NO301122B1

NO301122B1 - Rekombinant-metoder til produksjon av serinproteaseinhibitorer og DNA-sekvenser for disse

Info

Publication number: NO301122B1
Application number: NO863182A
Authority: NO
Inventors: Pradip K Bandyopadhyay; Stephen P Eisenberg; Gary L Stetler; Robert C Thompson
Original assignee: Amgen Boulder Inc
Priority date: 1984-12-06
Filing date: 1986-08-06
Publication date: 1997-09-15
Also published as: EP0205475A1; NO863182L; GR852940B; JP2683500B2; IL95223A0; AU5202986A; CA1296273C; PT81624B; AU590238B2; DE3587875T2; HUT41442A; IL77227A; IE853083L; PT81624A; FI863188A; EP0205475B1; ATE108205T1; FI863188A0; NO863182D0; FI108943B

Description

Foreliggende oppfinnelse angår fremgangsmåte til fremstilling av en serinproteaseinhibitor, syntetiske DNA-sekvenser, og rekombinante vektorer.

Endogene proteolytiske enzymer tjener til å nedbryte invaderende organismer, antigen-/antistoff-komplekser og visse vevsproteiner som ikke lenger er nyttige for organismen. I en normalt fungerende organisme produseres proteolytiske enzymer i en begrenset mengde og reguleres delvis gjennom syntesen av proteaseinhibitorer.

Et stort antall naturlig forekommende proteaseinhibitorer tjener til å regulere de endogene proteaser ved begrensning av deres reaksjoner lokalt og temporært. Dessuten kan proteaseinhibitorer inhibere proteaser innført i legemet ved infiserende og parasitt-iske agenter. Vev som er spesielt utsatt for proteolytisk angrep og infeksjon, f.eks. de i åndedrettssystemet, er rike på proteaseinhibitorer.

Proteaseinhibitorer omfatter ca. 10 % av de menneskelige plasma-proteiner. Minst åtte inhibitorer er blitt isolert fra denne kilde og er karakterisert i litteraturen. Disse innbefatter

a =-makroglobulin (a=M), ai-proteaseinhibitor (ctiPI), cti-antikymo-trypsin (aiAchy), fli-antikollagenase (fiaAC) og inter-trypsininhibitor (lal).

En forstyrrelse av protease/proteaseinhibitor-balansen kan føre til proteaseforårsaket vevsødeleggelse innbefattet emfysem, artritt, nyrebetennelse, tannrothinnebetennelse, muskeldystrofi, svulstinvasjon og forskjellige andre patologiske forhold. I visse situasjoner, f.eks. alvorlige patologiske prosesser såsom blodforgiftning eller akutt leukemi øker mengden av frie proteolytiske enzymer som foreligger på grunn av frigjøring av enzymer fra sekresjonscellene. I tillegg, eller hver for seg i andre situasjoner, kan en forminsket regulerende inhibitorkapasitet av organismen også bevirke forandringer i protease/proteaseinhibitor-balansen. Et eksempel på en slik forminsket regulerende inhibitorkapasitet er ax-protease-inhibitordefekt som er høyt korrelert med utviklingen av lungeemfysem.

I organismer hvor slike avvikende forhold foreligger kan alvorlig skade på organismen finne sted med mindre forholdsregler kan tas for å regulere de proteolytiske enzymer. Derfor har man søkt etter proteaseinhibitorer som kan gis til en organisme for å regulere de proteolytiske enzymer.

Leukocyttelastase er et eksempel på en serinprotease av særlig interesse fra et farmakologisk synspunkt. Leukocyttelastase, når det frigjøres ekstracellulært nedbryter bindevev og andre verdifulle proteiner. Skjønt det er nødvendig for enhver normalt fungerende organisme å nedbryte en viss mengde bindevev og andre proteiner, har nærværet av en for stor del leucocyttelastase blitt satt i forbindelse med forskjellige patologiske tilstander såsom emfysem og leddgikt. For å motarbeide virkningene av leukokcyttelastase når det foreligger i større mengder enn normalt, har man søkt etter en proteaseinhibitor som er virksom mot leucocytelastase. En slik proteaseinhibitor ville være spesielt verdifull dersom den kunne fremstilles via en rekombinant DNA-metode, i renset form og i tilstrekkelige mengder til å være farmasøytisk nyttig.

Fra før av er minst to leukocyttelastaseinhibitorer blitt identifisert i litteraturen. Et protein beskrevet i Schiessler et al., "Acid-Stable Inhibitors of Granulocyte Neutral Proteases in Human Mucous Secretions: Biochemistry and Possible Biological Function" i Neutral Proteases of Human Polymorphonuclear Leucocytes, Haveman et al. (redaktører), Urban and Schwarzenberg, Inc. (1978), ble isolert fra menneskelig sædplasma og spytt og var karakterisert ved en størrelse på ca. 11 Kda med tyrosin som den N-avsluttende aminosyre. Rapporter i litteraturen om dette protein har bare vist en partiell aminosyresekvens, men selv denne partielle sekvens tyder på at dette protein avviker betraktelig fra proteinene ifølge den foreliggende oppfinnelse. Rapportene om sekvensen for dette protein i kombinasjon med dataene for aminosyresekvens for proteiner ifølge oppfinnelsen tyder på at det produkt som er sekvensert av Schiessler et al. kan ha vært et nedbrutt protein som ikke var en enkelt polypeptid-kjede.

Et annet protein, i et tilfelle isolert fra menneskelig plasma er blitt kalt ai-proteaseinhibitor. Arbeid med dette protein er summert i et sammendrag av Travis og Salvesen, Annual Review of Biochemistry 52: 655-709 (1983). Rapportene for aminosyresekvensen av dette protein tyder på at det også avviker betydelig fra proteinene ifølge den foreliggende oppfinnelse.

På grunn av de betydelige forskjeller i struktur mellom enkeltpolypeptidkjede-proteiner ifølge oppfinnelsen og eventuelle enkeltpolypeptidkjede-serinproteaseinhibitorer i tidligere kjent teknikk er de tidligere kjente enkeltpolypeptidkjede-serinproteaseinhibitorer ikke "stort sett homologe" med proteinene ifølge den foreliggende oppfinnelse.

Trypsin er en annen protease av særlig interesse fra et farmakologisk synspunkt. Trypsin er kjent for å initiere nedbrytning av vev av visse bløte organer så som bukspyttkjertelens vev under en rekke forskjellige akutte tilstander såsom bukspyttkjertelbeten-nelse. Forskjellige anstrengelser har vært gjort med hensyn til behandling av disse forhold uten nevneverdig suksess ved bruken av proteiner som man håpet ville hindre virkningen av trypsin. Illustrative for slike anstrengelser er forsøk på å bruke eksogene storfe-trypsininhibitorer i behandling av menneskelig bukspytt-kj ertelbetennelse. Skjønt slike teknikker er blitt forsøkt i Europa er de ennå ikke blitt godkjent som virkningsfulle av U.S. Food and Drug Administration. Der er således et behov for en proteaseinhibitor som er virksom i å nøytralisere overskytende trypsin i en rekke akutte og kroniske tilstander. På samme måte som det var tilfellet med leukocyttelastaseinihibitoren angitt ovenfor vil en trypsininhibitor være spesielt nyttig dersom den kan isoleres og fremstilles, ved rekombinante DNA-metoder, i en renset form og i tilstrekkelige mengder til å være farmasøytisk nyttig.

Katepsin G er en annen protease som foreligger i store mengder i leukocytter. Katepsin G er kjent for å kunne nedbryte in vitro en rekke verdifulle proteiner, innbefattet dem fra den komplemen-terende rute (complement pathway). Bukspyttelastase er en annen elastase som kan ha en rolle i pankreatitt eller bukspyttkjertel-betennelse. Således er inhibitorer for disse proteaser også av potensiell farmasøytisk verdi.

Leukocyttelastase, trypsin, katepsin G og bukspyttelastase er eksempler på en klasse proteaser kjent som serinproteaser som har elementer av felles struktur og mekanisme. Deres aktivitet overfor forskjellige substrater og deres følsomhet for forskjellige inhibitorer antas å være et resultat av forandringer i bare noen få aminosyrerester. Ved analogi er det mulig å tenke seg en klasse serinproteaseinhibitorer som også har felles elementer av struktur og mekanisme hvor forandringer i forholdsvis få aminosyrer vil føre til inhibisjon av forskjellige proteaser, og at minst ett medlem av denne klasse vil inhibere enhver serinprotease av den ovenfornevnte klasse. Klassen av serinproteaseinhibitorer ville da være av betydelig verdi.

Det er derfor en hensikt å fremstille rekombinant serinproteaseinhibitor.

Denne hensikt er oppnådd med foreliggende oppfinnelse kjennetegnet ved det

som fremgår av kravene.

Det er nå overraskende funnet en DNA-sekvens som kan dirigere syntesen av

en slik serinproteaseinhibitor, hvilken inhibitor er biologisk ekvivalent med en som er isolert fra spyttsekresjoner. Proteaseinhibitoren, fremstilt ved de rekombinante DNA-metoder som er angitt heri, antas å ha minst to aktive seter; ett sete som oppviser inhiberende egenskaper for leukocyttelastaser og et annet sete som oppviser inhiberende aktivitet overfor tryposin.

