂ Ｂ₃ Ｄ₄ ”と
称される。

【００２８】所望のハイブリドインターフェロンの製造
を促進するため、ＬｙＩＦＮ−α−２及びＬｙＩＦＮ−
α−３コード領域を含有するＤＮＡ挿入部を、再連結の
ために制限部位ＨｉｎｄIII （又はＥｃｏＲＩ）、Ｐｖ
ｕII及びＰｓｔＩがそれらの挿入部についてユニークで
あるように変形しなければならない。ＬｙＩＦＮ−α−
２をコードする遺伝子の３′シストロン外領域に追加の
ＰｖｕII部位が存在することが図４から明らかである。

【００２９】この部位は、例えば、ＬｙＩＦＮ−α−２
コード領域を含有するハイブリドベクターをＰｖｕIIに
より部分開裂せしめ、生ずる線状化ＤＮＡを制限酵素Ｐ
ｓｔＩにより認識されるＤＮＡ配列を含有するリンカー
に連結し、ＰｓｔＩにより開裂せしめ、その消化物を低
ＤＮＡ濃度において再連結し、そして所望の変形、すな
わちＰｖｕII部位が除去された短縮された３′シストロ
ン外領域を有するプラスミドを選択する（例えば制限酵
素分析により）ことにより容易に除去することができ
る。同様にして、ＩＦＮ遺伝子をクローニングするため
に使用されるベクターを、これらにとって制限部位Ｈｉ
ｎｄIII ，ＰｖｕII及びＰｓｔＩがユニークであるよう
に有利に変形することができる。

【００３０】この発明は、式（Ｉ）〜（VI）のハイブリ
ドインターフェロンのいずれかをコードしそして発現制
御配列に作用可能に連結されているＤＮＡ配列を含んで
成るハイブリドベクター、及びその製造方法に関する。

【００３１】ベクターは、形質転換に使用される宿主細
胞に依存して選択される。適当な宿主の例は、制限酵素
又は修飾酵素を有しないか又は少ししか有しない微生
物、例えば酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエー
(Saccharomyces cerevisiae)、及び細菌の株、特にエシ
ェリシヤ・コリ(Escherichia coli)の株、例えばＥ．コ
リＸ１７７６、Ｅ．コリＨＢ１０１、Ｅ．コリＷ３１１
０、Ｅ．コリＨＢ１０１／ＬＭ１０３５、Ｅ．コリＪＡ
２２１及びＥ．コリＫ１２株２９４、バシルス・ズブチ
リス(Bacillus subtillis)、バシルス・ステアロサーモ
フィルス(Bacillus stearothermophilus) 、シュードモ
ナス(Pseudomonas) 、ヘモフィルス(Haemophilus) 、ス
トレプトコッカス(Streptococcus) 等、そしてさらに高
等生物の細胞、特に樹立されたヒト又は動物のセルライ
ンである。Ｅ．コリの上記の株、例えばＥ．コリＨＢ１
０１及びＥ．コリＪＡ２２１、そしてさらにサッカロミ
セス・セレビシエーが宿主微生物として好ましい。

【００３２】特に、選択された宿主中で複製し、そして
この発明のハイブリドＩＦＮ遺伝子を発現するすべての
ベクターが適当である。Ｅ．コリ株中でのハイブリドイ
ンターフェロン遺伝子の発現に適当なベクターの例は、
バクテリオファージ、例えばλバクテリオファージの誘
導体、又はプラスミド、例えば特に、プラスミドＣｏｌ
Ｅ１及びその誘導体、例えばｐＭＢ９，ｐＳＦ２１２
４，ｐＢＲ３１７又はｐＢＲ３２２である。この発明の
好ましいベクターはプラスミドｐＢＲ３２２に由来す
る。

【００３３】適当なベクターは完全なレプリコン及びマ
ーカー遺伝子を含有し、このマーカー遺伝子は表現型形
質に基いて発現プラスミドにより形質転換された宿主を
選択しそして同定することを可能にする。適当なマーカ
ー遺伝子は宿主に、例えば重金属、抗生物質等に対する
耐性を付与する。さらに、この発明の好ましいベクター
は、レプリコン及びマーカー遺伝子領域の外側に制限エ
ンドヌクレアーゼのための認識配列を含有し、これによ
ってこれらの部位にハイブリドＩＦＮ遺伝子及び適当な
場合には発現制御配列を挿入することができる。

【００３４】好ましいベクターであるプラスミドｐＢＲ
３２２は、無傷のレプリコン、テトラサイクリン及びア
ンピシリンに対する耐性を付与するマーカー遺伝子（ｔ
ｅｔ ^R 及びａｍｐ^R ）、並びに例えばＰｓｔＩ（ａｍｐ
^R 遺伝子中を開裂せしめ、ｔｅｔ^R 遺伝子を無傷のまま
残す）、ＢａｍＨＩ，ＨｉｎｄIII 及びＳａｌＩ（いず
れもｔｅｔ^R 遺伝子を開裂せしめ、ａｍｐ^R 遺伝子中を
無傷のまま残す）、ＮｒａＩ、並びにＥｃｏＲＩの多数
のユニーク制限部位を含有する。

【００３５】幾つかの発現制御配列を遺伝子発現の制御
のために使用することができる。特に、形質転換される
べき宿主の高度に発現される遺伝子の発現制御配列が使
用される。ハイブリドベクターとしてのｐＢＲ３２２及
び宿主微生物としてのＥ．コリの場合には、例えば、ラ
クトースオペロン、トリプトファンオペロン、アラビノ
ースオペロン等、及びβ−ラクタマーゼ遺伝子の発現制
御領域（これらは特にプロモーター及びリボゾーム結合
部位を含む）、並びにファージλＮ遺伝子又はファージ
ｆｄ−コート蛋白質遺伝子の対応する配列等が適当であ
る。プラスミドｐＢＲ３２２はβ−ラクタマーゼ遺伝子
（β−ｌａｃ遺伝子）のプロモーターをすでに含有して
いるが、このプラスミドに他の発現制御配列を導入しな
ければならない。

【００３６】酵母中での複製及び発現のために適当なベ
クターは、酵母複製開始点、及び酵母のための選択遺伝
子マーカーを含有する。酵母複製開始点、例えば染色体
自律複製セグメント（ａｒｓ）を含有するハイブリドベ
クターは、形質転換の後酵母細胞内で染色体外に維持さ
れ、そして自律的に複製する。さらに、酵母２μプラス
ミドＤＮＡに相同な配列を含有するハイブリドベクター
を使用することができる。

【００３７】このようなハイブリドベクターは、細胞内
にすでに存在する２μプラスミド中に組換により組み込
まれるか、あるいは自律的に複製するであろう。２μ配
列は、高形質転換頻度を有するプラスミドのために特に
有用であり、そして高コピー数を可能にする。この発明
の好ましいベクターはプラスミドｐＪＤＢ２０７であ
る。

【００３８】酵母のための適当なマーカー遺伝子は特
に、宿主に抗生物質耐性を付与するもの、又は栄養要求
性酵母変異株の場合には宿主の欠損を補完する遺伝子で
ある。対応する遺伝子は例えば、抗生物質シクロヘキシ
ミドに対して耐性を付与するもの、又は栄養要求性酵母
変異株に原栄養性を提供するものであり、例えばＵＲＡ
３，ＬＥＡ２，ＨＩＳ３，又は特にＴＲＰ１遺伝子であ
る。好ましくは酵母ハイブリドベクターはさらに、ハイ
ブリドベクター及びその中間体の造成及びクローニング
を細菌宿主中で行うことができるように、細菌宿主、特
にＥ．コリのための複製開始点及びマーカー遺伝子を含
有する。

【００３９】酵母中での発現に適する発現制御配列は例
えば高度に発現される酵母遺伝子の制御配列である。す
なわち、ＴＲＰ１遺伝子、ＡＤＨＩ又はＡＤＨII遺伝
子、酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ３又はＰＨＯ５）遺伝
子、イソチトクローム遺伝子のプロモーター、又は解糖
経路の酵素に関与するプロモーター、例えばエノラー
ゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲ
ナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、３−ホスホグリセレートキナー
ゼ（ＰＧＫ）、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキ
ラーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、グルコース−６−ホ
スフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムタ
ーゼ、ピルベートキナーゼ、トリホスフェートイソメラ
ーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ及びグルコキナー
ゼ遺伝子のプロモーターを使用することができる。

【００４０】この発明の好ましいプロモーターは転写制
御を伴うプロモーター、例えばＰＨＯ５，ＡＤＨII及び
ＧＡＰＤＨ遺伝子のプロモーターを含有し、これらは増
殖条件の変化によりターンオン又はターンオフされ得
る。例えば、ＰＨＯ５プロモーターは単に培地中の無機
リン酸塩の濃度を上昇又は低下せしめることによって抑
制又は抑制解除され得る。哺乳動物細胞中で使用するた
めのプロモーターは、例えばウイルスプロモーター、例
えばＨＴＬＶ，ＳＶ４０、ワクチニアプロモーター等で
ある。

【００４１】ハイブリドインターフェロンの効果的な発
現を保証するように、プロモーターがコード領域に連結
される。この発明の１つの態様においては、プロモータ
ーが連結部に挿入された翻訳開始シグナル（ＡＴＧ）を
介して成熟ハイブリドＩＦＮのコード領域に直接連結さ
れる。プロモーターをハイブリドＩＦＮコード領域に連
結するための好ましい領域は大ｍＲＮＡ出発部とそのプ
ロモーターに天然に付加されている遺伝子のＡＴＧとの
間である。

【００４２】この発明の他の態様において、特に宿主微
生物として酵母が使用される場合、造成物中にシグナル
配列を含有せしめる。適当なシグナル配列は使用される
プロモーターに天然に連結されているものである。例え
ば、ＰＨＯ５シグナル配列、さらに酵母インベルターゼ
遺伝子又はα−ファクター遺伝子のシグナル配列を使用
することができる。シグナル配列と成熟ハイブリドＩＦ
Ｎアミノ酸配列との間の正確な開裂を可能にする組み合
わせが好ましい。

【００４３】追加の配列、特異的なプロセシングシグナ
ルを担持しているか又は担持していいないプロ配列又は
スペーサー配列をも造成物中に含有せしめて前駆体分子
の正確なプロセシングを促進することが好ましい。他の
方法として、インビボ又はインビトロで適切な成熟を可
能にする内部プロセシングシグナルを含有する融合蛋白
質を生じさせることができる。

【００４４】好ましくは、この発明のハイブリドベクタ
ーはさらに、転写停止及びポリアデニレーションのため
の適切なシグナルを含有する、遺伝子の３′−フランキ
ング領域をも含有する。適当な３′−フランキング領域
は、例えば使用されるプロモーターに天然に連結されて
いる遺伝子のそれである。酵母が宿主微生物として使用
されそしてＰＨＯ５プロモーターが発現制御配列として
使用される場合、３′−フランキング配列は好ましくは
ＰＨＯ５遺伝子のそれである。

【００４５】好ましい態様において、この発明は、宿主
株において複製及び表現型選択が可能でありそしてプロ
モーター及び新規なハイブリドインターフェロンのいず
れかをコードするＤＮＡ配列を含んで成るハイブリドベ
クターに関し、このＤＮＡ配列はこのハイブリドベクタ
ー中の転写開始シグナル及び転写停止シグナル並びに翻
訳開始シグナル及び翻訳終止シグナルと共に、前記プロ
モーターの制御のもとにあり、この結果、形質転換され
た宿主中で該ＤＮＡ配列が発現されこの発明のハイブリ
ドインターフェロンが生産される。

【００４６】この発明のハイブリドベクターは、ＬｙＩ
ＦＮ−α−２コード領域及びＬｙＩＦＮ−α−３コード
領域の適当なセグメントをインビトロ連結し、得られる
ハイブリドＩＦＮ遺伝子を適当なベクターに挿入する
か、又は特定のＩＦＮ−ＤＮＡセグメントを、残りの部
分をすでに含有する線状化されたベクターＤＮＡに挿入
して所望のハイブリドインターフェロンをコードする遺
伝子を形成することにより製造することができる。アミ
ノ末端配列を提供するＤＮＡセグメントが発現制御配列
にすでに融合していることが好ましい。

【００４７】ＬｙＩＦＮ−α−２コード領域及びＬｙＩ
ＦＮ−α−３コード領域の適切なセグメントは特にこの
発明の好ましい出発ベクター、すなわちｐＢＲ３２２由
来のプラスミドｐＡＭ２及びｐＡＭ２１から得られる。
プラスミドｐＡＭは、β−ラクタマーゼプロモーターの
制御のもとにＬｙＩＦＮ−α−３コード領域を含有する
ＨｉｎｄIII −ＰｓｔＩ挿入部を含有する。

【００４８】プラスミドｐＡＭ２のベクター部分はＰｖ
ｕIIに対して耐性である。プラスミドｐＡＭ２１は、９
２位にユニークＰｖｕII部位を有しそしてβ−ラクタマ
ーゼプロモーターの制御のもとにあるＬｙＩＦＮ−α−
２コード領域を含有するＨｉｎｄIII −ＰｓｔＩを含有
する。プラスミドｐＡＭ２１のベクター部分は同様にＰ
ｖｕIIに対して耐性である。

【００４９】特に、ハイブリドインターフェロン“Ｂ₁
Ｂ₂ Ｂ₃ Ｄ₄ ”をコードする遺伝子はプラスミドｐＡＭ
２１の大ＰｓｔＩ−ＰｖｕII断片、プラスミドｐＡＭ２
１の小Ｓａｕ３Ａ−ＰｖｕII断片及びプラスミドｐＡＭ
２の小Ｓａｕ３Ａ−ＰｓｔＩ断片を連結することによっ
て調製される。この造成は、β−ラクタマーゼプロモー
ターの制御のもとにハイブリドインターフェロン“Ｂ₁
Ｂ₂ Ｂ₃ Ｄ₄ ”コード領域を含有するプラスミドｐＪＣ
３４４をもたらす。

【００５０】同様にして、ハイブリドインターフェロン
“Ｂ₁ Ｂ₂ Ｄ₃ Ｂ₄ ”をコードする遺伝子は、プラスミ
ドｐＡＭ２１の大ＰｖｕII−ＰｓｔＩ断片、プラスミド
ｐＡＭ２の小Ｓａｕ３Ａ−ＰｖｕII断片及びプラスミド
ｐＡＭ２１の小Ｓａｕ３Ａ−ＰｓｔＩ断片を連結するこ
とによって調製される。この造成は、β−ラクタマーゼ
プロモーターの制御のもとにハイブリドインターフェロ
ン“Ｂ₁ Ｂ₂ Ｄ₃ Ｂ₄”コード領域を含有するプラスミ
ドｐＪＣ３４２をもたらす。

【００５１】ハイブリドインターフェロン“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｄ
₃ Ｄ₄ ”をコードする遺伝子は、プラスミドｐＡＭ２１
の小ＨｉｎｄIII −Ｓａｕ３Ａ断片、プラスミドｐＡＭ
２の小Ｓａｕ３Ａ−ＰｖｕII断片及びプラスミドｐＡＭ
２の大ＰｖｕII−ＨｉｎｄIII 断片を連結することによ
り調製することができる。この造成は、β−ラクタマー
ゼプロモーターの制御のもとにハイブリドインターフェ
ロン“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｄ₃ Ｄ ₄ ”コード領域を含有するプラス
ミドｐＡＭ９４をもたらす。

【００５２】同様にして、ハイブリドインターフェロン
“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｂ₃ Ｂ₄ ”をコードする遺伝子は、プラスミ
ドｐＡＭ２１の小ＨｉｎｄIII −Ｓａｕ３Ａ断片、プラ
スミドｐＡＭ２の小Ｓａｕ３Ａ−ＰｖｕII断片及びプラ
スミドｐＡＭ２１の大ＰｖｕII−ＨｉｎｄIII 断片を連
結することにより調製される。この造成は、β−ラクタ
マーゼプロモーターの制御のもとにハイブリドインター
フェロン“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｂ ₃ Ｂ₄ ”コード領域を含有するプ
ラスミドｐＡＭ９０をもたらす。

【００５３】ハイブリドインターフェロン“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｂ
₃ Ｄ₄ ”コード領域を含有するプラスミド（例えばプラ
スミドｐＤＭ１）又はハイブリドインターフェロン“Ｂ
₁ Ｄ ₂ Ｄ₃ Ｂ₄ ”コード領域を含有するプラスミド（例
えばプラスミドｐＤＭ２）を同様にして調製することが
できる。

【００５４】これらのプラスミドは、Ｅ．コリ中で複製
し、そしてハイブリドＩＦＮ遺伝子を発現するために適
当である。所望により、前記ハイブリドインターフェロ
ンのいずれかをコードするＤＮＡ挿入部を対応するプラ
スミドから切り出しそして異るベクターＤＮＡに導入す
ることができる。こうして、β−ラクタマーゼプロモー
ター以外のプロモーターの制御のもとにハイブリドイン
ターフェロンコード領域を含有し、そして／又はＥ．コ
リ以外の宿主中で遺伝子が発現されることを可能にする
プラスミドを得ることができる。

【００５５】前記ハイブリドインターフェロンのいずれ
かをコードする構造遺伝子を含んで成るＤＮＡの調製は
また、化学合成によっても行うことができる。ＤＮＡの
合成のための適当な方法はS.A.Narang〔Tetrahedron 3
9, 3 (1983)〕により要約されている。既知の合成技法
が、長さ２０塩基までのポリヌクレオチドを良好な収率
で、高純度で、そして比較的短時間に調製することを可
能にする。

【００５６】適切に保護されたヌクレオチドがホスホジ
エステル法〔 K.L.Agarwal等、Angew.Chem. 84, 489 (1
972)〕により、又は一層効率的なホスホトリエステル法
〔 R.L.Letsinger等、 J.Am.Chem.Soc. 98, 3655 (197
6) 〕により相互に連結される。ヌクレオチド鎖が適当
なポリマーにより結合される固相法によりオリゴヌクレ
オチド及びポリヌクレオチドの合成を簡単にすることが
できる。

【００５７】Itakura等、〔 J.Am.Chem.Soc. 103 , 706
(1981)〕は、個々のヌクレオチドではなく固相合成に
おいてホスホトリエステル法により連結されるトリヌク
レオチドを使用し、これらを短時間で且つ良好な収量で
縮合せしめて、例えば３１塩基のポリペプチドを得てい
る。実際の２本鎖ＤＮＡを化学合成された短セグメント
から酵素的に組み立てることができる。このために、 K
horana等〔 J.Biol.Chem. 251 , 565 (1976)〕は両ＤＮ
Ａ鎖からのオーバーラップするポリヌクレオチド配列を
使用しており、これらの塩基対合により正しい配置で一
緒にされ、そして次に酵素ＤＮＡリガーゼにより化学的
に連結される。

【００５８】他の可能な方法においては、２つのＤＮＡ
鎖のそれぞれのポリヌクレオチド配列を、オーバーラッ
プする短セグメントを伴って、４種類の必要なデオキシ
ヌクレオチドトリホスフェートの存在下で、ＤＮＡポリ
メラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼＩ、ポリメラーゼ
ＩのKlenow断片、もしくはＴ₄ ＤＮＡポリメラーゼ、又
はＡＭＶ（鳥類骨髄芽球症ウイルス）逆転写酵素と共に
インキュベートする。

【００５９】こうすることによって２つのポリヌクレオ
チドが塩基対合により正しい位置で一緒にされ、そして
必要なヌクレオチドが酵素により補完されて完全な２本
鎖ＤＮＡが与えられる〔 S.A.Nargang等、Anal.Bioche
m. 121 , 356 (1982)〕。 Itakura等〔 J.Biol.Chem. 2
57 , 9226 (1982) 〕は、この原理に基いて、いかにし
てヒト白血球インターフェロンα₂ −遺伝子の１３５塩
基対のセグメントがＤＮＡポリメラーゼＩ（Klenow断
片）の存在下で４個の３９〜４２塩基対の化学合成断片
から組立てられ、そしてリガーゼのみを用いる方法と比
べて化学合成における４０％の節約が達成されるかにつ
いて記載している。この発明のＤＮＡを調製するために
適切な方法が例えばヨーロッパ特許出願 No.１４６，７
８５に記載されている。

【００６０】この発明のハイブリドインターフェロンの
いずれかをコードする構造遺伝子を含んで成る化学的に
合成されたＤＮＡは、発現制御配列がこの遺伝子の発現
を制御するような態様で、発現制御配列を含有するベク
ターＤＮＡに挿入することができる。

