FI108943B - Menetelmiä seriiniproteaasi-inhibiittorien valmistamiseksi ja menetelmässä käytettävä synteettinen tai eristetty DNA-sekvenssi, yhdistelmävektori sekä bakteeri- tai hiivaisäntäsolu - Google Patents

Description

1 08943

Menetelmiä seriiniproteaasi-inhibiittorien valmistamiseksi ja menetelmässä käytettävä synteettinen tai eristetty DNA-sekvenssi, yhdistelmävektori sekä bakteeri- tai hiiva-isän täsolu 5 Tämä keksintö koskee menetelmää yksittäisen poly-peptidiketjun käsittävän seriiniproteaasi-inhibiittorin valmistamiseksi yhdistelmä-DNA-synteesillä, jossa inhibiittorissa on ainakin yksi aktiivinen kohta, jolla on se-10 riiniproteaasi-inhibiittoriaktiivisuus, ja jolla inhibiittorilla on aminohapposekvenssi

Ser-Gly-Lys-Ser-Phe-Lys-Ala-Gly-Val-Cys-Pro-Pro-Lys-Lys-Ser-Ala-Gln-Cys-Leu-Arg-Tyr-Lys-15 Lys-Pro-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp-Trp-Gln-Cys-Pro-

Gly-Lys-Lys-Arg-Cys-Cys-Pro-Asp-Thr-Cys-Gly-Ile-Lys-Cys-Leu-Asp-Pro-Val-Asp-Thr-Pro-Asn-Pro-Thr-Arg-Arg-Lys-Pro-Gly-Lys-Cys-Pro-Val-! t , Thr-Tyr-Gly-Gln-Cys-Leu-Met-Leu-Asn-Pro-Pro- ’·*·’ 20 Asn-Phe-Cys-Glu-Met-Asp-Gly-Gln-Cys-Lys-Arg-

Asp-Leu-Lys-Cys-Cys-Met-Gly-Met-Cys-Gly-Lys-

Ser-Cys-Val-Ser-Pro-Val-Lys-Ala, i · · t · · I ·

I

: tai sen homologin valmistamiseksi, jolla on seriiniprote- ;V; 25 aasi-inhibiittoriaktiivisuus. Keksintö koskee myös syn- • · teettistä tai eristettyä DNA-sekvenssiä, yhdistelmävekto-.·. ; ria ja bakteeri- tai hiiva-isäntäsolua.

!..* Keksinnön tausta

Endogeeniset proteolyyttiset entsyymit auttavat • t i/·· 30 hajottamaan eliöön tunkeutuvia organismeja, antigeeni- : vastaainekomplekseja ja tiettyjä kudosproteiineja, jotka . eivät ole organismille enää tarpeellisia tai käyttökelpoi- siä. Normaalisti toimivassa organismissa proteolyyttisiä * · ’*· entsyymejä muodostuu rajoitetussa määrässä ja osittain 35 niitä säätelee proteaasi-inhibiittorien synteesi.

Suuri joukko luonnossa esiintyviä proteaasi-inhi-biittoreita toimii siten, että ne valvovat endogeenisia 108943 2 proteaaseja rajoittamalla niiden reaktioita paikallisesti ja ajallisesti. Lisäksi proteaasi-inhibiittorit voivat inhiboida proteaaseja, joita infektoivat aineet ja loisteki-jät ovat tuoneet eliöön. Proteaasi-inhibiittoreita on run-5 säästi kudoksissa, jotka ovat erityisen alttiita proteo-lyyttiselle vaikutukselle ja infektioille, esim. hengityselinten alueella.

Proteaasi-inhibiittorit käsittävät suunnilleen 10 % ihmisen plasmaproteiineista. Ainakin kahdeksan inhibiitto-10 ria on eristetty tästä lähteestä ja karakterisoitu kirjallisuudessa. Näihin kuuluvat (X2-makroglobuliini (α2Μ) , αχ-proteaasi-inhibiittori (αχΡΙ), (Χι-antikymotrypsiini (α,χ-Achy), βχ-antikollagenaasi (βι-AC) ja inter-a-trypsiini-inhibiittori (lal).

; 15 Proteaasi/proteaasi-inhibiittori -tasapainon häi riintyminen voi johtaa proteaasivälitteiseen kudoksen vaurioitumiseen; tällaisia tiloja ovat mm. emfyseema, art-riitti, glomerulonefriitti, periodontiitti, lihasdystro-. . fia, kasvaimen muodostuminen ja lukuisat muut patologiset ) I 20 tilat. Tietyissä tilanteissa, esim. vakavissa patologisis-sa prosesseissa, kuten sepsiksessä tai akuutissa leukemi- • · · · assa, vapaiden proteolyyttisten entsyymien määrä nousee : .· sen vuoksi, että entsyymejä vapautuu sekretorisista soul,: luista, Lisäksi, tai joissakin tilanteissa tästä erillään, ::: 25 myös organismin säätävän inhibiittoritehon väheneminen voi aiheuttaa muutoksia proteaasi/proteaasi-inhibiittori -ta- : sapainoon. Esimerkki tällaisesta vähentyneestä säätävästä • · .*··. inhibiittoritehosta on ai-proteaasi-inhibiittoripuutos, ’ joka suuressa määrin korreloi keuhkoemfyseeman kehittymi- ’· 30 sen kanssa.

Organismeissa, joissa esiintyy tällaisia poikkeuk-: .·. sellisia tiloja, voi aiheutua vakavia vaurioita organis- ,···. mille, mikäli ei voida ryhtyä toimenpiteisiin proteolyyt tisten entsyymien kontrolloimiseksi. Sen vuoksi on yritet-35 ty kehittää proteaasi-inhibiittoreita, joita voitaisiin käyttää organismin hoitoon proteolyyttisten entsyymien kontrolloimiseksi.

3 108945

Leukosyyttielastaasi on farmakologisesti erittäin mielenkiintoinen esimerkki seriiniproteaaseista. Kun leu-kosyyttielastaasia vapautuu solujen ulkopuoliseen tilaan, se hajottaa sidekudosta ja muita arvokkaita proteiineja.

5 Vaikka normaalisti toimivalle organismille onkin tarpeen, että tietty määrä sidekudosta ja muita proteiineja hajoaa, leukosyyttielastaasin läsnäolo ylimäärin on yhdistetty erilaisiin patologisiin tiloihin, kuten emfyseemaan ja reumaattiseen artriittiin. Jotta voitaisiin vastustaa 10 vaikutuksia, joita leukosyyttielastaasilla on silloin, kun sitä on normaalia suurempina määrinä, on yritetty kehittää proteaasi-inhibiittori, joka olisi tehokas leukosyytti-elastaasia vastaan. Tällainen proteaasi-inhibiittori olisi erityisen hyödyllinen, jos sitä voitaisiin valmistaa yh-15 distelmä-DNA-tekniikalla puhtaana muotona ja farmaseuttiseen käyttöön riittävinä määrinä.

Ainakin kaksi leukosyyttielastaasi-inhibiittoria on aikaisemmin identifioitu kirjallisuudessa. Yksi proteiini, ·,·. joka on kuvattu julkaisussa Schiessler et ai., "Acid- ! ! 20 stable inhibitors of granulocyte neutral proteases in hu- ‘ man mucous secretions: Biochemistry and possible biologi cal function", Neutral Proteases of Human Polymorphoneu-; ·’ clear Leucosytes, toim, Havemann et al., Urban and Schwar- | : zenberg, Inc., 1978, eristettiin ihmisen siemennesteestä ν.ί 25 ja syljestä, ja sen todettiin olevan kooltaan suunnilleen 11 kilodaltonia tyrosiinin ollessa N-pääteaminohappo. Tätä proteiinia koskevat kirjallisuuskatsaukset ovat esittäneet H**. vain osittaisen aminohapposekvenssin, mutta jo tämä osa- « · · ,·, sekvenssi osoittaa, että tämä proteiini eroaa olennaisesti 30 esillä olevan keksinnön mukaisista proteiineista. Tämän proteiinin sekvenssin kuvaukset yhdessä esillä olevan kek-| J; sinnön mukaisten proteiinien aminohapposekvenssitietojen .*·*. kanssa osoittavat tämän keksinnön tekijöille, että tuote,

I I I

jonka sekvenssin Schiessler et ai., ovat identifioineet, 35 on voinut olla pilkkoutunut proteiini, joka ei ollut yksittäinen polypeptidiketju.

108943 4

Toinen proteiini, joka eräässä tapauksessa on eristetty ihmisen plasmasta, on nimetty aj.-proteaasi-inhi-; biittoriksi. Tätä koskevasta tutkimuksesta on tehty yh teenveto katsaukseen Travis ja Salvesen, Annual Review of 5 Biochemistry, 52 (1983) s. 655-709. Tämän proteiinin ami nohapposekvenssiä koskevat selostukset osoittavat, että sekin eroaa olennaisesti tämän keksinnön mukaisista proteiineista .

Tämän keksinnön mukaisesti valmistettujen yksi-10 polypeptidiketjuisten proteiinien ja ennestään tunnettujen yksi-polypeptidiketjuisten seriiniproteaasi-inhibiittorien välisten oleellisten rakenne-erojen vuoksi ennestään tunnetut yksi-polypeptidi-ketjuiset seriiniproteaasi-inhi-biittorit eivät ole "oleellisesti homologisia" tämän kek-15 sinnön mukaisesti valmistetuille proteiineille.

Trypsiini on toinen farmakologiselta kannalta katsoen erittäin mielenkiintoinen proteaasi. Trypsiinin tiedetään aloittavan tiettyjen pehmeiden elinkudosten, kuten ·.·. esimerkiksi haimakudoksen ha j oamisreaktio erilaisissa ·.·. 20 akuuteissa tiloissa, kuten haimatulehduksessa. Tällaisten tilojen hoidon kehittämiseksi on tehty erilaisia yrityksiä, joissa on käytetty proteiineja, joiden on toivottu inhiboivan trypsiinin vaikutusta, mutta näillä yrityksillä •f ei ole ollut merkittävää menestystä. Esimerkkinä näistä .*.· 25 tutkimuksista ovat yritykset käyttää eksogeenisia naudan trypsiini-inhibiittoreita ihmisen haimatulehduksen hoi-’·,· toon. Vaikka tällaisia tekniikkoja on kokeiltu Euroopassa, "*; U.S. Food and Drug Administration ei ole hyväksynyt niitä ,* . tehokkaiksi. Siten on olemassa sellaisen proteaasi-inhi- 30 biittorin tarve, joka on tehokas neutraloimaan trypsii- niylimäärän erilaisissa akuuteissa ja kroonisissa tilois-sa. Kuten edellä käsitellyn leukosyyttielastaasiinhibiit-torin ollessa kyseessä, myös trypsiini-inhibiittori olisi erityisen hyödyllinen, jos se voitaisiin eristää ja val-35 mistaa yhdistelmä-DNA-menetelmillä puhtaana muotona ja määrinä, jotka olisivat farmaseuttiseen käyttöön riittävinä määrinä.

108943 5

Katepsiini G (Cathepsin G) on toinen proteaasi, jota on suurina määrinä leukosyyteissä. Katepsiini G:n tiedetään pystyvän hajottamaan in vitro lukuisia arvokkaita proteiineja, joihin kuuluu mm. komplementin reaktiotien 5 proteiinit. Haimaelastaasi on toinen proteaasi, joka voi olla osallisena haimatulehduksessa. Siten myös näiden pro-teaasien inhibiittoreilla on potentiaalista farmaseuttista arvoa.

Leukosyyttielastaasi, trypsiini, katepsiini G ja 10 haimaelastaasi ovat esimerkkejä seriiniproteaaseina tunnettujen proteaasien luokasta; näillä proteaaseilla on yhteisiä rakenteellisia ja toimintamekanismin piirteitä. Niiden aktiivisuuden erilaisina substraatteja kohtaan ja niiden herkkyyden erilaisille inhibiittoreille uskotaan 15 johtuvan muutoksista vain muutamissa harvoissa aminohap-poryhmissä. Analogisesti voidaan ajatella olevan luokka seriiniproteaasi-inhibiittoreita, joilla on myös yhteisiä rakenteellisia ja toimintamekanismin piirteitä ja joissa muutokset suhteellisen harvalukuisissa aminohapoissa joh- ! ! 20 tavat eri proteaasien inhibitioon, ja että ainaki-n yksi • · · * *t tämän luokan jäsen inhiboi edellisen luokan jokaisen se- riiniproteaasin. Seriiniproteaasi-inhibiittorien luokka : olisi siten merkittävän arvokas.

Tämän keksinnön tekijät ovat yllättävästi löytä-25 neet DNA-sekvenssin, joka pystyy ohjaamaan tällaisen se-riiniproteaasi-inhibiittorin synteesiä; tämä inhibiittori \· on biologisesti ekvivalenttinen parotidieritteistä (kor- * * *··. vasylkirauhaseritteistä) eristetylle inhibiittorille.

y _ Tässä kuvatussa proteaasi-inhibiittorissa, joka on vai- • · • “ 30 mistettu seuraavassa esitetyillä yhdistelmä-DNA-menetel- i · » millä, uskotaan olevan ainakin kaksi aktiivista kohtaa; ‘ yksi kohta, jolla on leukosyyttielastaasia inhiboivat ,···. ominaisuudet, ja toinen kohta, joka on inhiboivasti ak tiivinen trypsiinin suhteen.

35 Tämän keksinnön mukaisesti tuotetun yhdistelmäin- hibiittorin uskotaan olevan huomattavan kestävä lämpö- ja happodenaturoitumista vastaan ja resistentti myös eri- 108943 6 laisten proteolyyttisten entsyymien aiheuttaman proteo-lyyttisen pilkkoutumisen suhteen. Tässä hakemuksessa käytettynä "yhdistelmäinhibiittori" on tarkoitettu viittaamaan proteaasi-inhibiittoriin, joka on tuotettu yhdistel-5 mä-DNA-menetelmillä ja -tekniikoilla. Edelleen tämän keksinnön mukaisesti valmistetun yhdistelmäinhibiittorin aktiivinen muoto on termodynaamisesti stabiili olosuhteissa, jotka normaalisti vallitsevat solujen ulkopuolella nisäkkään kehossa. Yhdistelmäproteaasi-inhibiittorin de-10 naturoidulla muodoilla on myös kyky muodostaa disulfi-disidoksia ja aikaansaada ei-kovalenttisia vuorovaikutuksia, jotka ovat tarpeen aktiivisen tertiaarisen rakenteen muodostumiseksi biologisen herätteen puuttuessa.

Tämän keksinnön mukaiset DNA-sekvenssit, jotka 15 seuraavassa esitetään täydellisemmin, pystyvät ohjaamaan proteiinisynteesiä, jossa muodostuva proteiini eroaa suuresti muista julkaistuista leukosyyttielastaasi-inhibiit-torisekvensseistä.

• Tämän keksinnön mukaisen DNA-sekvenssin identifi- ! ! i 20 ointi on siten mahdollistanut yhdistelmä-DNA-menetelmien ' \ keksimisen tässä esitettyjen uusien yhdistelmäproteaasi- inhibiittorien tuottamiseksi.

: .* Tällaisten yhdistelmämenetelmien avulla voidaan tuottaa inhibiittoreita riittävinä määrinä ja riittävän '·': 25 puhtaina taloudellisten farmaseuttisten koostumusten ai kaansaamiseksi, joilla koostumuksilla on seriiniproteaase-'·_! ja inhiboiva aktiivisuus. Lisäksi DNA-sekvenssin identifi- ", ointi on mahdollistanut yhdistelmä-DNA-menetelmien keksi misen yllä kuvatun seriiniproteaasi-inhibiittorin analo- • '! 30 gien tuottamiseksi.

Yhteenveto keksinnöstä

Keksinnön mukaiselle menetelmälle yksittäisen po-lypeptidiket j un käsittävän seriiniproteaasi-inhibiittorin valmistamiseksi yhdistelmä-DNA-synteesillä, jossa inhi-35 biittorissa on ainakin yksi aktiivinen kohta, jolla on se-riiniproteaasi-inhibiittoriaktiivisuus, ja jolla inhibiittorilla on aminohapposekvenssi 108943 7

Ser-Gly-Lys-Ser-Phe-Lys-Ala-Gly-Val-Cys-Pro-Pro-Lys-Lys-Ser-Ala-Gln-Cys-Leu-Arg-Tyr-Lys-Lys-Pro-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp-Trp-Gln-Cys-Pro-5 Gly-Lys-Lys-Arg-Cys-Cys-Pro-Asp-Thr-Cys-Gly-

Ile-Lys-Cys-Leu-Asp-Pro-Val-Asp-Thr-Pro-Asn-Pro-Thr-Arg-Arg-Lys-Pro-Gly-Lys-Cys-Pro-Val-Thr-Tyr-Gly-Gln-Cys-Leu-Met-Leu-Asn-Pro-Pro-Asn-Phe-Cys-Glu-Met-Asp-Gly-Gln-Cys-Lys-Arg-10 Asp-Leu-Lys-Cys-Cys-Met-Gly-Met-Cys-Gly-Lys-

Ser-Cys-Val-Ser-Pro-Val-Lys-Ala, tai sen homologin valmistamiseksi, jolla on seriiniprote-aasi-inhibiittoriaktiivisuus, on tunnusomaista se, mitä 15 patenttivaatimuksessa 1 esitetään. Keksinnön mukaiselle synteettiselle tai eristetylle DNA-sekvenssille on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 16 esitetään. Keksinnön mukaiselle yhdistelmävektorille on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 22 esitetään ja keksinnön ! ! 20 mukaiselle bakteeri- tai hiiva-isäntäsolulle on tunnus- * » · » » » ‘ *, omaista se, mitä patenttivaatimuksessa 23 esitetään.

Tämä keksintö koskee yhdistelmä-DNA-menetelmiä pro-‘ ·* teaasi-inhibiittorien tuottamiseksi yleensä ja tarkemmin sellaisten yhdistelmäinhibiittorien tuottamiseksi, jotka t · V.J 25 kohdistuvat ihmisen polymorfonukleaarisiin (PMN-) granulo- syyttiproteaaseihin. Erityisesti tämä keksintö koskee yh- “,· distelmä-DNA-menetelmiä ihmisen seriiniproteaasin, mukaan lukien leukosyyttielastaasin ja trypsiinin, inhibiittorien i » » • tuottamiseksi.

» ♦ » » · • 30 Lisäksi tämä keksintö koskee yhdistelmä-DNA-mene- '...· telmiä kyseisten seriiniproteaasi-inhibiittorien analogien ; t uo 11 ami s e ks i . Tämä keksintö koskee myös synteettisiä ja luonnossa esiintyviä DNA-sekvenssejä, jotka ovat käyttökelpoisia yhdistelmä-DNA-menetelmissä, kuten seuraavassa 35 on esitetty.

Tämän keksinnön päämääränä on aikaansaada seriini-proteaasi-inhibiittorin yhdistelmä-DNA-synteesi, joka in- 108943 8 hibiittori on yksittäinen polypeptidiketju, jolla on se-riiniproteaasi-inhibiittorin aktiivisuus. Näillä inhibiittoreilla on aktiivisuus, joka on biologisesti ekvivalenttien aktiivisuudelle, joka on ihmisen parotidieritteistä 5 eristetyllä luonnon leukosyyttielastaasi- tai trypsiini-inhibiittoreilla.

Näiden seriiniproteaasi-inhibiittorien vaihtoehtoisten yhdistelmä-DNA-synteesien helpottamiseksi tämän keksinnön päämääränä on edelleen aikaansaada synteettisiä 10 DNA-sekvenssejä, jotka pystyvät ohjaamaan näiden yhdistel-mäproteaasi-inhibiittorien muodostumista sekä ekvivalent-tisia luonnon DNA-sekvenssejä. Tällaisia luonnon DNA-sek-venssejä voidaan eristää cDNA:sta tai geenikirjastoista, joista proteaasi-inhibiittorin synteesiä ohjaamaan pystyvä 15 geeni voidaan identifioida ja eristää.

Edelleen tämän keksinnön päämääränä on aikaansaada yhdistelmä-DNA-menetelmä yllä käsiteltyjen proteaasi-inhi-biittorien analogien tuottamiseksi ja vastaavia tällaisis-·,·, sa menetelmissä käyttökelpoisia analogisia DNA-sekvens- j . ! 20 sejä.

‘ Keksinnön muut päämäärät ja edut esitetään osit- * tain selityksessä, ja osittain ne käyvät ilmeisiksi seli- t · · • ·’ tyksen perusteella tai havaitaan sovellettaessa keksintöä M.· käytäntöön. Päämäärät ja edut voidaan toteuttaa ja saavut- ν'.* 25 taa oheisissa patenttivaatimuksissa erityisesti mainittu jen keinojen ja yhdistelmien avulla.

’*,· Tämän keksinnön päämäärien saavuttamiseksi ja sen > · ”·. tarkoitusten mukaisesti on keksitty DNA-sekvenssi, joka ,· t pystyy ohjaamaan yhdistelmä-DNA-tekniikan avulla sellais- * · ’ *· 30 ten proteaasi-inhibiittorien muodostumista, jotka aktiivi- sinä muotoinaan ovat yksi-polypeptidiketjuisia proteiine- ' ja, joilla on seriiniproteaasi-inhibiittorin aktiivisuus.

