NO831041L

NO831041L - Nytt dna og fremgangsmaate for fremstilling derav.

Info

Publication number: NO831041L
Application number: NO831041A
Authority: NO
Inventors: Masakazu Kikuchi; Kyozo Tsukamoto; Tsutomu Kurokawa
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date: 1982-03-24
Filing date: 1983-03-23
Publication date: 1983-09-26
Also published as: GR78493B; FI830984A0; ES520877A0; AU1274483A; FI830984L; EP0089676A3; ES8500996A1; PH20744A; IL68100A0; EP0089676A2

Abstract

Menneske-immuninterferon produseres ved. å fremstille en DNA som inneholder en basesekvens som koder for menneske-immuninterferonpolypeptidet, transformere en vert med denne, dyrke verten og utvinne polypeptidet. i

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en DNA som inneholder en basesekvens som koder for menneske-immuninterferonpolypeptidet, en vert som er transformert ved denne og en fremgangsmåte for å fremstille menneske-immuninterferon under anvendelse av verten, samt forskjellige interferonprodukter.

Interferoner (heretter enkelte ganger forkortet til "IF-er") er proteiner som fremstilles av celler hos høyere dyr som respons på stimulering fra et virus, en nukleinsyre etc., og som har antiviral, antitumor og andre virkninger.

For tiden er det kjent at menneske-IF-er omfatter tre typer, nemlig alfa-, beta- og gammatyper, med forskjellige egenskaper. Alfa- og betatypene induseres av et virus eller en nukleinsyre og gammatypen induseres vanligvis av mitogener.

I sammenligning har undersøkelsen av alfatype IF (heretter referert til som "IF-a") og betatype IF (heretter referert til som "IF-3") avansert betydelig, og mekanismene for deres fremstilling er i en betydelig utstrekning oppklart. Videre har fremskritt i genmanipuleringsteknikker gjort det mulig å fremstille IF-a og IF-3^ ved å dyrke Escherichia coli eller å fremstille IF-^ved å dyrke en gjær, disse IF-er lar seg følgelig erholde i store mengder som fysiologisk virksom-me proteiner (se D.V. Goeddel et al., Nature, 287, 411 (1980), E. Yelverton et al., Nucleic Acids Res., 9, 731 (1981), D.V. Goeddel et al., Nucleic Acids Res., 8, 4057 (1980), R. Hitzeman et al., Nature, 293, 717 (1981)). Videre har det vært gjort forsøk på å fremstille slike IF-er i mengder som er tilstrek-kelig store til å muliggjøre kommersiell klinisk bruk av dem.

Gammatype IF (heretter enkelte ganger referert til som "IF-y") kalles også immuninterferon (heretter noen ganger referert til som "IFI") fordi det fremstilles ved hjelp av immunologisk kompetente celler under de betingelser som kan indusere kim-dannelse av lymfocytter eller fremstilling av lymfokin. IFI har større antifruktbarhets- og antitumorvirk-ninger enn IF-a og IF-3, og er derfor mer lovende med tanke på klinisk anvendelse. Det er imidlertid ikke blitt etablert noe virksomt produksjonssystem for dette ettersom nydannende lymfo cytter er nødvendige. Videre har den mulighet vært antydet at forskjellige cellearter fremstiller IFI-er med forskjellige molekyltyper i forskjellige eksperimentelle systemer.

På den annen side må menneske-avledede IF-er brukes under anvendelse på mennesker ettersom IF-er er svært arts-spesifikke. Masseproduksjon av menneske-immuninterferon har imidlertid vært så vanskelig at dets anvendelse i klinisk bruk hittil har vært umulig. Utvikling av en teknikk som er istand til på en enkel måte å fremstille store mengder menneske-IFI med høy renhetsgrad og til lave kostnader, har vært ventet på med begjærlighet.

Ved å bruke genmanipuleringsteknikker har oppfinn-erne til den foreliggende .oppfinnelse vært beskjeftiget med å utvikle en teknikk som muliggjør fremstilling av det for-ønskede IFI ved å klone menneske-IFI-genet, innlemme det erholdte rekombinante DNA-molekylet i en vert og derved forår-sake uttrykking av menneske-IFI-genet i verten, og utvinne menneske-IFI.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en DNA som inneholder en basesekvens som koder for menneske-immuninterferonpolypeptidet, en vert som er transformert med det nevnte DNA, en fremgangsmåte for å fremstille menneske-immuninter-feronet eller en polypeptidekvivalent til dette, idet fremgangsmåten omfatter å dyrke en vert som er transformert med det nevnte DNA, og nye interferonprodukter.

Den DNA som er tilveiebragt ved hjelp av den foreliggende oppfinnelse, er følgelig en DNA som har basesekvensen med formelen

hvor X er TAA, TGA eller TAG.

DNA med formel (I) koder for polypeptidet med formel

eller et polypeptid som er ekvivalent til dette med hensyn til immunologiske eller biologiske virkninger.

Den ovenfor nevnte DNA (I) kan ha følgende 5'-ende:

5'ATG AAA TAT ACA AGT TAT ATC TTG GCT TTT CAG CTC

TGC ATC GTT TTG GGT TCT CTT GGC 3' (III)

eller

ATG (IV).

Når DNA (I) har DNA med formel (III) i 5'-enden, koder den ikke bare for polypeptidet (II), men ogsa for polypeptidet som har Met Lys Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gin Leu Cys Ile Val Leu Gly Ser Leu Gly lagt til N-enden eller et polypeptid som er ekvivalent til dette med hensyn til virkninger. Når DNA (I) har DNA med formel (IV) i 5'-enden, koder det ikke bare for polypeptidet (II), men også for polypeptidet som har Met lagt til- i N-enden eller et polypeptid som er ekvivalent til dette med hensyn til virkninger.

