NO164664B - Rekombinante dna-molekyler som omfatter en dna-sekvens som koder for et polypeptid av interferon alpha (ifn-alfa) type. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører rekombinante DNA-molekyler. Mer spesielt vedrører oppfinnelsen DNA-sekvenser uttrykt i passende vertsorganismer. De rekombinante DNA-moelkyler som er vist, er særpreget ved at de koder for polypeptider av interferon (IFN) cx-type og omfatter de DNA-sekvenser som er angitt i krav 1 * s karakteriserende del.

Som det vil fremgå av det etterfølgende, kan DNA-sekvensene anvendes ved fremstilling av polypeptider som er nyttige som antivirale og antitumor eller antikreftmidler og -metoder.

I den etterfølgende beskrivelse vil den interferonnomenkla-tur som er publisert i Nature, 286, side 2421 (10. juli 1980) bli anvendt. Denne nomenklatur erstatter den som er anvendt i den prioritetsbegrunnende søknad, eksempelvis er IF nå betegnet IFN og leukocyttinterferon er nå betegnet med IFN-a.

Det er kjent at to klasser interferoner ("IFN") eksisterer. Interferoner i klasse I er små, syrestabile (glyko)-proteiner som gjør celler motstandsdyktige mot viral infeksjon (A. Isaacs and J. Lindenmann, "Virus Interference I. The Interferon", Proe. Royal Soc. Ser. B., 147, sidene 258-67

(1957) og W. E. Stewart, II, The Interferon System, Springer-Verlag (1979) (i det etterfølgende betegnet med "The Interferon System")). Fordi i en viss grad cellespesifikke (The Tnterferon System ) IFNer ikke er virusspesifikke, beskytter IFNer cellene mot et bredt spektrum av vira.

Human interferoner ("HuIFN") er klassifisert i tre grupper, nemlig a, 3 og y. HuIFN-ct eller leukocyttinterf eron produseres i menneske leukocyttceller sammen med mindre mengder HuIFN-3 (fibroblast interferon) i lymfoblastoidcellene. HuIFN-a er renset til homogenitet og karakterisert (eks. M. Rubenstein et al., "Human Leukocyte Interferon: Production, Purification To Homogeneity And Initial Characterization" Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 76, sidene 640-44 (1979)). ■ Det er heterogent med hensyn til størrelse antageligvis pågrunn av dets karbohydratkjerne. To komponenter er beskrevet, en med molekylvekt i området 21000-22000 og den andre i området 15000-18000. Komponenten med lavere molekylvekt er rapportert å representere en ikke-glykosylert form. Den mindre form av HuIFN-a er også rapportert å bibeholde alt eller mesteparten av dets HuIFN-a aktivitet (W.E. Stewart, II et al. , "Effeet Of Glycosylation Inhibitors On The Production And Properties Of Human Leukocyte Interferon", Virology, 97, sidene 473-76 (1979)). En del av aminosyresekvensen for HuIFN-a fra lymfoblastceller og deres aminosyresammensetning er rapportert (K.C. Zoon et al., "Amino Terminal Sequence Of The Major Component Of Human Lumphoblastoid Interferon", Science, 207, sidene 527-28 (1980) og M. Hunkapiller and L. Hood, personlig kommunikasjon (1980)).

HuIFN-a er også rapportert å eksistere i flere forskjellige former, se eksempelvis britisk patentsøknad nr. 2.037.296A. Disse former synes å adskille seg fra hverandre både strukturelt og fysiologisk. Ingen akseptert nomenklatur er god-kjent for disse former av HuIFN-a. Derfor vil i den etter-følgende beskrivelse hver form bli betegnet med et tall etter den generelle HuIFN-a betegnelse, eksempelvis HuIFN-al eller HuIFN3.

HuIFN-a kan(som mange andre humanproteiner,også være poly-morft. Derfor kan spesielle individuelle celler danne HuIFN-a typer innen den mere generelle HuIFN-a gruppe eller former innen denne gruppe som er fysiologisk tilsvarende/men strukturelt noe forskjellig fra gruppen eller formen hvorav den er en del. Derfor, selv om proteinstrukturen av HuIFN-a generelt er veldefinert,kan spesielle individer produsere en HuIFN-a som ubetydelig variant av denne, idet denne arvelige variasjon trolig er mindre alvorlig enn forskjellen mellom de forskjellige former av HuIFN-a.

HuIFN er vanligvis ikke påvisbar i normale eller sunne celler (The Interferon System, sidene 55-57). I stedet vil proteinet fremstilles som følge av at cellen utsettes for en IFN fremkaller (inducer). IFN-fremkallere er vanligvis vira^men kan også være av ikke-viral karakter', såsom naturlig eller syntetisk dobbeltkjedet RNA, intracellulære mikrober, mikro-bielle produkter og forskjellige kjemiske midler. Mange for-søk er utført for å utnytte disse ikke-virale fremkallere for å gjøre menneskeceller resistente mot viral infeksjon (S. Baron og F. Dianzani (eds.), Texas Reports On Biology And Medicine, 35 ("Texas Reports"), sidene 528-40 (1977)). Disse forsøk har ikke vært særligvellykkede. I stedet er nå foretrukket anvendelse av eksogent HuIFN som sådant.

Interferonterapi mot vira og tumorer eller kreft er utført

i forskjellige doseområder under forskjellige administra-sjonsmåter (The Interferon System, sidene 305-321). Eksempelvis har interferon blitt administrert effektivt oralt eller ved inokulering såsom intravenøs, intramuskulær, in-tranasal, intradermal og subkutan inokulering, og i form av øyedråper, salver og dusjer. Det administreres en til tre ganger daglig i doser på 10 4 -10 7enheter. Den terapeutiske behandling kan være avhengig av pasienten og den tilstand som behandles. For eksempel blir virusinfeksjoner vanligvis behandlet med doser en eller to ganger daglig over flere dager til flere uker og tumorer og kreft blir vanligvis behandlet med daglige eller flere daglige doser over flere måneder eller år. Den mest effektive terapi for en spesiell pasient må naturligvis bestemmes av den behandlende lege som vil ta i betraktning velkjente faktorer med hensyn til syk-dommens utvikling, tidligere terapi og pasientens respons til interferon ved valg av administrasjonsmåte og dosemengde.

Som antiviralt middel er HuIFN anvendt for behandling av

de følgende:luftveisinfeksjoner (Texas Reports, sidene 486-96), herpes simplex keratitis (Texas Reports, sidene 497-500, akutt hemorrhagic conjunctivitis (Texas Reports, sidene 501-10), varicella zoster (Texas Reports, sidene 511-15), cytomegalovirus infeksjon (Texas Reports, sidene 523-27),

og hepatitis B (Texas Reports, sidene 516-22). Se også The Interferon System, sidene 307-19. Imidlertid vil anvendelse i stor skala av IFN som antiviralt middel kreve større mengder IFN enn det som til nå har vært tilgjengelig.

HuIFN har også andre effekter i tillegg til dens antivirale virkning. For eksempel så antagoniserer den effekten av kolonistimulerende faktor, inhiberer"vekst av hemopoetisk-kolonidannende celler og virker inn på den normale differen-siering av granulocytter og makrofage forløpere (Texas Reports, sidene 343-49). Den inhiberer også erytroid differen-siering i DMSO-behandlede Friend leukemiceller (Texas Reports, sidene.-.42Q.-28-)-. HuIFN kan også spille en-rolle ved reguler-ing av immunresponsen. Avhengig av dosen og anvendelsestids-punktet i forhold til et antigen,kan HuIFN-a både være im-munopotensierende og immunoundertrykkende in vivo og in vitro (Texas Reports, sidene 357-69). I tillegg er det observert at spesielt sensitiserte lymfocytter vil danne HuIFN-a etter kontakt med et antigen. Slik antigenindusert HuIFN-a kan derfor være en regulator for immunresponsen og påvirke både de sirkulerende antigennivåer og cellulær

immunitet (Texas Reports, sidene 370-74). HuIFN er også kjent for å forsterke aktiviteten av drepende lymfocytter og antistoffavhengig cellebetinget cytotoksisitet. (R. R. Her-berman et al., "Augmentation By Interferon Of Human Natural And Antibody Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity", Nature, 277, sidene 221-23 (1979), P. Beverley og D. Knight, "Kil-ling Comes Naturally", Nature, 278, sidene 119-20 (1979), Texas Reports, sidene 375-80). Begge disse typer er sann-synligvis involvert ved immunologisk angrep på tumorceller.

Derfor , i tillegg til anvendelse som human antiviralt middel- så utviser HuIFN potensiell anvendelse ved antitumor- og anti.kreftterapi. (The Interferon System, sidene 319-21).

Det er nå kjent at IFNer påvirker veksten av mange klasser

av tumorer i mange dyr (The Interferon System, sidene 292-304). Lik mange andre antitumormidler synes de mest effektive når de anvendes mot små tumorer. Antitumoreffektene for animalsk IFN er avhengig av dosen og tidspunktet, men er påvist ved konsentrasjoner under toksiske nivåer. Følgelig er mange forsøk og kliniske prøver blitt og er utført for å klarlegge antitumor og antikanseregenskapene for IFNer.

Disse innebefatter behandling av mange ondartede sykdommer såsom osteosarcoma, akutt myeloid leukemi, multippel myeloma og Hodgkin's sykdom (Texas Reports, sidene 429-35). I tillegg er HuIFN nylig rapportert å bevirke lokal tumorsuppre-sjon når det injiseres i subkutane tumornoduler i melanoma- og brystcarcinoma-påvirkede pasienter (T. Nemoto et al., "Human Interferons And Interalesional Therapy Of Melanoma And Breast Carcinoma", Amer. Assoc. For Cancer Research,

Abs. nr. 994, p. 246 (1979)). Selv om resultatene av disse kliniske forsøk er oppmuntrende^har antitumor og antikreft anvendelse av IFN blitt alvorlig hemmet på grunn av mangel

på . tilstrekkelig tilførsel av renset IFN. I dag fremstilles HuIFN-a enten ved vekst av menneskeceller i vevkultur eller fra humanleukocytter eller oppsamlet fra blodgivere. Det er rapportert 2,6 x IO<9> IU rå HuIFN-a erholdt fra 800 1 kultiverte Namalvaceller (P.J. Bridgen et al., supra). I meget store blodsentra, eksempelvis det finske Røde Kors-senter i Helsingfors^er den årlige produksjonskapasitet ca. 1011 IU rå HuIFN-a. Da dosen typisk er 3 x IO<6> IU pr. pasient pr. dag,er disse kilder ikke tilstrekkelig til å tilveiebringe de nødvendige kommersielle mengder HuIFN-a. Derfor er fremstilling av HuIFN-a ved hjelp av andre fremgangsmåter ønskelig.Som følge av at den spesifike aktivitet av IFN-a er

8 9

meget høy, av størrelsesorden 4 x 10 til 10 IU/mg,er mengden av HuIFN-a for kommersiell anvendelse liten. For eksempel vil 100 g ren HuIFN-a gi 3-30 millioner doser.

Nylige fremskritt innen molekylærbiologien har gjort det mulig å introdusere DNA-koding for spesifikke ikke-bakterielle eukaryotiske proteiner i bakterieceller. Generelt for D.NA andre enn de fremstilt via kjemisk syntese^ vil konstruksjon av slike rekombinante DNA-molekyler omfatte trinnene å fremstille en enkeltkjedet DNA-kopi (cDNA) av e renset bud-bringer RNA (mRNA) mal (template) for det ønskede protein, omdanne cDNA til den dobbeltkjedede DNA, forbinde den erholdte DNA i et passende sted i en passende kloningsbærer for å gi et DNA-molekyl og transformere en passende vert med det rekombinante DNA-molekyl. En slik transformering kan påvirke verten slik at den produserer det ønskede protein.\

Flere ikke-bakterielle proteiner og gener er erholdt i

E.; coli ved anvendelse av rekombinant DNA-teknologi. Disse innebefatter et protein som utviser rotte proinsulin antigendeterminanter (L. Villa-Komaroff et al.,"A Bacterial Clone Synthesizing Proinsulin", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 75, sidene 3727-31 (1978)), rotteveksthormon (P.H. Seeburg et al., "Synthesis Of Growth Horraone By Bacteria", Nature, 276, sidene 795-98 (1978)), mus dihydrofolat reduktase (A.C.Y. Chang et al., "Phenotypic Expression In E. coli Of A DNA Sequence Coding For Mouse Dihydrofolate Reductase", Nature, 275, sidene 617-24 (1978)), human somatostatin (K. Itakura et al., "Expression In Escherichia coli Of A Chemically Synthesized Gene For The Hormone Somatostatin", Science,

198, sidene 1056-63 (1977)), europeiske patentsøknader nr. 0.001.929, 0.001,930 og 0.001.931, samt beslektede søknader i andre land), A og B polypeptidkjeder i humaninsulin (D. V. Goeddel et al., "Expression In Escherichia coli Of Chemically Synthesized Genes For Human Insulin", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 76, sidene 106-10 (1979), samt de europeiske og beslektede patentsøknader som ovenfor nevnt), antigener for human hepatitt B virus (C. J. Burrell et al., "Expression In Escherichia coli: Of Hepatitis B Virus DNA Sequences Cloned In Plasmid pBR322", Nature, 279, sidene 43-7 (1979) og M. Pasek et al., "Hepatitis B Virus Genes And Their Expression In E. coli", Kature, 282, sidene 575-79 (1979)), human veksthormon (D. V. Goeddel et al., "Direct Expression In Escherichia coli Of A DNA Sequence Coding For Human Growth Hormone", Nature, 281, sidene 544-51 (1979)), SV40 t antigen (T. M. Roberts et al., "Synthesis Of Simian Virus 40 t Antigen In Escherichia coli", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 76, sidene 5596-600 (1979)), og human fibroblast interferon (Hu IFN-3) (T. Taniguchi et al., "Construction And Identification Of A Bacterial Plasmid Containing The Human Fibroblast Interferon Gene Sequence", Proe. Japan Acad., 55, Ser. B, sidene 464-69 (1979), samt personlig kommunikasjon 1980).

Imidlertid er ingen av disse rekombinante DNA rettet mot HulFN-a. Dette er det problem som foreliggende oppfinnelse vedrører. Dets løsning er ikke muliggjort, slik som for de ovenfor beskrevne rekombinante DNA-systemer ved tilgjengelighet av sekvensinformasjon som er nødvendig for å fremstille et syntetisk gen,(såsom somatostatin) eller av en celletype eller virus som er rik på en spesiell DNA sekvens (eksempelvis hepatitt viralantigen) eller mRNA typer(eksempelvis rotteinsulin) som muliggjør fremstilling og identifisering av bakteriekloner inneholdende det ønskede hybrid DNA eller et system som muliggjør valg av E. coli verter som uttrykker det ønskede protein (eksempelvis musedihydrofolate reduktase). Heller ikke lettes problemet ved rapportering av et plasmid som er sagt å inneholde en DNA-sekvens som hybridiserer til en mRNA fra poly(A) RNA, hvilket mRNA frem-mer HuIFN-0 aktivitet i oocytter (eksempelvis fibroblast-interferon). Heller ikke er løsningen ifølge oppfinnelsen rettet mot det tilsynelatende forslag i Research Disclosure No. 18309, sidene 361-62 (1979) for fremstilling av rent eller i det vesentlige rent HuIFN-omRNA før kloning av HuIFN-a genet.

Endelig bør det forstås at valg av en DNA-sekvens eller konstruksjon av et rekombinant DNA-molekyl som hybridiserer til mRNA fra polyA RNA, hvilket mRNA danner HuIFN aktivitet i oocytter, ikke er tilstrekkelig for å demonstrere at DNA-sekvensen eller hybridinnskuddet i det rekombinante DNA-molekyl korresponderer til HuIFN. I stedet kan kun fremstilling av et polypeptid som utviser en immunologisk og biologisk aktivitet for HuIFN virkelig demonstrere at den valgte DNA-sekvens eller det konstruerte rekombinante DNA-molekyl korresponderer til HuIFN. Viktig er det ytterligere at kun etter at HuIFN aktivitet er vist via DNA-sekvensen, det rekombinante DNA-molekyl eller tilhørende sekvens, kan denne anvendes for å velge andre sekvenser tilsvarende HuIFN, i henhold til foreliggende oppfinnelse.

Det vil derfor forstås av det foregående at problemer ved-rørende fremstilling av HuIFN-a ved anvendelse av rekombinant DNA-teknologi adskiller seg vesentlig fra de ovenfor beskrevne prosesser. I foreliggende tilfelle må det finnes en spesiell DNA-sekvens med ukjent struktur, dvs. koding for uttrykket HuIFN-a i en passende vert,oq denne må separe-res fra en meget kompleks blanding av DNA-sekvenser for at den kan. anvendes ved fremstilling av HuIFN-a. Ytterligere blir dette lokaliserings- og separasjonsproblem vanskelig-gjort ved den uhyre lave konsentrasjon av den ønskede DNA-sekvens i den komplekse blanding og mangel på effektive midler for raskt å analysere de mange DNA-sekvenser i blandingen for å velge og separere-den ønskede sekvens.

Foreliggende oppfinnelse løser problemene med lokalisering og separering av DNA-sekvenser som koder for uttrykket HuIFN-oc i en passende vert og derved tilveiebringer DNA-sekvenser og rekombinante DNA-molekyler, ved hjelp av hvilke en vert transformeres til å produsere et polypeptid som utviser en immunologisk eller biologisk aktivitet tilsvarende den for human leukocyttinterferon.

Som følge av foreliggende oppfinnelse er det mulig å erholde et polypeptid som utviser en HuIFN-a immunologisk eller biologisk aktivitet for anvendelse som antivirale, antitumor eller antikansermidler eller metoder. Oppfinnelsen tillater også fremstilling av disse polypeptider i mengder og ved hjelp av metoder som opptil nå ikke har vært tilgjengelige.

Som det vil forstås av den etterfølgende beskrivelse, vil DNA-sekvensene og de rekombinante DNA-molekyler ifølge oppfinnelsen være i stand til å rette produksjonen, i en passende vert, mot fremstilling av et polypeptid som utviser en HIFN-a immunologisk eller biologisk aktivitet. Replisering av disse DNA-sekvenser og rekombinante DNA-molekyler i en passende vert muliggjør også fremstilling av store mengder gener som koder for disse polypeptider. Molekylærstrukturen og egenskapene for disse polypeptider og gener kan lett bestemmes. Polypeptidene og genene er nyttige, enten slik de er produsert i en vert eller etter passende derivatomdann-else eller modifisering, i blandinger og anvendelse i metoder for å påvise og forbedre produksjonen av disse produktene i seg selv og for anvendelse som antivirale og antitumor eller antikansermidler og fremgangsmåter hvori slike midler anvendes.

Foreliggende fremgangsmåte adskiller seg som tidligere nevnt fra de kjente fremgangsmåter, ved at i henhold til foreliggende fremgangsmåte og i motsetning til de ovenfor omtalte fremgangsmåter innebefatter fremstilling og valg av en DNA-sekvens og rekombinante DNA-molekyler som inneholder passende DNA-sekvenser som koder for i det minste et polypeptid som utviser en HuIFN-a immunologisk eller biologisk aktivitet.

Det vil forstås av det foregående at det grunnleggende trekk ved foreliggende oppfinnelse er tilveiebringelse av en DNA-sekvens som er særpreget ved de trekk som er angitt i krav l<*>s karakteriserende del. Fig. 1 viser skjematisk en utførelsesform av foreliggende fremgangsmåte ved fremstilling av en blanding av rekombinante DNA-molekyler, som er særpreget ved innskutte DNA-sekvenser som koder for polypeptidene av IFN-oc-type. Fig. 2 viser skjematisk den initiale kloneutsiktningsprosess. Fig. 3 viser skjematisk en utførelsesform av kloneutsikt-ningsprosessen under anvendelse av DNA-sekvenser i henhold til oppfinnelsen. Fig 4 viser et restriksjonskart for en av vektorene ifølge oppfinnelsen, den absolutte posisjon for hver av restrik-sjonsstedene for dette klon er ikke vist. Figurene 8-10 viser mere absolutte posisjoner for disse restriksjonsposisjoner. Fig 5 viser skjematisk en fremgangsmåte for å bestemme orienteringen for et DNA-innskudd i et rekombinant DNA-molekyl ifølge oppfinnelsen. Fig. 6 viser den partielle nukleotidsekvens for visse kloningsvektorer som er nyttige i henhold til oppfinnelsen. Fig. 7 viser resultater for en "Sephadex G-100" fraksjone-ring av en supernatant fremstilt fra en bakteriekultur transformert med en vektor ifølge oppfinnelsen. Figurene 8-10 viser nukleotidsekvensen for et DNA-innskudd i et rekombinant molekyl ifølge oppfinnelsen. Sekvensen er nummerert fra nukleotidet etter polyG 5<1> hale til nukleotidet før polyA restene og polyC 3' halene. Nukleotidene 57-125 representerer eh signalsekvens og nukleotidene 126-62 6 representerer det ferdigutviklede interferon og stopp-kodonet.

Aminosyresekvensen for signalsekvensen er vist ovenfor dets nukleotidsekvens med mindre bokstaver, og aminosyresekvensen for det ferdigutviklede interferon er vist over dets nukleotidsekvens med store bokstaver. Forskjellige restriksjonsendonuklease-gjenkjenningsposisjoner i dette gen er også angitt i figurene 8-10. Disse posisjoner er mere absolutt lokalisert enn de som er vist i fig. 4. Fig. 11 er en skjematisk sammenligning av restriksjonskartene for de to DNA-innskudd av rekombinante DNA-molekyler ifølge oppfinnelsen. Fig. 12-16 viser nukleotidsekvenser for to DNA-innskudd for rekombinante DNA-molekyler ifølge oppfinnelsen. Sekvensene er nummerert fra nukleotidet etterfølgende polyG 5' hale og til nukleotidet før polyA restene og polyC 3' haler. Aminosyresekvensene for signalsekvensen i hver av disse innskudd er vist over deres respektive nukleotidsekvenser med små bokstaver og aminosyresekvensen for det ferdigutviklede interferon er angitt over dets nukleotidsekvens med store bokstaver. Fig. 17 viser et delrestriksjonskart av Z-pBR322(Pst)/HcIF-11- 206 og rekkefølgestrategien som anvendes for å bestemme" nukleoti/isekvensen av Hif-II-206 fragmentet vist i figurene 12- 16. Fig. 18 viser et delvis restriksjonskart av en serie hybridfa-ger som hybridiserer til Hif-2h fragmentet. Fig. 19 viser et delrestriksjonskart av et hybridinnskudd i Z-pBR322Pst/HchrIF-35HBa og rekkefølgestrategien som anvendes for å bestemme dets nukleotidsekvens. Fig. 20-23 viser nukleotidsekvensen for HchrIF-35HBo fragmentet og aminosyresekvensen avledet derav. Fig. 24 viser deltilknytningskart for HuIFN-a beslektede gener. Pilene viser områder som danner R-løkker som indu-serer leukocytt poly(A) RNA. Den stiplede boks (chr-16) indikerer at denne sekvens var dedusert fra "blotting" eksperi-menter, men ikke var åpenbar ved R-løkkekartlegging. Fig. 25 er et skjematisk riss av konstruksjonen av plasmid C8-IFN-ctl. Fig. 26 er et skjematisk riss av konstruksjonen av plasmidet LAC-AUG(a2). Fig. 27 viser konstruksjonen av det AUG initierende kodon og CYS initialkodonet i konstruksjonen av LAC-AUG(a2). Fig. 23 er et skjematisk riss av konstruksjonen av plasmidet C8-IFN-cx2 og hybridmolekylene I, II, III og IV. Fig. 29-32 viser nukleotidsekvensen og aminosyresekvensen kodet derav for IFN-a4b og detssignalsekvens.

Oppfinnelsen skal beskrives nærmere i det etterfølgende og i denne beskrivelse anvendes de følgende betegnelser: Nukleotid, en monomerenhet av DNA eller RNA bestående av en sukkerrest (pentose), et fosfat og en nitrogenholdig hetro-cyklisk base. Basen er forbundet til sukkerresten via gly-kosidkarbonet (l<1> karbonet i pentosen) og kombinasjonen av basen og sukkeret er et nukleotid. Basen karakteriserer nukleotidet. De fire DNA-baser er adenin ("A"), guanin ("G"), cytosin ("C"), og tymin ("T"). De fire RNA-baser er A, G, C og uracil ("U" ).

DNA- sekvens, en lineær serie av nukleotider forbundet til hverandre via fosfodiesterbindinger mellom 3' og 5' karbon-ene i tilstøtende pentoser.

Kodon, en DNA-sekvens av tre nukleotider (en triplett) som via mRNA koder for en aminosyre, et translasjonsstartsignal eller et translasjonsstoppsignal. For eksempel koder nukleotidtriplettene TTA, TTG, CTT, CTC, CTA og CTG for aminosyren leucin ("Leu"), TAG, TAA og TGA er translasjons-stoppsignaler og ATG er et translasjonsstartsignal.

Leseramme, grupperingen av kodoner under overføring av mRNA til aminosyresekvenser. Under overføring må den riktige leseramme bibeholdes. For eksempel kan sekvensen GCTGGTTGT AAG omsettes til tre leserammer eller faser, hver som gir en forskjellig aminosyresekvens:

Polypeptid, en lineær serie av aminosyrer forbundet med hverandre ved peptidbindinger mellom a-amino og karboksygruppene av tilstøtende aminosyrer.

