DK173590B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af et antiviralt polypeptid og at et dobbeltstrenget DNA, der omfatter en sekvens, der koder - Google Patents

Description

, DK 173590 B1 5 Den foreliggende opfindelse angår den mikrobielle fremstilling af et hidtil ukendt antiviralt polypeptid samt fremstilling af et dobbeltstrenget DNA, der omfatter en sekvens, der koder for polypeptidet. Opfindelsen angår endvidere et dobbeltstrenget DNA, en replicerbar plasmidudtryksbærer, et plasmid, en 10 mikroorganisme, der er transformeret med en udtryksbærer samt det antivirale polypeptid.

Relativt homogene leukocytinterferoner er blevet udvundet fra raske eller leukæmiske donorers leukocyter. Disse in-terfero-15 ner er en klasse af proteiner, der er karakteriseret ved en udpræget evne til at meddele deres målceller en virusresistent tilstand. Interferonet kan tillige virke hæmmende på celleformering og modulere immunrespons. Disse egenskaber har givet anledning til klinisk anvendelse af interferon som et 20 terapeutisk middel til behandling af virusinfektioner og maligne tilstande.

Rekombinant DNA-teknik er for nylig blevet taget i anvendelse til at identificere strukturerne af humane leu-25 kocytinterferoner og lejlighedsvis til mikrobiel fremstilling af humane leukocytinterferoner. Mens Nagata et al.

[Nature 287, 401-408 (1980)] beskriver strukturen af et af de otte eller flere forskellige kromosomale gener for humant interferon a, beskriver Streuli et al. [Science 209, 1343-30 1347 {1980}] eksistensen af mindst tre leukocytinterferoner af human type, og Allen et al. [Nature 287, 408-411 (1980)] har rapporteret eksistensen af en familie af strukturelle gener for leukocytinter-feron af human type, Goeddel et al.

[Nature 290, 20-26 (1981)] har beskrevet strukturen af otte 35 forskellige hu-mane leukocytinterferoner, der er udledt fra klonede cDNA'er, hvis aminosyresekvenser udviser en homologi af størrelsesordenen 70% i forhold til hinanden. Goeddel og Pestka [Nature 287, DK 173590 B1 2 411-416 (1980)] har beskrevet fremstillingen af humant leuko-cytinterferon A (LeIF A).

Gener, der indkoder aminosyresekvenser fra andre leukocyt-5 interferoner, der blandt andet betegnes henholdsvis LeIF B, C, D, F, G og H, fås fra cellelinjen KG-1, der beskrives af H.P. Koeffler og D.W. Golde [Science 200, 1153-1154 (1978)] og af David V. Goeddel og Sidney Pestka [Nature 287, 411-416 (1980)]. Cellelinjen KG-1 er blevet deponeret hos American 10 Type Culture Collection, ATCC accessionsnummer CRL 8031. Når sådanne gener anbringes hensigtsmæssigt i plasmidbærere til bakteriel udtrykkelse, kan de anvendes til at transformere værtsbakterier, især E. coli K-12 stamme 294, deponeret i den amerikanske typekultursamling 28. oktober 1978, med acces-15 sionnummeret 31446.

Den rekombinante DNA-tekniks arbejdsredskab er plasmidet, en ikke-chromosomal løkke af dobbeltstrenget DNA, der findes i bakterier og andre mikrober, ofte i multiple kopier pr.

20 celle. De oplysninger, der er indkodet i plasmid DNA, omfatter den nødvendige information til reproduktion af plasmidet i datterceller (dvs. et "replikon") og almindeligvis én eller flere udvælgelseskarakteristika såsom, for bakteriers vedkommende, resistens over for antibiotika, som gør det 25 muligt for kloner fra værtscellen, der indeholder det ønskede plasmid, at blive genkendt og fortrinsvis dyrket i selektive medier. Plasmidernes anvendelighed er begrundet i, at de kan spaltes specifikt af én eller flere restriktionsendonucleaser eller "restriktionsenzymer", der hver især genkender et for-30 skelligt sted på plasmid DNA'et. Derefter kan heterologe gener eller genfragmenter indsættes i plasmidet ved ende-tilende sammenføjning på spaltningsstedet eller på rekonstruerede ender ved siden af spaltningsstedet. DNA-Rekombination foretages uden for cellen, men det resulterende "rekombinan- DK 173590 B1 3 te" plasmid kan indføres i denne ved en fremgangsmåde kaldet transformation, og der kan fås store mængder af det heterologe genholdige rekombinantplasmid ved dyrkning af transformanten. Hvor genet indsættes korrekt med hensyn til de dele 5 af plasmidet, der styrer transkriptionen og oversættelsen af det indkodede DNA-budskab, kan den resulterende udtryksbærer ydermere anvendes til faktisk at fremstille den polypeptid-sekvens, som det indsatte gen koder for, en proces, der kaldes udtrykkelse.

10

Udtrykkelse indledes i et område kaldet promotoren, som kan genkendes og bindes af RNA-polymerase. I visse tilfælde, som fx tryptophan eller "trp" promotoren, der foretrækkes til udførelse af den foreliggende opfindelse, overlappes promotor-15 områder af "operator”-områder til dannelse af en sammensat promotor-operator. Operatorer er DNA- sekvenser, der genkendes af såkaldte undertrykkerproteiner, som tjener til at regulere hyppigheden af transkriptionsindledning ved en bestemt promotor. Polymerasen vandrer langs DNA’et og trans-20 kriberer de oplysninger, der er indeholdt i den kodende streng, fra dens 5'- til 3'-ende ind i kurér-RNA, som på sin side oversættes til et polypeptid med den aminosyresekvens, som DNA*et koder for. Hver aminosyre indkodes af en nucleo-tidtriplet eller "kodon" inden i hvad der til formålet kan 25 kaldes "strukturgenet", dvs. den del, der indkoder det udtrykte produkts aminosyresekvens. Efter binding til promotoren transkriberer RNA-polymerasen først nucleotider, der indkoder et ribosombindingssted, derefter et oversættelsesindlednings- eller- "start"-signal (sædvanligvis ATG, der i 30 det resulterende kurér-RNA bliver til AUG), og derpå nucleo-tidkodonerne inden i selve strukturgenet. Såkaldte stopkodo-ner transkriberes ved enden af strukturgenet, hvorefter polymerasen kan danne en yderligere sekvens af kurér-RNA, der på grund af stopsignalets tilstedeværelse forbliver uoversat af DK 173590 B1 4 ribosomerne. Ribosomer binder til det bindingssted, der findes på kurér-RNA'et, i bakterier sædvanligvis medens RNA'et dannes, og de frembringer selv det indkodede polypeptid, der begynder ved oversættelsesstartsignalet og slutter ved det 5 nævnte stopsignal. Det ønskede produkt frembringes, hvis disse sekvenser, der indkoder ribosombindingsstedet, er anbragt korrekt med hensyn til AUG-indledningskodonen, og hvis alle de resterende kodoner følger indledningskodonen i fase. Det resulterende produkt fås ved lysering af værtscel-10 len og udvinding af produktet ved på hensigtsmæssig måde at rense det for andet bakterielt protein.

Studier af nucleotidsekvenser hos gener, der indkoder de forskellige leukocytinterferoner, afslører en vis lighed 15 mellem flere af dem med hensyn til tilstedeværelse og placering af spaltningssteder, der genkendes af bestemte restrik-tionsendonucleaser. Ved den foreliggende opfindelse kan man drage nytte af denne lighed til ved hjælp af DNA-rekombination at danne hidtil ukendte hybride gener, der er nyttige i 20 den mikrobielle produktion af hybride leukocytinterferoner, som i større eller mindre grad kan forventes at besidde de antivirale eller andre egenskaber hos interferoner, der indkodes af stamgenerne. I foretrukne udførelsesformer for opfindelsen kan sådanne hybride leukocytinterferoner have for-25 øget virkning i forhold til de interferoner, der indkodes af stamgenerne.

Den foreliggende opfindelse angår således en fremgangsmåde til fremstilling af antivirale polypeptider på 165 til 166 30 aminosyrer, idet disse polypeptiders aminosyresekvens består af dels en afgrænset aminosyre-undersekvens af humant leuko-cytinterferon A og af dels en afgrænset aminosyre-undersekvens af humant leukocytinterferon B eller D, og idet poly-peptidernes aminosyresekvenser i hele deres sammensætning DK 173590 B1 5 afviger fra aminosyresekvenserne i naturligt forekommende leukocytinterferoner, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at den omfatter anbringelsen af et hybridt dobbeltstrenget DNA-fragment, der omfatter en streng, som indkoder 5 polypeptidet, inden i en replicerbar plasmidudtryksbærer, transformation af en mikroorganisme med denne, dyrkning af mikroorganismen og forårsagelse af det indkodede polypeptids udtrykkelse, lysering af den resulterende mikroorganisme og udvinding af polypeptidet derfra.

10

Den foreliggende opfindelse angår også et dobbeltstrenget DNA, der indkoder et antiviralt polypeptid på ca. 165 til 166 aminosyrer, idet polypeptidets aminosyresekvens omfatter en afgrænset aminosyre-undersekvens af humant leukocytinterferon 15 A og af humant leukocytinterferon B eller D, og idet polypeptidets aminosyresekvens i hele sin sammensætning afviger fra naturligt forekommende leukocytinterferoners aminosyresekvens .

20 Opfindelsen angår ligeledes en replicerbar plasmidudtryksbærer, der i en transformeret mikroorganisme er i stand til at udtrykke et polypeptid, der indkodes af en DNA-sekvens som defineret ovenfor, samt en mikroorganisme, der er transformeret med en sådan udtryksbærer.

25

Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af det ovenfor definerede dobbeltstrengede DNA, hvilken fremgangsmåde omfatter 30 a) udvælgelse af et første, dobbeltstrenget DNA-frag-ment, der omfatter kodoner, som indkoder hele eller en del af det første, naturligt forekommende leuko-cytinterferons aminosyresekvens, hvilket fragment indeholder kodoner for den aminoterminale del af det 6 DK 173590 B1 5 nævnte interferon og anbragt i 3'-retningen fra denne et første restriktionsendonucleasespaltningssted; b) spaltning af fragmentet med restriktionsendonucle-asen; 10 c) udvælgelse af et andet, dobbeltstrenget DNA-fragment, der indkoder hele eller en del af aminosyresekvensen i et andet, forskelligt, naturligt forekommende leukocytinterferon, hvilket andet fragment omfatter 15 et identisk restriktionsendonucleasespaltningssted, der er identisk anbragt set ud fra aminosyrenum-mereringen for de to interferoner, og som udover dette sted yderligere omfatter kodoner for den carb-oxyterminale del i det andet interferon; 20 d) spaltning af det andet fragment med restriktions-endonucleasen; og e) ligatering af produkterne fra restriktionsendo- 25 nucleasedigestionen i trin b) og d) for at gendanne re- striktionsendonucleasestedet og danne et hybridt fragment, der i rækkefølge består af kodoner for det første interferons aminoterminale del og det andet interferons carboxyterminale del.

30

Endvidere angår opfindelsen et antiviralt polypeptid på 165-166 aminosyrer, som er ejendommeligt ved det i krav 21’s kendetegnende del angivne.