DNA (I) er fortrinnsvis knyttet til stedet som ligger etter en promoter. Passende promotere omfatter tryptofan-(trp) promotoren, bakteriofag lambda PT-promotoren eller andre kjente promotere slik som laktose- (lac) promoteren, og proteinkjedeforlengelsesfaktor Tu- (tufB) promoteren. Foretrukket blant disse er trp-promoteren og PLTi -promoteren. P i- l-promotoren er en svært sterk promoter som kan kontrolleres effektivt og bekvemt ved hjelp av X cl-repressoren. Genet som koder for repressoren har en mutasjon, clts2 eller clts857, som gjør repressoren temperaturfølsom. Ved 30°C funksjonerer repressoren normalt og fra ca. 37°C til ca. 42°C inaktiveres den. PL-promoteren undertrykkes (slås av) følgelig ved 30°C og undertrykkingen oppheves (slås på) ved 42°C. Denne egen-skapen er her ønskelig ettersom det aktuelle genproduktet kan være giftig for cellen eller, dersom det er tilstede i store mengder, vil den være skadelig for celleveksten. På grunn av muligheten for å kontrollere PL~promotren kan man dyrke kulturen ved ca. 30 - ca. 3 6°C uten å uttrykke genproduktet og på et optimalt tidspunkt endre temperaturen fra ca. 3 7°C til ca. 4 2°C for å fremstille det ønskede genproduktet.

I den generelle formel (I) er X, som er et oligode-oksyribonukleotid, fortrinnsvis TAA.

Symbolene slik de er brukt i beskrivelsen, tegning-ene og kravene har betydningene som er angitt i tabell 1.

tab. 1 forts.

EDTA = etylendiamintetraacetat

SDS = natriumdodecylsulfat

Gly = glycin

Ala = alanin

Val = valin

Leu = leucin

Ile = isoleucin

Ser = serin

Thr = threonin

Cys = cystein

Met = methionin

Gly = glutaminsyre

Asp = asparaginsyre

Lys = lysin

Arg = arginin

His = histidin

Phe = fenylalanin

Tyr = tyrosin

Trp = tryptofan

Pro = prolin

Asn = asparagin

Gin = glutamin

DNA-en ifølge foreliggende oppfinnelse som har basesekvensen med formel (I), kan f.eks. fremstilles ved å

(a) dyrke menneske-IFI-utskillende celler, f.eks. menneske-lymfocytter fra perifert blod, (b) isolere fra cellene en messenger-(m) RNA som koder for

menneske-IFI,

(c) syntetisere en enkeltkjedet komplementær (c) DNA ved bruken av den nevnte messenger-RNA og omvendt transkriptase, (d) omdanne den nevnte (c) DNA til en dobbelt-kjedet DNA, (e) sette inn den nevnte dobbelt-kjedede DNA i et plasmid, (f) transformere en vert, f.eks. Escherichia coli eller

Bacillus subtilis, med det rekombinante plasmidet,

(g) isolere et plasmid som inneholder den forønskede DNA

fra kulturen av verten,

(h) om ønsket, fjerne den klonede DNA fra plasmidet og (i) om ønsket, binde den klonede DNA til stedet etter en promoter i en kloningsbefordrer.

Menneskelymfocyttene fra perifert blod som brukes ved utøvelsen av oppfinnelsen, kan enten være ikke-induserte celler eller induserte celler.

Induksjonsmidlet for IFI som brukes ved utøvelsen

av oppfinnelsen, kan være et hvilket som helst middel som er istand til å indusere menneske-lymfocytiske celler til å produsere IFI og omfatter bl.a. fytohemaggutinin (PHA), Concanavalin A (ConA), enterotoksin A fra stafylokokker (SEA), neuraminidase-galaktoseoksidase (NAGO), 12-0-tetradekanoyl-forbol-13-acetat (TPA) og blandinger av disse.

Induksjon av IFI kan utføres ved å dyrke cellene

i et i og for seg kjent medium, slik som RPMI-1640 eller MEM-medium, fortrinnsvis i RPMI-1640-medium som inneholder blod-serum fra oksefoster. Dyrkingen utføres ved en temperatur på 35 - 39°C, fortrinnsvis 36 - 38°C, i 12 - 72 timer, fortrinnsvis 22 - 26 timer. Cellene samles opp (ved hjelp av en i og for seg kjent fremgangsmåte) og etter tilsetning av f.eks. guanidintiocyanid, bentonitt, heparin, polyvinylsulfat, aurin-trikarboksylsyre, vanadiumkompleks, dietylpyrokarbonat (DPC) eller natriumdodecylsulfat (SDS) som RNase-inhibitoren, lyst for RNA-ekstraksjon ved å tilsette f.eks. natrium-N-lauroylsarkosinat "Tween 80" eller "Nonidet P-40". Etter gjentatt ekstraksjon, om nødvendig, ved å tilsette fenol, fenol-kloro-form eller lignende til den RNA-holdige ekstrakten, samles RNA-er opp ved å felle ut med etanol. Ettersom mange mRNA-er som er tilstede i cytoplasmaet hos eukaryotiske celler er kjent for å inneholde en poly(A)-sekvens ved 3'-enden, samles poly(A) -RNA-er opp ved å bruke oligo-(dT)-cellulose, poly-(U)-sefarose eller lignende og fraksjoneres ved hjelp av sentrifugeringsfremgangsmåten for sukrosedensitetsgradient. Aliquoter av hver erholdt fraksjon injiseres i oocytter fra

fra Xenopas laevis (en froskeart) for translasjon. (J.B. Gurdon, et al., Nature, 233, 177 (171)). Det fremstilte proteinet analyseres for antiviral virkning. På denne måte kan mRNA-en for IFI erholdes. mRNA-en kan også renses ved hjelp av formamid-polyakrylamid-gelelektroforese eller ved hjelp av agarosegel-eletroforese eller ved hjelp av agarosegel-elektroforese under anvendelse av glyoksal.

Ved å bruke den således erholdte mRNA som en tem-plett, syntetiseres den enkeltkjedede komplementære DNA-(cDNA) kjeden ved hjelp av en i og for seg kjent fremgangsmåte, f.eks. ved å bruke en omvendt transkriptase. cDNA omdannes så til den dobbeltkjedede DNA (T. Maniatis et al., Cell, 8, 163

(1976)).

Denne DNA settes f.eks. inn i plasmidet pBR322, f.eks. ved spaltingsstedetfor Pstl-eller Sphl-restriksjons-endonuklease, f.eks. ved hjelp av fremgangsmåten for tilknyt-ning av dG-dC- eller dA-dT-homopolymer beskrevet i T.S.