Genom, alt DNA av en celle eller virus. Det inn-befatter blant annet strukturelle gener som koder for polypepotidene av substansen, såvel som operator, promoter og samspillsek-venser såsom Shine-Dalgarno sekvenser.

Strukturelt gen, en DNA-sekvens som koder via sin "budbrin-ger" RNA ("mRNA")-sekvens for aminosyrer som er karakteristiske for et spesifikt polypeptid.

Transkripsjon, prosessen for dannelse av mRNA fra et strukturelt gen.

Translasjon, prosessen ved fremstilling av et polypeptid fra mRNA.

Ekspresi on. prosessen som et strukturelt gen undergår for å danne et polypeptid. Dette er en kombinasjon av transkripsjon og translasjon.

Plasmid, en ikke-kromosom dobbeltkjedet DNA-sekvens omfattende et intakt "replicon", slik at plasmidet dupliseres i vertscellen. Når plasmidet plasseres inne i en encelleorga-nisme vilorganismens egenskaper forandres eller omdannes som følge av plasmidets DNA. For eksempel vil et plasmid som bærer et gen for tetracyklinresistens (Tet<R>), omdanne en celle som tidligere var følsom for tetracyklin til en som er resistent mot tetracyklin. En celle omdannet av et plasmid kalles en "transformant".

Fag eller bakteriofag. bakteriell virus, hvorav mange inn-befatter DNA-sekvenser innkapslet i en proteinomhylning eller en proteinkappe ("capsid").

Klonin<g>sbærer. et plasmid, fag DNA eller andre DNA-sekvenser som er i stand til å duplisere seg i en vertscelle og er særpreget ved en eller et lite antall endonukleasegjenkjen-nende posisjoner, i hvilke slike DNA-sekvenser kan settes inn på en bestemt måte uten at det oppstår tap av DNA<1>s nød-vendige biologiske funksjon, dvs. duplisering, produksjon av tilsvarende proteiner eller tap av promoter eller bind-ingsposisjoner, og som inneholder en markør som er egnet for anvendelse ved identifikasjon av omdannede celler, eks-

empelvis tetra yklinresistens eller ampicillinresistens.

En kloningsbærer kalles ofte en vektor.

Kloning, prosessen for å erholde en populasjon av organismer eller DNA-sekvenser avledet fra en slik organisme eller sekvens ved aseksuell reproduksjon.

Rekombinant DNA- molekyl eller hybrid DNA, et molekyl som består av segmenter av DNA fra forskjellige genomer som er forenet ende-til-ende utenfor levende celler og som har evnen til å infisere visse vertsceller og bibeholdes deri.

Ekspresjons- kontro11sekvens, en nukleotidesekvens som kontrollerer og regulerer ekspresjon av strukturelle gener når den er operativt forbundet med disse gener. De innebefatter lac-systemet, trp-systemet, hovedoperator- og promotorom-rådene for fag , kontrollområdet for fd kappeproteinet og andre sekvenser som er kjent for å kontrollere expresjonen av gener av prokaryolytiske eller eukaryolytiske celler og deres vev.

Under henvisning til fig. 1 er det vist skjematisk en ut-førelsesform av fremgangsmåten ved fremstilling av en blanding av rekombinante DNA-molekyler hvorav visse er særpreget ved innskutte DNA-sekvenser som koder for polypeptider som utviser en immunologisk eller biologisk aktivitet tilsvarende den for human leukocyttinterferon.

FREMSTILLING AV POLY( A) RNA- INNEHOLDENDE HUMAN INTERFERON

mRNA ( IFN- amRNA)

Humane leukocytter ble indusert i 5 t ved 37°C med Sendai virus og ekstrahert til å gi en poly(A) RNA-blanding inneholdende human leukocyttinterferon mRNA ("HuIFN-amRNA"). 'Induksjonen ble utført ved hjelp av Cantell-prosedyren (The Interferon System, sidene 130-131 og i henhold til de deri angitte referanser). Poly(A) RNA-blandingen er vist i fig. 1 uten hensyntagen til dens aktuelle proporsjoner. Induserte leukocytter ble oppsamlet og 10ii celler ble resuspendert i 1 1 av en oppløsning inneholdende 8 g NaCl, 0,2 g KC1, 1,15 g Na2HP0^2H20 og 0,2 g KH2P04 oppløst ill vann ("PBS") og tilsatt langsomt under kraftig omrøring til 17 1 20 mM Tris-HC1 (pH 7,5), 1 mM EDTA ("TE buffer"), 2% natriumdodecyl-sulfat ("SDS") i 50 1 skilletrakt. "Seif-digested" Pronase (Calbiochem) ble tilsatt til 200 ug/ml og oppløsningen om-rørt ilt ved romtemperatur. 10^ tellinger/min. ("cpm")

125

av I-globin mRNA ble tilsatt som markør for gjenvinning av poly(A) RNA og for å kontrollere mRNA-nedbrytningen under de etterfølgende trinn. 2M Tris-HCl (pH 9) i en mengde tilsvarende 1/20 av det totale volum ("1/20 vol") ble tilsatt og blandingen ekstrahert under kraftig omrøring med 15 1 om-destillert fenol ved 10 min. 3 1 kloroform ble tilsatt og blandingen omrørt i 5 min. Etter henstand i 3 0 min. for faseseparasjon ble den vandige fase gjenvunnet og igjen ekstrahert med fenol og kloroform. Den resulterende vandige fase på ialt 19,1 1 ble kombinert med 60 g SDS. Nukleinsyrer ble presipitert fra den vandige fase med 1/10 vol 3M natriumacetat (pH 5,5) og 2 vol etanol.

Etter lagring over natten ved -20°C ble det fibrøse nuklein-syrepresipitat fjernet ved filtrering gjennom en plasttesil. Dette materialet ble deretter omrørt med 200 ml TNE (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl, 5 mM EDTA) inneholdende 0,5 % SDS. Det ble slutligen oppløst ved tilsetning av ytterligere 350 ml av denne oppløsning. Det ikke-fibrøse presi-pitat ble oppsamlet ved sentrifugering ill "Sorvall" flas-ker i en "Sorvall RC-3" sentrifuge i 15 min. ved 5000 omdr./ min. og gjenoppløst i 350 ml TNE inneholdende 0,5 % SDS.

De to TNE-oppløsninger ble kombinert, ekstrahert 3 ganger med 1 vol fenol, 3 ganger med 1/2 vol eter og 3 ganger med 1 vol eter. RNA-gjenvinningen fra den vandige fase utgjorde totalt 775 mg, bestemt ved adsorpsjon ved 260 nm.

Isolering av poly(A) RNA-blandingen ble oppnådd ved gjentatte satsvise adsorpsjoner til oligo(dT) cellulose ("type 7", P-L Biochemicals, Inc.). 2,7 g oligo(dT) cellulose ble tilsatt til 500 ml, dvs. ca. halvparten av den ovenfor beskrevne RNA-inneholdende-oppløsning. Etter omrøring i 1 time ved romtemperatur for å tilveiebringe adsorpsjon av poly(A) RNA til oligo(dT) cellulosen, ble cellulosen og blandingen av mRNAer bundet til denne, oppsamlet ved sentrifugering og vasket en gang med 50 ml TNE og en andre, gang med 15 ml TNE. Det bundende poly(A) RNA ble deretter eluert med fem påhverandre følgende vaskinger med 2 ml t^O. Utbyttet var 860 ug poly(A) RNA bestemt ved dets optiske densitet (Fremstilling A). Den supernatante RNA-oppløs-ning fra den første adsorpsjon ble underkastet to ytterligere adsorpsjonscykler på samme måte som beskrevet ovenfor. Den andre og den tredje adsorpsjon ga henholdsvis 600 p. q og 170 pg RNA som ble. kombinert (Fremstilling B) .

RNA ble analysert med hensyn til HuIFN-amRNA ved injeksjon inni Xenopus laevis oocytter(The Interferon System), sidene 93-95): RNA ble oppløst i 15 mM Tris-HCl (pH 7,5), 88 mM NaCl ("TNK buffer") til å gi en konsentrasjon på ca. 1 mg/ ml. 50 ni av denne oppløsning ble injesert i hver av 50 oocytter. Oocyttene ble inkubert over natten ved romtemperatur i et "Barth" medium (Gurdon, J. Embryol and Exper. Morph., 20, sidene 401-414 (1968) og Barth, J. Embryol og Exper. Morph., 7, sidene 210-222 (1959)). De inkuberte oocytter ble deretter renset og homogenisert med en Pasteur pipette i et 1,5 ml "Eppendorf" sentrifugerør i 0,5 ml 52 mM Tris glycinbuffer (pH 8,9). Blandingen ble sentrifugert

i 2 min. i en "Eppendorf" sentrifuge og supernatanten ble trukket av og frosset ved -20°C for analyse. IFN-a aktiviteten ble bestemt ved plaque reduksjonsbestemmelsen beskrevet av H. Strander og K. Cantell, "Production Of Interferon By Human Leukocytes In Vitro", Ann. Med. exp. Fenn., 44, sidene 265-73 (1966). En enhet IFN-a reduserer virusplaquer med 50 %. Aktiviteten for et IFN-a preparat uttrykkes i for-

hold til human referanse HuIFN-a 69/19 (International Sym-posium on Standardization of Interferon and Interferon In-ducers, 1969). Alternativt kan bestemmelsen basert på redu-ksjon av den cytopatiske effekt, i det vesentlige slik som beskrevet av W. E. Stewart, II og S. E. Sulkin, "Interferon Production In Hamsters Experimentally Infected With Rabies Virus", Proe. Soc. Exp. Biol. Ned., 123, sidene 650-3 (1966), anvendes bortsett fra at humane CCL-23 celler ble anvendt og infisert med Mengo virus. Oocyttekstraktene utviste 300 IU av IFN-a aktivitet pr. injesert RNA. I senere bestemmelser var inkubasjonstiden for injiserte oocytter 48 timer og kun inkubasjonsmediet ble undersøkt fordi størstedelen av interferonet ble utskilt av oocyttene (A. Colman og J. Mor-ser, "Export Of Proteins From Oocytes Of Xenopus laevis", Cell, 17, sidene 517-26 (1979)). For ytterligere rensning av poly(A) RNA ble tilstrekkelig 0,5 M etylendiamintetra-eddiksyre ("EDTA") tilsatt til poly(A) RNA-preparatet A for å bringe konsentrasjonen til 5 mM EDTA. Den erholdte opp-løsning ble ekstrahert to ganger med et tilsvarende volum TNE mettet med fenol og 5 ganger med tilsvarende volum etere. Oppløsningen ble deretter ført igjennom en 0,1 ml "Chelex-100 Bio-Rad" kolonne, oppvarmet i 90 s ved 100°C og lagt på en 13 ml 5-23% sukkrosegradient inneholdende 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,2 M NaCl. 10000 cpm 5<1->terminert <32>P-merkede DNA-fragmenter fremstilt ved en samtidig behandling av pBR322 med restriksjonsenzymene Hindlll og Pstl (New England Biolabs), ble tilsatt som størrelsemarkører. Sentrifugering ble utført i en "SW40" rotor ved 10°C og 35000 omdr./min. i 16 t. Fraksjoner (0,6 ml) ble oppsamlet med en ISCO gradientkollektor ved 1 ml/min. Fraksjonene ble under-søkt med hensyn til HuIFN-amRNA som beskrevet ovenfor, og deres posisjon relativ til 3 2P-DNA-markørene ble notert for fremtidig referanse. De etterfølgende sentrifugeringer ble HuIFN-amRNA-inneholdende fraksjoner identifisert i forhold til markørene. Fraksjonene med HuIFN-amRNA-aktivitet inneholdt 80 pq av poly(A) RNA. De ble blandet med 2 vol TNE inneholdende 0,5% SDS og 0,02% polyvinylsulfat (i senere fremstillinger ble polyvinylsulfat utelatt) og tilført en 50 } il oligo(dT) cellulosekolonne. Etter vasking av kolonnen som ovenfor beskrevet,ble 4 0 ;ug av RNA-blandingen eluert med 4 vaskinger med 0,6 ml sterilt destillert vann. Etter eta-nolutfelling ble RNA oppløst til å gi 1 mg/ml i 0,5 mM EDTA.

En bestemmelse av HuIFN-amRNA-aktivitet ble utført som ovenfor beskrevet på en del av poly(A) RNA presipitatet. Det utviste en spesifikk aktivitet på 3600 IU interferon/ug injesert RNA. Sukkrosegradienten hadde derfor anriket poly(A) RNA ca. 10 ganger med hensyn til HuIFN-amRNA. I en etterfølgende tilsvarende fremstilling ble en 40 gangers anrikning oppnådd. Preparat B ble renset på tilsvarende måte,og da den utviste'en tilsvarende spesifikk aktivitet som preparat A,ble de to preparater slått sammen.

Det bør understrekes at selve poly(A) RNA produktet erholdt fra sukkrosegradienten inneholdt et meget stort antall forskjellige mRNA'er. Bortsett fra mRNA spesifikk for IFN-a, utgjør de andre mRNA'er uønskede forurensninger (fig. 1). Uheldigvis vil disse forurensende RNA'er oppføre seg tilsvarende som HuIFN-amRNA gjennom den gjenværende klonings-fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen. Derfor vil deres tilstedeværelse i poly(A) RNA føre til en endelig fremstilling av et stort antall uønskede bakteriekloner som inneholder gener som koder for polypeptider andre enn IFN-a. Denne foruren-sning fører til komplekse isolasjonsproblemer ved isolering av de ønskede IFN-a hybridkloner. For tilfellet av IFN-a blir isolasjonsproblemet ytterligere komplisert som følge av mangel på en tilstrekkelig renset prøve av HuIFN-amRNA eller DNA eller deler derav som kan virke som en avskjermingsprobe for identifikasjon av de ønskede kloner. Derfor er avskjerm-ingsprosessen for IFN-a klonene meget tidkrevende og vanskelig Ytterligere fordi kun en meget liten prosentandel av IFN-a klonene i seg selv er forventet å uttrykke IFN-a i en biologisk aktiv eller immunologisk aktiv form/er isoleringen av en aktiv klon en "nål i en høystakk" isolas jonsprosess.

Fordelaktig kan det anvendes rekombinant DNA-teknologi for å tilveiebringe en ytterligere renset prøve av HuIFN-amRNA eller cDNA eller en del derav. Denne rensede mRNA eller cDNA kan anvendes for raskt å avskjerme et stort antall bakteriekloner og derved i vesentlig grad øke sannsynligheten for å isolere en klon som uttrykker IFN-a i en aktiv form.

Poly(A) RNA anriket med hensyn til IFN-amRNA (Preparatene A<+>B)^ ble anvendt som et templat for å fremstille enkeltkjedet komplementært DNA (cDNA) (Fig. 1) (Cf, A. Efstratiadis et al., "Full Length And Discrete Partial Reverse Transcripts Of Globin And Chorion mRNAs", Cell, 4, sidene 367-78 (1975) og deri anførte referanser). 800 ul reaksjonsblandingen inneholdende 40 mM Tris-HCl (pH 7,5), 30 mM NaCl, 5mM MgCl2, 0,5 mM DTT (Cal-Biochem), 20 pg/ml oligo(dT) 12-18 (P&L Biochemicals), 5 mM dGTP (Schwarz), dCTP (Laevosan) og dTTP (Sigma), 5 mM <32>P-dATP (NEN), spesifikk aktivitet 100 000 cpm/nmol), 60 ug/ml poly(A) RNA og 280 enheter fjærfe myeloblastose-virus (AMV) revers transkriptase (gave fra Life Sciences, Inc., St. Petersburg, Florida). Etter inkubasjon i 1 time ved 37°C, ble tilsatt 0,5 M EDTA og 20% SDS (omkrystallisert) til 10 mM EDTA og 0,1% SDS. Blandingen ble ekstrahert med 1 vol fenol (destillert). Fenolfasen ble vasket med 200 ul 200 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA og 0,1% SDS og de vandige faser kombinert. Disse ble ektrahert med et likt volum eter ("Fluka, pro anl.") og kromatografert på en 5 ml "Sephadex G-100 kolonne i TNE. Fraksjoner av 0,1 ml ble oppsamlet ved 0,3 ml/min. Fraksjoner som utviser radioaktivitet,(målt ved Cerenkov stråling) ble kombinert og 3M natriumacetat ble tilsatt til 0,3M. Nukleinsyrene ble presipitert med 2,5 vol etanol. Etter lagring over natten ved -20°C ble prøvene sentrifugert og supernantanten kastet. Presipitatet

ble oppløst i 180 ul destillert vann og overført til et silikonbehandlec "Eppendorf"-rør. 20 ul 5M MaOH ble tilsatt og blandingen holdt ved romtemperatur i 4 0 min. 20 ul 5M natriumacetat, 100 ul destillert vann og 500 ul etanol ble tilsatt. Etter avkjøling over natten ved -20°C ble det dannede presipitatet oppsamlet ved sentrifugering ved en kraft tilsvarende 10 000 ganger tyngdekraften (10000 G) i 20 min. ved 0°C. Utbyttet av enkeltkjedet cDNA var 10 ug.

Igjen må det forstås av det enkeltkjedede cDNA-produkt fremstilt som angitt ovenfor, i realiteten er en kompleks blanding av et stort antall forskjellige cDNA'er transkribert fra de tilsvarende mRNA'er tilstede i poly(A) RNA-blandingen.

(Fig 1) . Kun et meget lite antall av disse cDNA'er er IFN-a-relaterte, dvs. H ul FN-acDNA1 er. En annen faktor som virker til å komplisere cDNA-blandingen/er at hver mRNA-type i poly(A) RNA-blandingen vanligvis ikke er fullstendig transkribert. I stedet kan for hver mRNA-type transkriberingsprosessen være stoppet før enden av mRNA er nådd. Derfor kan et stort antall cDNA-typer fremstilles fra hver mRNA-type (ikke vist i fig. 1). Hver type vil oppføre seg mere eller mindre likt i de etterfølgende kloningsprosesser slik at det vil bli fremstilt bakteriekloner som inneholder rekombinante DNA-molekyler sor kun har et fragment av genet for et spesielt protein. Tilstedeværelse av disse fragmentinneholdende kloner vil ytterligere komplisere den endelige kloneav-skjermingsprosess.

Størrelsene for de forskjellige enkeltkjedede cDNA'er ble bestemt ved elektroforese av en liten del av en alkalisk 2% agarosegel under anvendelse av 30 mM NaOH, 2 mM EDTA som elektrolytt (M. W. McDonell et al., "Analysis Of Restriction Fragments Of T7 DNA And Determination Of Molecular Weights By Electrophoresis In Neutral And Alkaline Gels", J. Mol. Biol., 110, s. 119-46. (1977)). <32>P-cDNA med en lengde på 600-1000 nukleotider i forhold til det enkeltkjedede globulin cDNA og <32>P-merkedeDNA-fragmenter ble anvendt som størr-elsesmarkører.

Det enkeltkjedede cDNA kan gjøres dobbeltkjedet ved behandling med DNA-polymerase I (T. Maniatis et al., "Amplification And Characterization Of A Ø-Globin Gene Synthesized In Vitro", Cell, 8, s. 163-82 (1976)). Det presipiterte enkeltkjedede cDNA erholdt som ovenfor angitt, ble oppløst i 200 pl H20, oppvarmet til 100°c i 2 min. og inkubert i 500 ul 0,1

M varmedenaturert kaliumfosfatbuffer (pH 6,9), 10 mM MgCl2# 10 mM DTT (Calbiochem), 1 mM hver av dATP (Merck), dGTP (Schwarz) og dCTP (Laevosan), 1 mM <3>H-dTTP (NEN, spesifikk aktivitet 100 000 cpm/nmol) og 150 enheter/ml E. coli DNA-polymerase I ("Boehrincjer-Mannheirn" ) . Etter 6,5 timer ved 15° C ble 0,5 M EDTA og 20% SDS tilsatt til 10 mfl EDTA og 0,1% SDS. Blandingen b<1>a ekstrahert med 500 ul fenol og fenolfasen ble omekstrahert med 250 ul 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM EDTA ("TE puffer"). De to vandige faser ble kombinert og kromatografert på en 5 ml "Sephadex G-100" kolonne under de samme betingelser som tidligere beskrevet. Natriumacetat (3M) ble tilsatt til u,3 M og 2,5 vol etanol ble innblandet for å presipitere DNA. En totalmengde på 13 ug DNA ble gjenvunnet.

Det erholdte DNA ble behandlet med nuklease S^, fremstilt ved fremgangsmåten i henhold til R. C. Wiegand et al., "Spe-cificity Of The S^ Nuclease From Aspergillus oryzal", J. Biol. Chem., 250, s. 8848-55 (1975). Det presipiterte DNA ble oppløst i 250 ul S1 buffer (0,2 M NaCl, 50 mM natriumacetat (pH 4,5), 10 mM sinksulfat) og oppvarmet ved 37°C i 30 min..1,5 ul S-^ enzym (11 enheter/ul) ble tilsatt blandingen, og denne ble inkubert ved 37°C i 30 min. SDS og EDTA ble tilsatt til 0,1% SDS og 5 mM EDTA og blandingen ekstrahert med 250 ul fenol. Fenolfasen ble vasket med 100 ul TE-puffer. De vandige faser ble kombinert og kromatografert på "Sephadex G-100" ("Pharmacia") kolonne i TNE. 0,1-ml's fraksjoner ble oppsamlet ved 0,3 ml/min. og "Cerenkov" stråling-en ble bestemt for hver fraksjon. 8 ug dobbelkjedet cDNA ble gjenvunnet etter presipitering med etanol og natriumacetat som angitt ovenfor.

Det må igjen forstås at det dobbeltkjedede cDNA fremstilt som ovenfor angitt er en blanding av et stort antall cDNA'er og fragmenter derav, mens ganske få utgjøres av HuIFN-acDNA eller dets fragmenter (fig. 1).

Et stort antall verts/kloningsbærerkombinasjoner kan anvendes ved kloning av det dobbelt kjedede cDNA fremstilt som beskrevet ovenfor. F.eks. kan egnede kloningsbæreré bestå av segmenter av kromosomale, ikke-kromosomale og syntetiske DNA-sekvenser, så som forskjellige kjente bakterie-plasmider, eksempelvis plasmider av E. coli-innbefattende col El, pCRl, pBR322 og deres derivater, brede vertsområdeplasmider, eks-eksempelvis RP4, fag DNA, eksempelvis de mange derivater av fag eksempelvis NM 989, og vektorer avledet fra kombinasjoner av plasmider og fag DNA så som plasmider som er modifisert for anvendelse av fag DNA eller andre ut-trykkskontrollsekvenser eller gjærplasmider så som 2 u plasmid eller derivater derav. Nyttige verter kan innbefatte bakterieverter så som stammer av E. coli, eksempelvis E. coli HB 101, E. coli X1776, E. coli X2282, E. coli MRCI og stammer av Pseudomonas,. Bacillus subtilis, Bacillus stearo-thermophilus og andre bakterier, gjærtyper og sopp, dyr-eller planteverter så som dyr- (innbefattende mennesker) '. eller planteceller i kultur eller andre verter. Naturligvis vil ikke alle vert/vektorkombinasjoner være like effektive. Det spesiell^ valg av vert/kloningsbærerkombinasjon kan gjøres av en fagmann etter vurdering av de fremlagte prin-sipper uten å avvike fra foreliggende oppfinnelses ramme.

Ytterligere ini.en hver spesifikk kloningsbærer kan forskjellige posisjoner velges for innføring av det dobbeltkjedede DNA. Disse posisjoner er vanligvis betegnet med den restrik-sjons-endonuklease som kutter disse. F.eks. i pBR322 er Psti-<p>osisionen lokalisert i genet for B-laktamase, mellom nukleotid-triplettene som koder for aminosyrene 181 og 182 i dette protein. Denne posisjonen ble anvendt av Villa-Komaroff et al., som ovenfor angitt, ved deres syntese av protein som utviser rotte-proinsulin-antigendeterminanter. En av de to jiindll-endonuklease-gjenkjennelsesposisjoner ligger mellom triplettene som koder for aminosyrene 101 og 102 og den andre av flere Tag-posisjoner ved tripletten som koder for aminosyre 45 i B-laktamasi i pBR322. På samme måte ligger EcoRI-posisjonen og Py^jII-posis jonen i dette plasmid utenfor ethvert kodningsområde, EcoRI-posisionen er lokalisert mellom henholdsvis genene som koder for resistens mot tetracyklin og ampicillin. Denne posisjonen ble anvendt av Itakura et al. og Goeddel et al. i deres rekombinante synte-seskjemaer, nevnt ovenfor. Det må naturligvis forstås at en klonings "vektor som er nyttig ved utøvelse av foreliggende oppfinnelse ikke behøver en restriksjons-endonuklease-posisjon for innføring av det valgte DNA-fragment.

Vektoren eller kloningsbæreren og den spesielle posisjon valgt deri for tilknytning av et valgt DNA-fragment for å

gi et rekombinant DNA-molekyl/bestemmes av et antall forskjellige faktorer, eksempelvis antall posisjoner følsomme for et spesielt restriksjonsenzym, størrelsen av proteinet som skal uttrykkes, følsomheten for det ønskede protein for proteolytisk degradering av vertscelleenzymene, forurensninger av proteinet som skal uttrykkes av vertscelleproteinene som er vanskelige å fjerne under rensning, ekspresjonskarakteris-ti,ka som posisjonen av start- og stoppkodonene i forhold til vektorsekvensene, samt andre aktorer som er velkjente for en fagmann. Valg av vektor og innskuddsposisjon for et spesielt gen bestemmes av en balanse mellom disse faktorer, og ikke alle valg er like effektive for et gitt tilfelle.