35 DK 173590 B1 7

Hybrid leukocytinterferonerne fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen adskiller sig strukturelt meget fra stam-leukocytinterferonerne, der koder for de her omhandlede hybrider, og på indleveringstidspunktet for nærværende an-5 søgning og forud for fremstillingen af disse hybrider var det ikke muligt at forudsige, at et hybridt leukocytinterferonmolekyle ville være i besiddelse af nogen biologisk aktivitet overhovedet. Det har imidlertid overraskende vist sig at hybriderne fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse har 10 biologisk aktivitet, som det er blevet påvist i de antivirale assay i den foreliggende ansøgning. Envidere har det også overraskende vist sig, at forholdet mellem aktiviteterne for de forskellige hybrider på humane og bovine cellelinier varierer med næsten fire størrelsesordener. Ved at sammen-15 ligne med stamleukocytinterferon genprodukterne A-I, der er vist nederst i tabel 4, ses det, at disse har en langt mindre variation i størrelsesorden, det vil sige én størrelsesorden eller endda mindre.

20 De hybride leukocytinterferoner fremstillet ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse udviser således uventede nyttige biologiske aktiviteter såvel indbyrdes som sammenlignet med stamproteinerne.

25 Stam-leukocytinterferongenerne, der indkoder de her omhandlede naturligt forekommende leukocytinterferonproteiner, udviser naturlige allele variationer fra individ til individ.

Disse variationer kan vises ved (en) aminosyreforskel (le) i hele proteinsekvensen eller ved sletninger, erstatninger, 30 indsætninger, inversioner eller tilføjelser af (en) aminosyre (r) i denne sekvens. For hvert stamleukocytinterferon mærket LeIF A, LeIF B.... LeIF D, etc., falder sådanne allele variationer inden for rammerne af det begreb, der definerer DK 173590 B1 8 et sådant, og falder således også inden for den foreliggende opfindelses rammer.

Måden, hvorpå disse og andre af opfindelsens formål og for-5 dele opnås, fremgår af den detaljerede del af beskrivelsen og af tegningen, på hvilken:

Fig. 1 viser nucleotidsekvenser fra de kodende områder i 8 leukocytinterferon ("LelF")-komplementær DNA ("cDNA")-kloner.

10 Af disse er én, der betegnes LelF E, tilsyneladende et "pseudogen", der ikke indkoder noget aktivt leukocytinterferon, medens en anden, der betegnes LelF G, indeholder mindre end den fulde sekvens for den tilsvarende interferonart. ATG-Oversættelsesindledningskodonen og afslutningstripletten for 15 hvert LelF er understreget.

Fig. 2 viser restriktionsendonucleasekort for 8 typer af LeIF-klonede cDNAs (A til H). Plasmider, der indeholder klonerne konstrueres ved hjælp af dC:dG-haledannelsesmetoden 20 [Goeddel, D.V. et al. Nature 287, 411-416 (1980)]. Derfor kan cDNA-indsætningerne skæres ud med Pst I, dvs. hver ende på hver indsætning er et Pst I-restriktionsendonucleasespalt-ningssted. Linjerne på enden af hver cDNA-indsætning repræsenterer de flankerende homopolymere dC:dG-haler. Pvu II-, 25 EcoRI- og Bgl Il-restriktionsstedernes stillinger er vist. Schatterede områder på tegningen står for modne LeIF'ers kodende sekvenser; de skraverede områder viser signalpeptiders kodende sekvenser; og de hvide områder viser 3' og 5' ikke-kodende sekvenser.

30

Fig. 3 er en sammenligning af de 8 LeIF-proteinsekvenser, der forventes ud fra nucleotidsekvenserne. De enkeltbogstavsforkortelser, der anbefales af IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature, er anvendt; A, alanin; C, cystein; D, DK 173590 B1 9 asparaginsyre; E, glutaminsyre; F, phenylalanin; G, glycin; H, histidin; I, isoleucin; K, lysin; L, leucin; M, methionin; N, asparagin; P, prolin; Q, glutamin; R, arginin; S, serin; T, threonin; V, valin; W, tryptophan; og Y, tyrosin. Tallene 5 står for aminosyrestilling (S står for signalpeptid). Stregen i LeIF A-sekvensen på 165 aminosyrer ved stilling 44 indføjes for at bringe LeIF A-sekvensen på linje med de øvrige LeIF’-ers aminosyresekvenser på 166. LeIF E-Sekvensen bestemmes ved, at man ignorerer det ekstra nucleotid (stilling 187 på 10 fig. 1) i dets kodende område. Stjernerne viser i-fase-af-slutningskodoner. Aminosyrer, der er fælles for alle LeIF’er (undtagen pseudogenet LeIF E), vises også. De understregede remanenser er aminosyrer, der også er til stede i humant fibroblastinterferon.

15

Hvad angår fig. 1, svarer nucleotiderne +1 til 69 til SI til S23-aminosyrerne på fig. 3. Kodonen TGT (nucleotiderne 70 til 72) på fig. 1 svarer til cystein (C, aminosyre 1) på fig. 3.

På fig. 3 findes Pvu II-restriktionsendonucleasespaltnings-20 stedet mellem kodonerne for aminosyrerne 92 og 93 i LeIF A, B, D, F og G, dvs. mellem nucleotiderne 346 og 347, på fig.

I.

Fig. 4 sammenligner aminosyresekvenserne for de modne leuko-25 cytinterferoner A og D, idet en sletning af aminosyre 44 i LeIF A er vist ved en punkteret linje. Kun de LeIF D aminosyrer, der afviger fra de tilsvarende aminosyrer hos LeIF A, vises; LeIF D's aminosyresekvens er derudover identisk med LeIF A's. Fig. 4 viser også Bgl II- og Pvu II-restriktions-30 endonucleasespaltningsstedernes relative stilling på det tilsvarende gen, hvilke spaltningssteder anvendes til dannelse af de foretrukne hybride leukocytgener ifølge opfindelsen.

DK 173590 B1 10

Fig. 5 og 6 viser resultaterne af en sammenlignende testning af et foretrukket hybridt leukocytinterferon ifølge opfindelsen ("LeIF-A/D") for virkning mod henholdsvis encephalorayo-carditis-virus {"EMC") og vesiculøs stomatitis-virus ("VSV") 5 i museceller.

Fig. 7 og 8 viser resultaterne af en sammenlignende testning, der omfatter LeIF-A/D og andre interferoner mod EMC-virusin-fektioner i henholdsvis mus og hamstere. Dataene i fig. 7 er 10 resultatet af intraperitoneale behandlinger 3 timer før infektionen. Doseringer af LeIF- A/D og LeIF-A er som titreret på WISH-celler.

Fig. 9 viser DNA-sekvenser hos fem LeIF-proteiner ifølge 15 opfindelsen, herunder typerne I og J.

Anvendte mikroorganismer

Det beskrevne forskningsarbejde gør brug af to mikroorganis-20 mer: E. coli xl776, som beskrevet i USA-patentskrift 4190495, og E. coli K-12 stamme 294 (ende A, thi-, hsr-, hsm+jc), som beskrevet i offentliggjort britisk patentansøgning nr.

2055382A. Hver af disse er blevet deponeret henholdsvis 3. juli 1979, og 28. oktober 1978, hos American Type Culture 25 Collection, ATCC accessionsnr. 31537 og 31446. Alt rekombi-nant DNA-arbejde er udført i overensstemmelse med National Institutes of Health's retningslinjer.

I sine mest foretrukne udførelsesformer er opfindelsen be-30 skrevet under henvisning til E. coli, herunder ikke blot stammerne E. coli xl776 og E. coli K-12 stamme 294, som ovenfor beskrevet, men også andre kendte E, coli-stammer såsom E. coli B eller andre mikrobielle stammer, hvoraf mange er deponeret og (potentielt) tilgængelige hos anerkendte DK 173590 B1 li institutioner for deponering af mikroorganismer såsom the American Type Culture Collection, ATCC. (Jfr. ATCC kataloget og tysk offentliggørelsesskrift 2644432). Disse andre mikroorganismer omfatter fx baciller såsom Bacillus subtilis og 5 andre enterobacteriaceae, blandt hvilke man som eksempel kan nævne Salmonella typhimurium og Serratia marcesans, der udnytter plasmider, som kan replicere og udtrykke heterologe gensekvenser deri. Gær såsom Saccharomyces cerevisiae kan også med fordel anvendes som værtsorganisme under fremstil-10 ling af interferonproteiner ved udtrykkelse af gener, der koder derfor, under kontrol af en gærpromotor.

LeIF-Hybriderne fremstilles i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse ved at drage nytte af de restriktions-15 endonucleasespaltningssteder, der almindeligvis findes i de enkelte stamgener og hver ende deraf, sammen med de samme steder i bærende udtryksplasmider (vektorer). Fx kan det store (ca. 3900 bp) fragment fra en Xba I- til Pst I-digestion af pLeIF A trp 25 udtryksplasmidet ligateres med Xba I til 20 Pvu II og Pvu II til Pst I-digestionsfragmenter af de forskellige LeIF stamgener for at tilvejebringe udtryksplasmider, der er i stand til at frembringe et tilsvarende hybridt LeIF.

25 Hvert LeIF-udtryksplasmid konstrueres uafhængigt af de andre med digestionsfragmenter, der er isoleret fra forskellige LeIF-plasmider, fx pLeIF A trp 25, pLeIF B trp 7, pLeIF C trp 35, pLeIF D trp 11, pLeIF F trp 1, pLeIF G, pLeIF H og pLeIF I etc., hvis konstruktion er beskrevet i Nature 287, 411 30 (1980), eller fra pBR322, hvis konstruktion er beskrevet i Gene 2, 95 (1977). I visse af disse plasmider betegner "trp" et tryptophanpromotor-operatorsystem, der er det mest foretrukne for bakteriel udtrykkelse, som beskrevet i offentliggjort europæisk patentansøgning nr. 36776.

DK 173590 B1 12

Direkte udtrykkelse af et første modent leukocytinterferon

Den anvendte fremgangsmåde til udtrykkelse af LeIF A direkte som et modent interferonpolypeptid omfatter kombinationen af 5 syntetiske (N-terminale) og komplementære DNA’er.

Et Sau 3a-restriktionsendonucleasested er hensigtsmæssigt anbragt mellem kodonerne 1 og 2 på LeIF A. Der fremstilles to syntetiske deoxyoligonucleotider, der inkorporerer en ATG 10 oversættelsesindledningskodon, rekonstruerer kodonen for aminosyre 1 (cystein) og danner en EcoRI hæfteende. Disse oligomerer ligateres til et 34 bp langt Sau 3a - Ava Ilfragment af pL31. Det resulterende 45 bp lange produkt ligateres til to yderligere DNA-fragmenter for at konstruere et 15 865 bp langt syntetisk-naturligt hybridgen, der koder for LeIF A, og som er afgrænset af EcoRI og Pst I-restriktions-steder. Dette gen indsættes i pBR322 mellem EcoRI- og Pst I-stederne, hvorved fås plasmidet pLeIF Al.