【００６１】２．宿主細胞の形質転換 この発明はまた、形質転換された宿主の製造方法に関
し、この方法はこの発明のハイブリドインターフェロン
のいずれかをコードしそして発現制御配列によって制御
されるＤＮＡ配列を含んで成る発現ベクターにより宿主
を形質転換することを含んで成る。

【００６２】適当な宿主の例は上記の微生物、例えばサ
ッカロミセス・セレビシエー、バシルス・ズブチリス、
及びエシェリシャ・コリの株である。この発明の発現プ
ラスミドによる形質転換は、例えば文献に記載されてい
るようにして、すなわちＳ・セレビシエーについてはA.
Hinnen等、 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75, 1929(1978),
Ｂ．ズブチリスについてはAn agnostopoulos等、 J.Bac
teriol. 81, 741 (1961), そしてＥ．コリについてはM.
Mandel等、J.Mol.Biol. 53, 159 (1970)に記載されてい
るようにして行われる。

【００６３】従って、Ｅ．コリ細胞の形質転換法は、Ｄ
ＮＡの取り込みを可能にするための細胞のＣａ⁺⁺による
前処理、及びハイブリドベクターとのインキュベーショ
ンを含む。細胞は親細胞からの形質転換細胞の分離を可
能にする選択増殖培地に移される。ベクターを含有しな
い細胞はこのような培地に生存しないであろう。

【００６４】酵母の形質転換は、例えば（１）グルコシ
ダーゼによる酵母細胞壁の酵素的除去、（２）ポリエチ
レングリコール及びＣａ⁺⁺イオンの存在下でのベクター
による得られたスフェロプラストの処理、及び（３）該
スフェロプラストを寒天に包埋することによる細胞壁の
再生の段階を含んで成る。好ましくは、再生寒天は細胞
壁の再生と形質転換された再細胞の選択とを同時に可能
にするように調製される。この発明はまた、上記の経路
で得られる形質転換された宿主に関する。

【００６５】３．形質転換された宿主細胞の培養及び発
現されたハイブリドインターフェロンの単離 この発明はさらに、式（Ｉ）〜（VI）のハイブリドイン
ターフェロンの製造方法に関し、この方法は該ハイブリ
ドインターフェロンのいずれかをコードするＤＮＡ配列
を含有するハイブリドベクターにより形質転換された宿
主細胞を培養し、そしてハイブリドインターフェロンを
単離することを特徴とする。

【００６６】形質転換された細胞を、資化性の炭素源、
窒素源及び無機塩を含有する液体培地中で当業界におい
て既知の方法により培養する。この発明の形質転換され
た宿主の培養のために種々の炭素源を使用することがで
きる。好ましい炭素源の例として資化性炭水化物、例え
ばグルコース、マルトース、マンニトールもしくはラク
トース、又は酢酸塩が挙げられ、これらは単独で、又は
適当な混合物として使用することができる。

【００６７】適当な窒素源の例として、アミノ酸、例え
ばカザミノ酸、ペプチド並びに蛋白質及びその分解生成
物、例えばトリプトン、ペプトン、又は肉エキス、そし
てさらに酵母エキス、マルトエキス、そしてさらにアン
モニウム塩、例えば塩化アンモニウム、硫酸アンモニウ
ム又は硝酸アンモニウムが挙げられ、これらは単独で又
は適当な混合物として使用することができる。

【００６８】さらに使用することができる無機塩は、例
えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、及びカル
シウムの硫酸塩、塩化物、リン酸塩及び炭酸塩である。
培地はさらに、例えば増殖促進物質、例えば微量元素、
例えば鉄、亜鉛、マンガン等、及び好ましくは選択圧を
与えそして発現プラスミドを失った細胞の増殖を阻害す
る物質を含有する。すなわち、例えば、発現プラスミド
がａｍｐ^R 遺伝子を含有する場合にはアンピシリンを培
地に加える。

【００６９】抗生物質のこのような添加はさらに、抗生
物質感受性の汚染微生物を破壊する効果を有する。例え
ば必須アミノ酸について栄養要求性である酵母菌株が宿
主微生物として使用される場合、プラスミドは好ましく
は宿主の欠損を補完する酵素をコードする遺伝子を含有
する。酵母菌株の培養は前記アミノ酸に欠ける最少培地
中で行われる。

【００７０】培養は当業界において既知の方法により行
われる。培養条件、例えば温度、培地のpH値及び発酵時
間は、ハイブリドインターフェロンの最高力価が得られ
るように選択される。すなわち、Ｅ．コリ又は酵母菌株
は、振とう又は攪拌を伴う深部培養による好気的条件
下、約２０℃〜４０℃において、好ましくは約３０℃に
おいて、そして４〜８のpH値、好ましくは約pH７におい
て、約４〜３０時間、好ましくはハイブリドインターフ
ェロンの最高収量が達成されるまで培養される。

【００７１】驚くべきことに、この発明のハイブリドイ
ンターフェロンの最高力価、例えば、標準的条件下で培
養された形質転換酵母の粗抽出物中に得られるハイブリ
ドインターフェロン“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｄ₃ Ｂ₄ ”，“Ｂ₁ Ｄ₂
Ｂ₃ Ｄ₄ ”，“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｄ₃Ｄ₄ ”、及び“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｂ
₃ Ｂ₄ ”の最高力価は、米国特許４，４１４，１５０に
記載されているハイブリドインターフェロン“ＢＤ”及
び“ＤＢ”に極めて近縁なハイブリドインターフェロン
“Ｂ₁ Ｂ₂ Ｄ₃ Ｄ₄ ”及び“Ｄ₁ Ｄ₂ Ｂ₃ Ｂ₄”、並び
にインターフェロン−α−２のそれよりも明らかに高い
ことが見出された。

【００７２】細胞濃度が十分な値に達した時培養を停止
しそしてハイブリドインターフェロンを宿主の細胞から
放出せしめる。この目的のため、例えば洗剤、例えばＳ
ＤＳ又はトリトンで処理することにより細胞を破壊し、
あるいはリゾチーム又は同様に作用する酵素により細胞
を溶解する。酵母を宿主微生物として使用する場合、グ
ルコシダーゼを用いる酵素的消化により細胞壁を除去す
る。

【００７３】この方法に代えて、又はこの方法に加え
て、機械的な力、例えば剪断力（例えばＸ−プレス、フ
レンチプレス、ダイノミルによる）、又はガラスビーズ
もしくは酸化アルミニウムとの振とう、又は例えば液体
窒素中での凍結と例えば３０℃〜４０℃での解凍との反
復、あるいは超音波を用いて細胞を破壊することができ
る。蛋白質、核酸及び他の細胞成分を含有する得られた
混合物を、遠心分離した後それ自体既知の方法により、
ハイブリドインターフェロンを含有する蛋白質について
濃縮する。

【００７４】すなわち、例えば非蛋白質性成分のほとん
どをポリエチレンアミン処理により除去し、そしてハイ
ブリドインターフェロンを含む蛋白質を、例えば硫酸ア
ンモニウム又は他の塩による溶液の飽和により沈澱せし
める。細菌性蛋白質はさらに、酢酸による酸性化によっ
て（例えば０．１％，pH４〜５）沈澱せしめることがで
きる。

【００７５】これ以上の精製段階は、例えば限外濾過、
ダイアフィルトレーション、ゲル電気泳動、クロマトグ
ラフ法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、サイズ
排除クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ等、
適当なセファデックスカラムによる分子サイズによる混
合物の成分の分離透析、アフィニティークロマトグラフ
ィー、例えば抗体、特にモノクローナル抗体のアフィニ
ティークロマトグラフィー、及び他の既知の方法、特に
当業界において知られている方法を包含する。

【００７６】驚くべきことに、この発明のハイブリドイ
ンターフェロンはインターフェロンＬｙＩＦＮ−α−２
及びハイブリドインターフェロン“Ｂ₁ Ｂ₂ Ｄ₃ Ｄ₄ ”
よりも高い熱安定性を有する。すなわち、抗ウイルス活
性の５０％が失われる温度（１℃／分でのＩＦＮ溶液の
温度の上昇）はＬｙＩＦＮ−α−２の場合６２．８℃で
あり、そしてハイブリドインターフェロン“Ｂ₁ Ｂ₂ Ｄ
₃ Ｄ₄ ”の場合６３℃であるが例えばハイブリドインタ
ーフェロン“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｄ₃ Ｄ₄ ”，“Ｂ₁ Ｄ₂Ｂ
₃ Ｂ₄ ”，“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｂ₃ Ｄ₄ ”及び“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｄ₃ Ｂ
₄ ”の対応する値はそれぞれ６５℃，６４．７℃，６
５．３℃及び６４．２℃である。

【００７７】この発明はさらに、この発明の方法に従っ
て調製されるか否かにかかわらず式（Ｉ）〜（VI）のハ
イブリドインターフェロンに関する。この発明はさら
に、この発明の方法に従って得られるハイブリドインタ
ーフェロンに関する。この発明は特に、例に記載されて
いるハイブリドベクター、形質転換された宿主細胞、ハ
イブリドインターフェロンポリペプチド、及びその製造
方法に関する。

【００７８】ハイブリドインターフェロンの生物学的性
質及び医薬製剤 この発明のハイブリドインターフェロンは、これを価値
ある医薬として特徴付ける興味ある生物学的性質を示
す。

【００７９】この発明のハイブリドインターフェロン
は、哺乳動物細胞、例えばウシの細胞及び特にヒトの細
胞に対する非常に強力な抗ウイルス活性により特徴付け
られる。すなわち、S.Rubinstein等の方法〔 J.Virol.
37, 755 (1981)〕、ウシ（ＭＤＢＫ）及びヒト（ＷＩＳ
Ｈ）細胞に対するチャレンジウイルスとして水疱性口内
炎ウイルス（ＶＳＶ）を使用する〕に従う細胞変性効果
の低下として決定される抗ウイルス力価は次の通りであ
る。

【００８０】

【表１】

【００８１】従って、この発明のハイブリドインターフ
ェロンの抗ウイルス作用はヒト細胞に対して確認されな
いがしかし常に異種間的(interspecific) である。すな
わち、ハイブリドインターフェロン“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｄ
₃ Ｄ₄ ”，“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｂ₃ Ｂ₄ ”，“Ｂ₁ Ｂ₂ Ｄ
₃ Ｂ₄ ”，“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｂ₃ Ｄ₄ ”、及び“Ｂ₁ Ｂ₂ Ｂ₃
Ｄ₄ ”の抗ウイルス活性は親インターフェロンα−２及
び米国特許 No.４，４１４，１５０に開示されているハ
イブリドインターフェロン“ＢＤ”に非常に近縁なハイ
ブリドインターフェロン“Ｂ₁ Ｂ₂ Ｄ₃ Ｄ₄ ”のそれに
匹敵する程度であり、しかし親インターフェロンα−３
に対して（１０〜３０の係数をもって）、及び参照ハイ
ブリドインターフェロン“Ｄ₁ Ｄ₂ Ｂ₃ Ｂ₄ ”に対して
（２３０〜６００の係数をもって）明らかに卓越してい
る。

【００８２】ヒト細胞に対する一般的抗ウイルス活性と
は別に、この発明のハイブリドインターフェロンは標的
細胞の一層特異的な反応を生じさせる。すなわち、イン
ターフェロンの作用に基き種々の細胞内酵素が誘導され
る。これらの内特に（２′−５′）オリゴイソアデニレ
ートシンセターゼ（“２−５Ａシンセターゼ”）が挙げ
られ、この酵素は（２′−５′）連結されたオリゴヌク
レオチドを生じさせ、そしてこれらのオリゴヌクレオチ
ドが今度は潜伏状態のエンドリボヌクレアーゼを活性化
し、これがウイルスｍＲＮＡを開裂せしめる。

【００８３】驚くべきことに、この発明のハイブリドイ
ンターフェロン“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｄ₃ Ｄ₄”，“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｂ₃
Ｂ₄ ”，“Ｂ₁ Ｂ₂ Ｂ₃ Ｄ₄ ”、及び“Ｂ₁ Ｂ₂ Ｄ₃ Ｂ
₄ ”はヒト細胞中で、２−５Ａシンセターゼ活性の特に
活性な誘導物質である。すなわち、１０³ ユニット／ml
において、ハイブリドインターフェロン“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｄ ₃
Ｄ₄ ”，“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｂ₃ Ｂ₄ ”，“Ｂ₁ Ｂ₂ Ｂ
₃ Ｄ₄ ”、及び“Ｂ₁ Ｂ₂ Ｄ₃Ｂ₄ ”は Daudi細胞中
で、それぞれ１７．５倍、１１．４倍、８．５倍、及び
９．６倍の２−５Ａシンセターゼ活性を与え、これに対
して親インターフェロンα−２及びα−３並びに参照ハ
イブリドインターフェロン“Ｂ₁ Ｂ₂ Ｄ₃ Ｄ₄ ”及び
“Ｄ₁ Ｄ₂ Ｂ₃ Ｂ₄ ”はそれぞれ５．６倍、３．９倍、
４．０倍、及び４．３倍の増加を示す。

【００８４】さらに、この発明のハイブリドインターフ
ェロンは抗増殖活性(antiproliferative activities)を
示す。抗増殖活性は次のようにして測定することができ
る。インターフェロン含有溶液を、１０％ウシ胎児血清
を含有するＲＰＭＩ培地２ml中５×１０⁴ 個／mlの Dau
di細胞と共にインキュベートする。３日間のインキュベ
ーションの後、細胞の増加を、トリパン・ブルー排除試
験を用いてヘマチトメーター中で生存細胞を計数するこ
とにより決定する。

【００８５】Daudi細胞の増加の５０％阻害を導くのに
必要なハイブリドインターフェロン“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｄ
₃ Ｄ₄ ”，“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｂ₃ Ｂ₄ ”，“Ｂ₁ Ｂ₂ Ｂ
₃ Ｄ₄ ”，“Ｂ₁Ｂ₂ Ｄ₃ Ｂ₄ ”，“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｂ
₃ Ｄ₄ ”、及び“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｄ₃ Ｂ₄ ”、の濃度はそれぞ
れ約４，４，１．３，１．３，４及び４ユニット／mlで
あり、従って親インターフェロンα−２及び参照ハイブ
リドインターフェロン“Ｂ₁ Ｂ₂ Ｄ₃ Ｄ₄”とおよそ同
等（約１．３ユニット／ml）であり、そして親インター
フェロンα−３（約２０ユニット／ml）及び参照ハイブ
リドインターフェロン“Ｄ₁ Ｄ₂ Ｂ ₃ Ｂ₄ ”（約４００
ユニット／ml）に卓越している。

【００８６】ヒト癌に対する抗増殖活性もインビボで証
明することができる。すなわち、ヒト由来の種々の癌、
例えば乳癌、結腸癌、肺癌、卵巣癌、及び黒色腫をヌー
ドマウスで増殖させた。増殖した腫瘍の小断片を単離
し、そして套管針により（Ｂａｌｂ／ｃ×ＤＢＡ／２）
Ｆ₁ （ＣＤＦ₁ ）マウスの静脈のう下に移植した。ＩＦ
Ｎを、５×１０⁵ 〜５×１０⁷ IU／kg／inj の１日２回
投与で、１〜５日（投与の日：０日）筋肉内投与した。
６日目に動物を殺し、最終腫瘍サイズを測定し、そして
最初の腫瘍サイズ（ＩＦＮ処理前）及び未処理対照マウ
スにおける腫瘍サイズと比較する。

【００８７】この発明のハイブリドインターフェロン、
例えば“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｄ₃ Ｄ₄ ”、及び“Ｂ₁ Ｂ₂ Ｄ
₃ Ｂ₄ ”による処理の後、腫瘍増殖のかなりのそして有
意な阻害、及び特に腫瘍の退化が観察される。驚くべき
ことに、ハイブリドインターフェロンの抗増殖活性は親
インターフェロンα−２及びα−３のそれ、並びにハイ
ブリドインターフェロン“Ｂ₁ Ｂ₂ Ｄ₃ Ｄ₄ ”及び“Ｄ
₁ Ｄ₂ Ｂ₃ Ｂ₄ ”のそれに卓越する。

【００８８】この発明のハイブリドインターフェロンの
抗ウイルス性及び抗増殖性は、これらのポリペプチド
を、ヒト及び動物の、ウイルス感染、例えばインフルエ
ンザ及び他の呼吸器ウイルス感染、ヘルペスウイルス感
染、狂犬病及び肝炎感染、並びに新生物疾患、例えば黒
色腫、腎癌、ハーリー細胞白血病(hairy cell leukemi
a) の治療のために有用なものとしており、これらのポ
リペプチドは場合によっては他の抗ウイルス剤又は抗腫
瘍剤と組合わせて、好ましくは、医療的に有効な量の活
性成分を場合によっては無機又は有機の固体又は液体の
医薬として許容され非経腸的投与に適する担体と組合わ
せ又は混合して含んで成る医薬製剤の形で使用される。

【００８９】非経腸製剤は特に注射液であり、これは種
々の態様、例えば静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投
与、鼻内投与、皮内投与、又は皮下投与において有効で
ある。このような液剤は好ましくは、例えば活性成分を
単独で又は医薬として許容される担体と共に含有する凍
結乾燥剤から調製することができる等張水溶液又は懸濁
液である。医薬製剤は無菌化することができそして／又
は添加剤、例えば防腐剤、安定剤、湿潤剤及び／又は乳
化剤、溶解剤、浸透圧調製塩及び／又は緩衝剤を含有す
る。

【００９０】この発明の医薬製剤は、他の医薬として価
値ある物質を含有し、そしてそれ自体既知の方法によ
り、例えば常用の溶解又は凍結乾燥法により製造され、
そして約０．１％〜１００％、特に約１％〜約５０％
の、そして凍結乾燥物の場合には１００％までの活性成
分を含有する。この発明のハイブリドインターフェロ
ン、例えば“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｄ₃ Ｄ₄ ”は活性の喪失を伴わな
いで凍結乾燥し、そして再溶解することができる。これ
に対して、親インターフェロンα−２及びα−３の凍結
乾燥品は、顕著な活性の低下を伴って濁った溶液をもた
らす。従って後者のインターフェロンは緩衝化溶液中で
のみ貯蔵することができる。

【００９１】この発明はまた、この発明の薬理学的に活
性な化合物を医薬として活性な担体と混合することを特
徴とする医薬組成物に関する。特定の投与方法及び投与
量は、患者の状態、病気の種類及び病気の状態を考慮し
て医者により選択されるであろう。

【００９２】例えば、ウイルス感染は、通常１日に１回
又は２回数日〜数週間にわたって治療され、他方新生物
の治療は一般に１日１回〜複数回、数週間〜数ケ月にわ
たって行われる。通常のインターフェロン療法において
使用されるのと同じ日用量レベル、すなわち約１０⁶ 〜
１０⁷ ユニットが投与される。

【００９３】ハイブリドインターフェロンに対するモノ
クローナル抗体 ＩＦＮαハイブリドを包含するＩＦＮαの幾つかのサブ
タイプに対する高親和性及びＩＦＮαのその他のタプタ
イプに対する低い親和性を有する、ＩＦＮαに対する新
規なモノクローナル抗体、及びこれらを分泌するハイブ
リドーマ細胞を提供することがこの発明の目的の一つで
ある。

【００９４】この新規なモノクローナル抗体は、ＩＦＮ
α／Ｂ，Ｄ，Ｆ及び関連するサブタイプ〔 D.V.Goeddel
等、 Nature 290 , 20 (1981) を参照のこと〕並びにこ
れらのサブタイプのハイブリド、特にこの発明のハイブ
リドインターフェロンに対して高い親和性を有するが、
しかし例えばＩＦＮα／Ａサブタイプに対して低い親和
性を有することにより特徴付けられる。

【００９５】このモノクローナル抗体は１４４ＢＳと命
名される。このモノクローナル抗体は１４４ＢＳ２２−
６−１９と称するハイブリドーマセルラインにより分泌
される。この発明はさらに、このモノクローナル抗体の
誘導体、例えば抗体断片、放射性ラベルされたモノクロ
ーナル抗体、及びモノクローナル抗体と酵素との接合体
等に関する。