Nelson (Methods in Enzymology, 68, 41 (1979), Academic Press Inc., New York). Det rekombinante plasmidet innføres så f.eks. i Escherichia coliX1776 ved transformasjon. Transformantene kan selekteres som tetracyklinresistente eller ampicillinresistente kolonier. Atskilt syntetiseres kjemisk et prøveoligonukleotid med en basesekvens som antas å svare til i det minste en del av aminosyresekvensen hos IFI-p<p>ly-peptidet, og det merkes med 3 2P. Ved å bruke det merkede oli-gonukleotidet som prøveforbindelse, etterutskilles de ønskede klonene fra de allerede erholdte tetracyklin- eller ampicillinresistente' transformantene, f.eks. ved hjelp av den i og for seg kjente kolonihybridiseringsfremgangsmåten (M. Grunstein og D.S. Hogness, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 72, 3961 (1975)).

For å stadfeste nærværet av IFI-genet bestemmes basesekvensen til klonene som oppviser det positive kolonihybridi-seringsresultatet, f.eks. ved hjelp av Maxam-Gilbert-metoden (A.M. Maxam og W. Gilbert, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 74,

560 (1977)) eller den dideoksynukleotid-syntetiske kjedeav-slutningsfremgangsmåten under anvendelse av phage M13 (J. Messing et al., NucleicAcids Res., 9, 309 (1981)). Hele eller

en del av IFI-genet kan også tas ut av de erholdte klonene og deretter tilknyttes etter en passénde promoter og SD-( "Shine-Delgarno") sekvens for i-nføring i en passende vert.

Promoteren omfatter de ovenfor nevnte promotere og verten omfatter slike bakterier som Escherichia coli eller Bacillus subtilis og andre mikroorganismer, slik som gjæren Saccharomyces cerevisiae. Foretrukket som vert er Escherichia coli, slik som E. coli stamme 294 eller "3110, særlig E. coli 294.

Escherichia coli 294 er en kjent bakteriestamme (K. Backman et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 73, 4174

(1976)) og er også deponert ved Institute for Fermentation, Osaka (deponering nr. IFO-14171).

Transformasjonen av en vert med DNA-en ifølge foreliggende oppfinnelse utføres f.eks. ved hjelp av den kjente fremgangsmåten til S.N. Cohen et al.,(Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 69, 2110 (1972)).

Forbindelsen med formel:

hvor Y er (a) hydrogen, (b)_Met eller (c) Met Lys Tyr Thr Ser Tyr Ile Ala Phe Gin Leu Cys Ile Val Leu Gly Ser Leu Gly kan fremstilles f.eks. ved å dyrke den således erholdte verten, akkumulere forbindelsen (II') i dyrkingsvæsken og utvinne denne.

Verten dyrkes i et i og for seg kjent medium.

Mediet er f.eks. M9-medium som inneholder glukose

og casaminosyrer (J. Miller, Experiments in Molecular Gene-tics, 431 - 433 , Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1972). For at promoteren skal virke fullgodt, kan om nødvendig et middel som virker opphevende på undertrykkingen, slik som 3-indolylakrylsyre, tilsettes.

Inkubasjonen utføres vanligvis ved 15 - 43°C i 3 - 24 timer, om nødvendig med lufting og/eller omrøring.

Når det brukes en transformant som har en X cl-repressor og en ekspresjonsvektor som inneholder PL~promoteren, brukes det lavere temperaturer ved inkuberingen, dvs. omtrent 30 - ca. 36°C, og X cl-repressoren kan fortrinnsvis inaktiveres under inkuberingen ved ca. 3 7 - 4 2°C.

Etter inkuberingen samles cellene opp ved hjelp

av en kjent fremgangsmåte og lyses f.eks. etter suspendering i en bufferoppløsning, f.eks. ved hjelp av ultrasonisk behandling, ved hjelp av lysozym og/eller nedfrysing og opp-tining, eller andre fremgangsmåter (f.eks. Gunsalus, "Ex-traction of Enzymes from Microorganisms", Methods in Enzymology 1:51 (1955)). Supernatanten utvinnes ved sentrifugering.

Isoleringen av menneske-IFI fra supernatanten kan utføres ved hjelp av vanlig kjente fremgangsmåter for pro-teinrensing.

Det IFI som fremstilles ifølge oppfinnelsen, eller polypeptidekvivalenten til dette med hensyn til immunologiske eller biologiske virkninger, har immunologiske og biologiske virkninger som er ekvivalente til virkningene av IFI-artene som tidligere har blitt fremstilt ved hjelp av kjente fremgangsmåter, og kan brukes på samme måte og til samme formål som de kjente IFI-artene.

IFI har oppvist antiviral, antitumor, vekstinhiber-ende og immunologisk undertrykkende virkning. Forbindelsen kan blandes med en steril farmasøytisk akseptabel bærer slik som sterilt vann, menneske-serumalbumin, (HSA), vanlig salt-vannsoppløsning eller andre bærere som er velkjente innen teknikken, og administreres oralt eller topisk. Daglige doseringer for intravenøs behandling varierer fra ca. 10 millioner enheter til ca. 100 millioner enheter pr. dag for normale voksne personer, fortrinnsvis ca. 50 - 60 millioner enheter pr. dag. Det farmasøytiske produktet kan inneholde andre farmasøytisk akseptable bestanddeler, slik som salter, fortynnere, hjelpestoffer, andre bærere, buffere, bindemid-ler, overflateaktive midler, preserveringsmidler etc. Pre-parater for parenteral bruk kan tilveiebringes i form av en ampulle av steril oppløsning eller suspensjon av produktet sammen med vann eller annen farmasøytisk akseptabel væske som bærer, eller en ampulle av sterilt pulver (fortrinnsvis erholdt ved lyofilisering av en oppløsning av IFI) for for-tynning med farmasøytisk akseptabel væske.

Videre kan produktet ifølge den foreliggende oppfinnelse inneholde andre farmasøytisk aktive bestanddeler som er passende administrerbare sammen med IFI, omfattende f.eks. lymfocytt- eller fibroblastinterferon, i mengder som varierer fra ca. 1 - 99%, basert på mengden IFI.