20 Plasmidet pGMl bærer E. coli's tryptophanoperon, der indeholder sletningen ALE1413 [G.F. Miozzari et al., J. Bacteriology 133, 1457- 1466 (1978)], hvorfor det udtrykker et fusionsprotein, der omfatter trp lederens første 6 aminosyrer og ca. den sidste tredjedel af trp E-polypeptidet (herefter 25 omtalt i sammenhængen som LE'), såvel som trp D-polypeptidet i dets helhed, altsammen under kontrol af trp promotor-opera-torsystemet. Plasmidet på 20 pg digereres med restriktionsenzymet Pvu II, som spalter plasmidet på fem steder. Genfragmenterne kombineres dernæst med EcoRI-koblere (der består af 30 et selv-komplementært oligonucleotid med sekvensen: pCATGAATTCATG), der tilvejebringer et EcoRI-spaltningssted for en senere kloning ind i et plasmid, der indeholder et EcoRI-sted. De 20 pg DNA-fragmenter, der fås fra pGMl, behandles med 10 enheder T4 DNA-ligase i nærværelse af 200 DK 173590 B1 13 picomol af det 5’-phosphorylerede syntetiske oligonucleotid pCATGAATTCATG og i 20 μΐ T4 DNA-ligasepuffer (20 mM tris, pH-værdi 7,6, 0,5 mM ATP, 10 mM MgCl2, 5 mM dithiothreitol) ved 4°C natten over. Opløsningen opvarmes derefter i 10 minutter 5 ved 70°C for at standse ligationen. Koblerne spaltes ved EcoRI-digestion, og fragmenterne, der nu har EcoRI-ender, adskilles under anvendelse af 5%'s polyacrylamid-gelelektro-forese (herefter "PAGE”), og de tre største fragmenter isoleres fra gelen ved først at plette med ethidiumbromid, lokali-10 sere fragmenterne med ultraviolet lys og udskære de ønskede dele fra gelen. Hvert gelfragment anbringes sammen med 300 μΐ Ο,ΙχΤΒΕ i en dialysepose og underkastes elektroforese ved 100 Vil time i Ο,ΙχΤΒΕ-puffer (TBE-puffer inderholder: 10,8 gm tris-base, 5,5 gm borsyre, 0,09 gm Na2EDTA i 1 liter 15 Η20). Den vandige opløsning opsamles fra dialyseposen, phe-nolekstraheres, chloroformekstraheres og gøres 0,2M natrium-chlorid, og DNA'et udvindes i vand efter ethanoludfældning.

Det trp promotor-operatorholdige gen med EcoRI-hæfte-ender identificeres ved den følgende fremgangsmåde, der omfatter 20 indsættelse af fragmenter i et tetracyclinfølsomt plasmid, der efter promotor-operatorindsættelse bliver tetracyclin-resistent.

Plasmidet pBRHl (R.I. Rodrigues, et al., Nucleic Acids Re-25 search 6, 3267-3287 [1979]) udtrykker ampicillinresistens og indeholder genet for tetracyclinresistens, men da der ikke er nogen dermed forbundet promotor, udtrykker det ikke denne resistens. Plasmidet er derfor tetracyclinfølsomt. Ved at indføre et promotor-operatorsystem på EcoRI-stedet kan plas-30 midet gøres tetracyclinresistent.

pBRHl digereres med EcoRI, og enzymet fjernes ved phenoleks-traktion efterfulgt af chloroformekstraktion og udvindes i vand efter ethanoludfældning. Det resulterende DNA-molekyle DK 173590 B1 14 kombineres i adskilte reaktionsblandinger med hvert af de tre ovenfor vundne DNA- fragmenter og ligateres med T4 DNA-ligase som ovenfor beskrevet. Det DNA, der er til stede i reaktionsblandingen, anvendes til at transformere kompetent E. coli 5 K-12 stamme 294 (K. Backman et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 73, 4174-4198 [1976]) på kendt måde (V. Hershfield et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71' 3455-3459 [1974]), og bakterierne udsås på LB-plader, der indeholder 20 pg/ml ampicillin og 5 pg/ml tetracyclin. Der udvælges adskillige 10 tetracyclinresistente kolonier, plasmid DNA isoleres, og tilstedeværelsen af det ønskede fragment bekræftes ved restriktionsenzymanalyse. Det resulterende plasmid betegnes pBRHtrp.

15 Et EcoRI- og BamHI-digestionsprodukt fra hepatitis B's virale genom fås på kendt måde og klones ind i plasmidet pGH6's EcoRI- og BamHI-steder {D.V. Goeddel et al., Nature 281, 544

[1979]), hvorved plasmidet pHS32 dannes. Plasmidet pHS32 spaltes med Xbal, phenolekstraheres, chloroformekstraheres og 20 ethanoludfældes. Det behandles derefter med 1 μΐ E. coli-polymerase I, Klenow-fragment (Boehringer-Mannheim) i 30 μΐ polymerasepuffer (50 mM kaliumphosphat, pH-værdi 7,4, 7 mM MgCl2, 1 mM β-mercaptoethanol), der indeholder 0,1 mM dTTP og 0,1 mM dCTP i 30 minutter ved 0°C og derefter i 2 timer ved 25 37°C. Denne behandling bevirker, at 2 af de 4 nucleotider, der er komplementære med Xbal-spaltningsstedets 5'-udragende ende, udfyldes

S· CTAUW- __ 5' C TAG A

30 3’ T— 3' TCT—

To nucleotider, dC og dT, inkorporeres, hvorved der fås en ende med to 5’-udragende nucleotider. Denne lineære remanens DK 173590 B1 15 af plasmidet pHS32 (efter phenol- og chloroformekstraktion og udvinding i vand efter ethanoludfældning) spaltes med EcoRI.

Det store plasmidfragment adskilles fra det mindre EcoRI-Xbal-fragment ved PAGE og isoleres efter elektroeluering.

5 Dette DNA-fragment fra pHS32 (0,2 pg) ligateres under betingelser, der ligner de ovenfor beskrevne, til tryptophanope-ronets EcoRI-Taq I-fragment (ca. 0,01 pg), der stammer fra pBRHtrp.

10 Under ligateringen af fragmentet fra pHS32 til EcoRI-Taq I-fragmentet som ovenfor beskrevet ligateres Taq I's udragende ende til Xbal's tiloversblevne udragende ende, selv om den ikke danner et fuldstændigt Watson-Crick basepar 15 _x + CTAGA - —TCTAGA-

_AGC tct- -AGCTCT

En del af denne ligationsreaktionsblanding transformeres ind i E. coli 294 celler, varmebehandles og udsås på LB-plader, 20 der indeholder ampicillin. Der udvælges 24 kolonier, der dyrkes i 3 ral LB-medier, hvorfra plasmiderne isoleres. Seks af disse viser sig at have fået Xbal-stedet regenereret via E. coli-katalyseret DNA-reparation og- replikation —T CTAGA- -TCTAGA- —AGCTCT- -AGATCT— 25 Disse plasmider viser sig også at spalte både med EcoRI og Hpal, hvorved der fås de forventede restriktionsfragmenter.

Et plasmid med betegnelsen pTrp 14 anvendes til udtrykkelse af heterologe polypeptider, hvilket er beskrevet nedenfor.

DK 173590 B1 16

Plasmidet pHGH 107 (D.V. Goeddel et al., Nature, 281, 544

[1979]) indeholder et gen for humant væksthormon bestående af 23 aminosyrekodoner, fremstillet af syntetiske DNA-fragmen-ter, og 163 aminosyrekodoner, der fås fra komplementært DNA 5 fremstillet via omvendt transkription af kurér-RNA for humant væksthormon. Dette gen indeholder en ATG oversættelsesindledningskodon, selv om det mangler kodonerne for human væksthormons "præ"-sekvens. Genet isoleres fra 10 pg pHGH 107 efter behandling med EcoRI efterfulgt af E. coli- polymerase 10 I Klenow-fragment og dTTP og dATP som ovenfor beskrevet.

Efter phenol- og chloroformekstraktion og ethanoludfældning behandles plasmidet med BamHI.

Det humane væksthormons ("HGH") genholdige fragment isoleres 15 ved PAGE efterfulgt af elektroeluering. Det resulterende DNA-fragment indeholder også de første 350 nucleotider af tetra-cyclinresistensstrukturgenet, men mangler tryptophan-promo-tor-operatorsystemet, således at når fragmentet senere klones ind i et udtryksplasmid, kan de plasmider, der indeholder 20 indsætningen, lokaliseres ved genoprettelse af tetracyclin-resistens. Da fragmentets EcoRI-ende er blevet udfyldt ved Klenow-polymerase I-fremgangsmåden, har fragmentet én stump ende og én hæfte^ende, hvilket sikrer korrekt orientering, når det senere indsættes i et udtryksplasmid.

25

Udtryksplasmidet pTrpl4 fremstilles derefter til at modtage det HGH- genholdige fragment, som er fremstillet ovenfor.

Således digereres pTrpl4 med Xbal, og de resulterende hæfteender udfyldes ved Klenow-polymerase I-fremgangsmåden under 30 anvendelse af dATP, dTTP, dGTP og dCTP. Efter phenol- og chloroformekstraktion og ethanoludfældning behandles det resulterende DNA med BamHI, og det resulterende store plas-midfragment isoleres ved PAGE og elektroeluering. Fragmentet, der fås fra pTrpl4, har én stump ende og én hæfte-ende, DK 173590 B1 17 hvilket muliggør rekombination i den korrekte orientering med det HGH-genholdige fragment/ der er beskrevet ovenfor.

HGH-Genfragmentet og pTrpl4 AXba-BamHI-fragmentet kombineres 5 og ligateres sammen under betingelser, der ligner de ovenfor beskrevne. De udfyldte Xbal- og EcoRI-ender ligateres sammen med stumpende-ligation for at gendanne både Xbal- og EcoRI-stedet 10 Udfyldt Xbal Udfyldt EcoRI HGH-genindledning -TCTAG + AATTCTATG- -^ -TCTAGAATTCTATG- -AQATC TTAAGATAC- -AGATCTTAAGATAC-

Xbal EcoRI

15 Denne konstruktion gendanner også tetracyclinresistensgenet. Eftersom plasmidet pHGH 107 udtrykker tetracyclinresistens fra en promotor, der ligger ovenfor HGH-genet (lac promotoren) , tillader denne konstruktion, der betegnes pHGH 207, udtrykkelse af genet for tetracyclinresistens under kontrol 20 af tryptophanpromotor-operatoren. Således transformeres ligationsblandingen ind i E. coli 294, og der udvælges kolonier på LB-plader, som indeholder 5 pg/ml tetracyclin.

Plasmidet pHGH 207 digereres med EcoRI, og trp promotoren, 25 der indeholder et 300 bp langt EcoRI-fragment, udvindes ved PAGE efterfulgt af elektroeluering. Det 300 bp lange EcoRI-fragment indeholder E. coli*s trp promotor, operator og trp leder-ribosombindingssted, men mangler en ATG-sekvens til indledning af oversættelse. Dette DNA-fragment klones ind i 30 pLeIF A’s EcoRI-sted.

Det netop nævnte trp fragment er analogt med E. coli's tryp-tophanoperon, fra hvilken den såkaldte trp svækker er blevet slettet for på kontrollabel måde at forhøje udtrykkelses- DK 173590 B1 18 niveauet. Udtryksplasmider, der indeholder den modificerede trp regulon, kan dyrkes til forudbestemte niveauer i næringsmedier, der indeholder tilsat tryptophan i tilstrækkelige mængder til at undertrykke promotor-operatorsystemet, hvor-5 efter de kan berøves for tryptophan, således at systemet afundertrykkes, hvorved udtrykkelse af det ønskede produkt finder sted.