【００９６】この発明のモノクローナル抗体の断片は、
例えばＦａｂ，Ｆａｂ′又はＦ（ａｂ′）₂ 断片であ
り、抗原決定基に対する特異性を維持しているもの、す
なわちヒトＩＦＮα及びＩＦＮαハイブリドサブタイプ
に対する親モノクローナル抗体の特徴的結合パターンを
維持しているものである。放射性ラベルされたモノクロ
ーナル抗体は、例えば放射性ヨウ素（ ¹²³Ｉ， ^{1 25}Ｉ，
¹³¹Ｉ）、炭素（¹⁴Ｃ）、硫黄（³⁵Ｓ）、又はトリチウ
ム（ ³Ｈ）等を含有する。放射性ヨウ素でラベルされた
モノクローナル抗体が好ましい。

【００９７】この発明の抗体接合体は、例えばモノクロ
ーナル抗体又はその断片と酵素、例えばホースラディッ
シュパーオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β
−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グ
ルコアミラーゼ、カルボアンヒドラーゼ、アセチルコリ
ンエステラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロゲナー
ゼもしくはグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナ
ーゼ、又はアビジンもしくはビオチンとの接合体であ
る。

【００９８】これらの接合体においては抗体は酵素に直
接に又はスペーサーもしくはリンカー基を介して結合し
ている。モノクローナル抗体と酵素ホースラディッシュ
パーオキシダーゼ又はアルカリ性ホスファターゼとの接
合体が好ましい。

【００９９】この発明のモノクローナル抗体は、ヒトＩ
ＦＮαの異るサブタイプに属するポリペプチドに対する
その結合能力により特徴付けられる。この結合能力は、
S.S.Alkan等、"Protides of the biological fluids",
H.Peeters編、ペルガモンプレス、 Vol 30, 495〜498
頁（1983) に記載されているいわゆるコンバインド・イ
ムノプレシピテーション・バイオアッセイにおいて決定
される。

【０１００】このアッセイ法においては、ＩＦＮα含有
溶液が試験されるべきモノクローナル抗体と共にインキ
ュベートされ、結合したモノクローナル抗体及び未結合
モノクローナル抗体が試験されるすべての抗体を結合す
るポリクローナル血清の添加により沈澱し、免疫沈澱物
が分離されそして酸溶液に再溶解され、そしてこうして
遊離したＩＦＮαがＩＦＮαの抗ウイルス活性に基く古
典的なバイオアッセイにより決定される。

【０１０１】この発明のモノクローナル抗体はＩＦＮサ
ブタイプＢ，Ｄ，Ｆ及びそのハイブリド、さらにはＩＦ
ＮαサブタイプＣ及びＪに強く結合するがしかしＩＦＮ
αサブタイプＡに低い親和性を示すことは驚くべきこと
であり、このサブタイプＡは３種類以上のＩＦＮαサブ
タイプを認識する他のすべてのモノクローナル抗体、す
なわち広サブタイプ認識抗体、例えばモノクローナル抗
体ＮＫ２〔D.Secher等、 Nature 285 , 446 (1980)〕、
ヨーロッパ特許出願ＥＰ１１９，４７６に開示されてい
るモノクローナル抗体ＥＢＩ−１，２及び３、又は国際
特許出願ＷＯ８４／０３１０６に開示されているモノク
ローナル抗体ＬＯ−２２により結合されるものである。

【０１０２】国際特許出願ＷＯ８４／０３１０５に開示
されている、ＩＦＮαサブタイプＤに特異的なモノクロ
ーナル抗体ＹＯＫに比べて、この発明のモノクローナル
抗体は驚くべきことに広い特異性を示し、特に抗体ＹＯ
Ｋにより結合されないＩＦＮαサブタイプＢ及びＦに対
して特異性を示す。１４４ＢＳと称するこの発明のモノ
クローナル抗体は、良く知られている方法、例えばクラ
ス特異的第２抗体を用いる免疫拡散オークテルロニー法
により決定される場合免疫グロブリンクラスＩｇＧ₁ κ
（カッパ）に属する。

【０１０３】この発明のモノクローナル抗体及びその誘
導体はそれ自体既知の方法により得られ、この方法はハ
イブリドーマセルライン１４４ＢＳ２２−６−１９を、 ａ）インビトロ培養し、そして培養上清からモノクロー
ナル抗体を単離し；又は ｂ）適当な哺乳類動物中でインビボ増殖せしめ、そして
該動物の体液からモノクローナル抗体を回収し；そして
所望により、 ｃ）得られたモノクローナル抗体をその誘導体に転換す
る；ことを特徴とする。

【０１０４】方法ａ）のインビトロ培養のために適当な
培地は標準的培地、例えば場合によっては哺乳動物血
清、例えばウシ胎児血清が補充されたドルベコ改変イー
グル培地又はＲＰＭＩ１６４０培地である。モノクロー
ナル抗体の単離を行うには、培養上清に含有される蛋白
質を硫酸アンモニウム等により沈澱せしめ、次に標準的
クロマトグラフ法、例えばゲル濾過、イオン交換、ＤＥ
ＡＥセルロース上でのクロマトグラフィー、又はイムノ
アフィニティークロマトグラフィーにより免疫グロブリ
ンを精製する。

【０１０５】方法ｂ）に従うハイブリドーマ細胞の増殖
により多量の所望のモノクローナル抗体を得ることがで
きる。細胞クローンを同種哺乳動物に注射し、これによ
り抗体産生腫瘍の増殖が生ずる。１〜３週間の後、目的
とするモノクローナル抗体を前記動物の体液から回収す
る。

【０１０６】例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来のハイブ
リドーマセルラインを、場合によってはあらかじめプリ
スタンのごとき炭化水素により処理しておいたＢａｌｂ
／ｃマウスに腹腔内注射し、そして１〜２週間後これら
のマウスの腹水を集める。モノクローナル抗体をそれ自
体既知の方法により、例えば硫酸アンモニウム等により
蛋白質を沈澱せしめることにより体液から単離し、次に
標準的方法、例えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラ
フィー、ＤＥＡＥセルロース上でのクロマトグラフィ
ー、又はイムノアフィニティークロマトグラフィーによ
り免疫グロブリンを精製する。

【０１０７】ＩＦＮαサブタイプの抗原決定基に対して
その特異性を維持しているモノクローナル抗体の断片、
例えばＦａｂ，Ｆａｂ′又はＦ（ａｂ′）₂ 断片は、方
法ａ）又はｂ）により調製されたモノクローナル抗体か
ら、それ自体既知の方法により、例えばペプシンもしく
はパパインのごとき酵素による消化及び／又は化学的還
元によるジスルフィド結合の開裂により得ることができ
る。

【０１０８】放射性ヨウ素によりラベルされたモノクロ
ーナル抗体は、それ自体既知のヨウ素化法により、例え
ばモノクローナル抗体を放射性ヨウ化ナトリウム又はヨ
ウ化カリウム及び化学的酸化剤例えば次亜塩素酸ナトリ
ウム、クロラミンＴもしくはこれらに類するもの、又は
酵素的酸化剤、例えばラクトパーオキシダーゼ、グルコ
ースオキシダーゼ及びグルコースでラベルすることによ
り調製される。

【０１０９】この発明の放射性ラベルされたモノクロー
ナル抗体はまた放射性ラベルされた栄養を方法ａ）のイ
ンビトロ培養の培地に添加することによっても調製する
ことができる。このようなラベルされた栄養は例えば放
射性炭素（¹⁴Ｃ）、トリチウム（ ³Ｈ）、硫黄（³⁵Ｓ）
等を含有し、そして例えばＬ−（¹⁴Ｃ）−ロイシン、Ｌ
−（ ³Ｈ）−ロイシン又はＬ−（³⁵Ｓ）−メチオニンで
ある。

【０１１０】この発明のモノクローナル抗体の接合体は
当業界において知られている方法により、例えば方法
ａ）もしくは方法ｂ）に従って調製されたモノクローナ
ル抗体又は上記のようにして調製されたその断片を、カ
ップリング剤、例えばグルタルアルデヒド、過ヨウ素酸
塩、Ｎ，Ｎ′−ｏ−フェニレンジマレイミド、Ｎ−（ｍ
−マレイミドベンゾイルオキシ）−サクシンイミド、Ｎ
−（３−（２′−ピリジルジチオ）−プロピオノキシ）
−サクシンイミド、Ｎ−エチル−Ｎ′−（３−ジ−メチ
ルアミノプロピル）−カルボジイミドの存在下で酵素と
反応せしめることにより調製される。

【０１１１】アビジンとの接合体は同様にして調製され
る。ビオチンとの接合体は例えばモノクローナル抗体を
ビオチンの活性化エステル、例えばビオチンＮ−ヒドロ
キシサクシンイミドエステルと反応せしめることにより
調製される。

【０１１２】この発明はさらに、１４４ＢＳ２２−６−
１９と称するハイブリドーマセルラインに関し、このセ
ルラインは１９８５年３月１４日に、パリ，パスツール
研究所"Collection Nationale de Cultures de Microor
ganismes" に No.Ｉ−４２４として寄託された。

【０１１３】このハイブリドーマセルラインはマウス骨
髄腫セルラインＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４と天然ヒトＩＦＮ
αにより免疫感作されたＢａｌｂ／ｃマウスの脾臓のＢ
リンパ球とのハイブリドである。これは安定なセルライ
ンであり、１４４ＢＳと称するモノクローナル抗体を分
泌する。セルラインは培養において又は液体窒素中での
深冷凍結により維持し、解凍により再活性化することが
できる。

【０１１４】この発明はさらに、モノクローナル抗体１
４４ＢＳを分泌する前記ハイブリドーマ細胞の製造方法
にも関し、この方法はＢａｌｂ／ｃマウスを天然ヒトＩ
ＦＮαで免疫感作し、該マウスの抗体産生細胞を骨髄腫
セルラインＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４の細胞と融合せしめ、
この融合において得られたハイブリド細胞をクローン化
し、そして所望の抗体を分泌する細胞クローンを選択す
る。

【０１１５】マウスの免疫は、例えば天然ヒトＩＦＮα
を２〜４回非経腸的に、例えば腹腔内及び／又は皮下
に、１０〜４０日の間隔で、約１０⁵IU 〜約１０⁶IU の
量で注射することにより行う。この注射は場合によって
はリンパ球生産を刺激するアジュバント、例えば完全フ
ロインドアジュバント又は不完全フロインドアジュバン
トを含有する。

【０１１６】最終追加免疫注射の２〜５日後に採取した
抗体産生脾細胞を融合促進剤の存在下で骨髄腫セルライ
ンＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４の細胞と融合せしめる。考慮さ
れる場合促進剤は例えばＵＶ−不活性化形である場合が
あるセンダイウイルスもしくは他のウイルス、カルシウ
ムイオン、界面活性脂質例えばリソレシチン、又はプロ
ピレングリコールである。好ましくは、１０００〜４０
００の分子量を有する約３０〜６０％のプロピレングリ
コールを含有する溶液中で骨髄腫細胞を免疫感作された
マウスからの脾細胞３〜２０倍過剰量と融合せしめる。

【０１１７】融合の後、細胞を再懸濁し、そして選択Ｈ
ＡＴ培地中で培養する。こうすることによりハイブリド
ーマ細胞のみが生存する。なぜなら、これらは骨髄腫細
胞に由来するインビトロで生育しそして複製する能力
と、免疫感作されたマウスの抗体産生脾細胞に由来す
る、ＨＡＴ培地での生存に必須な欠損ＨＧＰＲＴ又はＴ
Ｋ遺伝子を合わせ持つからである。

【０１１８】ハイブリドーマ細胞の拡張のために適当な
培地は標準的な培地、例えば場合によっては血清、例え
ば１０〜１５％のウシ胎児血清を補充されたグルベコの
改変イーグル培地、最少必須培地、ＲＰＭＩ１６４０培
地培養等である。好ましくは、フィーダー細胞、例えば
正常マウス腹腔浸潤細胞、脾細胞、骨髄マクロファージ
等を細胞増殖の初期に添加する。正常骨髄腫細胞がハイ
ブリドーマ細胞をオーバーグロー (overgrow) するのを
防止するため、培地に一定間隔で選択ＨＡＴ培地を補充
する。

【０１１９】ハイブリドーマ細胞培養上清を目的とする
モノクローナル抗体について、好ましくはコンバインド
・イムノプレシピテーション−バイオアッセイ、又はラ
ジオイムノアッセイによりスクリーニングする。陽性の
ハイブリドーマ細胞を、例えば限界稀釈法により２回以
上クローン化する。クローン化されたセルラインは常法
により凍結することができる。

【０１２０】この発明のモノクローナル抗体及び／又は
その誘導体は、天然の又は組換ＤＮＡ法により調製され
たヒトＩＦＮαサブタイプの、及びヒトハイブリドＩＦ
Ｎ、特にこの発明のそれの定性的及び定量的測定及び／
又は精製のために有用である。

【０１２１】例えば、モノクローナル抗体又はその誘導
体、例えば酵素接合体又は放射性誘導体は、例えばＩＦ
Ｎα活性を有するポリペプチドの抗体決定基とモノクロ
ーナル抗体との結合相互作用に基く既知のイムノアッセ
イのいずれかにおいて使用することができる。このよう
なアッセイ法の使用としてラジオイムノアッセイ、酵素
イムノアッセイ、イムノフルオレッセンス、ラテックス
凝集、及び血球凝集が挙げられる。

【０１２２】このようなイムノアッセイは例えば、天然
源又は遺伝子操作された微生物からのＩＦＮαの、及び
ハイブリドＩＦＮα蛋白質の生産及び精製をモニターす
る場合、並びに例えばＩＦＮ療法を行っているか又はそ
のような治療を必要とする患者の体液中のＩＦＮα及び
ハイブリドＩＦＮαの定性的及び定量的測定において有
用である。

【０１２３】この発明のモノクローナル抗体は、ラジオ
イムノアッセイ（ＲＩＡ）においてそれ自体として又は
放射性ラベルされた誘導体の形で使用することができ
る。ＲＩＡの既知の変法のいずれかを例えば均一相ＲＩ
Ａ、固相ＲＩＡ又は不均一ＲＩＡ、シングルＲＩＡ又は
ダブル（サンドイッチ）ＲＩＡ〔ＩＦＮの直接又は間接
（競争的）決定のため〕のために使用することができ
る。

【０１２４】サンドイッチＲＩＡが好ましく、この方法
においては、適当な担体、例えばポリスチレン、ポリプ
ロピレン又はポリ塩化ビニル製のミクロタイタープレー
ト又は試験管のプラスチック表面、ガラス又はプラスチ
ックビーズ、濾紙、又はデキストラン、酢酸セルロース
又はニトロセルロースのシートをＩＦＮαサブタイプに
対して特異的なモノクローナル抗体で、単純吸着によ
り、又は担体を例えばグルタルアルデヒド又は臭化シア
ンで活性化した後にコートし、そして ¹²⁵Ｉにより放射
性ラベルされたモノクローナル抗体の溶液及び試験溶液
とインキュベートし、ここでこの溶解したモノクローナ
ル抗体はＩＦＮαサブタイプの担体結合モノクローナル
抗体とは異るエピトープを認識し、そしてＩＦＮα又は
ハイブリドＩＦＮαの量を担体上に結合した放射能を測
定することにより決定する。

【０１２５】このような好ましいラジオイムノアッセイ
においては担体結合抗体又は放射性ラベルされた抗体の
いずれかが前記のこの発明のモノクローナル抗体又はそ
の誘導体であり、他方が場合によっては放射性ラベルさ
れているこの発明の範囲に属さないＩＦＮαに対するモ
ノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である。

【０１２６】前に記載したようにサンドイッチラジオイ
ムノアッセイが特に好ましく、この方法においては、こ
の発明のモノクローナル抗体がビーズ、例えばポリスチ
レンビーズに結合され、このコートされたビーズがＩＦ
Ｎα又はハイブリドＩＦＮαを含有する試験溶液又は標
準溶液中でインキュベートされ、そして最後に異るＩＦ
Ｎαエピトープを認識する放射性ラベルされたモノクロ
ーナル抗体により顕現される。

【０１２７】図５及び図６は、実験の部で詳細に記載す
るサンドイッチＲＩＡにおいて測定できるような、試験
溶液中ＩＦＮα／Ｂサブタイプに属するＩＦＮ−α−２
ポリペプチドの量の関数として担体ビーズに結合した放
射能を示す。ＲＩＡの感度は、１５０〜５０００IU／ml
のＩＦＮ−α−２サブタイプの、又は一層時間のかかる
方法を選択すれば１IU／mlという少量のＩＦＮ−α−２
の迅速で、確実でそして定量的な決定を可能にする。

【０１２８】他のＩＦＮαサブタイプ、例えばＩＦＮα
／Ｄサブタイプ又はＩＦＮα／Ｆサブタイプに属するポ
リペプチド、及び特にこの発明のハイブリドインターフ
ェロンの測定についてもサンドイッチＲＩＡにおいて同
様の結果が得られる。

【０１２９】この発明のモノクローナル抗体は酵素イム
ノアッセイにおいてそれ自体として、又は酵素接合誘導
体として使用することができる。このようなイムノアッ
セイは、この発明の酵素ラベルされたモノクローナル抗
体誘導体、この発明の抗−ＩＦＮα抗体を認識しこれと
結合するそれ自体既知の酵素ラベル抗体、又は他の抗−
ＩＦＮα抗体が使用される試験方法を含む。

【０１３０】ＥＬＩＳＡ（エンザイム−リンクド・イム
ノソルベント・アッセイ）が好ましく、この方法におい
ては、ＲＩＡについて前記した担体がこの発明のモノク
ローナル抗体によりコートされ、ＩＦＮαを含有する試
験溶液と共にインキュベートされ、そして次にＩＦＮα
に対するポリクローナル血清、例えばヒツジの血清と共
にインキュベートされ、そして最後にポリクローナル血
清の結合した抗体がそれらを認識しそして結合する酵素
ラベルされた抗体により顕現され、そして結合したＩＦ
Ｎαの量が酵素基質反応により測定される。このような
酵素ラベルされた抗体は例えばホスファターゼブラベル
されたヤギ−抗ヒツジ免疫グロブリンである。

【０１３１】次のようなＥＬＩＳＡも好ましい。すなわ
ち、ＩＦＮαサブタイプに対して特異的なモノクローナ
ル抗体によりコートされた担体がＩＦＮαを含有する試
験溶液と共に及び酵素と接合したモノクローナル抗体の
溶液と共にインキュベートされ、ここで溶解したモノク
ローナル抗体は担体に結合したモノクローナル抗体が認
識するのとは異るＩＦＮαサブタイプのエピトープを認
識する。

【０１３２】色の変化をもたらしそして目により又は光
学測定装置により観察することができる酵素基質反応に
より、試験溶液中のＩＦＮαサブタイプ又はＩＦＮαハ
イブリドサブタイプの量と比例する結合した酵素の量を
測定する。

【０１３３】イムノドット分析と呼ばれる酵素イムノア
ッセイが特に好ましく、この方法においてはＩＦＮα又
はハイブリドＩＦＮαを含有する試験溶液又は標準溶液
がポリペプチドに対する強い本来的親和性を有する微孔
性担体、例えばニトロセルロース上にスポットされ、前
記ＩＦＮα含有プローブの１個又は数個のドットを担持
する担体がこの発明のモノクローナル抗体の溶液中でイ
ンキュベートされ、そして次のこの発明のモノクローナ
ル抗体を認識しそしてそれと結合する酵素ラベルされた
第２抗体の溶液中でインキュベートされ、そして最後に
検出可能なシグナルをもたらす酵素基質、例えば着色基
質の溶液中でインキュベートされる。

【０１３４】このような酵素ラベルされた第２抗体は、
例えば４−クロロ−１−ナフトール等のごとき適切な酵
素基質により発色し得るホースラディッシュパーオキシ
ダーゼと接合したラビット抗−マウス免疫グロブリンで
ある。

【０１３５】ＩＦＮαサブタイプ又はハイブリドＩＦＮ
αの定性的又は定量的測定のための前記のようなモノク
ローナル抗体又はその誘導体のこの発明に従う使用はま
た、それ自体既知の他のイムノアッセイ、例えば、螢光
物質との抗体接合体又は抗原接合体を用いる免疫螢光試
験、抗原又は抗体でコートされたラテックス粒子を用い
るラテックス凝集法、及び抗原又は抗体でコートされた
赤血球を用いる血球凝集法等を包含する。