» » · f. Nämä yhdistelmäproteaasi-inhibiittorit ovat merkittävän resistenttejä lämpö- ja happodenaturointia vastaan. Edel-35 leen nämä proteaasi-inhibiittorit säilyttävät biologisen aktiivisuutensa jopa sen jälkeen, kun ne on altistettu monille proteolyyttisille entsyymeille kuten kymotrypsiinil- 108943 9 le, hiiren leuanalusproteaasille (submaxillary protease) ja klostripaiinille.

Koodaava säie DNA-sekvenssissä, jonka on keksitty ohjaavan näiden yhdistelmäseriiniproteaasi-inhibiittorien 5 tuotantoa, on seuraava:

5' AGCGG TAAAA GCTTC AAAGC TGGCG TATGC CCGCC

GAAAA AATCC GCGCA GTGTC TGCGG TACAA AAAAC

CGGAA TGCCA GTCCG ACTGG CAGTG CCCGG GTAAA

10 AAACG TTGTT GCCCG GACAC CTGCG GCATC AAATG

CCTGG ATCCG GTTGA TACCC CGAAC CCGAC TCGTC

GAAAA CCGGG TAAAT GCCCG GTAAC CTATG GCCAG

TGTCT GATGC TGAAC CCGCC GAACT TCTGC GAAAT

GGACG GCCAG TGTAA ACGAG ATCTG AAATG CTGTA

15 TGGGT ATGTG CGGCA AATCT TGTGT TTCCC CGGTA

! AAAGC ATAA 3'

Yllä olevien lyhenteiden tarkoittamat nukleotidit ·,·. on esitetty kohdassa "Edullisen sovellutusmuodon yksityis- !! 20 kohtainen kuvaus".

‘Koodaava säie toisessa, edullisessa DNA-sekvens-’ ’ sisissä, jonka on keksitty ohjaavan näiden yhdistelmäse- : ·* riiniproteaasi-inhibiittorien, erityisesti sekretorisen leukosyyttiproteaasi-inhibiittorin (SLPI) tuotantoa, on V,·* 25 seuraava:

',· 5' TCTGG TAAAA GCTTC AAAGC TGGCG TATGC CCGCC

'·. GAAAA AATCC GCGCA GTGTC TGCGG TACAA AAAAC

GCCAA GTCCG ACTGG CAGTG CCCGG GTAAA AACG Y 30 AAACG TTGTT GCCCG GACAC CTGCG GCATC AAATG

C CCTGG ATCCG GTTGA TACCC CGAAC CCGAC TCGTC

GAAAA CCGGG TAAAT GCCCG GTAAC CTATG GCCAG TGTCT GATGC TGAAC CCGCC GAACT TCTGC GAAAT GGACG GCCAG TGTAA ACGAG ATCTG AAATG CTGTA 35 TGGGT ATGTG CGGCA AATCT TGTGT TTCCC CGGTA

AAAGC ATAA 3' 108943 10

Edelleen tämän keksinnön päämäärien saavuttamiseksi ja sen tarkoitusten mukaisesti esitetään yhdistelmä-DNA-menetelmä, jonka avulla päästään näiden seriiniprote-i aasi-inhibiittorien tuotantoon mikrobien avulla käyttäen 5 yllä mainittuja, joko luonnossa esiintyviä tai synteetti-j siä DNA-sekvenssejä. Tämä yhdistelmä-DNA-menetelmä käsit tää seuraavat vaiheet: (a) valmistetaan DNA-sekvenssi, joka pystyy ohjaamaan isäntämikro-organismin tuottamaan proteiinia, jolla 10 on seriiniproteaasi-inhibiittorin aktiivisuus, edullisesti leukosyyttielastaasi-inhibiittorin aktiivisuus; (b) kloonataan DNA-sekvenssi vektoriin, joka on siirrettävissä isäntämikro-organismiin ja se pystyy replikoituinaan siinä, jolloin tämä vektori sisältää DNA-sek- 15 venssin toimintaelementtejä; (c) siirretään DNA-sekvenssin ja toimintaele- menttejä sisältävä vektori isäntämikro-organismiin, joka pystyy ilmentämään proteaasia inhiboivan proteiinin; ·,·. (d) viljellään mikro-organismia olosuhteissa, jot- » · · • ^ 20 ka sopivat vektorin lisääntymiseen ja inhibiittorin ilmen tymiseen; (e) kerätään inhibiittori talteen; ja ·’ (f) annetaan inhibiittorin omaksua aktiivinen tertiaarinen rakenne, jolloin sillä on proteaasi-inhi- 25 biittorin aktiivisuus.

Helpottaakseen tässä keksinnössä käyttökelpoisten luonnon DNA-sekvenssien identifiointia ja eristämistä, tä- t · - * * * * män keksinnön tekijät ovat kehittäneet ihmisen parotidiku- . doksen cDNA-kirjaston. Tämä kirjasto sisältää geneettisen ; ’· 30 informaation, joka pystyy ohjaamaan solun syntetisoimaan ···' tämän keksinnön mukaisesti saatavia seriiniproteaasi- : inhibiittoreita. Muita luonnon DNA-sekvenssejä, joita voi- daan käyttää tässä esitetyissä yhdistelmä-DNA-menetelmis-sä, voidaan eristää ihmisen geenikirjastosta.

35 Synteettisiä DNA-sekvenssejä, joita voidaan käyt tää tämän keksinnön mukaisissa menetelmissä, voidaan valmistaa polynukleotidisynteesi- ja jaksottelutekniikoilla, 108943 11 jotka ovat tunnettuja henkilöille, joilla on tavanomainen ammattitaito tällä alalla. Yllä kuvatussa menetelmässä käyttökelpoisia luonnon DNA-sekvenssejä voidaan identifioida ja eristää menetelmällä, joka käsittää seuraavat vai-5 heet: (a) valmistetaan ihmisen cDNA-kirjasto soluista, edullisesti parotidisoluista, jotka pystyvät tuottamaan seriiniproteaasi-inhibiittoria; (b) testataan ihmisen DNA-kirjastoa ainakin yhdel-10 lä koettimella, joka pystyy sitoutumaan proteaasi-inhi- biittorigeeniin tai sen proteiinituotteeseen; (c) ainakin yksi klooni, joka sisältää inhibiittoria koodaavaa geeniä, identifioidaan sen perusteella, että klooni pystyy sitomaan ainakin yhden koettimen, joka sitoo 15 geenin tai sen proteiinituotteen; (d) eristetään inhibiittoria koodaava geeni identifioidu ( i ) sta kloon(e)ista; ja (e) liitetään geeni tai sopivia fragmentteja siitä ·,·, toimintaelementteihin, jotka ovat tarpeen geenin säilyttä- c » * i.>.< 20 miseksi ja ilmentämiseksi isäntämikro-organismissa.

Yllä kuvatussa menetelmässä käyttökelpoisia luon- » · * · non DNA-sekvenssejä voidaan identifioida ja eristää myös i i · : ·’ menetelmällä, joka käsittää seuraavat vaiheet: (a) valmistetaan ihmisen geeni-DNA-kirjasto, joka 25 on edullisesti monistettu recArecBC-E. coli-isännässä; (b) testataan ihmisen geeni-DNA-kirjasto ainakin yhdellä koettimella, joka pystyy sitoutumaan seriiniprote- • · iini-inhibiittorigeeniin tai sen proteiinituotteeseen; , (c) ainakin yksi klooni, joka sisältää inhibiitto- i · ; '· 30 ria koodaavaa geeniä, identifioidaan sen perusteella, että * i klooni pystyy sitomaan ainakin yhden koettimen, joka sitoo geenin tai s en proteiinituotteen; ”·. (d) eristetään inhibiittoria koodaava geeni iden- » i · » tifioidu(i)sta kloonista tai klooneista; ja 35 (e) liitetään geeni tai sopivia fragmentteja siitä toimintaelementteihin, jotka ovat tarpeen geenin säilyttämiseksi ja ilmentämiseksi isäntämikro-organismissa.

108943 12 !

Edelleen tämän keksinnön päämäärien saavuttamiseksi ja sen tarkoitusten mukaisesti seriiniproteaasi-inhi-biittorin farmaseuttisesti käyttökelpoisia analogeja voidaan tuottaa yllä esitetyllä yhdistelmä-DNA-menetelmällä 5 muuttamalla synteettistä DNA-sekvenssiä tai luonnon DNA- i sekvenssiä yhdistelmä-DNA-tekniikalla sellaisen geenin ai kaansaamiseksi, joka sopivaan vektoriin kloonattuna ja sopivaan isäntämikro-organismiin siirrettynä pystyy aikaansaamaan halutun analogin ilmentymisen.

10 Lisäksi tämän keksinnön päämäärien saavuttamiseksi ja sen tarkoitusten mukaisesti esitetään farmaseuttisia koostumuksia, jotka sisältävät aktiivisena aineosana tämän keksinnön mukaisesti saatavaa yhdistelmäproteaasi-inhi-biittoria tai sen biologisesti aktiivista analogia, joka 15 on tuotettu yllä esitetyillä yhdistelmä-DNA-menetelmillä.

i 1 Oheiset piirrokset, jotka liitetään tähän ja ovat osa hakemusta, havainnollistavat erilaisia plasmideja, jotka ovat käyttökelpoisia tässä keksinnössä, ja selvittä-V, vät yhdessä niiden kuvauksen kanssa keksinnön periaattei- i · · . . 20 ta.

! · * * · · ! ’ Piirrosten lyhyt kuvaus I · 4 · i / kuvio 1 on plasmidin pSGE6 kartta, i $ : ·* kuvio 2 on plasmidin pSGE8 kartta, * kuvio 3 on plasmidin pGS285 kartta, ,V 25 kuvio 4 on plasmidin pGS485 kartta.

Edullisten sovellutusmuotojen kuvaus

Seuraavassa viitataan yksityiskohtaisesti keksin- * · "’j non tällä hetkellä edullisina pidettyihin sovellutusmuo- ,* , töihin, mikä yhdessä seuraavan esimerkin kanssa auttaa

I I

'* ' 30 keksinnön periaatteiden selvittämisessä.

Kuten edellä on mainittu, tämä keksintö koskee puh-> distettua muotoa eristettyjen proteaasi-inhibiittoreiden ti* · valmistamiseksi. Edullisesti tämän keksinnön mukaiset se- 4 t

4 > I

riiniproteaasi-inhibiittorit ovat yksi-polypeptidiketjui-35 siä proteiineja, jotka ovat oleellisesti homologisia ja edullisimmin biologisesti ekvivalentteja luonnossa esiintyville seriiniproteaasi-inhibiittoreille, joita on eris- 108943 13 tetty ihmisen parotidieritteistä. Ilmaisulla "biologisesti ekvivalentti" käytettynä koko selityksessä ja patenttivaa-; timuksissa tarkoitetaan, että koostumukset pystyvät estä mään proteaasin indusoimaa kudoksen hajoamista saman tyyp-5 pisesti vaikka ei välttämättä samoin määrin kuin luonnossa esiintyvä proteaasi-inhibiittori. Ilmaisulla "oleellisesti homologinen" käytettynä seuraavassa selityksessä ja patenttivaatimuksissa tarkoitetaan homologiaa luonnossa esiintyvän parotidi-inhibiittorin kanssa siten, että tämä 10 homologisuusaste ylittää aikaisemmin kirjallisuudessa ku vattujen yksi-polypeptidiketjuisten seriiniproteaasi-inhi-biittoriproteiinien osoittaman homologisuusasteen. Edullisesti homologisuusaste on yli 40 %, edullisimmin yli 50 %, erityisen edullisen proteiiniryhmän proteiinien ollessa 15 yli 60-prosenttisesti homologisia luonnon parotidi-inhi- biittorille.

Yllä mainittu prosentuaalinen homologisuusaste I lasketaan kahdesta sekvenssistä pienemmässä todettujen sellaisten komponenttien prosentuaalisena osuutena, jotka . ; 20 komponentit voidaan todeta myös kahdesta sekvenssistä suu- ;V.‘ remmassa, jolloin komponentilla tarkoitetaan neljän vie- ;..j rekkäisen aminohapon jaksoa.

; V. Nyt kysymyksessä olevilla yhdistelmämenetelmillä » » tuotettuja edullisia proteaasi-inhibiittoreita kuvataan : ’! 25 US-patenttihakemuksessa sarjanumero 678 823, hakija Robert ‘ C. Thompson et ai, otsikko "Serine Protease Inhibitors and

Methods for Isolation of Same". Tällaiset proteaasi-inhi-" biittorit ovat huomattavan kestäviä lämmön ja happojen vaikutuksesta tapahtuvaa denaturoitumista vastaan eivätkä 30 menetä aktiivisuuttaan altistettuina useille proteolyyt- tisille entsyymeille mukaan luettuina kymotrypsiini, hii-·’ ren submaksillaariproteaasi ja klostripaiini. Näillä inhi- d : biittoreilla on myös kyky muodostaa tarpeellisia disulfi- disidoksia ja osallistua sopivaan ei-kovalenttiseen vuoro-35 vaikutukseen, niin että ne voivat omaksua aktiivisen ter-tiaarirakenteen, joka pystyy toimimaan seriiniproteaasi-inhibitorisesti biokemiallisen herätteen puuttuessa, tai 108943 14 jos disulfidisidokset ovat katkenneet ja ei-kovalenttiset vuorovaikutukset ovat keskeytyneet, se pystyy muodostamaan uudelleen sellaisia sidoksia ja vuorovaikutuksia, niin että se saa uudelleen tällaisen aktiivisen tertiaariraken-j 5 teen biokemiallisen herätteen puuttuessa.

Tällaiset ominaisuudet omaavan edullisen proteaa-si-inhibiittorin happojärjestys on määritetty. Sekvenssin todettiin olevan seuraava: 10 Ser-Gly-Lys-Ser-Phe-Lys-Ala~Gly-Val-Cys-Pro-

Pro-Lys-Lys-Ser-Ala-Gln-Cys-Leu-Arg~Tvr-Lys-Lys-Pro-GIU-Cys-Gln-Ser-Asp~Trp-Gln-Cys-Pro-Gly-Lys-Lys-Arg-Cys-Cys~Pro-Asp-Thr-Cys-Gly-Ile-Lys-Cys-Leu-Asp-Pro-Val-Asp-Thr-Pro-Asn-15 Pro-Thr-Arg-Arg-Lys-Pro-Gly-Lys-Cys-Pro-Val-

Thr-Tyr-Gly-Gln-CYS-Leu-Met-Leu-Asn-Pro-Pro-Asn-Phe-Cys-Glu-Met-Asp-Gly-Gln-Cys-Lys-Arg-Asp-Leu-Lys-Cys-Cys-Met-Gly-Met-Cys-Gly-Lys-Ser-Cys-Val-Ser-Pro-Val-Lys-Ala.

. 20

Yllä olevat lyhenteet vastaavat polypeptidin ami-...j nohappotähteitä seuraavasti:

Aminohappo Lyhenne

Alaniini Ala I’! 25 Väliini Vai i · · * ‘ Leusiini Leu

Isoleusiini Ile . *: Proliini Pro * · »

Fenyylialaniini Phe » ,·. : 30 Tryptofaani Trp >··, Metioniini Met

Glysiini Gly k : Seriini Ser

Treoniini Thr 35 Kysteiini Cys

Tyrosiini Tyr

Asparagiini Asn 108943 15

Glutamiini Gin j Aspartiinihappo Asp

Glutaamihappo Glu

Lysiini Lys 5 Arginiini Arg

Histidiini His

On havaittu, että näillä tässä kuvatuilla yhdis-telmä-DNA-menetelmillä tuotetuilla proteaasi-inhibiitto-10 reillä on useampi kuin yksi erillinen domeeni. Useammalla kuin yhdellä erillisellä domeenilla tarkoitetaan, että proteiinilla on useita aktiivisia kohtia, jotka toimivat eri entsyymejä vastaan. Näiden kohtien läsnäolo ja sijainti on määritetty sen avulla, että on huomattu oleellista 15 homologiaa proteaasi-inhibiittorin ainakin kahden osan välillä. Uskotaan, että erillisten domeenien läsnäolo antaa kysymyksessä oleville proteaasi-inhibiittoreille kyvyn inhiboida lukuisia seriiniproteaaseja, joihin kuuluu sekä leukosyyttielastaasi että trypsiini.

20 Edelleen on huomattu, että näissä proteaasi-inhi- .V. biittoreissa olevien erillisten domeenien runsaslukuisuu- • · » den vuoksi näitä proteaasi-inhibiittoreita voidaan käyttää > · perusrakenteena, johon voidaan muodostaa erilaisia muita aktiivisia kohtia sellaisten proteaasi-inhibiittorien ai-25 kaansaamiseksi, joilla on lisäominaisuuksia. Tämän keksinnön edullisen sovellutusmuodon mukaisesti valmistetaan proteaasi-inhibiittori, joka inhiboi leukosyyttielastaa-· siä, katepsiini G:tä, haimaelastaasia ja trypsiiniä. Kaik- : ki nämä entsyymit ovat seriiniproteaaseina tunnettujen ; 30 proteaasien luokan jäseniä; tämän luokan proteaaseilla on sama toimintamekanismi ja monia yhteisiä rakenteellisia ;* piirteitä. Oletetaan, että muuttamalla tämän keksinnön mu- j kaisesti tuotettujen proteaasi-inhibiittorien muutamia : aminohapposivuketjuja, voidaan saada aikaan lukuisia inhi- 35 biittoreita, joista kukin pystyy inhiboimaan ainakin yhtä jäsentä koko seriiniproteaasien luokasta. Edelleen tällaisten sivuketjumodifikaatioiden voidaan olettaa johtavan 108943 16 ! lukuisiin inhibiittoreihin, joilla on parantuneet inhiboi- I vat ominaisuudet yllä kuvattuja seriiniproteaasien luokan tiettyjen jäsenten suhteen.

Tarvittaviin aminosivuketjujen muutoksiin näihin 5 päämääriin pääsemiseksi viittaavat tietyt rakenteellisesti samankaltaiset elementit, joita tämän keksinnön mukaisesti tuotetulla edullisella inhibiittorilla on muihin seriini-proteaasi-inhibiittoreihin nähden, joille inhibiittorin tärkeä toiminnallinen osa on selvitetty röntgensädekris-10 tallografian avulla. Näihin rakenteellisesti saman kaltaisiin elementteihin kuuluvat tämän keksinnön mukaisesti valmistetun yllä kuvatun edullisen seriiniproteaasi-inhi-biittorin aminohapot 17-29 ja aminohapot 70-83. Ehdotetut muutokset inhibiittorin aktiivisuuden parantamiseksi joko 15 määrän tai laadun suhteen trypsiinin tyyppisiä seriinipro-teaaseja vastaan käsittävät yhden tai useamman seuraavista muutoksista: aminohapon 20 Arg tilalle Lys, aminohapon 72 tai 74 Leu tilalle Lys tai Arg ja aminohapon 73 Met tilalle Lys tai Arg.

, 20 Ehdotetut muutokset inhibiittorin aktiivisuuden . parantamiseksi joko määrän tai laadun suhteen kymotrypsii- nin kaltaisia seriiniproteaaseja mm. katepsiini G:tä vas-: taan käsittävät yhden tai useamman seuraavista muutoksis- ! ta: aminohapon 20 Arg tilalle Phe, Tyr tai Trp, aminohapon 25 72 tai 74 Leu tilalle Phe, Tyr tai Trp ja aminohapon 73

Met tilalle Phe, Tyr tai Trp.

Ehdotetut muutokset inhibiittorin aktiivisuuden •j parantamiseksi joko määrän tai laadun suhteen haimaelas- taasin kaltaisia seriiniproteaaseja vastaan käsittävät yh-·' ; 30 den tai useamman seuraavista muutoksista: aminohapon 20

Arg tilalle Ala, aminohapon 72 tai 74 Leu tilalle Ala ja aminohapon 7 3 Met tilalle Ala.

• · Tätä keksintöä käytäntöön sovellettaessa on muis- : tettava, että aminohappojärjestyksen muuttaminen uusien 35 proteaasia inhiboivien ominaisuuksien antamiseksi kyseessä oleville proteiineille voi tuhota inhibiittorin aktiivisuuden leukosyyttielastaasia tai trypsiiniä vastaan. Täi- i 108943 17 laiset vaikutukset voidaan määrittää tavanomaisilla tutkimuksilla seuraten tämän keksinnön yhteydessä esitettyä.

Edelleen on oletettu, että erillisten aminohappojen tai aminohappojaksojen korvaaminen yllä esitetyllä ta-5 valla voi parantaa nyt esitettyjen proteaasi-inhibiit-torien leukosyyttielastaasien inhiboivia ominaisuuksia tai trypsiinia inhiboivia ominaisuuksia samalla kun menetetään jonkin verran parantamattoman domeenin aktiivisuudesta. Inhibiittoriproteiinin minkä tahansa domeenin aktiivisuus 10 voidaan todella poistaa kokonaan sopivilla aminohappojen korvaamisilla, jolloin saadaan aikaan inhibiittoriprote-iineja, jotka ovat spesifisiä yhdelle entsyymille tai jollekin entsyymien alaryhmälle niistä entsyymeistä, joita vastaan proteiini normaalisti on aktiivinen. Esimerkiksi 15 asemassa 20 olevan Arg:n korvaaminen Gly:llä deaktivoi trypsiini-inhibiittoridomeenin kun taas asemassa 73 olevan Met: n tai asemassa 72 tai 74 olevan Leu:n korvaaminen Gly:llä deaktivoi leukosyyttielastaasi-inhibiittoridomee-nin. Domeenit voidaan myös erottaa erillisiksi proteii-20 neiksi, joista jokainen säilyttää halutut inhibiittoritoi- minnot. Nyt esitetyt patenttivaatimukset käsittävät muita • menetelmiä sellaisten inhibiittorien tuottamiseksi näillä « · · · .. . tavoilla.