Fig. 1 viser kartet over restriksjonsenzymspalting av plasmidet pHIT3709 som fås i eksempel 1 (vii) , idet delen .. Y //////// A angir den delen som koder for det peptidet som antas

å være signalpeptidet, og delen angir den delen som koder for IFI-polypeptidet. Fig. 2 viser den primære strukturen (basesekvens) for plasmidet pHIT3709 som erholdes i eksempel 1 (vii). Fig. 3 viser oppbyggingsskjemaet for eksempel 2.

Fig. 4 er et delvis restriksjonskart for et 1200 bp Bgl II - Barn H 1-fragment som inneholder en PT-promoter. Fig. 5 illustrerer oppbyggingen av en ekspresjonsvektor pRC14 som inneholder X P -promoteren på et 350 bp-innskutt. Fig. 6 illustrerer systemet som brukes for å isolere 82 bp-fragmentet som inneholder SD-sekvensen for int-genet hos bakteriofag lambda for oppbygging av ekspresjonsvektor pRC15. Fig. 7 illustrerer oppbyggingen av ekspresjonsvektor pRC15. Fig. 8 illustrerer oppbyggingen av ekspresjons-

vektorene pRC21 og PrC22. Fig. 9 illustrerer oppbyggingen av ekspresjonsvektor PRC23 med en PL~promoter og en syntetisk

RBS.

Fig. 10 viser systemet som brukes for å innføre genet som koder for immuninterferon i pRC22 og sekvensen med promoter-gen-sammenkoplingen. Fig. 11 illustrerer innføringen av immuninterferon-genet i ekspresjonsvektor pRC23 og sekvensen med promoter-gen-sammenkoplingen og dens modifikasjon.

Eksempel 1

(i) Isolering av mRNA som koder for IFI

Lymfocytter fremstilt fra perifert menneskeblod ble inkubert i RPMI-1640-medium (som inneholder 10% blod-serum fra oksefoster) som inneholder 15 ng/ml 12-O-tetra-dekanoylforbol-13-acetat (TPA) og 40 yg/ml "Concanavalin A", ved 37°C for IFI-induksjon. Etter 24 timer med inkubering, ble de således induserte menneske-lymfocyttene (1 x 10"^ celler) ødelagt og denaturert i en tioguanidinoppløsning

(5M guanidintiocyanat, 5% merkaptoetanol, 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 10 mM EDTA) i en homogenisator av teflon. Deretter ble natrium-N-lauroylsarkosinat tilsatt i en konsentrasjon på 4% og blandingen ble etter homogenisering belagt på 6 ml 5,7 M cesiumkloridoppløsning (5,7 M cesiumklorid, 0,1 M EDTA) og sentrifugert ved 15°C og 24.000 omdr./min.

i 30 timer under anvendelse av en Beckman SW 27 rotor hvorved man fikk en RNA-utfelling.

Denne RNA-utfellingen ble oppløst i 0,2 5% N-lauroylsarkosinat og deretter utfelt med etanol hvorved man fikk 8,3 mg RNA. Denne RNA ble hensatt for å adsorberes i en saltoppløsning med høy konsentrasjon (0,5 M NaCl, 10 mM tris-HCl (pH 7,6), 1 mMEDTA, 0,3% SDS), på en oligo- (dT) cellulosekolonne og den poly-(A)-holdige mRNA ble eluert med en saltoppløsning med lav konsentrasjon (10 mM tris-HCl (pH 7,6), 1 mM EDTA, 0,3% SDS). Det ble samlet opp 700 yg mRNA.

Denne mRNA ble på nytt utfelt med etanol, deretter oppløst i 0,2 ml av en oppløsning (10 mM tris-HCl (pH 7,6), 2 mM EDTA, 0,3% SDS), behandlet ved 65°C i 2 minutter og frak-sjonert til 22 porsjoner ved hjelp av 10 - 35% sukrosedensi-tetsgradientsentrifugering ved 20°C og 25.000 omdr./min. i 21 timer under anvendelse av en Beckman SW 27 rotor. Aliquoter av hver fraksjon ble injisert i Xenopas laevis oocytter og de syntetiserte proteinene ble analysert med hensyn til interferonaktivitet, dvs. analysert for antiviral aktivitet slik den analyseres ved hjelp av inhiberingsprøven for den cytopatiske virkning av det vesikulare stomatitis viruset mot menneske-amnion-avledede WISH-celler (W.E. Stewart, The Interferon System 11 - 26, Springer-Verlag, New York (1979)). På denne måten ble det avslørt av fraksjon 12 (sedimenta-sjonskoeffisienten er 12 - 14S), hadde en aktivitet på 195 enheter (internasjonale IFN-enheter) pr. mikrogram RNA. mRNA-en i den således erholdte fraksjon 12 veide ca. 20 yg.

(ii) Syntese av enkeltkjedet DNA

Ved å bruke den ovenfor nevnte mRNA og en omvendt transkriptase, ble 100 yl av en reaksjonsblanding (5 yg mRNA, 50 yg oligo (dT), 100 enheter omvendt transkriptase, 1 mM

av hver av dATP, dCTP, dGTP og dTTP, 8 mM MgCl2, 50 mM KCl,

10 mM ditiotreitol og 50 mM tris-HCl (pH 8,3) inkubert ved 42°C i 1 time, deretter deproteinisert med fenol og behandlet med 0,IN NaOH ved 70°C i 20 minutter for nedbrytning av

RNA.

(iii) Syntese av dobbeltkjedet DNA

Den således syntetiserte enkeltkjedede, kompemen-tære DNA ble utsatt for omsetning i 50 yl av en reaksjonsblanding (den samme blanding som nevnt ovenfor med unntak av at mRNA og oligo (dT) var fraværende) ved 42°C i 2 timer for å syntetisere den dobbeltkjedede DNA.

(iv) Tilsetning av dC- endegrupper

Den ovenfor nevnte dobbeltkjedede DNA ble behandlet med nuklease Sl i 50 yl- av en reaksjonsblanding (dobbelt-kjedet DNA, 0,1 M natriumacetat (pH 4,5), 0,25 M NaCl, 1,5 mM ZnSO^, 60 enheter Sl nuklease) ved værelsestemperatur i 30 minutter. Reaksjonsblandingen ble deproteinisert med fenol, DNA ble utfelt med etanol og utsatt for endetransferaseomset- ning i en blanding av dobbeltkjedet DNA, 0,14 M kaliumkakody-lat, 2 mM ditiotreitol, 1 mM CoCl2, 0,15 mM dCTP, 30 enheter endetransferase i 0,3 M tris (base) (pH 7,6) ved 37°C i 3 minutter for tilsetning til den dobbeltkjedede DNA av ca. 20 deoksycytidinkjeder for hver 3'-ende hos DNA-en.