Nærmere bestemt digereres 250 pg af plasmidet pL31 med Pst I, 10 og den 1000 bp lange indsætning isoleres ved gelelektroforese på en 6%’s polyacrylamidgel. Der elektroelueres ca. 40 pg indsætning fra gelen, hvilket deles i 3 alikvoter til yderligere digestion 15 a) en prøve på 16 pg af dette fragment digereres delvis med 4 0 enheder Bgl II i 45 minutter ved 37°C, og reaktionsblandingen renses på en 6%'s polyacrylamidgel. Der udvindes ca.

2 pg af det ønskede 670 bp lange fragment.

20 b) En anden prøve (8 pg) af den 1000 bp lange Pst I-indsæt-ning restringeres med Ava II og Bgl II. Et pg af det anførte 150 bp lange fragment udvindes efter gelelektroforese.

c) 16 pg af det 1000 bp lange stykke behandles med Sau 3a og 25 Ava II. Efter elektroforese på en 10%'s polyacrylamidgel udvindes ca. 0,25 pg (ca. 10 pmol) af det 34 bp lange fragment. De to anførte deoxyoligonucleotider, 5'-dAATTCATGTGT (fragment 1) og 5'-dGATCACACATG (fragment 2) syntetiseres ved phosphortriestermetoden (Maxam and Gilbert, Methods Enzymol.

30 j65, 499-560 [1980]). Fragment 2 phosphoryleres som følger.

200 pi (ca. 40 pmol) (γ32Ρ) ATP (Amersham, 5000 Ci/mmol) tørres og gensuspenderes i 30 pi 60 mM Tris-HCl (pH-værdi 8), 10 mM MgCl2, 15 mM β-mercaptoethanol, der indeholder 100 pmol DNA-fragment og 2 enheder T4 polynucleotidkinase. Efter 15 DK 173590 B1 19 minutter ved 37°C tilsættes 1 μΐ 10 mM ATP, og reaktionen lades forløbe i yderligere 15 minutter. Blandingen opvarmes derefter ved 70°C i 15 minutter sammen med 100 pmol 5'-0H-fragment 1 og 10 pmol af det 34 bp lange Sau 3a - Ava II-5 fragment. Ligationen udføres i 5 timer ved 4°C i 50 μΐ af 20 mM Tris-HCl (pH-værdi 7,5) 10 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol, 0,5 mM ATP og 10 enheder T4 DNA-ligase. Blandingen elektro-foreseres på en 6%'s polyacrylamidgel, og det 45 bp lange produkt udvindes ved elektroeluering. Der udvindes 860.000 10 Cerenkov cpm (ca. 30 ng, 1 pmol) sammen med 0,5 pg (5 pmol) af det 150 bp lange Ava II - Bgl Il-fragment og 1 pg {2 pmol) af det 670 bp lange Bgl II - Pst I-fragment. Ligationen udføres ved 20°C i 16 timer med 20 enheder T4 DNA-ligase. Ligasen inaktiveres ved opvarmning til 65°C i 10 minutter. Blandingen 15 digereres derefter med EcoRI og Pst I for at eliminere polymerer af genet. Blandingen renses ved 6%'s polyacrylamidgel-elektroforese. Der isoleres 36.000 cpm (ca. 0,04 pmol, 20 ng) af det 865 bp lange produkt. Halvdelen (10 ng) af dette liga-teres ind i pBR322 (0,3 pg) mellem EcoRI og Pst I-stederne.

20 Ved transformation af E. coli 294 fås 70 tetracyclinresisten-te, ampicillinfølsomme transformanter. Plasmid DNA, der isoleres fra 18 af disse transformanter, digereres med EcoRI og Pst I. 16 af de 18 plasmider har et 865 bp langt EcoRI -Pst I-fragment. Ét pg af et af disse, pLeIF Al, digeréres med 25 EcoRI og ligateres til et 300 bp langt EcoRI-fragment (0,1 pg), der indeholder E. coli’s trp promotor og trp leder-ribosombindingssted, der fremstilles som ovenfor beskrevet. Transformanter, der indeholder trp promotoren, identificeres 32 ved hjælp af en P-trp prøve sammen med Grunstein-Hogness 30 koloniscreeningsmetoden (Grunstein et al. [Proc. Natl. Acad.

Sci. (USA) 72, 3961 (1975)]. Et asymmetrisk placeret Xba I-sted i trp fragmentet muliggør bestemmelse af rekombinanter, DK 173590 B1 20 i hvilke trp promotoren er orienteret i retning af LeIF A-genet.

Ekstrakter til IF-analyse fremstilles som følger. Én ml*s 5 kulturer dyrkes i L-bouillon, der indeholder 5 ug pr. ml tetracyclin, til en A^q på omkring 1,0, hvorefter de fortyndes med 25 ml M9-medier, der indeholder 5 ug pr. ml tetracyclin. 10 ml’s prøver høstes ved centrifugering, når A^q har nået 1,0, og cellepellets suspenderes i 1 ml 15%'s sac-10 charose, 50 mM Tris-HCl (pH-værdi 8,0) og 50 mM EDTA. 1 mg lysozym tilsættes, og efter 5 minutter ved 0°C ødelægges celler ved lydbehandling. Prøverne centrifugeres i 10 minutter ved 15.000 rpm i en Sorvall SM-24 rotor. Interferonaktivitet i supernatanterne bestemmes ved sammenligning med 15 standarderne for LeIF ved en analyse, der viser hæmningen af den cytopatiske effekt (CPE). For at bestemme antallet af IF-molekyler pr. celle anvendes en LeIF-specifik virkning på 4 x 108 enheder pr. mg [Rubinstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76, 640 (1979)].

20

Klon pLeIF A trp 25, i hvilken trp promotoren indsættes i den ønskede orientering, giver høje virkningsniveauer (så høje som 2,5 x 108 enheder pr. liter). Det interferon, der fremstilles af E. coli K-12 stamme 294/pLeIF A trp 25 opfører sig 25 som ægte humant LeIF; det er stabilt over for behandling ved pH-værdi 2, og det neutraliseres af antihumane leukocytan-tistoffer fra kaniner. Interferonet har en tilsyneladende molekylvægt på ca. 20.000.

30 Isolation af cDNA'er til yderligere leukocytinterferoner DNA fra det fuldtud karakteriserede LeIF A cDNA-holdige plasmid skæres ud med Pst I, isoleres elektroforetisk og DK 173590 B1 21 mærkes på kendt måde [Taylor et al., Biochem. Biophys. Acta.

442, 324 (1976]) med 32P. Det resulterende radioaktivt mærkede DNA bruges som en prøve til at screene yderligere E. coli 294 transformanter ved en in situ koloniscreeningsmetode.

5 Grunstein et al., supra. Der isoleres kolonier, som hybridi-serer i varierende mængde til prøven. Plasmid DNA fra disse kolonier og de ti hybridiserende kolonier, der er nævnt ovenfor, isoleres ved Pst-klipning og karakteriseres ved hjælp af tre forskellige metoder. For det første karakteri-10 seres disse Pst-fragmenter ved deres mønstre for restrik-tionsendonucleasedigestion med enzymerne Bgl II, Pvu II og EcoRI. Denne analyse muliggør klassificeringen af mindst otte forskellige typer (LeIF A, LeIF B, LeIF C, LeIF D, LeIF E,

LeIF F, LeIF G og LeIF H), hvilket nærmer sig placeringen af 15 forskellige restriktionsklip i forhold til LeIF's nu kendte præsekvens og kodende sekvens. En af disse, LeIF D, formodes at være identisk med den, der beskrives af Nagata et al.,

Nature 284, 316 (1980).

20 For det andet testes visse af DNA'erne ved en publiceret hybridiseringsudvælgelsesanalyse, Cleveland et al., Cell 20, 95 (1980), for evnen til selektivt at fjerne LeIF mRNA fra poly-A-holdigt KG-1 celle-RNA. LeIF A, B, C og F er positive ved denne analyse. For det tredje indsættes de nævnte Pst-25 fragmenter i et udtryksplasmid, E. coli 294 transformeres med plasmidet, og fragmenterne udtrykkes. Udtrykkelsesprodukter-ne, der formodes at være præinterferoner, er alle positive ved CPE-analyse for interferonaktivitet, omend LeIF F-frag-mentet kun er marginalt aktivt. Derudover sekventeres alle de 30 beskrevne LeIF-typer.

DK 173590 B1 22

Det andet modne leukocytinterferon

Sekvensen af det isolerede fragment, der omfatter genet for modent LeIF B, viser, at de første fjorten nucleotider af 5 typerne A og B er identiske. Vi foreslår derfor at isolere et fragment fra pLeIF A25, der bærer trp promotor-operatoren, ribosombindingsstedet og starten af LeIF (A=B)-genet, og kombinere dette med den resterende del af B-sekvensen i et udtryksplasmid.

10

For at få det ca. 950 bp lange Sau 3a til Pst I-fragment fra den sekvens, der er vist i fig. 7a, er flere trin nødvendige på grund af ét eller flere mellemliggende Sau 3a-restrik-tionssteders tilstedeværelse, dvs.

15 1. De følgende fragmenter isoleres a) 110 bp fra Sau 3a til EcoRI; b) 132 bp fra EcoRI til Xba; 20 c) >700 bp fra Xba til Pst.

2. Fragmenterne la og Ib ligateres og klippes med Xba og Bgl II for at udelukke selv-polymerisering gennem Sau 3a-og Xba-endeterminalerne (det relevante Sau 3a-sted 25 ligger inden i et Bgl Il-sted; Bgl II klipper, hvorved der efterlades en Sau 3a-hæfte-ende). Der isoleres et 242 bp langt fragment.

3. Produktet af 2 og lc ligateres og klippes med Pst I og 30 Bgl II, igen for at forhindre selv-polymerisering. Der isoleres et ca. 950 bp langt fragment, Sau 3a til Pst I på fig. 7a. Dette fragment omfatter den del af LeIF B-genet, der ikke findes i LeIF A.

DK 173590 B1 23 4. Et ca. 300 bp langt fragment (Hind III til Sau 3a), der omfatter LeIF A's trp promotor-operator, ribosombindingssted, ATG-startsignal og cysteinkodon, isoleres fra pLeIF A25.

5 5. Et ca. 3600 bp langt fragment (Pst I til Hind III) isoleres fra pBr 322. Dette omfatter replikonet og indkoder tetracyclinresistens, men ikke ampicillinresistens.

10 6. De i trin 3, 4 og 5 vundne fragmenter tripelligateres, og det resulterende plasmid transformeres ind i E. coli K-12 stamme 294.

Transformanterne miniscreenes (Birnboim et al., Nucleic Acid 15 Research 7, 1513 (1979)), og plasmidprøver digereres med

EcoRI. Digereringerne giver tre fragmenter, der er karakteri-ske for 1) EcoRI-EcoRI trp promotorfragmentet; 20 2) det indre EcoRI til EcoRI-fragmentet af pL4; og 3) proteinoversættelsesstartsignalet til EcoRI-fragment- et af pL4.

Ved CPE-analysen viser bakterielle ekstrakter fra kloner, der 25 er fremstillet på den ovennævnte måde, typisk ca. 10 x 106 enheder interferonaktivitet pr. liter ved A^q=1. Én repræsentativ klon, der er fremstillet på denne måde, er 294/pLeIF B trp 7.