‘ ; Tämän keksinnön tekijät ovat keksineet synteetti- ’·*’ 25 sen DNA-sekvenssin, joka pystyy ohjaamaan yllä käsitelty- V jen proteaasi-inhibiittorien solunsisäistä tuotantoa.

Tällä sekvenssillä on seuraava rakenne: ’ ; 30 108943 18

Hindlll

I 5'AGC GGT AAA AGC TTC AAA GCT GGC GTA TGC CCG CCG

Alul

FnuDII Rsal Hpall

5 AAA AAA TCC GCG CAG TGT CTG CGG TAC AAA AAA CCG

Hha-I

_ Xmal

GAA TGC CAG TCC GAC TGG CAG TGC CCG GGT AAA AAA

_Hpall

Neil 10

Neil

CGT TGT TGC CCG GAC ACC TGC GGC ATC AAA TGC CTG

Hpall Fnu4HI BstNI

BamHI

GAT CCG GTT GAT ACC CCG AAC CCG ACT CGT CGA AAA

15 Hpall TagI

Neil Hpall Ball

CCG GGT AAA TGC CCG GTA ACC TAT GGC CAG TGT CTG

Hpall Neil Haelll

ATG CTG AAC CCG CCG AAC TTC TGC GAA ATG GAC GGC

20 Hae III

l t I

·'*· Bqlll

CAG TGT AAA CGA GAT CTG AAA TGC TGT ATG GGT ATG

;··; Mbol • V Fnu4HI Neil . TGC GGC AAA TCT TGT GTT TCC CCG GTA AAA GCA TAA 3’ ' 25 Hpall

Nukleotidi Lyhenne

: deoksiadenyylihappo A

• ; deoksiguanyylihappo G

,’ , 30 deoksisytidyylihappo e

tymidyylihappo T

Tämän keksinnön tekijät ovat keksineet toisen, edullisen synteettisen DNA-sekvenssin, joka pystyy ohjaa-35 maan yllä käsiteltyjen proteaasi-inhibiittorien, varsinkin yllä mainitun sekretorisen leukosyyttiproteaasi-inhi- 108943 19 biittorin (SLPI) solun ulkopuolella tapahtuvaa tuotantoa.

Tällä sekvenssillä on seuraava rakenne:

Hindlll

5 ' TCT GGT AAA AGC TTC AAA GCT GGC GTA TGC CCG CCG 5 AluI

PnuDII RsaI Hpall

A AA AAA TCC GCG CAG TGT CTG CGG TAC AAA AAA CCG

HhaI

Xmal

GAA TGC CAG TCC GAC TGG CAG TGC CCG GGT AAA AAA

10 -

Hpall

Neil

Hpall

CGT TGT TGC CCG GAC ACC TGC GGC ATC AAA TGC CTG

Neil Fnu4HI BstNI

15

BamHI

GAT CCG GTT GAT ACC CCG AAC CCG ACT CGT CGA AAA

Hpall Taql

Hpall Hpall Ball

CCG GGT AAA TGC CCG GTA ACC TAT GGC CAG TGT CTG

20 NciI NciI Kaelll

.V. ATG CTG AAC CCG CCG AAC TTC TGC GAA AT G GAC GGC

Hae III

,! ·' Bglll

; CAG TGT AAA CGA GAT CTG AAA TGC TGT ATG GGT ATG

. .·. Mbol 25

Fnu4HI Neil TGC GGC AAA TCT TGT GTT TCC CCG GTA AAA GCA TAA 3'

Hpall

Siitä syystä, että nyt kyseessä olevilla proteaasi- 30 inhibiittoreilla on monidomeenirakenne kuten edellä on ' huomautettu, tässä esitettyyn synteettiseen DNA-sek- venssiin on suunniteltu variaatioita, jotka johtavat DNA-; ; : sekvenssiin, joka pystyy ohjaamaan edellä käsiteltyjen se- ;riiniproteaasi-inhibiittorien analogien tuotantoa. Tämän 35 keksinnön mukaisilla yhdistemä-DNA-tekniikoilla tuotetuilla edullisilla seriiniproteaasi-inhibiittorien analogeilla on erityisesti seuraava aminohappojärjestys: 108943 20 i Ri-Gly-Lys-Ser-Phe-Lys-Ala-Gly-Val-Cys-Pro-

Pro-Lys-Lys-Ser-Ala-Gln-Cys-Leu-R2-Tyr-Lys-Lys-Pro-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp-Trp-Gln-Cys-Pro-5 Gly-Lys-Lys-Arg-Cys-Cys-Pro-Asp-Thr-Cys-Gly-

Ile-Lys-Cys-Leu-Asp-Pro-Val-Asp-Thr-Pro-Asn-Pro-Thr-Arg-Arg-Lys-Pro-Gly-Lys-Cys-Pro-Val-Thr-Tyr-Gly-Gln-Cys-R8-R3-R9-Asn-Pro-Pro-Asn-Phe-Cys-Glu-R4-Asp-Gly-Gln-Cys-Lys-Arg-10 Asp-Leu-Lys-Cys-Cys-R5-Gly-R6-Cys-Gly-Lys-

Ser-Cys-Val-Ser-Pro-Val-Lys-R7, jossa

Ri ja R7 ovat samat ja erilaiset ja valittu ryhmästä, jonka muodostavat substituoitu tai substituoimaton 15 aminohappotähde ja niiden johdannaiset; ja R2, R3, R-j, Rs, Re, Rs ja Rg ovat samat tai erilaiset ja valitut ryhmästä, jonka muodostavat metioniini, väliini, alaniini, fenyylialaniini, tyrosiini, tryptofaani, ly-siini, glysiini ja arginiini.

20 Huomattakoon, että yllä esitetty DNA-sekvenssi esittää tämän keksinnön edullista sovellutusmuotoa. On ym- * [. märrettävä, että geneettisen koodin degeneraation vuoksi . voidaan tehdä lukuisia nukleotidivalintoja, jotka johtavat • DNA-sekvenssiin, joka pystyy ohjaamaan kyseessä olevien 25 proteaasi-inhibiittorien tai niiden analogien tuotantoa.

Siten DNA-sekvenssit, jotka ovat toiminnallisesti ekvivalentteja yllä esitetylle sekvenssille tai jotka ovat toi-| minnallisesti ekvivalentteja sekvensseille, jotka ohjaisi- : vat yllä esitetyn aminohappojärjestyksen mukaisesti muo- d . 30 dostuneen proteaasi-inhibiittorin analogien tuotantoa, on tarkoitettu kuuluviksi tämän keksinnön piiriin. Esimerkki-;* nä kodonisubstituutioista, jotka katsotaan geneettisen J : koodin degeneroitumisen seuraukseksi, seuraava kaavio esittää muita DNA-sekvenssejä, jotka on tarkoitettu tämän 35 keksinnön piiriin kuuluviksi yllä esitetyn edullisen aminohapposekvenssin tuottamista varten. Seuraamalla esimerkkiä ekvivalenttien, tämän proteiinin tuottamiseen käytet- j 108943 21 tavien DNA-sekvenssien määrittämiseksi alan ammattimiehet pystyvät määrittämään ekvivalentit DNA-sekvenssit myös edullisen aminohapposekvenssin analogien tuottamista varten .

5 10

Ser Gly Lys Ser Phe Lys Ala Gly Vai Cys Pro Pro Lys Lys Ser Ala

5'TCN GGN AAP TCN TTQ AAP GCN GGN GTN TGQ CCN CCN AAP AAP TCN GCN

AGQ AGQ AGQ

20 30 .Gin Cys Leu Arg Tyr Lys Lys Pro Glu Cys Gin Ser Asp Trp Gin Cys

10 CAP TGQ CTN CGN TAQ AAP AAP CCN GAP TGQ CAP TCN GAQ TGG CAP TGQ

TTP AGP AGQ

40

Pro Gly Lys Lys Arg Cys Cys Pro Asp Thr Cys Gly Ile Lys Cys Leu

CCN GGN AAP AAP CGN TGQ TGQ CCN GAQ ACN TGQ GGN ATQ AAP TGQ CTN

AGP ATA TTP

15 50 60 i Asp Pro Vai Asp Thr Pro Asn Pro Thr' Arg Arg Lys Pro· Gly Lys Cys

GAQ CCN GTN GAQ ACN CCN AAQ CCN ACN CGN CGN AAP CCN GGN AAP TGQ

AGP AGP

70 80

Pro Vai Thr Tyr Gly Gin Cys Leu Met Leu Asn Pro Pro Asn Phe Cys

20 CCN GTN ACN TAQ GGN CAP TGQ CTN ATG CTN AAQ CCN CCN AAQ TTQ TGQ

·. . TTP TTP

‘•V 90 ;·*: Glu Met Asp Gly Gin Cys Lys Arg Asp Leu Lys Cys Cys Met Gly Met

GAP ATG GAQ GGN CAP TGQ AAP CGN GAQ CTN AAP TGQ TGQ ATG GGN ATG • AGP TTP

h:.· 25 100 : Cys Gly Lys Ser Cys Vai Ser Pro Vai Lys Ala ' ‘ ‘ TGQ GGN AAP TCN TGQ GTN TCN CCN GTN AAP GCN 3'

AGQ AGQ

? ·

Yllä esitetyssä sekvenssissä lyhenteet on tarkoi- 30 tettu merkitsemään alla ilmoitettuja nukleotidejä.

1 Nukleotidi Lyhenne

A,G,C,T N

A, G p

C,T Q

35 Valittaessa kodoneja käytettäväksi tämän keksinnön mukaisissa synteettisissä DNA-sekvensseissä mukaan luettuna välittömästi edellä esitetty, on edullista, että tietyn 22 aminohapon koodaamiseen käytetyt kodonit ovat kodoneja, jotka liittyvät voimakkaasti ilmentyviin proteiineihin, Esimerkkejä tällaisista edullisista kodoneista on esitetty osittain julkaisussa Grantham, R. et. ai., "Codon catalog 5 usage is a genome strategy modulated for gene expressivity", Nucleic -Acids Research 9 (1981) r. 43. Tämän keksinnön mukainen edullinen DNA-sekvenssi valittiin valitsemalla Escherichia colin sekvenssin kodonit minkä tahansa degeneroituneen sekvenssin tilalle.

10 Lisäksi on toivottavaa, että valitaan kodonit, jotka helpottavat synteettisen DNA-sekvenssin muuttamista siten, että saadaan muodostetuksi synteettisiä DNA-sek-venssejä, jotka pystyvät ohjaamaan nyt kyseessä olevien proteaasi-inhibiittorien analogien muodostumista. Erityi-15 sen edullista on valita nukleotidisekvenssit, jotka mikäli mahdollista, muodostavat restriktioendonukleaasikohtia synteettisen DNA-sekvenssin asemiin tai lähelle asemia, joihin toivotaan voitavan siirtää lisäkodoneja tai joissa kohdissa kodoni halutaan korvata siten, että saadaan ai-20 kaan analogeja. Tämän keksinnön mukaisen DNA-sekvenssin ! ! edullisessa sovellutusmuodossa restriktiokohdat on esitet- • t t * ty yllä esitetyn nukleotidisekvenssin alla.

* Menetelmät tässä esitettyjen synteettisten DNA- * · · ;· · sekvenssien aikaansaamiseksi kuuluvat yleensä alan ammat- 25 timiehen rutiinitehtäviin ja ohjeet niiden toteuttamiseksi * · käyvät ilmi tästä selityksestä. Esimerkki sopivista menetelmistä, joita voidaan käyttää tässä esitetyn synteetti-sen DNA-sekvenssin aikaansaamiseksi on esitetty julkaisus-··. sa Matteacci. M.D, ja Caruthers, M.H., J, Am. Chem, Soc., • > 30 103 (1981) s. 3185, ja Beaucage. S.L. ja Caruthers, ” M.H., Tetrahedron Lett., 22 (1981) s. 1859.

Eräässä tämän keksinnön vaihtoehtoisessa sovellu-tusmuodossa on ihmisen geenikir j astosta eristetty DNA-·. sekvenssi, joka koodaa tämän keksinnön mukaisesti saatavaa 35 edullista sekretorista leukosyyttiproteaasi-inhibiittoria (SLPI). Tämä sekvenssi, joka koodaa neljännestä kodonista i 108943 23 lähtien ja sisältää intronit, kuten tämän keksinnön tekijöiden tiedossa on tällä hetkellä, on seuraava:

EcoRl .20 .40 .60

! - GAATTCTGGTGGGGCCACACCCACTGGTGAAAGAATAAATAGTGAGGTTTGGATTGGCC

j ---------INTRON--------------------------------------------- 80 . 100 . 120

ATCAGAGTCACTCCTGCCTTCACCATGAAGTCCAGCGGCCTCTTCCCCTTCCTGGTGCTG

140 . 160 . 180

10 CTTGCCCTGGAACTCTGGCACTTGGGCTTGGAAGGCTCTGAAATGTAAGTTGGAGTCACT

. Pstl . 220 . 240

CTGTCTAATCTGGGCTGCAGGGTCAGAGGTGGGGTCTCCTTGTGGTGTGGGTGTGTCCCC

260 . 280 . 300

15 TTGTGTAGGCTGTGATCCCTCAGCTTAGTTTCGGGAGACCTCCCTGAGGGTGGAATACAT

Sacl 320 . 340 . 360

GTCTGGCTGAGCTCCAAGGTTTGTGTGACAGTTTGAGCTTGTGGAAATGCTTCCTCTATG

20 . 380 . 400 . 420

CAGCCATGCTGTCAGCCCAGGTCCCACTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCA

!· . 440 . 460 . 480

TACTCCGCCTTCTTCTTCACCTTGCTGCGACTCTCAAATCATTAGTTTCTGACTCTGCTT

! ’···* 25 . 500 . 520 . 540

CCGTTGTGTCTTTGCTTCTGCTATTTTGTCTCTGTGCTTCTCGCTTGGGATTTAGCTCTC

, : . 560 . 580 . 600

’’ AACTTCTCTCACACTGGTTCTATTTATCTTTGTTTACCTCTCTCCATCTCCATCACTCCC

30 . 620 . 640 . 660

AGCCTTCGTCTCTGCCTTTGTGTAGCCTTGTTTTGCTCTTGGGTGGAGGTCTTGACTAGA

680 . 700 . 720

: j AGCCTGCTGCCCTTTTCTTGGGTGTGAAACGTCCCCTGTCCATTTGTCTAATTTAATCAA

> 1 . 740 . 760 . 780

GCCCATCAATACACCTGGAGATCAGGCAGGCATGACCTTTGGGCTTTGTGGACAGCTACT

108943 24 . 800 . 820 . 840

GAGGTAAGGGTCTCTCCCCCTCAAAAGTGGTGCTTTGTTCAGGAGGCATGATGGGTCCTC

860 . 880 . 900

AGTACCCAGCCTCCTCCTACCTCTTGACTTTCTCTTCAAAAGCCTTCAAAGCTGGAGTCT 5 --------------END OF INTRON--------------- F K A G V

920 . 940 . 960

GTCCTCCTAAGAAATCTGCCCAGTGCCTTAGATACAAGAAACCTGAGTGCCAGAGTGACT CPPKKSAQCLRYKKPECQS D

980 . 1000 . BamHl

GGCAGTGTCCAGGGAAGAAGAGATGTTGTCCTGACACTTGTGGCATCAAATGCCTGGATC 10 WQCPGKKRCCPDTCGIKCLD

. 1040 . . 1060 . 1080 CTGTTGACACCCCAAACCCAAGTAAGCAGGTCGGGGAACTGGGTAGAGAGATAGCCTGGG P V D T P N P -----START INTRON---:------------------ ; . 1100 . 1120 StuI . 1140

15 GACACAGCATTAGAGGGACGGAACTGGGTGATGGGTCCTGCCAGGCCTCCTTGTCAATGC

1160 . PvuII . 1200

CGTAGTGAGTCACAGTGCCCTAAGAGAAGTAGCCAGCTGGTGAAGCAGCGGGCATTTAGA

1220 . 1240 . 1260

20 TAGCCAGGTAGTTGGAAGCCTCCCACCTAGTCAGCACTGGGCGGCTGGCACCTGCATAAT

\V . 1280 . 1300 . 1320

GGGGGGCCTGAAGTTCTAGGAGAGCCAGGTGCTATGTTTGGGGGCCGCCTTAGGGAGAAG

# · * • · • * . 1340 . 1360 . 1380

i ·* 25 GTGGTGGTGATAGAGGTGGGGAGGGGATGATCCCCCCTGCTGAAGCTGGACGAGGGGCTC

I M

: . 1400 . 1420 StuI . 1440 ACTCTAAAAAGTGGGGATGGGAGGGGTTGTATAAAGTACAAGGCCTCTGACCGGTAGCCT ---------------------------------------- END OF INTRON----- 30 . 1460 . 1480 . 1500

CACTCTCACCCAACCCAGCAAGGAGGAAGCCTGGGAAGTGCCGAGTGACTTATGGCCAAT

‘ . ------------------ R R K P G K C P V T Y G Q

1520 . 1540 . 1560

•. ‘ GTTTGATGCTTAACCCCCCCAATTTCTGTGAGATGGATGGCCAGTGCAAGCGTGACTTGA

CLMLNPPNFCEMDGQCKRDL

"·; 1 . 15 8 0 . 160 0 . 16 2 0

AGTGTTGCATGGGCATGTGTGGGAAATCCTGCGTTTCCCCTGTGAAAGGTAAGCAGGGGA KCCMGMCGKS CVS PVK —START INTRON

108943 25 . Sacl 1640 . 1660 . 1680

CGAGGGCACACTGAGCTCCCTCAGCCCTCTCAGCCTCAACCCTCTGGAGGCCCAGGCATA

1700 . 1720 . 1740

5 TGGGCAGGGGGACTCCTGAACCCTACTCCAAGCACAGCCTCTGTCTGACTCCCTTGTCCT

1760 . 1780 . 1800

T CAAGAGAACTGTTCTCCAGGTCTCAGGGCCAGGATTTCCATAGGAGTCGCCTGTGGCTT

1820 . 1840 . 1860

10 TGATTCT'ATTCTAGTGTCTCTGGGTGGGGGTCCTGGGCAAGTGTCTTTCTGAGTCTAGTT

1880 . 1900 . 1920

TCTTTATCGGTAAAATGTACATAATGAGATGAAAGTGCTCTGCAAAGACCTATGTGCACT

15 . 1940 . 1960 . 1980

AAGAATTATTATTCAGGTGTTTCCATCATGTTTTCTGAGGTGAAATCACAAAGGATCAGT

. 2000 . 2020 . 2040

GGAGTTTGAGGATTATCTAGTTCAATGCTTTGAGTTTAGAGTTTTACGTGAAAATGÄGAC

9n · 2060 . 2080 . 2100 zu TTGTCTCCTGACACTAAGTCTCTCTCAACTATAGCGCTATCTTGCTATTTTCTCTATCTC

• » » » • t · . 2120 . 2140 . 2160

W AGAAGGATCCTTGGGCAGGAGGAAGGATGTGGATATATGATTTGGCTGGTTTCTATGCTG

I I « < " ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ —» —» ^ ^ ^ ^ M —· _ _ ^ ™ ^ ^ v ^ M -m ^ ^ _ __ _ __ ^ _ I * i*V 25 . 2130 . 2200 . 2220

AAGCTCTGATCTGATTTTCTCTCACAGCTTGATTCCTGCCATATCGGAGGAGGCTCTGGA

-PROBABLE------------------ STOP

:Y; END OF INTRON

2240 . 2260

I GCCTGCTCTGTGTGGTCCAGGTCCTTTCCACCCTGAGCTTGGCTCCACCACTGGT

• · » 30 *’ Tässä sekvenssissä aminohappotähteille käytetyt . ·· lyhenteet ovat yksikirjaimisia lyhenteitä, joita käytetään yleisesti ja jotka on esitetty esimerkiksi julkaisussa Lehninger, A.L., Biochemistry, 2. painos, Worth Publis-35 hers, Inc., New York, 1976, s. 72.

Käyttäen tätä sekvenssiä ja tässä esitettyjä tietoja aminohappojärjestyksestä voidaan laatia synteettinen 108943 26 DNA-sekvenssi, joka liitettynä yllä mainittuun genomisek-venssiin johtaa geeniin, joka koodaa koko proteaasi-inhibiittorin. Vaihtoehtoisesti voidaan edellä esitettyä DNA-sekvenssiä käyttäen laatia koettimia ja niiden avulla 5 etsiä ihmisen geenikirjastosta DNA-jakso, jossa on ensimmäisten kolmen aminohapon kodonit.