Denne serien av reaksjoner ga ca. 300 ng av en dobbeltkjedet deoksycytidin-kjede-holdig DNA.

(v) Spalting av Escherichia coli-plasmid og tilsetning

av dG- endegrupper

10 g Escherichia coli-plasmid pBR322 DNA ble behandlet separat med restriksjonsenzym Pstl i 50 yl av en re-aks jonsblanding som inneholdt 10 yg pBR322 DNA, 50 mM NaCl, 6 mM MgCl2, 6 mM 2-merkaptoetanol, 100 yg/ml okseserumal-bumin og 20 enheter Pstl i 6 mM tris-HCl (pH 7,4), ved 37°C

i 3 timer for spalting av det eneste stedet som er tilstede i PBR322 DNA, som gjenkjennes av Pstl. Reaksjonsblandingen ble deretter deproteinisert med fenol og DNA ble ytterligere behandlet med endetransferase i 50 yl av en reaksjonsblanding som inneholdt 10 yg DNA, 0,14 M kaliumkakolylat, 2 mM ditiotreitol, 1 mM CoCl2, 0,15 mM dGTP og 30 enhter endetransferase i 0,3 M tris (base) (pH 7,6) ved 37°C i 3 minutter for tilsetning av ca. 8 deoksyguanosinrester i hver 3'-ende hos det ovenfor nevnte plasmid pBR3 22 DNA.

(Vi) Ringslutning av cDNA og transformasjon av Eschericia coli Ringslutningen ble utført ved å varme opp 0,1 yg av den således erholdte syntetiske dobbeltkjedede DNA med dC-endegrupper og 0,5 yg av det ovenfor nevnte plasmid pBR322

med dG-endegrupper i en oppløsning som inneholdt 0,1 M NaCl,

50 mM tris-HCl (pH 7,6) og 1 mM EDTA ved 65°C i 2 minutter og deretter ved 45°C i 2 timer, etterfulgt av gradvis ned-kjøling. Transformasjonen av Escherichia coliX1776 ble ut-ført ved hjelp av fremgangsmåten ifølge Enea et al. (J. Mol.Biol., 96, 495 (1975)).

(vii) Isolering av plasmid som inneholder cDNA

Ca. 8500 tetracyklinresistente kolonier ble så isolert og DNA fra hver koloni ble festet på et nitrocellulose-filter (M. Grunstein og D.S. Hogness, Proe. Nati. Acad. Sei.

USA, 72 3961 (1975)).

Basert på aminosyresekvensen for IFI som er rapportert av D.V. Goeddel et al. (Nature, 295, 503 (1982)) ble to basesekvenser 5' TCCTGGCA^TA^C 3' og 5'' AC^TTCAT^TC^TC^T 3'

G G A A C C_

som var antatt å svare hhv. til aminosyrene nr. 1-5 (Cys.Tyr.-Cys.Gln.Asp) og aminosyrene 77 - 82 (Lys.Gin.Asp.Met.Asn.Val)

i IFI-sekvensen, hver for seg kjemisk syntetisert ved hjelp av triesterfremgangsmåten beskrevet i R. Crea et al. (Proe. Nati. Acad. Sei USA, 75, 5765 (1978)). Disse oligonukleotidene ble behandlet med T4-polynukleotidkinase i 50 yl av en reaksjonsblanding (0,2 yg oligonukleotid, 10 mM MgCl?, 10 mM

32

merkaptoetanol, 50 yg Ci-A- -P-ATP og 3 enheter T4-poly-nukleotidkinase i 50 mM tris-HCl (pH 8,0), ved 37°C i 1 time. Disse oligonukleotidene som var merket på denne måte med 3 2p

i 5'-enden, ble brukt som prøver og ringsluttet sammen med DNA på det ovenfor nevnte nitrocellulosefilteret ved hjelp

av fremgangsmåten til Lawn et al (Nucleic Acids Res., 9, 6103

(1981)). Det ble isolert fire kolonier som var reaktive mot

de ovenfor nevnte to oligonukleotidprøvene ved å bruke auto-radiografi.

Plasmid DNA-er ble isolert fra bakteriecellene i

hver av disse koloniene ved hjelp av fremgangsmåten til Birnboim og Doly (Nucleic Acids Res. 7, 1513 (1979)) . Inn-skuddene i plasmid DNA-ene ble fjernet ved hjelp av Pstl-restriksjonsenzymet. Blant de isolerte plasmidene ble det som inneholdt det lengste cDNA-innskuddet valgt ut og betegnet "pHIT3709".

Restriksjonsenzymkartet for dette plasmidet er vist

i fig. 1.

Den primære strukturen (basesekvens) for den cDNA-sekvensen som er innført i pHIT3709-plasmidet, ble så bestemt ved hjelp av dideoksynukleotidfremgangsmåten for syntetisk kjedeavslutning og ved hjelp av Maxam-Gilbert-fremgangsmåten. Den primære strukturen var slik som vist i fig. 2.

Denne primære strukturen er i overensstemmelse med den til IFI cDNA rapportert av Gray et al. (Nature, 295, 503 - 508 (1982)) med unntak av at den førstnevnte adskiller seg fra den sistnevnte i ett codon; den førstnevntes codon for amino-syre nr. 140 er nemlig CGA, mens den sistnevntes er CAA for Gin. Proteinet som bestemmes av denne basesekvensen består antagelig av 166 aminosyrer hvis syntese initieres fra nukleotid nr. 30, nemligATG-codonet, som er signalet for opp-starting av proteinsyntese. De første 20 aminosyrene utgjør sannsynligvis et signalpeptid. Også aminosyresekvensen er forskjellig fra det IFI som ble rapportert av Gray et al. med hensyn til aminosyren nr. 140 (Arg i stedet for Gin).