30 Flere modne leukocytinterferoner

Yderligere genfragmenter i fuld længde, som omfatter andre LeIF-typer, kan skræddersyes og placeres i udtryksbærere til DK 173590 B1 24 udtrykkelse, som det er tilfældet med LeIF A. Fuldstændig sekventering på kendt måde afslører, om et restriktionssted ligger tilstrækkelig nær den første aminosyrekodon for den modne interferontype til at muliggøre bekvem anvendelse af 5 den fremgangsmåde, der går ud på eliminering af præsekvensen ved restriktionsklipning og erstatning af kodoner for de N-terminale aminosyrer, der går tabt ved præsekvens-eliminering ved ligationen af et syntetisk DNA-fragment som ovenfor beskrevet. Hvis dette ikke kan lade sig gøre, kan den frem-10 gangsmåde, der er beskrevet i Kleid et al., supra, tages i brug. Kort fortalt omfatter dette spaltning af det præse-kvensholdige fragment lige før det punkt, på hvilket kodonen for den første aminosyre i det modne polypeptid begynder, ved 15 1. omdannelse af det dobbeltstrengede DNA til enkeltstrenget DNA i et område, der omslutter dette punkt; 2. hybridisering til det enkeltstrengede område, der er dannet i trin 1), af en komplementær primerlængde af 20 enkeltstrenget DNA, idet 5'-enden på primeren ligger over for nucleotidet ved siden af det påtænkte spaltningssted; 3. gendannelse af den del af den anden streng, der elimineres i trin 1, og som ligger i 3'-retningen fra primeren, 25 ved reaktion med DNA-polymerase i nærværelse af adenin, thymin, guanin og cytosin-holdige deoxynucleotidtriphos-phater; og 4. digerering af den resterende enkeltstrengede længde af 30 DNA, der rager ud over det påtænkte spaltningspunkt.

En kort længde af syntetisk DNA, der ved 3'-enden på den kodende streng slutter med oversættelsesstartsignalet ATG, kan derefter ligateres ved fx stumpende-ligation til det DK 173590 B1 25 resulterende skræddersyede gen for de modne interferoner, og genet kan indsættes i et udtryksplasmid og bringes under kontrol af en promotor og det dermed forbundne ribosombindingssted.

5 På tilsvarende måde som ovenfor beskrevet dannes de genfragmenter, der indkoder LeIF C og LeIF D, på hensigtsmæssig måde til direkte bakteriel udtrykkelse. Udtrykkelsesstrategien for disse yderligere leukocytinterferoner omfatter i hvert til-10 fælde, at man anvender det ca. 300 bp lange fragment {Hind III til Sau 3a) fra pLeIF A25, hvilket fragment omfatter LeIF A’s trp promotor-operator, ribosombindingssted, ATG startsignal og cysteinkodon. Til dette kombineres genfragmenter fra de yderligere interferongener, der indkoder deres respektive 15 aminosyresekvenser ud over det indledende cystein, der er fælles for dem alle. Hvert resulterende plasmid anvendes til at transformere E. coli K-12 stamme 294. Der foretages følgende ligationer til dannelse af de respektive gener.

20 LeIF C

Isoler de følgende fragmenter fra pLeIF C

a) 35 bp fra Sau 3a til Sau 96.

25 b) >900 bp fra Sau 96 til Pst I.

c) Isoler et ca. 300 bp langt fragment (Hind III til Sau 3a) fra pLeIF A-25 som i del N (4) ovenfor.

d) Isoler det ca. 3600 bp lange fragment af del N (5) ovenfor.

30

Konstruktion 1) Ligater a) og c). Spalt med Bgl II, Hind III og isoler det ca. 335 bp lange produkt.

DK 173590 B1 26 2) Tripelligater 1) + b) + d) og transformer E. coli med det resulterende plasmid.

5 En repræsentativ klon, der er fremstillet på denne måde, er E. coli K-12 stamme 294/pLeIF C trp 35.

LeIF D

10 Isoler fra pLeIF D

a) 35 bp fra Sau 3a til Ava II.

b) 150 bp fra Ava II til Bgl II.

c) Ca. 700 bp fra Bgl II til Pst I.

15

Isoler fra pLeIF A25 d) 300 bp fra Hind III til Sau 3a.

20 Isoler fra pBr 322 e) Ca. 3600 bp fra Hind III til Pst I.

Konstruktion 25 1) Ligater a) + b), klip med Bgl II og rens et 185 bp langt produkt (1).

2) Ligater 1) + d), klip med Hind III, Bgl II og rens det 30 ca. 500 bp lange produkt (2).

3) Ligater 2) + c) + e) og transformer E. coli med det resulterende plasmid.

DK 173590 B1 27

En repræsentativ klon, der er fremstillet på denne måde, er E. coli K-12 stamme 294/pLeIF D trp 11.

LeIF F

5

Det LeIF F-holdige fragment kan skræddersyes til direkte udtrykkelse gennem gensamling, der er hensigtsmæssig på grund af den fuldstændige homologi af LeIF B's og LeIF F's aminosyrer 1 til 13. Et trp promotorholdigt fragment (a) med ender 10 af passende form fås fra pHGH 207, der er beskrevet ovenfor, via Pst I- og Xba I-digestion efterfulgt af isolation af det ca. 1050 bp lange fragment. Der fås et andet fragment (b) som det største fragment, der stammer fra Pst I- og Bgl Il-digestion af plasmidet pHKY 10, der er et derivat af pBR322, og 15 som indeholder et Bgl Il-sted mellem tetracyclinresistens-promotoren og strukturgenet. Fragment (a) indeholder ca. halvdelen af genet, der indkoder ampicillinresistens; fragment (b) indeholder resten af dette gen og hele genet for tetracyclinresisténs undtagen den dermed forbundne promotor.

20 Fragmenterne (a) og (b) kombineres via T4-ligase, og produktet behandles med Xba I og Bgl II for at eliminere dimerise-ring, hvorved der dannes et fragment (c), der omfatter trp promotor-operatoren og gener for tetracyclin- og ampicillinresistens .

25

Et fragment (d) på ca. 580 bp fås ved Ava II- og Bgl Ildigestion af pLeIF F. Dette omfatter kodoner for LeIF F's aminosyrer 14 til 166.

30 Et fragment (e) (49 bp) fås ved Xba I- og Ava II-digestion af pLeIF B. Fragment (e) indkoder LeIF F's aminosyre 1 til 13.

Fragmenterne (c), (d) og (e) tripelligateres i nærværelse af T4-ligase. De respektive fragmenters hæfte-ender er af en DK 173590 B1 28 sådan art, at det sammensatte plasmid ringslutter korrekt, således at det bringer tetracyclinresistensgenet under kontrol af trp promotor-operatoren sammen med genet for modent LeIF F, således at bakterier, der er transformeret med det 5 ønskede plasmid, kan udvælges på tetracyclinholdige plader.

En repræsentativ klon, der er fremstillet på denne måde, er E. coli K-12 stamme 294/pLeIF F trp 1.

LeIF H

10

Det komplette LeIF H gen kan dannes til udtrykkelse som et modent leukocytinterferon som følger 1. Plasmidet pLeIF H underkastes Hae II- og Rsa I-digestion 15 med isolation af det 816 bp lange fragment, der strækker sig fra signalpeptidets aminosyre 10 til det 3’ ikke-kodende område.

2. Fragmentet denatureres og underkastes reparationssyntese 20 med Klenow fragment, Klenow et al., Proc. Hati. Acad.

Sci. USA 65, 168 (1970), idet man anvender den syntetiske deoxyribooligonucleotidprimer 5'-dATG TGT ATT CTG TOT.

Denne almene fremgangsmåde beskrives også af Goeddel et al i EP-A2-48970.

25 3. Det resulterende produkt spaltes med Sau 3a, og der isoleres et 452 bp langt fragment, der repræsenterer aminosyre 1 til 150.

30 4. Ved Sau 3a- og Pst I-digestion af pLeIF H og isolation af det resulterende 500 bp lange fragment fås et gen, der indkoder aminosyrer 150 og hen til slutningen af den kodende sekvens.

DK 173590 B1 29 5. Fragmenter, der er isoleret i trin 3 og 4, ligateres til dannelse af et fragment 1 166 roet cys asp stop

ATG TGT---1- . . . GAT TGA .... Pst I

Sati 3a 5 der indkoder LeIF H*s 166 aminosyrer.

6. pLeIF A trp 25 digereres med Xba I, der dannes stumpe ender med DNA-polymerase I, og produktet digereres med Pst I. Det store resulterende fragment kan isoleres og 10 ligateres med produktet fra trin 5 til dannelse af et udtryksplasmid, der efter transformation af E. coli K-12 stamme 294 eller andre værtsbakterier er i stand til at udtrykke modent LeIF H.

15 LeIF I

Phagen λ Charon 4A's rekombinantbibliotek over det humane genom, hvilket er konstrueret af Lawn et al.. Cell Γ5, 1157 (1978), screenes for leukocytinterferongener på den af Lawn 20 et al., supra, og Maniatis et al., Cell 15, 687 (1978) beskrevne måde. En radioaktiv LeIF-prøve, der fås fra cDNA-klonen LeIF A (Goeddel et al., Nature 287, 411 (1980), anvendes til at screene ca. 500.000 plaques. Der fås 6 LelF-genomkloner ved denne screening. Ved efterfølgende genscree-25 ning og plaquerensning udvælges en af disse kloner AHLeIF2 til videre analyse.

Ved den ovenfor beskrevne metode kan andre prøver med fordel anvendes til at isolere yderligere LeIF-kloner fra det humane DK 173590 B1 30 genom. Disse kan derefter anvendes til at frembringe yderligere leukocytinterferonproteiner i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse.

5 1. Det 2000 bp lange EcoRI-fragment af den genome klon (AHLeIF2) subklones ind i pBR325 på EcoRI-stedet. Det resulterende plasmid LeIF I spaltes med EcoRI, og det 2000 bp lange fragment isoleres. Deoxyoligonucleotidet dAATTCTGCAG (en EcoRI til Pst I konverter) ligateres til 10 det 2000 bp lange EcoRI-fragment, og det resulterende produkt spaltes med Pst I, hvorved fås et 2000 bp langt fragment, der indeholder Pst I-ender. Dette spaltes med Sau 96, og der isoleres et 1100 bp langt fragment, som har én Pst I-ende og én Sau 96-ende.

15 2. Plasmidet pLeIF C trp 35 digereres med Pst I og Xba I.

Det store fragment isoleres.

3. Det lille Xba I- til Pst I-fragment fra pLeIF C trp 35 20 digereres med Xba I og Sau 96. Der isoleres et 40 bp langt Xba I- til Sau 96-fragment.

4. De i trin 1, 2 og 3 isolerede fragmenter ligateres til dannelse af udtryksplasmidet pLeIF I trp 1.

25

LeIF J

1. Plasmidet pLeIF J indeholder et 3,8 kb langt Hind III-fragment af humant genomt DNA, der indeholder LeIF J's 30 gensekvens. Der isoleres et 760 bp langt Dde I- til Rsa I-fragment fra dette plasmid.

DK 173590 B1 31 2. Plasmidet pLeIF B trp 7 spaltes med Hind III og Dde I, og der isoleres et 340 bp langt Hind III- til Dde I-frag-ment.

5 3. Plasmidet pBR322 spaltes med Pst I, og der dannes stumpe ender ved inkubation med DNA-polymerase I (Klenow fragment) , hvorefter plasmidet digereres med Hind III. Det store (ca, 3600 bp lange) fragment isoleres.