Lisäksi tällaisia koettimia voidaan käyttää tunnistettaessa ihmisen genomijakso, joka sisältää sopivan leader-sekvenssin. Oletetaan, että tätä leader-sekvenssiä 10 tai mitä tahansa muuta sopivaa leader-sekvenssiä voitaisiin käyttää yhdessä tämän genomi-DNA-jakson kanssa nisäkkäiden ilmentymissysteemissä.

Tämän keksinnön eräässä toisessa vaihtoehtoisessa sovellutusmuodossa parotidikirjastosta on eristetty CDNA-15 klooni, joka koodaa DNA-sekvenssiä, joka pystyy ohjaamaan keksinnön mukaisen edullisen sekretorisen leukosyyttipro-teaasi-inhibiittorin solunsisäistä tuotantoa. Tämä klooni on talletettu 3. joulukuuta 1985 talletuslaitokseen American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, talle-20 tusnumerolla ATCC 40207.

, , On esitetty yhdistelmä-DNA-menetelmä proteaasi- inhibiittorin tuottamiseksi, joka inhibiittori koostuu yk- i 1 · sittäisestä polypeptidiketjusta, jossa on ainakin yksi ak- 1 '* tiivinen kohta, jolla on seriiniproteaasi-inhibiittori-

li I

• ’,· 25 aktiivisuus. Keksinnön eräässä sovellutusmuodossa aktii- ! | ! vinen kohta toimii tavalla, joka on biologisesti ekviva- lenttinen ihmisen parotidieritteistä eristetyn luonnon * t leukosyytti-elastaasi-inhibiittorin toimintatavalle.

; Luonnossa esiintyvää tai synteettistä DNA-sek- 30 venssiä voidaan käyttää proteaasi-inhibiittorien tuotannon ohjaamiseen. Tämä menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: ; (a) valmistetaan DNA-sekvenssi, joka pystyy ohjaa maan isäntämikro-organismin tuottamaan proteiinia, jolla on seriiniproteaasi-inhibiittoriaktiivisuus; 35 b) kloonataan DNA-sekvenssi vektoriin, joka on siirrettävissä isäntämikro-organismiin ja pystyy replikoi- 108943 27 tumaan siinä, tällaisen vektorin sisältäessä DNA-sek-venssin toimintaelementtejä; (c) siirretään synteettisen DNA-sekvenssin ja toimintaelementte j ä sisältävä vektori isäntämikro-organis- 5 miin, joka pystyy ilmentämään proteaasi-inhibiittorin; (d) viljellään mikro-organismia olosuhteissa, jotka ovat sopivat vektorin monistumiselle ja inhibiittorin ilmestymiselle; (e) kerätään inhibiittori talteen; ja 10 (f) annetaan inhibiittorin omaksua aktiivinen tertiaarinen rakenne, jolloin sillä on seriiniproteaasi-inhibiittoriaktiivisuus.

Synteettisiä DNA-sekvenssejä, jotka on suunniteltu käytettäviksi tässä menetelmässä, on käsitelty yksityis-15 kohtaisesti edellä. Vaihtoehtoisessa sovellutusmuodossa on edelleen suunniteltu, että myös luonnon DNA-sekvenssejä voidaan käyttää tässä menetelmässä. Näihin sekvensseihin kuuluu CDNA- tai genomisia DNA-segmenttejä. Tämän sovellu-tusmuodon edullisessa toteutuksessa ehdotetaan luonnon 20 DNA-sekvenssi saatavaksi menetelmällä, joka käsittää seu-raavat vaiheet: • · '•V (a) valmistetaan ihmisen cDNA-kir j asto soluista, • · ·.·.· edullisesti parotidisoluista, jotka pystyvät tuottamaan seriiniproteaasi-inhibiittoria; 25 (b) testataan ihmisen DNA-kirjastoa ainakin yhdel- ; lä koettimella, joka pystyy sitoutumaan proteaasi-inhi- • t · /,*. biittorigeeniin tai sen proteiinituotteeseen; • · (c) identifioidaan ainakin yksi klooni, joka si- . . sältää inhibiittoria koodaavan geenin sen perusteella, et- · · 30 tä klooni pystyy sitomaan ainakin yhden geenille tai sen ·;·* proteiinituotteelle spesifisen koettimen; • · : (d) eristetään inhibiittoria koodaava geeni vali- tusta kloonista tai valituista klooneista; • » » . (e) liitetään geeni tai sopivia fragmentteja siitä 35 toimintaelementteihin, jotka ovat tarpeen geenin säilyttä-’···* miseksi ja ilmentymiseksi isäntämikro-organismissa.

108943 28

Edellä mainitussa menetelmässä käyttökelpoiset luonnon DNA-sekvenssit voidaan identifioida ja eristää myös menetelmällä, joka käsittää seuraavat vaiheet: (a) valmistetaan ihmisen genominen DNA-kirjasto, 5 joka edullisesti on kasvatettu recArecBC-E. coli -isännässä; (b) testataan ihmisen genomista DNA-kirjastoa ainakin yhdellä koettimella, joka pystyy sitoutumaan serii-niproteiini-inhibiittorigeeniin tai sen proteiinituottee- 10 seen; (c) identifioidaan ainakin yksi klooni, joka sisältää inhibiittoria koodaavan geenin, sillä perusteella, että klooni pystyy sitomaan ainakin yhden geenille tai sen proteiinituotteelle spesifisen koettimen; 15 (d) eristetään inhibiittoria koodaava geeni iden tifioidusta kloonista tai identifioiduista klooneista; ja (e) liitetään geeni tai sopivia fragmentteja siitä toimintaelementteihin, jotka ovat tarpeen geenin säilymiseksi isäntämikro-organismissa ja ilmentymiseksi siinä.

20 Eristettäessä luonnon DNA-sekvenssi, joka sopii käytettäväksi yllä kuvatussa menetelmässä, on edullista identifioida kaksi restriktiokohtaa, jotka sijaitsevat so-·.·.* pivan geenin tai sen fragmenttien pääteosien välisellä l" alueella ja lähinnä niitä. DNA-segmentti, joka sisältää 25 sopivan geenin, poistetaan sitten muusta genomisesta mate- • · : riaalista käyttäen sopivia restriktioendonukleaaseja.

.V. DNA-sekvenssin irrottamisen jälkeen sen 31- ja 51- • · päät rakennetaan uudelleen niin, että saadaan sopivat DNA-. . sekvenssit, jotka pystyvät koodaamaan seriini-inhibiit- 30 toriproteiinin N- ja C-pääteryhmät ja liittämään DNA-sek-·;·’ venssin sen toimintaelementteihin.

: Vektoreihin, jotka on suunniteltu käytettäväksi tässä keksinnössä, kuuluvat kaikki vektorit, joihin edellä .käsitelty DNA-sekvenssi voidaan viedä yhdessä edullisten 35 tai tarvittavien toimintaelementtien kanssa, ja joka vek- > » *···’ tori voidaan sen jälkeen siirtää isäntämikro-organismiin ja monistaa tällaisessa mikro-organismissa. Edullisia ovat i 108943 29 sellaiset vektorit, joiden restriktiokohdat ovat hyvin dokumentoitu ja jotka sisältävät toimintaelementit, jotka ovat edullisia tai tarpeen DNA-sekvenssin kopioimiseksi.

Tässä käsiteltyihin "toimintaelementteihin" kuuluu 5 ainakin yksi promoottori, ainakin yksi operaattori, ainakin yksi leader-sekvenssi, ainakin yksi Shine-Dalgarno-sekvenssi, ainakin yksi lopetuskodoni, ja mikä tahansa muu DNA-sekvenssi, joka on tarpeen vektori-DNA:n sopivalle ko-pioitumiselle ja sitä seuraavalle luennalle. Erityisesti 10 on suunniteltu, että tällaiset vektorit sisältävät ainakin yhden replikaatiolähtökohdan, jonka isäntämikro-organismi | tunnistaa yhdessä ainakin yhden valinnaisen markkerin ja ' ainakin yhden sellaisen promoottorisekvenssin kanssa, joka pystyy aloittamaan synteettisen DNA-sekvenssin kopioinnin.

15 Lisäksi eräässä sovellutusmuodossa on edullista, että vektori sisältää tiettyjä DNA-sekvenssejä, jotka pystyvät toimimaan säätelijöinä ja toisia DNA-sekvenssejä, jotka pystyvät koodaamaan säätelyproteiinia. Eräässä sovellutus-muodossa nämä säätelijät toimivat siten, että ne estävät 20 synteettisen DNA-sekvenssin ilmentymisen tietyissä ympä-j t # ristöolosuhteissa, ja toisissa ympäristöolosuhteissa sal- | '**,· livat kopioinnin ja sitä seuraavan, synteettisen DNA- | ·.*.* sekvenssin koodaaman proteiinin ilmentämisen. Erityisesti on edullista, että vektoriin liitetään sellaisia sääte-: · : 25 lysegmenttejä, että synteettisen DNA:n ilmentyminen ei ta- : pahdu esimerkiksi isopropyylitio-p-d-galaktosidin puut- tuessa. Tässä tapauksessa synteettistä DNA:ta sisältävä transformoitu mikro-organismi voidaan kasvattaa tiettyyn ,·, ; tiheyteen ennen proteaasi-inhibiittorin ilmentämisen • · · !..* 30 aloittamista. Tässä sovellutusmuodossa halutun proteaasi- ” inhibiittorin ilmentäminen aloitetaan lisäämällä mikrobin :(·.· elinympäristöön ainetta, joka pystyy aikaansaamaan DNA- : sekvenssin ilmentymisen sen jälkeen, kun haluttu tiheys on • t · . saavutettu.

35 Lisäksi on edullista, että sopiva sekretorinen ···’ leader-sekvenssi on läsnä joko vektorissa tai synteettisen DNA-sekvenssin 5'-päässä. Leader-sekvenssi on asemassa, 108943 30 joka sallii leader-sekvenssin olla välittömästi proteaasi-inhibiittorin ilmentämistä ohjaamaan pystyvän nukleoti-disekvenssin aloituskohdan vieressä, niin ettei niiden välissä ole mitään luennan lopetussignaaleja. Leader-sek-5 venssin läsnäolo on toivottavaa osaksi yhdestä tai useammasta seuraavasta syystä: 1) leader-sekvenssin läsnäolo voi helpottaa prosessia, jossa isäntä muuttaa alkutuotteen kypsäksi yhdistelmäproteaasi-inhibiittoriksi; 2) leader- sekvenssin läsnäolo voi helpottaa yhdistelmäproteaasi-10 inhibiittorin puhdistamista ohjaamalla proteaasi-inhibiit-torin ulos solun sytoplasmasta; 3) leader-sekvenssin läsnäolo voi vaikuttaa yhdistelmäproteaasi-inhibiittorin kykyyn taipua aktiiviseksi rakenteekseen ohjaamalla proteaa-si-inhibiittorin ulos solun sytoplasmasta.

15 Erityisesti leader-sekvenssi voi ohjata aluksi muodostuneen luentatuotteen lohkeamista leader-peptidaasin vaikutuksesta, niin että leader-sekvenssi poistuu ja jäljelle jää polypeptidi, jossa on edullinen aminohappojärjestys ja potentiaalinen seriiniproteaasia inhiboiva ak-20 tiivisuus. Joissakin isäntämikro-organismilajeissa sopivan leader-sekvenssin läsnäolo mahdollistaa lopullisen prote- * 1 iinin siirtymisen periplasmiseen tilaan kuten esimerkiksi ;,V E. colin ollessa kyseessä. Tietyillä hiivoilla ja Bacilli- ja Pseudomonas-kannoilla sopiva leader-sekvenssi mahdol-25 listaa proteiinin siirtymisen solumembraanin läpi solun ; J. ulkopuoliseen tilaan. Tässä tapauksessa proteiini voidaan puhdistaa solun ulkopuolisesta proteiinista.

Kolmanneksi joidenkin tämän keksinnön mukaisesti . . valmistettujen proteaasi-inhibiittorien ollessa kyseessä * · · te1 30 leader-sekvenssin läsnäolo voi olla tarpeen lopullisen * » ···’ proteiinin sijoittamiseksi elinympäristöön, jossa se voi taipua niin, että se omaksuu aktiivisen rakenteensa, jolla rakenteella on sopiva elastaasi-inhibiittoriaktiivisuus.

, Muut toimintaelementit sisältävät, kuitenkaan ra- 35 joittumatta näihin, ribosomin sitomiskohtia ja muita DNA-sekvenssejä, jotka ovat tarpeen vieraiden proteiinien ilmentämiselle mikrobisesti. Tämän keksinnön edullisessa so- 108943 31 vellutusmuodossa sekvenssiä GAGGCGCAAAAA(ATG) käytettäisiin ribosomin sitomiskohtana. Tässä käsitellyt toiminta-elementit ovat alan keskitason ammattimiesten valittavissa tavanomaiseen tapaan aikaisemman kirjallisuuden ja tässä 5 selityksessä esitettyjen tietojen perusteella. Yleisiä esimerkkejä näistä toimintaelementeistä on esitetty julkaisussa Lewin, B., Genes, Wiley & Sons, New York, 1983.

Tässä tarkoitetut vektorit voidaan konstruoida osittain plasmidien pBR322 ja/tai PIQ osista.

10 Tämän keksinnön eräässä edullisessa sovellutusmuo- dossa lisä-DNA-sekvenssi sijaitsee välittömästi ennen synteettistä DNA-sekvenssiä, joka koodaa proteaasi-inhibiit-toria. Lisä-DNA-sekvenssi pystyy toimimaan translaatiokyt-kijänä, se on DNA-sekvenssi, joka koodaa RNA:ta, joka toi-15 mii siten, että se ohjaa ribosomit paikkaan, joka on välittömästi siihen liittyvän proteaasi-inhibiittori-RNA:n ribosomin sitomiskohdan vieressä. Tämän keksinnön eräässä sovellutusmuodossa translaatiokytkijä voidaan muodostaa käyttäen DNA-sekvenssiä TAACGAGGCGCAAAAAATGAAAAAGACAGC-20 TATCGCGATCGGAGTGTAAGAAATG ja translaatiokytkijöihin liit- \ tyviä menetelmiä, jotka ovat nykyään alan keskitason am-

mattimiesten tuntemia. Toisessa, edullisessa translaa-V.: tiokytkij ässä on DNA-sekvenssi TAACGAGGCGCTGGACAGTATC

h*: GCGATCAAGGAGAAATAAATG.

25 Yllä kuvatun vektorin kaikkien tarpeellisten ja haluttujen komponenttien synteesin ja eristämisen jälkeen V. vektori kootaan menetelmillä, jotka ovat alan keskitason ammattimiesten yleisesti tuntemia. Tällaisten vektorien , . kokoamisen uskotaan kuuluvan tehtäviin ja töihin, joita • i ; 1 30 alan ammattimiehet normaalisti suorittavat, ja siten se on ···’ mahdollista suorittaa ilman kohtuutonta kokeellista tutki- musta. Samankaltaisia DNA-sekvenssejä on esimerkiksi liga- I > toitu sopiviin kloonausvektoreihin, kuten on esitetty julkaisussa Schoner et ai., Proceedings of the National Aca-·’ · 35 demy of Sciences U.S.A., 81 (1984) s. 5403 - 5407.

Konstruoitaessa tämän keksinnön mukainen kloonaus-vektori olisi edelleen huomattava, että monia synteettisen 108943 32 DNA-sekvenssin kopioita ja siihen liittyviä toimintaele-menttejä voidaan viedä kuhunkin vektoriin. Tällaisessa so-vellutusmuodossa isäntäorganismi tuottaisi haluttua prote-aasi-inhibiittoria suurempina määrinä vektoria kohti.

5 DNA-sekvenssin kerrannaiskopioiden lukumäärää, joka voidaan viedä vektoriin, rajoittaa vain se, onko muodostuvan vektorin koon vuoksi mahdollista siirtää se sopivaan isän-tämikro-organismiin ja monistaa ja kopioida se tässä.

Lisäksi on edullista, että vektori sisältää todet-10 tavissa olevan markkerin, kuten lääkeainetta kestävän markkerin tai muun markkerin, joka aiheuttaa todettavissa olevan piirteen ilmenemisen isäntämikro-organismissa. Tämän keksinnön erityisen edullisessa sovellutusmuodossa kloonausvektoriin sisällytetään edullisesti tetrasykliini-15 resistenssiä aiheuttava geeni.

Tällainen lääkeresistenssiä aiheuttava tai muuten todettavissa oleva markkeri on osaksi tarkoitettu helpottamaan transformaattien valintaa. Lisäksi sellaisen todettavissa olevan markkerin läsnäolo kloonausvektorissa 20 voi olla hyödyllinen epäpuhtautena viljelmään pyrkivien mikro-organismien monistumisen estämiseksi viljelyväliai-·.·.· neessa. Tässä sovellutusmuodossa transformoitujen isäntä- mikro-organismien puhdasviljelmä saataisiin viljelemällä :·*: mikro-organismia olosuhteissa, jotka edellyttävät muodos- 25 tettua fenotyyppiä mikro-organismin pysymiseksi hengissä.

. Näin saatu vektori siirretään sitten sopivaan ·,·. isäntämikro-organismiin. Uskotaan, että voidaan valita mikä tahansa mikro-organismi, jolla on kyky ottaa vastaan , , eksogeenista DNA:ta ja ilmentää kyseiset geenit ja niihin • » "· *· 30 liittyvät toimintaelementit. On edullista, että isäntä- ··’ mikro-organismi on valinnaisesti anaerobinen tai aerobi- nen. Erityisiä isäntiä, joita voidaan edullisesti käyttää tässä menetelmässä, ovat mm. hiivat ja bakteerit. Yksittäisiä käyttökelpoisia hiivoja ovat mm. suvun Saccharomy-: 35 ces hiivat ja varsinkin Saccharomyces cerevisiae. Yksit- täisiä käyttökelpoisia bakteereja ovat mm. sukujen Bacil- 1 08943 33 lus, Escherichia ja Pseudomonas lajit, erityisesti Bacillus subtilis ja Escherichia coli.

Kun isäntäorganismi on valittu, vektori siirretään isäntäorganismiin käyttäen menetelmiä, jotka ovat 5 alan ammattimiesten yleisesti tuntemia. Esimerkkejä tällaisista menetelmistä on julkaisussa Davis et ai., Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Press, New York, 1980. Eräässä sovellutusmuodossa on edullista, että transformointi suoritetaan alhaisissa lämpötiloissa, kos-10 ka lämpötilasäätely katsotaan keinoksi säädellä geenin ilmentymistä käyttämällä toimintaelementtejä, kuten edellä on esitetty. Toisessa sovellutusmuodossa, mikäli vektoriin on viety osmolaari-säätelijöitä, on tarpeen säätää suolapitoisuuksia transformaation aikana synteettisten 15 geenien sopivan valvonnan varmistamiseksi.

Mikäli on suunniteltu, että yhdistelmäseriinipro-teaasi-inhibiittorit ilmennetään lopuksi hiivassa, on edullista, että kloonausvektori siirretään ensin Escherichia coliin, jossa vektorin annetaan monistua ja josta 20 vektori otettaisiin talteen ja puhdistettaisiin lisääntymisen jälkeen. Vektori siirrettäisiin sitten hiivaan se- • · •.V riiniproteaasi-inhibiittorin lopullista ilmentämistä var- t · : : : ten.

;··· Isäntämikro-organismia viljellään olosuhteissa, : V. 25 jotka ovat sopivat seriiniproteaasi-inhibiittorin ilmen- > * , tämiselle. Nämä olosuhteet ovat yleensä isäntämikro-orga- • » nismille spesifiset ja ne ovat alan ammattimiehen helpos- • · ti määritettävissä tällaisten organismien kasvuolosuhteita koskevan kirjallisuuden valossa, esimerkiksi jul- • · * “· 30 kaisun Begey's Manual of Determinative Bacteriology, 8, » · · ...· painos, Williams & Wilkins Company, Baltimore, Maryland, ;\j perusteella.

• · ,*··. Mitkä tahansa olosuhteet, jotka ovat tarpeen i ·

I I I

• DNA-sekvenssin ilmentymisen säätelemiseksi vektoriin vie- I * · h'. · 35 tyjen tai siinä olevien toimintaelementtien mukaisesti, i » » g..· ovat tehokkaat transformaatio- ja vil jelyvaiheissa.

Eräässä sovellutusmuodossa solut kasvatetaan suureen ti- 108943 34 heyteen saakka sopivasti säätelevissä olosuhteissa, jotka estävät DNA-sekvenssin ilmentymisen. Kun solujen optimi-tiheys on saavutettu, elinympäristön olosuhteita muutetaan, niin että ne tulevat sopiviksi synteettisen DNA-5 sekvenssin ilmentymiselle. Siten on suunniteltu, että proteaasi-inhibiittorin tuotanto tapahtuu ajanjaksona, joka seuraa isäntäsolujen kasvatusta lähes optimitihey-teen saakka, ja että muodostunut proteaasi-inhibiittori kerätään talteen jonkin ajan kuluttua siitä, kun sen il-10 mentämiselle tarpeelliset säätelevät olosuhteet aikaansaatiin .