Den rekombinante inhibitor som fremstilles ved den foreliggende oppfinnelse antas å være bemerkelsesverdig motstandsdyktig for denaturering ved varme og syrer og motstandsdyktig for proteolytisk nedbrytning av en rekke forskjellige proteolytiske enzymer. Uttrykket "rekombinant inhibitor", slik det anvendes i den foreliggende søknad, referer til en proteaseinhibitor som fremstilles ved rekombinant DNA-metodologi og -teknikker. Videre er den aktive form av den rekombinante inhibitor ifølge oppfinnelsen termodynamisk stabil under betingelser som normalt påtreffes ekstracellulært i pattedyrlegemet. Denatuerte former av den rekombinante proteaseinhibitor har også evnen til å danne disulfidbindingene og danne de ikke-kovalente interaksjoner som er nødvendige for å anta en aktiv tertiær struktur i fravær av biokjemisk stimulus.

DNA-sekvensene ifølge oppfinnelsen, angitt i mer detalj nedenunder, kan dirigere syntesen av et protein som avviker meget fra andre publiserte leukocyttelastase inhibitor-sekvenser.

Således har identifikasjonen av DNA-sekvensen ifølge oppfinnelsen gjort mulig oppfinnelsen av rekombinante DNA-metoder til fremstilling av de nye rekombinante proteaseinhibitorer som her er angitt.

Slike rekombinant-metoder tillater fremstilling av inhibitorene i mengder og renheter som er tilstrekkelige til å skaffe økonomiske farmasøytiske blandinger som har serinproteaseinhibitoraktivitet. Videre har identifikasjonen av DNA-sekvensen gjort mulig oppfinnelsen av rekombinante DNA-metoder til fremstilling av analoger av den ovenfor beskrevne serinproteaseinhibitor.

SAMMENDRAG AV OPPFINNELSEN

Oppfinnelsen angår rekombinante DNA-metoder for fremstilling av proteaseinhibitorer generelt, og nærmere bestemt fremstillingen av rekombinante inhibitorer rettet på menneskelige polymorfonukleære (PMN) granulocytt-proteaser. Nærmere bestemt angår oppfinnelsen rekombinante DNA-metoder for fremstilling av inhibitorer for menneskelige serinproteaser innbefattet leukocytelastase og trypsin.

Videre angår oppfinnelsen rekombinante DNA-metoder for fremstillingen av analoger av de foreliggende serinproteaseinhibitorer. Den foreliggende oppfinnelse angår også syntetiske og naturlige DNA-sekvenser som er nyttige i de rekombinante DNA-metoder som er angitt nedenunder.

Det er en hensikt med oppfinnelsen å skaffe en metode for rekombinant DNA-syntese av en serinproteaseinhibitor, hvilken inhibitor er en enkelt polypeptidkjede som oppviser serinproteaseinhibitor-aktivitet. Disse inhibitorer er i besittelse av aktivitet som er biologisk ekvivalent med den aktivitet som oppvises av naturlige leukocyttelastase- eller trypsin-inhibitorer isolert fra menneskelige spyttsekresjoner.

For å lette alternative rekombinante DNA-synteser for disse serinproteaseinhibitorer er det videre en hensikt med oppfinnelsen å skaffe syntetiske DNA-sekvenser som kan dirigere produksjonen av disse rekombinante proteaseinhibitorer, samt ekvivalente naturlige DNA-sekvenser. Slike naturlige DNA-sekvenser kan isoleres fra et cDNA-

eller genomisk arkiv eller bibliotek (library) fra hvilket genet som kan dirigere syntese av proteaseinhibitoren kan identifiseres og isoleres.

Videre er det en hensikt med den foreliggende oppfinnelse å skaffe rekombinante DNA-metoder for fremstillingen av analoger av de proteaseinhibitorer som er angitt ovenfor, og tilsvarende analoge DNA-sekvenser som er nyttige i slike fremgangsmåter.

Ytterligere hensikter og fordeler med oppfinnelsen skal angis i beskrivelsen som følger, og delvis vil de være åpenbare fra beskrivelsen, eller de kan forstås ved utførelse av oppfinnelsen. Hensiktene og fordelene kan realiseres og oppnås ved bruk av de midler og kombinasjoner som særlig er vist i de tilhørende krav.

For å oppnå hensiktene og i overenstemmelse med formålene med den foreliggende oppfinnelse er det oppdaget en DNA-sekvens som kan dirigere produksjonen, ved rekombinant DNA-metodologi, av proteaseinhibitorer som, i sin aktive form, er enkeltpolypeptidkjede-proteiner som oppviser serinproteaseinhibitor-aktivitet. Disse rekombinante proteaseinhibitorer er bemerkelsesverdig motstandsdyktige for denaturering ved varme og syrer. Videre beholder disse proteaseinhibitorer sin biologiske aktivitet selv etter å være utsatt for mange proteolytiske enzymer, såsom kymotrypsin, protease fra underkjeven (submaxillary) hos mus og clostripain.

Kodestrengen for en DNA-sekvens som er funnet å dirigere fremstillingen av disse rekombinante serinproteaseinhibitorer er:

De nukleotider som er representert ved de ovenfor angitte forkortelser er angitt i den detaljerte beskrivelse av den foretrukne utførelsesform.

Kodestrengen for en andre, foretrukket DNA-sekvens som er funnet

å dirigere fremstillingen av disse rekombinante serinproteaseinhibitorer, særlig en sekresjons-leukocyttproteaseinhibitor (SLPI) ifølge oppfinnelsen er:

For videre å oppnå hensiktene og i henhold til formålene med den foreliggende oppfinnelse er en rekombinant DNA-metode beskrevet, som fører til mikrobiell fremstilling av de foreliggende serinproteaseinhibitorer ved bruk av enten de naturlige eller syntetiske DNA-sekvenser som er angitt ovenfor. Denne rekombinante DNA-metode omfatter å: (a) Fremstille en DNA-sekvens som kan dirigere en vertsmikroorganisme til å produsere et protein som har serinproteaseinhibitor-aktivitet, fortrinnsvis leukocyttelastaseinhibitor-aktivitet; (b) Klone DNA-sekvensen inn i en vektor som kan overføres inn i og gjennomgå replikasjon i en vertsmikroorganisme idet en slik vektor inneholder operasjonelle elementer for DNA-sekvensen. (c) Overføre vektoren som inneholder DNA-sekvensen og operasjonelle elementer inn i en vertsmikroorganisme som kan

uttrykke det proteaseinhiberende protein; (d) Dyrke mikroorganismen under betingelser som er riktige for formering av vektoren og ekspresjon av inhibitoren;

(e) Høste inhibitoren; og

(f) Tillate inhibitoren å anta en aktiv tertiær struktur hvorved den er i besittelse av serinproteaseinhibitor-aktivitet.

For å lette identifiseringen og isoleringen av naturlige DNA-sekvenser til bruk i den foreliggende oppfinnelse er der utviklet et cDNA-arkiv over menneskelig spyttkjertelvev. Dette arkiv inneholder den genetiske informasjon som kan dirigere en celle til å syntetisere serinproteaseinhibitorene ifølge oppfinnelsen. Andre naturlige DNA-sekvenser som kan anvendes i rekombinante DNA-metoder som er angitt kan isoleres fra det menneskelige genomiske arkiv.

De syntetiske DNA-sekvenser som er nyttige i fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved polynukleotidsyntese og sekvenseringsteknikker kjent av fagfolk. De naturlige DNA-sekvenser som er nyttige i den foregående prosess kan identifiseres og isoleres gjennom en fremgangsmåte som omfatter: (a) Fremstilling av et menneskelig cDNA-arkiv fra celler, fortrinnsvis spyttkjertelceller(parotid cells) som kan generere en serinproteaseinhibitor; (b) Avsøking av arkivet av menneskelig DNA med minst én sonde som kan binde seg til proteaseinhibitorgenet eller dets proteinprodukt; (c) Identifisering av minst én klon inneholdende det gen som koder for inhibitoren ved hjelp av klonens evne til å binde minst én sonde for genet eller dets proteinprodukt; (d) Isolering av genet som koder for inhibitoren fra den eller de kloner som er identifisert; og (e) Kobling av genet eller egnede fragmenter derav til operasjonelle elementer som er nødvendige for å opprettholde og utvikle genet i en vertsmikroorganisme.

De naturlige DNA-sekvenser som er nyttige i den foregående prosess kan også identifiseres og isoleres gjennom en fremgangsmåte som

omfatter:

(a) Fremstilling av et menneskelig genomisk DNA-arkiv, fortrinnsvis forplantet i en recArecBC E. coli vert; (b) Avsøking av det menneskelige genomiske DNA-arkiv med minst én sonde som kan binde seg til et serinproteaseininhibitor-gen eller dets proteinprodukt; (c) Identifisering av minst én klon inneholdende genet som koder for inhibitoren ved hjelp av klonens evne til å binde minst én sonde for genet eller dets proteinprodukt; (d) Isolering av genet som koder for inhibitoren fra den eller de kloner som er identifisert; og (e) Kobling av genet eller egnede fragmenter derav til operasjonelle elementer som er nødvendige for å opprettholde og uttrykke genet i en vertsmikroorganisme.