Selv om et antall fremgangsmåter er kjent innen teknikken

for innføring av fremmed DNA i en kloningsbærer eller vektor til å gi et rekombinant DNA-molekyl, er den foretrukkede fremgangsmåte for den første konstruksjon i henhold til oppfinnelsen den som er beskrevet av Villa-Komaroff et al., supra, og vist i fig. 1. Denne fremgangsmåte er særpreget ved behandling av plasmidet (særlig pBR322) med restriksjonsenzymet som er spesifikk for den valgte posisjon for innføringen (særlig Pstl) og addere dGMP-haler til endedelene ved terminal transferase. dGMP-haler adderes til 5'endene av det delte plasmid for å regenerere Pstl-posisionen og tillate tilknytning til et cDNA-fragment som bærer komplimentære haler.

På samme måte forlenges det dobbeltkjedede cDNA ved tilsetning av dCMP-haler til 3 * enden for forening av det med haler forsynte plasmidet. Det sistnevnte og cDNA blir deretter forenet for å innføre cDNA i den passende posisjon av plasmidet og for å sirkularisere hybrid DNA, idet de komplementære karakterer av halene muliggjør deres kohesjon (fig. 1). Det resulterende rekombinante DNA-molekyl bærer et gen for den valgte restriksjonsposisjon (fig. 1).

Naturligvis kan andre kjente metoder for innføring av DNA-sekvenser i kloningsbærere til å gi rekombinante DNA-molekyler være like nyttige. Dette innbefatter eksempelvis direkte "annealing", syntetiske linkere, eksonuklease og polymerase-forbundne reparasjonsreaksjoner fulgt av "annealing", eller forlengelse av DNA-kjeden med DNA-polymerase og et passende enkeltkjedet templat etterfulgt av "annealing". Det må naturligvis forstås at nukleotidsekvensene eller cDNA-fragmendene innført i den valgte posisjon i kloningsbæreren kan innbefatte nuklotider som ikke er en del av det aktuelle strukturelle gen for det ønskede polypeptid, eller kan innbefatte kun et fragment av det komplette strukturelle gen for det. ønskede protein. Det er kun nødvendig at ved den DNA-sekvens som innføres, vil den transformerte vert produsere et polypeptid som utviser en biologisk eller immunologisk aktivitet for HuIFN-a, eller at DNA-sekvensen i seg selv anvendes som en hybridiseringssonde for å velge kloner som. inneholder DNA-sekvenser som er egnede ved fremstilling av polypeptider med immunologisk eller biologisk aktivitet som HulFN-a.

Kloningsbæreren eller vektoren inneholdende det fremmede gen anvendes for å transformere en vert for å tillate at verten uttrykker proteinet eller en del derav som hybrid DNA koder for. Valget av passende vert kontrolleres også av et antall faktorer som er velkjente innen teknikkens stand. Disse innbefatter eksempelvis forenlighet med den valgte vektor, toksisiteten for proteinene kodet for av hybrid-plasmidet, gjenvinningsletthet for det ønskede protein, ekspres.jonskarak-teristika, biosikkerhet og omkostninger. En balanse mellom disse faktorer må finnes ut fra den forståelse at ikke alle verter vil være like effektive for å uttrykke et spesielt rekombinant DNA-molekyl.

I henhold til foreliggende oppfinnelse er den foretrukne initiale kloningsbærer bakterielt plasmid PBR322, og den foretrukne initiale restriksjonsendonuklease-posisjon deri er Pstl-posisjon (fig. 1). Plasmidet er et lite (molekylvekt ca. 2,6 megadalton) plasmid som bærer resistensgener for ampicillin (Amp) og tetracyklin (Tet) antibiotika. Plasmidet er fullstendig karakterisert (F. Bolivar et al., "Contruc-tion And Characterization Of New Cloning Vehicles II. A Multi-Purpose Cloning System", Gene, s. 95-113 (1977); J. G. Sutcliffe, "pBR322 Restriction Map Derived From the DNA Sequence: Accurate DNA Size Markers Up To 4361 Nucleotide Pairs Long", Nucleic Acids Research, 5, s. 2721-28 (1978)). Innføring av DNA-produktet i denne posisjonen gir et stort antall bakterielle kloner som hver inneholder en av DNA-genene eller fragmenter derav som er tilstede i det tidligere fremstilte DNA-produkt. Igjen vil kun et lite antall av disse kloner inneholde genet for IFN-a eller fragmenter derav (fig. 1). Den foretrukne vert for den initielle kloning i henhold til oppfinnelsen er E. coli HB 101. Andre forsøk ble utført med E. coli X1776, en vert beskrevet i engelsk patent nr. 1,516,458 og deponert i the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, hvor det er betegnet med ATCC nr. 31244.

1. Fremstilling av Pstl- spaltet, dGMP- forlenget pBR322 Plasmid pBR322 (20 ug) ble behandlet med 21 enheter Pstl-endonuklease ("MRE Porton Downs" eller "Nev; England Biolabs") i 150 pl 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 6 mM 2-merkaptoetanol, 200 mg/pl storfe-serumalbumin ("BSA")

("Calbiochem") . Etter 2 timer ved 37°C ble blandingen ekstrahert med en fenol-kloroformblanding (1:1) og 1 vol eter og presipitert med etanol.

Addering av homopolymere dGMP-haler (fig. 1) ved terminal deoksynukleotidyl-transferase (TdT) (renset i henhold til F. J. Bollum, "Deoxynucleotide Polymerizing Enzymes From Calf Thymus Gland", i Methods in Enzymology, (L. Grossman and K. Moldave, eds.), Academic Press, New York, 128, s. 591-611 (1968)) ble utført i et 328-pl reaksjonsvolum inneholdende 100 mM natriumkakodylat (pH 7,2), 10 mM NaH2P04, 5 mM MgCl2 1 mM dGTP, 50 pg/pl BSA og 3-6 enheter TdT (renset som angitt ovenfor) pr. pg DNA. Inkubasjonen ble ut-ført ved 37°C i 20 min. EDTA ble tilsatt til 10 mM og blandingen ekstrahert som angitt ovenfor og dialysert i 2 døgn mot TNE-buffer.

"2.. Fremstilling av dCMP- forlenget DNA

Dobbeltkjedet DNA ble forlenget med dCMP-rester ved hjelp av standard fremgangsmåter (eksempelvis Villa-Komaroff et al., supra). 150 ng av det dobbeltkjedede cDNA beskrevet ovenfor ble inkubert i 8 ul 100 mM natriumkakodylat (pH 7,2), 2,5 mM CoCl2, 50 ug/ul BSA, 0,1 mM dCTP inneholdende 3-6 enheter renset TdT pr. ug DNA i 8 min. ved 27°C og deretter frosset ved -20°C. Som tidligere nevnt er det erholdte dCMP-forlengede DNA en blanding av forskjellige typer hvorav kun noen få er IFN-relaterte (fig. 1).

3. Fremstilling av Ca++- behandlet E. coli X1776

En enkel koloni E. coli X1776 ble inokulert i 100 ml tryptonmedium (C. Weissmann og W. Boll, "Reduction Of Possible Hazards In The Preparation Of Recombinant Plasmid DNA", Nature, 261, sidene 428-29 (1976), supplementert med 100 ,ug/ ml diaminopalmitinsyre ("Koch-Light Laboratories"), 10 pg/ml naldiksinsyre ("Calbiochem") og 10 jug/ml tetracyklin ("Ach-romycin", American Cyanamid). Kulturen ble dyrket ved 37°C til en. observert optisk densitet på 0,6 ved 650 nm (OD65Q), (målt i et "Beckman DB" spektrometer) og avkjølt i is i 30 min. Kulturen ble deretter sedimentert ved 4000 omdr./min. i en "Sorvall H4" svingende kuvetterotor, cellene ble vasket med 50 ml 10 mM NaCl, ompelletert ved sentrifugering og på nytt suspendert i 20 ml 100 mM CaCl2. Suspen-sjonen ble avkjølt i is i 30 min., pelletisert ved sentrifugering og på ny suspendert i 4 ml 100 mM CaCl2 og holdt avkjølt på is over natten for anvendelse. E. coli HB101

ble fremstilt for tranformering i henhold til fremgangsmåten til M. Mandel og A. Higa, "Calcium-Dependent Bacteriophage DNA Infection", J. Mol. Bio,L. , 53, sidene 159-62 (1970). Alikvote deler (0,5 ml) ble holdt frosset ved -70°C og de bibeholdt deres aktivitet i minst 3 måneder.

4. Forening av dGMP- forlenget pBR322 og dCMP- forlenget DNA Foreningen av den med hale forsynte Pstl-spaltede pBR3 22 og med haleforsynt cDNA ble utført som beskrevet av J. Van den Berg et al., "Comparison Of Cloned Rabbit And Mouse 3~globin Genes Showing Strong Evolutionary Divergence Of Two

Homologous Pairs Of Introns", Nature, 276, sidene 37-44

(1978). 8 ng av det dCMP-forlengede DNA produkt ble blandet med 22 ng dGMP-forlenget Pstl-spaltet pBR322 i 50 pl TNE buffer. Inkubasjon ble utført i 4 påhverandre 1 timers trinn ved 65°C, 46°C, 37°C og 20°C. 20 pl 100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM CaCl2, 100 mM MgCl2 og 50 pl TNE-buffer ble tilsatt og blandingen avkjølt i is i 20 min.

Det erholdte produkt er naturligvis en blanding av et stort antall forskjellige rekombinante DNA-molekyler og noen kloningsbærere uten innskutte DNA-sekvenser. Imidlertid inneholder hvert rekombinant DNA-molekyl et cDNA-segment

ved Pstl-posisjonen. Hvert slikt cDNA-segment kan omfatte et gen eller et fragment derav. Kun noen meget få cDNA-segmenter koder for IFN eller en del derav (fig. 1). Hoveddelen koder for en av de andre proteiner eller deler derav hvis mRNA'er var en del av poly(A) RNA som var anvendt

(Fig. 1)'.

5. Transfeksjon av E. coli X1776 med de forenede hybridplasmider

Transfeksjon av E. coli X1776 med blandingen av rekombinante DNA-molekyler ble utført som beskrevet av J. Van den Berg et al., supra. P3 oppdemningsmuligheter ble anvendt ved transfeksjonsprosessen og alle etterfølgende trinn i hvilke de resulterende transformerte bakterier ble håndtert. De forende pBR322 rekombinante DNA-molekyler ble tilsatt til 100 pl Ca<++->behandlede E. coli X1776, fremstilt som ovenfor angitt, og blandingen avkjølt i is i 20 min., oppvarmet til 20°C i 10 min. og 0,6 ml tryptonmedium tilsatt. Blandingen ble utspredd på 2 tryptonmedium agarplater behandlet som ovenfor angitt. Transfeksjonseffektiviteten var 3,3 x 10^ kolonier pr. pg forenet pBR322 transfekserende DNA, nativt pBR322 ga 3 x IO<6> kolonier pr. pg.

Da plasmidet pBR322 innebefatter genet for tetracyklinresistens,vil E. coli verter som er transformert med et plasmid inneholdende dette gen intakt vokse i kulturer inneholdende dette antibiotikum og således utelukke vekst av de bakterier som ikke er transformert på denne måte. Derfor vil vekst i tetracyklininneholdende kultur muliggjøre utvelgelse av verter som er transformert med et rekombinant DNA-molekyl eller recyklisert vektor. .Etter 48 timer ved 37° ble individuelle kolonier tatt opp og suspendert i 100 ul tryptonmedium (supplementert som ovenfor angitt) i brønnene i mikrotiterplater (Dynatech). Etter inkubasjon ved 37°C over natten ble 100 ul 40 % glycerol iblandet i hver brønn. Platene ble lagret ved -20°C og en samling av 100 000 individuelle kloner av transformert E. coli X1776 ble fremstilt.

Disse 100 000 kloner inneholdt et antall rekombinante DNA-molekyler som representerte fullstendige eller delvise kopier av blandingen av mRNA'er i poly(A) RNA-preparatene fra IFN-induserte leukocytter. (Fig. 2). Hoveddelen av disse vil inneholde kun et enkelt rekombinant DNA-molekyl og ganske få av disse rekombinante DNA-molekyler er relaterte til IFN. Følgelig må klonene avskjermes for å separere IFN-relaterte kloner fra de andre.

Sikting for et klon inneholdende HuIFN- acDNA

Det er flere angrepsmåter for å isolere' bakteriekloner inneholdende human leukocyttinterferon cDNA ("HuIFN-acDNA"). Disse innebefatter eksempelvis RNA seleksjonshybridisering (Alwine et al., infra), differensiel1 hybridiserina (T. P. St. John og R. W. Davis, "Isolation Of Galactose-Inducible DNA Sequences From Saccharomyces Cerevisiae By Differential Plaque Filter Hybridization", Cell, 16, sidene 443-452 (1979) Hoeijmakers et al., infra), hybridisering med en syntetisk prøve (probe) (B. Noyes et al., "Detection And Partial Sequence Analysis Of Gastrin mRNA By Using An Oligodeoxynucleo-tide Probe", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 76, sidene 1770-1774 (1979)) eller avskjerming av kloner som fremstiller det ønskede protein ved immunologiske (L. Villa-Komaroff et al., supra eller biologiske (A.C.Y. Chang et al., supra) bestemmelser. I foreliggende tilfelle ble RNA seleksjonshybridisering ansett for å være den mest velegnede og lovende me-.

t<p>de for en primærisolering av kloner inneholdende IFN-acDNA.

RNA seleksjonshybridiseringsanalyse

1• Oversikt over initial analyse

Under henvisning til fig. 2 ble rekombinant DNA isolert fra en kultur av en blanding av 512 kloner fra den ovenfor nevnte samling av kloner (to blandinger av 2 kloner er vist i fig. 2) (Trinn A). Grunnen for å velge denne satsstørrelse vil bli forklart i det etterfølgende. De rekombinante DNA-molekyler ble spaltet, denaturert og hybridisert til leukocytt poly(A) RNA-inneholdende IFN-amRNA, fremstilt som tidligere angitt (Trinn B). Alle rekombinante DNA-molekyl-poly(A) RNA-hybrider ble separert fra ikke-hybridisert poly(A) RNA (Trinn C). Poly(A) RNA ble gjenvunnet fra hybridene og renset (Trinn D). Gjenvunnet RNA ble undersøkt med hensyn til dets IFN-amRNA aktivitet som angitt ovenfor (Trinn E). Hvis,og bare hvis, blandingen av rekombinante DNA-molekyler inneholder et rekombinant DNA-molekyl med en innskutt hukleotidsekvens i stand til hybridisering til IFN-mRNA i poly(A) RNA under stringente hybridiseringsbeting-elser^vil mRNA frigjort fra dette hybrid forårsake dannelse av IFN-a i oocytter fordi mRNA frigjort fra eventuelle andre rekombinante DNA-molekyl-poly(A) RNA-hybrid vil ikke være IFN-a relatert. Hvis en gruppe på 512 kloner ga en positiv respons ble klonene omgruppert i 8 porsjoner a 64x og hver porsjon ble undersøkt som ovenfor angitt. Denne prosess ble gjentatt inntil en enkel klon som gir respons til denne undersøkelse/var identifisert.

Det gis ingen sikkerhet for at rekombinante DNA-molekyler og bakteriekloner transformert med disse, som er identifisert på denne måte, inneholder den fullstendige IFN-acDNA-sekvens eller IFN-a eller til og med DNA-sekvensen som i realiteten koder for IFN-a. Imidlertid vil de rekombinante DNA-molekyler sikkert inneholde betydelige nukleotidsekvenser som er komplementære til den IFN-amRNA kodende sekvens. Derfor kan i det minste et rekombinant DNA-molekyl anvendes som en kilde for en prøve for raskt å isolere andre rekombinante DNA-molekyler og kloner transformert med disse for å identi-fisere ytterligere sett. kloner som kan inneholde en autentisk og komplett IFN-a nukleotidkodende sekvens.

3. Teoretiske betraktninger

Betingelsene for hybridisering (trinn B) er kritiske. De absolutte konsentrasjoner og forholdet mellom rekombinant DNA-molekyl og poly(A) RNA må velges slik at det medtas i betraktning reaksjonshastigheten og støkiometrien. Det er vanskelig å gjøre det rette valg fordi andelen av IFN-amRNA

i poly(A) RNA ikke er kjent. For å sikre kontrollert og riktig kinetikk, ble hybridiseringen utført under betingelser hvor konsentrasjonen av DNA-sekvensene fra de rekombinante DNA-molekylene var i overskudd sammenlignet med'den antatte IFN-amRNA-konsentrasjon. I en blanding av 512 mulige forskjellige rekombinante DNA-molekyler vil en IFN-a relatert DNA- sekvens ("IFN-aR DNA") enten ikke være tilstede (i et negativt analyseresultat) eller vil utgjøre minst 1/512 av de rekombinante DNA-molekyler. Konsentrasjonen av den rekombinante DNA-molekylblanding, og følgelig konsentrasjonen av IFN-aR DNA, hvis noen, kan således justeres i hybridi-seringstrinnet for å sikre passende hybridiseringshastig-heter. I tillegg må mengden av IFN-aR DNA i reaksjonsblandingen være tilstrekkelig til å binde nok IFN-amRNA fra poly

(A) RNA for å muliggjøre påvisning av IFN-a etter injeksjon

i oocytter av mRNA gjenvunnet fra det rekombinante DNA-molekyl-poly(A) RNA-hybridet.

For å påvise IFN-a med de tilgjengelige analyser bør konsentrasjonen være 100 IU/ml eller høyere. Fordi 0,5 ml alikvote deler er nødvendig for dobbeltbestemmelser, bør 50 IU genereres i oocyttene. Poly(A) RNA fra induserte tidligere anvendte leukocytter genererer ca. 500 IU IFN-a ved injeksjon av 1 pg i oocytter. Derfor må minst 0,1 pg poly(A) RNA injiseres for å generere de nødvendige 50 IU. Modell-forsøk med rotteglobulin mRNA og rotte B-globulin cDNA-klo-125 ner viste at den totale gjenvinning av I-globulin mRNA i

125

oocytter i forhold til I-globulin mRNA tilsatt til hybri-diseringsblandingen var ca. 10 % og gjenvinning av mRNA

aktiviteten var ca. 5%. Derfor bør minst 0,1/0,05 = 2 /ag leukocytt poly(A) RNA anvendes ved hybridiseringsanalysen. For å oppnå en tilstrekkelig sikkerhetsmargin ble 12 /jg poly(A) RNA anvendt pr. analyse. For å beregne hvor meget DNA fra de rekombinante DNA-molekyler som er nødvendig for

å binde IFN-amRNA i 12 pg poly(A) RNA ble IFN-amRNA-inn-holdet i poly(A) RNA estimert. 1 pg poly(A) RNA genererer i 500 IU IF. Den spesifikke aktivitet for IFN-a ligger mellom 8 9 2 x 10 og 10 IU/mg protein. 500 IU IFN-a svarer derfor til mellom 500/2 x IO<8> = 2,5 x 10~<6> mg (2,5 ng) og 500/10<9> =

5 x 10 ^ mg (0,5 ng) interferon.

Forholdet mellom injisert mengde IFN-amRNA til en oocytt og mengden av produsert IFN-a er ukjent. For tilfellet B-globulin mRNA produseres ca. 30 proteinmolekyler pr. mol mRNA pr. time. Denne verdi er ca. 6 for p-globulin (J.B. Gurdon et al., "Message Stability In Injected Frog Oocytes: Long Life Of Mammalian And B-Globin Messages", J. Mol. Biol., 80, sidene 539-51 (1973)). Hvis det antas en midlere verdi på 20 for IFN-a og en molekylvekt på 18000 for IFN-a og en molekylvekt på 330 000 for IFN-amRNA,skulle 26 mg (18000/ 3330000 x 20 x 24) IFN-a produseres i 24 t pr. mg injisert IFN-amRNA. Hvis den spesifikke aktivitet for IFN-a er 2 x 10<8>/mg (2 x IO<2> IU/ng). så vil 1 ng IFN-amRNA gi 26 x 2 x 10<2>=

3 9 5,2 x 10 IU IFN-a. Hvis den spesifikke aktivitet er 10 /mg 3 4 (10 IU/ng); vil den produserte mengde IFN-a være 2,6 x 10 IU. Fordi 1 pg leukocytt poly(A) RNA gir 500 IU IFN-a under de ovenfor antatte betingelser/burde konsentrasjonen av IFN-amRNA i 1 pg poly(A) RNA ligge i området 0,1-0,02 ng og andelen av IFN-amRNA i leukocytt poly(A) RNA ligge i området 1:10000 og 1:50000. Derfor inneholder 12 pg poly(A) RNA 0,2-1,2 ng IFN-amRNA.

Skulle translasjonsforholdet av IFN-amRNA i oocyttene være en tierpotens lavere enn det som er gjennomsnittlig for a-globulin mRNA,vil IFN-amRNA-inneholdet i poly(A) RNA være ca. 10 ganger høyere enn det som er beregnet ovenfor eller ligge mellom 1:1000 til 1:5000. I dette tilfellet ville 12 pg poly(A) RNA inneholde 2-12 ng IFN-amRNA. På den annen side^vis ' translas jonsforholdet. for IFN-amRNA i oocyttene skulle være en tierpotens lavere enn det som er vanlig for globulin mRNA, ville IFN-amRNA-inneholdet i poly(A) RNA være 10 ganger lavere enn det som er beregnet ovenfor eller ligge i området 1:100 000 og 1:500 000. 12 pg poly(A) RNA vil da inneholde 0,02-0,1 ng IFN-amRNA.

Plasmid pBR322 har 4361 b.p. Det komplette cDNA i IFN-amRNA vil addere ca. 800-1000 b.p. til pBR322 ved dannelse av pBR322-IFN-acDNA til en total i området 5200-5400 b.p. Molekylvekten vil således være 12 ganger (2 x 5200/800) den for IFN-amRNA alene. Derfor for å sikre IFN-amRNA som ovenfor beregnet til å være tilstede i 12 pg poly(A) RNA nødvendig for analysen^vil det være nødvendig med en mengde rekombinant DNA-molekyler som er lik 12 ganger mengder av IFN-amRNA (støkiometrisk mengde).

Fordi IFN-amRNA-inneholdet i poly (A) RNA anvendt for fremstilling av rekombinante DNA-molekyler var øket 10-40 ganger over den for utgangs-poly(A) RNA, burde gruppen av 512 kloner inneholde 10-40 ganger flere kloner inneholdende det ønskede IFN-amRNA enn det sam er beregnet fra det ovenfor angitte. Hvis IFN-amRNA er 1 del i 1000 deler utgangspoly{A) RNA da vil 12 pg poly(A) RNA inneholde 12 ng IFN-amRNA og den støkiometriske mengde IFN-acDNA plasmid er 144 ng. Da hver gruppe av 512 kloner vil inneholde minst 5 med IFN-acDNA-innskudd,vil totalmengden av hybridplasmid DNA kreve 14,8 pg (144 x 512/5 x 10~<3>). Hvis IFN-amRNA utgjør 1 del av 10 000/vil 12 pg poly(A) RNA inneholde 1,2 ng IFN-amRNA og mengden av IFN-acDNA plasmid som er nødvendig,vil være 14,4 ng. En gruppe på 512 kloner vil inneholde enten 0 eller 1 IFN-acDNA-innskudd,slik at den totale mengde hybridplasmid DNA som er nødvendig er 7,4 pg (14,4 x 512 x 10 ). Hvis IFN-amRNA er 1 del i 100 000,vil totalmengden av hybridplas--3

mid DNA som er nødvendig være 0,74 pg (1,44 x 512 x 10 ). For å sikre at hybridiseringsreaksjonen vil forløpe under DNA-overskuddsbetingelser (dvs. overskudd rekombinant DNA sammenlignet med poly(A) RNA) ble 20 pg av blandingen (ca. 1,4 til 30 gangers overskudd valgt for analysen.

Hybridiseringen må utføres under betingelser som sikrer (a) at den hybridiserte del av poly(A) RNA gjenvinnes intakt og

i en biologisk aktiv form, (b) at ikke-spesifikk DNA-mRNA assosiering forhindres og (c) at hybridiseringsreaksjonen forløper til minst 75% fullstendighet. Disse betingelser vil mest sannsynlig tilfredsstilles ved hybridisering i 80% formamid,0,4M NaCl (J. Casey og N. Davidson, "Rates Of For-mation And Thermal Stability Of RNA:DNA And DNA:DNA Duplexes At High Concentrations Of Formamide", Nucleic Acids Res., 4, sidene 1539-52 (1977)). I denne oppløsning kan hybridiseringen utføres ved ca. 40°C i stedet for 60-70°C som er nød-vendig når formamid utelates. Lavere temperaturer er foretrukket for å minimalisere ødeleggelse av poly(A) RNA. Den valgte hybridiseringstemperatur var 56°C. Dette er ca. 3° lavere enn T1 . (J. Casey og N, Davidson, supra) og ca. 10-13 C under T^/2d (Hama9ucni & Geidushek, J. Amer. Chem. Soc., 84, side 1329). Denne temperatur skulle derfor ikke tillate hybridisering av sekvenser med mindre enn ca. 87%'s homologi,da 1%'s utilpasning senker T-[./2d mec* l°c (T' F* Bonner et al., "Reduction In The Rate Of DNA Reassociation By Sequence Divergence", J. Mol. Biol. 81, sidene 123-35

(1973)).