【０１３６】この発明はさらに、ＩＦＮαサブタイプ及
びこの発明のハイブリドＩＦＮαの定性的及び定量的測
定のための試験キットに関し、このキットはモノクロー
ナル抗体１４４ＢＳ及び／又はその誘導体、並びに場合
によってはヒトＩＦＮαに対する他のモノクローナル抗
体又はポリクローナル抗体、及び／又は付加物を含む。

【０１３７】ラジオイムノアッセイのためのこの発明の
試験キットは、例えばＩＦＮαに対するモノクローナル
抗体によりコートされているか又はコートされていない
適当な担体、ＩＦＮαに対するモノクローナル又はポリ
クローナル抗体又はその放射性ラベル誘導体の凍結乾燥
されたもの又は濃縮された溶液（ここで、抗体上にコー
トされているか、溶液であるか又は放射性ラベルされた
形であるモノクローナル抗体の少なくとも１つはこの発
明のモノクローナル抗体である）、ヒトＩＦＮαの標準
溶液、緩衝液、及び場合によっては非特異的吸着及び凝
集体の生成を防止するためのポリペプチド及び洗剤、ピ
ペット、反応容器、換算曲線等を含む。

【０１３８】酵素イムノアッセイのためのこの発明の試
験キットは、例えば適当な担体、ＩＦＮαに対するモノ
クローナル抗体及び／又はポリクローナル抗体の、並び
にＩＦＮα又はＩＦＮαを認識する第１抗体に対する酵
素ラベルされたモノクローナル抗体又はポリクローナル
抗体の、場合によっては凍結乾燥されているか又は濃縮
されている溶液（ここで、ＩＦＮαに対するモノクロー
ナル抗体か又はＩＦＮαに対する酵素ラベルされた抗体
誘導体は、この発明のモノクローナル抗体又はその誘導
体である）、固体又は溶解形の酵素基質、ヒトＩＦＮα
の標準溶液、緩衝液、並びに場合によってはポリペプチ
ド及び洗剤、ピペット、反応ベッセル、換算曲線、カラ
ースケール表等を含む。

【０１３９】天然由来のＩＦＮαもしくはＩＦＮαサブ
タイプ又はＩＦＮα関連ポリペプチド、例えばこの発明
のハイブリドインターフェロンはこの発明のモノクロー
ナル抗体の助けによりイムノアフィニティークロマトグ
ラフィーにより精製することができる。モノクローナル
抗体又はその断片を有機又は無機の適当な担体、例えば
架橋されたアガロース、デキストラン又は適切な官能化
型のポリアクリルアミドに、場合によっては活性化の
後、当業界において既知の一般的方法を適用して連結す
る。

【０１４０】例えば、活性化されたエステル官能基を有
する担体を水性緩衝液中に懸濁し、モノクローナル担体
又はその断片の溶液と混合し、濾過し、再懸濁し、そし
て洗浄して過剰のモノクローナル抗体を除去し、そして
無関連の蛋白質の溶液で処理して担体の遊離反応性部分
をブロックする。

【０１４１】この抗体でコートされた担体を使用して、
ヒトＩＦＮαサブタイプ、例えばＩＦＮα／Ｂ，ＩＦＮ
α／Ｄ及びＩＦＮα／Ｆサブタイプ並びに関連ポリペプ
チド、例えばこの発明のハイブリドインターフェロン
（グリコシル化形又は非グリコシル化形）を結合せしめ
る。

【０１４２】この目的のため、担体材料を適当な水性溶
剤、例えば塩溶液、例えばＮａＣｌ溶液、又は緩衝液、
例えばリン酸緩衝化ＮａＣｌ溶液、ＮａＨＣＯ₃ 溶液又
は３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸溶液中に
懸濁し、そしてＩＦＮαを含有する溶液と接触せしめ、
例えばクロマトグラフィーカラムに注入しそしてＩＦＮ
α含有溶液を導入しそしてポンプにより所望により加圧
下で担体材料中に通す。未結合蛋白質及び他の不純物を
水性溶液、例えばpHが約５〜９の緩衝液、及び／又は塩
溶液、例えばＮａＣｌ溶液により洗浄除去する。

【０１４３】担体材料上の抗体に結合したＩＦＮαを適
当な水性溶液、例えばpHが約２〜５の緩衝液、例えばグ
リシン緩衝液又はクエン酸、異る組成又は塩溶液、例え
ば濃ＮＨ₄ ＳＣＮ溶液のpHグラジエントにより溶出す
る。ＩＦＮαを含有する溶出液は場合によっては中和
し、そして精製されたＩＦＮαを既知の方法により単離
する。次に、例によりこの発明をさらに具体的に説明す
るが、これによりこの発明の範囲を限定するものではな
い。

【０１４４】実験の部 例中に次の略号を使用する。

【表２】

【０１４５】パート１． エシェリシャ・コリ中でのイ
ンターフェロンα−２／α−３ハイブリド遺伝子の造成
及びクローニング 下記のすべてのハイブリドインターフェロン蛋白質コー
ド配列はβ−ラクタマーゼプロモーターに作用可能に連
結し、ｐＢＲ３２２由来発現プラスミド中にクローン化
し、そしてＥ．コリＨＢ１０１に形質転換した。

【０１４６】例１． リンポブラストイドＩＦＮα−２
及びＩＦＮα−３のＤＮＡ配列を担持するＰｖｕII耐性
ベクターの造成 ｐＢＲ３２２をＰｖｕII（ビオラブス）により切断し、
そして線状ＤＮＡを、次のようにして、〔³²Ｐ〕−Ｂｃ
ｌＩリンカー〔固相ホスホトリエステル法、H.Rink等、
Nucleic Acids Research 12, 6369 (1984) 〕により合
成されたｄ (ATGTGTGATCACACAT) に連結する。

【０１４７】制限酵素処理されたプラスミドＤＮＡ（１
μｇ、約０．７pmole 未満）を³²Ｐラベル化ＢｃｌＩリ
ンカー（約４０pmole 未満）に、２０mM Tris−ＨＣｌ
（pH７．８），１０mM ＭｇＣｌ₂ ，１０mM ＤＴＴ，
０．５mM ｒＡＴＰ及び４０Ｕ／ml Ｔ₄ ＤＮＡリガー
ゼ（ビオラブス）を含有する５０mlの反応溶液中で連結
する。

【０１４８】１５℃にて２〜３時間インキュベートした
後、水相を等容量のフェノール／クロロホルムで抽出
し、そしてＤＮＡを、１／９容量の１０×ＴＮＥ及び
２．５容量のエタノールを添加しそして−２０℃にて一
夜保持することにより沈澱せしめた。ＤＮＡペレットを
５０μｌのＴＥ（pH８．０）に再懸濁し、そしてコント
ロンＴＳＴ６０ローター中で５〜２３％シュークロース
グラジエント〔５０mM Tris−ＨＣｌ（pH８．０）／１
mM ＥＤＴＡ〕中で１５℃，５８０００rpm にて４時間
遠心分離する。

【０１４９】このグラジエントを頂部から底部に画分
し、そして各画分の放射能をセレンコフ計数によりモニ
ターする。注目の画分をプールし、そしてＤＮＡをＴＮ
Ｅ及びエタノールにより沈澱せしめる。ＤＮＡペレット
を制限緩衝液中に再懸濁し、そしてＢｃｌＩで消化し、
そして水相をフェノール／クロロホルムで抽出した後再
び沈澱せしめる。次に、この線状ＤＮＡを５μｇ／mlの
濃度においてリンカーの連結について記載したのと同一
の条件下で再環化する。

【０１５０】連結されたＤＮＡを酵素ＨｉｎｄIII ，Ｐ
ｖｕII（残っている無傷のｐＢＲ３２２を除去するた
め）及びＰｓｔＩで切断し、複製開始点及びａｍｐ^R 遺
伝子を含有するＨｉｎｄIII −ＰｓｔＩ大断片（３６０
０bp＋リンカー）をシュークロースグラジエント遠心に
より単離する。

【０１５１】ＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩＦＮ−α−
２からのＨｉｎｄIII −ＰｓｔＩ挿入部（１１６０bp）
及びＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩＦＮ−α−３からの
ＨｉｎｄIII −ＰｓｔＩ挿入部（１０２０bp）（ヨーロ
ッパ特許出願 No.７６，４８９）をシュークロースグラ
ジエント遠心により得、それぞれを上記のようにして調
製したＤＮＡに連結して、β−ラクタマーゼプロモータ
ーの制御のもとに、それぞれＬｙＩＦＮ−α−２コード
領域及びＬｙＩＦＮ−α−３コード領域を含有するプラ
スミドｐＡＭ４及びｐＡＭ２を得る。

【０１５２】連結されたＤＮＡを直接使用して、次のよ
うにしてコンピテントＥ．コリを形質転換する。ＤＮＡ
連結混合物（又はその画分）を１５０μｌの１５mM Tr
is−ＨＣｌ（pH７．５），１０mM ＣａＣｌ₂ ，１０mM
ＭｇＣｌ₂ ，１０mM ＮａＣｌ及び０．５mM ＥＤＴ
Ａ中に移し、そして５０μｌのＣａＣｌ₂ 処理した受容
体Ｅ．コリＨＢ１０１を加える。混合物を０℃にて２０
分間保持し、次に４２℃に移して２分間置き、そして室
温に冷却した後１mlのＮ−培地を添加する。

【０１５３】インキュベーションを３７℃にて１時間続
け（シェーカープラットホーム、２５０rpm ）、この後
６００μｌをテトラサイクリン（１０μｇ／ml）を含有
するマッコンキー−寒天（ディフコ）上にプレートす
る。ペトリ皿を３７℃にて１６〜１８時間インキュベー
トし、この時点で細菌コロニーを観察することができ
る。

【０１５４】プラスミドＤＮＡを次の方法により形質転
換体から得る。テトラサイクリン（１０μｇ／ml）を含
有する１０mlのＮ−培地を１個ずつの形質転換体コロニ
ーと共にインキュベートし、そしてこの培養物を３７℃
にて０．９〜１．１（６５０nm）の光学濃度に達するま
で攪拌（シェーカープラットホーム、１５０−３００rp
m ）する。

【０１５５】細胞を集め、そしてテトラサイクリン（１
０μｇ／ml）及びクロラムフェニコール（８０μｇ／m
l）を含有する等容量のＮ−培地中に再懸濁する。イン
キュベーションを３７℃にてさらに１８時間続けて細胞
当りのプラスミドの数を増幅する。集菌し、そして細菌
のペレットを５０mM Tris−ＨＣｌ（pH８）（湿細胞重
量ｇ当り１０ml）中に再懸濁し、そしてリゾチームを加
えて最終濃度２mg／mlとする。

【０１５６】０℃にて１０分間の後、この溶液を５０mM
ＥＤＴＡに調整し、０℃にて１０分間の後、トリトン
Ｘ１００を最終濃度０．８％まで加え、そしてこの調製
物を０℃に１時間保持し、次にソルバルＳＳ−３４ロー
ター中で１８０００rpm にて３０分間遠心分離する。透
明な上清をフェノールで抽出し次にクロロホルムで２回
抽出した後、ＲＮａｓｅ（シグマ）を最終濃度２５μｇ
／mlに加え、そして溶液を３７℃にて１時間インキュベ
ートする。

【０１５７】ＲＮＡを除去するため、ＮａＣｌ（最終濃
度１Ｍ）及びポリエチレングリコール６０００（最終濃
度７．５％）を加え、そしてこの調製物を−１０℃にて
２時間保持し、次にソルバルＳＳ−３４ローター中で１
０，０００rpm ，０℃にて１０分間遠心分離する。ペレ
ットを２００μｌのＴＮＥ中に再懸濁し、そしてフェノ
ール／クロロホルム（１：１）で再度抽出し、次に沈澱
を行う（５００μｌのエタノールの添加、−８０℃にて
５分間、１０分間のエッペンドルフ遠心による）。ＤＮ
Ａペレットを２０〜４０μｌのＴＥに再懸濁する。この
方法により得られる典型的な収量はプラスミドＤＮＡ約
２０μｇである。調製されたプラスミドＤＮＡ（ｐＡＭ
４及びｐＡＭ２）を制限酵素分析にかける。ｐＡＭ４及
びｐＡＭ２の構造を確認する。

【０１５８】例２． ｐＡＭ４からの３′シストロン外
ＰｖｕII部位の除去 ｐＡＭ２（α−３）とは異り、ｐＡＭ４（α−２）はな
お２個のＰｖｕII部位を含有している（図４を参照のこ
と）。ＩＦＮコード領域内のＰｖｕII部位におけるハイ
ブリドＩＦＮ遺伝子の造成を促進するため、シストロン
外領域内の第２のＰｖｕII部位を除去する。

【０１５９】プラスミドｐＡＭ４のこの変形は本質上、
ＰｓｔＩ部位と３′シストロン外ＰｖｕII部位との間の
３′シストロン外ＩＦＮα−２ｃＤＮＡ配列の除去であ
る（図４参照のこと）。ｐＡＭ４をＰｖｕIIにより部分
消化し〔５μｇのｐＡＭ４，５０mM ＮａＣｌ，６mM
ＭｇＣｌ₂ ，６mM ２−メルカプトエタノール、１０mM
Tris−ＨＣｌ（pH７．５），１ユニット／μｇ Ｐｖ
ｕII（ビオラブス）中、３７℃にて５分間消化、フェノ
ール抽出により反応停止〕、そして〔³²Ｐ〕−ＰｓｔＩ
リンカー（コラボラティブ・リサーチ、第１に記載した
方法による）に連結する。

【０１６０】ＤＮＡ混合物を上記のようにしてＥ．コリ
ＨＢ１０１に形質転換し、そして１６クローンのプラス
ミドをＰｓｔＩ，ＰｖｕII及びＨｉｎｄIII を用いる制
限酵素分鎖により正しいサイズ（２４６bp）の欠失の存
在についてスクリーニングする。スクリーニングされた
１６個のクローンの内３個が未変形のｐＡＭ４であり、
１個が多量体であり、５個が大きな欠失（６２０bp）を
有し、そして７個が目的の小欠失（２４６bp）を担持し
ている。短縮されたＩＦＮα−２挿入部（ＨｉｎｄIII
−ＰｓｔＩ小断片）９０７bpを有する１つのクローンを
選択し、そしてｐＡＭ２１と称する。

【０１６１】例３． アミノ酸９２におけるクロスオー
バー部位を有するＰｖｕハイブリドの造成 プラスミドｐＡＭ２（α−３）及びｐＡＭ２１（α−
２）のそれぞれをＨｉｎｄIII 及びＰｖｕIIで切断し、
β−ラクタマーゼプロモーター配列及びＩＦＮ遺伝子の
Ｎ−末端側の半分（アミノ酸１−９２をコードする）を
含むＤＮＡ断片（５２１bp）を切り出す。

【０１６２】大断片（約４Kb）及び小断片（５２１bp）
をシュークロースグラジエント遠心により分離し、そし
て大断片を、５０μｌの５０mM Tris（pH８）中で１μ
ｇのＤＮＡ断片を１ユニットのウシ腸アルカリ性ホスフ
ァターゼ（１０pmol ５′末端当り）により３７℃にて
３０分間処理することにより脱リン酸化する。

【０１６３】上記の適切な大ＤＮＡ断片及び小ＤＮＡ断
片を連結することによりハイブリドインターフェロン
“Ｂ₁ Ｂ₂ Ｄ₃ Ｄ₄ ”及び“Ｄ₁ Ｄ₂ Ｂ₃ Ｂ₄ ”遺伝子
を造成する〔ｐＡＭ２からのＨｉｎｄIII −ＰｖｕII大
断片（約４Kb）をｐＡＭ２１からのＨｉｎｄIII −Ｐｖ
ｕII小断片（５２１bp）に連結することによりタイプ
“Ｂ₁ Ｂ₂ Ｄ₃ Ｄ₄ ”ＩＦＮ遺伝子が生ずる等〕。

【０１６４】連結は、２０mM Tris−ＨＣｌ（pH７．
８），１０mM ＭｇＣｌ₂ ，１０mMＤＴＴ，０．５mM
ｒＡＴＰ，４０ユニット／μｌ Ｔ₄ ＤＮＡリガーゼ
（ビオラブス）、並びに約５００ngの大ＤＮＡ断片及び
２０〜４０ngの小ＤＮＡ断片を含有する１０μｌの容量
中で行う。１５℃にて５時間の後、５μｌの連結混合物
を使用してＥ．コリＨＢ１０１を前記のようにして形質
転換し、それぞれ約１０００個の形質転換されたコロニ
ーを得る。

【０１６５】３個ずつのコロニーを拾い上げ、これらの
プラスミドを単離し、そして酵素ＨｉｎｄIII ，Ｐｖｕ
II，ＥｃｏＲＩ，ＴａｑＩ及びＰｓｔＩにより分析す
る。予想される構造を有するプラスミドＤＮＡ〔ｐＡＭ
２７（“Ｂ₁ Ｂ₂ Ｄ₃ Ｄ₄ ”）、及びｐＡＭ３３（“Ｄ
₁ Ｄ₂ Ｂ₃ Ｂ₄ ”）〕を含む２個のコロニーを選択す
る。

【０１６６】例４． アミノ酸１５０でクロスオーバー
するハイブリドＩＦＮ遺伝子の造成 プラスミドｐＡＭ２（α−３）及びｐＡＭ２１（α−
２）のそれぞれをＰｖｕII及びＰｓｔＩにより消化す
る。ＤＮＡ断片をシュークロースグラジエント遠心によ
り、ＰｖｕII−ＰｓｔＩ大断片（約４Kb，ＩＦＮα−２
及びα−３のＮ−末端の９２個アミノ酸をコードす
る）、並びにＰｖｕII−ＰｓｔＩ小断片（長さが３８６
bp及び４９５bpであり、それぞれＩＦＮα−２及びα−
３のＣ−末端をコードする）に分離する。

【０１６７】第２段階において、ｐＡＭ２及びｐＡＭ２
１からの精製されたＰｖｕII−ＰｓｔＩ小断片をそれぞ
れ次のようにして³²Ｐ−ラベルする。ＤＮＡ断片（約１
μｇ）をそれぞれ５０μｌの５０mM Tris−ＨＣｌ（pH
８．０）に溶解して、そしてIU／１０pmole ５′末端の
アルカリ性ホスファターゼで３７℃にて３０分間処理す
ることにより脱リン酸化する。

【０１６８】６５℃にて１時間インキュベートすること
により酵素を不活性化し、そしてＤＮＡをＤＥＡＥ−セ
ルロースへの吸着及びそれからの溶出により精製し、そ
してエタノール中で沈澱せしめる。このＤＮＡを、５０
mM Tris−ＨＣｌ（pH９．５），１０mM ＭｇＣｌ₂ ，
〔５mM ＤＴＴ，３０〜４０μｌの凍結乾燥したγ−〔
³²Ｐ〕−ＡＴＰ（アメルシャム、６０００Ci／mmol，１
mCi／ml）〕及び０．５Ｕ／μｌ Ｔ₄ キナーゼ（Ｐ．
Ｌ．バイオケミカルス）を含有する２０μｌの反応容積
中でリン酸化する。

【０１６９】３７℃にて２０分間の後、ＥＤＴＡを１０
mMまで加えることにより反応を停止する。次に、過剰
（約４μｇ）の対応する未反応ＤＮＡ断片を加え、そし
て溶液をフェノール及びクロロホルムにより抽出する。
ＤＮＡを残留γ−〔³²Ｐ〕−ＡＴＰからＴＮＥ中セファ
デックスＧ５０によるクロマトグラフィーにより分離す
る。セレンコフ計数によりモニターされた排除ピーク画
分をプールし、そしてエタノールで沈澱せしめる。

【０１７０】この³²ＰラベルされたＰｖｕII−ＰｓｔＩ
小断片のそれぞれをＳａｕ３Ａにより完全消化し、そし
てこの制限酵素処理されたＤＮＡを、ランニング緩衝液
としてＴＢＥを用いる６％ポリアクリルアミドゲル中で
の電気泳動により分離する。ＰｖｕII−Ｓａｕ３Ａ（Ｉ
ＦＮα−２及びα−３のアミノ酸９３−１５０をコード
する１７２bp）、及びＳａｕ３Ａ−ＰｓｔＩ（それぞ
れ、ＩＦＮα−２及びα−３のアミノ酸１５１−１６６
をコードする２１４bp及び３２３bp）に対応する４個の
ＤＮＡ断片をゲルから単離する。