10 4. De i trin 1, 2 og 3 isolerede fragmenter ligateres til dannelse af udtryksplasmidet pLeIF J trp 1.

De fremgangsmåder og materialer, der anvendes i de følgende konstruktioner, er som beskrevet ovenfor. Tabel I nedenfor 15 anfører detaljer for specielle konstruktioner af hybride LeIF-plasmider.

TABEL 1 20 Totale Udtryks- Forende

LeIF amino plasmid Amino- hybrid syrer* (vektor) Fragment syrer 1 AD 165 a Xba I-Pvu II af pLelf A 1-91 25 trp 25 (285 bp) 2 DA 166 a Xba I-Pvu II af pLeIF D 1-92 trp 11 (288 bp) 30 3 AD 165 - Bgl II-Pst I stort 1-62 fragment af pLeIF A trp 25 DK 173590 B1 32 4 DA 166 - Bgl II-Pst I stort 1-63

fragment af pLeIF D trp II

5 5 AB 165 a Xba I-Pvu II af pLeIF 1-91 A trp 25 (285 bp) 6 AF 165 a Xba I-Pvu II af pLeIF 1-91 A trp 25 (285 bp) 10 7 AG 165 a Xba I-Pvu II af pLeIF 1-91 A trp 25 (285 bp) 8 AI 165 a Xba Ι-Bgl II delvis 1-150 15 af pLeIF A trp 25 (ca. 455 bp) 9 BA 166 b Hind III-Pvu II af 1-92 pLeIF B trp 7 20 (ca. 630 bp) TABEL 1 fortsat 10 BD 166 b Hind III-Pvu II af 1-92 25 pLeIF B trp 7 (ca. 630 bp) 11 BF 166 b Hind III-Pvu II af 1-92 pLeIF B trp 7 30 (ca. 630 bp) 12 BG 166 b Hind III-Pvu II af 1-92 pLeIF B trp 7 (ca. 630 bp) DK 173590 B1 33 13 DB 166 a Xba I-Pvu II af 1-92 pLeIF D trp 11 (288 bp) 5 14 DF 166 a Xba I-Pvu II af pLeIF 1-92 D trp 11 (288 bp) 15 DG 166 a Xba I-Pvu II af pLeIF 1-92 D trp 11 (288 bp) 10 16 FA 166 a Xba I-Pvu II af pLeIF 1-92 ' F trp 1 (288 bp) 17 FB 166 a Xba I-Pvu II af pLeIF 1-92 15 F trp 1 (288 bp) 18 FD 166 a Xba I-Pvu II af pLeIF 1-92 F trp 1 (288 bp) 20 19 FG 166 a Xba I-Pvu II af pLeIF 1-92 F trp 1 (288 bp) 20 IA 166 a Xba I-Bgl II af pLeIF 1-151 I trp 1 (ca. 458 bp) 25 - DK 173590 B1 34

Bagende

Amino Resulterende

Fragment syrer udtryksplasmid

5 1 Pvu II-Pst I af pLeIF D 93-166 pLeIF AD

trp 11 (ca. 550 bp) trp (Pvu II)

2 Pvu II-Pst I af pLeIF A 92-165 pLeIF DA

trp 25 (ca. 550 bp) trp (Pvu II) 10

3 Bgl II-Pst I af pLeIF D 64-166 pLeIF AD

trp 11 (ca. 600 bp) trp (Bgl II)

4 Bgl II delvis-Pst I af 63-165 pLeIF DA

15 pLeIF A trp 25 (ca. 700 bp) trp (Bgl II)

5 Pvu II delvis-Pst I af 93-166 pLeIF AB

pLelFB trp 7 (ca. 750 bp) trp (Pvu II)

20 6 Pvu II-Pst I af pLeIF F 93-166 pLeIF AF

trp 1 (ca. 700 bp) trp (Pvu II)

7 Pvu II-Pst I af pLeIF G 93-166 pLeIF AG

(ca. 750 bp) trp (Pvu II) 25

8 Bgl II-Pst I af LeIF I 151-165 pLeIF AI

trp 1 (ca. 650 bp) trp (Bgl II)

9 Pvu II-Pst I af pLeIF A 92-165 pLeIF BA

30 trp 25 (ca. 550 bp) trp (Pvu II)

10 Pvu II-Pst I af pLeIF D 93-166 pLeIF BD

trp 11 (ca. 550 bp) trp (Pvu II) DK 173590 B1 35

11 Pvu II-Pst I af pLeIF F 93-166 pLeIF BF

trp 1 (ca. 700 bp) trp (Pvu II)

12 Pvu II-Pst I af pLeIF G 93-166 pLeIF BG

5 (ca. 750 bp) trp (Pvu II)

13 Pvu II delvis-Pst I af 93-166 pLeIF DB

pLeIF B trp 7 (ca. 750 bp) trp (Pvu II)

10 14 Pvu II-Pst I af pLeIF F 93-166 pLeIF DF

trp 1 (ca. 700 bp) trp (Pvu II)

15 Pvu II-Pst I af pLeIF G 93-166 pLeIF DG

(ca. 750 bp) trp (Pvu II) 15

16 Pvu II-Pst I af pLeIF A 92-165 pLeIF FA

trp 25 (ca. 550 bp) trp (Pvu II)

17 Pvu II delvis-Pst I af 93-166 pLeIF FB

20 pLeIF B trp 7 (ca. 750 bp) trp (Pvu II)

18 Pvu II-Pst I fra pLeIF D 93-166 pLeIF FD

trp 11 (ca. 550 bp) trp (Pvu II)

25 19 Pvu II-Pst I fra pLeIF G 93-166 pLeIF FG

(ca. 750 bp) trp (Pvu II)

20 Bgl II-Pst I af pLeIF A 152-166 pLeIF IA

trp 25 (ca. 430 bp) trp (Bgl II) 30__ * undtagen N-terminalt methionin a stort (ca. 3900 bp langt) fragment af Xba I- til

Pst I-digerering af pLeIF A trp 25 DK 173590 B1 36 b stort (ca. 3600 bp langt) fragment af Hind III- til

Pst I-digerering af pBR322.

Hvad angår tabel I, fremstilles de første fire beskrevne 5 hybride LeIF'er af to LeIF udtryksplasmider. Et Bgl Il-sted, der er fælles for LeIF A og D cDNA'er, anvendes til at konstruere et udtryksplasmid pLeIF trp AD (Bgl II), der koder for de 63 aminoterminale aminosyrer i LeIF A og de 102 car-boxyterminale aminosyrer i LeIF D. Det samme sted benyttes 10 til konstruktion af et udtryksplasmid pLeIF trp DA (Bgl II), der koder for de 64 aminoterminale aminosyrer i LeIF D og 102 carboxyterminale aminosyrer i LeIF A. Pvu Il-stedet anvendes til konstruktion af to andre hybride interferon-udtryksplas-mider: 91 aminoterminale aminosyrer i A med 74 carboxytermi-15 nåle aminosyrer i D (pLeIF trp AD (Pvu II)), og 92 aminoterminale aminosyrer i LeIF D med 74 carboxyterminale aminosyrer i LeIF A (pLeIF trp DA (Pvu II)). Kort sagt gælder det for pLeIF AD trp (Pvu II) 20 at det store (ca. 3900 bp lange) fragment af en Xba I- og Pst I-digerering af pLeIF A trp 25 ligateres med et 285 bp langt

Xba Ι-Pvu Il-fragment af pLeIF A trp 25 og et ca. 550 bp langt Pvu II-Pst I-fragment af pLeIF D trp 11; 25 pLeIF DA trp (Pvu II) at det store (ca. 3900 bp lange) fragment af en Xba I- og Pst I-digerering af pLeIF A trp 25 ligateres med et 288 bp langt

Xba I-Pvu Il-fragment af pLeIF D trp 11 og et ca. 550 bp langt Pvu II-Pst I-fragment af pLeIF A trp 25; 30 pLeIF AD trp (Bgl II) at det store fragment fra en Bgl II- og Pst I-digerering af pLeIF A trp 25 ligateres med et ca. 600 bp langt Bgl II-Pst I-fragment fra pLeIF D trp 11; og DK 173590 B1 37 pLelF DA trp (Bql II) at det store fragment fra en Bgl II- og Pst I-digerering af pLeIF D trp 11 ligateres til et ca. 700 bp langt fragment, der fås ved Pst I-spaltning af pLeIF A trp 25 efterfulgt af 5 delvis Bgl Il-digestion.

I det femte beskrevne hybrid pLeIF AB trp (Pvu II) 10 det store (ca. 3900 bp lange) fragment af en Xba I- og Pst I-digerering af pLeIF A trp 25 ligateres med et 285 bp langt Xba Ι-Pvu Il-fragment af pLeIF A trp 25 og et ca. 750 bp langt Pvu II (delvis)-Pst I-fragment af pLeIF B trp 7.

15 De øvrige konstruktioner, der vises i tabel I, defineres på lignende måde. Som et yderligere eksempel kan anføres, at til konstruktion af et hybrid, der indeholder en LeIF C- og/eller LeIF H-del, kan man drage nytte af falles Bbv I-steder, der findes omtrent ved gensekvensernes nucleotid 294 (dvs.

20 GCTGC).

På lignende måde kan der dannes plasmider, der egner sig til mikrobiel udtrykkelse af andre hidtil ukendte hybride leuko-cytinterferoner, ved hensigtsmæssig manipulation af dobbelt-25 strenget DNA, der indkoder alle eller dele af naturligt forekommende leukocytinterferoners aminosyresekvenser. Således udvælges et første dobbeltstrenget DNA-fragment, der indkoder aminoterminalen af et første, naturligt forekommende leuko-cytinterferons aminosyresekvens og, idet man fortsætter der-30 fra i 3'-retningen, en væsentlig del af aminosyresekvensen deraf. Fragmentet omfatter ved siden af et restriktionsendo-nucleasespaltningssted anbragte kodoner for aminosyre "n" af det første leukocytinterferon, idet n aminosyrer udgør en væsentlig del af det første interferons aminosyresekvens. Ved DK 173590 B1 38 spaltning med restriktionsendonuclease fås et fragment, der omfatter det første interferons aminoterrninal og kodoner for ca. n aminosyrer. Der udvælges et andet fragment, der omfatter alle eller en del af kodonerne for et andet, forskelligt 5 leukocytinterferons aminosyresekvens, hvilket fragment omfatter et spaltningssted for ved siden af et identisk restrikti-onsendonucleasested anbragte kodoner for denne aminosyre i det andet interferon, hvis aminosyreantal (hvis man fortsætter fra det andet interferons aminoterrninal) er ca. 166-n.

10 Ved spaltning af det andet fragment med denne restriktionsendonuclease fås et produkt, der er komplementært til den "n"-terminale del af digestionsproduktet fra det første fragment, således at det andet digestionsprodukt kan ligate-res til det første, hvorved restriktionsendonuclease-genken-15 delsesstedet gendannes, og kodonen for det første interferons aminosyre n rekonstrueres, hvor denne er gået tabt ved den indledende digestion. Produktet fra restriktionsendonuclease-digestionen af det andet fragment fortsætter fortrinsvis fra den ende, der er resultatet af spaltningen i 3'-retningen, 20 til de nucleotider, der indkoder det andet leukocytinter-ferons carboxyterminal.