Ved foreliggende hybridisering er selvhybridisering av DNA ikke noe hovedproblem fordi blandingen av DNA'er som anvendes består av den samme vektor (pBR322) og et antall cDNA-innskudd. Derfor vil de fleste DNA-sekvenser være heterodup-lekser hvori innskuddene er tilgjengelige for hybridisering til poly(A) RNA. Det er lite sannsynlig at komplementære cDNA innskudd som utgjør en del av de forskjellige duplekser, vil samreagere som følge av topografiske begrensninger. I alle tilfelle vil DNA:DNA reassosiasjon minimaliseres under de anvendte reaksjonsbetingelser (J. Casey og N. Davidson, supra).

For å bestemme den nødvendige hybridiseringstid for å sikre minst 75% omsetning^ble en annenordéns reaksjonsligning anvendt:

hvori:

R = den molare nukleotidkonsentrasjon i hybridisert

RNA

Co= den molare nukleotidkonsentrasjon av det initiale

DNA som skal hybridiseres

Ro= den molare nukleotidkonsentrasjon av det initiale

RNA som skal hybridiseres

kR= omsetningshastighetskonstant for RNA-DNA hybridisering

t tid (f)

og :

0,7 5 (75% omsetning)

kR 472 (kR = 1/12 k^ (J. Casey og N. Davidson, supra)

hvor: k^ = annen-ordens reaksjonskonstant for DNA under de valgte hybridisering sbe tinge ls ene

og: kd = 1,7 x IO<5> x L1//2 x N_1

(J. R. Hutton og J. G. Wetmur, "Renaturation Of Bacteriophage 8 X17 4 DNA-RNA Hybrid: RNA Length

Effect And Nucleation Rate Con-stant", J. Mol. Biol., 77, sidene 495-500 (1973))

L 900 (kjedelengde i b.p., ca. 900

er tilstede i det fullstendige IFN-acDNA-innskudd)

N 900 (kompleksitet i b.p. av hyb-ridkjeden. Her er kompleksiteten 900 fordi de 900 nukleider av IFN-amRNA er forbundet med kom-lementære 9 00 nukleotider i IFN-acDNA innskuddet)

-7

Co = 2,5 x 10 (Basert på 40 pl oppløsning inneholdende de tidligere be-

35

stemte 20 ug rekombinante DNA-molekyler som skal anvendes i analysen, igjen under forutset-ning av at IFN-acDNA innskuddet vil være 1/12 av det rekombinante DNA-molekyl og vil finne sted i det minste i 1 av 512 kloner og angi 662 som den midlere molekylvekt for et DNA-basepar)

Ro = 8,7 x 10 — 8 (Basert på 40 ul oppløsning inneholdende det tidligere bestemte 12 ug poly(A) RNA som anvendes ved analysen, igjen under antagelsen at poly(A) RNA inneholder 1:10 000 deler IFN-amRNA (utfra at i det store overskudd av DNA, vil en forskjellig andel ha liten effekt på hybri-diseringshastigheten) og anta 3 43 som den midlere molekylvekt av et ribonukleotid i RNA)

3. Utførelse av den initiale analyse

Trinn A-Fremstilling og spaltning av blandingen av rekombinante DNA-molekyler

Det ønskede antall bakteriekloner ble inokulert på trypto-fonmediumagarplater supplementert som angitt ovenfor ved å overføre en alikvot del fra hver mikrotiterbrønn ved hjelp av en mekanisk anordning. Etter inkubasjon i 37°C hadde hver klon ført til en koloni med en diameter på flere milli-meter. Alle kolonier ble vasket av platen(ene) og forenet til å gi et inokulum anvendt for å inokulere 1 1 tryptofon-medium, supplementert som angitt ovenfor, en 2 1 Erlenmyer flaske. Kulturen ble rystet ved 37°C til en observert 0D,C- på ca. 0,8 (bestemt visuelt). Et volum supplementert tryftofonmedium og kloramfenikol til 170 ug/ml ble tilsatt til kulturen som ytterligere ble rystet ved 37 C 1 16 timsr.

20 ml kloroform ble tilsatt og kulturen igjen rystet i 10 min. ved 37°C for å drepe bakteriene (C. Weissmann og W. Boll, supra). Kulturen ble dekantert fra kloroformen og cellene oppsamlet ved sentrifugering ("Sorvall GS3" rotor)

i 15 min. ved 6000 omdr./min. ved 4°C. Ca. 1-2 g celler ble erholdt ved hver liter av preparatet. Cellene ble suspendert i 30 ml 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), sentrifugert i 20 min. ved 5000 omdr./min. og 4°C ("Sorvall SW" rotor) og resuspendert i 30 ml 50 mM Tris-HCl (pH 7,5). 0,25 vol lysozym-oppløsning (10 mg/ml i 50 mM Tris-HCl (pH 7,5)) ble tilsatt, og etter avkjøling i 10 min ved 0° C ble det tilsatt 0,33 vol (regnet på volumet av den opprinnelige 50 mM Tris-HCl-kultursus-pensjon) 0,5 M EDTA (pH 8,0) og forsiktig blandet inn uten rysting. Etter ytterligere 10 min. ved 0°C ble 1/16 vol (igjen regnet på det opprinnelige volum) 2% "Triton X-100" tilsatt. Etter 60 min. ble prøven sentrifugert i 60 min. ved 10 000 omdr./min. ved 0°C i en "Sorvall SW" rotor) Den supernantante væske ble overført til et beger inneholdende en magnetisk rører og 3M NaOH ble tilsatt under omrøring inntil en pH på 12,5 ble nådd, målt ved 20°C under anvendelse av en glasselektrode og en "Orion Research" modell 601 pH meter, standardisert med Beckman pH 10 Carbonate Buffer Standard (nr. 3505). Etter omrøring i 10 min. ved 20 oC ble pH justert til 8,5. Etter 3 min. ytterligere omrøring ble 1/9 vol 5 M NaCl og 1 vol fenol (destillert og brakt i like-vekt med 9,5 M NaCl) tilsatt og kraftig omrørt i 5 min. Fasene ble separert ved sentrifugering ("GSA Sorvall" rotor) ved 10 000 omdr./min. ved 0°C i 10 min. Supernantanten som inneholdt Form I DNA (sirkulært dobbeltkjedet DNA) ble forsiktig fjernet fra mellomfasen (som inneholdt enkeltkjedet DNA) og ekstrahert 3 ganger med kloroform. (Fenol må for en stor del fjernes ved dette trinn). Form I DNA-fraksjonen vil inneholde de rekombinante DNA-molekyler (pBR322-cDNA innskutt) som opprinnelig ble anvendt for å transformere de vertsceller som utgjorde en del av de 512 kloner som ble valgt for undersøkelse.

Pankreatisk RNAase A (5 mg/ml, forvarmet 10 min. ved 85°C) ble tilsatt til Form I DNA til en konsentrasjon på 20 ug/ml, og blandingen inkubert ved 60 min. ved 37°C. 1/5 vol 5 M

NaCl ble tilsatt og blandingen justert med 30% polyetylen-

glykol 6000 ("Union Carbide", autoklavert i 20 min. ved 120 oC) opp til en sluttkonsentrasjon på 7,5% PEG. Etter 2-16 t ved -10°C ble presipitatet oppsamlet i en "Sorvall SW"

rotor i 20 min. ved 8 000 omdr./min. ved 0°C,oppløst i 0,075 M

NaCl, 0,0075 M Na-sitrat til en absorpsjon på 20 ved 260 nm

og justert til 0,5% SDS. Oppløsningen ble inkubert i 30 min.

ved 37°C med 0,5 mg/ml pronase (selv-"digested" ved 20 mg/ml i 2 tved 37 C) og ekstrahert 3 ganger med 1 vol destillert fenol og 2 ganger med 1 vol kloroform. Prøven (opptil 2 ml av en 1 mg/ml DNA-oppløsningen) ble sentrifugert gjennom en 5%'ig til 23%<1>ig sukrosegradient i 50 mM Tris-HCl (pH 7,5)

1 mM EDTA i 15 t ved 21 000 omdr./min. ved 15°C under anvend-

else av en "SW 27 Beckman Rotor". Fraksjonene ble oppsamlet og OD260 ble observert. DNA-inneholdende fraksjoner ble slått sammen og DNA presipitert med natriumacetat og etanol. 20 - 100 pg av Form I DNA-blandingen ble gjenvunnet ved sentrifugeringen.

20 pg renset Form I DNA ble behandlet i 150 pl 10 mM Tris-

HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl , 50 mM NaCl, 6 mM 2-merkaptoetanol,

200 pg/ml BSA eller gelatin og 20 enheter Hindlll (New England Biolabs). Hindlll restriksjonsenzymet spalter Form

1 DNA ved posisjonen inne i pBR322-enheten (det er lite tro-

lig at også cDNA-enheten spaltes, men hvis den spaltes, vil bestemmelsen ikke påvirkes i vesentlig grad). Etter 2 t ved 37°C ble en alikvot del (1%) analysert ved eletroforese igjennom en 1%<1>ig agarosegel i 50 mM Tris-acetat (pH 7,8),

2 mM EDTA ilt ved 50 mA for å fastslå om spaltningen var fullstendig. Hvis dette ikke var tilfellet, ble mere Hindlll tilsatt og inkubasjonen fortsatt i 2 timer. Når

Form I DNA fullstendig var omdannet til lineære molekyler,

ble pronase (Calbiochem), EDTA og SDS tilsatt til henholdsvis 0,5 mg/ml,

10 mM og 0,5%. Etter 30 min. ved 37°C ble oppløsningen ekstrahert med 30 pl fenol-kloroform .(1:1). Den organiske fase ble vasket med 50 pl 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) 1 mM EDTA og de kombinerte vandige faser ekstrahert 3 ganger med eter,

filtrert gjennom en 0,1-ml "Chelex"-kolonne, oppsamlet i et EDTA-kokt "Pyrex "-rør og presipitert med 1/10 vol 3M natrium-

acetat og 2,5 vol etanol. Etter henstand over natten ved o

-20 C ble DNA oppsamlet ved sentrifugering.

Trinn B - Hybridisering av DNA med poly(A)

RNA

To hybridiseringsblandinger ble fremstilt.

Blanding I inneholdt 4 ul 10 ganger konsentrert hybridiser-ingsbuffer (4M NaCl, 0,1 PIPES (pH 6,4, 1,4 piperazin-dietan-125 sulfonsyre, "Sigma"), 50 mM EDTA, 0,5 ul (ca. 5 ng I-globin mRNA (5000 cpm) og 6 ul indusert leukocytt poly(A) RNA (2 pg/pl) i en mengde tilstrekkelig til å generere 6000 IU IFN ved injisering av oocytter.

Blanding II inneholdt 10 ug av det Hindlll-spaltede Form I DNA, som fremstilt ovenfor, og 0,1 pg Pstl-spaltet Z-pBR322-(H3)/RcBG-4,13 (et pBR322-derivat som inneholder B-globulin-sekvensen i Hindlll-posisjon) (Mantei et al., "Rabbit 3-globin mRNA Production In Mouse L Cells Transformed With Cloned Rabbit 3-globin Chromosomal DNA", Nature 281, sidene 40-46

125

(1979)). I-globulin mRNA i blanding I og B-globulin

DNA i blanding II tjener som interne positive kontroller for hybridiseringsbestemmelsen. Begge blandinger ble tørket i en damp av nitrogengass. 40 ul 80%'ig formamid ble tilsatt til residuet av blanding II og oppløsningen ble denaturert i 10 min. ved 100°C og avkjølt raskt i is. Den denaturerte oppløsning ble anvendt for å oppløse, residuet fra blanding I og den erholdte oppløsning inkubert ved 56°C i 4 timer.

Trinn C - Separasjon av hybridisert poly(A)

RNA-DNA fra ikke-hybridisert poly(A) RNA

Etter fortynning til 1 ml med kald 0,9 M NaCl, 0,09 M Na-sitrat og formamid (100%) til 4 volum%/ble oppløsningen filtrert ved 0,5 ml/min. gjennom et "Millipore"-filter (pore-størrelse 0,45 pm), idet filteret på forhånd var undersøkt med hensyn til dets. evne til å holde tilbake RNA-DNA-hybrider, fordi ikke alle filtere erholdt fra fabrikanten var like effektive.

Trinn D - Rensning av hybridisert Poly(A)

RNA

Det ovenfor nevnte filter med tilknyttede poly(A) RNA-hybrider ble neddykket i 1 ml 0,15 mM NaCl, 0,015 M Na-sitrat, 0,5 % SDS i 10 min. ved 37°C, renset med 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 2 mM CaCl-, og plassert i 0,6 ml ny buffer.

Etter tilsetning av 5 ul jodacetat-behandlet DNAase (5mg/ml)

(S. B. Zimmermann og G. Sandeen, Anal. Biochem., 14, s. 269

(1966); P. A. Price et al., "Alkylation Of A Histidine Resi-due At The Active Site Of Bovine Pancreativ Deoxyribonuclea-se", J. Biol. Chem., 244, sidene 924-32 (1969)), ble filteret inkubert ved 37 C i 10 min.

Filteret ble fjernet og oppløsningen ekstrahert med 1 vol fenol og 1 vol eter og ført gjennom en 0,1 ml "Chelex"-kolonne. 5 ug bærer RNA (renset gjær RNA) ble deretter tilsatt oppløsningen og RNA presipitert med natriumacetat og etanol. Presipitatet ble oppsamlet ved sentrifugering ved 10 000 G, oppløst i 100 pl 1 mM EDTA, oppvarmet i 90 s ved 100°C og TNE og SDS ble tilsatt til henholds-

vis 2 ganger TNE og 0,5% SDS. RNA ble absorbert til 100 pl oligo(dT) cellulosekolonne, eluert med 4 vaskinger av 0,3

ml destillert vann og presipitert med natriumacetat og etanol. Etter 16 t ved -20°C ble det presipiterte RNA separert ved sentrifugering og oppløst i 2 pl TNK-buffer.

Trinn E - Bestemmelse av IFN-amRNA aktivitet

Poly(A) RNA-oppløsningen erholdt fra det foregående trinn ble injisert i 40 oocytter (ca. 50 ni pr. oocyt). Oocytene ble inkubert ved 23°C i 24-48 h, homogenisert og sentrifugert (eller inkuberingsmediet ble gjenvunnet) og analysert slik som beskrevet tidligere for IFN-a.

4. Etterfølgende bestemmelse - hybridisering til filter-bundet DNA

De fleste etterfølgende analyser av et rekombinant DNA-molekyl fra en enkelt klon ble utført med DBM eller DPT papir-bundet DNA fordi analysebetingelsene ikke lenger var kritiske og bestemmelsen mere velegnet. DPT-papir ga lavere, bak-grunnsstøy og ble fortrinnsvis anvendt. D3M-papir ble fremstilt som beskrevet av J. C. Alwine et al., "Method For Detection Of Specific RNAs In Agarose Gels By Transfer To Diazobenzyl Oxymethyl-Paper And Hybridization With DNA Pro-bes", Proe. Nati. Aead. Sei. USA, 14,sidene 5350-54 (1977) APT-papir ble fremstilt ved fremgangsmåten ifølge B. Seed (personlig kommunikasjon): Ark av "Whatman 540" papir (20 g) ble omrørt i 16 tved 20 oC med en blanding av 70 ml 0,5 M NaOH, 2 mg/ml NaBH^ og 30 ml 1,4 butandioldiglycidyleter. Papiret ble deretter overført til en oppløsning av 10 ml 2-aminotiofenol i 40 ml aceton og omrørt i 10 t. Papiret ble omhyggelig vasket med aceton, 0,1 N HC1, H20, 0,1 N HCl, H20 og tørket. APT papir ble diazotert til DPT papir slik som beskrevet for omdannelse av ABM til DBM papir (Alwine et al., supra).

2

DNA (opp til 15 pg) ble bundet til 50 mm diazotert ABM (DBM) eller diazotert APT (DPT) papir slik som beskrevet av J.H.J. Hoeijmakers et al. "The Isolation Of Plasmids Containing DNA Complementary To Messenger RNA For Variant Surface Glycoproteins Of Trypanosoma Brucei", Gene, under trykking 1980), som angitt i det etterfølgende.

Hybrid plasmid DNA ble behandlet med endonuklease Pstl, behandlet med 500 pg pronase pr. ml, 0,5 % SDS og 10 mM EDTA i 30 min. ved 37°C, ekstrahert med fenol og eter, ført gjennom en 0,1 ml "Chelex"-kolonne og presipitert med etanol. Det varmedenaturerte DNA (opp til 5 pg med en liten mengde

3 2

merket P-DNA addert som markør) ble inkubert over natten ved 0°C med 1 cm 2 DBM eller DPT papir i 200 pl 25 mM kaliumfosfatbuffer (pH 6,5). Filtrene ble vasket tre ganger i 5 min. ved romtemperatur ved 50 mM kaliumfosfatbuffer (pH 6,5) 1% glysin og tre ganger med 99% omkrystallisert formamid.

En ytterligere inkubasjon med 99%'ig formamid i 2 min. ved 68°C ble etterfulgt av tre vaskninger i 50 mM kaliumfosfatbuffer (pH 6,5) ved 20°C og to vaskinger i 0,4 M NaOH ved 37°C i 10 min. Ca. 40-60% av radioaktiviteten ble bibeholdt i filtrene. Disse filtere ble inkubert i 3 t ved 38°C i forhybridise ingsraediet A, som var tilsatt 1% glysin, under anvendelse a\, 330 pl pr. filter. Medium A inneholder 50% formamid, 5 x SSC, 0,04% polyvinylpyrrolidon, 0,04% "Ficoll"

(Pharmacia), 0,1% SDS, 25 pg poly(A) (P & L) og 100 pg gjær RNA (BDH, ekstrahert seks ganger med fenol og presipitert med etanol). Filtrene ble vasket to ganger i medium A og deretter hybridisert i 16 t ved 38°C med poly(A) RNA som indikert (vanligvis 5-8 pg) i medium A under paraffinolje. RNA ble tilsatt på følgende måte: et vått DNA-filter ble presset og innført i en steril Petri-skål, 20-40 pl av RNA-oppløsningen ble pipettert på filteret og et andre DNA-filter (enten en duplikat eller en kontroll) ble lagt på toppen av det første, og de to overliggende filtere ble dekket med steril parafinolje. Etter hybridisering ble filtrene i rekkefølge vasket i medium A (2 ganger) i en opp-løsning inneholdende 1 x SSC, 0,2% SDS, 1 mM EDTA (3 ganger 10 min. ved 20°C hver gang), medium A (2 t ved 38°C) og i 50%'ig formamid, 5 x SSC, 0,1% SDS (3 ganger, 10 min. ved 20°C). Hybridisert RNA ble eluert ved oppvarmning i 1 min. ved 100°C i 200 pl 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM EDTA og 0,1% SDS. Elueringstrinnet ble gjentatt to ganger og elu-atene kombinert og RNA presipitert med etanol etter tilsetning av 2 pg gjær RNA (renset som angitt ovenfor). Den vaskede pellet ble vakuumtørket, oppløst i 3 pl H20 og injisert i oocyter. IFN-a-aktiviteten ble bestemt som angitt ovenfor.

5. Resultater av RNA- seleksjonshybridiseringsbestemmelse Bestemmelsene fra 8 grupper av 512 kloner (dvs. gruppene T, Y, j, K, • , 0, <£ og rz var negative. Bestemmelsene fra 4 grupper av 512 kloner (dvs. gruppene 1, 6, N og \) var positive, men ikke konsistente. De positive resultater er rapportert på følgende måte: IU/ml IFN-a produsert av RNA frigjort fra poly(A) RNA-DNA-hybrid (bestemmelse fra kontrollhybridisering under anvendelse av Z-pBR322(H3)/Rc3 G-4,13, supra), bestemmelsene hvor forsøksresultatene var høyere enn bakgrunnskontrollen er understreket.

Gruppe A ble oppdelt i 8 grupper av 6 4 kloner og hybridiseringen analysert som tidligere. Undergruppene ga de følgende resultater vist i samme format som ovenfor:

Undergruppene X-III ble oppdelt i 8 sett av 8 kloner og hybridisert og analysert:.

Fordi de første positive resultater ble oppnådd med settet A-III-4, ble de individuelle kolonier i dette sett (betegnet A-H) hybridisert og analysert:

Derfor inneholder klon X-III-4-C et rekombinant molekyl som er i stand til å hybridisere IFN-amRNA.

Det rekombinante DNA-molekyl i dette klon er betegnet: Z-pBR322(Pst)/HcIF-4C ("Hif-4C"), og bakteriestammen inneholdende dette: E. coli X1776 (Z-pBR322 (Pst)/HcIF-4C) ("E. coli Hif-4C"). Denne nomenklatur indikerer at det rekombinante DNA-molekyl stammer fra Zurich (Z) og plasmidet pBR322 inneholder ved Pstl-posisjonen et HIFN-acDNA ("HcIF"). Det spesielle rekombinante DNA-molekyl er avledet fra klon X- -III-4-C ( ("4C") .

OMKLONING OG KARAKTERISERING AV Z- pBR322( Pst)/ HcIF- 4C

Da primærkloner av transformerte celler ofte inneholder mere enn en type rekombinant DNA-molekyl (Efstratiadis et al., "The Primary Structure Of Rabbit Ø-globin mRNA As Determined From Cloned DNA", Cell, 10, sidene 571-85 (1977)), ble Hif-4C isolert fra E. coli X1776 (Hif-4C) kloner og renset som DBM-papirmetoden ble anvendt ved denne bestemmelsen. beskrevet ovenfor. Prøver av Hit-4C og pBR322 ble behandlet og spaltet med Pstl og analysert ved hjelp av elektroforese på en 1%-ig ag£rosegel. Hif-4C ga to bånd, en med mobiliteten for Pst-spaltet pBR322 og den andre med mobiliteten tilsvarende ca. 320 b.p.

E. coli HB101 ble transformert med det isolerte Hif-4C som beskrevet ovenfor. Seks kloner tetracyklinresistente, transformerte bakterier ble plukket ut og små kulturer fremstilt og form I DNA renset og analysert ved Pstl-spaltning og agarosegelelektroforert som angitt. Alle prøver viste spaltningsmønstere identiske med Hif-4C. En av disse om-klonede rekombinante DNA-molekyler ble betegnet Z-pBR322 (Pst)/HcIF-4c ("Hif-4c") og anvendt for ytterligere forsøk. Liten "c" betegner et omklonet DNA-molekyl.

For å bestemme kapasiteten for Hif-4c og dets cDNA-innskudd med hensyn til hybridisering til IFN-amRNA, ble Hif-4c (115 ug) fullstendig spaltet med 125 enheter Pstl, ekstrahert med fenol og kloroform og presipitert med etanol som beskrevet ovenfor. En alikvot del (10 pg) ble 5' terminalt merket

(for å tjene som markør i etterfølgende trinn) ved å oppløse det 100 pl 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), føre oppløsningen gjennom en 0,1 ml "Chelex 100" kolonne og behandle det med 0,6 enheter bakteriell alkalinfosfatase i 1 tifie ved6 5°C. Ti ganger konsentrert TNE (40 ul) ble tilsatt og oppløsningen ekstrahert 3 ganger med 1 vol fenol og 3 ganger med 1 vol kloroform. DNA ble presipitert med 2 vol etanol ved -20°C over natten og oppsamlet ved sentrifugering. For ytterligere rensning ble en prøve på 0,5 ml TNA adsorbert på 0,2 5 ml DEAE-cellulose ("Whatman DE52", forvasket med 2 ml 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 2 mM EDTA) ("NET-buffer"), vasket med 2 ml NET buffer, eluert med 0,4 ml 1,5 M NaCl,

20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 2 mM EDTA og presipitert med etanol som angitt tidligere. Det erholdte DNA ble inkubert med y-<32>P-ATP (spesifikk aktivitet ca. 5000 Ci/mmol) og polynuk-leotidkinase, (A.M. Maxam og W. Gilbert, "A New Method For Sequencing DNA", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 74, sidene 560-564 (1977)) og renset ved kromatografi på 3 ml "Sephadex-

G50" kolonne i TNE. De eluerte fraksjoner ble slått sammen

32

og P-DNA pr7 esipitert med etanol som angitt tidliq^ere. utbytte ca. 10 dpm.

Det umerkede Pstl-spaltede Hif-4c DNA (90 ug) ble blandet

5 32

med 6 x 10 dpm P-merket, Pstl-spaltet Hif-4c DNA som erholdt ovenfor og elektroforert gjennom en 10 x 20 x 0,7 cm, 2%-ig horisontal agarosegel i 50 mM Tris-acetatbuffer (pH 7,8) under anvendelse av en spalte på 2,5 cm. En rønt-genfilm ble eksponert for gelen og posisjonen av 320-bp-fragmentet bestemt. Gelstripen inneholdende det radioaktive bå• nd (1,3 x 10 5dpm) ble skåret ut, knust ved presning gjennom en plast- 2 ml injeksjonssprøyte og ekstrahert over natten ved 4°C ved omrøring med 10 ganger gelens volum med NET puffer. DNA ble adsorbert på en 0,1 ml hydroksyapatitt-kolonne (forvasket med 1 ml NET buffer). Kolonnen ble vasket med 1 ml 0,1 M K-fosfatbuffer (pH 7,5) og DNA eluert med 0,2 ml 1 M K-fosfatbuffer (pH 7,5). Eluatet ble fortynnet 10 ganger med sterilt, destillert H20 og DNA adsorbert til og eluert fra DEAE og presipitert med etanol som beskrevet tidligere. Dette DNA ble betegnet "Hif-4c fragment".