Videre, for å oppnå hensiktene og i henhold til formålene med

den foreliggende oppfinnelse, kan farmasøytisk nyttige analoger av serinproteaseinhibitoren fremstilles ved den ovenfor angitte rekombinante DNA-metode ved at den syntetiske DNA-sekvens eller det naturlige DNA-segment forandres via rekombinante DNA-teknikker for å danne et gen som kan indusere ekspresjon av den ønskede analog når den er klonet inn i en passende vektor og overført inn i en passende vertsmikroorganisme.

Videre, for oppnåelse av hensiktene og i henhold til formålene med den foreliggende oppfinnelse, er det beskrevet farmasøytiske blandinger inneholdende, som en aktiv ingrediens, en rekombinant proteaseinhibitor i henhold til den foreliggende oppfinnelse eller dens biologisk aktive.analog fremstilt ved de ovenfor angitte rekombinante DNA-metoder.

De ledsagende tegninger som innlemmes heri og utgjør en del

av søknaden, viser forskjellige plasmider som er nyttige i oppfinnelsen og som sammen med beskrivelsen tjener til å forklare oppfinnelsens prinsipper.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Figur 1 er et kart av plasmid pSGE6

Figur 2 er et kart av plasmid pSGE8

Figur 3 er et kart av plasmid pGS285

Figur 4 er et kart av plasmid pGS485.

BESKRIVELSE AV DE FORETRUKNE UTFØRELSESFORMER

En beskrivelse i detalj skal nå gis av de for tiden foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen som sammen med det følgende eksempel tjener til å forklare oppfinnelsens prinsipp.

Som angitt ovenfor angår oppfinnelsen proteaseinhibitorer som er blitt isolert i en renset form. Fortrinnsvis er serinproteaseinhibitorene i følge- oppfinnelsen enkeltpolypeptidkjede-proteiner som er stort sett homologe med og helst biologisk ekvivalente med naturlige serinproteaseinhibitorer isolert fra menneskelige spyttsekresjoner. Med "biologisk ekvivalent" slik det anvendes i beskrivelsen og kravene skal det forstås at blandingene kan hindre proteaseindusert vevskade av samme type, men ikke nødvendigvis i samme grad som den naturlige proteaseinhibitor. Ved "stort sett homolog" slik det er anvendt i den etterfølgende beskrivelse og krav, skal forstås en grad av homologi med den naturlige spyttinhibitor som overstiger den som oppvises av tidligere rapporterte enkelt-polypeptid-kj ede-serinproteaseinhibitor-proteiner. Fortrinnsvis er graden av homologi i overkant av 40%, helst mer enn 50% og en særlig foretrukket gruppe proteiner er mer enn 60% homolog med den naturlige spyttinhibitor. Den prosentvise homologi som beskrevet ovenfor er beregnet som prosentandelen komponenter funnet i den minste av de to sekvenser som også kan finnes i den største av de to sekvenser idet en komponent skal forstås som en sekvens av fire tilstøtende aminosyrer.

Foretrukkede proteaseinhibitorer fremstilt ved de foreliggende rekombinante fremgangsmåter er beskrevet i US patentsøknad nr. 678,823 av Robert C. Thompson et al. med tittelen "Serine Protease Inhibitors and Methods of Isolation of Same" innlevert 06.12.1984, og US Patentsøknad nr. 803 423 som nå har ført til patent med nr. 4 760 130 av Robert C. Thompson et al. med tittelen "Serine Protease Inhibitors and Methods for Isolation of Same" innlevert samme dato. Slike proteaseinhibitorer er bemerkelsesverdig motstandsdyktige for denaturering ved varme og syrer og motstandsdyktige for tap av aktivitet når de utsettes for mange proteolytiske enzymer innbefattet kymotrypsin, underkjeveprotease fra mus og clostripain. Disse inhibitorer har også evnen til å danne de nødvendige disulfidbindinger og gjennomgå de riktige ikke-kovalente interaksjoner for å anta en aktiv tertiær struktur som kan uttrykke serinproteaseinhibitor-aktivitet i fravær av en.biokjemisk stimulus eller, dersom disulfidbindingene er blitt brutt og de ikke-kovalente interaksjoner er avbrutt, til å re-danne slike bindinger og interaksjoner for å gjenvinne slik aktiv tertiær struktur i fravær av biokjemisk stimulus.

En foretrukket serinproteaseinhibitor som har disse egenskaper er blitt sekvensert. Sekvensen ble ved bestemmelse funnet å være som følger:

De følgende forkortelser svarer til aminosyrerestene i poly-peptidet som følger:

Det er funnet at disse proteaseinhibitorer fremstilt ved de rekombinante DNA-metoder som her er beskrevet har mer enn ett bestemt domene. Med mer enn ett bestemt domene menes det at proteinet har flere aktive seter som er funksjonelle mot forskjellige enzymer. Nærværet og plasseringen av disse seter er blitt bestemt ved oppdagelsen av en betydelig homologi mellom minst to partier av proteaseinhibitoren. Det antas at nærværet av bestemte domener meddeler de foreliggende proteaseinhibitorer evnen til å inhibere en rekke forskjellige serinproteaser som omfatter både leukocyttelastase og trypsin.

Det er videre funnet at på grunn av flerheten av bestemte domener av disse proteaseinhibitorer kan proteaseinhibitorene tjene som rammer på hvilke andre aktive seter kan konstrueres for å danne proteaseinhibitorer som har ytterligere egenskaper. Den foretrukne utførelsesform av oppfinnelsen omfatter produksjon av en proteaseinhibitor som inhiberer leukocyttelastase, catepsin G, bukspyttelastase og trypsin. Disse enzymer er alle medlemmer av en klasse proteaser kjent som serinproteaser som deler en felles mekanisme og mange strukturelle trekk. Det antas at gjennom manipulasjon av noen få aminosyre-sidekjeder på proteaseinhibitorene fremstilt ved den forliggende oppfinnelse, kan en rekke inhibitorer fremstilles som hver er i stand til å inhibere minst ett medlem av hele klassen serinproteaser. Videre kan slike sidekjedemodifikasjoner ventes å gi en rekke inhibitorer som har forbedrede inhibitoriske egenskaper med hensyn til spesielle medlemmer av klassen serinproteaser beskrevet ovenfor. Forandringer i aminosyre-sidekjeden som er nødvendige for oppnåelse av disse mål er antydet ved visse elementer av strukturell likhet mellom den foretrukne inhibitor fremstilt ved den foreliggende oppfinnelse og andre serinproteaseinhibitorer for hvilke den viktige funksjonelle del av inhibitoren er blitt belyst gjennom røntgenkrystallografi. Disse elementer av strukturell likhet inkluderer aminosyrer 17 - 29 og aminosyrer 70 - 83 av den foretrukne serinproteaseinhibitor fremstilt ved den foreliggende oppfinnelse beskrevet ovenfor. Forandringene foreslått for å forbedre inhibitorens aktivitet enten ved mengde eller kvalitet overfor trypsinliknende serinproteaser innbefatter å forandre en eller flere av aminosyre 20 fra Arg til Lys, aminosyre 72 eller 74 fra Leu til Lys eller Arg og aminosyre 73 fra Met til Lys eller Arg,

Forandringene foreslått for å forbedre inhibitorens aktivitet enten ved mengde eller kvalitet overfor kymotrypsin-liknende serinproteaser innbefattet katepsin G omfatter å forandre en eller flere av aminosyre 20 fra Arg til Phe, Tyr eller Trp, aminosyre 72 eller 74 fra Leu til Phe, Tyr eller Trp, og aminosyre 73 fra Met til Phe, Tyr eller Trp.

Forandringene foreslått for å forbedre inhibitorens aktivitet enten ved mengde eller kvalitet overfor bukspyttelastaseliknende serinproteaser omfatter å forandre en eller flere av aminosyre 20 fra Arg til Ala, aminosyre 72 eller 74 fra Leu til Ala og aminosyre 73 fra Met til Ala.

En må huske ved utførelse av den foreliggende oppfinnelse at forandringen av aminosyresekvensene for å meddele de foreliggende proteiner nye proteaseinhiberende egenskaper kan forstyrre inhibitorens aktivitet overfor leukocyttelastase eller overfor trypsin. Slike virkninger kan bestemmes ved rutinemessige forsøk i henhold til det som er angitt i den foreliggende oppfinnelse.

Videre antas det at substitusjon av visse aminosyrer eller av visse sekvenser av aminosyrer, som angitt ovenfor, kan fremme de foreliggende proteaseinhibitorers inhibitoriske egenskaper overfor enten leukocyttelastase eller trypsin, mens noe av aktiviteten av det domene som ikke er fremmet ofres. Aktiviteten av et hvilket som helst domene inne i inhibitorproteinet kan i virkeligheten elimineres fullstendig ved riktige aminosyre-substitusj oner, hvorved man danner inhibitorproteiner som er spesifikke for ett eller annet undersett av enzymene overfor hvilke proteinet normalt er aktivt. For eksempel, substitusjon av Gly for Arg i stilling 20 deaktiverer det trypsininhiberende domene, mens substitusjon av Gly for Met i 73-stillingen eller for Leu i 72- eller 74-stillingen deaktiverer det inhiberende domene for leukocyttelastase. Domenene kan også separeres i adskilte proteiner som hver beholder de ønskede inhiberende funksjoner. De foreliggende krav strekker seg til andre prosesser for fremstilling av slike inhibitorer ved disse fremgangsmåter.