【０１７１】３種類の適切な断片の再連結（第２表を参
照のこと）により、アミノ酸１５０においてクロスオー
バーした４つのハイブリドＩＦＮタイプが生ずる。対応
するプラスミドを次の一連の段階において再構成する。
第１の連結反応において、等モル量のＰｖｕII−Ｓａｕ
３Ａ ＤＮＡ断片及びＳａｕ３Ａ−ＰｓｔＩ ＤＮＡ断
片を、２０mM Tris−ＨＣｌ（pH７．８），１０mM Ｍ
ｇＣｌ₂ ，１０mM ＤＴＴ，０．５mM ｒＡＴＰ及び４
０ユニット／μｌ Ｔ₄ ＤＮＡリガーゼを含有する連結
緩衝液中で、１５℃にて３〜６時間連結する（コンカテ
マーＤＮＡが生ずる）。

【０１７２】ＰｖｕII−ＰｓｔＩによる消化及びフェノ
ール／クロロホルム（１：１）による消化の後、過剰の
適切なＰｖｕII−ＰｓｔＩ大断片〔脱リン酸化されてい
る：典型的には、１μｇのＤＮＡを５０μｌの５０mM
Tris−ＨＣｌ（pH８）中で（約０．６pmole ５′末端）
０．０６ユニットのウシ腸アルカリ性ホスファターゼに
より３７℃にて３０分間処理する〕を加え、そしてＤＮ
Ａを再度連結する。

【０１７３】Ｅ．コリＨＢ１０１を形質転換し、そして
制限酵素分析（ＰｖｕII，Ｓａｕ３Ａ，ＴａｑＩ及びＥ
ｃｏＲＩ）により決定された予想された構造を有するＤ
ＮＡを担持する４個のクローンを拾い上げる。これらの
クローンをＥ．コリＨＢ１０１／ｐＪＣ３３４，ｐＪＣ
３７，ｐＪＣ３４２及びｐＪＣ３４４と称する（第２表
を参照のこと）。

【０１７４】

【表３】

【０１７５】例５． アミノ酸６０においてクロスオー
バーするハイブリドＩＦＮ遺伝子の造成 これらのハイブリドＩＦＮ遺伝子の造成は、例４に記載
したのと実質的に同じ方法により達成される。プラスミ
ドｐＡＭ２（α−３）及びｐＡＭ２１（α−２）のそれ
ぞれをＨｉｎｄIII 及びＰｖｕIIにより切断し、そして
断片をシュークロースグラジエント遠心により分離す
る。

【０１７６】ＨｉｎｄIII −ＰｖｕII小断片（５２１b
p，β−ｌａｃプロモーター領域を含有し、そしてＩＦ
Ｎα−２及びα−３のＮ−末端９２アミノ酸をコードす
る）を³²Ｐ−ラベルし、そしてＳａｕ３Ａにより部分消
化する（ＤＮＡ μｇ当り０．５ユニットの酵素、３７
℃にて５分間反応、フェノール抽出により反応停止）。
断片の得られた混合物を６％ポリアクリルアミドゲル中
での電気泳動により分離し、そして４つの断片（２つの
４２４bp ＨｉｎｄIII −Ｓａｕ３Ａ断片、及び９７bp
のＳａｕ３Ａ−ＰｖｕII断片）をゲルから抽出する。

【０１７７】例４に記載したような段階的方法による３
個の適切な断片の連結（第３表参照のこと）、及びＥ．
コリＨＢ１０１への形質転換により予想した４造成物の
内２個の形質転換体のみが得られる。ｐＡＭ６５（“Ｄ
₁ Ｂ₂ Ｄ₃ Ｄ₄ ”）、及びｐＡＭ９０（“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｂ₃
Ｂ₄ ”）。

【０１７８】

【表４】

【０１７９】アミノ酸６１においてクロスオーバーする
他の２種類のハイブリドＩＦＮ遺伝子を造成するため、
プラスミドｐＡＭ６３及びｐＡＭ９０のそれぞれをＨｉ
ｎｄIII 及びＰｖｕIIで切断し、そして小ＨｉｎｄIII
−ＰｖｕII ＤＮＡ断片（５２１bp）をアガロースゲル
中での電気泳動により単離した。

【０１８０】ｐＡＭ９０のＨｉｎｄIII −ＰｖｕII小断
片をｐＡＭ２のＨｉｎｄIII −ＰｖｕII大断片と連結す
ることによりｐＡＭ９２（Ｂ₁ Ｄ₂ Ｄ₃ Ｄ₄ ）を得、そ
してｐＡＭ６５のＨｉｎｄIII −ＰｖｕII小断片をｐＡ
Ｍ２１のＨｉｎｄIII −ＰｖｕII大断片と連結すること
によりプラスミドｐＡＭ７６（Ｄ₁ Ｂ₂ Ｂ₃ Ｂ₄ ）を得
る。上記４種類のプラスミドＤＮＡの構造を制限酵素分
析により確認する。対応するクローンを、Ｅ．コリＨＢ
１０１／ｐＡＭ６５，ｐＡＭ９０，ｐＡＭ９４及びｐＡ
Ｍ７６と称する。

【０１８１】パートII. サッカロミセス・セレビシエ
ーにおけるインターフェロンα−２／α−３ハイブリド
遺伝子の造成及びクローニング 下記のすべてのハイブリドインターフェロン蛋白質コー
ド配列はＰＨＯ５プロモーター及びＰＨＯ５転写停止シ
グナルに連結され、酵母２μベクターｐＪＤＢ２０７に
クローン化され、そして酵母Ｓ・セレビシエーＧＲＦ１
８株に形質転換された。

【０１８２】例６． 発現プラスミドｐ３１ＲＴ（Δ７
２）の造成 プラスミドｐＪＤＢ２０７／ＩＦ２（５₁ ）Δ７２（ヨ
ーロッパ特許出願 No.１００，５６１）をＨｉｎｄIII
及びＥｃｏＲＩで消化し、そしてインターフェロンα−
２のカルボキシル末端及びＰＨＯ５転写停止シグナルを
含んで成る４７０bp断片をゲル電気泳動及び電気溶出に
より〔R.Yang等、 Methods Enzym. 68,176 (1979)〕ミ
クロ−コロジオンバッグを用いて単離する。

【０１８３】プラスミドｐ３１Ｒ（ＥＰ１００，５６１
を参照のこと）をＨｉｎｄIII 及びＥｃｏＲＩにより消
化し、そして同じ技法を用いて４．１kbベクター部分を
単離する。２００ngのベクター及び挿入部ＤＮＡをＥ．
コリＴ₄ ＤＮＡリガーゼを用いて連結しそしてＥ．コリ
ＨＢ１０１をアンピシリン耐性に形質転換した後、ＰＨ
Ｏ５プロモーター、インターフェロンα−２のＣ−末端
及びＰＨＯ５転写停止シグナルを含有するｐ３１ＲＴ
（Δ７２）と称するプラスミドを単離し、そしてその構
造を制限酵素分析により確認する。

【０１８４】例７． プラスミドｐＪＤＢ２０７ ＰＨ
Ｏ５／ＩＦＮ ＡＭ１０４，ＡＭ１１４，及びＡＭ１１
９の造成 ＰＨＯ５ 発現プラスミドｐ３１ＲＴ（Δ７２）（例６を
参照のこと）を、Ｅ．コリのＤＮＡポリメラーゼＩのKl
enow断片を用いてｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＡＴＰ及びｄ
ＴＴＰによりフィルインする。次に、平滑末端を細菌ア
ルカリ性ホスファターゼにより脱リン酸化する。

【０１８５】プラスミドｐＪＣ３３４，ｐＡＭ９０及び
ｐＪＣ３３７（例４及び５）を、ＴａｑＩにより（ｐＪ
Ｃ３３４及びｐＡＭ９０）、又はＴａｑＩ及びＥｃｏＲ
Ｉにより（ｐＪＣ３３７）消化し、そして３′のくぼん
だ末端を上記のようにして対応するデオキシヌクレオチ
ドによりフィルインする。約５６０bpのＤＮＡ断片をア
ガロース電気泳動及び電気溶出によりミクロ−コロジオ
ンバッグを用いて上記のようにして単離する。

【０１８６】プラスミドｐ３１ＲＴ（Δ７２）の調製さ
れたベクター部分２００ng及び溶出されたＤＮＡ断片２
２０nmをＴ₄ ＤＮＡリガーゼを用いて連結しそしてＥ．
コリＨＢ１０１をアンピシリン耐性に形質転換すること
により、プラスミドｐ３１Ｒ／ＩＦＮ ＡＭ１０４（ハ
イブリドインターフェロン“Ｄ₁ Ｄ₂ Ｄ₃ Ｂ₄ ”コード
配列を含有する）、ｐ３１Ｒ ＩＦＮ ＡＭ１１９（ハ
イブリドインターフェロン“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｂ₃ Ｂ₄ ”コード
配列を含有する）、及びｐ３１Ｒ ＩＦＮ ＡＭ１１４
（ハイブリドインターフェロン“Ｄ₁ Ｄ₂ Ｂ₃ Ｄ₄ ”コ
ード配列を含有する）がそれぞれ得られる。

【０１８７】これらのプラスミドをＢａｍＨＩ及びＨｉ
ｎｄIII で切断することにより、ＰＨＯ５プロモーター
／ＩＦＮ蛋白質コード配列／ＰＨＯ５転写停止シグナル
の配置を有する約１３００bpのＤＮＡ断片をアガロース
電気泳動及び電気溶出により単離する。この断片をプラ
スミドｐＪＤＢ２０７のＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩ部
位の間にクローン化する。

【０１８８】プラスミドを酵母株ＧＲＦ１８に形質転換
してＬｅｕ⁺ にする（ＥＰ１００，５６１、及び例１４
を参照のこと）。生ずるクローンをＳ．セレビシエーＧ
ＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７ ＰＨＯ５／ＩＦＮ ＡＭ１
０４，ＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７ ＰＨＯ５／ＩＦＮ
ＡＭ１１４、及びＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７ ＰＨ
Ｏ５／ＩＦＮ ＡＭ１１９と称する。

【０１８９】例８． プラスミドｐＪＤＢ２０７ ＰＨ
Ｏ５／ＩＦＮ ＡＭ１２９の造成 プラスミドｐＡＭ９４（例５）をＴａｑＩにより完全消
化し、そしてＥｃｏＲＩにより（１０ng／mlの臭化エチ
シウムの存在下で）部分消化する。約５８０bpのＤＮＡ
断片をアガロースゲル電気泳動及び電気溶出により単離
し、そしてプラスミドｐ３１ＲＴ（Δ７２）（例６を参
照のこと）のＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで切断されそして
ゲル精製されたベクター部分に連結する。

【０１９０】Ｅ．コリＨＢ１０１をアンピシリン耐性に
形質転換した後、プラスミドｐ３１Ｒ ＰＨＯ５／ＩＦ
Ｎ ＡＭ１２９を単離する。インターフェロン“Ｂ₁ Ｄ
₂ Ｄ₃ Ｄ₄ ”コード領域を含有するこのプラスミドをＨ
ｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩで消化し、そして１３００bp
ＤＮＡ断片を例７に記載したようにしてｐＪＤＢ２０
７に連結する。このプラスミドを上記のようにして酵母
株ＧＲＦ１８に形質転換する。生ずるクローンをＳ・セ
レビシエーＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７ ＰＨＯ５／Ｉ
ＦＮ ＡＭ１２９と称する。

【０１９１】例９． プラスミドｐＪＤＢ２０７ ＰＨ
Ｏ５／ＩＦＮ ＡＭ１０６，ＡＭ１１０及びＡＭ１１２
の造成 プラスミドｐＪＤＢ２０７ ＰＨＯ５／ＩＦＮ ＡＭ１
０４，ＡＭ１１４及びＡＭ１２９（例７及び８を参照の
こと）をＢａｍＨＩ及びＰｖｕIIで消化し、そしてイン
ターフェロンコード領域のそれぞれのＣ−末端を含有す
る６．８Kbのベクター部分をアガロース電気泳動及び電
気溶出により単離する。

【０１９２】同様にして、プラスミドｐＪＤＢ２０７Ｒ
／（α−２）Δ７２（ヨーロッパ特許出願 No.１００，
５６１）をＢａｍＨＩ及びＰｖｕIIで消化し、そして８
００bpのＤＮＡ断片を単離する。対応する断片の連結及
びＥ．コリＨＢ１０１の形質転換により、プラスミドｐ
ＪＤＢ２０７ ＰＨＯ５／ＩＦＮ ＡＭ１０６（ハイブ
リドインターフェロン“Ｂ₁ Ｂ₂ Ｂ₃ Ｄ₄ ”コード領域
を含有する）、ＡＭ１１２（ハイブリドインターフェロ
ン“Ｂ₁ Ｂ₂ Ｄ₃ Ｂ₄ ”コード領域を含有する）、及び
ＡＭ１１０（ハイブリドインターフェロン“Ｂ₁ Ｂ₂ Ｄ
₃ Ｄ₄ ”コード領域を含有する）が生ずる。酵母株ＧＲ
１８を通常通り形質転換する。

【０１９３】生ずるクローンをＳ・セレビシエーＧＲＦ
１８／ｐＪＤＢ２０７ ＰＨＯ５／ＩＦＮ ＡＭ１０
６，ｐＪＤＢ２０７ ＰＨＯ５／ＩＦＮ ＡＭ１１２、
及びｐＪＤＢ２０７ ＰＨＯ５／ＩＦＮ ＡＭ１１０と
称する。

【０１９４】例１０． プラスミドｐＪＤＢ２０７ Ｐ
ＨＯ５／ＩＦＮ ＤＭ１及びＤＭ２の造成 プラスミドｐＪＤＢ２０７ ＰＨＯ５／ＩＦＮ ＡＭ１
１９（例７）をＨｉｎｄIII 及びＢｇｌIIで消化し、そ
してインターフェロンコード領域のＮ−末端部分を含有
する７．５Kbベクター部分をアガロースゲル電気泳動及
び電気溶出により単離する。

【０１９５】同様にして、プラスミドｐＪＤＢ２０７
ＰＨＯ５／ＩＦＮ ＡＭ１１４及びｐＪＤＢ２０７ Ｐ
ＨＯ５／ＩＦＮ ＡＭ１０４（例７を参照のこと）のそ
れぞれを前記と同じ酵素で消化し、そしてインターフェ
ロンコード領域のＣ−末端を含有する約６００bpのＤＮ
Ａ断片を単離する。対応する断片をＴ₄ ＤＮＡリガーゼ
で連結する。

【０１９６】Ｅ．コリＨＢ１０１を形質転換した後、ハ
イブリドインターフェロン“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｂ₃ Ｄ₄ ”コード
領域を含有するプラスミドｐＪＤＢ２０７ ＰＨＯ５／
ＩＦＮ ＤＭ１、及びハイブリドインターフェロン“Ｂ
₁ Ｄ₂ Ｄ₃ Ｂ₄ ”コード領域を含有するプラスミドｐＪ
ＤＢ２０７ ＰＨＯ５／ＩＦＮ ＤＭ２を得る。酵母株
ＧＲＦ１８を前記のようにして形質転換する。生ずるク
ローンをＳ・セレビシエーＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７
ＰＨＯ５／ＩＦＮ ＤＭ１、及びＳ・セレビシエーＧ
ＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７ ＰＨＯ５／ＩＦＮ ＤＭ２
と称する。

【０１９７】例１１． プラスミドｐＪＤＢ２０７ Ｐ
ＨＯ５／ＩＦＮ ＨＲｉ４３の造成 プラスミドｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＩＦ（α−２）Δ７２
（ヨーロッパ特許出願 No.１００，５６１）をＢａｍＨ
Ｉ及びＰｖｕIIにより消化し、そして６．８KbのＤＮＡ
断片を単離する。同様にして、プラスミドｐＪＤＢ２０
７Ｒ／ＩＦ（α−３）（ＥＰ１００，５６１）を前記と
同じ酵素で消化し、そして８００bpのＤＮＡ断片を単離
する。

【０１９８】２個のＤＮＡ断片の連結及びＥ．コリＨＢ
１０１のアンピシリン耐性への形質転換により、ハイブ
リドインターフェロン“Ｄ₁ Ｄ₂ Ｂ₃ Ｂ₄ ”コード領域
を含有するプラスミドｐＪＤＢ２０７ ＰＨＯ５／ＩＦ
Ｎ ＨＲｉ４３を得る。上記のように、酵母株ＧＲＦ１
８を形質転換する。生ずるクローンをＳ・セレビシエー
ＧＲＦ１８ ｐＪＤＢ２０７ ＰＨＯ５／ＩＦＮ ＨＲ
ｉ４３と称する。

【０１９９】例１２． サッカロミセス・セレビシエー
ＧＲＦ１８の形質転換及びインターフェロン生産の誘導 プラスミドｐＪＤＢ２０７ ＰＨＯ５／ＩＦＮ ＡＭ１
２９“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｄ₃ Ｄ₄ ”をサッカロミセス・セレビシ
エーＧＲＦ１８株（α，ｈｉｓ３−１１，ｈｉｓ３−１
５，ｌｅｕ２−３，ｌｅｕ２−１１２，ｃａｎ ^R ）に、
Hinnen等、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 75, 1929 (1989)
に記載されている方法と類似する方法により導入する。

【０２００】１μｇのプラスミドＤＮＡを１００μｌの
スフェロプラスト懸濁液に加え、そしてこの混合物をポ
リエチレングリコールで処理する。スフェロプラストを
１０mlの再形成寒天と混合し、そしてロイシンを含有し
ない酵母最少培地プレートにプレートする。３０℃にて
３日間インキュベートした後、約１０００個の形質転換
された細胞を得る。

【０２０１】酵母形質転換プレートからの１個の単酵母
コロニーを、１００mlのエルレンマイヤーフラスコ中１
０mlの酵母最少培地に拾い上げ、そして３０℃，２００
rpmにて２４時間、約２〜３×１０⁷ 細胞／mlの濃度に
まで培養する。細胞を２０mlの低−ｐｉ最少培地〔２０
ｇ／ｌのグルコースを補完した“ディフコアミノ酸不含
酵母最少培地”であって、ディフコの処方 (Difco Manu
al, ディフコ・ラボラトリーズ，デトロイト，米国）に
従って調製したものであるが、但し１ｇ／ｌのＫＨ₂ Ｐ
Ｏ₄ の代りに０．０３ｇ／ｌのＫＨ₂ ＰＯ₄ ＋１ｇ／ｌ
のＫＣｌが使用されている〕により１回洗浄する。

【０２０２】３mlの再懸濁細胞を用いて１０００mlのエ
ルレンマイヤーフラスコ中３００mlの低−ｐｉ最少培
地、及び３００mlの正常最少培地のそれぞれに接種す
る。３０℃，１６０rpm にてインキュベーションを行
う。ＰＨＯ５プロモーターの誘導を、Ｔｏｈ−ｅ等 J.B
acteriol. 113 , 727 (1973)に記載されているようにし
て全体細胞中での酸性ホスファターゼの出現を測定する
ことにより追跡する。細胞を約１〜２×１０⁷ 細胞／ml
まで増殖せしめる（２６〜３０時間のインキュベーショ
ン）。

【０２０３】例１３． 酵母細胞抽出物の調製及びイン
ターフェロン力価の決定 １〜２×１０⁷ ／mlの濃度の培養液（例１２を参照のこ
と）３００mlから細胞をソルバルＧＳＡローター中４
℃，８０００rpm にて５分間の遠心分離により集める。
この細胞を１００mlの水で１回洗浄し、６mlの氷冷した
細胞溶解混合液〔０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（pH
７．４）、１ｖ／ｖ％トリトンＸ−１００，０．０００
１Ｍ ＰＭＳＦ（メルク）〕中に再懸濁し、そして３０
mlのコレックスチューブに移す。

【０２０４】懸濁液を再度ソルバルＳＳ−３４ローター
中で８０００rpm にて４℃で５分間遠心分離し、そして
３mlの細胞溶解混液に０℃にて再懸濁する。４ｇのガラ
スビーズ（直径０．４mm）を細胞に加え、そして懸濁液
をボルテックスミキサー（サイエンティフィック・イン
スツルメンツ社，米国）上で最高速度で３０秒間振とう
し、そして次に氷浴中で１分間冷却する。この振とう操
作を５〜１０回、９０％以上の細胞が破壊されるまで
（光学顕微鏡下で点検する）反復する。