Dette Hif-4c fragment (120 ng) ble bundet til DPT-papir

(0,5 x 0,5 cm) som tidligere beskrevet. Som kontroll ble 120 ng B-globulin cDNA-fragment eksitert med Hindlll fra hybridplasmidet Z-pBR322(H3)RcBG-4,13 (F. Meyer et al., "Transposition Of AT-linked, Cloned DNA From One Vector. To Another", Experimentia, 35, side 972 (1979), N. Mantel et al., supra) og behandlet på samme måte. Hybridiseringen av duplikatfilteret til poly(A) RNA (i 20 pl), vasking av filterene og gjenvinning av RNA fra filterene ble utført som tidligere beskrevet. Etter injeksjon i oocytter ble de føl-gende IFN-a aktiviteter påvist:

Det kan således sees at Hif-4c inneholder et innskudd som er i stand til å hybridisere til IFN-amRNA.

IDENTIFISERING AV KLONER AV E. COLI INNEHOLDENDE REKOMBINANTE DNA- MOLEKYLER KRYSSHYBRIDISERT TIL INNSKUDDET I HIF- 4C

Da cDNA-innskuddet i det rekombinante DNA-molekyl Hif-4c kun var ca. 320 b.p., eller en tredjedel av den estimerte størr-else for IFN-amRNA,ble det rensede Hif-4c fragment beskrevet ovenfor anvendt som en prøve for å isolere bakterielle kloner inneholdende rekombinante DNA-molekyler inneholdende beslektede hybrid DNA-innskudd (fig. 3).

64 bakteriekloner utgjørende.undergruppe Å.-III beskrevet ovenfor,ble trykket på en "Millipore" membran (diameter 8cm), plassert på en agarplate (supplementert med diaminopimelin-syre, nalidiksinsyre og tetracyklin, som tidligere angitt) og inkubert i 24 timer ved 37°C. Filteret ble plassert på en 0,75 ml dråpe 0,5 M NaOH og ble etter 2-3 min overført til et papirhåndkle for å fjerne overskuddsvæske, hvoretter trinnet ble gjentatt. Filteret ble nøytralisert under anvendelse av 1 M Tris-HCl (pH 7,5) og vasket med 1,5 M NaCl - 0,5 M Tris-HCl (pH 7,4) på samme måte som angitt ovenfor og luft-tørket. Filteret ble dyppet i 0,3 M NaCl, lufttørket og

varmet til 80 C i 2 t under våkum. Hif-4c Pst fragmentet

32

(30 ng) ble P-merket ved "nick" translasjon (A.J. Jeffreys og R.A. Flavell, "The Rabbit 3-Globin Gene Contains A Large Insert In The Coding Sequence", Cell, 12, sidene 1097-1108

32 32

(1977)) under anvendelse av B- p dATP og a- P dCTP (spesifikk aktivitet, 40 Ci/mmol hver). Filteret som bar A-III koloniene, ble forhybridisert i 4 x SETT (SETTer 0,15 M NaCl, 30 mM Tris-HCl (pH 8,0), ImM EDTA), 0,1% (w/v) "Ficoll", 0,1% polyvinylpyrrolidin, 0,1% (w/v) BSA, 0,5% SDS og 200 ug/ml denaturerte, fragmenterte laksesperm DNA i 7 t ved 68°C og

5 32

hybridisert med 2 x 10 cpm P-merket Hif-4c i 4 x SETT 0,02% (w/v) "Ficoll", 0,02% polyvinylpyrrolidin,0,02% w/v BSA, 0,5% SDS og 200 pg/ml denaturert laksesperm DNA ved 68°C i 16 h. Filteret ble vasket med SETT-0,5% SDS ved romtemperatur, vasket 2 x SETT - 0,5% SDS i 5 t ved 68°C, utbytte oppløsningen en gang, og med 3 mM "Trizma" base ved romtemperatur i 4 tiner, under erstatning av oppløsningen en gang. Etter tørking av filteret ble en røntgenfilm eksponert for filteret i 8 tirrer under anvendelse av en sjikt. Tre kolonier ga sterk positiv respons, nemlig A.-III-7D, \-III-2H ogA-III-4C og to ga en svak respons,nemlig A. -IH-IE, X-III-3D.

Små kulturer ble fremstilt fra Hif-4c beslektede kloner, form I DNA ble renset, spaltet med Pstl og analysert ved agarosegelelektroforese som tidligere beskrevet. Alle form I DNA'er ga et stort fragment (plasmid pBR322 kjerne) og et lite fragment (hybridinnskudd). Det rekombinante DNA-molekyl fra X.-III-2H frigjorde det største innskudd, nemlig ca. 900 b.p. Dette rekombinante DNA-molekyl ble betegnet Z-pBR322(Pst)/ HcIF-2H ("Hif-2H") og dets innskudd "Hif-2H fragment".

Hif-2H ble undersøkt med hensyn til dets evne til å binde IFN-amRNA ved å binde det til DPT-papir (4 pgAm 2) og deretter hybridisere det til poly(A) RNA (0,3 ug/ul), utført som tidligere beskrevet, i 16 t og deretter bestemme IFN-amRNA-aktiviteten .

I et ytterligere ekseperiment ble et ytterligere sett E. coli kloner inneholdende rekombinante DNA-molekyler fremstilt og koloniene hybridisert til merkede Hif-4c fragmenter ble identifisert. For å sikre et høyt utbytte av plasmider med lange

32 cDNA-innskudd ble en del av det dobbeltkjedede P-merkede leukocytt cDNA fremstilt enzymatisk fra leukocytt poly(A) RNA (det samme cDNA-preparat fremstilt som tidligere angitt) ble størrelsesfraksjonert ved sentrifugering gjennom en suk-krosedensitetsgradient under anvendelse av den samme fremgangsmåte som beskrevet for sentrifugering av poly(A) RNA. Fraksjonene inneholdende cDNA med en sedimentasjonshastighet tilsvarende et 600 b.p. DNA fragment eller større ble slått sammen og cDNA gjenvunnet etter etanolpresipitering. cDNA ble forlenget med dCMP-rester, hybridisert til dGMP-forlenget Pstl-spaltet pBR322 og det erholdte hybrid DNA anvendt for å transformere E. coli som tidligere angitt, bortsett fra at E. coli HB101 ble anvendt. Bakteriene ble fordelt på 8 cm diameter "Millipore" filtere plassert på "Tryptone" medium-agarplater (inneholdende 10 pg/ml tetracyklin) og dyrket inntil små kolonier kom til syne. Et duplikatfilter ble fremstilt ved å presse et nytt, fuktig "Millipore" filter på det kolonibærende filter, hvoretter filteret ble trukket av, plassert med oversiden opp på en agarplate inneholdende 4,4%

glycerol og inkubert inntil små kolonier kom til syne. Dette kolonibærende filter ble dekket med et ytterligere "Millipore" filer, frosset ved -55°C og lagret (D. Hanahan og M. Meselson, "A Protocol For High Density Plasmid Screening", Sept. 1978, personlig kommunikasjon. I alt atten filtere med ialt ca. 5000 kolonier ble fremstilt. En replika av hvert filter ble

anvendt for hybridisering til "^P-merkede, Psjtl-behandlet Hif-4c DNA-f r -igmen t, på samme måte som beskrevet ovenfor.

Ca. 185 positive kolonier ble identifisert på et autoradio-grafi, omklonet på "Millipore" filteret og identifisert nok en gang ved hybridisering.- 95 kloner som ga den kraftigste hybridiseringsrespons ble betegnet Z-pBR322(Pst)/HcIF-SNl til SN95 og anvendt for ytterligere undersøkelser. Det er naturligvis åpenbart at når Hif-2h har evnen til å produsere et polypeptid som utviser en immunologisk eller biologisk effekt av HuIFN (infra), så vil dette Hif-2h og andre DNA-sekvenser beslektet med dette, eksempelvis Hif-4c,kunne anvendes ved denne fremgangsmåte for kloneavskjerming like godt på andre kloner inneholdende DNA-sekvenser erholdt ved rekombinant DNA-teknologi, synteser ,naturlige kilder eller en kombinasjon derav eller kloner inneholdende DNA-sekvenser beslektet med hvilke som helst av de ovenfor nevnte DNA-sekvenser ved mutasjon innbefattende enkle eller multiple basesubstitusjoner, innskudd, inversjoner eller delesjoner for å velge andre DNA-sekvenser og kloner som også koder for HuIFN. Derfor vil slike DNA-sekvenser og deres identifikasjon falle innenfor foreliggende oppfinnelses ramme. (Eksempelvis infra). Det må også forstås at DNA-sekvenser som ikke er isolert ved hjelp av de ovenfor nevnte DNA-sekvenser, men som likevel er et resultat av deres rearrangement av nukleotidkoden for uttrykket for polypeptider som koder ved hjelp av ekspresjon for de ovenfor nevnte DNA-sekvenser, vil falle innen oppfin-nelsens ramme.

Ytterligere karakterisering av Hif- 2h DNA- innskuddet

Som beskrevet ovenfor inneholder det rekombinante DNA-molekyl Hif-2h et innskudd på ca. 900 b.p. og hybridiserer til human leukocyttinterferon mRNA. De følgende ytterligere karakteristika ble bestemt.

1. Hybridarrestert translasjon

Hvis et mRNA hybridiseres til et klonet, komplementært cDNA, forhindres translasjonen av mRNA. Imidlertid frigjør varme-denaturering av hybridet translaterbar mRNA (B. M. Paterson et al., "Structural Gene Identification And Mapping By DNA-mRNA Hybrid-Arrcstcd Col1-Free■ Translation", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 74, sidene 4370-74 (1977)). 2,2 pg _s_fcl-spaltet Hif-2h( og som kontroll 2 ug Hindlll-splittet Z-pBR322(H3)/RcSG-4,13 ("Rc3G"),ble denaturert i 10 pl 80%-ig (vol/vol) deionisert formamid - 20 mM "PIPES" buffer (pH 6,4) i 10 min. ved 80°C. Oppløsningen ble tilsatt et Eppendorfrør inn i hvilket leukocytt poly(A) RNA (5 pg), NaCl (4 p mol) oq LDTA (10 nmol) var nedtørket. Blandingen ble oppvarmet i 7 t ved 4 8°C under et lag parafinolje, avkjølt og fortynnet med 200 pl H20. De to prøver ble hver delt i to like deler hvorav en av h<y>er av disse ble oppvarmet til 100°C i 30 s. Nukleinsyrene ble presipitert med etanol, oppløst i 3 pl H^O og undersøkt med hensyn til IFN-amRNA-aktivitet i oocytter som ovenfor angitt:

Derfor inhiberte Hif-2h, når det ble hybridisert med poly(A) RNA, translasjonen av IFN-amRNA i poly(A) RNA, og etter denatu-rering av hybridet ble igjen IFN-amRNA translaterbar. Dette forsøk bekrefter ytterligere at Hif-2h inneholder sekvenser komplementære til IFN-amRNA.

2. Analyse ved hjelp av restriksjonsenzymspaltning og be-stemmelse av nukleotid/aminosyresekvenser og restriksjonskart

Spalning av Hif-2h med forskjellige restriksjonsenzymer (New England Biolab) ble utført og de erholdte produkter analysert ved agarosegel-elektroforese. De understrekede fragmenter er ikke felles for pBR322 og Hif-2h:

32

I tillegg ble 5' terminert P-merket Pstl spaltet Hif-2h i tillegg spaltet med flere restriksjonsenzymer og størrelsen av de radioaktive fragmenter avledet fra cDNA-innskudd idet rekombinante DNA-molekyl ble bestemt.

På basis av disse data ble et restriksjonskart- for Hif-2h dedusert (fig. 4). Kartet er ikke definitivt med hensyn til den absolutte plassering med hensyn til posisjonene og kan være ufullstendig med hensyn til MbolI-posisjonene inne i innskuddet. Kun posisjonene nærmest innskuddet er gitt inne i pBR322-kjernen. Pilen indikerer orienteringen for IFN-acDNA-kodekjeden.

Selv om den aktuelle struktur av Hif-2h-fragmentet eller andre innskudd i klonene ifølge oppfinnelsen eller for aminosyresekvensen eller1 strukturen av polypeptinene kodet derfra ikke er nødvendig for en fagmann som skal utøve oppfinnelsen, så ble de ovenfor nevnte data og restriksjonskartet medtatt i den opprinnelige beskrivelse som den beste tilgjengelige informasjon med hensyn til fragmentets struktur på tidspunktet for innlevering av den opprinnelige søknad. Siden det tidspunkt er som ventet (supra, s 9, linjene 27-29) disse data og restriksjonskartet for Hif-2h-fragmentet forbedret under anvendelse av velkjent teknikker, for nukleotid-sekvensering og restriksjonsanalyse. Se eksempelvis A. M. Maxam and W. Gilbert, "A New Method For Sequencing DNA", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 74, sidene 560-64 (1977). Plasmid DNA ble fremstilt ved metode B (N. M. Wilkie, et al., "Hybrid Plasmids Containing An Active Thymidine Kinase Gene Of Herpes Simplex Virus 1", Nucleic Acids Research, 7, sidene 859-77

(1979)) og spaltet av forskjellige restriksjonsenzymer i det vesentlige i henhold til leverandøren, bortsett fra at 200 ug/ml gelatin erstattet C-serumalbuminet i enzymbufferne.

( EcoRI var en gave fra W. Boll, Bspl en gave fra A. Kiss og andre enzymer ble erholdt fra New England Biolabs).

Spaltet DNA (20 pg) ble ekstrahert med fenol, presipitert med etanol, oppløst i 0,05 M Tris-HCl (pH 8) og ført gjennom en liten kolonne "Chelex-100". Fragmenter med strake eller 5<* >"klebrige" ender ble defosforylert ved behandling med 0,2 enheter kalv fordøyelsesalkalisk fosfatase (Boehringer) pr. pmol DNA 5'-ender i 200 pl 0,05 M Tris-HCl (pH 8) i 60 min ved 37"C. Enzymet ble inaktivert ved oppvarming i 60 min ved 65'C. For DNA-fragmenter med 3' "klebrige" ender ble bakteriell alkalisk fosfatase (Worthington) anvendt som beskrevet av (A. M. Maxairt og W. Gilbert, supra) , bortsett fra at inkubasjons-stiden var 30 min ved 65° C. Det defosforylerte DNA ble renset ved adsorpsjon på og eluering fra DEAE-cellulose (W. Muller et al., "Site-Directed Mutagenesis In DNA: Generation of Point Mutations Corresponding To Amino Acids 121-123", J. Mol. Biol., 124, sidene 343-58 (1978)) eller underkastet polyakrylamingel-elektroforese når dette var nødvenig (se nedenfor). Fragmenter gjenvunnet fra polyakrylamid (eller agarose)-gelen i 0,15 M NaCl, 0,05 M Tris-HCl (ppH 8), ble absorbert på en 0,1 ml hydroksyapatitt ("Biorad HTP")-kolonne, vasket 4 ganger med 1 ml 0,1 M kaliumfosfatbuffer (pH 7) og eluert med 0,3 ml 1 M kaliumfosfatbuffer (pH 7). Oppløsningen ble fortynnet 10 ganger og DNA absorbert på DEAE-cellulose og gjenvunnet 10 ganger som beskrevet av W. Muller et al., supra.

Etter etanolpresipitering ble DNA 5<1->terminertmerket med

32

[Y- P] ATP (12-34 pCi pr. pmol DNA 5'-ender) og polynukleo-tidkinase (New England Biolabs eller P-L Biochemicals Inc.)

i det vesentlige slik som beskrevet av A. M. Maxam og W. Gilbert, supra, bortsett fra at DNA ikke ble denaturert før kinasereaksjonen. Spesifikke aktiviteter på 1-1,5 pCi-

32

[ P] fosfat pr. pmol DNA 5'-ender ble erholdt.

For sekvensering ble merkede fragmenter spaltet ved hjelp av et andre restriksjonsenzym og produktene separert ved elektroforese gjennom en 5%''ig polyakrylamidgel i tris-borat-EDTA-buffer. De ønskede fragmenter ble ekstrahert fra gelen og renset (Muller et al., supra). De forskjellige fragmenter for sekvensering ble fremstilt som følger (tallet indikerer den nominelle fragmentkjedelengde i baseparene, de angitte posisjoner er merket med en stjerne): (1) spaltning av Hif-2h med Bspl, isolering av BspI- BspI-232 og BspI- BspI-949 ved 5% polyakrylamidgel-elektroforese i <M>Loening's" buffer (U. E. Loening "The Fraction Of High Molecular Weight Ribonukleic Acid By Polyacrylamide Gel Elec-trophoreses", J. Biochem. side 102 (1967)); (2) spaltning av Hif-2h med Bspl, merking, spaltning med Pstl, isolering av BspI<*->PstI-83 og BspI*- PstI-827; (3) spaltning av Hif-2h med Bglll, merking, spalting ved Pstl, isolering av BglII*- PstI-336 og BglII*- PstI-570; (4) spaltning av Hif-2h med MboII, merking, nedbrytning med Pstl og Hindll (for å spalte et interfererende 350 bp pBR322-fragment), isolering av MboII - PstI-519 og MboII - PstI-351; (5) spaltning av Hif-2h med EcoRI, merking, spaltning med Pstl, isolering av EcoRI*- PstI-708 og EcoRI*- PstI-198; (6) spaltning av Hif-2h med Pstl, merking, spaltning med Bglll, isolering av PstI*- BglII-570 og Pstl -BglII-336; (7) spaltning av Hif-2h med AvalI, merking, spaltning med Pstl og Bglll, isolering av AvaII - PstI-186 og Avall - Bglll-147 ; (8) spaltning av Hif-2h med PvuII, merking, spaltning med Pstl og Bglll, isolering av PvuII - PstI-486.

Fragmentene ble degradert i henhold til fremgangsmåten iføl-ge A. M. Maxam og W. Gilbert, supra, med de modifikasjoner som er beskrevet i protokollene tilveiebrakt av de samme forfattere i september 1978. Produktene ble fraksjonert på 0,1 x 25 x 36 cm 12%'ig polyakrylamidgeler (akrylamid/bisak-rylamid = 18/1) i 50 mM tris-borat, 1 mM EDTA (pH 8,3) med forsøk utført ved 2, 8, 18 og 26 h ved 900 V etter en 6 timers forelektroforese ved 700 V. Best resultater ble erholdt når gelene ble holdt ved romtemperatur 2-3 dager før anvend-elsen .

Hver utstrekning av cDNA-innskuddet ble sekvensert fra begge bånd og hver restriksjonsposisjon, som tjente som merket terminal, ble sekvensert under anvendelse av et fragment som omfattet dette. De således erholdte nukleotidsekvenser er gjengitt i figurene 8-10. Som forventet er posisjonene for de forskjellige restriksjonsposisjoner i dette innskudd lokalisert mere absolutt enn de som ble bestemt med restriksjonsenzym-spaltning alene og gjengitt i fig. 4.

Under henvisning til fig. 8-10 kan det ses at den heteropoly-mere del av innskuddet er flankert av 23G rester ved 5'-enden og med 7A-rester (muligens reflekterende poly(A)-av-slutningen av mRNA) fulgt av 15C-rester ved 3'-endedelen. For referanse er innskuddet nummerert fra det første nukleotid som følger dG-halen til den siste nukleotid før poly(A)-restene. En ATG-initierende triplett i posisjon 57-59 og en TAA terminerende triplett i posisjon 624-626 definerer en leseramme ikke avbrudt av nonsens kodoner. Begge de to andre leserammer i dette området av innskuddet inneholder henholdsvis 18 og 12 nonsens kodoner. Ytterligere,

de eneste andre sekvenser, dvs. i forskjellige leserammer som er flankert av ATG og GTG og et terminerende signal,

som koder for et polypeptid med 25 aminosyrer eller flere(

er lokalisert henholdsvis mellom nukleotidene 226 og 304, 640 og 778 og 683 og 743. Området mellom nukleotidene 57 og 626 vil derfor mest sannsynlig innbefatte nukleotidesekvens-ene for Hif-2h-fragmentet som koder for et polypeptid som utviser en biologisk og immunologisk aktivitet av IFN-a.

Det må naturligvis forstås at klonet cDNA fra poly(A) RNA ved de vanlige fremgangsmåter (A. Efstratiadis et al., supra) mangler 5'terminal nukleotider og kan også inneholde kunst-ige sekvenser (R. I. Richards et al., "Molecular Cloning. And Sequence Analysis Of Adult Chicken B-Globin cDNA", Nucleic Acids Research, 7, sidene 1137-46 (1979)). Det er derfor ikke sikkert at ATG lokalisert i nukleotidene 57-59 i virke-ligheten er det første ATG i autentisk mRNA. Imidlertid for formålet med den etterfølgende beskrivelse er det antatt at ATG ved nukleotidene 57-59 er det første ATG i autentisk mRNA.

Ved å sammenligne polypeptidet kodet av dette området av innskuddet med sekvensen på 3 5 amino-terminal aminosyre i autentisk humant lymfoblastoid interferon —SerAspLeuProGlnThrHis-SerLeuGlyAsnArgArgAlaLeuIleLeuLeuAlaGlnfletGlyArglleSerLeu-PheSerCysLeuLysAspArgHisAsp-- bestemt av K. C. Zoon ét al., supra og M. Hunkapiller and L. Hood, supra, synes det som om den valgte leseramme er korrekt og at nukleotidene 57-124 kan kode for en signalsekvens som kommer forut for nukleotidsekvensen som koder for det ferdigutviklede polypeptid, fordi en sammenholding av den publiserte sekvens med den bestemte sekvens (fra den 24. aminosyre og utover) viser en omfattende homologi (dvs. for 26 av 35 aminosyrer).

I eukaryotisk mRNA'er er den første AUG-triplett fra 5'-endedel vanligvis den initierende posisjon for proteinsyn-tesen (M. Kozak, "How Do Eukaryotic Ribosomes Select Ini-tiation Regions In Messenger RNA", Cell, 15, sidene 1109-25

(1978)). Kodonet i Hif-2h-fragmentet som tilsvarer den første aminosyre i lymfoblastoid-interf eron^er 22 kodoner fra den første AUG (og 14 kodoner fra den andre) hvilket indikerer at sekvensen som koder for interferon kan ligge forut for sekvensen som bestemmer et signalpeptid på 23 (eller mindre trolig 15) aminosyrer. Den lengste av de antatte signalsekvenser inneholder en uabrutt serie på 11 hydrofobe aminosyrer (og den korteste en på 6 hydrofobe aminosyrer). Denne akkumulering av hydrofobe rester er karakteristisk for en signalsekvens (cf-, B. D. Davis and P. C. Tai, "The Mechanism Of Protein Secretion Across Membranes", Nature, 283, sidene 433-38 (1980)).

Sekvensen som tilsynelatende svarer ferdigutviklet IFN-a-polypeptid, omfatter 4 98 nukleotider som koder for 166 aminosyrer. Hvis det antas at det ikke skjer noen karboksyterminal avkutning (prosessing^ er molekylvekten for interferon-polypeptidet 19 388. Basesammensetningen for kodesekvensen er 50% GC. Kodonanvendelsen i interferonkodesekvensen er i rimelig overensstemmelse med denforeslått for pattedyr mRNA'er generelt. (R. Grantham, et al., "Codon Catalog Usa-ge And The Genome Hypothesis", Nucleic Acids Research, 8, sidene 49-62 (1980)). Eventuelle observerte avvik kan til-skrives det lille antall som er involvert.

Strukturen for polypeptidet gjengitt i fig. 8-10 for Hif-2h-fragmentet,tar naturligvis ikke hensyn til eventuelle modifikasjoner av polypeptidet forårsaket av samspillet med in vivo-enzymene (eksempelvis glykosylering). Det må derfor forstås at denne struktur ikke behøver å være identisk med det in vivo-dannede IFN-a^men har meget likesom ikke identiske, biologiske og immunologiske egenskaper. Heller ikke vil denne struktur utelukke sannsynligheten for at andre modifikasjoner så som mutasjoner, innbefattende enkelte eller multiple, basesubstitusjoner, delesjoner, innskudd, eller inversjoner eller kjemiske avledninger fra denne struktur vil danne forbindelser som også utviser IFN-a-aktivitet.

3. Bestemmelse av plusskieden i det innskutte IFN- acDNA

DNA-kjeden som har den samme sekvens som mRNA,betegnes som plusskjeden og dets komplement som minuskjeden Plusskjeden av IFN-acDNA innskuddet ble identifisert som indikert i fig. 5. Hif-2h DNA ble spaltet med restriksjonsenzymet Bglll. endedelene merket med 3 2P-fosfat, slik som beskrevet ovenfor for Pstl-spaltede ender) og DNA ble behandlet med Pstl til å gi lengere (545 b.p. (570 b.p. bestemt ved den ovenfor rapporterte mere raffinerte analysemåte)) og kortere 340 bp (336 bp som bestemt ved den mere raffinerte analysemåte angitt ovenfor)) radioaktive fragmenter. Disse fragmenter ble denaturert og hybridisert til poly(A) RNA fra induserte leukocytter i 80 % formamid, 0,4 M NaCl, dvs. under betingelser hvor DNA-DNA reassosiasjon ikke finner sted (supra). Nukleinsyrene ble behandlet med nuklease Sl, som nedbryter alle enkeltkjedede nukleinsyrer, særlig ikke-hybri-32 ■

d.isert P-DNA(og produktene ble separert pa en polyakrylamidgel (R. F. Weaver og C. Weissmann, "Mapping Of RNA By A Modification•Of The Berk-Sharp Procedure", Nucleic Acid Research, 7, sidene 1175-93 (1979)). Et autoradiogram viste at kun det kortere nukleotidfragment var hybridisert og beskyttet av poly(A) RNA, hvilket identifiserer den 5'merkede kortere nukleotidkjede som minuskjeden. Orienteringen av plusskjeden er derfor som gitt i fig. 4 og fig. 5 (høyre side).