Alternativt kan der dannes hybrider, der indeholder væsentlige dele af aminosyresekvenser fra flere end to naturligt 25 forekommende leukocytinterferoner, i hvilke tilfælde fx det andet ovenfor nævnte fragment yderligere udvælges til at indeholde et andet restriktionsendonucleasested nedenfor det første, idet det andet sted er identisk med et på tilsvarende måde anbragt sted inden i et fragment, der indkoder et tredje 30 leukocytinterferons carboxyterminale del, etc. I det nævnte eksempel kan produkterne af på hinanden følgende restrikti-onsendonuclease-operationer tripelligateres til dannelse af et hybridt gen, der indkoder et første interferons aminoter-minale del, aminosyresekvensen i midten af det andet og det DK 173590 B1 39 tredjes carboxyterminale del (eller i en anden variation af den første, hvor det første og tredje interferon er ens).

Det første ovennævnte fragment stammer fortrinsvis fra et 5 udtryksplasmid, dvs. et plasmid, i hvilket kodonerne for det første leukocytinterferons aminoterminale del kommer efter en ATG eller en anden oversættelsesindledningskodon og et promotor- eller promotor-operatorsystem. Heraf følger, at slutproduktet af de foretagne manipulationer, der er beskrevet oven-10 for, vil være et plasmid, der er i stand til at udtrykke det polypeptid, der indkodes af det hybride gen, i bakterier eller andre mikrobielle organismer, der er transformeret med plasmidet. Andre måder til dannelse af det hybride gen for mikrobiel udtrykkelse vil være indlysende for fagfolk.

15 I foretrukne udførelsesformer for opfindelsen indkoder de hybride gener en hidtil ukendt leukocytinterferon-aminosyre-sekvens på ca. 165 til 166 aminosyrer, der udgør et konjugat af væsentlige amiriosyresekvenser, der stammer fra to eller 20 flere forskellige leukocytinterferoner udvalgt blandt gruppen bestående af LeIF A, LeIF B, LeIF C, LeIF D, LeIF E, LeIF F,

LeIF G og LeIF H som vist i fig. 3. Mest foretrukket omfatter de hidtil ukendte leukocytinterferoner, der indkodes af de hybride gener, de aminosyrer, der er bestemt og anbragt som 25 vist i sekvensen "alle" i fig. 3. Udtrykkelsesprodukterne fra plasmider, der er dannet i overensstemmelse med opfindelsen, kan testes for antiviral virkning på kendt måde som i de nedennævnte bestemmelser for biologisk virkning.

30 Påvisning af antiviral virkning E. coli K-12 stamme 294 transformeres på kendt måde med henholdsvis plasmiderne pLeIF trp A 25, pLeIF trp D, pLeIF trp A/D (Bgl II) og pLeIF trp D/A (Bgl II). Transformanterne DK 173590 B1 40 dyrkes separat i 5 ml's kulturer i L-bouillon, der indeholder 5 pg/ml tetracyclin, til en A^q på ca. 1,0, hvorefter de fortyndes rued 1 liter M9-nvedier, der indeholder 5 pg/ml tetracyclin. Cellerne høstes, når A55Q når 1,0, og cellepel- 5 lets suspenderes i 10 ml 15%'s saccharose, 50 mM tris-HCl (pH-værdi 8,0) og 50 mM EDTA. Der tilsættes 10 mg lysozym, og efter 5 minutter ved 0°C ødelægges cellerne med lydbehandling. Prøverne centrifugeres i 10 minutter ved 15000 rpm i en Sorvall SM-24 rotor. Interferonaktivitet i supernatanterne 10 underkastes testning for antiviral virkning.

Udbytterne pr. liter kultur af disse interferoner, der er titreret på en human cellelinje (WISH), er vist i tabel II, hvoraf det fremgår, at LeIF A/D-virkningen frembringes i 15 større mængder, end det er tilfældet med de øvrige interferoner. Denne forskel kan skyldes større egentlig virkning hos LeIF A/D eller større udbytte udtrykt i mg protein af dette interferon. Da den genetiske sammensætning er identisk for alle disse interferoner, forekommer det sandsynligt, at 20 LeIF A/D i det væsentlige har større virkning end de øvrige interferoner.

DK 173590 B1 41

TABEL II

Udbytte af leukocytinterferoner fra rystekolbekulturer af E. coli 5 _ _

Virkningsudbytte/1 Type interferon (enheder på WISH)* A 8 x 107 10 D 5 X 106 AD (Bgl II) 2 x 108 DA (Bgl II) 1 x 106 15 * målt ved inhibering af den cytopatiske indvirkning på WISH-celler inficeret med VSV.

De forskellige interferoners virkningsgrad i en række cellelinjer fra pattedyr bestemmes (human, WISH; grøn marekat, 20 VERO; hamster- fibroblast, BHK; kaninnyreceller, RK-13; mus, L-929; og kvægnyre, MDBK-celler). For at sammenligne interferonernes relative virkning beregnes deres virkning på forskellige celler i forhold til deres virkning på WISH-celler, der har fået værdien 100. Resultaterne i tabel III viser, at 25 LeIF A/D har en meget høj virkning i VERO og L-929- celler, hvorimod LeIF D/A har en lav virkning i disse cellelinjer.

Disse resultater tyder på, at kombinationen af LeIF A's N-terminale del og LeIF D's C-terminale del i et molekyle (LeIF A/D) meddeler det hybride protein en særlig stor virknings-30 grad, som er tydelig i adskillige pattedyrarter. Ydermere er disse egenskaber ikke blot en sammenlægning af stam-interfe-ronernes egenskaber. Dette fremgår tydeligt af virkningen på L-929-celler (tabel III), hvor hverken en blanding eller LeIF

DK 173590 B1 42 A og LeIF D eller det andet hybrid, LeIF D/A, har nogen væsentlig virkning.

TABEL III. Titrering af forskellige leukocytinterferoner i 5 cellelinjer fra forskellige pattedyrarter

Leukocytinterferoner*

Celle- "Buffy- 10 linje A D A/D D/A A+D coat" WISH 100 100 100 100 100 100 VERO 250 75 1.670 20 200 200 BHK 400 200 833 2.000 400 20 15 RK-13 12 500 6 N.D. N.D. 120 L-929 150 5 3.300 2 10 0,1 * Interferoner testet mod VSV-infektion af de forskellige 20 cellelinjer. Virkning udtrykt som procentdel af den i WISH-celler iagttagne virkning.

LeIF A/D's virkning mod andre vira undersøges også. Dataene i fig. 5 viser den antivirale virkning mod EMC-virusinfektion 25 af L-celler, og dataene i fig. 6 viser virkningen mod VSV-infektion af L-celler. Af disse data fremgår det, at den større virkning af LeIF A/D ikke er begrænset til ét virus (VSV), og dets større virkning er sandsynligvis en generel egenskab mod mange vira. Naturlige humane "buffy-coat” inter-30 feronpræparater har ingen virkning mod museceller (se tabel II). LeIF A/D's virkning mod EMC-virusinfektion af CD-l-mus undersøges derfor. Af fig. 7 fremgår det, at LeIF A/D er særdeles virksomt med dræbende EMC-virusinfektion, og LeIF A

DK 173590 B1 43 har også en antiviral virkning, hvilket kan forventes fra virkningen i cellelinjer (tabel II). Dataene i fig. 7 stammer fra intraperitoneale behandlinger 3 timer før infektion. Doseringer af LeIF A/D og LeIF A er som titreret på WISH.

5 Dødelig EMC-virusinfektion af hamstere påvirkes også af LeIF A/D og LeIF A (fig. 8), idet det førstnævnte er mest virksomt, og "buffy-coat”-interferon har kun en lille og statistisk ubetydelig virkning. Hvad angår fig. 8, indgives alle 10 interferoner intraperitonealt 3 timer før infektion i en dosis på 5 x 105 pg/kg, titreret på WISH-celler.

Disse resultater tyder på, at LeIF A/D's udtalte antivirale virkning i en række pattedyrarter ikke er begrænset til 15 cellekulturer, men også observeres i dødelige virusinfektio ner.

EMC-Virus kan anses som en model, en påvisning af antiviral virkning, hvormed man kan forudse den antivirale virkning mod 20 den repræsenterede virusfamilie, fx picornavirusfamilien, hvorunder mund- og-klovsyge og polio hører. VSV-Virus kan anses for en model, en påvisning af antiviral virkning, hvormed man kan forudse den antivirale virkning mod den repræsenterede virusfamilie, fx rhabdovirusfamilien, som 25 rabies er et fremtrædende eksempel på.

Tabel IV opstiller virkningerne af forskellige af LelF-hybri-derne på WISH og MDBK-celler og virkningsforholdene deraf.

DK 173590 B1 44

TABEL IV

LeIF Enheder/liter Enheder/liter Virkningsforhold hybrid kultur, kultur, WISH/MDBK

5 (Pvu II) WISH celler MDBK celler AB 2,4 x 108 4 x 107 6 AD 1,2 x 108 2 x 107 6 AF 6 x 107 1 x 107 6 10 AG 4 x 107 1,5 x 107 2,7 AI 3,2 x 107 1,2 x 107 2,7 BA 1,5 x 107 1 x 107 1,5 BD 6 x 107 1,5 x 107 4 BF 1 x 106 3,5 x 105 0,3 15 BG 2 x 107 6 x 107 0,3 DA 3 x 106 1,2 x 108 0,025 DB 2 x 106 5 x 107 0,04 DF 2 x 105 4 x 106 0,05 DG 2 x 105 1,5 x 107 0,014 20 FA 2 x 105 6 x 1070,003 FB 2 x 106 8 x 1070,025 FD 1 x 107 2 x 1070,5 FG 1 x 106 4 x 1070,025 IA 2,4 x 106 6 x 1070,04 25 A1 8 X 107 1,2 x 108 0,7 B1 8 x 107 4 x 1080,2 C1 2 x 107 1,5 x 107 1,3 D1 5 x 106 2,5 x 107 0,2 F1 2 x 107 2 x 1080,1 30 I1 1,6 x 107 1,2 x 107 1,3 til sammenligning DK 173590 B1 45

Parenteral administration

De hybride leukocytinterferoner kan administreres parenteralt til patienter, der har behov for antitumor- eller antiviral 5 behandling, og til patienter, der udviser immunosuppressive tilstande. Doser og doseringshyppighed kan være de samme som dem, der for tiden anvendes i kliniske undersøgelser af materialer af human oprindelse, fx ca. (1 til 10) x 106 enheder om dagen, og når materialerne har en renhed på over 1%, sand-10 synligvis op til fx 5 x 107 enheder om dagen. De preliminære angivelser i den ovenfor beskrevne abeundersøgelse tyder på, at doser af fra bakterier vundet LeIF kan forøges betydeligt for større virkning som følge af, at humane proteiner udover LeIF i det store og hele er fraværende, hvilke proteiner i 15 materialer, der fås fra leukocyter, kan virke som pyrogener idet de udviser skadelige virkninger som fx ildebefindende, temperaturstigninger etc.

Som eksempel på en passende dosisform for i det væsentlige 20 homogent bakterielt LeIF i parenteral form, der med forbehold for forandringer kan anvendes til den foreliggende opfindelse, kan 3 mg LeIF med en specifik virkning på fx 2 x 10® enheder/mg opløses i 25 ml 5N serumalbumin (human)-USP, opløsningen føres gennem et bakteriologisk filter, og den fil-25 trerede opløsning fordeles aseptisk på 100 glas, der hver især indeholder 6 x 106 enheder rent interferon, der er egnet til parenteral administration. Glassene opbevares fortrinsvis koldt (-20°C) før brugen.