Av den ovenfor nevnte primære strukturen er det klart at plasmidet har hele det kodende området for IFI-proteinet. Dette faktum gjør det mulig å få verter slik som Escherichia coli til å fremstille immuninterferon og overføre DNA-sekvensen som er innskutt i dette plasmidet til et annet ekspresjonsplasmid.

Eksempel 2

Innskuddet i pHIT3709-plasmidet som ble erholdt i eksempel 1,ble fjernet fra nukleotid nr. 100 ved hjelp av BstNI-restriksjonsenzymet (jfr. fig. 2 og fig. 3) og, etter innfylling av de ujevne endene med DNA-polymerase I stort fragment (også kalt Klenow's DNA-polymerase I), koplet sammen ved å bruke et T2 DNA-ligase med oligonukleotid-mellomstykket:

som ble syntetisert kjemisk ved hjelp av den ovenfor nevnte triesterfremgangsmåten, og som inneholder startcodonet ATG for proteinsyntese.

Et annet plasmid (ptrp601) som inneholder pBR322 og triptofanpromoterdelen fra Escherichia coli (dvs. det promoter- og operator-holdige DNA-fragmentet), som inneholder 276 basepar, ble bygd opp som ekspresjonsplasmidet ved å bruke fremgangsmåten til G.N. Bennett et al. (J. Mol. Biol., 121, 113 (1978)).

Dette plasmidet ptrp601 ble kuttet med Clal-restriksjonsenzymet og IFI-genet med det ovenfor nevnte mellomstykket koplet til ble innført i plasmidvektoren etter tryptofan- promoteren ved å bruke T4 DNA-ligase. Et IFI-ekspresjonsplasmid pHIT-trp301 ble konstruert på denne måten (fig. 3).

En bakteriestamme som inneholdt dette plasmid pHIT.trp301 ble erholdt ved å transformere Escherichia coli 294 med dette plasmidet ved hjelp av fremgangsmåten til Cohen et al. nevnt ovenfor.

Eksempel 3

Bakteriestammen som inneholdt IFI-ekspresjonsplasmidet erholdt i eksempel 2 dyrkes i M9-medium som inneholder 0,5% glukose og 0,5% casaminosyrer ved 37°C i 6 timer. Cellene samles deretter opp og suspenderes i 0,15 M NaCl-opp-løsning i 0,02 M fosfatbuffer (pH 6,8) og lyses ved hjelp av ultralydbehandling. Sentrifugering gir en supernatant. Inter-feronaktiviteten i denne supernatanten kan måles ved å ana-lysere med hensyn på WISH-celler i overensstemmelse med fremgangsmåten nevnt i eksempel l(i) ovenfor og beskrevet av W.E. Steward som angitt ovenfor.

Eksempel 4

Bakteristammen som inneholder IFI-ekspresjonsplasmidet pHIT-trp301 erholdt i eksempel 2 ble dyrket i M9-medium som inneholder 0,5% glukose og 0,5% casaminosyrer ved 3 7°C i 6 timer under rysting.

Indolakrylsyre ble tilsatt til en sluttkonsentra-sjon på 20 yg/ml og inkubasjonen ble fortsatt videre ved 3 7°C i 3 timer under rysting.

En 10 ml prøve ble tatt ut, cellene ble samlet opp ved sentrifugering og resuspendert i 0,1 ml 50 mM tris (pH 7,4) som inneholdt 10% sukrose, og suspensjonen ble hurtig frosset ned i et tørris/etanolbad. Deretter ble cellene tint opp ved 20°C og overført til et isbad. Til cellesuspensjonen ble det tilsatt NaCl til en konsentrasjon på 100 mM, EDTA

til 10 mM, spermidin til 20 mM og lysozym til 200 yg/ml. Blandingen ble holdt på is i 4 5 minutter, og deretter inkubert ved 37°C i 2 minutter. Lyse var åpenbart ut fra økning-en i viskositeten i suspensjonen. Cellerester ble fjernet ved sentrifugering og supernatanten ble analysert for IFI-anti-viral aktivitet på WISH-celler. Dette eksperimentet ga et

utbytte på 1280 enheter IFI-aktivitet pr. ml celleekstrakt.

De følgende illustrerende utførelsesformene viser ekspresjonen av IFI under anvendelse av APL-promotersystemet sammen med det IFI-kodende DNA-segment ifølge foreliggende oppfinnelse.

Eksempel 5

For å isolere et 350-basepar- (bp) fragment som inneholder A PT-promoteren, ble 250 yg A cl857 Sam7 DNA (Miles Laboratories) brutt ned ved hjelp av restriksjonsendonukle-asene BamHl og Bgl II og produktene ble separert på agarosegel ved hjelp av elektroforese. Et 1200 bp-fragment som inneholdt PL~promoteren ble isolert fra gelen (se fig. 4).

Dette 1200 bp-fragment ble så brutt ned fullstendig med Hpal og delvis brutt ned med Hinf I og et 350 bp-fragment ble isolert fra en 5% polyakrylamidgel. Nedbryting med Hpal eliminerte 2 HinfI-delfragmenter på ca. 350 bp som ellers ville ha forurenset det ønskede fragment.

Dette 3 50 bp-fragment inneholder PT-promoteren og O^-operatorstedene (0Lj_/ °l2' °L3^ som ^ cl-repressoren bindes til. Hinfl-stedet som opptrer mellom Shine-Dalgarno-(SD) sekvensen i A N-genet og det initierende codonet for N-genet (se fig. 4), gir anledning til oppbytningen av hybrid-ribosom-bindende steder for det formål å uttrykke fremmede gener i E. coli. Dette Hinfl-stedet kan også omdannes til et EcoRl-sted.

350 bp Bgl II - HinfI-fragmentet ble klonet inn i plasmid pRCl som var blitt brutt ned med EcoRl og Bgl II. pRCl er et' derivat av pBR322 som inneholder et Bgl II-sted grensende opp til EcoRl-stedet (se fig. 5). Fig. 5 viser sekvensene i den sammenbindende ende og indikerer hvordan EcoRl-enden i vektoren kan knyttes til Hinfl-enden i fragmentet og således gjenopprette EcoRl-stedet. (Sirklene A i fig. 5 ble fylt igjen in vivo). Det resulterende rekombinante plasmidet ble betegnet pRC14.