Det er nå funnet en syntetisk DNA-sekvens som kan dirigere intracellulær produksjon av de ovenfor angitte proteaseinhibitorer. Denne sekvens har den følgende struktur:

der de følgende nukleotider er representert ved forkortelsene angitt nedenunder.

Det er nå oppdaget en andre, foretrukket DNA-sekvens som kan dirigere ekstracellulær produksjon av de ovenfor angitte proteaseinhibitorer, særlig den sekresjons-leukocyttproteaseinhibitor (SLPI) som er angitt ovenfor. Denne sekvens har den følgende struktur:

På grunn av multippel domenestruktur av de foreliggende proteaseinhibitorer, som angitt ovenfor, regner man med variasjoner i den syntetiske DNA-sekvens som her er angitt, hvilket vil føre til en DNA-sekvens som kan dirigere produksjonen av serinproteaseinhibitor-analogene, som angitt ovenfor. Nærmere bestemt har foretrukne analoger av serinproteaseinhibitorene fremstilt ved rekombinante DNA-teknikker i henhold til den foreliggende oppfinnelsen den følgende aminosyresekvens:

hvor

R og R^ er de samme eller forskjellige og er valgt fra gruppen bestående av en substituert eller usubstituert aminosyrerest eller derivat derav; og

R2, R3, Pvt, R5 og Rg, Rg og Rj er de samme eller forskjellige og er valgt fra gruppen bestående av metionin, valin, alanin, fenylalanin, tyrosin, tryptofan,

lysin, glycin og arginin; og R8 og Rg er like eller forskjellige og er selektert fra gruppen som består av metionin, valin, alanin, fenylalanin, tyrosin,

tryptofan, lysin, glycin, leucin og arginin.

Det skal bemerkes at DNA-sekvensen som er angitt ovenfor representerer en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen. På grunn av degenerering av den genetiske kode skal det forstås at forskjellige valg av nukleotider kan gjøres som vil føre til en DNA-sekvens som kan dirigere produksjonen av de foreliggende proteaseinhibitorer eller deres analoger. Som sådanne er DNA-sekvenser som er funksjonelt ekvivalente med sekvensen angitt ovenfor, eller som er som er funksjonelt ekvivalente med sekvenser som dirigerer produksjonen av analoger av proteaseinhibitoren fremstilt i henhold til aminosyresekvensen angitt ovenfor, beregnet på å falle innenfor den foreliggende oppfinnelse. Som et eksempel på de kodonsubstitusj oner som man kan tenke seg som et resultat av den degenererte genetiske kode, representerer det følgende diagram ytterligere DNA-sekvenser som er ment å innlemmes innenfor oppfinnelsens omfang for fremstilling av den foretrukne aminosyresekvens som er angitt ovenfor. Ved å følge eksempelet for bestemmelse av ekvivalente DNA-sekvenser for fremstilling av dette protein vil fagfolk også være istand til å bestemme ekvivalente DNA-sekvenser for fremstilling av analoger av den foretrukne aminosyresekvens.

I den ovenfor angitte sekvens anvendes forkortelser som representerer nukleotidene angitt nedenunder.

Ved valg av kodoner for bruk i de syntetiske DNA-sekvenser ifølge oppfinnelsen, innbefattet det som er angitt like ovenfor, foretrekkes det at de kodoner som anvendes til å indikere en spesiell aminosyre er de som er forbundet med høyt uttrykte proteiner. Eksempler på disse foretrukne kodoner er tildels angitt i Grant-ham, R. et al., "Codon Catalog Usage Is a Genome Strategy Modu-lated For Gene Expressivity" i Nucleic Acids Research 9_:r43

(1981). Den foretrukne DNA-sekvens ifølge oppfinnelsen ble valgt ved selektering av Escherichia coli-sekvenskodoner for hvilket som helst av de degenererte sekvenser.

Dessuten er det ønskelig å velge kodoner som letter forandringen av den syntetiske DNA-sekvens for å konstruere ytterligere syntetiske DNA-sekvenser som kan dirigere produksjonen av analoger av de foreliggende proteaseinhibitorer. Særlig foretrekkes det at nukleotidsekvenser velges som om mulig danner restriksjonsendonuklease-seter på eller like ved posisjoner i den syntetiske DNA-sekvens inn i hvilken det kan være ønskelig å innføye ytterligere kodoner eller på hvilke seter det kan være ønskelig å skifte ut et kodon slik at analoger kan dannes. I den foretrukne utførelsesform av DNA-sekvensen ifølge oppfinnelsen, er restrik-sjonssetene antydet nedenfor nukleotidsekvensen angitt ovenfor.

Fremgangsmåter til å danne de syntetiske DNA-sekvenser som man her tenker seg, ligger innenfor området av rutinemessige arbeids-oppgaver utført av en med vanlig innsikt i faget og veiledet ved den foreliggende beskrivelse. Et eksempel på en egnet fremgangsmåte som kan anvendes for å oppnå den syntetiske DNA-sekvens som her er beskrevet er angitt i Matteacci, M.D. og Caruthers, M.H., J.Am.Chem.Soc. 103:3185 (1981 ) og Beaucage, S.L. og Caruthers, M.H., Tetrahedron Lett. 22/.1 859 (1981 ), som begge er spesielt innlemmet som referanse heri.

I en annen utførelsesform av oppfinnelsen, er en DNA-sekvens blitt isolert fra et menneskelig genomisk arkiv som koder for en foretrukket sekresjon-leucocyttproteaseinhibitor (SLPI) ifølge oppfinnelsen. Denne sekvens, som koder fra det fjerde kodon og innbefatter intronene som tidligere kjent for oppfinnerne, er som følger:

I denne sekvens er forkortelsene som er brukt for aminosyrerestene de forkortelser på én bokstav som er vanlig anvendt, og som kan finnes f.eks. i Biochemistry av A.L. Lehninger, 2. utgave, Worth Publishers, Inc., New York, New York (1976), side 72.

Ved bruk av denne sekvens og aminosyresekvens-dataene inneholdt heri kan en syntetisk DNA-sekvens konstrueres som når den settes til den genomiske sekvens ovenfor fører til et gen som koder for hele proteaseinhibitoren. Alternativt kan sonder konstrueres ved bruk av DNA-sekvensen angitt ovenfor og brukes til å ta ut et DNA-segment fra et menneskelig genomisk arkiv som har kodoner for de første tre aminosyrer.

Dessuten kan slike sonder brukes til å identifisere en menneskelig genomisk sekvens som inneholder en passende ledersekvens. Det antas at denne ledersekvens eller en hvilken som helst annen passende ledersekvens kan brukes i tilslutning til denne genomiske DNA-sekvens i et pattedyr-ekspresjonssystem.

I en annen alternativ utførelsesform av oppfinnelsen, er en cDNA-klon blitt

isolert fra et spyttarkiv som koder for en DNA-sekvens som kan dirigere intracellulær produksjon av en foretrukket sekresjons-leukocyttprotease-

inhibitor ifølge oppfinnelsen.

En rekombinant DNA-metode for fremstillingen av en proteaseinhibitor bestående av en enkelt polypeptidkjede med minst ett aktivt sete som har serinproteaseinhibitor-aktivitet er angitt. I en utførelse av oppfinnelsen fungerer aktivsete-funksjonene på en måte som er biologisk ekvivalent med den for naturlig leukocyttelastaseinhibitor isolert fra menneskelige spyttkjertelsekresjoner. En naturlig eller syntetisk DNA-sekvens kan brukes til å dirigere produksjonen av proteaseinhibitorene. Denne fremgangsmåte omfatter å: (a) Fremstille en DNA-sekvens som kan dirigere en vertsmikroorganisme til å produsere et protein som har serinproteaseinhibitor-aktivitet; (b) Klone DNA-sekvensen inn i en vektor som kan overføres inn i og gjennomgå replikasjon i en vertsmikroorganisme idet en slik vektor inneholder operasjonelle elementer for DNA-sekvensen; (c) Overføre vektoren som inneholder den syntetiske DNA-sekvens og operasjonelle elementer inn i en vertsmikroorganisme som kan uttrykke proteaseinhibitoren; (d) Dyrke.mikroorganismen under betingelser som er riktige for formering av vektoren og ekspresjon av inhibitoren;

(e) Høste inhibitoren, og

(f) Tillate inhibitoren å anta en aktiv tertiærstruktur hvorved den er i besittelse av serinproteaseinhibitor-aktivitet.