! Tämän keksinnön eräässä edullisessa sovellutusmuo- i ! dossa yhdistelmäproteaasi-inhibiittori puhdistetaan tal teenoton jälkeen ja ennen sen muuttumista aktiiviseksi 15 muodoksi. Tämä sovellutusmuoto on edullinen, sillä tämän keksinnön tekijät uskovat, että uudelleen taipuneen proteiinin suuren saannon saaminen helpottuu, jos proteiini puhdistetaan ensin. Eräässä edullisessa vaihtoehtoisessa sovellutusmuodossa proteaasi-inhibiittorin voidaan kui-20 tenkin antaa taipua uudelleen, niin että se saa aktiivisen rakenteensa ennen puhdistamista. Vielä eräässä vaih- » · . toehtoisessa edullisessa sovellutusmuodossa proteaasi- :Y: inhibiittori on uudelleen taipuneessa aktiivisessa tilas- » · ;·· sa silloin, kun se otetaan talteen kasvualustalta.

V. 25 Tietyissä olosuhteissa proteaasi-inhibiittori .* » omaksuu varsinaisen aktiivisen rakenteensa sinä aikana, I kun se ilmennetään isäntämikro-organismissa ja kulkeutuu ’ ' solunseinämän tai membraanin läpi tai periplasmiseen ti laan. Tämä tapahtuu yleensä, jos sopivaa leader-sekvens-30 siä koodaava DNA on liitetty yhdistelmäproteiinia koodaa- '...· vaan DNArhan. Jos proteaasi-inhibiittori ei omaksu varsi- ,·. : naista aktiivista rakennettaan, kaikki muodostuneet di- * * ,··, sulfidisidokset ja/tai kaikki esiintyvät ei-kovalenttiset sidosvoimat hajotetaan ensin denaturoimalla pelkistämäl-: 35 lä, esimerkiksi guanidiniumkloridilla ja merkaptoetano- lilla, ennen kuin proteaasi-inhibiittorin annetaan omaksua aktiivinen rakenteensa sen jälkeen, kun se on laimen- 108943 35 nettu ja kaikki nämä pelkistimet on hapetettu kontrolloiduissa olosuhteissa.

On ymmärrettävä, että tämän keksinnön yhteydessä esitettyjen seikkojen soveltaminen tiettyyn ongelmaan tai 5 ympäristöön kuuluu alan ammattimiehen ammatilliseen taitamiseen tässä esitettyjen tietojen valossa. Esimerkkejä tämän keksinnön mukaisista tuotteista ja havainnollistavia menetelmiä niiden eristämiseksi ja tuottamiseksi on esitetty seuraavassa esimerkissä.

10 Esimerkki 1 Käyttäen perusteina yllä kuvattua aminohapposekvenssiä, kodonin käyttöä Escherichia colin vahvasti ilmentyvissä geeneissä ja sitä, että restriktioendonukleaasin katkaisukohdat ovat sopivat, ehdotettiin käytettäväksi 15 seuraavaa DNA-sekvenssiä:

Hindlll

5 ' AGC GGT AAA AGC TTC AAA GCT GGC GTA TGC CCG CCG

AI ui _ FnuDII RsaI HDall

AAA AAA TCC GCG CAG TGT CT G CGG TAC AAA AAA CCG

20 HhaI

Xmal

,Y: GAA TGC CAG TCC GAC TGG CAG TGC CCG GGT AAA AAA

! _Hpall

Neil • : Neil

*. CGT TGT TGC CCG GAC ACC TGC GGC ATC AAA TGC CT G

.·,· Hpall Fnu4HI BstNI

i ·

•h* BamHI

GAT CCG GTT GAT ACC CCG AAC CCG ACT CGT CGA AAA

, . Hpall TagI

30 ,···. NcH Hpall Ball

··* CCG GGT AAA TGC CCG GTA ACC TAT GGC CAG TGT CTG

Hpall Neil Haelll » f · • »

ATG CTG AAC CCG CCG AAC TTC TGC GAA AT G GAC GGC

’K' Haelll *’·/ 35 Bq lii

CAG TGT AAA CGA GAT CTG AAA TGC TGT ATG GGT ATG

Mbol

Fnu4HI Neil TGC GGC AAA TCT TGT GTT TCC CCG GTA AAA GCA TAA 3 ’

Hpall 108943 36

Jotta voitiin säätää proteiinin ilmentäminen muotoon, joka sopii kuljetettavaksi E. colin periplasmiseen tilaan, valittiin käytettäviksi seuraavat säätelytekijät: tac-promoottori vahvan kopioitumisen aloittamiseksi; lac-5 operaattori kopioinnin säätelemiseksi; lac-repressori (lac lq) koodattavaksi plasmidin toiseen kohtaan; OmpA Shine-Dalgarno-sekvenssi vahvan luennan aloittamiseksi; OmpA-leader tuotteen kuljettamiseksi periplasmiseen tilaan; Ala-Ser-liittymän Ala näiden toimintaelementtien koodaaman 10 proteiinisekvenssin ja yllä kuvattujen rakenteellisten geenien koodaaman proteiinisekvenssin väliin aluksi saadun tuotteen lohkaisemisen määräämiseksi, niin että saadaan kypsä leukosyyttielastaasi-inhibiittori. Kaikki nämä tekijät sisällytetään seuraavaan DNA-sekvenssiin: 15 CTGCA GCTGT TGACA ATTAA TCATC GGCTC GTCTC GTATA ATGTG ATAAC GAGGCgcaaa aaATG AAAAA GACAG ctatc gcgat cgcag tggca CTGGC TGGTT TCGCT ACCGT AGCGC AGGCC.

Jotta pystytään säätelemään proteiinin ilmentäminen 20 sellaisessa muodossa, että proteiini jää E. colin sytoplasmaan, valitaan käytettäviksi seuraavat toimintaelemen-tit: tac-promoottori, lac-operaattori ja lac-repressori * i (lac lq) , Shine-Dalgarno-sekvenssien yhdistelmä ja vahvan it<: luennan aloittamiseksi translaatiokytki j änä käytettävä I 25 PmpA-leader-peptidin fragmentti. Translaatiokytkijäsek- j ; venssi sisältää DNA:n, joka koodaa OmpA-geenin luennan * * '** aloitusaluetta, OmpA-leader-peptidin ensimmäiset kahdeksan i * aminohappoa, yllä kuvatun Shine-Dalgarno-sekvenssiyhdis-telmän ja luennan lopetussignaalin. Translaatiokytkijäse-30 kvenssi on liitettävä seriihiproteaasi-inhibiittorigeenin | *"’; promoottorin ja luennan aloituskohdan väliin niin, että se > . on päällekkäin viime mainitun kanssa. Kaikki nämä tekijät ! sisällytetään seuraavaan DNA-sekvenssiin: i « · [ « i ·

I ; f\ 35 CTGCA GCTGT TGACA ATTAA TCATC -GGCTC GTCTC GTATA ATGTG ATAAC GAGGC

! GCAAA AAATG AAAAA GACAG CTATC GCGAT CGGAG TGTAA GAAAT G.

i 1 1 ! . , , * ! 1 08943 37 A. Geenin fragmenttien muodostaminen Yllä mainittujen sekvenssien muodostamiseksi syntetisoidaan seuraavat deoksiribonukleotidit käyttäen ABI 5 DNA-syntetisaattoria (Foster City, Kalifornia). Tuotteet puhdistetaan elektroforeesilla polyakryyliamidigeelillä kuten ABI -laitteen käsikirjassa on kuvattu. Ne 5' fosfo-ryloidaan käyttäen T4-polynukleotidikinaasia ja ATP:tä va- kiomenetelmillä.

-10 Nukleotidi Ab6 on: GAGCC GATGA TTAAT TGTCA ACAGC TGCA.

Nukleotidi Ab 7 on: TCCGC TCACA ATTCC ACACA TTATA C.

Nukleotidi Ab8 on: 15 CCTCG TTATG TGTGA AATTG TTA.

Nukleotidi Ab9 on: AGCTT TTACC GCTCA TTTCT TACAC TCCGA TCGCG ATAGC TGTCT TTTTC ATTTT TTGCG.

Seuraavia oligonukleotidisekvenssejä käytetään ·,·,·* 20 käytetään fragmentin B muodostamiseen:

Oligonukleotidi B1 on: :··· AGCTT CAAAG CTGGC GTATG CCCGC CGAAA AAATC CGCG.

Oligonukleotidi B2 on: • , . .·. CAGTG TCTGC GGTAC AAAAA ACCGG AATGC CAG.

25 Oligonukleotidi B3 on: ' · * TCCGA CTGGC AGTGC CCGGG TAAAA AACGT TGTTG C.

, , Oligonukleotidi B4 on: y CCGGA CACCT GCGGC ATCAA ATGCC TG.

·*’ Oligonukleotidi B5 on:

30 GATCC AGGCA TTTGA TGCCG CAGGT GTCCG GGCAA CAACG TTTTT

•‘h TACCC GGGCA.

( Oligonukleotidi 36 on: •y ; CTGCC AGTCG GACTG GCATT CCGGT.TTTTT GTACC G.

h.,* Oligonukleotidi B7 on: 35 CAGAC ACTGC GCGGA TTTTT TCGGC GGGCA TACGC CAGCT TTGA.

Seuraavia oligonukleotidisekvenssejä käytetään fragmentin C muodostamiseen: 1 08943 38 01igonukleotidi Cl on: GATCC GGTTG ATACC CCGAA CCCG.

01igonukleotidi C2 on: ACTCG TCGAA AA.

5 01igonukleotidi C3 on: CCGGG TAAAT GCCCG GTAAC CTATG GC.

01igonukleotidi C4 on: CAGTG TCTGA TGCTG AACCC GCCGA AC.

01igonuk1eotidi C5 on: 1Q TTCTG CGAAA TGGAC GGCCA GTGTA AACGA GAT.

Oligonuklsotidi C6 on: CTAGA TCTCG TTTAC ACTGG CCGTC CATTT CGCAG AAGTT.

01igonukleotidi C7 on: CGGCG GGTTC AGCAT CAGAC ACTGG CCATA GGTTA CCGGG CA.

15 Oligonukleotidi C3 on: TTTAC CCGGT TTTCG ACGAG TCGGG TT.

Oligonukleotidi C9 on: CGGGG TATCA ACCG.

Seuraavaa oligonukleotidisekvenssien ryhmää käyte- .V: 20 tään fragmentin D muodostamiseen: ! :Y: Oligonukleotidi Dl on: • · GATCT GAAAT GCTGT ATGGG TATGT GCGGC.

Oligonukleotidi D2 on: ’ ,·. AAATC TTGTG TTT CC CCGGT AAAAG CATAA G.

’*.* 25 Oligonukleotidi D3 on: TCGAC TTATG CTTTT ACCGG GGAAA CACAA G AT TT GCCGC A. Oligonukleotidi D4 on: h'·: CAT AC CCATA CAGCA TTTCA.

.·. : 30 Seuraavat oligonukleotidiryhmät sekoitetaan ja ,···’ niille suoritetaan anneal-käsittely vakio-olosuhteissa ja ligaatio toisiinsa ja kloonaus- ja jaksotusvektoreiden M13 ;.· : mpl8 ja 19 kanssa ja katkotaan sopivilla restriktioendo- :,,,· nukleaaseilla käyttäen T4 DNA-ligaasia vakio-olosuhteissa.

35 Tuotteilla transformoidaan E. coli JM105, ja kiinnostuksen kohteena olevaa DNA:ta sisältävät kloonit valitaan IPTG-Xgal -levyillä olevista valkeista plakeista ja seulotaan 108943 39 edelleen hybridisaatiolla 32P-leimattujen oligonukleotidi-en kanssa, jotka valitaan anneal-vaiheessa käytetystä ryhmästä. Insertin rakenne varmistetaan kloonatun DNA:*1 dide-oksisekventoinnilla käyttäen universaalialuketta.

5 Ryhmä Aa sisältää oligonukleotidit Aal - AalO, jotka ligatoidaan M13 mpl8:aan ja 19:ään, jotka on katkaistu Pstlrllä ja HindIII:lla. Ryhmä Ab sisältää oligonukleotidit Abi - Ab9, jotka ligatoidaan M13 mp 18:aan ja 19:ään, jotka on katkaistu Pstlrllä ja Hindlllrlla. Ryhmä 10 B, joka sisältää oligonukleotidit B1 - B7, ligatoidaan M13 mpl8:aan ja 19:ään, jotka on katkaistu Hindllrlla ja Bam-Hlrllä. Ryhmä C, joka sisältää oligonukleotidit Cl - C9, ligatoidaan M13 mpl8:aan ja 19:ään, jotka on katkaistu BamHIrllä ja Xbalrllä. Ryhmä D, joka sisältää oligonukleo-15 tidit Dl - D4, ligatoidaan M13 mpl8:aan ja 19:ään, jotka on katkaistu BamHIrllä ja Sallrllä.

M13:n replikoituvan muodon DNA otetaan talteen va-kiomenetelmin kloonista, jossa on haluttu DNA-insertti. Ryhmää Aa vastaava DNA-insertti irrotetaan M13rn DNArsta 20 katkaisemalla DNA sopivilla restriktioendonukleaaseilla ja puhdistetaan elektroforeesilla polyakryyliamidigeelillä, Sen rakenne onr

AATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGCTG

GCTCGAGCCATGGGCCCCTAGGAGATCTCAGCTGGACGTCGAC

*··* OE

TTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCG

‘ ‘ ’ AACTGTTAATTAGTAGCCGAGCATATTACACACCTTAACACTCGC

. . GATAACAATTTCACACATAACGAGGCGCAAAAA

CTATTGTTAAAGTGTGTATTGCTCCGCGTTTTT

• i i

·*·: ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATCGCAGTGGCACTGGCT

,·) ; 30 TACTTTTTCTGTCGATAGCGCTAGCGTCACCGTGACCGA

t ·

GGTTTCGCTACCGTAGCGCAGGCCAGC

·;·’ C C AAAGC GAT GGC ATC GC GT CC GGTC G

··: : GGTAAA

CCATTTTCGA

» · ♦ 35

Ryhmää Ab vastaava DNA-insertti irrotetaan katkaisemalla DNA restriktioendonukleaaseilla EcoRI ja Hindlll 108943 40 ja puhdistetaan elektroforeesilla polyakryyliamidigeelil-lä. Sen rakenne on:

AATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTA

GCTCGAGCCATGGGCCCCTAGGAGAT

5 GAGTCGACCTGCAGCTGTTGACAATTAATC

CTCAGCTGGACGTCGACAACTGTTAATTAG

ATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAG

TAGCCGAGCATATTACACACCTTAACACTC

CGGATAACAATTTCACACATAACGAGGCGC 10 GC CTATTGTTAAAGT GT GTATT GCTC C GC G

AAAAAATGAAAAAGACAGCTATCGCGATCGG

TTTTTTACTTTTTCTGTCGATAGCGCTAGCC

AGTGTAAGAAATGAGCGGTAAA TCACATTCTTTACTC GCCATTTTC GA

15 Ryhmää B vastaava DNA-insertti irrotetaan katkai semalla DNA restriktioendonukleaaseilla Hindlll ja BamHI ja puhdistetaan elektroforeesilla polyakryyliamidigeelil-lä. Sen rakenne on:

AGCTTCAAAGCTGGCGTATGCCCGCCG 20 AGTTTCGACCGCATACGGGCGGC

* *

AAAAAATCCGCGCAGTGTCTGCGGTACAAA

TTTTTTAGGCGCGTCACAGACGCCATGTTT

: ·* AAACCGGAATGCCAGTCCGACTGGCAGTGC

: TTTGGCCTTACGGTCAGGCTGACCGTCACG

25

CCGGGTAAAAAACGTTGTTGCCCGGACACC

GGCCCATTTTTTGCAACAACGGGCCTGTGG

TGCGGCATCAAATGCCTG

ACGCCGTAGTTTACGGACCTAG

♦ » . 30 Ryhmää C vastaava DNA-insertti irrotetaan katkaise- !..* maila DNA restriktioendonukleaaseilla BamHI ja Bglll ja ;· puhdistetaan elektroforeesilla polyakryyliamidigeelillä.

· Sen rakenne on: 35 108943 41

GATCCGGTTGATACCCCGAACCCGACT

GCCAACTATGGGGCTTGGGCTGA

C GT C GAAAAC C GGGT AAAT GC C C GGTA GCAGCTTTTGGCCCATTTACGGGCCAT

5 ACCTATGGCCAGTGTCTGATGCTGAACCCG TGGATACCGGTCACAGACTACGACTTGGGC

CCGAACTTCTGCGAAATGGACGGCCAGTGT

GGCTTGAAGACGCTTTACCTGCCGGTCACA

AAACGA

1Q TTTGCTCTAG

Ryhmää D vastaava DNA-insertti irrotetaan katkaisemalla DNA restriktioendonukleaaseilla SauIIIA ja Sali ja puhdistetaan elektroforeesilla akryyliamidigeelillä. Sen rakenne on: 15

GATCTGAAATGCTGTATGGGTATG

ACTTTACGACATACCCATAC

TGCGGCAAATCTTGTGTTTCCCCG

ACGCCGTTTAGAACACAAAGGGGC

V. 20 GTAAAAGCATAAG

CATTTTCGTATTCAGCT

• ♦ · • · B. Geenin muodostaminen j ;·,·. Kun tarkoituksena on erittyminen, insertit ryhmistä 3. Aa, B, C ja D yhdistetään ja ligatoidaan M13 mpl8:aan ja * » · i‘.’ 25 19:ään, jotka on katkaistu EcoRI:lla ja Sällillä, käyttäen * · · * ** T4 DNA-ligaaseja vakio-olosuhteissa. Geenin sisältävät kloonit valitaan niiden Xgal-levyillä saaman värin perus-'i teella ja seulotaan edelleen hybridisaatiolla 32P-leimatun ,,,·' oligonukleotidin kanssa. Valittujen kloonien rakenne .*, : 30 varmistetaan dideoksisekventoimalla DNA:n inserttialue käyttäen universaalialuketta.

Kun tarkoituksena on ilmentäminen sytoplasmassa, i insertit ryhmistä Ab, B, C ja D yhdistetään ja ligatoidaan li(! M13 mpl8:aan ja 19:ään, jotka on katkaistu EcoRI: 11a ja 35 Sällillä, käyttäen T4 DNA-ligaasia vakio-olosuhteissa.

Geenejä sisältävät kloonit valitaan sen perusteella, mikä väri niillä on Xgal-levyillä, ja seulotaan edelleen hybri- 108943 42 disaatiolla 32P-leimatun insertin kanssa. Valittujen kloonien rakenteet varmistetaan dideoksisekventoimalla DNA:n inserttialue käyttäen universaalialuketta.

Esimerkki 2 5 Käyttäen perusteina yllä kuvattua aminohapposek venssiä, kodonin käyttöä Escherichia colin vahvasti ilmentyvissä geeneissä ja sitä, että restriktioendonukleaasin katkaisukohtien tulee olla sopivat, suunniteltiin seuraava DNA-sekvenssi: 10 Hindlll

5'TCT GGT AAA AGC TTC AAA GCT GGC GTA TGC CCG CCG

AI ui

FnuDII RsaI Hpall

l A AA AAA TCC GCG CAG TGT CTG CGG TAC AAA AAA CCG

Hnal 15

Xmal

GAA TGC CAG TCC GAC TGG CAG TGC CCG GGT AAA AAA

Hpall

Neil

Hoall

.V: 20 CGT TGT TGC CCG GAC ACC TGC GGC ATC AAA TGC CTG

,·,·§ Neil Fnu4HI BstNI

• · t »

: * * i BamHI

' GAT CCG_ GTT GAT ACC CCG AAC CCG ACT CGT CGA AAA

: V Hpall Taql '•V Hpall Hpall Ball

CCG GGT AAA TGC CCG GTA ACC TAT GGC CAG TGT CTG

* * Neil Neil Haelll

·. ; ATG CTG AAC CCG CCG AAC TTC TGC GAA AT G GAC GGC

; y Haelll

Bglll

30 CAG TGT AAA CGA GAT CTG AAA TGC TGT ATG GGT ATG

!,,' MboI

>' __Fnu4HI Neil TGC GGC *** TCT TGT GTT TCC CCG ~GTA AAA GCA TAA 31 I* Hpall 35 Ilmentämisen säätelemiseksi siten, että muodostuva proteiini olisi sopivassa muodossa kuljettuakseen E. colin periplasmiseen tilaan, ehdotetaan käytettäviksi seuraavia 108943 43 säätelyelementtejä: plasmidin pKK223-3 tac-promoottori vahvan kopioitumisen aloittamiseksi, plasmidin pKK223-3 lac-operaattori kopioinnin säätämiseksi, lac-repressori (lac I1) koodattavaksi E. colin kannan JM107 kromosomiin, 5 OmpA Shine-Dalgarno-sekvenssi vahvan luennan aloittamiseksi, OmpA-leader tuotteen kuljettamiseksi periplasmiseen tilaan, Ala-Ser-liittymän Ala näiden operaattorielement-tien koodaamaan proteiinisekvenssin ja yllä kuvattujen ra-kennegeenien koodaamaan proteiinisekvenssin väliin aluksi 10 saatavan tuotteen lohkeamisen määräämiseksi niin, että saadaan kypsä leukosyyttielastaasi-inhibiittori. OmpA-osat liitetään seuraavaan DNA-sekvenssiin:

GAATT CGATA TCTCG TTGGA GATAT TCAT GACGT ATTTT GGATG ATAAC GAGGC

GCAAA AAATG AAAAA GACAG CTATC GCGAT CGCAG TGGCA

15 CTGGC TGGTT TCGCT ACCGT AGCGC AGGCC.

Ilmentämisen säätämiseksi siten, että muodostuva proteiini on sellaisessa muodossa, että se jää E. colin sytoplasmaan, ehdotetaan käytettäviksi seuraavia toiminta-20 elementtejä: plasmidin pKK223-3 tac-promoottori, plasmidin pKK223-3 lac-operaattori ja E. coli -kannan JM107 kro- i * * | it[; mosomm lac-repressori (lac I4), Shine-Dalgarno-yhdistel- ! * · | ,, , mäsekvenssi ja vahvan luennan aloittamiseksi OmpA-leader- ’ ) peptidin fragmentti käytettäväksi translaatiokytkijänä.