4. Påvisning av at poly( A) RNA fra ikke- induserte humanleukocytter ikke hybridiserer til Hif- 2h DNA

Et forsøk identisk til det beskrevet i det foregående avsnitt ble utført, imidlertid ble det anvendt poly(A) RNA fra ikke-induserte humanleukocytter, fremstilt ved den samme fremgangsmåte som beskrevet for Sendai virus-induserte leukocytter. Ingen påvisbare mengder merket DNA ble beskyttet. Ved sammenligning med resultatene fra det foregående avsnitt, så inneholdt poly(A) RNA fra ikke-induserte celler mindre enn 1/2 0 av mengden av mRNA hybridisert til Hif-2h enn det som er tilfelle for poly(A) RNA induserte celler.

SYNTESE AV ET POLYPEPTID MED INTERFERONAKTIVITET VED HJELP AV E. COLI INNEHOLDENDE REKOMBINANTE DNA- MOLEKYLER BESLEKTET

MED Z- pBR322( Pst)/ HcIF~ 4c

Pstl posisjonen for pBR322 ligger innen 3-laktamase (penicillinase) genet. Derfor når et kodende DNA-segment (eksempelvis en cDNA omfattende alt eller en del av et gen) innpodes

i posisjonen i den riktige orientering og riktige lese ramme, kan et sammensmeltet protein oppstå. Proteinet vil bestå av en amjno-avsluttende del av 3-laktamase etterfulgt av aminosyresekvensen for hvilken den innskutte DNA-sekvens koder

(L. Villa-Komaroff et al., supra). Hvis det innskutte DNA-segment omfatter en DNA-sekvens inneholdende sitt eget ini-tieringssignal og har en sekvens forut for dette med et terminerende signal i fase med 3-laktamasesekvensen,kan terminering og reinitiering finne sted ved det andre initie-ringssignal og et ikke-sammensmeltet, aktivt protein kan oppstå (A.C.Y. Chang et al., supra). For å sikre at DNA-

innskuddet beslektet med Ii.if-.4c ble innskutt i den riktige leseramme for ekspresjon inne i 3-laktamaselegemet, ble et sett derivater av pBR322, nemlig pKT279, pKT280 og pKT287 (konstruert av K. Talmadge, personlig kommunikasjon 1979). Hvert av disse derivater har en Pstl-posisjon lokalisert slik at et DNA-inskudd podet inn i denne posisjon vil være i en annen leseramme i forhold til et innskudd ved Pstl-posisjonen for de andre derivater av settet (fig. 6). Derfor muliggjør settet innføring av DNA i 3-laktamasegenet i alle tre leserammer. Det Pstl-utskårede innskudd fra Hif-2h ble fremstilt som beskrevet for fragmentet Hif-4c. Hif-2h Pst fragmentet (10 ng) ble blandet med Pstl-spaltet pBR322, pKT279, pKT280 eller pKT287 (10 ng i hvert tilfelle) i 20 pl 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 6 mM 3-merkaptoetanol, 200 pg/ml gelatin og 0,1 mM ATP og inkubert med 0,1 enheter T4 DNA-ligase (New England Biolabs) i 16 t ved 10°C. De resulterende rekombinante DNA-molekyler er betegnet Z-pBR322 (Pst)/HcIF-2h, Z-pKT279(Pst)/HcIF-2h,Z-pKT280(Pst)/HcIF-2h og Z-pKT287(Pst)/HcIF-2h. E. coli HB101 ble transformert med hver av disse rekombinante DNA-molekyler,og transformerte kolonier ble utvalgt på tetracyklininneholdende agarplater, som tidligere beskrevet. Da tetracyklinresistente kloner av transformerte bakterier også kan inneholde den recykliserte vektor,ble bakteriekoloniene fra hvert sett dyrket på "Millipore" filtere og kolonier hybridisert til <32>P-merkede Hif-4c fragmenter ble identifisert og valgt ut, som ovenfor beskrevet. Disse stammer ble betegnet som følger,

E. coli HB101 (Z-pBR322(Pst)/HcIF-2h-AHl) til (-AH3),

E. coli HB101 (Z-pKT279(Pst)/HcIF-2h-AHl). til (-AH8),

E. coli HB101 (Z-pKT280(Pst)/HcIF-2h-AHl) til (-AH8),

E. coli HB101 (Z-pKT287(Pst)/HcIF-2h-AHl) til (-AH8),

Ekstrakter av noen av de ovenfor nevnte stammer såvel som noen av stammene Z-pBR322 (Pst)/HcIF-SNl til 95; ble undersøkt med hensyn til IFN-a aktivitet. Bakteriene ble dyrket i et tryptonmedium til stasjonær fase, oppsamlet, vasket med 1/20 vol ( regnet på volumet på kulturen) 50 mM Tris-HCl (pH 8), 3 0 mM NaCl og frosset. Etter tining ble cellene resuspendert i volumet indikert i det etterfølgende av den tidligere buffer og lysozym ble tilsatt til 1 mg/ml. Etter 60 min. ved 0°C ble suspensjonene frosset (i et etanoltørt isbad) og tinet (ved 37°C) 5 ganger og sentrifugert i 10 min. ved 12 000 omdr./min. i en "GSA Sorvall" rotor.

I visse tilfeller ble en del av supernatanten (S30) ytterligere sentrifugert ved 100 000 x g i en "Type 65 Spinco" rotor og supernatantene (S100) gjenvunnet. Slike super-natanter ble undersøkt med hensyn til IFN-ct aktivitet bestemt ved nedsettelse av den cytopatiske effekt (Eksperiment 1). Koloniene som viste en positiv respons i forsøk 1 ble igjen undersøkt,såvel som 49 kloner fra settet Z-pBR322/ HcIF-SN-1 til SN-95 som beskrevet tidligere, ved en mindre fortynning (eksperiment 2).

Kilde til ekstraktet:

Kilde til ekstraktet:

Noen av de mest aktive produsenter fra de ovenfor nevnte ble undersøkt mere detaljert. Kulturer ble dyrket til sen "log-fase" (observert OD650 ca" °'9' og cellene lysert som angitt ovenfor i 1/50 av kulturvolumet. De følgende aktiviteter ble funnet under anvendelse av Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN32 som negativ kontroll:

Det må forstås at det aktuelle protein produsert av disse stammer ikke er analysert strukturelt for å bestemme hvorvidt det er produsert sammensmeltet til aminosyrer som ikke er beslektet med IFN eller med alt eller en del av IFN's signalsekvens. Imidlertid uansett hvilket protein som er fremstilt, så utviser det en immunologisk og biologisk aktivitet som IFN. Derfor er proteinet som uttrykt,nyttig. Mere viktig

er at proteinets aktivitet demonstrerer at DNA-sekvensen som koder for det,er en DNA-sekvens beslektet med HuIFN-a. Det er derfor innen teknikkens stand å anvende denne DNA-sekvens, slik som vist,for å velge andre lignende HuIFN-a beslektede DNA-sekvenser og for å gi en basis for andre konstruksjoner som vil uttrykke ferdigutviklet interferon eller andre varianter derav, eller som vil forbedre utbyttet av det spesielle protein som er uttrykt.

Produksjonsnivået for et protein styres av to hovedfaktorer: antall kopier av dets gen inne i cellen og effektiviteten med hvilken disse genekopier er transkribert og translatert. Effektiviteten av transkripsjonen og translasjonen (som sammen utgjør ekspresjon) er på sin side avhengig av nukleotidsekvensene som normalt forekommer foran den ønskede kodesekvens.

Disse nukleotidsekvenser eller ekspresjonskontrollsekvenser definerer blant annet lokaliseringen ved hvilken RNA-polymerase innvirker til å initiere transkripsjon (promotorsek-vensen) og til hvilken ribosomer bindes og innvirker med mRNA (produktet av transkripsjonen) for å initiere translasjon. Ikke alle slike ekspresjonskontrollsekvenser virker med den samme effektivitet. Det er således fordelaktig å separere de spesifikke kodesekvenser for det ønskede protein fra deres tilstøtende nukleotidsekvenser og i stedet sammen-smelte dem til andre kjente ekspresjonskontrollsekvenser, for således å fremme høye nivåer av ekspresjonen. Når dette er oppnådd;kan det nykonstruerte DNA-fragment inn-skytes i et multikopiplasmid eller et bakteriofagderivat for å øke antallet av genekopier inne i cellen og derved ytterligere forbedre utbyttet av det uttrykte protein.

Flere ekspresjonskontrollsekvenser kan anvendes som beskrevet ovenfor. Disse innebefatter operator, promotor og ribosom-binding og påvirkningssekvensene (innebefattende sekvenser såsom Shine-Dalgarno sekvensene) for laktose operon av

E. coli ("lac-systemet"), de tilsvarende sekvenser for tryp-tofansyntetase-systemet av E. coli ("trp-systemet"), hovedoperator- og promotorområdenem for fag X (0_P_ og OrPr), kontrolområdet for fag fd kappeprotein, eller andre sekvenser som kontrollerer ekspresjonen for gener av prokaryo-tisk eller eukaryttiske celler og deres vira. Derfor for å forbedre produksjonen av spesielle polypeptider i en passende vert,kan genet som koder for dette polypeptid fremstilles som tidligere og fjernes fra et rekombinant DNA-molekyl inneholdende dette,og igjen innføres i et rekombinant DNA-molekyl nærmere dens tidligere ekspresjonskontrollsekvens eller under kontroll av en av de ovenfor nevnte ekspresjons<on~ trollsekvenser. Slike fremgangsmåter er kjent fra teknikkens stand.

Ytterligere forøkelse i cellulært utbytte av de ønskede produkter er avhengig av forøkelsen i antallet gener som kan utnyttes i cellen. Dette oppnås, eksempelvis, ved innføring av rekombinante DNA-molekyler konstruert som tidligere beskrevet i det passende ("templat") bakteriof ag A. (NM989) , enklest ved behandling av plasmidet med et restriksjonsenzym til å gi et lineært molekyl som deretter blandes med en restrik-sjonsbehandlet fagA.kloningsbærer(eksempelvis typen beskrevet av N. E. Murray et al., "Lambdoid Phages That Simplify The Re-covery Of In Vitro Recombinants", Molec. gen. Genet. 150, sidene 53-61 (1977) og N. E. Murray et al., "Molecular Cloning Of The DNA Ligase Gene From Bacteriophage T4", J. Mol. Biol., 132, sidene 493-505 (1979)) og det rekombinante DNA-molekyl fremstilt ved inkubasjon med DNA-ligase. Den ønskede rekombinante fag velges som tidligere og anvendes for å lysogenisere en vert av stammen E. coli.

Særlig nyttige A. klonebærere inneholder en temperaturtøl-som mutant av represjonsgenet cl og suppressible mutasjoner i genet S, produktet av hvilket er nødvendig for lyse av vertscellen og genet E, produktet av hvilket er hovedkapsid-proteinet for viruset. Med dette systera dyrkes de lysogene celler ved 32°C og oppvarmes deretter til 45°C for å indu-sere avkutning av profaget. Ytterligere vekst ved 37°C fører til høye produksjonsnivåer av proteinet som bibeholdes inne i cellene da disse ikke er lysert av faggenproduktene på normal måte og da faggeninnskuddene ikke er enkapsidert vil det forbli tilgjengelig for ytterligere transkripsjon. Kun-stig lyse av cellene vil derved frigjøre produktet' i høyt utbytte.

I et første forsøk på å forøke utbyttet av polypeptidet som utviser en biologisk eller immunologisk aktivitet som humanleukocyttinterferon, fremstilt fra verter transformert med Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN35 ved den ovenfor beskrevne fremgangsmåte så ble et restriks jonskart for DNA-innskuddet for hybridet bestemt. Denne kartlegning viste at sammenlignet med Hif-2h, manglet Hif-SN35 en Pstl-posisjon flankerende 3' enden av sekvensen, en del av signalsekvensen var borte (opptil og innebefattende kodon 7) og Avall—posisjonen i signalsekvensen var erstattet med en Bspl posisjon. Derfor er Hif-SN35 trol:g en polymerisk eller arvelig variant av Hif-2h.

Plasmidet Hif-SN35 ble åpnet med Pstl og resulterende DNA-bånd avkuttet (chewed back) ved begge ender under anvendelse av standard prosedyre og LAC-Alu fragmentet (infra) innskutt deri og plasmidet på nytt lukket. Den aktuelle struktur av det modifiserte plasmid, identifisert som Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN3 5-AHL6, og aminosyresekvensen ved aminoterminalenden av proteinet produsert i E. coli, er bestemt. Nukleotidsekvensen av denne konstruksjon viser at LAC-Alu fragmentet var knyttet til en aminosyre borte fra den første aminosyre av IFN-al (SN35). Denne aminosekvens for aminoterminaldelen av proteinet uttrykt i E. coli viste at et sammensmeltet protein var fremstilt med seks aminosyrer sammensmeltet til IFN-al (SN35) sekvensen. Imidlertid fremstilte verter transformert med det modifiserte plasmid ca. 100 ganger mere polypeptid som utviste den biologiske eller immunologiske aktivitet for humanleukocyttinterferon , sammenlignet med verter transformert med umodifisert Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN35.

Under henvisning til figur 25,så vises et annet forsøk på å forbedre utbyttet av polypeptidet som utviser en immunologisk eller biologisk aktivitet for human leukocyttinterferon, fremstilt av verter transformert med Z-pBR322-(Pst)/HcIF-SN35 (SN35 i figur 25). Hybridplasmidet ble spaltet under anvendelse av standard fremgangsmåter med Bspl ( en gave fra Dr. Kiss). Etter varmeinaktivering (65°C, 30 min.) av restriksjonsenzymet ble blandingen justert til 50 mM Tris-HCl (pH 8) og oppvarmet (37°C, 30 min.). Etter ekstraksjon med fenol og eter ble det største, nemlig alcDNA-fragmentet, isolert på lavtemperaturgelende agarose (0,8 %)

og Hindlll- linkere festet. Det modifiserte fragment ble forenet med Hindlll-spaltet plasmid HS-pBR322 (Eco)/lacUV5-150 ("LAC-150")<*> (en gave fra H. Schaller) ved å smelte fragmentinneholdende gelstykker (ca. 20 ul hver) ved 65 C, avkjøling til 37°C og tilsette 20 enheter/ul T4 DNA-ligase. Etter 16 t ved 15°C fant ligering sted i den størknede gel (H. Lehrach, (personlig meddelelse 1980) . Et tiendedels volum 100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM CaCl2, 100 mM MgCl2 ble tilsatt til prøven,og den ble oppvarmet i 5 min. ved 65°C og avkjølt til 37°C. Prøvene ble deretter anvendt for å transformere en Ca ^-behandlet E. coli HB101, inkubert ved

o o

0 C i 20 min., oppvarmet ved 42 C i 1 min. og i 10 min. ved 20 oC. Etter tilsetning av 1 mol tryptonmedium ble prøvene inkubert i 60 min. ved 37°C og plassert på agarplater inneholdende ampicillin. Plasmid DNA ble separert fra disse kulturer som tidligere angitt,og hybridplasmidet inneholdende IFN-al-innskuddet ved dets 5'ende tilstøtende LAC-fragmenter identifisert ved restriksjonsanalyse. Plasmidet ble deretter spaltet med EcoRI ved anvendelse av konvensjonelle fremgangsmåter og behandlet med eksonuklease BAL-31 (0,06

+ Dette plasmid inneholder lac-promotoren HaeIII-202 bp-fragmentet (W. Gilbert et al., "Lactose Operator Sequences And The Action Of Lac Repressor" in Protein Ligand Interactions, H. Sund and G. Blauer, eds. (Berlin, Walter de Gruyter), sidene 193-206 og. K. Backman et al., "Maximizing Gene Expression On A Plasmid Using Recombination In Vitro", Cell. 13. sidene 65-71 (1978) flankert av en EcoRI- linker ved dets 3'ende.

enheter/ml, 2-4 min. ved 30°C) for å fjerne den overhengende EcoRI-hale av LAC-fragmentet og for å avkorte det B-galaktosidase-kodende segment.

For å sikre at det behandlede plasmid inneholdt en fullstendig IFN-al-kodende sekvens ble plasmidet spaltet med Bglll, under anvendelse av vanlige fremgangsmåter, opparbeidet som tidligere,og det største fragment ble separert på agarosegel (0,8 %). Dette fragment ble deretter kombinert med et BspI- Bglll-fragment fra Z-pBR322 (Pst)/HcIF-SN35, og det resulterende hybridplasmid anvendt for å transformere E. coli HB101 som,tidligere angitt. De transformerte kolonier ble avskjermet for IFN-aktivitet, og en klon med et høyt nivå for IFN-aktivitet ble valgt ut. Denne klon ble betegnet E. coli HB101 (C8-IFN-al) og dets hybridplasmid C8-IFN-al.

DNA-sekvensanalyse av C8-IFN-al viste at kodesekvensen etterfølgende initiator-tripletten bestemmer de første 7 aminosyrer av B-galaktosidase, en Pro-rest generert ved sammensmeltning, aminosyrene 16-23 av IFN-al-signalsekvensen og IFN-al (SN35)-sekvensen. E. coli minicellestammer (DS410) transformert med hybridplasmidet C8-IFN-al produserer ca. 50 millioner enheter IFN pr. liter eller ca. 2500 ganger mere polypeptid som utviser en immunologisk eller biologisk aktivitet tilsvarende den for HuIFN, sammenlignet med miniceller transformert med umodifisert Z-pBR322(Pst)/Hif-SN35. Aminosyresekvensen for polypeptidet produsert av plasmidet C8-IFN-al bekrefter at produktet er et sammensmeltet protein med 7 aminosyrer fra 3-galaktosidase, en aminosyre generert ved smeltning av aminosyrene 16-23 i IFN-al-signalsekvensen smeltet til IFN-al.

Ytterligere eksempler på forskjellige konstruksjoner for å forbedre proteinutbyttet i henhold til foreliggende oppfinnelse er diskutert i forbindelse med andre former for IFN-a (infra).

EGENSKAPER AV INTERFERONAKTIVITET PRODUSERT VED E. COLI TRANSFORMERT MED HYBRIDPLASMIDER

1. IFN- a- aktivitetens følsomhet mot trypsin

50 ul prøver autentisk HuIFN-a (spesifikk aktivitet 1,2 x 10^ enheter/mg, 50U) og SlOO-ekstraktene beskrevet ovenfor av E. coli HB101 (Z-pKT287(Pst)/HcIF-2h-AG6) ("Hif-287-6-ekstrakter") (200 enheter/ml, 10 enheter) og av E. coli HB101 (Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN35) ("Hif-35-ekstrakter") (1000 enheter/ml, 50 enheter) ble inkubert med forskjellige mengder trypsin, slik som indikert nedenfor, i 30 min. ved 37°C.

Da S100-ekstraktene har et høyere proteininnhold, hvilken HuIFN-a ikke har, ble en blanding av HuIFN-a og kontroll SlOO-ekstrakter Hif-32 undersøkt parallelt:

Følgelig er IFN-a fra ekstraktene følsomme for trypsin og er følgelig et protein.

2. Oppførsel ved kromatografi på " Sephadex G- 100" Ekstraktet Hif-35 (1 ml) og S100-ekstraktet av E. coli HB101 (Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN32) ("Hif-32-ekstrakter") ble kromatografert på en 32-ml Sephadex G-100 kolonne ved 4 o'C i "50mM K-fosfatbuffer (pHi 7,4). Cytokrom c (0,2 mg) ble tilsatt som en intern markør. Strømningshastigheten var 2 ml/ fe og 1 ml's fraksjoner ble oppsamlet. Absorpsjonen ved 280 nm og 405 nm (cytokrom c), og IFN-a-aktiviteten ble bestemt. Som det fremgår av fig.. 7 var IFN-a-aktiviteten for Hif-35-ekstraktene eluert før cytokrom c, med en k^-verdi på ca. 0,45. Derfor er den .observerte molekylvekt for substansen mellom 20 000 og 30 000 (Molekylvekten bestemt ved nuk-leotidesekvensering og forutsatt ingen karboksyterminal "prosessing" er 19 388). Ingen aktivitet ble påvist for fraksjoner av kontrollekstraktet Hif-32. 3. Inhibiering av interferonaktiviteteh for Hif-35 og Hif-287-6 ved hjelp av antistoff mot human leukocyttinterf eron.

HuIFN-a (spesifikk aktivitet 1,2 x IO<6> IU/mg), og Hif-35/ Hif-287-6 S100-ekstraktene ble inkubert med forskjellige fortynninger av saueantiserum mot HuIFN-a (fremstilt av K. Cantell, 24. februar 1976, spesifikk aktivitet 450 000 enheter/ml) i 100 ul "Modified Eagles Medium" (MEM) med 10 % kalveserum i 30 min. ved 37°C hvoretter 45 ul ble undersøkt med hensyn til IFN-a-aktivitet ved nedsettelse av den cyto-fatiske effekt. (Antistoffet i seg selv forårsaker ikke noen cytofatisk effekt).

For å vise at virkningen av anti stoffet ikke skyldtes en uspesifisert effekt, så som en proteolytisk degradering, ble tilsvarende forsøk utført med museinterferonsystemet:

Med antistoffer virksomme mot HuIFN-a inhiberes spesielt IFN-a-aktiviteten for polypeptider fremstilt i E. coli transformert med visse rekombinante DNA-molekyler inneholdende HcIF-2h DNA-sekvensen. Den tilsynelatende lave affini-tet for antistoffet overfor IFN-a produsert av E. coli kan muligens reflektere strukturelle forskjeller mellom den sistnevnte og naturlig HuIFN-a, eksempelvis fravær av karbo-hydratenhet, tilstedeværelsen av en signalsekvens eller sammensmeltning av to deler av B-laktamasesekvensen.

4. Nedsatt aktivitet av Hif- 35 og Hif- 287- 6 ekstrakter overfor museceller

Human CCL23-celler eller Mus L929-celler ble behandlet med

E. coli ekstrakter, HuIFN-a (fremstilt av K. Cantell, spesifikk aktivitet 1,2 x IO6 enheter/mg) eller mus IF (N.I.H.-standard) ble smittet med virus (Mengo-virus når det gjalt humancellene og VSV når det gjalt muscellene) og IFN-a-aktiviteten bestemt ved nedsettelse av den cytopatiske effekt-bestemmelse.

Resultatene viser at Hif-35 og Hif-287-6-ekstrakter har en beskyttende virkning for humanceller og kun en liten effekt (~10 %) på museceller, hvilket er typisk for humant interferon .

5. Effekt på visse cellefunksjoner

Ekstrakter fra E. coli HB101 (Z-pBR322(Pst)/Hif-SN35-AHL6) ble sammenlignet med autentisk IFN for dens effekt på visse cellefunksjoner. IFN-a fremstilt av E. coli utviser de følg-ende egenskaper som for naturlig IFN-a: (1) forsterker den naturlige drepeaktivitet for humane lymfocytter, (2) det forsterker antistoff -avhengig celletilknyt-tet cytotoksisitet, (3) det undertrykker antigen- og mitogen-indusert leukocyttmigreringsinhibering og (4) det inhiberer vekst av IFN-følsomme Burkitt lymfeceller. Disse egenskaper er indikative for E. coli syntesert IFN-al's aktivitet,mot humantumorer og kreft. 6. Aktivitet av IFN- a uten amino- terminalsekvenser IFN-a uten amino-terninalsekvenser er også fremstilt i E. coli og er vist å utvise aktivitet i overensstemmelse med IFN-aktivitet.

For å konstruere det passende rekombinante DNA-molekyl ble plasmid Hif-2H (supra) delvis spaltet med EcoRI og BamHI og fragmentet inneholdende IFN-al kodesekvensen separert på agarosegel og kombinert med den ikke-IFN-al-kodende sekvens erholdt fra en EcoRI/ BamHI- spalting av plasmidet Hif-SN35 som mangler en Pstl posisjon tilstøtende 3'enden av hybridinnskuddet, sammenlignet med Hif-2h (supra). Det erholdte plasmid ble deretter spaltet med Pstl/ Bgll for å fjerne en del av aminoendedelen av den IFN-al-kodende sekvens. I dets sted ble innskutt en serie IFN-al-fragmenter fremstilt ved spaltning av plasmidet Hif-2h med PvuII, behandling med Bal eksonuklease, tilknytning av Pstl-linkere og spalt-

ing med Bglll. De resulterende plasmider inneholdt således en serie IFN-al-kodesekvenser som manglet forskjellige deler av deres aminoterminale sekvenser. Et av disse (plasmid 2H-M8) ble spaltet med Pstl og dets nukleotidsekvens bestemt.