Syntetiske DNA-sekvenser som man kan tenke seg til bruk i denne fremgangsmåte er angitt i detalj ovenfor. Man tenker seg videre i en alternativ utførelsesform at de naturlige DNA-sekvenser også kan anvendes i denne fremgangsmåte. Disse sekvenser innbefatter cDNA- eller genomiske DNA-segmenter. I en foretrukket versjon av denne utførelsesform, antas det at den naturlige DNA-sekvens vil fås ved en fremgangsmåte omfattende: (a) Fremstilling av et menneskelig cDNA-arkiv fra celler, fortrinnsvis spyttkjertelceller, som kan generere en serinproteaseinhibitor; (b) Avsøking av det menneskelige DNA-arkiv med minst én sonde som kan binde seg til proteaseinhibitor-genet eller dets proteinprodukt; (c) Identifisering av minst én klon, inneholdende det gen som koder for inhibitoren ved hjelp av klonens evne til å binde minst én sonde for genet eller dets proteinprodukt; (d) Isolering av genet som koder for inhibitoren fra den eller de kloner som velges; og (e) Kobling av genet eller egnede fragmenter derav til operasjonelle elementer som er nødvendige for å opprettholde og uttrykke genet i en vertsmikroorganisme.

De naturlige DNA-sekvenser som er nyttige i den ovenfor angitte fremgangsmåte, kan også identifiseres og isoleres ved en metode omfattende: (a) Fremstilling av et menneskelig genomisk DNA-arkiv, fortrinnsvis forplantet i en recArecBC E. coli-vert. (b) Avsøking av det menneskelige genomiske DNA-arkiv med minst én sonde som kan binde seg til et serinproteininhibitor-gen eller dets proteinprodukt; (c) Identifisering av minst én klon, inneholdende det gen som koder for inhibitoren ved hjelp av klonens evne til å binde minst én sonde for genet eller dets proteinprodukt; (d) Isolering av genet som koder for inhibitoren fra den eller de kloner som er identifisert; og (e) Kopling av genet eller egnede fragmenter derav til operasjonelle elementer som er nødvendige for å opprettholde og uttrykke genet i en vertsmikroorganisme.

Ved isolering av en naturlig DNA-sekvens egnet til bruk i metoden ovenfor, foretrekkes det å identifisere de to restriksjonsseter som er anordnet inne i og nærmest endepartiene av det riktige gen eller seksjoner av genet. DNA-segmentet inneholdende det riktige gen blir deretter fjernet fra resten av det genomiske materiale ved bruk av riktige restriksjonsendonukleaser. Etter kutting blir 3'- og 5<1->endene av DNA-sekvensen rekonstruert for å skaffe riktige DNA-sekvenser som kan kode for N- og C-endepunktene av serinproteaseinhibitor-proteinet og kan føye DNA-sekvensen til dets operasjonelle element.

De vektorer som tenkes brukt i den foreliggende oppfinnelse innbefatter hvilke som helst vektorer som en DNA-sekvens som angitt ovenfor kan føyes inn i, sammen med hvilke som helst foretrukne eller ønskede operasjonelle elementer og hvilken vektor deretter kan overføres inn i en vertsmikroorganisme og gjennomgå replikasjon i en slik mikroorganisme. Foretrukne vektorer er de hvis restriksjonsseter er blitt grundig dokumentert, og som inneholder de operasjonelle elementer som foretrekkes eller kreves for transkripsjon av DNA-sekvensen.

Uttrykket "operasjonelle elementer" slik det her er brukt innbefatter minst én promotor, minst én operator, minst én ledersekvens og minst én Shine-Dalgarno sekvens, minst ett avslutnings-kodon og hvilke som helst andre DNA-sekvenser som er nødvendige eller foretrukne for riktig transkripsjon og etterfølgende translasjon av vektor-DNA. Nærmere bestemt antas det at slike vektorer vil inneholde minst ett replikasjonsorigo, som gjenkjen-nes av vertsmikroorganismen sammen med minst én selekterbar markør og minst én promotorsekvens som kan initiere transkripsjon av den syntetiske DNA-sekvens. Det foretrekkes dessuten at vektorer, i én utførelsesform, inneholder visse DNA-sekvenser som kan fungere som regulatorer og andre DNA-sekvenser som kan kode for regulator-protein. Disse regulatorer, i en utførelsesform, tjener til å hindre ekspresjon av den syntetiske DNA-sekvens i nærvær av visse miljøbetingelser, og i nærvær av andre miljøbetingelser tillater de transkripsjon og etterfølgende ekspresjon av det protein som er kodet for ved den syntetiske DNA-sekvens. Særlig foretrekkes det at regulerende segmenter innføyes i vektoren slik at ekspresjonen av det syntetiske DNA ikke vil finne sted i fravær av f.eks. isopropyltio- -d-galaktosid. I denne situasjon kan de transformerte mikroorganismer inneholdende det syntetiske DNA dyrkes til en ønsket tetthet før initiering av ekspresjonen av proteaseinhibitoren. I denne utførelsesform blir ekspresjon av den ønskede proteaseinhibitor indusert ved tilsetning av et stoff til det mikrobielle miljø som er i stand til å forårsake ekspresjon av DNA-sekvensen etter at den ønskede tetthet er blitt oppnådd.

Videre foretrekkes det at en passende sekresjons-ledersekvens foreligger, enten i vektorene eller i 5'-enden av den syntetiske DNA-sekvens. Ledersekvensen er i en posisjon som tillater den å slutte helt opp til begynnelsespartiet av en nukleotidsekvens som kan dirigere ekspresjon av proteaseinhibitoren uten noen inter-venerende translasjonsavslutningssignaler. Nærværet av ledersekvensen er ønskelig tildels for en eller flere av de følgende grunner: 1) Nærværet av ledersekvensen kan lette vertsbehandling av det opprinnelige produkt til den modne rekombinante proteaseinhibitor. 2) Nærværet av ledersekvensen kan lette rensingen av de rekombinante proteaseinhibitorer ved å dirigere proteaseinhibitoren ut av cellecytoplasmaet. 3) Nærværet av ledersekvensen kan virke inn på evnen av den rekombinante proteaseinhibitor til å folde seg til sin aktive struktur ved å dirigere proteaseinhibitoren ut av cellecytoplasmaet.

Nærmere bestemt kan ledersekvensen alltid dirigere kløyving av det opprinnelige translasjonsprodukt ved lederpeptidase for å fjerne ledersekvensen og etterlate et polypeptid med den foretrukne aminosyresekvens som har potensial for serinproteaseinhiberende aktivitet. I visse arter av vertsmikroorganismer vil nærværet av den riktige ledersekvens tillate transport av det fullførte protein inn i det periplasmatiske rom som i tilfellet med E. coli.

I tilfellet for visse gjærsorter og stammer av Bacilli og Pseudomonas vil den riktige ledersekvens tillate transport av proteinet gjennom cellemembranet og inn i det ekstracellulære medium. I denne situasjon kan proteinet renses fra ekstracellulært protein.

For det tredje, hva angår noen av proteaseinhibitorene fremstilt ved den foreliggende oppfinnelse, kan nærværet av ledersekvensen være nødvendig for å lokalisere det ferdige protein i et miljø hvor det kan folde seg for å anta sin aktive struktur, hvis struktur innehar den riktige elastaseinhibitor-aktivitet.

Ytterligere operasjonelle elementer innbefatter, men er ikke begrenset til, ribosom-bindingsseter og andre DNA-sekvenser som er nødvendige for mikrobiell ekspresjon av fremmedproteiner. I en fortrukket utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse, ville sekvensen GAGGCGCAAAAA(ATG) blitt brukt som ribosom-bindingssete. De operasjonelle elementer slik de her er diskutert, velges rutinemessig av fagfolk i lys av kjent litteratur og de retningslinjer som her er gitt. Generelle eksempler på disse operasjonelle elementer er angitt i B. Lewin, Genes, Wiley & Sons, New York (1983). Vektorene man her kan tenke seg kan konstrueres tildels fra deler av plasmider pBR322 og/eller pIQ.

I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen, blir en ytterligere DNA-sekvens plassert straks før den syntetiske DNA-sekvens som koder for proteaseinhibitoren. Den ytterligere DNA-sekvens kan fungere som et translasjonelt koplingselement, dvs. den er en DNA-sekvens som koder for et RNA som tjener til å plassere ribosomer helt i tilslutning til ribosom-bindingssetet av proteaseinhibitor -RNA som den støter opp til. I en utførelsesform av oppfinnelsen kan translasjonskobleren avledes ved bruk av DNA-sekvensen TAACGAGGCGCAAAAAATGAAAAAGACAGCTATCGCGATCGGAGTGTAAGAAATG og fremgangsmåter som for tiden er kjent for fagfolk angående translasjonskoblere. En annen foretrukket translasjonskobler har DNA-sekvensen TAACGAGGCGCAAAAAATGAAAAAGACAGCTATCGCGATCAAGGAG-AAATAAATG.

Ved syntese og isolasjon av alle nødvendige og ønskelige kompo-nentdeler av den ovenfor angitte vektor, blir vektoren sammensatt ved fremgangsmåter generelt kjent for fagfolk. Sammensetningen av slike vektorer antas å ligge innenfor de plikter og arbeids-oppgaver som utføres av folk med vanlig kjennskap til faget, og som sådan kan de utføres uten overdreven eksperimentering. F.eks. er DNA-sekvenser er blitt ligatisert inn i riktige klonings-vektorer, som angitt i Schoner et al., Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 81:5403-5407 (1984).