【０２０５】細胞破片及びガラスビーズを、ソルバルＨ
Ｂ−４ローター中４℃，８０００rpm にて１０分間遠心
分離することにより除去する。上清をエッペンドルフチ
ューブに移し、液体窒素中で凍結し、そして−６０℃に
て貯蔵する。インターフェロン活性を、S.Rubinstein
等、 J.Virol. 37, 755 (1981)に従って決定する。７×
１０⁹ ユニット／ml細胞抽出液である。

【０２０６】例１２及び１３に記載したのと同様にし
て、Ｓ・セレビシエーＧＲＦ１８株を、プラスミドｐＪ
ＤＢ２０７ ＰＨＯ５／ＩＦＮ ＡＭ１１９（“Ｂ₁ Ｄ
₂ Ｂ₃Ｂ₄ ”），ＡＭ１０６（“Ｂ₁ Ｂ₂ Ｂ
₃ Ｄ₄ ”），ＡＭ１１２（“Ｂ₁ Ｂ₂ Ｄ₃Ｂ₄ ”），Ｄ
Ｍ１（“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｂ₃ Ｄ₄ ”），ＤＭ２（“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｄ
₃ Ｂ₄ ”），ＡＭ１１０（“Ｂ₁ Ｂ₂ Ｄ₃ Ｄ₄ ”）、及
びＨＲｉ４３（“Ｄ₁ Ｄ₂ Ｂ₃ Ｂ₄”）により形質転換
する。得られた菌株を培養する。細胞を収得し、そして
前記のようにしてインターフェロン力価を決定する。

【０２０７】Ｓ・セレビシエー ＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ
２０７ ＰＨＯ５／ＩＦＮ ＡＭ１１９：５・１０⁹ ユ
ニット／mlＳ・セレビシエー ＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７ ＰＨ
Ｏ５／ＩＦＮ ＡＭ１０６：７・１０⁷ ユニット／mlＳ・セレビシエー ＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７ ＰＨ
Ｏ５／ＩＦＮ ＡＭ１１２：２・１０⁸ ユニット／mlＳ・セレビシエー ＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７ ＰＨ
Ｏ５／ＩＦＮ ＤＭ１：３・１０⁹ ユニット／mlＳ・セレビシエー ＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７ ＰＨ
Ｏ５／ＩＦＮ ＤＭ２：５・１０⁹ ユニット／mlＳ・セレビシエー ＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７ ＰＨ
Ｏ５／ＩＦＮ ＡＭ１１０：３・１０⁸ ユニット／mlＳ・セレビシエー ＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７ ＰＨ
Ｏ５／ＩＦＮ ＨＲｉ４３：１・１０⁹ ユニット／ml

【０２０８】同じ条件下で、Ｓ・セレビシエーＧＲＦ１
８／ｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＩＦ（α−２）及びＩＦ（α−
３）（ＥＰ１００，５６１）はそれぞれ１×１０⁸ 及び
３×１０⁹ ユニット／mlの力価を与える。

【０２０９】例１４． ３０ｌ規模での、形質転換され
た酵母細胞によるハイブリドインターフェロン“Ｂ₁ Ｄ
₂ Ｄ₃ Ｄ₄ ”の製造 酸性ホスファターゼプロモーターＰＨＯ５の下流にハイ
ブリドインターフェロン“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｄ₃ Ｄ₄ ”の遺伝子
を有するプラスミドｐＪＤＢ２０７ ＰＨＯ５ＩＦＮ
ＡＭ１２９を担持する酵母菌株ＧＲＦ１８をＹＮＢ培地
の寒天表面上にストリークする。このプレートを３０℃
にて、コンフルエント増殖が観察されるまでインキュベ
ートする。無菌ループを用いて表面培養物の一部分を次
の組成の前培養培地ＩＦＮ／２１を収容した振とうフラ
スコに移す。

【０２１０】

【表５】

【０２１１】５００mlのフラスコは１個のバッフルを有
し、そして１００mlの培地を収容する。培地は脱イオン
水を用いて調製し、そして約６．０のpH値を有する。グ
ルコースは別に殺菌する。接種した後、第１培養物を３
０℃にて２４時間、５cmスローの回転振とう機上で２５
０回／分のスピードでインキュベートする。この第１前
培養フラスコが第２前培養フラスコのための接種物を提
供する。

【０２１２】第２前培養フラスコには１ｖ／ｖ％の接種
物を加える。培地及び培養条件は第１前培養の場合と同
じである。第２前培養段階の十分な数のフラスコを一緒
にして３０ｌ発酵槽のための１ｖ／ｖ％の接種物を得
る。製造用発酵槽は３０ｌの実働容積を有し、４個のバ
ッフルを有し、そして直径１１５mmの６枝羽根ディスク
タービン攪拌機１個を有する。攪拌速度は６００回／分
とし、空気を１ｖ／ｖ／分で吹き込み、そして０．３ba
r の上圧をかける。発酵温度は３０℃である。発酵槽を
次の培地と共に殺菌する。

【０２１３】

【表６】

【０２１４】グルコースは別に殺菌し、これを加えて最
終容量を３０ｌにする。接種の後、発酵pHを６．０より
下らないように水酸化ナトリウムを添加することにより
調製する。発酵は約１８時間、又はインターフェロンの
最高収量が達成されるまで続ける。酵母の増殖の便利な
測定値である光学濃度が６〜７ODユニットに達する。グ
ルコースは多く消費されるがしかし完全には消費され
ず、酸性ホスファターゼ活性の誘導にインターフェロン
の生産が伴う。

【０２１５】インターフェロン力価は実験室で機械的細
胞破砕により調製された粗抽出物について測定すること
ができ、そして７×１０⁹ ユニット／ｌ細胞抽出物であ
る。粗抽出物中の蛋白質含量は約１mg／mlである。発酵
の終点において、所望により培養液１０℃に冷去した後
に取り出し、そしてハイブリドインターフェロンを回収
する。

【０２１６】pH６．０の３０ｌの培養液を１０℃に冷却
し、そしてシャープレス遠心分離機により細胞を分離す
る。透明な上清はＩＦＮ活性を含有しない。得られた細
胞塊を、バッファーＸ〔２mM Tris（pH８．０），５mM
ＥＤＴＡ，０．５Ｍ ＮａＣｌ，２０μＭフェニルメ
チルスルホニルフルオリド〕により１４００mlに調整
し、そしてこれはpH８．０である。

【０２１７】５〜１０℃に冷却した後、懸濁液を、ポリ
ウレタン攪拌ディスク及び０．５〜０．７５mm直径のガ
ラスビーズ５００mlを備え、そして３，０００rpm の攪
拌速度及び１０ｌ／時の供給速度を有するダイノーミル
（タイプＫＤＬ Pilot, ０．６ｌ）に通し、こうして細
胞を破砕する。上清はpH８である。破砕された細胞を含
有する懸濁液を遠心分離により透明にする。遠心分離は
ソルバル６ＳＡローター中で１２，０００rpm ，４℃に
て２０分間行う。

【０２１８】同様にして、それぞれプラスミドｐＪＤＢ
２０７ ＰＨＯ５／ＩＦＮ ＡＭ１１９，ＡＭ１０６，
ＡＭ１１２，ＤＭ１及びＤＭ２を含有するＳ・セレビシ
エーＧＲＦ１８株を培養し、そして対応するハイブリド
インターフェロンを含有する透明な溶液を得ることがで
きる。

【０２１９】例１５． Ｅ．コリＨＢ１０１／ｐＡＭ９
４株の抽出物の調製及びＩＦＮ活性の決定 Ｅ．コリＨＢ１０１／ｐＡＭ９４株を６５０nmにおける
光学濃度８まで、０．４％のカザミノ酸及び２％のグル
コースを含有するＭ９培地１ｌ中で増殖せしめる。細胞
を沈降せしめ、そして０．１Ｍ Tris−ＨＣｌ（pH８．
０），０．５ＭＮａＣｌ，５mM ＥＤＴＡ及び１００μ
Ｍ ＰＭＳＦを含有する緩衝液中に再懸濁する（１６０
mlの緩衝液中１６ｇの細胞）。

【０２２０】リゾチームを１mg／mlの最終濃度に添加す
る。次に、この溶液を氷上に３０分間保持する。この懸
濁液中の細胞をソルバル・オムニミックスを用いて６０
秒間３回の設定で破壊する。破壊された細胞を含有する
懸濁液をソルバル６５Ａローター中で１２，０００rpm
、４℃にて２０分間遠心分離することにより透明にす
る。上清を、Rubinstein等（前掲）の方法を用いてＩＦ
Ｎ活性について測定する。

【０２２１】５×１０⁷ ユニット／ml細胞抽出物のＩＦ
Ｎ活性が見出される。同様にして、Ｅ．コリＨＢ１０１
／ｐＡＭ９０，ｐＪＣ３４４、及びｐＪＣ３４２を培養
し、そして上記のようにしてインターフェロン力価が５
×１０⁸ ，５×１０⁷ 及び５×１０⁶ ユニット／ml細胞
抽出物であると決定される。

【０２２２】例１６． ハイブリドーマ細胞の調製 ａ）免疫原の由来 K.Cantell博士（ヘルシンキ）から入手した半精製天然
ヒト白血球ＩＦＮ（ＩＦＮα）のサンプル（比活性１３
×１０⁶ IU／mg）蛋白質を免疫原として使用する。

【０２２３】ｂ）免疫感作方法 １０〜１４週令の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス７匹を、４個
の足パッドにフロインドの完全アジュバント（ディフ
コ）に懸濁した４×１０⁵ IUのＩＦＮαを注射すること
により免疫感作する。３０日目に、フロインドの不完全
アジュバント中ＩＦＮα ４×１０⁵ IUを投与し、そし
て６０日目にＰＢＳ中ＩＦＮα ６×１０⁵ IUの追加免
疫注射（ｉ．ｐ．）を行う。

【０２２４】ｃ）細胞融合 すべての融合実験は、 G.Kohler 及び C.Milstein 〔Na
ture, 256 , 495 (1975)〕の方法に従って、非分泌性Ｓ
ｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫セルライン〔 M.Shu/man, C.
D.Wilde 及び G.Koehler, Nature 276 ，269 (1978)〕
を用いて行う。１０⁸ 個の脾細胞を１０⁷ 個の骨髄腫細
胞と、１mlの５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ１
５００、セルバ）の存在下で混合する。

【０２２５】洗浄した後、細胞を４８mlの標準的ドルベ
コの最少必須培地（ギブコ No.０４２２５０１）に再懸
濁する。１融合当たり３×１０⁶ 個の正常マウス腹腔浸
潤細胞をフィーダー細胞として加える。細胞を４８個の
１mlコスターウエルに分配し、そして１週間に３回標準
的ＨＡＴ培地を３〜６週間にわたって加える。ハイブリ
ドーマ細胞の増殖が見えるようになったとき、上清を免
疫沈澱−バイオアッセイ組合せ法（例１９）によりスク
リーニングする。

【０２２６】合計２２１個のハイブリドーマの内、１０
ハイブリドーマが抗ＩＦＮα抗体を生産することが見出
される。ハイブリドーマ細胞をミクロタイタープレート
上での限界稀釈法により少なくとも１回クローン化す
る。ハイブリドーマ１４４ＢＳが特に安定であり、そし
て大量の免疫グロブリンを分泌するためこれを選択して
さらに検討する。

【０２２７】例１７． モノクローナル抗体の単離及び
精製 ８〜１０週令のＢａｌｂ／ｃマウス（ティーファーム，
シッセルン，スイス）を０．３mlのプリスタン（アルド
リッチ）により腹腔内前処理する。２〜３週間後、２〜
５×１０⁶ 個のクローン化されたハイブリドーマ細胞及
び０．２mlのプリスタンを腹腔内接種する。８〜１０日
後、腹水を集め、そして８００×ｇで遠心分離しそして
−２０℃で貯蔵する。

【０２２８】解凍した腹水を５００００×ｇにて６０分
間遠心分離する。表面に浮上する脂肪層を注意深く除去
し、そして蛋白質濃度を１０〜１２mg／mlに調整する。
飽和硫酸アンモニウム溶液０．９容量を０℃にて滴加す
ることにより粗免疫グロブリンを沈澱せしめ、そして２
０mM Tris−ＨＣｌ／５０mM ＮａＣｌ（pH７．９）に
溶解し、そして同じ緩衝液に対して透析する。

【０２２９】２０mM Tris−ＨＣｌ／２５〜４００mM
ＮａＣｌ（pH７．９）の緩衝液グラジエント系を用いる
ＤＥＡＥ−Ｄ５２セルロース（ワットマン）クロマトグ
ラフィーにより免疫グロブリン画分を得る。免疫グロブ
リンを硫酸アンモニウムにより再び沈澱せしめ、そして
１０mg／mlの濃度でＰＢＳ中に溶解する。ドデシル硫酸
ナトリウムアクリルアミドゲル電気泳動によりモノクロ
ーナル抗体１４４ＢＳが９５％以上の純度であることが
示される。

【０２３０】例１８． モノクローナル抗体のクラス及
びサブクラスの決定 クローン化されたハイブリドーマ細胞により生産される
モノクローナル抗体のクラス及びサブクラスを、クラス
及びサブクラス特異的ラビット抗体（バイオネティック
ス）を用いるオークテルロニーの既知の寒天ゲル免疫拡
散法により決定する。この結果を酵素イムノアッセイ
（ＥＬＩＳＡ）により次のようにして確認する。

【０２３１】ミクロタイタープレートを、５０μｌのＰ
ＢＳ中クラス−又はサブクラス−特異的血清（イオネテ
ィックス）のラビット免疫グロブリン調製物１μｇ／ウ
エルによりコートする。プレートの遊離結合能を、０．
２（Ｗ／Ｖ）％ＮａＮ₃ を含有するＰＢＳ（pH７．４）
中１％ウシ血清アルブミンの緩衝液により飽和する。モ
ノクローナル抗体を含有する１００μｌのプローブを３
７℃にて１時間、ウエル中でインキュベートする。

【０２３２】プレートをＰＢＳで洗浄し、次にプレート
のコーティングに使用したのと同じ特異性を有する、ホ
スファターゼに接合したラビット免疫グロブリン調製物
と共にインキュベートする。固定された酵素を、０．５
mM ＭｇＣｌ₂ 及び０．０２Ｗ／Ｖ％ＮａＮ₃ を含有す
るジエタノールアミン緩衝液（pH９．８）中酵素基質ｐ
−ニトロフェニルホスフェートの溶液（１０％）とイン
キュベートすることにより発色せしめ、そして４０５nm
にて光学濃度を測定する。モノクローナル抗体１４４Ｂ
ＳはクラスＩｇＧ₁ κ（カッパ）に属する。

【０２３３】例１９． コンバインド・イムノアッセイ
−バイオアッセイ ５０μｌの粗天然ヒト白血球ＩＦＮ又は組換ＩＦＮαポ
リペプチド（例２０ａ）（１０⁴ IU／ml）を等容量の試
験溶液、例えばハイブリドーマの培養上清又は精製され
たモノクローナル抗体のＰＢＳ溶液と混合し、そしてミ
クロチューブ（エッペンドルフ３８１０）中で３７℃に
て２時間インキュベートする。

【０２３４】次に、５０μｌのあらかじめ力価検定され
た抗マウスＩｇ抗体（ノルディック）を加え、そしてこ
の混合物を３７℃にして１時間、そして次に４℃にて１
６時間インキュベートし、遊離のモノクローナル抗体及
びＩＦＮに結合したモノクローナル抗体が免疫複合体を
形成する。チューブを１２，０００rpm 、４℃にて５分
間遠心する。免疫沈澱物を１mlの冷緩衝化塩溶液（pH
７．２）により１回洗浄し、そして次に２００μｌの緩
衝化塩溶液pH２．２に溶解する。

【０２３５】これによって遊離したＩＦＮ活性を J.A.A
rmstrong, Appl.Microbiol 21, 723 (1971)による標準
的バイオアッセイにおいて測定する。メンゴ(Mengo) ウ
イルスの細胞変性効果の阻害（ウエル当り４００プラー
ク形成ユニット）をＨｅｐ２細胞（３×１０⁴ 細胞／ウ
エル）を用いてミクロタイタープレート中で測定する。

【０２３６】例２０． インターフェロン特異性の決定 ａ）組換ＩＦＮαポリペプチドの由来 それぞれＩＦＮαＦ，ＩＦＮαＢ及びＩＦＮαＤに近縁
のＬｙＩＦＮ−α−１，ＬｙＩＦＮ−α−２及びＬｙＩ
ＦＮ−α−３ポリペプチドはヨーロッパ特許出願 No.７
６，４８９に記載されている。ＩＦＮαＡ及びＩＦＮα
Ｊは J.Davis博士（バイオジュン，ジュネーブ）及び
C.Weissmann教授（スイス，チューリッヒ大学）から入
手し、そしてＩＦＮαＣは Weizmann Institute of Sci
ence, Department of Virology, Rehorvot, イスラエル
から入手した。

【０２３７】ｂ）比較のために使用されるＩＦＮに対す
るモノクローナル抗体の由来 モノクローナル抗体１Ｋ２及び２Ｋ２は英国特許 No.
２，１０８，５１０に記載されているようにして調製す
る。ＭＡｂ ＮＫ２及びＹＯＫはセルテック（バーシャ
ー）から得られ、ＩＹ−１及びＩＹ−２はインター・イ
エダ（イスラエル）から得られ、Ｓ−１，Ｓ−２，Ｓ−
３及びＳ−４は C.Favre博士、ＵＮＩＣＥＴ，ダーディ
リー（フランス）から得られ、そしてＭＡｂ１／２４は
M.Aguet,チューリッヒ大学（スイス）から得られる。

【０２３８】ｃ）反応性の決定 ＩＦＮαサブタイプに対する種々のモノクローナル抗体
の反応性の決定は例１９に記載したコンバインド・イム
ノプレシピテーション−バイオアッセイ、及びD.S.Sech
er, Nature 290 , 501 (1981)により記載されたタンデ
ム・ラジオイムノアッセイにより行われる。結果を第４
表にまとめる。モノクローナル抗体１４４ＢＳ，１Ｋ２
及び２Ｋ２はヒトＩＦＮβ（レンチュラー，ラオプハイ
ム，西独）又はヒトＩＦＮγ（バイオサイエンス，エン
メンブリュッケ，スイス）と反応しない。

【０２３９】

【表７】

【０２４０】空欄結合未決定 （およその値）

【０２４１】第４表の結果は、モノクローナル抗体１４
４ＢＳがユニークな結合パターンを示すことを示してい
る。特に、ＩＦＮαＡに対する低い結合性及びＩＦＮ−
α−２，ＩＦＮ−α−３及びＩＦＮ−α−１ポリペプチ
ドに対する高い結合性が注目される。さらに第４表の結
果は第５表に概略示すエピトープ分析を可能にする。

【０２４２】

【表８】

【０２４３】第５表の分析から、各ＩＦＮαサブタイプ
のエピトープの結合わせがユニークであることが明らか
になる。さらに、この分析は、タンデムイムノアッセイ
においてＩＦＮαの特定のサブタイプの決定をその他の
サブタイプを排除して行うためのモノクローナル抗体の
適切な対を予想することを可能にする。

【０２４４】例えば、モノクローナル抗体１４４ＢＳと
モノクローナル抗体ＮＫ２，Ｓ−３，ＩＹ−１、又はＩ
／２４のいずれかとの組合わせがＩＦＮαＤによる妨害
を伴わないでＩＦＮαＢを検出するために有用であり、
そしてモノクローナル抗体１４４ＢＳとモノクローナル
抗体ＹＯＫとの組合わせがＩＦＮαＢの存在下でＩＦＮ
αＤを検出するために有用である。

【０２４５】例２１． 免疫吸着カラムの調製 １mlのアフィーゲル１０（ビオーラド）を製造者の指示
に従って１７mgのモノクローナル抗体１４４ＢＳとカッ
プリングせしめる。アフィーゲル１０を焼結ガラスフィ
ルター上でまず冷蒸留水によりそして次に０．１Ｍ Ｎ
ａＨＣＯ₃ 溶液（pH８．０）（カップリング緩衝液）に
より洗浄する。