Sekvensen viste at plasmidet 2H-M8 inneholdt flere nukleotider mellom Pst-posisjonen og den første kodon (CYS<N> av IFN-al. Derfor ble Pstl-spaltet plasmid 2H-M8 behandlet med T4-polynuklease/dATP, Sl eksonuklease og spaltet med Sali. Denne prosedyre genererte en serie fragmenter, hvis IFN-al-kodesekvenser manglet deler av deres aminoterminal-ende. Disse fragmenter ble deretter plassert under LAC-kontroll ved operativt å knytte disse til GUA-LAC-fragmentet fremstilt fra plasmid Lac3V8 ved spaltning med EcoRI, behandling med eksonuklease Sl og spaltning med Sali. De resulterende fragmenterende serier av plasmider hadde således IFN-al-kodesekvenser som manglet forskjellige deler av deres aminoterminalender knyttet i en "mot urviseren" retning via en AUG til et fragment inneholdende LAC-promotoren.

Visse av disse plasmider ble sekvensert. En begynte ved den femte aminosyre i IFN-a og en ved den tiende aminosyre i

IFN-al. I E. coli miniceller (DS410) produserte begge disse plasmider polypeptider som utviste IFN-aktivitet. Derfor er ikke alt av IFN-al-proteinet nødvendig for IFN-aktivitet.

IDENTIFISERING AV KLONER AV E. COLI INNEHOLDENDE REKOMBINANTE DNA-MOLEKYLER, HVIS DNA-INNSKUDD KRYSSHYBRIDISERER SVAKT TIL INNSKUDDET I Hif-4c OG SOM HAR ET FORSKJELLIG RESTRIKSJONSKART ENN Hif- 2h- FRAGMENTET

Sammenligning av de første 35 aminosyrer i autentisk lymfoblastoidinterferon (Zoon et al., supra, og M. Hunkapiller og L. Hood, supra) og sekvensen dedusert fra Hif-2h-fragmentet viste 9 forskjeller. I alle tilfeller skulle kodonene for de adskillende aminosyrer være relatert av "one base" for-andringer. Aminosyresammensetningene bestemt direkte for autentisk lymfoblastoid-interferon på den ene side og dedusert fra sekvensen av Hif-2h-fragmentet på den annen side, utviser også bemerkelsesverdige forskjeller med hensyn til deres innhold av Gly, Pro, Cys og Met. Disse forskjeller er for store til at de kan forklares ved polymorfisme. I steden reflekterer de trolig eksistensen av minst to ikke-arvelige gener, fordi graden av avvik for de to proteiner (26 % mistilpasning) tilsvarer den eksempelvis mellom menneske- og sau-P-globulin (23 % mistilpasning)• Følgelig ble klonene som utviste svak hybridisering til fragment Hif-4c, tidligere identifisert (supra), undersøkt, og en klon E. coli HB101 (Z-pBR322(Pst)/HcIF-II-206) ble identifisert.

Hybridplasmidet Z-pBR322(Pst)/HcIF-II-206 ("HcIF-II-206") i denne klon og dens DNA-innskudd "Hif-II-206-fragment" hybridisere svakt til Hif-4c og Hif-2h-fragmentet. E. coli transformert med plasmid Hif-II-206 produserer polypeptider som utviser en biologisk eller immunologisk aktivitet som for HuIFN-a. Hif-11-206 -fragmentet har et restriksjonskart

som er forskjellig fra det bestemt for Hif-2h-fragmentet.

En sammenligning av de to restriksjonskart er vist i fig. 11. Igjen er den absolutte lokalisering av seksjonsposisjonene for Hif-II-206-fragmentet ikke bestemt ved restriksjonskart-legning alene. Imidlertid, sekvensering av nukleotidsekvensene for dette innskudd, under anvendelse av de ovenfor beskrevne prosedyrer, muliggjør en mer absolutt bestemmelse

av disse lokaliseringer. Imidlertid, på grunn av forskjellen i restriksjonskartet for Hif-II-206-fragmentet sammenlignet med det for Hif-2h-fragmentet er det klart at inter-ferongenene for disse to innskudd har forskjellige nukleotidsekvenser.

Under henvisning til figurene 12-16 er vist nukleotidsekvenser for den innskutte DNA-sekvens -- Hif-II-206-fragmentet --av kultur HcIF-G og for den innskutte DNA-sekvens -- Hif-2h-fragrrentet — av kultur HcIF-E (infra) , tidligere bestemt og tilsvarende aminosyresekvenser for proteiner kodet av disse nukleotidsekvenser. Nukleotidsekvensene av Hif-II-206-fragmentet, nemlig Pst I-fragmentet (790bp) av plasmid DNA, isolert under anvendelse av fremgangsmåten ifølge metode B beskrevet av N. M. Wilkie et al., Nucl. Acids Res., 7, sidene 859-77 (1979) fra kultur HcIF-G, ble bestemt under anvendel^ se av standard prosedyren til A. M. Maxam og W. Gilbert, supra. Den anvendte sekvenseringsstrategi er vist i figur 17 .

Restriksjonsspaltet DNA (vanligvis ca. 10 ug) ble 5'terminalrrerket

slik som beskrevet av N. Mantei et el., Gene, 10, sidene 1-

10 (1980). Merkede fragmenter ble spaltet med et andre restriks jonsenzym,produktene separert ved elektroforese gjennom en 5 %'ig polyakrylamidgel i Tris-borat-EDTA-buffer (A.

C. Peacock og C. W. Dingman. Bioch., 6, sidene 1818-27

(1967)), ekstrahert fra gelen og renset som beskrevet av

W. Muller et al., J. Mol. Biol., 124, sidene 343-58 (1978).

Under henvisning til fig. 17 ble de forskjellige fragmenter for sekvensering fremstilt som følger: 25 og 26 — spaltning av Hif-II-206 med Pstl, merkning, spaltning med Bglll, isolering av et Pstl*- Bglll-fragment (257bp) ("25") og et PstI<*->BglII-fragment (279bp) ("26"),

21, 22 og 23 — spaltning av Hif-II-206 med PvuII, merkning, spaltning med Bglll, isolering av et PvuII*- BglII-fragment (88bp) ("21"), et PvuII<*->BglII-fragment (176bp) ("22") og et PvuI<*->BglII-fragment (214bp) ("23"),

11, 12, 13 og 14 — spaltning av Hif-II-206 med Bglll, merkning, spaltning med Pstl, isolering av et Bglll -Pstl-fragment (279bp) ("14") og en samemigrerende blanding av et Bglll - Psti-fragment og et Bglll - Bglll -fragment. Spaltning av blandingen med PvuII og isolasjon av et Bglll - Pstl-fragment (257bp) ("13") og et BglII*- PvuII-fragment (176bp)

("12") og et BglII<*->PvuIl-fragment (88bp) ("11").

27L, 27U, 41, 43, 44 og 45 — spaltning av Hif-II-206 med HinfI, merkning, isolering av forløperfragmentene: HinfI tit-Hinfl<*> (113bp) ("27P"), HinfI*- HinfI* (146bp) ("28P"), HinfI*- Hinfl* (159bp) ("30P"), HinfI*- HinfI* (397bp) ("31P") og HinfI*- HinfI* (1522bp) ("32P"). Spaltning av 28P med MboII og isolering av et fragment HinfI - MboII (112bp)

("41"). Spaltning av 30P med MboII og isolering av et fragment HinfI*- MboII (126bp) ("43"). Spaltning av 31P med Pstl og isolering av et fragment HinfI - Pstl (151bp) ("44").

Hf Spaltning av 32P med Pstl og isolering av et fragment HinfI - Pstl (139bp) ("45"). Kjedeseparasjon av 27P til å gi to kjeder

:..("27U" og "27L" ) .

Alle segmenter, bortsett fra 27U og 27L ble sekvensert på begge kjeder og over réstriks jonsposis jonefté som tjente som utgangssteder for sekvensering, bortsett fra for Bglll-still-ingen ved posisjon 185.

Fra en sammenligning av aminosyresekvensene kodet for av de to innskudd er det åpenbart at Hif-II-206-fragmentet koder for et interferonlignende protein som inneholder en aminosyre mindre enn Hif-2h-fragmentet (aminosyre 44 (Asp) tilstede i Hif-2h mangler i Hif-II-206j. Ytterligere 10 % av nukleotidposisjonene og 17 % av de avledede aminosyrerester i de to fragmenter er forskjellige.

I tillegg når man sammenligner de 35 aminosyrer bestemt for aminoterminalen for lymfoblastoidinterferon (K. C. Zoon et al., Science, 207, sidene 527-28 (1980)), koder innskuddet Hif-II-206 for et protein som adskiller seg i 5 rester fra de 35 aminosyrerester bestemt av Zoon et al., supra. Derfor må det eksistere minst 3 forskjellige IFN-gener av leukocytt-typen (a-typen) nemlig Hif-2h-fragmentet, Hif-II-206-fragmentet og genet for Zoon's IFN. I henhold til den nylig foreslåtte nomenklatur for interferon,vil i det etter-følgende proteiner kodet for av disse gener bli identifisert som følger:

Forskjellen mellom IFN-al og IFN-a2 reflekteres også i deres varierende aktiviteter på human CCL23 og storfefosternyre (BEK)-celler:

Derfor er IFN-al ca. 30 ganger mindre aktiv på humanceller enn IFN-a2. De er likevel ca. like aktive på storfeceller. Derfor kan IFN'er i tillegg til deres vanlige anvendelse som antiviral- og antitumor- eller anticancermidler for mennesker, også være nyttige ved behandling av disse tilstander hos storfe. F.eks. fremstilling av HuIFN-a kunne anvendes på en standard måte (supra) ved behandling av FMDV og andre velkjente virusinfeksjoner hos storfe. Dette er mere spesielt tilfellet for IFN-al da dets aktivitet på storfeceller er ca. 20 ganger større enn dets aktivitet på humanceller.

Som følge av det forbedrede utbyttet som oppnås i tilfellet for IFN-al med konstruksjonen C8 (supra), ble en tilsvarende konstruksjon gjort for IFN-a2. Z-pBR322(Pst)/Hif-II-206 ble spaltet fullstendig med Bspl og delvis med PvuII (ved Pl) (fig. 28) og 867 bp-fragmenter ble isolert fra en 6 %' ig polyakrylamidgel. Dette fragment ble deretter oppdelt til et 2590 bp PvuII-fragment av C8-IFN-al. (C8-IFN-al har tre

PvuII-restriksjonsposisjoner (fig. 28).^2590 bp-fragmentene ligger mellom P. og P^.) Det resulterende hybrid-plasmid ble anvendt for å transformere E. coli HB101 og klonene avskjermet foc AFN-aktivitet. En klon utviste en høy aktivitet og ble valgt og betegnet med E. coli HB101 (C0-IFN-a2).

DNA-sekvensering av hybrid-plasmidet C8-IFN-a2 viste at det, lik C8-IFN-al hadde en kodesekvens etterfølgende initiator-tripletten som bestemte de første 7 aminosyrer av 6-galaktosidase, en Pro-rest generert ved smeltning av aminosyrene 16 til 23 av IFN.-a2-signalsekvensen. Derfor er det igjen trolig at et sammensméltet protein inneholdende IFN-a2 er uttrykt.

Miniceller transformert med dette plasmid ga 100-200 millioner enheter pr. 1 av IFN eller 20000-40000 ganger høyere utbytter for IFN-a2 enn miniceller transformert med umodifisert Z-pBR322(Pst)/Hif-II-206.

En sammenligning av de relative utbytter for C8-IFN-al

(~50 x 10 /r enheter/liter) og C8-IFN-a2 (~100-200 millioner enheter pr. liter) er ved første øyekast overraskende fordi at IFN-a2 er vist å være ca. 30 ganger mere aktiv enn IFN-al på humanceller (supra). Imidlertid, kvantitativ analyse av mengden av de to proteiner fremstilt fra minicellene, transformert med de to C8 plasmider viser at det i C8-IFN-al er fremstilt ca. 5-6 ganger mere protein enn i C8-IFN-a2. Derfor er utbyttene målt på basis av IFN-aktivitet forskjøvet som følge av den meget større mengde protein som er fremstilt for tilfellet C8-IFN-al.

Under henvisning til fig. 26 er det vist en annen konstruksjon i et forsøk på å forbedre utbyttet av IFN-a2. Først ble det fremstilt et ekspressjonsplasmid inneholdende LAC-Alu-fragmentet med begrensning av den kjente lac-promotor med Alul og forlengelse av fragmentet slik som vist (for 1 endedel) i fig. 27 med EcoRI- linkere. Det forlengede fragment ble innført i pBR322 ved EcoRI-posisjonen og et lite EcoRI- EcoRI-fragment ble fjernet fra konstruksjonen. Det resulterende plasmid, betegnet 404 i fig. 2(}/ ble spaltet med et Hindlll og PvuII for innføring av det IFN-a2-inneholdende fragment. Dette IFN-a2-fragment ble fremstilt ved partiell Sau3A- spalting av Z-pBR322(Pst)/HcIF-II-206 ("206" i fig. 26), forlengelse av Sau3A-fragmentet med Hindlll- linkere (fig. 27) og spaltning med Bsp_I. Etter innføring av dette fragment inn i det HindiII- PvuII-spaltede plasmid 404 ble det resulterende plasmid spaltet mea Hindlll og EcoRI, behandlet med Sl-nuklease for å bringe LAC-promotoren nærmere IFN-a2-genet og religert. Denne konstruksjon^identifisert som plasmid LAC-AUG(a2)/ har IFN-a2 DNA-sekvensen under kontroll av LAC-promotoren. Ytterligere IFN-a2-sekvensen følger umiddelbart etter den initierende AUG-kodon for denne promotor (se fig. 27). Derfor vil minst en del av IFN fremstilt av disse plasmider vcare ferdigutviklet IFN, f.eks. IFN uten noen aminosyrer fra signalsekvensen)'.

I miniceller var utbyttet av IFN-cc2 erholdt med plasmid LAC-AUG(a2) 5-10 millioner enheter pr. liter.

En annen IFN-ct2 konstruksjon basert på tilsvarende tilknyt-ningsprinsipper er også fremstilt. Her ble penicillinase ekspresjonskontrollsekvensen for pBR322 forbundet via et AUG initiator-kodon til IFN-ct2 genet fra HIF-II-206.<*>

Denne konstruksjon kunne mest effektivt gjøres ved en partiell oppløsning av pBR322 med MboII, behandling med Sl, festing av EcoRI- linkere som tidligere angitt og gjeninnføre fragmentet i EcoRI-posis jonen for pBR322 og utelate en EcoRI-posisjon. Det resulterende plasmid ("B-lac-AUG-plasmid") kunne deretter kombineres med en Sl behandlet (mildt) Hindlll tilknytter-Bspl fragment av 206, som tidligere beskrevet. Etter spaltning med EcoRI og behandling med Sl og fosfatase isoleres ekspresjons-plasmidet B-lac-AUG(a2).

Konstruksjonen med andre gener kunne utføres på samme måte ved å utnytte det konstruerte B-lac-AUG-plasmid for innføring av andre gener eller konstruksjoner eller mere foretrukket ved å anvende Sau3A-posisjonen i selve 3-lac-AUG(a2) plasmidet.

Dette plasmid,betegnet som B-lac-AUG(a2) f muliggjør, når dette anvendes for å transformere vertsceller, produksjon av IFN-a2 uten fusjon til andre proteinsekvenser. I miniceller er utbytter på 50-100 millioner enheter pr. liter observert. .Dette plasmid er det mest foretrukne plasmid i henhold til foreliggende oppfinnelse. Det er også foretrukket for anvendelse med andre IFN-a gener som er vist i foreliggende beskrivelse. Den foretrukne vert i henhold til oppfinnelsen er E. coli DS410 (ara azide TonA lac y Tsx min a min b galXxyl step ). Denne stamme er deponert sammen med en prøve av det foretrukne plasmid B-lac-AUG(a2) som HcIF-K.

Andre konstruksjoner hvori anvendes forskjellige promotor-sekvenser, ribosombindingsposisjoner, Sh.ine-Dalgarnosek-venser og DNA-sekvenser mellom promotoren og AUG initiator-kodonet og under anvendelse av forskjellige IFN-a gener vist heri,kan også konstrueres under anvendelse av tilsvarende fremgangsmåteprinsipper.

HYBRIDMOLEKYLER AV IFN- al OG IFN- a2

Et antall hybridmolekyler av IFN-al og IFN-a2 er konstruert. Overraskende utviser disse hybridkonstruksjoner kvantitative forskjellige egenskaper og aktiviteter sammenlignet med hver av deres foreldre, nemlig IFN-al eller IFN-a2.

Under henvisning til fig.28 hvori er vist skjematisk konstruksjon av fire av" disse hybridmolekyler. For letthets skyld er disse hybridmolekyler betegnet som plasmidene I, II, III og IV. I disse konstruksjoner ble spalting med restriks jonsenzymer (erholdt fra Biolabs, bortsett fra Bspl, en gave fra Dr. Kiss) utført i det vesentlige slik som an-befalt av leverandørene. Delvis DNA-spaltning ble utført med nedsatte enzymmengder. Etter varme-inaktivering (65°C, 30 min) av restriksjonsenzymet^ble prøvene justert til 50 mM Tris-HCl (pH 8) og om nødvendig med kalvetarm alkalisk fosfatase (Boehringen) (1 vol pr. pg DNA) tilsatt. Etter 3 0 min ved 37°C ble prøvene ekstrahert med fenol og eter. I de fleste tilfeller ble DNA-fragmentene separert på lav-temperatur gelende agarose (0,8 %). For ligsring ble fragmentinneholdende gelstykker (hver på ca. 20 pl) smeltet ved 65°C, avkjølt til 37°C og tilsatt 20 enheter pr. pl T4 DNA-ligase. Blandingen ble holdt ved 15°C i 16 timer og ligering fant sted i den størknede gel (H. Lehrach, personlig meddelelse 1980). Et tiendedels vol 100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM CaCl2, 100 mM MgCl2 ble tilsatt og prøven oppvarmet i 5 min. ved 65°C og deretter avkjølt til 37°C.

+2

Prøvene ble deretter tilsatt til Ca - behandlede miniceller, inkubert ved 0°C i 20 min, oppvarmet i 1 min. ved 42°C og 10 min. ved 20°C og 1 m i tryptonmedium tilsatt. Etter inkubering i 60 min. ved 37°c ble kulturene påført agarplater inneholdende egnede antibiotika. Alle plasmidene ble karakterisert ved nukleotidsekvensanalyse over foreningen i IFN-sekvensen.

Hybridmolekyl I;et g-1 ( PvuII)a-2 hybrid,ble konstruert ved partiell spaltning av C8-IFN-al (supra) (C8-al i fig. 28) med PvuII, defosforylert, spaltet med Pstl og Pstl- PvuII(P2) 13 4 6 bp fragment isolert. Dette fragment ble ligert til-

et 2135 bp Ps_tl (a) - PvuII (P-,) fragment fremstilt ved total spaltning av C8-IFN-ri2 (supra) (C8-a2 i fig. 28) med PvuII og delvis spalte dette med Pstl.

Hybridmolekyl Il^et a-1(Bglll)a-2 hybrid, ble konstruert ved å spalte hybridmolekyl I med Bglll. Etter defosfor-ylering ble det større Bglll fragment isolert og ligert til det mindre Bglll fragment av C8-IFN-a2. Etter kloning ble hybridplasmidet med det mindre Bglll fragment i den riktige orientering identifisert ved restriksjonsanalyse.

Hybridmolekyl III, et a-2(PvuII)a-1 hybrid, ble konstruert ved delvis spaltning av C8-IFN-al med PvuII, defosforyler-ing, spaltning med Aval og isolering av 1686 bp PvuII(P2)-Aval og 3233 bp PvuII(P^)- Aval fragmentene. Disse fragmenter ble deretter ligert til 300 bp PvuII (P.^ - PvuII (P2 ) fragmentet i HcIF-II-206 (supra) (SN206 i fig. 28) og plasmidet inneholdende det mindre PvuII fragment ble identifisert ved å undersøke transformerte E. coli stammer for IFN-a aktivitet.

Hybridmolekylet IV, et a-2( Bglll)a-1 hybrid,ble konstruert ved å spalte C8-IFN-al med Bglll og Aval og 1776 bp fragmentet isolert. Dette fragment ble deretter ligert til 3543 bp Bglll- Aval fragmentet i hybridmolekyl III.

De biologiske aktiviteter for de forskjellig interferontyper i forhold til hverandre ble også bestemt. Kulturer av miniceller (DS410), transformerte med de forskjellige plasmider, ble dyrket og bakteriene oppsamlet ved sentrifugering, vasket med PBS, suspendert i PBS (ca. 1/20 av det originale volum) , inkubert i 60 min. ved 0°C med 1 mg/ml lysozym, 10 mM EDTA, fryse-tint 4 ganger, skjærbehandlet ved gjennom-føring 5 ganger gjennom en injeksjonssprøyte og adskilt ved sentrifugering.

Aktivitetene overfor human-, mus-, marsvin-og storfeceller var som følger:

Overraskende utviser alle interferonene den tilnærmet samme aktivitet overfor kvegceller mens IFN-al og de to hybrid IFN'er (I og II) som har de samme aminoterminalgrupper av IFN-al utviser 10 til 1000 ganger lavere aktivitet på humanceller enn IFN-a2 og de to hybrid IFN'er (III og IV) som inneholder aminoterminalgruppene av IFN-a2. Det er ennå mere overraskende at de to hybride IFN'er (I og II) med aminoterminaldelen av IIN-al utviser mere enn 10 ganger lavere aktivitet på humanceller enn IFN-al i seg selv. Likevel utviser en av hybridene (III), med aminoterminaldelen av IFN-a2,omtrent den samme aktivitet på humanceller som IFN-a2.

IDENTIFISERING AV KROMOSOMALGENER FOR IFN- g

En samling av hybridfag avledet fra menneskefoster kromosomal DNA som var generert ved delvis spaltning med Haelll og Alul og forenet med EcoRI linkere A.Charon 4A armer er fremstilt av R. M. Lawn et al., Cell, 15, sidene 1157-74

(1978). Denne genebank ble avskjermet ved en " in situ" fremgangsmåte (W. D. Benton og R. W. Davis, Science, 196, sidene 180-82 (1977); T. Maniatis et al., Cell, 15, sidene 687-701

(1978)) under anvendelse som "sonde" det 3 2P-merkede IFN-gl cDNA innskudd fjernet fra pBR322(Pst)/Hif-2h. Seksten hybridiseringspositive fagkloner ble isolert fra 240 000 plater ved gjentatte platerensninger (T. Maniatis et al., supra). Ti av hybridfag DNA-preparatene ble spaltet med henholdsvis Hindlll, Tad, Hhal, BamHI, EcoRI og Bglll, og fragmentene separert ved elektroforese på en agarosegel, overført til en "Millipore" membran (E. M. Southern, J. Mol. Biol., 98, sidene 503-17 (1975)) og hybridisert med <32>P-merket Hif-2h cDNA innskudd. Fig. 18 oppsummerer resultatene i form av partielle restriksjonskart og forskjellige tabeller. Som vist ble det for hvert hybridfag DNA-preparat etablert minst noen få karakteristiske restriksjonsposisjoner og om-råd (er) som hybridiserer til den adskilte IFN-gl gen "sonde"

(sort pil).

Det skraverte området på chr-16 i figurene 18 og 2 4 representerer en sekvens som hybridiserer

svakt til Hif-2h cDNA men som ikke utviste stor R-"looping").

Under henvisning til figurene 18 og 24 kan det sees at klonene chr-3 og chr-26 kan representere DNA-segmenter som overlapper meget over deres lengde fordi de har flere EcoRI og Hindlll fragmenter felles. I tillegg kan den hybridiserende del av chr-1 og en av de hybridiserende deler av chr-10 være de samme fordi Kindlll- Hindlll og EcoRI- EcoRI fragmentene som hybridiserer med Hif-2h "sonden" har den samme lengde (henholdsvis 3,2kb og 0,95kb). Det synes også som at den "høyre hånd" hybridiserende del av chr-16 (merket "r" i fig.

18)kan være identisk med den hybridiserende del av chr-35, selv om den er orientert i motsatt retning, idet hver av de to kloner gir et l,4kb Bg.l.II-Bglll fragment og et 2kb EcoRI-EcoRI fragment som hybridiserer med Hif-2h cDNA "sonden".

Det er derfor meget trolig at chr-16 og chr-35 innskuddene overlapper.

Følgelig synes det som at de 13 hybridiserende deler av de

11 hybridkromosomal DNA'er faller inn i ikke mindre enn 10 distinkte klasser — chr-1, chr-3, chr-12, chr-13, chr-16 (venstre hånd, merket "1" i fig. 18) chr-26, chr-30, chr-35, chr-19 og chr-27.

Under henvisning til fig. 24 er vist overlappingen av chr-1, chr-3, chr-10 og chr-26 og den for chr-16 og chr-35.

De ovenfor gitte data indikerer at gnomet for et enkelt menneske ikke inneholder mindre enn 10 forskjellige DNA-sekvenser som krysshybridiserer til Hif-2h. Denne konklu-sjon forsterkes ved det faktum at andelen av Hif-2h beslektede sekvenser påvist i klonebanken er ca. 1 i 16000. Antas det en verdi på 3 x 10 9 bp for det haploide humang den forventede verdi for en enkelt genekopi med en gjennomsnittlig DNA-fragmentstørrelse på 16kb (den midlere verdi for de undersøkte kloner) ca. 1:190000. Derfor er frek-vensen for Hif-2h beslektede fragmenter 12 ganger høyere enn det som er forventet for et enkelt gen.