Ved konstruksjon av kloningsvektoren ifølge oppfinnelsen skal det dessuten bemerkes at flere kopier av den syntetiske DNA-sekvens og dens ledsagende operasjonelle elementer kan innføyes i hver vektor. I en slik utførelsesform vil vertsorganismen produsere større mengder pr. vektor av den ønskede proteaseinhibitor. Antallet multippel kopier av DNA-sekvensen som kan innføyes i vektoren er begrenset bare av den resulterende vektors evne, som skyldes dens størrelse, til å overføres inn i og gjennomgå

replikasjon og transkripsjon i en egnet vertsmekanisme.

Dessuten foretrekkes det at vektoren inneholder en selekterbar markør såsom en medikamentresistent markør, eller annen markør som bevirker ekspresjon av et selekterbart trekk ved vertsmikroorganismen. I en særlig foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen blir genet for tetracyklinmotstand fortrinnsvis innlemmet på kloningsvektoren.

En slik medikamentsmotstandsevne eller annen selekterbar markør er ment delvis å lette seleksjonen av transformanter. Dessuten kan nærværet av en slik selekterbar markør på kloningsvektoren være nyttig for å holde forurensende mikroorganismer fra å formere seg i dyrkingsmediet. I denne utførelsesform blir en slik ren kultur av de transformerte vertsorganismer oppnådd ved dyrking av mikroorganismene under betingelser som krever den induserte fenotype for å overleve.

Vektoren som således fås blir deretter overført inn i den riktige vertsmikroorganisme. Det antas at en hvilken som helst mikroorganisme som har evnen til å ta opp eksogent DNA og uttrykke disse gener og ledsagende operasjonelle elementer kan velges. Det foretrekkes at vertsmikroorganismen er en fakultativ anaerob eller en aerob. Spesielle verter som det kan være gunstig å bruke i denne fremgangsmåte innbefatter gjærsorter og bakterier. Spesielle gjærsorter omfatter dem fra slekten Saccharomyces og særlig Saccharomyces cerevisiae. Spesielle bakterier omfatter dem fra slekten BacilluS/ Escherichia og Pseudomonas, særlig Bacillus subtilis og Escherichia coli.

Etter at en vertsorganisme er blitt valgt, blir vektoren overført inn i vertsorganismen ved bruk av fremgangsmåter som er generelt kjent for fagfolk. Eksempler på slike metoder kan finnes i Advanced Bacterial Genetics av R.W. Davies et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, (1980). Det foretrekkes i en utførelsesform at overføringen skjer ved lave tempera-turer, da temperaturregulering anses som en måte å regulere genekspresjonen på ved bruk av operasjonelle elementer som angitt ovenfor. I en annen utførelsesform, dersom osmolare regulatorer er blitt innsatt i vektoren, vil regulering av saltkonsentra-sjonene under transformasjonen være nødvendige for å sikre riktig kontroll over de syntetiske gener.

Dersom det antas at de rekombinante serinproteaseinhibitorer til slutt vil bli uttrykt i gjær, foretrekkes det at kloningsvektoren først overføres inn i Escherichia coli, hvor vektoren tillates å gjennomgå replikasjon og fra hvilken vektoren kan oppnås og renses etter forøkelse. Vektoren vil siden bli overført inn i gjæren for den endelige ekspresjon av serinproteaseinhibitoren.

Vertsmikroorganismene dyrkes under betingelser som er riktige for ekspresjonen av serinproteaseinhibitoren. Disse betingelser er generelt spesifikke for vertsorganismen, og kan lett bestemmes av fagfolk i lys av publisert litteratur angående dyrkingsbetingelser for slike organismer, f.eks. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. utgave, Williams & Wilkins Company, Baltimore, Maryland.

Hvilke som helst betingelser som er nødvendige for regulering av ekspresjonen av DNA-sekvensen, avhengig av eventuelle operasjonelle elementer som er innføyet i eller foreligger i vektoren, vil gjelde ved transformasjonen og dyrkingstrinnene. I én utførelses-form dyrkes cellene til en høy tetthet i nærvær av de riktige regulerende betingelser, hvilke hindrer ekspresjonen av DNA-sekvensen. Når optimal celletetthet oppnås, blir de miljømessige betingelser forandret til dem som er riktige for ekspresjon av den syntetiske DNA-sekvens. Det antas således at produksjonen av proteaseinhibitoren finner sted i et tidsrom som følger etter dyrkingen av vertscellene til nær optimal tetthet, og at den resulterende proteaseinhibitor høstes på et tidspunkt etter at de regulerende betingelser som er nødvendige for dens ekspresjon ble innført.

I en foretrukket utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse, blir den rekombinante proteaseinhibitor renset etter høsting, og før antagelse av dens aktive struktur. Denne utførelsesform foretrekkes da man tror at utvinning av et refoldet protein med høyt utbytte lettes dersom proteinet først renses. I en foretrukket alternativ utførelsesform, kan imidlertid proteaseinhibitoren tillates å refolde for antagelse av sin aktive struktur før rensing. I nok en annen foretrukket alternativ utførelsesform foreligger proteaseinhibitoren i sin refoldede aktive tilstand ved utvinning fra dyrkingsmediet.

Under visse omstendigheter vil proteaseinhibitoren anta sin riktige aktive struktur ved ekspresjon i vertsmikroorganismen, og transport av proteinet gjennom celleveggen eller membranen eller inn i det periplasmatiske rom. Dette vil generelt finne sted dersom DNA-koding for en riktig ledersekvens er blitt koblet til DNA-kodingen for det rekombinante protein. Dersom proteaseinhibitoren ikke antar sin riktige, aktive struktur, vil eventuelle disulfidbindinger som er blitt dannet, og/eller eventuelle ikke-kovalente interaksjoner som har funnet sted først avbrytes ved denaturering- og reduksjonsmidler, f.eks. guanidinklorid og -merkaptoetanol, før proteaseinhibitoren tillates å anta sin aktive struktur etter fortynning og oksidasjon av disse midler under regulerte betingelser.

Det skal forstås at anvendelse av veiledningen i følge oppfinnelsen på et spesielt problem eller miljø vil ligge innenfor evnene til personer med alminnelig innsikt i faget, i lys av de retningslinjer som her er gitt. Eksempler på produktene ifølge oppfinnelsen og representative fremgangsmåter for deres isolasjon og fremstilling er gitt i det følgende eksempel.

EKSEMPEL 1

På grunnlag av den aminosyresekvens som er beskrevet ovenfor, kodonbruken i høyt uttrykte gener av Escherichia coli og at der skaffes passende restriksjonsendonuklease-kløyvingsseter, ble den følgende DNA-sekvens foreslått:

For å regulere ekspresjonen av proteinet i en form som er egnet for utførsel til periplasmaet av E. coli ble de følgende regulerende elementer foreslått: en tac-promotor for initiering av transkripsjon på høye nivåer; en lac-operator for transkripsjonsregulering; en lac-undertrykker (lac I"), som skal kodes et annet sted på plasmidet; en OmpA-Shine-Dalgarno-sekvens for å initiere translasjon på et høyt nivå; en OmpA-leder for å lette periplasmatisk utførsel av produktet; en Ala av en Ala-Ser-forbindelse mellom proteinsekvensen kodet for av disse operatorelementer, og det som er kodet for av de strukturelle gener beskrevet ovenfor for å diktere kløyving av det opprinnelige produkt for å gi den modne leukocyttelastaseinhibitor. Alle disse trekk er innlemmet i den følgende DNA-sekvens:

For å regulere ekspresjonen av proteinet i en form slik at proteinet forblir i E. coli cytoplasmaet foreslås de følgende operasjonelle elementer: tac-promotoren, lac-operatoren og lac-undertrykkeren (lac I"); en samstemmighet av Shine-Dalgarno-sekvensene, og, for å initiere et høyt translasjonsnivå, at et fragment av OmpA-lederpeptidet brukes som en translasjonskobler. Translasjonskoblingssekvensen omfatter det DNA som koder for translasjonsinitieringsområdet av OmpA-genet, de første åtte aminosyrer av OmpA-lederpeptidet, den samstemte Shine-Dalgarno-sekvens beskrevet ovenfor, og en translasjonsavslutter. Transla-sj onskoblingssekvensen skal innføyes mellom promotoren og transla-sj onsinitieringssetet av serinproteaseinhibitor-genet, og overlapper det sistnevnte. Alle disse trekk er innlemmet i den følgende DNA-sekvens:

A. Konstruksjon av genfragmenter

For å konstruere de ovenfor angitte sekvenser ble de følgende deoksyribonukleotider syntetisert ved bruk av ABI DNA-syntetisator (Foster City, California). Produktene renses ved polyakrylamidgel-elektroforese som beskrevet i veiledningen for ABI-instru-mentet. De er 5<1->fosforylert ved anvendelse av T4-polynukleotid-kinase og ATP ved bruk av standard fremgangsmåter.

Den følgende gruppe oligonukleotidsekvenser brukes for å konstruere fragmentet Aa.