【０２４６】カップリング緩衝液中５０％ゲルの懸濁液
をプラスチックチューブに移し、等容量の精製されたモ
ノクローナル抗体と混合し、そして室温にて４時間攪拌
する。カップリングの後、ゲルをカップリング溶液で洗
浄し、そして、未反応部位をブロックするため０．１ml
の１Ｍエタノールアミン−ＨＣｌ（pH８．０）を室温に
て１〜２時間処理する。１０mM ＮａＮ₃ の存在下でＰ
ＢＳによりゲルを洗浄し、そしてその中に４℃にて保持
する。

【０２４７】例２２． イムノアフィニティークロマト
グラフィーによる組換ＩＦＮαの精製 組換ＩＦＮαを生産するＥ．コリ例えばＥ．コリＨＢ１
０１／ｐＡＭ９４（例１５参照のこと）の破砕された細
胞の懸濁液を、ソルバル６ＳＡローター中１２，０００
rpm 、４℃にて２０分間遠心分離することにより透明に
する。ポリエチレンアミン（ポリイミンＰ、フルカ、pH
８．０）を上清に最終濃度が０．２５Ｗ／Ｖ％となるよ
うに加える。この溶液を１時間攪拌し、そして次に遠心
分離する。

【０２４８】ペレットを廃棄し、そして上清を硫酸アン
モニウム６５％飽和にする。この混合物を１時間攪拌
し、そして次に遠心分離する。上清を廃棄し、ペレット
を１０倍容量（１５〜２０ml）のＰＢＳ（pH７．２）に
懸濁する。この溶液を０．０２％ＮａＮ₃ を含有するＰ
ＢＳに対して一夜透析する。

【０２４９】透析された溶液を例２１のイムノアフィニ
ティーゲル１mlと混合する。この混合物を１時間おだや
かに攪拌し、そしてカラムに充填し、そして５カラム容
量のＰＢＳ，０．２％トリトンＸ−１００及び０．５Ｍ
ＮａＣｌを含有する５カラム容量のＰＢＳ、及び５カ
ラム容量のＰＢＳにより次々と洗浄する。この方法に代
えて、イムノアフィニティーゲルをまずカラムに詰め、
そして前記透析された溶液を頂部に加え、そして次に上
記のようにして洗浄する。

【０２５０】組換ハイブリドＩＦＮα（“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｄ₃
Ｄ₄ ”）は、０．１Ｍクエン酸及び０．３Ｍ ＮａＣｌ
を含有する酸性緩衝液pH２．５により溶出される。活性
ＩＦＮ画分を１Ｍ Trisにより中和し、ＰＢＳに対して
透析し、そして限外濾過平床膜×Ｍ１０（アミコン）を
用いて約０．１mg／mlに濃縮する。

【０２５１】１７mgのモノクローナル抗体１４４ＢＳを
含有する例２１の免疫吸着カラムの最大能力は約１．２
mgのＩＦＮ−α−２及びＩＦＮ−α−３ポリペプチド、
０．８mg以上のＩＦＮα−１型ポリペプチド、１．１５
mgのハイブリドインターフェロン“Ｂ₁ Ｂ₂ Ｄ
₃ Ｂ₄ ”、１．２５mgのハイブリドインターフェロン
“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｂ₃ Ｂ₄ ”、１．２５mgのハイブリドインタ
ーフェロン“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｄ₃ Ｄ₄ ”、０．４４mgのハイブ
リドインターフェロン“Ｂ₁ Ｂ₂ Ｂ₃ Ｄ₄ ”、１．６mg
のハイブリドインターフェロン“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｂ₃ Ｄ₄ ”、
１．６mgのハイブリドインターフェロン“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｄ₃
Ｂ₄ ”、１．１５mgのハイブリドインターフェロン“Ｂ
₁ Ｂ₂ Ｄ₃ Ｄ₄ ”、及び１．２５mgのハイブリドインタ
ーフェロン“Ｄ₁ Ｄ₂ Ｂ₃ Ｂ₄ ”である。

【０２５２】免疫吸着ゲルは能力の実質的な喪失を伴わ
ないで５０回までの分離に使用することができる。この
方法によって精製された組換ＩＦＮα−２，ＩＦＮ−α
−３，ＩＦＮ−α−１型ポリペプチド及びハイブリドイ
ンターフェロンはＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で均一である。

【０２５３】例２３． イムノドット分析 イムノドット分析をR.Hawkes等、Anal.Biochem. 119 ,
142 (1982)に従って行う。天然インターフェロン又は組
換インターフェロンを含有するプローブを異る濃度でニ
トロセルロースシート上にスポットする。ドットを空気
乾燥し、そしてニトロセルロースの残留結合能を１０％
ウマ血清を含有するTris緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣ
ｌ，０．０１Ｍ Tris−ＨＣｌ，pH７．６）中でのイン
キュベートによりブロックする。

【０２５４】次にニトロセルロースのストリップをモノ
クローナル抗体１４４ＢＳの溶液（２３μｇ／ml）と共
にインキュベートし、そして同様にして調製されたスト
リップを比較用モノクローナル抗体２Ｋ２溶液（３０μ
ｇ／ml）、陰性対照としての正常マウス免疫グロブリン
の溶液（１：１００稀釈）、又は陽性対照としてのポリ
クローナル抗−ヒトインターフェロンαマウス血清の溶
液（エンゾ、１：１０００稀釈）と共にインキュベート
する。洗浄後、すべてのストリップを、パーオキシダー
ゼブラベルされたラビット抗−マウス免疫グロブリン
（ノルディック、１：４００稀釈）で処理し、そして結
合した第２抗体をパーオキシダーゼ基質４−クロロ−１
−ナフトールにより発色せしめる。

【０２５５】モノクローナル抗体はドット当り０．４ng
以上の濃度のＩＦＮαＤタイプポリペプチド（例えばＩ
ＦＮ−α−３）及びドット当り１０ngのＩＦＮαＢタイ
プポリペプチド（例えばＩＦＮ−α−２）を染色し、他
方モノクローナル抗体２Ｋ２はＩＦＮαＤタイプポリペ
プチド（ドット当り４ng）のみを認識する。

【０２５６】例２４． ビーズ−ラジオ−イムノ−タン
デム−アッセイ ａ） ¹²⁵Ｉによるモノクローナル抗体１４４ＢＳの放射
性ラベル化 ０．１mgのモノクローナル抗体１４４ＢＳを F.C.Green
wood等、 Biochem.J.89, 114 (1963)の標準的方法に従
って、 ¹²⁵Ｉヨウ化ナトリウム（１mC) 及びクロラミン
Ｔによりヨード化する。

【０２５７】反応生成物をイオン交換カラムビオ−ラド
ＡＧ１×８により精製し、そしてＰＢＳで稀釈すること
により活性を４×１０⁵cpm／mlに標準化する。同様にし
て、モノクローナル抗体２Ｋ２をヨード化する。モノク
ローナル抗体ＹＯＫ及びＮＫ２はセルテックから放射性
ラベルされた形で市販されている。

【０２５８】ｂ）マクロビーズへのモノクローナル抗体
１４４ＢＳのカップリング ポリスチレンビーズ（直径６．３mm、スフェロテックＡ
Ｇ、チューリッヒ）を４℃にて１６時間、５mM ＥＤＴ
Ａ及び０．１％ＮａＮ₃ を含有するＰＢＳのカップリン
グ緩衝液（pH８）中１mg／mlのＭＡｂ １４４ＢＳの溶
液中で、１０mlの溶液当り２０個のビーズの比率でおだ
やかに揺動することによりインキュベートする。

【０２５９】次に、コートされたビーズを、１０％のウ
マ血清及び０．１％のＮａＮ₃ を含有するブロッキング
緩衝液に移し、そして使用するまで少なくとも２４時
間、この中に保持する。他のＭＡｂのカップリングも同
様にして行う。

【０２６０】ｃ）アッセイ方法 プラスチックチューブ（ファルコン、５ml）を、１０％
のウマ血清及び０．１％のＮａＮ₃ を含有するＰＢＳの
ブロッキング緩衝液０．５mlにより一夜コートする。緩
衝液を吸引除去し、そしてブロッキング緩衝液中ＩＦＮ
含有試験溶液又は標準溶液０．２mlをチューブの底に直
接加える。例２４ｂのＭＡｂ−カップリングされそして
ブロックされたビーズをきれいなティッシュ上で短時間
乾燥し、そしてＩＦＮ溶液を収容するチューブ中に泡が
生じないように注意深く移す。

【０２６１】ビーズをおだやかに揺動させながら４〜６
時間室温にてインキュベートする。ＩＦＮ溶液を吸引除
去し、そして各ビーズを２mlずつのブロッキング緩衝液
で３回洗浄する。次にビーズを、８０×１０³cpmに相当
する ¹²⁵Ｉ−ラベル第２抗体（例２４ａ）０．２ml中で
４℃にて１６時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄
し、そして計数のため新しいチューブに移す。

【０２６２】第６表は、固相第１抗体（ビーズにカップ
リングしている）と ¹²⁵Ｉ−ラベル第２抗体との異る組
み合わせにより得られたＩＦＮ−α−３及びＩＦＮ−α
−２ポリペプチドの標準溶液についての結果を示す。

【０２６３】

【表９】

【０２６４】ＩＦＮ−α−３の検出のためにはＭＡｂ
１４４ＢＳとＭＡｂ ＹＯＫとの組合わせにより、そし
てＩＦＮ−α−２の検出のためにはＭＡｂ １４４ＢＳ
とＭＡｂ ＮＫ２との組合わせにより、最良の結果が得
られる。

【０２６５】図５は、固相にカップリングしたＭＡｂ
１４４ＢＳと放射性ラベル化形のＭＡｂ ＮＫ２との組
合わせを用いる定量的力価検定実験の結果を示す。この
アッセイは、ＩＦＮαＢタイプポリペプチドの１〜５０
００IU／ml（２pg／ml〜１０ng／ml）について直線的結
果を与える。ＩＦＮ−α−２と“標準αＢ”タイプポリ
ペプチド（セルテックより入手）の検定曲線の差異は２
つのＩＦＮ標品のバイオアッセイ測定における偏差に基
く。

【０２６６】固相にカップリングしたＭＡｂ １４４Ｂ
Ｓと放射性ラベル化形のＭＡｂ ＹＯＫとの組合わせを
用いるＩＦＮαＤタイプポリペプチドの定量的測定実験
においても同様の結果が得られる。このアッセイは、１
IU／ml（２pg／ml）以上のＩＦＮαＤタイプポリペプチ
ドを確実に検出する。固相にカップリングしたＭＡｂ１
４４ＢＳとＭＡｂ ＮＫ２との組合わせも、ＩＦＮαＦ
タイプポリペプチドの測定のために使用することができ
る。

【０２６７】ｄ）短縮されたアッセイ法（同時アッセ
イ） 例２４ｃ）に記載した一般的方法を使用し、ＭＡｂとカ
ップリングしたビーズを室温にて３時間、試験溶液
（０．１ml）及び放射性ラベルされた第２抗体（０．１
ml）と一緒にインキュベートし、この間の洗浄を省略す
る。図６は、前記の短縮された同時アッセイが、１５０
IU／ml以上を含有するＩＦＮαＢタイプポリペプチド
（例えばＩＦＮ−α−２）の迅速なスクリーニングのた
めの確実に使用され得るが、しかし例２４ｃ）のアッセ
イ法より感度が低いことを示す。図６中、ｂｇはバック
グラウンドである。

【０２６８】ｅ）ビーズ−ラジオ−イムノ−タンデムア
ッセイのための試験キット 例２４ｃ）に記載したアッセイのための試験キットは次
のものを含む。

【表１０】

【０２６９】例２５． 酵素−免疫測定（ＥＬＩＳＡ） ａ）アルカリ性ホスファターゼによるモノクローナル抗
体１４４ＢＳのラベル化 １．４mlのＰＢＳ中１．４mgのＭＡｂ １４４ＢＳを、
Voller等、 Bull.World Health Organ. 53, 55 (1976)
の標準的方法に従って、グルタルアルデヒド（０．２ｖ
／ｖ％）を用いて、５mgのアルカリ性ホスファターゼ
（ＳＩＧＭＡ Ｐ６７７４、タイプ VII−Ｔ）を含有す
る溶液と２時間にわたってカップリングせしめる。接合
体を、１mmole のＭｇＣｌ₂ ，１％ＢＳＡ及び０．０２
％ＮａＮ₃を含有するTris緩衝液（０．０５Ｍ，pH８．
０）５ml中に移す。この溶液を暗所に４℃にて保持す
る。

【０２７０】ｂ）アッセイ法 ポリプロピレンミクロタイタープレート（ダイナテック
・ラブス社）を、３７℃にて２時間そして４℃にて一
夜、pH８．６の緩衝液（０．０２％のナトリウムアジド
を含有する炭酸塩緩衝化０．９％食塩溶液中モノクロー
ナル抗体ＮＫ２（セルテック、１０μｇ／ml）の溶液に
よりコートする。

【０２７１】このプレートをＰＢＳにより５回洗浄し、
そしてなお存在する蛋白質反応性部位をpH７．４の緩衝
液（ＰＢＳ中０．２％ゼラチン及び０．２％ＮａＮ₃ ）
２５０μｌと共に３７℃にて１時間インキュベートする
ことにより飽和する。このようにしてコートされたプレ
ートはこの緩衝液中４℃にして数日間保持することがで
きる。

【０２７２】段階的に稀釈した試験溶液又はＩＦＮαサ
ブタイプを含有する標準溶液５０μｌ，５０μｌの緩衝
液（pH７．４）、及び緩衝液（pH７．４）により１：１
００稀釈されたホスファターゼラベル化抗体１４４ＢＳ
（例２５ａ）の溶液５０μｌを混合し、そしてミクロタ
イタープレートのウエル中で３７℃にて２時間及び４℃
にて３０分間インキュベートする。

【０２７３】プレートをＰＢＳにて５回洗浄し、次に３
７℃にて３０分間ｐ−ニトロフェニルホスフェートの溶
液（１mg／ml，１０％ジエタノールアミン緩衝液、０．
５mMＭｇＣｌ₂ ，pH９．８中）１５０μｌと共にインキ
ュベートする。４５０nmでの光学濃度を測定することに
より放出されたｐ−ニトロフェノールの量を測定する。
この量は結合した酵素ホスファターゼの量に比例し、そ
してそれ故に試験溶液中のＩＦＮαサブタイプの量に比
例する。

【０２７４】このアッセイ法は、ＩＦＮαＢタイプ（例
えばＩＦＮ−α−２）又はＩＦＮαＦタイプのポリペプ
チドの量を決定するために使用することができる。ＩＦ
ＮαＤタイプ（例えばＩＦＮ−α−３）ポリペプチドの
測定のためには、ミクロタイタープレートをモノクロー
ナル抗体ＮＫ２の代りにＹＯＫ（セルテック）を使用し
てコートする。

【０２７５】ミクロタイタープレートをＭＡｂ １４４
ＢＳによりコートし、そして第２抗体としてそれぞれホ
スファターゼとカップリングしたＭＡｂ ＮＫ２及びＹ
ＯＫを用いる場合、同様の結果が得られる。 ｃ）ＥＬＩＳＡのための試験キット 例２５ｂ）に記載したアッセイ法に使用するキットは次
のものを含む。

【０２７６】

【表１１】

【０２７７】例２６． 沈澱及びクロマトグラフ法を用
いるハイブリドインターフェロンの精製 遠心分離（例１３〜１５を参照のこと）により透明にさ
れたインターフェロン“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｄ₃ Ｄ₄ ”含有溶液１
ｌを、該溶液がpH２．２に達するまで２Ｍ ＨＣｌを用
いて酸性化する。この溶液を４℃にて１時間攪拌し、そ
して沈澱した蛋白質を遠心分離（ＧＳＡローターソルバ
ル、１２，０００rpm 、４℃にて２０分間）により分離
する。

【０２７８】ペレットを廃棄し、そして上清を固体硫酸
アンモニウムにより３０％飽和にする。この溶液を４℃
にて１時間攪拌し、そして次に遠心分離する。次に、イ
ンターフェロンを含有する上清を０．１Ｍ ＮＨ₄ ＨＣ
Ｏ₃ （pH８．２）に対して透析する。インターフェロン
活性が約１０⁸ IU／mlであることが見出される。

【０２７９】製造者の指示によりＣｕ⁺⁺イオンを負荷し
たキレート化セファロース６Ｂ（ファルマシア）５０ml
を収容するカラムを２５０mlの０．０５Ｍ酢酸ナトリウ
ム（pH７．０）及び０．５Ｍ ＮａＣｌを用いて平衡化
する。２００mlの透析された溶液（上記を参照のこと）
を４℃にてカラムに適用する。カラムを１５０mlの平衡
化緩衝液で洗浄する。

【０２８０】結合したインターフェロンの溶出は、２５
０mlの０．０５Ｍ酢酸ナトリウム（pH７．０）及び０．
５Ｍ ＮａＣｌ；並びに２５０mlの０．０５Ｍ酢酸ナト
リウム（pH２．８）及び０．５Ｍ ＮａＣｌの直線グラ
ジエントを用いて行い、次に１５０mlの０．０５Ｍ酢酸
ナトリウム（pH２．８）及び０．５Ｍ ＮａＣｌにより
洗浄する。

【０２８１】活性インターフェロン画分をプールし、そ
して０．０５Ｍ Tris−ＨＣｌ緩衝液（pH８．０）に対
して透析する。透析された溶液中のインターフェロン活
性は約１０⁸ IU／mlである。カラムの最大能力は約７５
mgのインターフェロン“Ｂ₁Ｄ₂ Ｄ₃ Ｄ₄ ”である。

【０２８２】５０mlのＱ−セファロース陰イオン交換体
（ファルマシア）を含有するカラムを２５０mlの０．０
５Ｍ Tris−ＨＣｌ緩衝液（pH８．０）を用いて緩衝化
する。１００mlの上記透析されたインターフェロン含有
溶液を室温にてカラムに適用する。次に、カラムを５０
mlの平衡化緩衝液により洗浄する。結合したインターフ
ェロンを２００mlの０．０５Tris−ＨＣｌ（pH８．０）
中０〜０．７Ｍ ＮａＣｌの直線グラジエントを用いて
溶出する。

【０２８３】純粋なインターフェロンは約０．３Ｍ Ｎ
ａＣｌにおいて溶出する。ＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ル上で分析した場合、活性画分は見かけ分子量１９，０
００の単一バンドを示す。イオン交換カラムの最大能力
は約５０mgのハイブリドインターフェロン“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｄ
₃ Ｄ₄ ”である。同様にして、ハイブリドインターフェ
ロン“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｂ₃ Ｂ₄ ”，“Ｂ₁ Ｄ₂Ｂ₃ Ｄ₄ ”，
“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｄ₃ Ｂ₄ ”，“Ｂ₁ Ｂ₂ Ｂ₃ Ｄ₄ ”、及び
“Ｂ₁ Ｂ₂ Ｄ ₃ Ｂ₄ ”を精製することができる。

【０２８４】例２７． ハイブリドインターフェロン
“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｄ₃ Ｄ₄ ”の凍結乾燥 モノクローナル抗体１４４ＢＳを用いるイムノアフィニ
ティークロマトグラフィーによるか又は常用のクロマト
グラフ法（例２６を参照のこと）により精製されたイン
ターフェロン“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｄ₃ Ｄ₄ ”を０．５Ｍ ＮＨ₄
ＨＣＯ₃ に対して透析しそして次に凍結乾燥する。ＮＨ
₄ ＨＣＯ₃ を完全に除去するため凍結乾燥されたサンプ
ルに少容量の水を２回加え溶液を再凍結乾燥する。

【０２８５】インターフェロン“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｄ₃ Ｄ₄ ”溶
液の再構成を次のようにして行う。０．５Ｍ ＮＨ₄ Ｈ
ＣＯ₃ （pH８．２）を凍結乾燥されたサンプルに加えて
約０．１mg／mlのインターフェロン濃度を得る。再溶解
したインターフェロンは２×１０⁸ IU／mgの比活性を有
し、この活性は凍結乾燥前の対応する値と同一である。

【０２８６】例２８． ハイブリドインターフェロンの
物理化学的特徴付け この発明のハイブリドインターフェロン及び親インター
フェロンを、Laemmli,Nature 227 , 680 (1970)に記載
されている方法に従ってポリアクリルアミドＳＤＳゲル
電気泳動にかける。ハイブリドインターフェロンの見か
け分子量（キロダルトン；KD) を第７表に要約する。第
７表はさらに、アンホラインを含有するＬＫＢポリアク
リルアミドゲルを用いて決定されたハイブリドインター
フェロンの等電圧（ｐＩ) をも含む。