• » · *·' 25 Translaatiokytki j äsekvenssi sisältää DNA:n, joka koodaa • « *

OmpA-geenin luennan aloitusaluetta. OmpA-leader-peptidin kahdeksan ensimmäistä aminohappoa, yllä kuvatun Shine--/·· Dalgarno-yhdistelmäsekvenssin ja luennan lopetussignaalin.

' : Translaatiokytkijäsäkvenssi on liitettävä lac-operaattorin t.’ . 30 ja seriiniproteaasi-inhibiittorigeenin luennan aloituskoh- » i · I,.’ dan väliin, viime mainitun kanssa päällekkäin. Translaa- ‘,*’ tiokytkijän osatekijät sisällytetään seuraavaan DNA-sek- : venssiin: GAATT CGATA TCTCG TTGGA GATAT TTCAT GACGT ATTTT GGATG ATAAC GAGGC GCAAA AAATG AAAAA GACAG CTATC GCGAT CAAGG AGAAA TAAAT G.

• » i i 108943 44 C. Geenin fragmenttien muodostaminen Yllä mainittujen sekvenssien muodostamiseksi syntetisoidaan seuraavat deoksiribonukleotidit käyttäen ABI DNA-syntetisaattoria (Foster City, Kalifornia). Tuotteet 5 puhdistetaan elektroforeesilla polyakryyliamidigeelillä kuten on kuvattu ABI-laitteen käsikirjassa. Ne 5' fosfo-ryloidaan käyttäen T4-polynukleotidikinaasia ja ATP:tä va-kiomenetelmillä.

Seuraavia oligonukleotidisekvenssejä käytetään 10 fragmentin Aa muodostamiseksi.

01igonukleotidi Aal on: AATTCGATATCTCGTTGGAGATATTCATGACGTATTTTGGATGATAACGAGGCGCAAAA.

Oligonukleotidi Aa2 on: ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATCG.

15 Oligonukleotidi Aa3 on: GATCCGATCGCGATAGCTGTCTTTTTCATTTTTTGC.

Oligonukleotidi Aa4 on: ! GCCTCGTTATCATCCAAAATACGTCATGAATATCTCCAACGAGATATCG.

! Oligonukleotidi Aa5 on: 20 gatccgatcgcagtggcactggctggtttcgctaccgtagcgcaggcctctggtaaa.

. . Oligonukleotidi Aa6 on: *·’;* agcttttaccagaggcctgcgctacggtagcgaaaccagccagtgccactgcgatcg.

♦ · · *·*·* Seuraavia oligonukleotidisekvensse j ä käytetään • · « · ’ * fragmentin Ab muodostamiseen: * * · • 25 Oligonukleotidi Abi on: :: AATTCGATATCTCGTTGGAGATATTCATGACGTATTTTGGATGATAACGAGGCGCAAAA.

Oligonukleotidi Ab2 on: ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATCG.

Oligonukleotidi Ab3 on: 30 GATCCGATCGCGATAGCTGTCTTTTTCATTTTTTGC.

«ti / t Oligonukleotidi Ab4 on: GCCTCGTTATCATCCAAAATACGTCATGAATATCTCCAACGAGATATCG.

Oligonukleotidi Ab5 on: I CAAGGAGAAATAAATGAGCGGTAAA.

35 i 108943 45

Oligonukleotidi Ab6 on: AGCTTTTACCGCTCATTTATTTCTCCTTGAT.

Seuraavia oligonukleotidisekvenssejä käytetään ; 5 fragmentin B muodostamiseen:

Oligonukleotidi B1 on: AGCTT CAAAG CTGGC GTATG CCCGC CGAAA AAATC CGCG.

Oligonukleotidi B2 on: CAGTG TCTGC GGTAC AAAAA ACCGG AATGC CAG.

^ Oligonukleotidi B3 on: TCCGA CTGGC AGTGC CCGGG TAAAA AACGT TGTTG C.

Oligonukleotidi B4 on: CCGGA CACCT GCGGC ATCAA ATGCC TG.

Oligonukleotidi B5 on: 15 OATCC AGGCA TTTGA TGCCG CAGGT GTCCG GGCAA CAACG TTTTT TACCC GGGCA.

Oligonukleotidi B6 on: CTGCC AGTCG GACTG GCATT CCGGT TTTTT GTACC G. Oligonukleotidi B7 on: 20 CAGAC ACTGC GCGGA TTTTT TCGGC GGGCA TACGC CAGCT TTGA.

. . Seuraavia oligonukleotidisekvenssejä käytetään *·’·’ fragmentin muodostamiseen.

I t I

Oligonukleotidi Cl on: "'· G AT CC GGTTG ATACC CCGAA CCCG.

* V 25 Oligonukleotidi C2 on: actcg tcgaa aa.

Oligonukleotidi C3 on: CCGGG TAAAT GCCCG GTAAC CTATG GC.

,·. : Oligonukleotidi C4 on: * · · 30 CAGTG TCTGA TGCTG AACCC GCCGA AC.

Oligonukleotidi C5 on: TTCTG CGAAA TGGAC GGCCA GTGTA AACC-A GAT.

Oligonukleotidi C6 on: ;]·, CTAGA TCTCG TTTAC ACTGG CCGTC CATTT CGCAG AAGTT.

!.V 35 Oligonukleotidi C7 on: CGGCG GGTTC AGCAT CAGAC ACTGG CCATA GGTTA CCGGG CA.

108943 46

Oligonukleotidi C8 on: TTTAC CCGGT TTTCG ACGAG TCGGG TT.

Oligonukleotid i C9 on: CGGGG TATCA ACCG.

5 Seuraavia oligonukleotidisekvenssejä käytetään fragmentin D muodostamiseen.

Oligonukleotidi Dl on: GATCT GAAAT GCTGT ATGGG TATGT GCGGC.

Oligonukleotidi D2 on: 10 AAATC TTGTG TTTCC CCGGT AAAAG CATAA G.

Oligonukleotidi D3 on: | TCGAC TTATG CTTTT ACCGG GGAAA CACAA GATTT GCCGC A.

' Oligonukleotidi D4 on: CATAC CCATA CAGCA TTTCA.

15 Seuraavat ryhmät oligonukleotideja sekoitetaan ja suoritetaan anneal-käsittely vakio-olosuhteissa ja liga-toidaan toisiinsa ja kloonaus- ja sekventointivektoreihin M13 mpl8 ja 19, jotka on katkaistu sopivilla restriktioen-donukleaaseilla, käyttäen T4 DNA-ligaasia vakio-olosuh-20 teissä. Tuotteita käytetään E. coli JM105:n transformoin-. . tiin ja kiinnostuksen kohteena olevaa DNA:ta sisältävät kloonit valitaan hybridisaatiolla 32P-leimattu j en oligo- • « · nukleotidien kanssa, jotka on valittu ryhmästä, jota käy-' · tettiin anneal-vaiheessa. Insertin rakenne varmistetaan * '.· 25 dideoksisekventoimalla kloonattu DNA käyttäen universaa li.: lialuketta.

:V: Oligonukleotidit Aal - Aa4 ligatoidaan M13 * · mpl8:aan ja M13 mpl9:ään, jotka on katkaistu EcoRIrllä ja : BamHIilla, M13:n replikoituvan muodon DNA, jossa on halut- • · ·

* I

,···. 30 tu DNA-insertti otetaan talteen vakiomenetelmillä. DNA-

' ’·’ insertti irrotetaan M13:n DNA:sta katkaisemalla M13:n DNA

* · restriktioendonukleaaseilla EcoRI ja Pvu 1 ja puhdistetaan •,,, · elektroforeesilla polyakryyliamidigeelillä. Sen rakenne ! .·. on: * » t * · 35 108943 47

AATTCGATATCTCGTTGGAGATATTCATGACGTATTTTGGATGATAACGAGGCGCAAAAAATGA

GCTATAGAGCAACCTCTATAAGTACTGCATAAAACCTACTATTGCTCCGCGTTTTTTACT

AAAAGACAGCTATCGCGAT

TTTTCTGTCGATAGCGC

5

Oligonukleotidit Aa5 ja Aa6 ligatoidaan Ml 3 mpl8:aan ja M13 mpl9:ään, jotka on katkaistu BamHI:llä ja Hindlll:11a. M13:n replikoituvan muodon DNA, jossa on haluttu DNA-insertti, otetaan talteen vakiomenetelmin. DNA-10 insertti irrotetaan Ml3:n DNA:sta katkaisemalla DNA re-striktioendonukleaaseilla PvuI ja Hindlll ja puhdistetaan elektroforeesilla polyakryyliamidigeelillä. Sen rakenne on

CGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCAGGCCTCTGGTAAA

TAGCGTCACCGTGACCGACCAAAGCGATGGCATCGCGTCCGGAGACCATTTTCGA

15 Tämä Pvul-Hindlll -fragmentti yhdistetään EcoRI-Pvul-fragmenttiin, joka on valmistettu oligonukleotideista Aal - Aa4 ja ligatoidaan M13 mpl8:aan tai M13 mpl9:ään, jotka on katkaistu EcoRI:llä ja HindIII:lla. M13:n repli-20 koituvan muodon DNA otetaan talteen vakiomenetelmin. DNA-. . insertti, joka on DNA-fragmentti Aa, irrotetaan M13:n ; * DNA:sta katkaisemalla M13:n DNA restriktioendonukleaa- *·’·’ seilla EcoRI ja Hindlll ja puhdistetaan elektroforeesilla ' * polyakryyliamidigeelillä. Sen rakenne on: Γ\’: 25

. .·. AATTCGATATCTCGTTGGAGATATTCATGACGTATTTTGGATGATAACGAGGCGCAAAAAATGA

* · ·

! * .* GCTATAGAGCAACCTCTATAAGTACTGCATAAAACCTACTATTGCTCCGCGTTTTTTACT

* * *

‘* AAAAGACAGCTATCGCGATCGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCAGGCCTCTGGTA

TTTTCTGTCGATAGCGCTAGCGTCACCGTGACCGACCAAAGCGATGGCATCGCGTCCGGAGACCAT

: aa * *

!..* 30 TTTCGA

’’’ Oligonukleotidit Abi - Ab4 ligatoidaan EcoRI :llä * · ja BamHI:llä katkaistuihin M13 mpl8:aan ja M13 mpl9:ään.

• · ·

Ml3:n replikoituvan muodon DNA, jossa on haluttu DNA- : .·. inserttir otetaan talteen vakiomenetelmin. DNA-insertti 35 irrotetaan M13:n DNA: sta katkaisemalla DNA restriktioendo-nukleaaseilla EcoRI ja PvuI ja puhdistetaan elektroforeesilla polyakryyliamidigeelillä. Sen rakenne on: i 108943 48

AATTCGATATCTCGTTGGAGATATTCATGACGTATTTTGGATGATAACGAGGCGCAAAAAATGA

gctatagagcaacctctataagtactccataaaacctactattgctccgcgttttttact AAAAGACAGCTATCGCGAT TTTTCTGTCGATAGCGC

5 Tämä EcoRI-PvuI -fragmentti yhdistetään oligonuk- leotideihin Ab5 ja Ab6 ja ligatoidaan EcoRI:llä ja Hin-dIII:lla katkaistuihin M13 mpl8-:aan ja M13 mpl9:ään.

M13:n replikoituvan muodon DNA, jossa on haluttu DNA-insertti, otetaan talteen vakiomenetelmin. DNA-insertti, 10 joka on fragmentti Ab, irrotetaan M13:n DNArsta katkaisemalla DNA restriktioendonukleaaseilla EcoRI ja Hindlll ja puhdistetaan elektroforeesilla polyakryyliamidigeelillä.

Sen rakenne on:

15 AATTCGATATCTCGTTGGAGATATTCATGACGTATTTTGGATGATAACGAGGCGCAAAAAATGA

GCTATAGAGCAACCTCTATAAGTACTGCATAAAACCTACTATTGCTCCGCGTTTTTTACT AAAAGACAGCTATCGCGATCAAGGAGAAATAAATGAGCGGTAAA TTTTCTGTCGATAGCGCTAGTTCCTCTTTATTTACTCGCCATTTTCGA

Ryhmä B, joka sisältää oligonukleotidit B1 - B7, 20 ligatoidaan Hindlll:11a ja BamHI:llä katkaistuihin M13 mp 18:aan ja 19:ään. Ryhmää B vastaava DNA-insertti irrote- • · · ! taan katkaisemalla DNA restriktioendonukleaaseilla Hindlll • ·[ ja BAMHI ja puhdistetaan elektroforeesilla polyakryyliami- » · * · digeelillä. Sen rakenne on: : 25

: AGCTTCAAAGCTGGCGTATGCCCGCCG

AGTTTCGACCGCATACGGGCGGC

* ·

AAAAAATCCGCGCAGTGTCTGCGGTACAAA

. TTTTTTAGGCGCGTCACAGACGCCATGTTT

30 AAACCGGAATGCCAGTCCGACTGGCAGTGC

; · ‘ TTTGGCCTTACGGTCAGGCTGACCGTCACG

‘*,ί CCGGGTAAAAAACGTTGTTGCCCGGACACC

k *

1”. GGCCCATTTTTTGCAACAACGGGCCTGTGG

·’ TGCGGCATCAAATGCCTG

35 ACGCCGTAGTTTACGGACCTAG

*

Ryhmä C, joka sisältää oligonukleotidit Cl - C9, ligatoidaan BamHI:llä ja Xbal:llä katkaistuihin M13 108943 49 mpl8:aan ja 19:ään. Ryhmää C vastaava DNA-insertti irrotetaan katkaisemalla DNA restriktioendonukleaaseilla BamHI ja Bglll ja puhdistetaan elektroforeesilla polyakryyliami-digeelillä. Sen rakenne on:

5 GATCCGGTTGATACCCCGAACCCGACT GCCAACTATGGGGCTTGGGCTGA CGTCGAAAACCGGGTAAATGCCCGGTA GCAGCTTTTGGCCCATTTACGGGCCAT ACCTATGGCCAGTGTCTGATGCTGAACCCG

10

TGGATACCGGTCACAGACTACGACTTGGGC

CCGAACTTCTGCGAAATGGACGGCCAGTGT

GGCTTGAAGACGCTTTACCTGCCGGTCACA

AAACGA

TTTGCTCTAG

15

Ryhmä D, joka sisältää oligonukleotidit Dl - D4 li-gatoidaan M13 mpl8:aan ja 19:ään, jotka on katkaistu BamHI :llä ja Sällillä. Ryhmää D vastaava DNA-insertti irrotetaan katkaisemalla DNA restriktioendonukleaaseilla SauIIIA 20 ja Sali ja puhdistetaan elektroforeesilla akryyliamidigee-. . Iillä. Sen rakenne on:

GATCTGAAATGCTGTATGGGTATG

ACTTTACGACATACCCATAC

« t «

. TGCGGCAAATCTTGTGTTTCCCCG

« · ·

25 ACGCCGTTTAGAACACAAAGGGGC GTAAAAGCATAAG CATTTTCGTATTCAGCT

; ; D. Geenin muodostaminen : ···. 30 Kun tarkoituksena on erittyminen, insertit ryh- '·’ mistä Aa, B, C ja D yhdistetään ja ligatoidaan M13 , ! mpl8:aan ja 19:ään, jotka on katkaistu EcoRIillä ja Sällillä, käyttäen T4 DNA-ligaasia vakio-olosuhteissa. Kun i .·. tarkoituksena on sytoplasminen ilmentyminen, insertit ryh- ,···, 35 mistä Ab, B, C ja D yhdistetään ja ligatoidaan M13 mpl8:aan ja 19:ään, jotka on katkaistu EcoRIillä ja Sällillä, käyttäen T4 DNA-ligaasia vakio-olosuhteissa. Gee- i 108943 50 nin sisältävät kloonit valitaan sen perusteella, mikä väri niillä on Xgal-levyillä ja seulotaan edelleen 32P-lei-matulla oligonukleotidilla. Valittujen kloonien rakenne varmistetaan dideoksisekvensoimalla DNA:n inserttialue 5 käyttäen universaalialuketta.

Esimerkki 3

Ilmentymisvektoreiden muodostaminen

Insertit, jotka oli muodostettu erittymistä varten ja sytoplasmassa tapahtuvaa ilmentymistä varten, siirret-10 tiin ilmentymisvektoreihin seuraavasti. M13:n replikoitu-i van muodon DNA, jossa on haluttu DNA-insertti, otetaan talteen vakiomenetelmin kuten edellä on esitetty. Sopiva DNA-insertti irrotetaan Ml3:n DNA:sta katkaisemalla DNA restriktioendonukleaasilla ECORI ja PstI ja puhdistetaan 15 elektroforeesilla polyakryyliamidigeelillä. Sen jälkeen se ligatoidaan pKK223-3:een, joka on katkaistu restriktioendonukleaasilla EcoRI ja PstI ja muodostunut plasmidi kloonataan E. coli JM107:ään. Esimerkeissä 4 ja 5 käytettävä, erittymiseen tarkoitettu konstruktio on pSGE6 ja esimer-20 kissä 7 käytettävä sytoplasmiseen ilmentämiseen tarkoitet- . . tu konstruktio on pSGE8. Esimerkeissä 4 ja 5 erittymiseen • * · ) * käytettävä E. coli -kanta on SGE10 ja esimerkissä 6 syto- * * · ·’·* plasmiseen ilmentymiseen käytettävä kanta on SGE30.

* · « * A. pSGE6:n kokoaminen * * · : .·’ 25 Plasmidi pSGE6 muodostettiin korvaamalla pKK223- * 3:ssa EcoRI: n ja Pstl:n kat kaisukohtien välinen DNA Eco-: : Rl/PstI -fragmentilla, joka sisältää onv SLPI:tä koodaa- van DNA:n. Tämä ompA-SLPI:n DNA-sekvenssi on seuraava: .’·· 10 20 30 40 50 60

,··, 30 GAATTCGATA TCTCGTTGGA GATATTCATG ACGTATTTTG GATGATAACG AGGCGCAAAA

,..· CTTAAGCTAT AGAGCAACCT CTATAAGTAC TGCATAAAAC CTACTATTGC TCCGCGTTTT

70 80 90 100 110 120

• ’·’ AATGAAAAAG ACAGCTATCG CGATCGCAGT GGCACTGGCT GGTTTCGCTA CCGTAGCGCA

TTACTTTTTC TGTCGATAGC GCTAGCGTCA CCGTGACCBA CCAAAGCGAT GGCATCGCGT

’. 130 140 150 160 170 180

• j GGCCTCTGGT AAAAGCTTCA AAGCTGGCGT ATGCCCGCCG AAAAAATCCG CGCAGTGTCT

!.* 35 CCGGAGACCA TTTTCGAAGT TTCGACCGCA TACGGGCGGC TTTTTTAGGC GCGTCACAGA

190 200 210 220 230 240

GCGGTACAAA AAACCGGAAT GCCAGTCCGA CTGGCAGTGC CCGGGTAAAA AACGTTGTTG

CGCCATGTTT TTTGGCCTTA CGGTCAGGCT GACCGTCACG GGCCCATTTT TTGCAACAAC

108943 51 250 260 270 280 290 300

CCCGGACACC TGCGGCATCA AATGCCTGGA TCCGGTTGAT ACCCCGAACC CGACTCGTCG GGGCCTGTGG ACGCCGTAGT TTACGGACCT AGGCCAACTA TGGGGCTTGG GCTGAGCAGC

310 320 330 340 350 360

AAAACCGGGT AAATGCCCGG TAACCTATGG CCAGTGTCTG ATGCTGAACC CGCCGAACTT

5 TTTTGGCCCA TTTACGGGCC ATTGGATACC GGTCACAGAC TACGACTTGG GCGGCTTGAA

370 380 390 400 410 420

CTGCGAAATG GACGGCCAGT GTAAACGAGA TCTGAAATGC TGTATGGGTA TGTGCGGCAA

GACGCTTTAC CTGCCGGTCA CATTTGCTCT AGACTTTACG ACATACCCAT ACACGCCGTT

430 440 450 460

ATCTTGTGTT TCCCCGGTAA AAGCATAAGT CGACCTGCAG

TAGAACACAA AGGGGCCATT TTCGTATTCA GCTGGACGTC

10

Sekvenssi, josta seuraavassa käytetään nimitystä "ompA-SLPI", on DNA edellä kuvatusta erittymistä varten muodostetusta lopullisesta M13 mpl8:sta. Plasmidi pSGE6 on esitetty kuviossa 1. Kuviossa 1 ensimmäinen ompAss-SLPI:n 15 kodoni on ompA-SLPI:ksi kutsutun DNA-sekvenssin asemassa 62 - 64. Ensimmäinen kypsän SLPI:n kodoni on asemassa 125 - 127. Ptac sisältää tac-promoottorin, lac-operaattorin ja β-galaktosidaadi-Shine/Dalgarno -sekvenssi DNA:n. Lyhenteet Rl, Pst ja Bam tarkoittavat restriktioentsyymien 20 EcoRI, PstI ja BamHI tunnistussekvenssejä. Tetr on .. pBR322:n tetrasykliiniresistenssiä aiheuttavan geenin osa, i * · · r , . , ) amp saa aikaan ampisilluniresistenssin, rrnb sisältää • i · ’*·* DNA:n rrnb-operonista asemasta 6416 asemaan 6840. Nuolet t · · · * * ilmaisevat kopioinnin suunnan.