Oligonukleotid Aa1 er:

Oligonukleotid Aa2 er:

Oligonukleotid Aa3 er:

Oligonukleotid Aa4 er:

Oligonukleotid Aa5 er:

Oligonukleotid Aa6 er: Oligonukleotid Aa7 er: >

Oligonukleotid Aa8 er:

Oligonukleotid Aa9 er:

Oligonukleotid Aa10 er:

De følgende oligonukleotidsekvenser er satt sammen for å konstruere fragment Ab.

Nukleotid Abl er:

Nukleotid Ab2 er:

Nukleotid Ab3 er:

Nukleotid Ab4 er:

Nukleotid Ab5 er:

Nukleotid Ab6 er:

Nukleotid Ab 7 er:

Nukleotid Ab8 er:

Nukleotid Ab9 er:

Det følgende er oligonuklotidsekvensenesatt sammen for å konstruere fragment B.

Oligonukleotid B1 er:

Oligonukleotid B2 er:

Oligonukleotid B3 er:

Oligonukleotid B4 er:

. Oligonukleotid B5 er:

Oligonukleotid B6 er:

Oligonukleotid B7 er:

Det følgende er oligonukleotidsekvensene brukt til å konstruere fragment C.

Oligonukleotid Ci er:

Oligonukleotid C2 er:

Oligonukleotid C3 er:

Oligonukleotid C4 er:

Oligonukleotid C5 er":

Oligonukleotid C6 er:

Oligonukleotid C7 er:

Oligonukleotid C8 er:

Oligonukleotid C9 er:

Den følgende gruppe oligonukleotidsekvenser er satt sammen for å danne fragment D.

Oligonukleotid D1 er:

Oligonukleotid D2 er:

Oligonukleotid D3 er:

Oligonukleotid D4 er:

De følgende grupper oligonukleotider blandes og herdes (anneaied) under standardbetingelser og ligatiseres til hverandre, og til klonings- og sekvenseringsvektorer M13 mp18 og 19 skåret med riktige restriksjonsendonukleaser ved bruk av T4 DNA-ligase under standardbetingelser. Produktene brukes til å overføre E. coli JM105, og kloner inneholdende det aktuelle DNA velges fra hvite plaquer i IPTG- Xgal-plater og sorteres ytterligere ved hybridisering med <a=>P-merket oligonukleotider valgt fra gruppen brukt i herdetrinnet. Den innføyde struktur bekreftes ved dideoksysekvensering av det klonede DNA ved bruk av en universell primer.

Gruppe Aa inneholder oligonukleotider Aa1-Aa10 som er ligatisert til M13 mp18 og 19 skåret med Pstl og Hindlll. Gruppe Ab inneholder oligonukleotider Ab1-Ab9 som ligatiseres til M1 3 mp18 og 19 skåret med Pstl og Hindlll. Gruppe B, som inneholder oligonukleotider B1 til B7, ligatiseres til M13 mp18 og 19 skåret med Hindlll og BamHI. Gruppe C, som inneholder oligonukleotider C1 til C9, ligatiseres til M13 mp18 og 19 skåret med BamHI og Xbal. Gruppe D, som inneholder oligonukleotider D1 til D4, ligatiseres til M13 mp18 og 19 skåret med BamHI og Sali.

M13 replikativ form DNA utvinnes fra klonen som har det ønskede innføyde DNA ved standard fremgangsmåter. Det innføyde DNA som svarer til gruppe Aa skjæres fra M13 DNA ved at DNA skjæres med riktige restriksjonsendonukleaser og renses ved polyakrylamidgel-elektroforese. Dets struktur er:

Det innføyde DNA som svarer til gruppe Ab skjæres ut ved kutting av DNA med restriksjonsendonukleaser EcoRl og Hindlll og renses ved polyakrylamidgel-elektroforese. Dets struktur er:

Det innføyde DNA som svarer til gruppe B skjæres ut ved kutting av DNA med restriksjonsendonukleaser Hindlll og BamHI og renses ved polyakrylamidgel-elektroforese. Dets struktur er:

Det innføyde DNA som svarer til gruppe C skjæres ut ved kutting av DNA med restriksjonsendonukleaser BamHI og Bglll og renses ved polyakrylamidgel-elektroforese. Dets struktur er:

Det innføyde DNA som svarer til gruppe D skjæres ut ved kutting av DNA med restriksjonsendonukleaser SauIIIA og Sali og renses ved akrylamidgel-elektroforese. Dets struktur er:

B. Konstruksjon av genet

I konstruksjonen for utførsel blir innføyelsene fra gruppe Aa, B, C og D kombinert og ligatisert til M13 mp18 og 19 skåret ved EcoRI og Sali ved bruk av T4 DNA-ligaser under standardbetingelser. Klonene som inneholder genet velges ved deres farge på Xgal-plater og sorteres ytterligere ved hybridisering med det 3Z,"-merkede oligonukleotid. Strukturen av utvalgte kloner bekreftes ved dideoksysekvensering av det innføyde område av DNA ved bruk av den universelle primer.

I konstruksjonen for cytoplasmatisk ekspresjon blir innføyelsene fra gruppene Ab, B, C og D kombinert og ligatisert til M13 mp18 og 19 skåret med EcoRI o<g>Sall ved bruk av T4 DNA-ligase under standardbetingelser. Klonene som inneholder genet velges ved deres farge på Xgal-plater og sorteres ytterligere ved hybridisering med den ^^-raerkede innføyelse. Strukturene av selekterte kloner bekreftes ved dideoksysekvensering av det innføyde område av DNA ved bruk av den universelle primer.

EKSEMPEL 2

På grunnlag av aminosyresekvensen beskrevet ovenfor, kodonbruken

i høyt uttrykte gener av Escherichia coli, og under forutsetning av egnede restriksjonsendonuklease-kløyvingsseter, ble den følgende DNA-sekvens foreslått:

For å regulere ekspresjonen av proteinet i en form som er egnet til utførsel til periplasmaet av E. coli/ er de følgende regulerende elementer foreslått: En tac-promotor på plasmid pKK223-3 for initiering av transkripsjon på høye nivåer; en lac-operatør på plasmid pKK223-3 for transkripsjonsregulering; en lac-undertrykker ( lac I"), som kodes på kromosomet av E. colistammen JM107; en OmpA Shine-Dalgarno-sekvens for å initiere translasjon på et høyt nivå; en OmpA-leder for å lette periplasmatisk utførsel av produktet; en Ala av en Ala-Ser-kobling mellom proteinsekvensen kodet for av

disse operatorelementer og den som kodes for av de strukturelle gener beskrevet ovenfor, for å diktere kløyving av det opprin-

nelige produkt til å gi den modne leukocyttelastaseinhibitor. OmpA-elementene innlemmes i den følgende DNA-sekvens:

For å regulere ekspresjonen av proteinet i en form slik at proteinet forblir i E. coli-cvtoplasmaet, foreslås de følgende operasjonelle elementer: tac-promotoren på plasmid pKK223-3, lac-operatoren på plasmid pKK223-3 og lac-undertrykkeren (lac I") på kromosomet av E. coli-stammen JM107, en samstemt Shine-Dalgarno-sekvens, og, for å initiere et høyt translasjonsnivå, skal et fragment av OmpA-ledérpeptidet anvendes som en translasjonskobler. Translasjonskoblingssekvensen omfatter DNA som koder for translasjonsinitieringsområdet av OmpA-genet, de første åtte aminosyrer av OmpA-lederpeptidet, den samstemte Shine-Dalgarno-sekvens beskrevet ovenfor, og en translasjonsavslutter. Transla-sj onskoblingssekvensen skal innføyes mellom lac-operatoren og translasjonsinitieringssetet av serinproteaseinhibitor-genet og overlapper dette. Trekkene ved translasjonskobleren innlemmes i den følgende DNA-sekvens:

C. Konstruksjon av genfraqmenter

For å konstruere de ovenfor angitte sekvenser, blir de følgende deoksyribonukleotider syntetisert ved bruk av ABI DNA-syntetisator (Foster City, California). Produktene renses ved polyakrylamidgel-elektrof orese, som beskrevet i veiledningen for ABI-instrumen-tet. De er 5<1->fosforylert ved bruk av T4-polynukleotidkinase og ATP ved bruk av standard fremgangsmåter.

Den følgende gruppe oligonukleotidsekvenser brukes for å konstruere fragment Aa.

Oligonukleotid Aa1 er:

Oligonukleotid Aa2 er:

Oligonukleotid Aa3 er:

Oligonukleotid Aa4 er:

Oligonukleotid Aa5 er:

Oligonukleotid Aa6 ér:

De følgende oligonukleotidsekvenser er satt sammen for fremstilling av fragment Ab.

Oligonukleotid Ab1 er:

Oligonukleotid Ab2 er:

Oligonukleotid Ab3 er:

Oligonukleotid Ab4 er:

Oligonukleotid Ab5 er:

Oligonukleotid Ab6 er:

De følgende er oligonukleotidsekvenser satt sammen for å konstruere fragment B.

Oligonukleotid B1 er:

Oligonukleotid B2 er:

Oligonukleotid B3 er:

Oligonukleotid B4 er:

Oligonukleotid B5 er:

Oligonukleotid B6 er:

Oligonukleotid B7 er:

De følgende er oligonukleotidsekvensene brukt til å konstruere fragment C.