【０２８７】

【表１２】

【０２８８】この発明のハイブリドインターフェロンの
アミノ酸配列をアプライドバイオシステムの４７０Ａ蛋
白質シーケンサー又は８９０Ｃベックマンシーケンサー
を用いて決定する。いずれの場合も自働エドマン分解を
行う。見出された構造は予想されるそれと完全に一致す
る。Ｎ−末端アミノ酸はシステインである。

【０２８９】例２９． Daudi細胞における（２′−
５′）オリゴイソアデニレートシンセターゼ活性に対す
るハイブリドインターフェロンの効果 Daudi細胞を２×１０⁵ 細胞／mlで、第８表に示された
濃度のハイブリドインターフェロン“Ｂ₁ Ｂ₂ Ｂ
₃ Ｄ₄ ”，“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｂ₃ Ｂ₄ ”，“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｄ
₃ Ｄ ₄ ”、及び“Ｂ₁ Ｂ₂ Ｄ₃ Ｂ₄ ”を含有する１０％
ウシ胎児血清が補充されたＲＰＭＩ１６４０培地中に接
種する。

【０２９０】２４時間処理した後、サンプル当り５×１
０⁶ 個の細胞を遠心分離し（９０００回／分）そして５
００μｌの冷細胞溶解緩衝液〔２０mM ４−（２−ヒド
ロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸緩衝
液（pH７．５）、５mM ＭｇＣｌ₂ ，１２０mM ＫＣ
ｌ，７mMジチオスレイトール、１０％グリセリン、０．
５％ノニデットＰ４０〕に再懸濁し、そして氷上で２分
間インキュベートする。次に、サンプルを遠心分離し
（９０００回／分、８分間、４℃）そして上清を回収
し、そして次のようにして（２′−５′）−オリゴイソ
アデニレートシンセターゼ活性について測定する。

【０２９１】上清を５０μｌのポリ（ｒＩ）・（ｒＣ）
アガロース（Ｐ−Ｌビオケミカルス）と３０℃にして１
５分間混合し、そして非吸着物を遠心分離により除去す
る。ポリ（ｒＩ）・（ｒＣ）に吸着された物質を２．５
mM（α³²Ｐ）ＡＴＰ（４００Ci／ml）（アメルシャム・
インターナショナル）と共に３０℃にて２０時間インキ
ュベートし、細菌アルカリ性ホスファターゼ（シグマ）
により処理し、そして次にMerlin等、Analyt.Biochem.
110 , 190 (1981)に記載されているようにして３．０ml
の１Ｍグリシン−ＨＣｌ緩衝液（pH２．０）により酸ア
ルミナのカラムから溶出する。

【０２９２】第８表の結果は、インターフェロン処理細
胞中の（２′−５′）−オリゴイソアデニレートシンセ
ターゼ活性の、非処理対照細胞中の酵素活性のレベル
（平均活性５１．６±８．７pmol／時／１０⁵ 細胞）に
対する増加倍数として示される。

【０２９３】

【表１３】

【０２９４】例３０． 医薬製剤（非経腸投与用） ヒトＷＩＳＨ細胞に対して１．３×１０⁸ ユニット／mg
の比活性を有する２mgのハイブリドインターフェロン
“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｄ₃ Ｄ₄ ”を３０mlの５Ｎヒト血清アルブミ
ンに溶解する。得られた溶液を細菌学的フィルターに通
し、そして濾過された溶液を無菌条件下で１００本のバ
イアルに分配する。これらはそれぞれ２．６×１０⁶ ユ
ニットの純粋なハイブリドインターフェロンを含有す
る。非経腸投与用バイアルは好ましくは冷所、例えば−
２０℃にて貯蔵する。

【０２９５】同様にして、５．２×１０⁶ ユニット又は
１．０４×１０⁷ ユニットを含有するバイアルを、それ
ぞれ４mg又は８mgのハイブリドインターフェロンを用い
て調製する。同様にして、ハイブリドインターフェロン
“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｂ₃ Ｂ₄ ”，“Ｂ₁ Ｂ₂Ｄ₃ Ｂ₄ ”，“Ｂ₁
Ｄ₂ Ｂ₃ Ｄ₄ ”，“Ｂ₁ Ｄ₂ Ｄ₃ Ｂ₄ ”、又は“Ｂ₁ Ｂ
₂ Ｂ₃ Ｄ₄ ”（それぞれ比活性１．２８×１０⁸ ，２×
１０⁸ ，７．７×１０⁷ ，３．８×１０⁷ 及び８×１０
⁷ を有する）を含有するバイアルを調製することができ
る。

【０２９６】なお、プラスミドＣＧ−ｐＢＲ３２２／Ｈ
ＬｙｃＩＦＮ−８１及びＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃ
ＩＦＮ−５₁ を含有するＥ．コリＨＢ１０１がそれぞれ
ＮＲＲＬ Ｂ−１２５３２及びＮＲＲＬ Ｂ−１２５３
１として寄託されており、本発明の出発プラスミドＣＧ
−ｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩＦＮ−α−３及びＣＧ−ｐＢ
Ｒ（ＡＰ）／ＬｙＩＦＮ−α−２の造成のために使用さ
れた。これらの造成方法は特願昭５７−１７４４２６号
明細書に詳細に記載されている。また、本発明のその他
の出発プラスミド、例えばプラスミドｐ３１ＲＴ（Δ７
２）等の造成方法は前記特許出願明細書又は特願昭５８
−１４４５４２号明細書に詳細に記載されている。

【０２９７】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１６６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴：ハイブリドインターフェロン「Ｂ₁ Ｂ₂ Ｂ
₃ Ｄ₄ 」のアミノ酸配列 配列 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile Leu 5 10 15 Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His 20 25 30 Asp Phe Glu Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Asp Lys Gln Phe Gln Lys Ala 35 40 45 50 Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe 55 60 65 Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Leu Asp Glu Thr Leu Leu Asp Glu Phe 70 75 80 85 Tyr Ile Glu Leu Asp Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ser Cys Val Met Gln 90 95 100 Glu Val Gly Val Ile Glu Ser Pro Leu Met Tyr Glu Asp Ser Ile Leu Ala 105 110 115 Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr 120 125 130 135 Ser Ser Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser 140 145 150 Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Arg Leu Arg Arg Lys Glu 155 160 165

【０２９８】配列番号：２ 配列の長さ：１６６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴：ハイブリドインターフェロン「Ｂ₁ Ｂ₂ Ｄ
₃ Ｂ₄ 」のアミノ酸配列 配列 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile Leu 5 10 15 Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His 20 25 30 Asp Phe Glu Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Asp Lys Gln Phe Gln Lys Ala 35 40 45 50 Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe 55 60 65 Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Leu Asp Glu Thr Leu Leu Asp Glu Phe 70 75 80 85 Tyr Ile Glu Leu Asp Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Met Gln 90 95 100 Glu Glu Arg Val Gly Glu Thr Pro Leu Met Asn Ala Asp Ser Ile Leu Ala 105 110 115 Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr 120 125 130 135 Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser 140 145 150 Leu Ser Ile Asn Leu Gln Lys Arg Leu Lys Ser Lys Glu 155 160 165

【０２９９】配列番号：３ 配列の長さ：１６６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴：ハイブリドインターフェロン「Ｂ₁ Ｄ₂ Ｂ
₃ Ｄ₄ 」のアミノ酸配列 配列 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile Leu 5 10 15 Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His 20 25 30 Asp Phe Glu Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Asp Lys Gln Phe Gln Lys Ala 35 40 45 50 Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe 55 60 65 Thr Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Asp Leu Leu Asp Lys Phe 70 75 80 85 Cys Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ser Cys Val Met Gln 90 95 100 Glu Val Gly Val Ile Glu Ser Pro Leu Met Tyr Glu Asp Ser Ile Leu Ala 105 110 115 Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr 120 125 130 135 Ser Ser Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser 140 145 150 Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Arg Leu Arg Arg Lys Glu 155 160 165

【０３００】配列番号：４ 配列の長さ：１６６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴：ハイブリドインターフェロン「Ｂ₁ Ｄ₂ Ｄ
₃ Ｂ₄ 」のアミノ酸配列 配列 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile Leu 5 10 15 Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His 20 25 30 Asp Phe Glu Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Asp Lys Gln Phe Gln Lys Ala 35 40 45 50 Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe 55 60 65 Thr Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Asp Leu Leu Asp Lys Phe 70 75 80 85 Cys Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Met Gln 90 95 100 Glu Glu Arg Val Gly Glu Thr Pro Leu Met Asn Ala Asp Ser Ile Leu Ala 105 110 115 Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr 120 125 130 135 Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser 140 145 150 Leu Ser Ile Asn Leu Gln Lys Arg Leu Lys Ser Lys Glu 155 160 165

【０３０１】配列番号：５ 配列の長さ：１６６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴：ハイブリドインターフェロン「Ｂ₁ Ｄ₂ Ｄ
₃ Ｄ₄ 」のアミノ酸配列 配列 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile Leu 5 10 15 Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His 20 25 30 Asp Phe Glu Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Asp Lys Gln Phe Gln Lys Ala 35 40 45 50 Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe 55 60 65 Thr Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Asp Leu Leu Asp Lys Phe 70 75 80 85 Cys Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Met Gln 90 95 100 Glu Glu Arg Val Gly Glu Thr Pro Leu Met Asn Ala Asp Ser Ile Leu Ala 105 110 115 Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr 120 125 130 135 Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser 140 145 150 Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Arg Leu Arg Arg Lys Glu 155 160 165

【０３０２】配列番号：６ 配列の長さ：１６６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴：ハイブリドインターフェロン「Ｂ₁ Ｄ₂ Ｂ
₃ Ｂ₄ 」のアミノ酸配列 配列 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile Leu 5 10 15 Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His 20 25 30 Asp Phe Glu Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Asp Lys Gln Phe Gln Lys Ala 35 40 45 50 Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe 55 60 65 Thr Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Asp Leu Leu Asp Lys Phe 70 75 80 85 Cys Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ser Cys Val Met Gln 90 95 100 Glu Val Gly Val Ile Glu Ser Pro Leu Met Tyr Glu Asp Ser Ile Leu Ala 105 110 115 Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr 120 125 130 135 Ser Ser Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser 140 145 150 Leu Ser Ile Asn Leu Gln Lys Arg Leu Lys Ser Lys Glu 155 160 165

【０３０３】配列番号：７ 配列の長さ：１６６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴：ヒトリンポブラストイドインターフェロン
ＬｙＩＦＮ−α−２のアミノ酸配列 配列 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile Leu 5 10 15 Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His 20 25 30 Asp Phe Glu Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Asp Lys Gln Phe Gln Lys Ala 35 40 45 50 Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe 55 60 65 Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Leu Asp Glu Thr Leu Leu Asp Glu Phe 70 75 80 85 Tyr Ile Glu Leu Asp Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ser Cys Val Met Gln 90 95 100 Glu Val Gly Val Ile Glu Ser Pro Leu Met Tyr Glu Asp Ser Ile Leu Ala 105 110 115 Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr 120 125 130 135 Ser Ser Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser 140 145 150 Leu Ser Ile Asn Leu Gln Lys Arg Leu Lys Ser Lys Glu 155 160 165

【０３０４】配列番号：８ 配列の長さ：１６６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴：ヒトリンポブラストイドインターフェロン
ＬｙＩＦＮ−α−２のアミノ酸配列 配列 Cys Asp Leu Pro Glu Thr His Ser Leu Asp Asn Arg Arg Thr Leu Met Leu 5 10 15 Leu Ala Gln Met Ser Arg Ile Ser Pro Ser Ser Cys Leu Met Asp Arg His 20 25 30 Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala 35 40 45 50 Pro Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe 55 60 65 Thr Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Asp Leu Leu Asp Lys Phe 70 75 80 85 Cys Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Met Gln 90 95 100 Glu Glu Arg Val Gly Glu Thr Pro Leu Met Asn Ala Asp Ser Ile Leu Ala 105 110 115 Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr 120 125 130 135 Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser 140 145 150 Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Arg Leu Arg Arg Lys Glu 155 160 165

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、成熟ＬｙＩＦＮ−α−２及びＬｙＩＦ
Ｎ−α−３のアミノ酸配列を比較したものである。Ｌｙ
ＩＦＮ−α−３のアミノ酸はＬｙＩＦＮ−α−２と異る
もののみ示されている。ＬｙＩＦＮ−α−３の他のアミ
ノ酸配列はＬｙＩＦＮ−α−２のそれと同一である。

【図２】図２は、ＬｙＩＦＮ−α−２及びＬｙＩＦＮ−
α−３のコード領域の上流部分のヌクレオチド配列を示
す。ＡＴＧ翻訳開始コドン、停止トリプレット、及び便
利な制限部位にアンダーラインが付されている。コード
トリプレットに番号が付されている。

【図３】図３は、ＬｙＩＦＮ−α−２及びＬｙＩＦＮ−
α−３のコード領域の下流部分並びに３′シストロン外
領域のヌクレオチド配列を示す。

【図４】図４は、プラスミドｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩＦ
Ｎ−α−２、及びｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩＦＮ−α−３
のＨｉｎｄIII −ＰｓｔＩ小セグメントの制限地図を示
す。中白の太棒（ＬｙＩＦＮ−α−３）及び黒色の太棒
（ＬｙＩＦＮ−α−２）は成熟ＩＦＮのコード領域の範
囲を定める。下部に、ＩＦＮポリペプチド（１６６アミ
ノ酸）の４部分への分割が示されている。

【図５】図５は、サンドイッチＲＩＡにおいて測定され
た試験溶液中のＩＦＮ−α−２の量の関数として、担体
ビーズに結合した放射能を示す。

【図６】図６は、サンドイッチＲＩＡにおいて測定され
た試験溶液中のＩＦＮ−α−２の量の関数として、担体
ビーズに結合した放射能を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/19 9050−4Ｂ 1/21 7236−4Ｂ 15/62 // Ａ６１Ｋ 37/66 Ｆ 8314−4Ｃ Ｂ 8314−4Ｃ Ｃ０７Ｋ 15/26 7731−4Ｈ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｆ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (31)優先権主張番号 ８５１４７２５ (32)優先日 1985年６月11日 (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ８５１４７２６ (32)優先日 1985年６月11日 (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (72)発明者 アルバート ヒネン スイス国，4057 バーゼル，オッフェンブ ルガーシュトラーセ 20 (72)発明者 アンドレアス マイスター スイス国，4125 リーエン，リューティリ ンク 78 (72)発明者 マルクス ゲルハルト グリュッター スイス国，4146 ホッホバルト，ネッテン ベルクベーク （番地なし) (72)発明者 セフィク アルカン スイス国，4125 リーエン，ビンゼンアッ カーシュトラーセ ３

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＬｙＩＦＮ−α−２のアミノ酸１〜１５
   ０とＬｙＩＦＮ−α−３のアミノ酸１５１〜１６６とか
   ら成るアミノ酸配列を有するポリペプチド、ＬｙＩＦＮ
   −α−２のアミノ酸１〜９２とＬｙＩＦＮ−α−３のア
   ミノ酸９３〜１５０とＬｙＩＦＮ−α−２のアミノ酸１
   ５１〜１６６とから成るアミノ酸配列を有するポリペプ
   チド、及びＬｙＩＦＮ−α−２のアミノ酸１〜６０とＬ
   ｙＩＦＮ−α−３のアミノ酸６１〜９２とＬｙＩＦＮ−
   α−２又はＬｙＩＦＮ−α−３のアミノ酸９３〜１５０
   とＬｙＩＦＮ−α−２又はＬｙＩＦＮ−α−３のアミノ
   酸１５１〜１６６とから成るアミノ酸配列を有するポリ
   ペプチドから成る群から選択されるハイブリドインター
   フェロンポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含んで
   成るハイブリドベクター。
2. 【請求項２】 配列番号１に示すアミノ酸配列を有する
   ハイブリドインターフェロン「Ｂ₁ Ｂ₂ Ｂ₃ Ｄ₄ 」をコ
   ードするＤＮＡ配列を含んで成る請求項１に記載のハイ
   ブリドベクター。
3. 【請求項３】 配列番号２に示すアミノ酸配列を有する
   ハイブリドインターフェロン「Ｂ₁ Ｂ₂ Ｄ₃ Ｂ₄ 」をコ
   ードするＤＮＡ配列を含んで成る請求項１に記載のハイ
   ブリドベクター。
4. 【請求項４】 配列番号３に示すアミノ酸配列を有する
   ハイブリドインターフェロン「Ｂ₁ Ｄ₂ Ｂ₃ Ｄ₄ 」をコ
   ードするＤＮＡ配列を含んで成る請求項１に記載のハイ
   ブリドベクター。
5. 【請求項５】 配列番号４に示すアミノ酸配列を有する
   ハイブリドインターフェロン「Ｂ₁ Ｄ₂ Ｄ₃ Ｂ₄ 」をコ
   ードするＤＮＡ配列を含んで成る請求項１に記載のハイ
   ブリドベクター。
6. 【請求項６】 配列番号５に示すアミノ酸配列を有する
   ハイブリドインターフェロン「Ｂ₁ Ｄ₂ Ｄ₃ Ｄ₄ 」をコ
   ードするＤＮＡ配列を含んで成る請求項１に記載のハイ
   ブリドベクター。
7. 【請求項７】 配列番号６に示すアミノ酸配列を有する
   ハイブリドインターフェロン「Ｂ₁ Ｄ₂ Ｂ₃ Ｂ₄ 」をコ
   ードするＤＮＡ配列を含んで成る請求項１に記載のハイ
   ブリドベクター。
8. 【請求項８】 ＬｙＩＦＮ−α−２のアミノ酸１〜１５
   ０とＬｙＩＦＮ−α−３のアミノ酸１５１〜１６６とか
   ら成るアミノ酸配列を有するポリペプチド、ＬｙＩＦＮ
   −α−２のアミノ酸１〜９２とＬｙＩＦＮ−α−３のア
   ミノ酸９３〜１５０とＬｙＩＦＮ−α−２のアミノ酸１
   ５１〜１６６とから成るアミノ酸配列を有するポリペプ
   チド、及びＬｙＩＦＮ−α−２のアミノ酸１〜６０とＬ
   ｙＩＦＮ−α−３のアミノ酸６１〜９２とＬｙＩＦＮ−
   α−２又はＬｙＩＦＮ−α−３のアミノ酸９３〜１５０
   とＬｙＩＦＮ−α−２又はＬｙＩＦＮ−α−３のアミノ
   酸１５１〜１６６とから成るアミノ酸配列を有するポリ
   ペプチドから成る群から選択されるハイブリドインター
   フェロンポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含有す
   るハイブリドベクターにより形質転換された大腸菌又は
   酵母宿主。
9. 【請求項９】 前記ハイブリドインターフェロンポリペ
   プチドが配列番号１に示すアミノ酸配列を有するハイブ
   リドインターフェロン「Ｂ₁ Ｂ₂ Ｂ₃ Ｄ₄ 」である、請
   求項８に記載の宿主。
10. 【請求項１０】 前記ハイブリドインターフェロンポリ
    ペプチドが配列番号２に示すアミノ酸配列を有するハイ
    ブリドインターフェロン「Ｂ₁ Ｂ₂ Ｄ₃ Ｂ₄」である、
    請求項８に記載の宿主。
11. 【請求項１１】 前記ハイブリドインターフェロンポリ
    ペプチドが配列番号３に示すアミノ酸配列を有するハイ
    ブリドインターフェロン「Ｂ₁ Ｄ₂ Ｂ₃ Ｄ₄」である、
    請求項８に記載の宿主。
12. 【請求項１２】 前記ハイブリドインターフェロンポリ
    ペプチドが配列番号４に示すアミノ酸配列を有するハイ
    ブリドインターフェロン「Ｂ₁ Ｄ₂ Ｄ₃ Ｂ₄」である、
    請求項８に記載の宿主。
13. 【請求項１３】 前記ハイブリドインターフェロンポリ
    ペプチドが配列番号５に示すアミノ酸配列を有するハイ
    ブリドインターフェロン「Ｂ₁ Ｄ₂ Ｄ₃ Ｄ₄」である、
    請求項８に記載の宿主。
14. 【請求項１４】 前記ハイブリドインターフェロンポリ
    ペプチドが配列番号６に示すアミノ酸配列を有するハイ
    ブリドインターフェロン「Ｂ₁ Ｄ₂ Ｂ₃ Ｂ₄」である、
    請求項８に記載の宿主。