• · · ; *.· 25 B. pCJ-ompA-SLPI: n kokoaminen

Plasmidi pCJ-ompA-SLPI on sama kuin pSGE6, paitsi , että se sisältää geenin osan sijasta koko tetrasykliini- resistenssigeenin ja promoottorin. Tämä plasmidi aiheuttaa : E. coliin vietynä tetrasykliiniresistenssin ja se koottiin ,·*. 30 analogisesti pSGE6:n kanssa, paitsi että ompA-SLPI:tä koo- daavan DNA:n sisältävä EcoRI/Pstl-fragmentti kloonattiin • · vektoriin pCJl eikä pKK223-3: een. Vektori pCJl muodostet- » » * tiin seuraavasti. Plasmidi pKK223-3 pilkottiin täysin i ,·, Sphl:llä ja osittain BamHI :llä. 4,4 kiloemäksen fragmentti * · • •V 35 puhdistettiin geelillä ja liitettiin synteettiseen adapto-riin: i i 108943 52 GATCTAGAATTGTCATGTTTGACAGCTTATCAT ATCTTAACAGTACAAACTGTCGAATAGTAGC ja 539 emäsparin fragmenttiin DNA:ta, joka oli peräisin 5 pBR322:n tetr-geenin Clal, SphI-pilkkomistuotteesta PL Biochemicals, 27-4891-01).

C. pSGE8:n rakenne

Plasmidi pSGE8 on isogeeninen pSGE6:lle lukuun ottamatta sitä, että EcoRI:n ja Pst:n katkaisukohtien väli-10 nen DNA sisältää sekvenssin, jota kutsutaan nimellä ompA-tc-metSLPI, joka on johdettu edellä käsitellystä sytoplas-miseen ilmentymiseen tarkoitetusta lopullisesta M13 mpl8 -konstruktiosta. Tämä sekvenssi ohjaa metionyyli-SLPI:n synteesiä E. colin sytoplasmassa. Kuviossa 2 on pSGE8:n 15 osakaavio. Sekvenssissä, jota nimitetään "ompA-tc-met-SLPI":ksi, ompA:n aloituskodoni on asemassa 62 - 64, lope-tuskodoni asemassa 95 - 97 ja metionyyli-SLPI:n aloituskodoni asemassa 98 - 100, ompA-tc-met-SLPI:n DNA-sekvenssi on seuraava: 20 10 20 30 40 50 60

I . , GAATTCGATA TCTCGTTGGA GATATTCATG ACGTATTTTG GATGATAACG AGGCGCAAAA

. ! : CTTAAGCTAT AGAGCAACCT CTATAAGTAC TGCATAAAAC CTACTATTGC TCCGCGTTTT

• · :Y: 70 so 90 100 no 120

* \ AATGAAAAAG ACAGCTATCG CGATCAAGGA GAAATAAATG AGCGGTAAAA GCTTCAAAGC

:··· TTACTTTTTC tgtcgatagc gctagttcct ctttatttac tcgccatttt cgaagtttcg 25 130 140 150 160 170 180 ’ ; 0 tggcgtatgc ccgccgaaaa aatccgcgca gtgtctgcgg tacaaaaaac cggaatgcca : :: accgcatacg ggcggctttt ttaggcgcgt cacagacgcc atgttttttg gccttacggt * i * Y: 190 200 210 220 230 240

' ’ GTCCGACTGG CAGTGCCCGG GTAAAAAACG TTGTTGCCCG GACACCTGCG GCATCAAATG

CAGGCTGACC GTCACGGGCC CATTTTTTGC AACAACGGGC CTGTGGACGC CGTAGTTTAC

250 260 270 . 280 290 300

j ' CCTGGATCCG GTTGATACCC CGAACCCGAC TCGTCGAAAA CCGGGTAAAT GCCCGGTAAC

30 GGACCTAGGC CAACTATGGG GCTTGGGCTG AGCAGCTTTT GGCCCATTTA CGGGCCATTG

* » · .* . 310 320 330 340 350 360

,'·< CTATGGCCAG TGTCTGATGC TGAACCCGCC GAACTTCTGC GAAATGGACG GCCAGTGTAA

...* GATACCGGTC ACAGACTACG ACTTGGGCGG CTTGAAGACG CTTTACCTGC CGGTCACATT

• 370 380 390 400 410 420

/, ACGAGATCTG AAATGCTGTA TGGGTATGTG CGGCAAATCT TGTGTTTCCC CGGTAAAAGC

G ·* TGCTCTAGAC TTTACGACAT ACCCATACAC GCCGTTTAGA ACACAAAGGG GCCATTTTCG

• * · 35 » ...* 430

ATAAGTCGAC CTGCAG TATTCAGCTG GACGTC

108943 53 D. pCJ-met-SLPI: n kokoaminen

Plasmidi pCJ-met-SLPI on sama kuin pSGE8, paitsi että se sisältää koko tetrasykliiniresistenssigeenin (geenin osan sijasta). Plasmidi CJ-met-SLPI muodostettiin ana-5 logisesti pSGE8:n kanssa, paitsi että ompA-tc-met-SLPI:tä koodaavan DNA:n sisältävä EcoRI/PstI -fragmentti kloonattiin vektoriin pCJl eikä pKK223-3:een.

E. Hiivassa ilmentyvien plasmidien kokoaminen

Plasmidi pUC8 pilkottiin HindIII:lla ja ligatoi- 10 tiin Hindlll/Smal-adaptoriin (toimittaja Amersham, luettelonumero DA1006). Tämän adaptorin liittäminen Hindlll-kohtaan ei muodosta Hindlll-kohtaa uudelleen. DNA pilkottiin sitten Smal:llä ja ligatoitiin laimeassa liuoksessa, mitä seurasi E. coli JM83:n transformointi. Oikea plasmi-15 di, so. plasmidi, josta Hindlll-kohdan ja Smal-kohdan välisen polylinkerin katkaisukohdat puuttuivat, tunnistettiin pilkkomalla transformanteista eristetty plasmidi-DNA EcoRI:llä, Smalrllä tai HindIII:lla. Transformantti, joka sisälsi plasmidin, josta puuttui Hindlll-kohta mutta joka 20 sisälsi EcoRI-kohdan ja Smal-kohdan, tunnistettiin tällä tavalla. Tämä plasmidi on pGS185.

: EcoRI-fragmentti, joka sisälsi hiivan MF 1-geenin, :··· puhdistettiin geelielektroforeesilla plasmidista pCY17 ku- jV. ten Kurjan, J. ja Herskowitz, I, ovat kuvanneet julkai- . .·. 25 sussa Cell. 30 (1982) s. 933, ja ligatoitiin EcoRI:llä ,··. katkaistuun pGS185:een. Tällä ligaatioseoksella transfor moitiin E. coli HblOl käyttäen ampisilliiniresistenssi-valintaa. Plasmidi-DNA eristettiin transformanteista ja *· oikean insertin läsnäolo varmistettiin DNA:sta EcoRI:lla • « · 30 saatujen pilkkoutumistuotteiden avulla. Tämä on plasmidi ;\j pGS285 ja se on esitetty kuviossa 3.

Plasmidi pGS285 pilkottiin täysin HindIII:lle ja * * ligatoitiin uudelleen laimeissa olosuhteissa MF 1-geenin N! : neljästä sisäisestä Hindlll-kohdasta kolmen poistamiseksi, 35 kuten Kurjan ja Herskowitz (edellä mainittu julkaisu) ovat esittäneet. Oikea rakenne valittiin yllä kuvatulla tavalla. Tämä on plasmidi pGS385.

1 08943 54

Esimerkissä 2 kuvattu M13 AaBCD-klooni, joka sisältää synteettisen SLPI-geenin nukleotidisekvenssit, jotka koodaavat aminohapot 4 - 107, pilkottiin Hindlllrlla. Tämä DNA ligatoitiin seuraavaan oligonukleotidiadaptoriin:

5 5' GCT GAA GCT TCA GGT AAG

CGA CTT CGA AGT CCA TTC TCGA.

Tämä adaptori oli valmistettu anneal-käsittelyllä seuraavista kahdesta oligonukleotidista: 5' GCT GAA GCT TCA GGT AAG ja 5' AGC TCT TAC CTG AAG CTT 10 CAGC ensin 70 °C:ssa 2 minuuttia ja jäähdyttämällä sitten hitaasti yli yön.

Adaptorin ja Hindlllrlla katkaistun M13 AaBCDrn li-gaation jälkeen ligaatioseosta käsiteltiin Hindlllrlla ja Sali :11a, jolloin vapautui fragmentti, joka puhdistettiin 15 agaroosigeelielektroforeesilla ja elektroluutiolla. Tämä fragmentti pilkottiin vielä kerran Hindlllrlla ja ligatoitiin sitten pGS385:n DNArhan, joka oli katkaistu Hindlllrlla ja Sallrlla. E. coli HB101 transformoitiin ligaa-tioseoksella, ja valittiin ampisilliiniresistentit trans- ; 20 formantit. Transformantit, jotka sisälsivät plasmideja, • · •.V joissa oli oikea DNA-insertti, tunnistettiin valmistamalla plasmidi-DNA ja pilkkomalla se Hindlllrlla ja Sallrlla.

;··; Tällä tavalla koottu ja eristetty plasmidi on nimetty pGS485:ksi ja se on esitetty kuviossa 4. Tämä plasmidi si-. .·. 25 sältää MF 1-geenin liittyneenä syntetisoidun SLPI-geenin • Hindlll-kohtaan MF 1-geenin ensimmäisestä välikealueesta * 1 1 (spacer region). Tällaisten rakenteiden on hiivaan siirrettyinä esitetty ohjaavan heterologisten proteiinien syn- * · · ’· ’· teesiä, prosessointia ja erittymistä. Kuten ovat osoitta- 30 neet Brake, A.J. et ai., julkaisussa PNAS (USA), 81 s.

4662, MF 1-geenin ja SLPIrn fuusio sisältyy EcoRI-frag- • · ,··1. menttiin pGS485:ssä. Tämä EcoRI-f ragmentti kloonattiin » » • · · vektoriin YIp5, kuten on kuvattu esimerkissä 8.

* 1 · • t 1 » · · · · 108943 55

Esimerkki 4

Sekretorisen leukosyyttiproteaasi-inhibiittorin (SLPI) ilmentäminen ja puhdistaminen käyttäen plasmidia pSGE6 5 Plasmidin pSGE6 sisältäviä E. coli -soluja (SGE10- soluja) kasvatettiin 6 tuntia 10 litrassa M9-kasvualustaa, johon oli lisätty 2 % tryptonia. 0,5 % hiivauutetta, 20 g/1 glukoosia, 200 mg/1 vitamiini B^tä ja 100 mg/1 am-pisilliinia. IPTG:tä lisättiin pitoisuuteen 0,2 mM ja vil-10 jelmää kasvatettiin vielä 6 tuntia. 10 litraa seosta, jossa oli E. coli SGElO-soluja 8 g/1 pelletoitiin voimalla 18000 x g ja suspendoitiin uudelleen 50 mM Tris-. (HCliään (pH 7,5), jossa oli EDTA-puskuria pitoisuutena 4 mM (seu-! raavassa kutsutaan nimellä T50E4) ja pelletoitiin. Pellet- 15 ti suspendoitiin uudelleen 2,7 litraan T50E4:ää ja jäädytettiin 150 ml: n erinä. Kahdeksan näistä eristä (vastaa 36 g soluja) yhdistettiin ja lysoitiin ajamalla kerran french-puristimen läpi paineella 82,74 MPa ja 4 °C:ssa. Lysaattia lingottiin 1,5 tuntia voimalla 20000 x g. Kuu-20 desosa pelletistä, joka sisälsi solun liukenemattomat ai-neosat (vastaa 6 g soluja) pestiin kahdesti 125 ml :11a V,: T50E4:ää ja loppumateriaalia jäädytettiin yli yön.

Jäädytettyä pellettiä uutettiin 25 ml: 11a 100-mM

’·*; Tris.HCl (pH 8,0), 4-mM EDTA (seuraavassa kutsuttu nimellä . .'. 25 T100E4), joka sisälsi 20 MM DTT (toimittaja Sigma, luette- lonumero D-0632), 4 mM PMSF (toimittaja Sigma, luettelonumero P-7626) ja 8 M ureaa (ultrapuhdasta, toimittaja BRL, . . luettelonumero 5505UA) 1 tunti 37 °C:ssa ja lingottiin * » * voimalla 10000 x g 10 minuuttia. Saatu emäliuos sekoitet-···’ 30 tiin 10 ml: aan pakattua Sephades SP-C25:ttä (toimittaja ; *,· Pharmacia), joka oli ensin tasapainotettu uuttopuskurilla T100E4, joka sisälsi 20 mM DTT:tä ja 8 M ureaa, ja sekoi-, *, tettiin telasekoittimessa 10 minuuttia 37 °C:ssa SLPI:n i » * absorboimiseksi SP-Sephadexiin.

35 Hartsi ja siihen absorboitunut SLPI pelletoitiin linkoamalla 10 minuuttia voimalla 3000 x g ja emäliuos de-kantoitiin. Jäljelle jäänyt hartsi pestiin kahdesti 25 108943 56 ml :11a Tl00E4:ää, joka sisälsi 20 mM DTT:ta ja 8 M ureaa, ja sen jälkeen kahdesti 25 ml:lla T100E4:ää, joka sisälsi 20 mM DTT. Sen jälkeen hartsia uutettiin kerran seoksella, jonka muodostivat 0,6 ml 5-M NaCl ja 25 ml T100E4:ää, joka 5 sisälsi 20 mM DTT ja 0,3 M NaCl. Tämä uute sisälsi noin 0,15 mg/mg proteiinia ja yli 0,04 mg/ml SLPIrtä. Tällä me netelmällä saadun tuotteen puhtauden todettiin olevan yli 70 % kaasukromatografisesti määritettynä.

Esimerkki 5 10 Käyttäen esimerkin 4 menetelmää uutettiin toista erää jäädytettyä pellettiä T100E4:llä, joka sisälsi 1 %

Triton X-100:aa (toimittaja Sigma, luettelonumero T-6878) ensimmäisen T100E4/DTT/PMSF/urea-pesun sijasta. Saatu SLPI ! oli lievästi puhtaampaa kuin esimerkissä 4 saatu ja sillä 15 oli seuraavassa esimerkissä 6 esitetyssä uudelleentaipu- miskokeessa suurempi aktiivisuus.

Esimerkki 6

Puhdistetun SLPI:n uudelleentaivutus

Noin 40 pg:sta osittain puhdistettua, esimerkistä 20 4 tai 5 saatua SLPI:tä tehtiin 8-M seos ureaan tai 5-M

·.·.· seos guanidiinihydrokloridiin (toimittaja Pierce Chemical

Co., numero 24110) ja 4-mM DTT:hen ja inkuboitiin tunnin :*** ajan huoneen lämmössä. Hapetettua glutationia (toimittaja

·*·*; Sigma, luettelonro G-4626) lisättiin pitoisuuteen 13,5 mM

. .·. 25 ja seosta inkuboitiin taas tunti huoneen lämmössä. Seos

laimennettiin 10-kertaiseksi liuoksella, jossa oli 50 mM

• · ·

Tris NaOH:ssa, pH 10,7, ja inkuboitiin vielä 4 tuntia huoneen lämmössä. Sen jälkeen seos laimennettiin 5-kertai- I · · '* '·’ sesti 50-mM Trisillä, pH 8,0, ja 0,15-M NaCl:llä ja vie- ·.·’ 30 tiin 1x2 cm:n kolonniin, joka oli täytetty Sephadex SP- “· · C25:llä ja tasapainotettu ensin 50-mM Trisillä, pH 8,0 ja 0,25-M NaCl:llä. Hartsi pestiin 50-mM Trisillä (pH 8,0), joka sisälsi 0,25 M NaCl ja sen jälkeen 50-mM Trisillä (pH ’ : 8,0), joka sisälsi 0,5 M NaCl. Fraktio, joka eluoitui 0,5- 35 M suolalla oli täysin aktiivinen ja edusti noin 30 % ko lonniin viedystä SLPI:stä.

108943 57

Esimerkki 7 SLPI:n puhdistaminen liukenevasta ja liukenemattomasta SGE30-solulysaatista

Plasmidin pSGE8 ilmentyminen E. coli SGE30 -so-5 luissa tuotti SLPI:tä solulysaatin sekä liukoisina että liukenemattomina fraktioina. Soluproteiinin kokonaismäärän ollessa 1 % SLPI jakautui niin, että noin 80 % meni liukoisiin ja noin 20 % liukenemattomiin fraktioihin.

A. SLPI:n puhdistaminen liukenemattomasta fraktios- 10 ta E. coli SGE30 -soluja, jotka sisälsivät pSGE8:aa, kasvatettiin LB-väliaineessa, joka sisälsi 50 \xq ml am-pisilliinia, ravistuspullossa 0,7:n OD600:aan ja indusoitiin lisäämällä IPTG pitoisuuteen 0,2 mM. Kolmen tunnin 15 jälkeen solut pelletöitiin ja suspendoitiin.

A. SLPI:n puhdistaminen liukenemattomasta fraktiosta E. coli SGE30 -soluja, jotka sisälsivät pSGE8:aa, kasvatettiin LB-väliaineessa, joka sisälsi 50 μ9/ιη1 am- 20 pisilliinia, ravistuspullossa 0,7:n OD600:aan ja indusoi- tiin lisäämällä IPTG pitoisuuteen 0,2 mM. Kolmen tunnin

jälkeen solut pelletöitiin 3a suspendoitiin 50-mM

Tris.HCl:ään (pH 7,5) ja 4-mM EDTA:aan (seuraavassa kut- suttu nimellä (T50E4), jota käytettiin kaksinkertainen ; 25 määrä solujen painoon nähden. Solut hajotettiin sonikaa- ,V. tiolla 4 °C:ssa ja uutetta lingottiin 20 minuuttia < » · 4 °C:ssa voimalla 12000 x 9.

. . Pelletti pestiin sen tilavuuteen nähden kolminker- * « » täisellä tilavuudella TS0E4:ää ja solubilisoitiin huoneen

“·’ 30 lämmössä liuokseen, joka sisälsi joko 10 M ureaa tai 6 M

guanidiinihydrokloridia ja 5 mM pelkistettyä DTT:tä. Kun oli inkuboitu tunnin ajan huoneen lämmössä, lisättiin ha- • petettua glutationia pitoisuuteen 17,5 mm ja seosta inku- > * » ‘I;.' boitiin vielä tunti. Sen jälkeen seos laimennettiin 10- 35 kertaiseen tilavuuteen 50 mM Tris.CHl:ää (pH 10,7). Laimennetun seoksen annettiin seistä 4 tuntia huoneen lämmössä ja sen jälkeen säädettiin pH arvoon 8 lisäämällä 5- 108945 58 normaalista HC1. Tämä seos lingottiin saostuneen proteiinin poistamiseksi.

Näin saatu emäliuos sisälsi SLPI:tä, jolla oli sek-retorisen leukosyyttiproteaasi-inhibiittorin aktiivisuus.

5 Tämä proteiini puhdistettiin kromatografoimalla Sephadex SP-C25 -kolonnissa, kuten edellä on kuvattu.

B. SLPI:n puhdistaminen liukoisesta fraktiosta E. coli SGE30:n soluja, jotka sisälsivät plasmi-dia pSGE8, kasvatettiin ravistuspullossa 0,7:n OD600:aan 10 ja indusoitiin lisäämällä IPTG:tä pitoisuuteen 0,2 mM. Kohdassa 00600 l,l:tä solut pelletöitiin voimalla 25000 x g 15 minuuttia. Pelletti lietettiin uudelleen TS0E4:ään ja lysoitiin ajamalla kahdesti french-puristimen läpi paineella 137,9 Mpa 4 °C:ssa. Lysaattia lingottiin voimalla 15 25000 x g 15 minuuttia.