Ved sammenligning av disse data/når Lawn et al. (supra) avskjermet 300000 plater fra den samme genebank med en 3-globulin cDNA-sonde,ble kun 2 positive kloner identifisert,idet den forventede verdi er 1,6:300000.

Derfor kan det være 10-15 distinkte kromosomale DNA-segmenter i humangnomet som krysshybridiserer til Hif-2h fragmentet eller IFN-alcDNA.

YTTERLIGERE KARAKTERISERING AV Hif- chr3 5

Kun som illustrasjon ble hybridiseringssekvensen av chr-35 ("Hif-chr 35") ytterligere karakterisert.

Hybridiseringsdelen av chr-35 ("Hif-chr35") (og det høyre segment av Hif-chrl6 til hvilket det meget trolig er identisk, supra) er den eneste hybridiserende kromosomal DNA-del av en Bglll-posisjon. Da IFN-al og IFN-a2 cDNA'er har henholdsvis 1 og 2 Bglll-posisjoner innen deres kodende sekvenser, så synes det trolig som om Hif-chr35 er et motstykke til en av de to tidligere klonede interferongener. Hif-chr 35's sterke hybridisering til 3' terminal Hif-2h cDNA-fragmentet (inneholdende kun det 3' ikke-kodende område) sammenlignet med den svakere hybridisering for de andre kromosomale DNA'er til denne "sonde" underbygger troligheten av korrespondanse mellom Hif-chr35 og Hif-2h (f. Kafatos et al., Proe. Nati. Acad. Sei USA, 74, sidene 5618-22 (1977)).

For ytterligere å analysere Hif-chr35 fragmentet ble et Hindlll- BamHI fragment spaltet fra chr-35. Dette fragment (3,4kb) inneholdt den hybridiserende del ("Hif-chr35") av chr-35. Dette fragment ble subklonet inn i Pstl -posisjonen av pBR322 under anvendelse av de velkjente dC-dG tilknytnings-prosedyrer (L. Villa-Komaroff et al., supra) og E. coli HB101 ble transormert med det erholdte rekombinante DNA-molekyl, under anvendelse av velkjente fremgangsmåter (eksempelvis S. Nagata et al., Nature, 284, sidene 316-20 (1980)).

Kloner av disse transformanter ble avskjermet ved situ koloni-hybridisering (D. Hanahan og M. Meselson, Gene, 10, sidene 63-67 (1980)) med det 3 2P-merkede Hif-2h fragment (supra), og plasmid DNA, Z-pBR322(Pst)/HchrIF-35HB "HchrIF-35HB" ble separert fra positive kloner (N. M. Wilkie et al., Nucleic Acids Res., 7, sidene 859-77 (1979); Metode B). Orienteringen av hybridinnskuddet "HchrIF-35HB fragmentet" i plasmidet i forhold til 3-laktamasegenet av pBR322 ble bestemt ved EcoRI spaltning og størrelsesbestemmelse av de erholdte fragmenter. Innskuddet orientert slik at det falt sammen med 3-laktamase,ble betegnet med a og den motsatte orientering med 3 -

Kulturer av disse positive klonene ble dyrket til en til-s<y>nelatende OD65Q = 0,8 og bakteriene oppsamlet og lysert ved lysozym-fryse-tine-metoden beskrevet av S. Nagata et al., supra. Syv av de undersøkte 10 kloner viste IFN-a aktivitet på 75-500 enheter/g celler bestemt ved nedsettelse av den cytopatiske effekt.

DNA-innskuddet i en av disse 7 IFN-produserende kloner, nemlig E. coli HB 101 (Z-DBR322(Pst)/HchrIF-35HBa), ble ytterligere karakterisert ved restriksjonsanalyse og bestemmelse av nukleotidsekvensen. Plasmid DNA (HchrIF-35HBa) ble fremstilt fra klonen som tidligere beskrevet og restriksjonsposisjoner bestemt ved Smith-Birnstiel kartlegning (H. 0. Smith og M. L. Birnstiel, Nucl. Acids Res., 3, sidene 2387-98 (1976)); idet HchrIF-35HBa ble oppsluttet med EcoRI, merket ved 5' terminalen og oppsluttet med Bglll (og Pstl for å spalte uønskede fragmenter på ca. lkb).

l,04kb EcoRI- Bglll (3' proximal) og 0,96kb EcoRI- Bglll (5' proximal) fragmenter ble isolert ved agarosegelelektroforese som beskrevet av A. C. Peacock og C. W. Dingman, Biochemis-try, 6,sidene 1818-27 (1967)). Begge fragmenter ble delvis spaltet med henholdsvis Hinf , Bspl og MboII og produktene separert på en 1 % agarosegel i triacetatbuffer (pH 7,8) inneholdende 1 pg/ ml etidiumbromid. Etter farging ble de radioaktive bånd visualisert ved autoradiografi. Bst.NI og HgiAI-posisjonene ble bestemt på tilsvarende måte for l,04kb (3' proksimal) fragmentet. Resultatene av denne analyse er vist i fig. 19.

For nukleotidsekvens-bestemmelse ble HchrIF-35HBa spaltet med forskjellige restrUssjonsenzymer og produktene separert ved elektroforese igjennom en 5 % ig polyakrylamidgel i Tris-borat-EDTA-buffer (A. C. Peacock og C. W. Dingman, supra) og ekstrahert fra gelen og renset slik som beskrevet av W. Muller et al., J. Mol. Biol., 124, sidene 343-58

(1978) .

Den anvendte sekvenseringsstrategi er vist i fig. 19 og kan

beskrives son følger:

I og 2, — spaltning av HchrIF-35HBa med Bglll, merkning, spaltning med EcoRI og Pstl og isolering av et Bglll - EcoRI-fragment (940bp) ("1") og et BglII<*->EcoRI (360bp) ("2"),

3 og 4, — spaltning av HchrIF-35HBa med EcoRI, merkning,

fe

spaltning med Bspl og isolering av et EcoRI - Bspl-fragment (680bp) ("3") og et EcoRI<*->BspI-fragment (880bp) ("4"),

5, 6, 7 og 8, — spaltning av HchrIF-35HBa med PvuII, merkning, spaltning med Bglll og EcoRI og isolering av PvuII - EcoRI-fragment (780bp) ("5"), et PvuII*- BglII (215bp)

("6"), et P_£UII<*->BgJ.II-fragraent (90bp) ("7"), og et PvuII<*->EcoRI-fragment (290bp) ("8"), 9 og 10, spaltning av HchrIF-35HBa med EcoRI, isolering ved 1 % agarosegelelektroforese i Tris-borat EDTA-buffer av et 1300 bp EcoRI- EcoRI-fragment, videre spaltning med HinfI og isolering av et HinfI- HinfI-fragment (450bp), og et HinfI- Hinfl-fragment (180bp).

Merkning av det større HinfI- HinfI-fragment og spaltning med MboII muliggjorde isolering av et HinfI -MboII (190bp) ("9") . Merkning av det kortere HinfI- HinfI-fragment og spaltning

fe

med AvaII muliggjorde isolering av et HinfI - AvaII-fragment (150bp) ("10"),

II — spaltning av HchrIF-35HBa med MboII, merkning, spaltning med Bglll, og isolering av et MboII - Bglll-fragment (465bp) ("11")

12, 13 og 14 — spaltning av HchrIF-35HBa med Bspl og Bglll, isolering ved agaroseelektroforese som ovenfor av et 1200bp BspI- BglII-fragment og (a) spaltning med HgiAI, merkning, spaltning med MboII og isolering av et HgiAI - MboII-fragment (300bp) ("12") og et H_jiAI<*->MboII-fragment (360bp) ("13"), eller (b) spaltning med BstNI, merkning, spaltning med EcoRI og isolering av et BstNI*- EcoRI-fragment (380bp) ("14").

De forskjellige fragmenter ble sekvensert ved hjelp av Maxam-Gilbert-prosedyren (supra). Alle fragmenter ble sekvensert på begge kjeder og over restriksjonsposisjonene som tjente som utgangspunkt for sekvensering.

En sammenligning av nukleotidsekvensene for det kodende området av HchrIF-35HBa og det for Hif-2h (kodeområde) (fig. 8-10, sammenlignet med figurene 20-23) viser at de er identiske. Spesielt er det overraskende at det ikke er noen in-dikasjon på tilstedeværelse av introner inne i kodesekvensen av HchrIF-35HBa-fragmentet, dvs. mellom HinfI-posisjonen og i det 5' ikke-kodende området og EcoRI-posisjonen i det 3' ikke-kodende området. Således kunne intet intron påvises i den kromosomale sekvens tilsvarende ferdigutviklet IFN-amRNA.

YTTERLIGERE KARAKTERISERING AV Hif- chr 2 6 OG Hif- chr 3

De geninneholdende segmenter av chr-3 og chr-26

identiske med heteroduplexanalyse, men adskiller seg i det minste med en Bglll-begrensningsposisjon når de ble eksa-minert med nukleotidsekvensering. Fem nukleotidforskjeller i 725 basepar ble funnet. Kun to av disse er tilstede i kodningssekvensene. Da ikke bare genene men også i det minste 3,5 Kbp forutgående og 6,0 Kbp etter disse,dannet en perfekt heterodupleks, og på grunn av den relativt lave sek-vensdivergens som omfatter kun to aminosyreforandringer det som om Hif-chr3 og Hif-chr26 er arvelige former av det samme gen. Disse er betegnet IFN-a4a (Hif-chr3) og IFN-a4b (Hif-chr26). Nukleotidsekvensen og tilsvarende aminosyresekvens for IFN-a4b bestemt ved de tidligere beskrevne konvensjonelle sekvenseringsteknikker er vist i figurene 29-32.

En sammenligning av figurene 29-32 med figurene 8-10, 12-16 og 20-23 viser at proteiner kodet ved hjelp av hver av disse sekvenser adskiller seg fra hverandre med ca. 15 % av deres residuer. Denne divergens er typisk for produkter av ikke arvelige gener som har divergert for 20 - 90 millioner år siden.

Kkspressjon av Hif- chr35 i m useceller

Plasmid Z-pBR322(pst)/HchrIF-35HDa (supra) ble anvendt som kilde for et Hif-chr35-fragment for ekspressjon i museceller. Plasmidet ble spaltet med Pstl og behandlet med 5' eksonuklease for å fjerne 5<1->dG-halene. Dette fragment ble inn-ført i et 5<1->dG-behengt Kpnl-fragment av et plasmid fremstilt ved å forene BamHI- BamHI-fragmenter fra pBR322 og polynoma DNA. Den resulterende vektor ble anvendt for å transformere muse-3'f3-celler under anvendelse av kalsiumfos-fatteknikken (N. Mantei et al., Nature, 281 sidene 40-46

(1979)). Disse transformerte celler ble av bekvemmelighets-hensyn betegnet muse-3T3 (polynoma-Hif-chr35). Etter 20-40 t viste bestemmelser en IFN-a-aktivitet på 300 enheter/ml av IFN-a på humanceller og ca. 3000 enheter/ml IFN-a på storkvegceller.

Det bør naturligvis forstås at i nukleotidsekvensen beskrevet i figurene 8-10, 12-16, 20-23 og 29-32 er ikke tatt i betraktning eventuelle modifikasjoner i nukleotidsekvensene så som mutasjon, enkel eller multippel, basesubstitusjoner, innskudd, inversjoner eller delesjoner som allerede har funnet sted, eller som kan anvendes i det etterfølgende. Ytterligere, i sekvensen er det ikke tatt i betraktning en mulig substitusjon av andre kodonkodninger for den samme aminosyre som et kodon avbildet i disse figurer. Det bør derfor forstås at slike modifiserte sekvenser, som en kode for polypeptider som utviser en immunologisk eller biologisk aktivitet for IFN-a,også faller innenfor foreliggende oppfinnelse.

I tillegg må det forstås at i aminosyresekvensene avbildet

i figurene 8-10, 12-16, 20-23 og 29-32 er ikke medtattt i betraktning eventuelle modifikasjoner i polypeptidene forårsaket av deres påvirkning av in vivo- eller in vitro- midler, f.eks. in vivo-glykosyleringsenzymer.

FREMSTILLING I BÅKTERIEVERTER POLYPEPTIDER SOM UTVISER EN IMMUNOLOGISK ELLER BIOLOGISK AKTIVITET SOM FOR INTERFERON

Da bestemmelsen av nedsettelse av den cytopatiske effekt

(W. E. Stewart II og S. E. Sulkin, S. E. Proe. Soc. Exp.

Biol. Med., 123, sidene 650-53 (1966)) kan påvise uhyre små mengder IFN, nemlig mindre en ett aktivt molekyl pr. bakter-iecelle, ble lysater av E. coli HB101 infisert med ti hybrid A. fager, som tidligere beskrevet og undersøkt med hensyn til tilstedeværelse av IFN. Sju av de elleve fager (alle unntatt chr-10, chr-12, chr-19 og chr-27) ga lysater inneholdende IFN-aktivitet i området 3 til 50 enheter/ml. For tilfellet chr-10 og chr-12, uttrykte hybridisering (til Hif-2h) Hindlll- HindiII eller EcoRi-EcoRI-fragmenter, subklonet inn i Pstl-posisjonen av pBR322, som tidligere beskrevet, iFN-a-aktivitet i E. coli.

Da E. coli er antatt ikke å være i stand til å spleise mRNA (O. Mercereau-Puijalon og P. Kourilsky, Nature, 279, sidene 647-49 (1979)), inneholder trolig ikke disse IFN-a-kromosomale gener introner i sitt kodende område.

AVSLUTTENDE KONKLUSJONER

Det er isolert et sett rekombinante DNA-molekyler inneholdende cDNA fremstilt fra poly(A) RNA fra Sendai-virusbehand-lede (induserte) humanleukocytter, representative slike utviser de følgende egenskaper: (1) De hybridiserer til poly(A) RNA fra induserte, men ikke fra ikke-induserte humanleukocytter. (2) De hybridiserer til IFN-amRNA, slik som vist ved deres evne til å velge denne RNA fra en blanding av RNA'er samt ved deres evne til å inhibere (reversibel) translasjon av interferon mRNA ved hybridarrestert translasjonsbestemmelse. (3) E. coli inneholdende visse medlemmer av settet produserer en forbindelse med de følgende egenskaper.

(a) Det er følsomt for trypsin

(b) Det utviser IFN-a-aktivitet i humancellesystemet og kun

liten aktivitet i musecellesysternet

(c) Det har en molekylvekt i området 20 000 - 30 000 (19 388

basert på nukleotidsekvenseringen i figurene 8 - 10)

(d) IFN-a-aktiviteten er spesifikt inhibert av antistoff

til humanleukocyttinterferon.

(4) DNA-innskuddene av hybridplasmider ifølge oppfinnelsen er tilgjengelige, i tillegg til deres tilgjengelighet for å velge IFN-amRNA fra en blanding av RNA<*>er for å velge IFN--aDNA fra blandinger av forskjellige kilder innbefattende cDNA'er og fra hybrid- fag -genbanker av kromosomal DNA. (5) Et antall forskjellige kromosomale gener for IFN-a eksisterer. Det er uventet at disse gener mangler interoner og tillater direkte ekspresjon for interferon cg interferonlignende polypeptider i passende verter. (6) Minst tre av nukleotidsekvensene for disse rekombinante DNA-molekyler er forskjellige og indikerer eksistens av minst 3 ikke-arvelige gener for IFN-a. (7) Proteinene kodet for av disse tre nukleotidsekvenser er forskjellige fra de 35 aminosyrer bestemt fra autentisk lymfoblastoidinterferon. (8) Hybridproteiner fremstilt for forskjellige kombinasjoner av IFN-a-gensegmenter utviser kvantitative forskjellige egenskaper enn hverandre,eller deres foreldre og proteinene har ytterligere aminosyrer koblet til IFN-a eller proteiner omfattende IFN-a uten en del av dens aminoterminale sekvens utvisende IFN-aktivitet.

Disse egenskaper viser at rekombinante DNA-molekyler beskrevet i henhold til foreliggende oppfinnelse inneholder minst en del av kodesekvensen for humanleukocyttinterferon og at noen av disse plasmider fører til ekspresjon i E. coli for et polypeptid som utviser en immunologisk eller biologisk aktivitet tilsvarende den for humanleukocyttinterferon. Det bør også være åpenbart at de viste polypeptider kan være fragmentert, modifisert eller omdannes til derivater, slik som velkjent innen proteinteknikken. Mikroorganismer og rekombinante DNA-molekyler fremstilt ved foreliggende fremgangsmåte er eksemplifisert med kulturer deponert i kulturkolleksjonen i Deutsche Sammlung von Mikroorganismen i Gottingen, Vesttyskland 7. januar 1980 og identifisert som HcIF-A til E:

A: E. coli HB101 (Z-pBR322(Pst)/HcIF-4c

B: E. coli HB101 (Z-pBR322(Pst)/HcIF-2h

C: E. coli HB101 (Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN35

0: E. coli HB101 (Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN42

E: E. coli HB101 (Z-pKT322(Pst)/HcIF-2h-AH6

Disse kulturer ble henholdsvis gitt registreringsnummerene DSM 1699-1703.

I tillegg er mikroorganismene og de rekombinante DNA-molekyler fremstilt ved foreliggende fremgangsmåte eksemplifisert ved hjelp av kulturer deponert i kultursamlingen i American Type Culture Collection, Rockville, Maryland 27. mars

1980 og identifisert som HcIF-G til H og gitt henholdsvis ATCC registreringsnummerene 31633 og 3i634:

G: E.coli HB101 (Z-pBR322(Pst)/HcIF-II-206)

H: E.coli HB101 (Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN35-AHL6)

Andre mikroorganismer fremstilt ved foreliggende fremgangsmåte er eksemplifisert ved kulturer deponert i kultursamlingen i Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, i Gottingen, Vest-Tyskland 1. oktober 1980 og identifisert som HchrIF-A til J og gitt registreringsnummerene DSM 1914-1923:

A. subklonet Hindlll fragment av chr 3 i E. coli HB101,

B. subklonet EcoRI fragment av chr 12 i E. coli HB101,

C. s-ibklonet Hindlll fragment av chr 12 i E. coli HB101,

D. subklonet EcoRI fragment av chr 13 i E. coli HB101,

E. subklonet EcoRI fragment av chr 23 i E. coli HB101,

F. subklonet Hindlll fragment av chr 23 i E. coli HB101,

G. subklonet EcoRI fragment av chr 26 i E. coli HB101,

H. subklonet Hindlll fragment av chr 26 i E. coli HB101,

I. subklonet Hindlll/ BamHI fragment av chr 35 i E. coli

HB101,

J. subklonet BamHI fragment av chr 35 i E. coli HB101.

Avslutningsvis er mikroorganismene fremstilt ved foreliggende fremgangsmåte eksemplifisert med kulturer deponert i American Type Gul ture C<p>llection, Rockville, Maryland, 15. dese-mber 1980 og identifisert som HchrIF-K til HchrIF-Q og HcIF-I til HcIF-K og gitt ATTC registreringsnumrene:

31760 HchrIF-K

31761 HchrIF-L

31762 HchrlF-M

31763 HchrIF-N

31764 HchrIF-0

31765 HchrlF-P

31766 HchrIF-Q

31767 HcIF-I

31768 HcIF-J

31769 HcIF-K,

henholdsvis:

K. subklonet Tac- Tac fragment av chr 23 i E. coli

HB101. L. subklonet Bglll- Bglll fragment av chr 10 1 i E. coli HB101. M. subklonet Hindlll- Hindlll fragment av chr 10r i E.

coli HB101.

N. subklonet Bglll- Bglll fragment av chr 26 i E. coli

HB101.

O. subklonet Hindlll- Hindlll fragment av chr 30 i E.

coli HB101.

P. subklonet Bglll- Tac fragment av chr 13 i E. coli

HB101.

Q. subklonet Bglll-Tac fragment av chr 16 1 i E. coli

HB101.'

HcIF-I: E. coli DS410 (C8-IFN-a2)

HcIF-J: E. coli DS410 (LAC-AUG(a2))

HcIF-K: E. coli DS410 (B-Lac-AUG(_2))

Claims (9)

1. Rekombinant DNA-molekyl, karakterisert ved at det omfatter en DNA-sekvens som koder for et polypeptid av IFN-a type valgt fra: (a) DNA-innskuddene Z-pBR322(Pst)/HcIF-4c, Z-pBR322(Pst)/HcIF-2h, Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN35, Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN42 og Z-pKT287(Pst)/HcIF-2h-AH6, hvor disse DNA-innskudd er DNA-innskudd hos de rekombinante DNA-molekyler i mikroorganismene identifisert ved tilgangsnumrene DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen) 1699-1703, (b) DNA-sekvenser som hybridiserer til ethvert av de foregående DNA-innskudd og som koder for et polypeptid av IFN-a type, og (c) DNA-sekvenser som er degenererte som et resultat av den genetiske kode i forhold til DNA-sekvensene og innskuddene angitt under (a) og (b), og som koder for et polypeptid av IFN-cx type, hvor disse DNA-sekvenser er operativt forbundet til en ekspresjonskontrollsekvens i det rekombinante DNA-molekyl .

2. Rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 1, karakterisert ved at DNA-sekvensen (b) som hybridiserer til DNA-innskuddet (a) er valgt fra: (d) DNA-innskuddene Z-pBR322(Pst)/HcIF-II-206 og Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN35-AHL6, hvilke DNA-innskudd er DNA-innskudd av de rekombinante DNA-molekyler i mikroorganismene identifisert ved tilgangsnumrene ATCC (American Type Culture Collection) 31633-31634), (e) DNA-sekvenser som hybridiserer til ethvert av de foregående DNA-innskudd og som koder for et polypeptid av IFN-a type, og (f) DNA-sekvenser som er degenererte som et resultat av den genetiske kode til DNA-sekvensene og innskuddene angitt under (d) og (e) og som koder for et polypeptid av IFN-a type.

3. Rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at DNA-sekvensen (b) eller (e), som hybridiserer til DNA-innskuddet (a) eller (d), er valgt fra: (g) Hindlll fragmentet av Hif-chr3, EcoRI fragmentet av Hif-chrl2, Hindlll fragmentet av Hif-chrl2, EcoRI fragmentet av Hif-chrl3, EcoRI fragmentet av Hif-chr23, Hindlll fragmentet av Hif-chr23, EcoRI fragmentet av Hif-chr26, Hindlll fragmentet av Hif-chr26, Hindlll-BamHI fragmentet av Hif-chr35, BamHI fragmentet av Hif-chr35, Tac-Tac fragmentet av Hif-chr23, Billl-Bglll fragmentet av Hif-chrlOÆ, Hindlll-Hindlll fragmentet av Hif-chrlOr, Bglll-Bglll fragmentet av Hif-chr26, Hindlll-Hindlll fragmentet av Hif-chr30, Bglll-Tac fragmentet av Hif-chrl3, og Bglll-Tac fragmentet av Hif-chrl6Æ, hvilke hybridiserende deler er DNA-innskuddene til de rekombinante DNA-molekyler i mikroorganismene identifisert ved tilgangsnumrene DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen) 1914-1923 og ATCC (American Type Culture Collection) 31760-31766, (h) DNA-sekvenser som hybridiserer til enhver av de foregående DNA-sekvenser og som koder for et polypeptid av IFN-a type, og (i) DNA-sekvenser som er degenererte som et resultat av den genetiske kode til DNA-sekvensene og innskuddene angitt under punkt (g) og (h) og som koder for et polypeptid av IFN-a typen.

4. Rekombinant DNA-molekyl ifølge ethvert av kravene 1 til 3, karakterisert ved at DNA-sekvensen koder for prekursor eller ferdigutviklet form av et IFN-al type polypeptid med formel:

5. Rekombinant DNA-molekyl ifølge et hvert av kravene 1 til 3, karakterisert ved at DNA-sekvensen koder for prekursor eller ferdigutviklet form av et IFN-ot2 polypeptid av formel:

6. Rekombinant DNA-molekyl ifølge ethvert av kravene 1 til 3, karakterisert ved at DNA-sekvensen koder for prekursor eller ferdigutviklet form av et IFN-cx4b type polypeptid av formel:

7. Rekombinant DNA-molekyl ifølge.krav 1, karakterisert ved at ekspresjonskontrollsekvensen er valgt fra et lac system, et p-lac system et trp system, hovedoperator og promotorregioner av fagX og kontrollregionen av fd kappeprotein, og andre sekvenser som kontrollerer ekspresjonen av gener i bakterier, gjær eller animalske celler.

8. Rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 1, karakterisert ved at det er valgt fra C8-IFN-al, C8-IFN-CX2, LAC-AUG(oc2) og e-lac-AUG(a2) , hvilke rekombinante DNA molekyler er de rekombinante DNA-molekyler i mikroorganismene identifisert ved tilgangsnumrene ATCC (American Type Culture Collection) 31767-31769.

9. Rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 1, karakterisert ved at det er valgt fra Z-pBR322(Pst)/HcIF-2h, Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN35, Z-pBR322-(Pst)/HcIF-SN42, Z-pKT287(Pst)/HcIF-2h-AH6, Z-pBR322(Pst)/- HcIF-II-206, og Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN35-AHL6, hvilke rekombinante DNA-molekyler er de rekombinante DNA-molekyler i mikroorganismene identifisert ved tilgangsnumrene DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen) 1699-1703 og ATCC (American Type Culture Collection) 31633-31634.