30 Forbindelserne fremstillet ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse kan formuleres på kendt måde til fremstilling af farmaceutisk nyttige præparater, hvorved polypeptidet kombineres iblandet en farmaceutisk tolerabel bærer. Egnede bærere og deres formulering beskrives i Reming- DK 173590 B1 46 ton's Pharmaceutical Sciences af E.W. Martin. Sådanne præparater vil indeholde en virksom mængde interferonprotein sammen med en passende mængde bærer til fremstilling af farmaceutisk tolerable præparater, der egner sig til effektiv 5 administration til værten.

Claims (26)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et antiviralt polypeptid på 165 til 166 aminosyrer, idet polypeptidets aminosyrese- 5 kvens består af dels en afgrænset aminosyre-undersekvens af humant leukocytinterferon A og dels af en afgrænset aminosyre-undersekvens af humant leukocytinterferon B eller D, og idet polypeptidets aminosyresekvens i hele sin sammensætning afviger fra arainosyresekvensen i naturligt forekommende 10 leukocytinterferoner, kendetegnet ved, at den omfatter anbringelsen af et hybridt dobbeltstrenget DNA-fragment, der omfatter en streng, som indkoder polypeptidet, inden i en replicerbar plasmidudtryksbærer, transformation af en mikroorganisme med 15 denne, dyrkning af mikroorganismen og forårsagelse af det indkodede polypeptids udtrykkelse, lysering af den resulterende mikroorganisme og udvinding af polypeptidet derfra.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, 20 kendetegnet ved, at den N-terminale del af det antivirale polypeptid består af aminosyre 1 til 92 i LeIF D, og at den carboxyterminale del deraf består af aminosyre 92 til 165 i LeIF A.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den N-terminale del af det antivirale polypeptid består af aminosyre 1 til 91 i LeIF A, og at den carboxyterminale del deraf består af aminosyre 93 til 166 i LeIF D.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den N-terminale del af det antivirale polypeptid består af aminosyre 1 til 63 i LeIF D, 30 DK 173590 B1 48 og at den carboxyterminale del deraf består af aminosyre 63 til 165 i LeIF A.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, Skendetegnet ved, at den N-terminale del af det antivirale polypeptid består af aminosyre 1 til 62 i LeIF A, og at den carboxyterminale del deraf består af aminosyre 64 til 166 i LeIF D.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den N-terminale del af det antivirale polypeptid består af aminosyre 1 til 91 i LeIF A, og at den carboxyterminale del deraf består af aminosyre 93 til 166 i LeIF B. 15

7. Fremgangsmåde til fremstilling af et dobbeltstrenget DNA, der omfatter en sekvens, der koder for et antiviralt polypeptid på 165 til 166 aminosyrer, der består af dels en afgrænset aminosyre-undersekvens af humant leukocytinterferon A og 20 dels af en afgrænset aminosyre-undersekvens af humant leukocytinterferon B eller D, kendetegnet ved, at den omfatter a) udvælgelse af et første, dobbeltstrenget DNA-frag- 25 ment, der omfatter kodoner, som indkoder hele eller en del af det første, naturligt forekommende leukocytinterferons aminosyresekvens, hvilket fragment indeholder kodoner for den aminoterminale del af det nævnte interferon og anbragt i 3’-ret-30 ningen fra denne et første restriktionsendonuclea- sespaltningssted; b) spaltning af fragmentet med restriktionsendonucle-asen; DK 173590 B1 49 c) udvælgelse af et andet, dobbeltstrenget DNA-frag-ment, der indkoder hele eller en del af aminosyre-sekvensen i et andet, forskelligt, naturligt fore- 5 kommende leukocytinterferon, hvilket andet frag ment omfatter et identisk restriktionsendonuclea-sespaltningssted, der er identisk anbragt set ud fra aminosyrenummereringen for de to interferoner, og som udover dette sted yderligere omfatter kodo-10 ner for den carboxyterminale del i det andet in terferon; d) spaltning af det andet fragment med restriktions-endonucleasen; og 15 e) ligatering af produkterne fra restriktionsendo-nucleasedigestionen i trin b} og d) for at gendanne restriktionsendonucleasestedet og danne et hybridt fragment, der i rækkefølge består af kodo- 20 ner for det første interferons aminoterminale del og det andet interferons carboxyterminale del.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at det første naturligt forekom-25 mende leukocytinterferon er LeIF D, og det andet naturligt forekommende leukocytinterferon er LeIF A.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at det første naturligt fore-30 kommende leukocytinterferon er LeIF A, og det andet naturligt forekommende leukocytinterferon er LeIF D. DK 173590 B1 50

10 CDLPETHSLDHRRTLMLLAQMSRIS PSSCLMDRHDF6FPOEEF06NQFQK APAISVLHELIQ Q og at den carboxyterminale del deraf består af aminosyre 63 til 165 i LeIF-A, nemlig 15 IFNLFSTKD8SAAWDETLIDKFYTE LYQQLNDLEACVIOGVGVTETPLMK EOSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSP CAWEVVUAEIMRSFSLSTNLQESLR SKE. 20

10. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at det første naturligt forekommende leukocytinterferon er LeIF A, og det andet naturligt forekommende leukocytinterferon er LeIF B. 5

11. Dobbeltstrenget DNA, kendetegnet ved, at det indkoder et antiviralt polypeptid på ca. 165 til 166 aminosyrer, idet polypeptidets aminosyresekvens omfatter en afgrænset aminosyre-undersekvens 10 af humant leukocytinterferon A og af humant leukocytinter-feron B eller D, og idet polypeptidets aminosyresekvens i hele sin sammensætning afviger fra naturligt forekommende leukocytinterferoners aminosyresekvens.

12. Dobbeltstrenget DNA ifølge krav 11, kendetegnet ved, at den N-terminale del af det indkodede polypeptid består af aminosyre 1 til 92 i LeIF D, og at den carboxyterminale del deraf består af aminosyre 92 til 165 i LeIF A. 20

13. Dobbeltstrenget DNA ifølge krav 11, kendetegnet ved, at den N-terminale del af det indkodede polypeptid består af aminosyre 1 til 91 i LeIF A, og at den carboxyterminale del deraf består af aminosyre 93 25 til 166 i LeIF D.

14. Dobbeltstrenget DNA ifølge krav 11, kendetegnet ved, at den N-terminale del af det indkodede polypeptid består af aminosyre 1 til 63 i LeIF D, 30 og at den carboxyterminale del deraf består af aminosyre 63 til 165 i LeIF A.

15. Dobbeltstrenget DNA ifølge krav 11, DK 173590 B1 51 kendetegnet ved, at den N-terminale del af det indkodede polypeptid består af aminosyre 1 til 62 i LeIF A, og at den carboxyterminale del deraf består af aminosyre 64 til 166 i LeIF D. 5

16. Dobbeltstrenget DNA ifølge krav 11, kendetegnet ved, at den N-terminale del af det indkodede polypeptid består af aminosyre 1 til 91 i LeIF A, og at den carboxyterminale del deraf består af aminosyre 93 10 til 166 i LeIF B.

17. Replicerbar plasmidudtryksbærer, kendetegnet ved, at den i en transformeret mikroorganisme er i stand til at udtrykke et polypeptid, der 15 indkodes af en DNA-sekvens ifølge et hvilket som helst af kravene 11-17.

18. Plasmid ifølge krav 17, kendetegnet ved, at de t er udvalgt blandt gruppen 20 bestående af pLeIF AD trp (Bgl II), pLeIF AD trp (Pvu II), pLeIF DA trp (Bgl II) og pLeIF DA trp (Pvu II), som er fremstillet som beskrevet i tabel 1 og på side 30-31 i beskrivelsen.

19. Plasmid ifølge krav 17, kendetegnet ved, at det er bestående af pLeIF AB (Pvu II), som er fremstillet som beskrevet i tabel 1 og på side 30-31 i beskrivelsen.

20. Mikroorganisme, 30 kendetegnet ved, at den er transformeret med en udtryksbærer ifølge krav 18 eller 19. DK 173590 B1 52

21. Antiviralt polypeptid på 165-166 aminosyrer, kendetegnet ved, at det består dels af en afgrænset aminosyre-undersekvens af humant leukocytinterferon A og dels af en afgrænset aminosyreundersekvens af humant leukocytinterferon B eller D, idet polypeptidets samlede lo aminosyresekvens adskiller sig fra de naturligt forekommende leukocytinterferoner.

22. Polypeptid ifølge krav 21, kendetegnet ved, at den N-terminale del deraf 15 består af aminosyre 1 til 92 i LeIF-D, nemlig COLpETH$i.DNRRTLMLLAGMSR|S PSSCLMDRHDFGFPQEEFDGNQFηκ APAISVLHEUQQIFNLFTTKDSSa AWDEOILDKFCTELYQQ 20 og at den carboxyterminale del deraf består af aminosyre 92 til 165 i LeIF-A, nemlig LNDLEACV.1QGVGVTETPLMK 25 EOSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSP CAWEVVRAEIMRSFSLSTNIQESLR SKE.

23. Polypeptid ifølge krav 21, kendetegnet ved, at den N-terminale del deraf 30 består af aminosyre 1 til 91 i LeIF-A, nemlig COLPQTH8LQ6RRTLMLLAQMRKIS LFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKA ETIPVIHEMIQQIFNLFSTKOSSAA WDETLLDKFYTELYQQ 35 og at den carboxyterminale del deraf består af aminosyre 93 til 166 i LeIF-D, nemlig v D S |·ί A V im?VVVGETPLMN c a w eLvAvV aKfYi J tlyltekkysp .JWE VVnAElMRSLsr-STHUERln 5 DK 173590 B1 53

24. Polypeptid ifølge krav 21, kendetegnet ved, at den N-terminale del deraf består af aminosyre 1 til 63 i LeIF-D, nemlig

25. Polypeptid ifølge krav 21, kendetegnet ved, at den N-terminale del deraf består af aminosyre' 1 til 62 i LeIF-A, nemlig COLPOTHSLGSRRTLMLLAOMRKIS b LFSCUDRHDFGFPOEEFGNQFQKA ETIPVLHEMIQQ og at den carboxyterminale del deraf består af aminosyre 64 til 166 i LeIF-D, nemlig 30 ! ΪΛι,Λτ.7 kdssaawdeollokfcte i* v Q OLM OLEACVMQEERVGETPLMN X?wCI'wAwV«K^Y,:RII,TLYLTEKKY8,‘ CAWEVVRAEIMR6L6FSTNLQERLR R KE.

26. Polypeptid ifølge krav 21, 35 kendetegnet ved, at den N-terminale del deraf består af aminosyre 1 til 91 i LeIF-A, nemlig COLFQTHSLGSRRTLMLLAQMRKIS LFSCLKDHHDFGFPOEOFGNQFOKA " ETIPVLHEMIQOIFNLFBTKDSSAA WDETLLDKEYTELYQQ 5 DK 173590 B1 54 og at den carboxyterminale del deraf består af aminosyre 93 til 166 i LeIF-B, nemlig lnolevlcdgevgviesplmyedsi UVflKYFQntTLYLTEKKYSSCAWE VVnAEIMnSFSLSINLQKniKSKE.