Ved å bruke de samme teknikkene ble også en rekke andre ekspresjonsvektorer konstruert ved å bruke PT-promoteren (fig. 6, 7, 8 og 9). pRCl5 inneholder i tillegg til det 3 50 bp Bgl II - HinfI-fragmentet beskrevet ovenfor, et 55 baseparfragment (Hinf [-Mbol]) som inneholder SD-sekvensen fra X int-genet (se fig. 6 og 7). pRC21 og pRC22 er ana-loge til hhv. pRC14 og pRC15. Hovedforskjellen mellom disse plasmidene er orienteringen til det innskutte P -holdige fragmentet og således retningen for transkripsjon (se fig. 8). pRC23 ble bygd opp ved å kople sammen syntetiske oligonukleotider som inneholdt en "konsensus"-RBS (Scherer, et al., Nucleic Acids Research, 8, 3895 (1980)), med et 250 bp Bgl II - Hae III-fragment som inneholder PT-promoteren og innføre sammenkoplingsproduktet i pRC2 slik som vist i fig. 9.

Det ble også konstruert P Li-ekspresjonsvektorer som inneholdt immuninterferon- (IFI) genet fra plasmid pHIT3709

fra eksempel 1 ovenfor slik som vist i de følgende eksemplene.

Eksempel 6

Et 900 bp BstNl-fragment ble isolert fra pHIT3709 som inneholder 430 bp kodende sekvens for IFI og 4 70 bp av det 3'-ikke-kodende område. På dette fragmentet er sekvensene for "signal"-delen av IFI og codonene for de 3 første aminosyrene i det antatt komplette proteinet ikke tilstede. For å gjenopprette de tre manglende codonene og for å til-veiebringe et initierende Met-codon, ble det fremstilt syntetiske oligonukleotider som ble koplet til det 900 bp store fragmentet (se fig. 10). Det syntetiske segmentet omdannet begge BstNl-endene til EcoRl-ender. Det erholdte fragmentet ble klonet inn i vektor pRC22 som var blitt innskrenket med EcoRl. Orientering av innskuddet ble bestemt ved restrik-sjonsanalyse med Bgl I som kutter innenfor det 3'-ikkekodende området.

pRC22-vektoren som inneholder IFI-genet (betegnet pRC22/IFI-900) ble sekvensert over promoter-gensammenkopling-en for å sikre at alle sammenkoplingstrinnene oppsto som for-ventet. (Se fig. 10).

Som prøve på ekspresjon av IFI-genet ble stamme RRI (pRK248cIts, pRC22/IFI-900) dyrket i M9-glukosemedia ved 30°C til 3 - 4 x 10 8 celler/ml og deretter indusert ved 42 oC i 1 time. Før induksjonen ble ytterligere glukose og casamino syrer tilsatt til hhv. 1,0 og 0,5%. En 10 ml prøve ble tatt ut, cellene ble samlet opp ved sentrifugering og resuspendert i 0,1 ml 50 mM tris (pH 7,4), 10% sukrose og suspensjonen ble hurtig frosset ned i et tørris/etanolbad. Cellene ble tint opp ved 20°C, deretter overført til et isbad. Det ble tilsatt NaCl inntil 100 mM, EDTA til 10 mM, spermidin inntil 20 . mM og lysozym inntil 200 yg/ml. Blandingen ble holdt på is 1 4 5 minutter og deretter inkubert ved 3 7°C i 2 minutter. Cellerester ble fjernet ved sentrifugering og supernatanten ble analysert for IFI-aniviral aktivitet på WISH-celler. Dette innledende eksperimentet ga et utbytte på 1280 enheter IFI-aktivitet pr. ml celleekstrakt.

For å fastlegge kinetikken for induksjon, ble fremgangsmåten ovenfor gjentatt. En prøve ble holdt ved 30°C som en kontroll og andre prøver ble tatt etter induksjon ved 42°C i 30, 60, 90, 120 og 180 minutter. Prøvene ble behandlet som beskrevet ovenfor. Resultatene som er vist i tabell 2 indikerer at ved 30°C produseres det ingen aktivitet og at etter induksjon ved 4 2°C når mengden av påvist aktivitet et maksimum ved ca. 90 minutter og avtar deretter gradvis.

Eksempel 7

pRC22/IFI-900 DNA ble ytterligere innskrenket med EcoRl og det 900 bp store fragmentet som inneholder IFI-genet ble isolert og innført i pRC23 som var blitt innskren-

ket med EcoRl (se fig. 11). Den erholdte oppbygging, pRC23/IFI-900, inneholdt en RBS som var vesentlig forskjellig fra den i pRC22/IFI (sammenlign fig. 10 og 11).

For å undersøke ekspresjon av IFI-genet, ble stamme RRI (pRK248cIts, prC23/IFI-900) dyrket i M9-glukosemedia ved

o 8

30 C inntil 3 - 4 x 10 celler pr. ml, deretter indusert ved 42°C i 1 time. Før induksjon ble ytterligere glukose og casaminosyrer tilsatt inntil hhv. 1,0 og 0,5%. En prøve på 10 ml ble tatt ut, cellene ble samlet opp ved sentrifugering og resuspendert i 0,1 ml 50 mM tris (pH 7,4), 10% sukrose og suspensjonen ble hurtig frosset ned i et bad av tørris og etanol. Cellene ble tint opp ved 20°C, deretter overført til et isbad. NaCl ble tilsatt inntil 100 mM, EDTA inntil 10 mM, spermidin inntil 20 mM og lysozym inntil 1200 yg/ml. Blandingen ble holdt på is i 45 minutter og deretter inkubert ved 3 7°C i 2 minutter. Cellerester ble fjernet ved sentrifugering og supernatanten ble analysert med hensyn på IFI-anti-viral aktivitet på WISH-celler. pRC23/IFI når anvendt til å transformere E. coli-stammen. RRI, produserte ca. fire ganger høyere aktivitet enn pRC22/IFI, som vist i tabell 3.