Emäliuos tehtiin 25-mM:iseksi DTT:hen. Tätä seosta inkuboitiin 0 °C:ssa tunnin ajan ja lisättiin HC1 niin paljon, että loppupitoisuudeksi saatiin 5 %. Inkuboitiin 30 minuuttia 0 °C:ssa, minkä jälkeen seosta lingottiin ·.·. 20 voimalla 25000 x g 15 minuuttia ja emäliuos poistettiin . jatkokäsittelyä varten. Emäliuoksen pH säädettiin arvoon '. 8,0 10-M NaOHrlla ja ja analysoitiin SDS-page-kokeella ,, , käänteisfaasi-HPLC-kromatografiällä ja ELISA-kokeella, » · · ' | jotka osoittivat vähintään 0,7 μρ SLPI:tä 130 μρ:η koko- '···' 25 naisproteiinimäärää kohti. Näin saatu SLPI puhdistettiin t · · V.· edelleen Sephadex SP-C25-kromatografiapylväässä. Se taivu tettiin uudelleen aktiiviseksi SLPIrksi esimerkin 6 mukai- i · sesti.

> I t

Esimerkki 8

*, : 30 EcoRI-fragmentti, joka sisälsi fuusioidun SLPI-MF

*..[ 1-geenin (ks. esimerkki 3E) ligatoitiin hiivan vektorin YIp5 EcoRI-kohtaan, kuten on kuvattu julkaisussa Botstein, : D. ja Davis, R.W., The Molecular Biology of the Yeast Sac- charomyces, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, s. 607-35 636, YIpSLPI-l:n tuottamiseksi ja se liitettiin S. cere- visiae BS214:n URA3 -geenin (MAT, Ura3-52, pep4, brbl) 108943 59 kohta-ohjatulla (site-directed) yhdistelmämenetelmällä, kuten on kuvattu julkaisussa Orr-Weaver, T. et al.r Methods of Enzymology 101 (1983) s, 228. Tämä kanta S. cere-visiae SGY-L erittää täysin aktiivista SLPI:tä viljelyemä-5 liuokseen.

Myös toinen kanta, SGY-3, tuottaa ja erittää aktiivista SLPI:tä. Tässä kannassa on MF 1::SLPI-fuusio repli-koituvassa hiivaplasmidissa pGS585. Tämä plasmidi muodostettiin pJDB207:stä, kuten on kuvattu julkaisussa Broach.

10 J.R., Methods in Enzymologi, 101 (1983) s. 307, lisäämällä hiivan URA3 -geeni, joka oli eristetty plasmidista YEp24 kuten on kuvattu jullkaisussa Botstein, D. ja Davis, R.W.,

The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Cold ! Spring Harbor Laboratory, s. 607-636, ja kloonattu 15 pJDB207:n Hindlll-kohtaan pGS585:n muodostamiseksi. MF 1::SLPI-fuusiogeeni, joka sisälsi EcoRI-fragmentin, kloonattiin pGS585:n Sali-kohtaan käyttäen EcoRI-XHoI-adap-toreita (toimittaja Amersham, luettelon:o DA1007) YEpSLPI-l:n tuottamiseksi. Tämä plasmidi vietiin S. cerevisiae i ·.*. 20 DBY746:een (MAT, Ura3-52, leu2-3, his3 1, trp 1-289) [ · · · transformaatiolla, joka on kuvattu julkaisussa Ito et ai., J. Bacteriology, 153 (1983) s. 163.

• · , Saccharomyces cerevisiae -kannat SGY-L ja SGY-3 * j kasvatettiin 30 °C:ssa stationaaritilaan SD-väliaineessa, ;··’ 25 josta puuttui urasiili, menetelmällä, joka on kuvattu jul- i · · *·'.* kaisussa Sherman, F. et ai., Methods in Yeast Genetics,

Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New

* I

York (1981) s. 62. Solut poistettiin vil j elyväliaineesta

I I I

linkoamalla ja vil j elyemäliuos tutkittiin SLPI-aktii- ·. : 30 visuuden suhteen mittaamalla (1) proteaasi-inhibiittori- » * * · ··, aktiivisuus ja (2) sen materiaalin määrä, joka reagoi spe- sifisesti anti-SLPI-vasta-aineiden kanssa entsyymivälit- t · : teisessä immunoanalyysissä. Puhdistusmenettelyt voidaan • * · ,./ suunnitella tässä aiemmin kuvattujen menetelmien kanssa 35 analogisella tavalla.

108943 60

Alan ammattimiehelle on ilmeistä, että tämän keksinnön mukaisiin menetelmiin ja tuotteisiin voidaan tehdä lukuisia modifikaatioita ja variaatioita. Siten on tarkoitus, että tämän keksinnön piiriin kuuluvat sen kaikki mo-5 difikaatiot ja variaatiot, mikäli ne kuuluvat oheisten patenttivaatimusten piiriin tai ovat niille ekvivalentteja.

< · « • · * · • # * 1 · » · · > » « * > k

Claims (26)

1. 6i 1 08943
2. 1. Menetelmä yksittäisen polypeptidiketjun käsittävän seriiniproteaasi-inhibiittorin valmistamiseksi yh-5 distelmä-DNA-synteesillä, jossa inhibiittorissa on ainakin yksi aktiivinen kohta, jolla on seriiniproteaasi-inhibiit-toriaktiivisuus, ja jolla inhibiittorilla on aminohappo-sekvenssi
3. 10 Ser-Gly-Lys-Ser-Phe-Lys-Ala-Gly-Val-Cys-Pro- Pro-Lys-Lys-Ser-Ala-Gln-Cys-Leu-Arg-Tyr-Lys-Lys-Pro-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp-Trp-Gln-Cys-Pro-Gly-Lys-Lys-Arg-Cys-Cys-Pro-Asp-Thr-Cys-Gly-Ile-Lys-Cys-Leu-Asp-Pro-Val-Asp-Thr-Pro-Asn-! 15 Pro-Thr-Arg-Arg-Lys-Pro-Gly-Lys-Cys-Pro-Val- Thr-Tyr-Gly-Gln-Cys-Leu-Met-Leu-Asn-Pro-Pro- Asn-Phe-Cys-Glu-Met-Asp-Gly-Gln-Cys-Lys-Arg- Asp-Leu-Lys-Cys-Cys-Met-Gly-Met-Cys-Gly-Lys- Ser-Cys-Val-Ser-Pro-Val-Lys-Ala, ; ,Y: 20 tai sen homologin valmistamiseksi, jolla on seriinipro-teaasi-inhibiittoriaktiivisuus, tunnettu siitä, että ' ! (a) viljellään transformoitua tai transfektoitua 25 isäntämikro-organismia, joka sisältää DNA-sekvenssin, joka pystyy ohjaamaan isäntämikro-organismia tuottamaan mainit-i tua polypeptidiä, jolla on seriiniproteaasi-inhibiittori- , ·· aktiivisuutta olosuhteissa, joissa polypeptidiä tuotetaan; ja , : 30 (b) polypeptidi otetaan talteen. ·.’ 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA-sekvenssi on synteettinen ; · sekvenssi.
4. 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 35 tunnettu siitä, että DNA-sekvenssi on eristetty ja puhdistettu luonnon DNA-sekvenssi. c, 108943 62
5. 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se käsittää lisäksi polypep-tidin puhdistamisen.
6. 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että puhdistaminen suoritetaan ennen kuin polypeptidin annetaan omaksua aktiivinen muoto.
7. 6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että puhdistaminen suoritetaan sen jälkeen, kun polypeptidin on annettu omaksua aktiivinen 10 muoto.
8. 7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA-sekvenssi sisältyy vektoriin, joka sisältää pBR322:n ja pIQ:n muodostaman ryhmän vektorien osia.
9. 8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isäntämikro-organismi on valittu ryhmästä, jonka muodostavat sukujen Escherichia ja Saccharomyces mikro-organismit.
10. 9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, .V: 20 tunnettu siitä, että isäntämikro-organismi on Escherichia coli.
11. 10. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isäntämikro-organismi on ! Saccharomyces cerevisiae. * # ·
12. 11. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, * · · '*·* tunnettu siitä, että eristetty ja puhdistettu luonnon DNA-sekvenssi on saatavissa menetelmällä, joka kä- • · ‘Λ: sittää seuraavat vaiheet: » · · ,,,·* (a) valmistetaan ihmisen cDNA-kirjasto soluista, : 30 jotka pystyvät ilmentämään luonnon seriiniproteaasi-inhi- ’ * · ,···, biittoria; " (b) testataan c-DNA-kirjastoa ainakin yhdellä nuk- i leiinihappo-koettimella, joka pystyy hybridisoitumaan cDNA:n kanssa, joka koodaa inhibiittoria tai ainakin yh- 35 dellä koettimella, joka pystyy sitoutumaan cDNA kirjaston kloonin ilmentämään proteaasi-inhibiittoriproteiinin; 108943 63 (c) identifioidaan ainakin yksi klooni, joka sisältää inhibiittoria koodaavan cDNA:n ja mahdollisesti (d) eristetään inhibiittoria koodaava cDNA kloonista; ja 5 (e) liitetään cDNA tai sen sopivia fragmentteja toimintaelementteihin, jotka ovat tarpeen cDNA:n säilymiseksi ja ilmentymiseksi isäntämikro-organismissa.
13. 12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että solut ovat ihmisen parotidi- 10 soluja.
14. 13. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että eristetty ja puhdistettu luonnon DNA-sekvenssi on saatavissa menetelmällä, joka käsittää seuraavat vaiheet: 15 (a) valmistetaan ihmisen genomi-DNA-kirjasto; (b) testataan ihmisen genomi-DNA-kirjastoa ainakin yhdellä koettimella, joka pystyy sitoutumaan genomi-DNA:-han, joka koodaa inhibiittoria tai joka pystyy sitoutumaan genomi-DNA-kir jaston kloonin ilmentämään seriiniproteaasi- ,Y: 20 inhibiittoriproteiiniin; (c) identifioidaan ainakin yksi klooni, joka sisäl-tää inhibiittoria koodaavaa genomi-DNA:ta; käyttäen vai- • · ^ heen (b) koettimia ja mahdollisesti < · (d) eristetään inhibiittoria koodaava genomi-DNA » · · 25 kloonista; ja * · » '·*· (e) liitetään genomi-DNA tai sen sopivia fragment teja toimintaelementteihin, jotka ovat tarpeen DNA:n säi-lymiseksi ja ilmentymiseksi isäntämikro-organismissa. • 14. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, * * * 30 tunnettu siitä, että · * 1 1 · · a) valmistetaan DNA-sekvenssi, joka pystyy ohjaa- t ';· maan isäntämikro-organismia tuottamaan proteiinia, joka | sisältää aminohapposekvenssin » » · » 64 1 08943 Ser—Gly—Lys—Ser—Phe—Lys—Ala—Gly—Val—Cys— Pro—Pro—Lys—Lys—Ser—Ala—Gin—Cys—Leu—R2— Tyr—Lys—Lys—Pro—Glu—Cys—Gin—Ser—Asp—Trp— Gin—Cys—Pro—Gly—Lys—Lys—Arg—Cys—Cys—Pro—
15. 5 Asp—Thr—Cys—Gly—lie—Lys—Cys—Leu—Asp—Pro— Val—Asp—Thr—Pro—Asn—Pro—Thr—Arg—Arg—Lys— Pro—Gly—Lys—Cys—Pro—Val—Thr—Tyr—Gly—Gin— Cys—R8—R3—Rc,—Asn—Pro—Pro—Asn—Phe—Cys—Glu— R4—Asp—Gly—Gin—Cys—Lys—Arg—Asp—Leu—Lys—Cys—
16. 10 Cys—R5—Gly—R6—Cys—Gly—Lys—Ser—Cys—Val— Ser—Pro—Val—Lys—Ala, jossa R2, R3, R4, R5/ Rö, R8 ja R9 ovat samanlaisia tai eri-15 laisia ja merkitsevät metioniinia, valiinia, alaniinia, fenyylialaniinia, tyrosiinia, tryptofaania, lysiiniä, gly-siiniä, leusiiniä tai arginiinia; b) DNA-sekvenssi kloonataan vektoriin, jota pystytään siirtämään isäntämikro-organismiin ja replikoimaan .V: 20 siellä, joka vektori sisältää DNA-sekvenssin toimintaele-• * menttejä; • · c) siirretään DNA-sekvenssin ja toimintaelementit sisältävä vektori isäntämikro-organismiin, joka pystyy il- ] mentämään seriiniproteaasi-inhibiittorin; t * · 25 d) viljellään isäntämikro-organismia olosuhteissa, j * * * jotka ovat sopivia vektorin amplifikaatiolle ja inhibiittorin ilmentymiselle; * 1 *. e) otetaan inhibiittori talteen; ja I '...· f) annetaan inhibiittorin omaksua aktiivinen ter- : 30 tiaarinen rakenne, jolloin sillä on seriiniproteaasi-inhi- * · ,·*, biittoriaktiivisuus.
17. 15. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, » tunnettu siitä, että t t I a) valmistetaan DNA-sekvenssi, joka pystyy ohjaa-35 maan isäntämikro-organismia tuottamaan yksittäisen poly- 108943 65 peptidiketjun käsittävää seriiniproteaasi-inhibiittoria, joka vastaa ihmisen parotidisolujen eritteistä eristettyä, tai inhibiittorin homologia, jolloin mainitulla yksittäisen polypeptidiketjun käsittävällä seriiniproteaasi-inhi-5 biittorilla on aminohapposekvenssi Ser-Gly-Lys-Ser-Phe-Lys-Ala-Gly-Val-Cys-Pro-Pro-Lys-Lys-Ser-Ala-Gln-Cys-Leu-Arg-Tyr-Lys-Lys-Pro-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp-Trp-Gln-Cys-Pro-10 Gly-Lys-Lys-Arg-Cys-Cys-Pro-Asp-Thr-Cys-Gly- Ile-Lys-Cys-Leu-Asp-Pro-Val-Asp-Thr-Pro-Asn-Pro-Thr-Arg-Arg-Lys-Pro-Gly-Lys-Cys-Pro-Val-Thr-Tyr-Gly-Gln-Cys-Leu-Met-Leu-Asn-Pro-Pro-Asn-Phe-Cys-Glu-Met-Asp-Gly-Gln-Cys-Lys-Arg-15 Asp-Leu-Lys-Cys-Cys-Met-Gly-Met-Cys-Gly-Lys- Ser-Cys-Val-Ser-Pro-Val-Lys-Ala, tai osa siitä; b) DNA-sekvenssi kloonataan vektoriin, jota pys-20 tytään siirtämään isäntämikro-organismiin ja replikoimaan siellä, joka vektori sisältää DNA-sekvenssin toimintaele-menttejä; *. .t c) siirretään DNA-sekvenssin ja toimintaelementit * « ! sisältävä vektori isäntämikro-organismiin, joka pystyy il- 25 mentämään seriiniproteaasi-inhibiittorin; » » · d) viljellään isäntämikro-organismia olosuhteissa, jotka ovat sopivia vektorin amplifikaatiolle ja inhibiit-\‘'i torin ilmentymiselle; I lit ',,,ί e) otetaan inhibiittori talteen; ja i ; 30 f) annetaan inhibiittorin omaksua aktiivinen ter- • · tiaarinen rakenne, jolloin sillä on seriiniproteaasi-inhi-biittoriaktiivisuus. ;,· ! 16. Synteettinen tai eristetty DNA-sekvenssi, I I I iti·’ tunnettu siitä, että se pystyy ohjaamaan mikrobis- 35 sa tapahtuvaa yksittäisen polypeptidiketjun käsittävän se- 108943 66 riiniproteaasi-inhibiittorin synteesiä, jossa inhibiittorissa on ainakin yksi aktiivinen kohta, jolla on seriini-proteaasi-inhibiittoriaktiivisuus, ja jolla inhibiittorilla on aminohapposekvenssi 5 Ser-Gly-Lys-Ser-Phe-Lys-Ala-Gly-Val-Cys-Pro-Pro-Lys-Lys-Ser-Ala-Gln-Cys-Leu-Arg-Tyr-Lys-Lys-Pro-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp-Trp-Gln-Cys-Pro-Gly-Lys-Lys-Arg-Cys-Cys-Pro-Asp-Thr-Cys-Gly-10 Ile-Lys-Cys-Leu-Asp-Pro-Val-Asp-Thr-Pro-Asn- Pro-Thr-Arg-Arg-Lys-Pro-Gly-Lys-Cys-Pro-Val-Thr-Tyr-Gly-Gln-Cys-Leu-Met-Leu-Asn-Pro-Pro-Asn-Phe-Cys-Glu-Met-Asp-Gly-Gln-Cys-Lys-Arg-Asp-Leu-Lys-Cys-Cys-Met-Gly-Met-Cys-Gly-Lys-15 Ser-Cys-Val-Ser-Pro-Val-Lys-Ala, tai sen homologin, jolla on seriiniaktivaattori-inhibiit-toriaktiivisuus, synteesiä.
18. 17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen synteettinen 20 tai eristetty DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että » · se on valittu ryhmästä, jonka muodostavat (1) * i « < · · » » 5' AGCGG TAAAA GCTTC AAAGC TGGCG TATGC CCGCC f * · : GAAAA AATCC GCGCA GTGTC TGCGG TACAA AAAAC * · ♦
19. 25 CGGAA TGCCA GTCCG ACTGG CAGTG CCCGG GTAAA i * V·** AAACG TTGTT GCCCG GACAC CTGCG GCATC AAATG CCTGG ATCCG GTTGA TACCC CGAAC CCGAC TCGTC GAAAA CCGGG TAAAT GCCCG GTAAC CTATG GCCAG TGTCT GATGC TGAAC CCGCC GAACT TCTGC GAAAT ti» . 30 GGACG GCCAG TGTAA ACGAG ATCTG AAATG CTGTA t · TGGGT ATGTG CGGCA AATCT TGTGT TTCCC CGGTA > * AAAGC ATAA 3'; * t ;,· * ja (2) geneettisesti ekvivalentit saman proteiinin tuotan- toa ohjaavat sekvenssit. ti» 108945 67
20. 18. Patenttivaatimuksen 16 mukainen synteettinen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se pystyy ohjaamaan yksittäisen polypeptidiketjun käsittävän proteiinin synteesiä mikrobissa, jolla proteiinilla on amino-5 happosekvenssi Ser—Gly—Ly s—Ser—Phe—Lys—Ala—Gly—Vai—Cys— Pro—Pro—Lys—Lys—Ser—Ala—Gin—Cys—Leu—R2— Tyr—Lys—Lys—Pro—Glu—Cys—Gin—Ser—Asp—Trp—
21. 10 Gin—Cys—Pro—Gly—Lys—Lys—Arg—Cys—Cys—Pro— Asp—Thr—Cys—Gly—Ile—Lys—Cys—Leu—Asp—Pro— Vai—Asp—Thr—Pro—Asn—Pro—Thr—Arg—Arg—Lys— Pro—Gly—Lys—Cys—Pro—Vai—Thr—Tyr—Gly—Gin— Cys—R8—R3—R9—Asn—Pro—Pro—Asn—Phe—Cys—Glu—
22. 15 R4—Asp—Gly—Gin—Cys—Lys—Arg—Asp—Leu—Lys—Cys—Cys- R5—Gly—Rft—Cys—Gly—Lys—Ser—Cys—Vai—Ser— Pro—Vai—Lys—Ala, jossa .V; 20 R2, R3, R4, R5, R^ Rg ja R9 ovat samanlaisia tai eri- laisia ja merkitsevät metioniinia, valiinia, alaniinia, • · fenyylialaniinia, tyrosiinia, tryptofaania, lysiiniä, gly- ... siiniä, leusiiniä tai arginiinia. • « * 19. Patenttivaatimuksen 16 mukainen eristetty DNA-25 sekvenssi, tunnettu siitä, että se koodaa yksit- ’·*·* täisen polpeptidiketjun käsittävää seriiniproteaasi-inhi- biittoria, jolla on aminohapposekvenssi • * • « · • » ‘ /. Ser-Gly-Lys-Ser-Phe-Lys-Ala-Gly-Val-Cys-Pro- ; 30 Pro-Lys-Lys-Ser-Ala-Gln-Cys-Leu-Arg-Tyr-Lys- !..* Lys-Pro-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp-Trp-Gln-Cys-Pro- ';* Gly-Lys-Lys-Arg-Cys-Cys-Pro-Asp-Thr-Cys-Gly- • · -,· l Ile-Lys-Cys-Leu-Asp-Pro-Val-Asp-Thr-Pro-Asn- : [: Pro-Thr-Arg-Arg-Lys-Pro-Gly-Lys-Cys-Pro-Val-
23. 3. Thr-Tyr-Gly-Gln-Cys-Leu-Met-Leu-Asn-Pro-Pro- Asn-Phe-Cys-Glu-Met-Asp-Gly-Gln-Cys-Lys-Arg-Asp-Leu-Lys-Cys-Cys-Met-Gly-Met-Cys-Gly-Lys-Ser-Cys-Val-Ser-Pro-Val-Lys-Ala. 108943 68
24. 20. Patenttivaatimuksen 19 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se on cDNA.
25. 21. Patenttivaatimuksen 19 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se on genomi-DNA. I 5 22. Yhdistelmävektori, tunnettu siitä, j että se sisältää patenttivaatimuksen 16, 17, 18, 19, 20 tai 21 mukaisen DNA-sekvenssin.
26. 23. Bakteeri- tai hiiva-isäntäsolu, tunnet-t u siitä, että se on transformoitu patenttivaatimuksen 10 22 mukaisella vektorilla. f • · • · * 1 · · • · · * · · • · • · · · • « * · · • · · » · · • · · * · * · · * 1 1 > I • « · · * · · • · ♦ · · • » · * · · • 1 • I | • 1 1 • ♦ 108943 69