Eksempel 8

pRC23/IFI ble ytterligere innskrenket med EcoRl under betingelser som resulterte i at bare ett av to steder ble kuttet. De erholdte molekylene ble deretter behandlet med Pol I "Klenow" for å fylle igjen EcoRl-endene. De butte

endene ble koplet sammen med T DNA-ligase og DNA-en ble brukt til å transformere RRI(pRK248cIts). Transformantene ble sortert etter tap av EcoRl-stedet i begynnelsen av IFI-genet og to positive transformanter ble funnet. En av disse, betegnet pRC231/IFI-900, ble brukt til å transformere E.coli-stamme RRI til å uttrykke IFI. For å prøve ekspresjonen av IFI-genet ble denne stamme RRI (PpRK248cIts, pRC231/IFI-900) dyrket i M9-glukosemedia ved 30°C inntil 3 - 4 x 10^ celler pr. ml, og deretter indusert ved 4 2°C i 1 time. Før induksjon ble ytterligere glukose og casaminosyrer tilsatt inntil hhv. 1.0 og 0,5%. En prøve på 10 ml ble tatt ut, cellene ble samlet opp ved sentrifugering og resuspendert i 0,1 ml 50 mM tris (pH 7,4), 10% sukrose og suspensjonen ble hurtig frosset .ned i et bad av tørris og etanol. Cellene ble tint opp ved 20°C og deretter overført til et isbad. NaCl ble tilsatt inntil 100 mM, EDTA inntil 10 mM, spermidin inntil 20 mM og lysozym inntil 200 yg/ml. Blandingen ble holdt på is i 45 minutter og deretter inkubert ved 3 7°C i 2 minutter. Cellerester ble fjernet ved sentrifugering og supernatanten ble analysert med hensyn på IFI-anti-viral aktivitet på WISH-celler. Resultatene er vist i tabell 3.

Den beskrevne modifikasjon av pRC23/IFI ble ut-formet for å utvide sammenkoplingsområdet fra 6 til 10 bp.

I tilfellet med IFI synes en avstand på 6 bp å være bedre enn 10 bp for ekspresjon av IFI.

Eksempel 9

Menneske-immuninterferon erholdt i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse kan renses ved en fremgangsmåte slik som den følgende: .Alle trinnene utføres fortrinnsvis ved lave temperaturer, fortrinnsvis under værelsestemperatur og helst ved ca. 4°C. Materialet som inneholder IFI, f.eks. supernatant-væsken i eksempel 4, kan i rekkefølge filtreres gjennom et 3 mikron og deretter et 0,22 mikron "Nalgene"-filter.

I det neste trinnet.benyttes det en svak kationut-bytter væskekromatografikolonne med høy yteevne. CM 200-harpiks, 10 m (Separation Industries) pakkes i en 25 cm x 0,46 cm I.D.-kolonne og prepareres for bruk ved å rengjøre med 2 M KCl og på nytt ekvilibrere med 24 mM fosfatbuffer,

pH 7,5, eller med destillert, deionisert vann (som bør brukes gjennom hele denne fremgangsmåten), filtratet fra 0,2 mikrofilteret fortynnes med en like stor mengde vann og pumpes ved 1,5 ml/min. over på CM-kolonnen. Kolonnen vaskes så med 25 mM kaliumfosfat, pH 7,5, inntil proteinet i avløps-væsken fra kolonnen er tilbake på bakgrunnsnivå, bestemt ved automatisk overvåking av kolonnen med fluoreskamin. Kolonnen eluereres deretter med 0,5 ml/min. med en gradient av økende KCl (0 - 1 M) i 25 mM kaliumfosfatbuffer, pH 7,5.

De aktive fraksjonene fra CM-kolonnen slås sammen og oppkonsentreres på en på forhånd vasket CF 25 filterkjegle (Amicon Corp.). Den konsentrerte oppløsningen (0,5 ml eller mindre) injiseres deretter i en TSK 250 gjennomtrengnings-kolonne med silisiumdioksydgel (30 x 0,75 cm) (Bio-Rad Laboratories), som er ekvilibrert på forhånd, og elueres med 0,3 M KCl, 25 mM kaliumfosfat, pH 7,5, ved 25 ml/time. Fraksjoner samles opp etter intervaller på 1 minutt. Interferonaktivitet vil svare til en proteintopp. Homogent immuninterferon kan erholdes i én eller flere fraksjoner på dette trinnet, avhengig av utgangsmaterialet og effektiviteten på de tidligere trinnene. Om nødvendig kan urene fraksjoner på nytt konsentreres og på nytt kromatograferes på TSK- eller CM-kolonnen for å oppnå homogenitet.

Den foreliggende oppfinnelse har gjort det mulig

å fremstille menneske-immuninterferon eller en ekvivalent til denne på en økonomisk måte. Interferonet er nyttig som et antiviralt eller antitumormiddel.

Claims

1. Fremgangsmåte for å fremstille DNA som inneholder en basesekvens med formelen:

hvor X er TAA, TGA eller TAG, karakterisert ved å (a) dyrke menneske-immuninterferon-utskillende celler, (b) isolere en messenger RNA som koder for menneske-immuninterferon fra cellene, (c) syntetisere en enkeltkjedet, komplementær DNA ved bruken av den nevnte messenger RNA og omvendt transkriptase, (d) omdanne den komplementære DNA til en dobbeltkjedet DNA, (e) innføre den dobbeltkjedede DNA i et plasmid, (f) transformere en vert med det rekombinante plasmidet, (g) isolere et plasmid som inneholder den forønskede DNA fra vertkulturen, (h) om ønsket, ta den klonede DNA ut av plasmidet, og (i) om ønsket, knytte den klonede DNA til stedet etter en promoter i en vektor.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den forønskede DNA koder for polypeptidet:

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den forønskede DNA koder for et polypeptid som er ekvivalent med immuninterferonpolypeptidet når det gjelder immunologiske eller biologiske virkninger.

4. Fremgangsmåte ifølge kravene 1-3, karakterisert ved at den forønskede DNA danner en del av et rekombinant DNA-molekyl.

5. Fremgangsmåte ved fremstilling av en forbindelse med formelen:

hvor Y er (a) hydrogen, (b) Met eller (c) Met Lys Tyr Thr Ser Tyr Ile Ala Phe Gin Leu Cys Ile Val Leu Gly Ser Leu Gly, karakterisert ved å dyrke en vert som er transformert med en DNA som inneholder en basesekvens med formelen:

hvor X er TAA, TGA eller TAG, akkumulere forbindelsen i dyrkningsvæsken og utvinne den.