Oligonukleotid C1 er:

r Oligonukleotid C2 er:

Oligonukleotid C3 er:

Oligonukleotid C4 er:

Oligonukleotid C5 er:

Oligonukleotid C6 er:

Oligonukleotid C7 er:

Oligonukleotid C8 er:

Oligonukleotid C9 er:

Den følgende gruppe oligonukleotidsekvenser settes sammen for dannelse av fragment D.

Oligonukleotid D1 er:

Oligonukleotid D2 er:

Oligonukleotid D3 er:

Oligonukleotid D4 er:

De følgende grupper oligonukleotider blandes og herdes under standardbetingelser og ligatiseres til hverandre og til kloning-og sekvenseringsvektorer M13 mp18 og 19 skåret med riktige restriksjonsendonukleaser ved bruk av T4 DNA-ligase under standardbetingelser. Produktene brukes til å transformere E. coli JM105, og kloner inneholdende det aktuelle DNA velges ved hybridisering med <=>'<=>'--merkede oligonukleotider valgt fra gruppen brukt i herdetrinnet. Den innføyde struktur bekreftes ved dideoxy-sekvensering av det klonede DNA ved bruk av en universell primer.

Oligonukleotider Aa1-Aa4 ligatiseres til Ml3mp18 og M13mp19 skåret med EcoRI og BamHI. M13 replikativ form DNA som har det ønskede innføyde DNA, utvinnes ved standard fremgangsmåte. Det innføyde DNA skjæres ut fra M13 DNA ved kutting av M13 DNA med restriksjonsendonukleaser EcoRI og Pvul og renses ved polyakrylamidgel-elektrof orese. Dets struktur er:

Oligonukleotider Aa5 og Aa6 ligatisers til M13mp18 og M13mp19 skåret med BamHI og Hindlll. M13 replikativ form DNA som har det ønskede innføyde DNA utvinnes ved standard fremgangsmåte. Det innføyde DNA skjæres ut fra M13 DNA ved kutting av DNA med restriksjonsendonukleaser Pvul og Hindlll og renses ved polyakrylamidgel-elektroforese. Dets struktur er:

Dette PvuI-HindIII-fragment kombineres med EcoRI-Pvul-fragmentet fremstilt fra oligonukleotider Aa1-Aa4 og ligatiseres med Ml3mp18 eller M13mp19 skåret med EcoRI og Hindlll. M13 replikativ form DNA som har det ønskede innføyde DNA utvinnes ved standard fremgangsmåte. Det innføyde DNA som er DNA-fragment Aa, skjæres ut fra M13 DNA ved kutting av M13 DNA med restriksjonsendonukleaser EcoRI og Hindlll og renses ved polyakrylamidgel-elektroforese. Dets struktur er:

Oligonukleotider Ab1-Ab4 ligatiseres til M13mp18 og M13mp1 9 skåret med EcoRI og BamHI. M13 replikativ form DNA som har det ønskede innføyde DNA utvinnes ved standard fremgangsmåte. Det innføyde DNA skjæres ut fra M13 DNA ved kutting av DNA med restriksjonsendonuklease EcoRI og Pvul og renses ved polyakrylamidgel-elektrof orese. Dets struktur er:

Dette EcoRI- PvuI-fragment kombineres med oligonukleotider Ab5 og Ab6 og ligatiseres med Ml3mp18 eller M13mp19 skåret med EcoRI og Hindlll. M13 replikativ form DNA som har det ønskede innføyde DNA utvinnes ved standard fremgangsmåte. Det innføyde DNA som er fragment Ab skjæres ut fra M13 DNA ved kutting av DNA med restrik-sj onsendonukleaser EcoRI og Hindlll og renses ved polyakrylamidgel-elektrof orese. Dets struktur er:

Gruppe B som inneholder oligonukleotider B1-B7 ligatiseres til M13mp18 og 19 skåret med Hindlll og BamHI. Det innføyde DNA som svarer til gruppe B skjæres ut ved kutting av DNA med restrik-sj onsendonuklease Hindlll og BamHI og renses ved polyakrylamidgel-elektrof orese. Dens struktur er:

Gruppe C som inneholder oligonukleotider C1-C9 ligatiseres til M13mp18 og 19 skåret med BamHI og Xbal. Det innføyde DNA som svarer til gruppe C skjæres ut ved kutting av DNA med restrik-sj onsendonukleaser BamHI og Bqlll og renses ved polyakrylamidgel-elektrof orese. Dets struktur er:

Gruppe D, som inneholder oligonukleotider D1-D4, ligatiseres til Ml3mp18 og 19 skåret med BamHI og Sali. Det innføyde DNA som svarer til gruppe D, skjæres ut ved kutting av DNA med restrik-sj onsendonukleaser SauIIIA og Sali og renses ved polyakrylamidgel-elektrforese. Dets struktur er:

D. Konstruksjon av genet

I konstruksjonen for utførsel blir innføyelser fra gruppe Aa, B, C og D kombinert og ligatisert til Ml3mp18 og 19 skåret med EcoRI og Sali ved bruk av T4 DNA-ligase under standardbetingelser. I konstruksjonen for cytoplasmatisk ekspresjon blir innføyelsene fra gruppe Ab, B, C og D kombinert og ligatisert til M13mp18 og 19, skåret med EcoRI og Sali ved bruk av T4 DNA-ligase under standardbetingelser. Klonene inneholdende genet velges ved deres farge på Xgal-plater og sorteres ytterligere ved hybridisering med det merkede oligonukleotid. Strukturen av selekterte kloner bekreftes ved dideoksysekvensering av det innføyde område av DNA ved bruk av den universelle primer.

EKSEMPEL 3

Konstruksjon av ekspresjonsvektorer.

Innføyelsene for konstruksjonen for utførsel og konstruksjonen for cytoplasmatisk ekspresjon ble overført til ekspresjonsplasmider som følger: Ml 3 replikativ form DNA som har det ønskede innføyde DNA utvinnes ved standard fremgangsmåte som angitt ovenfor. Det riktige innføyde DNA skjæres løs fra M13 DNA ved kutting av DNA med restriksjonsendonukleaser EcoRI og Pstl og renses ved polyakrylamidgel-elektrof orese. Det ligatiseres deretter til pKK223-3 skåret med restriksjonsendonukleaser EcoRI og Pstl, og det resulterende plasmid klones inn i E. coli JM107. Konstruksjonen til bruk i eksempel 4 og 5 for utførsel er pSGE6 og det til bruk i eksempel 7 for cytoplasmatisk ekspresjon er pSGE8. E. coli stammen for utførsel i eksempel 4 og 5 er SGE10 og det for cytoplasmatisk ekspresjon i eksempel 6 er SGE30.

A. Organisering av pSGE6

Plasmid pSGE6 ble konstruert ved erstatning av DNA mellom EcoRI-og Pstl-setene på pKK223-3 med et EcoRI/Pstl-fragment inneholdende DNA som koder for ompA SLPI. DNA-sekvensen av ompA-SLPI er som følger:

Sekvensen som heretter er betegnet som "ompa-SLPl" er DNA fra den endelige Ml3mp18 konstruksjon for utførsel som beskrevet ovenfor. Plasmid pSGE6 er vist på Fig. 1. På fig. 1 er det første kodon for opmpAss-SLPI i en posisjon 62-64 av den DNA-sekvens som kalles "ompA-SLPl". Det første kodon for modent SLPI er ved posisjon 125-127. Ptac inneholder DNA for tac-promotoren, lac-operatoren og beta-galaktosidase Shine/Dalgarno-sekvensen. Forkortelsene R1, Pst og Barn er gjenkjennelsesekvenser for restriksjonsenzymene EcoRI, Pstl og BamHI. Tet1" er en del av genet fra pBR322 som meddeler motstand mot tetracyklin, amp'" meddeler motstand mot ampicillin, rrnB inneholder DNA fra rrnBoperonen fra posisjon 6416 til posisjon 6840. Piler angir transkripsjonens retning.

B. Organisering av pCJ- ompA- SLPI

Plasmid pCJ-ompA-SLPI er det samme som pSGE6 med den unntakelse at det inneholder hele tetracyklinmotstands-genet og promotor snarere enn det partielle gen. Dette plasmid meddeler tetracyklinmotstand når det innsettes i E. coli og ble konstruert på analog måte med pSGE6 bortsett fra at EcoRl/ Pstl-fragmentet inneholdende DNA som koder for ompA-SLPI ble klonet inn i vektor pCJ1, snarere enn pKK223-3. Vektoren pCJ1 ble konstruert som følger. Plasmid pKK223-3 ble digestert fullstendig med SphI og delvis med BamHI. Et fragment på 4,4 Kbp ble renset og kombinert med en syntetisk adaptor:

og et 539 bp fragment av DNA fra Clal, Sphl-digest av tet-"-genet av pBR322 (PL Biochemicals, 27-4891-01).

C. Struktur av pSGE8

Plasmid pSGE8 er isogent med pSGE6 med den unntakelse at DNA mellom EcoRI- og Pst-setene inneholder sekvensen kalt ompA-tc-met-SLPI som fås fra den endelige M13mp18-konstruksjon for cytoplasmatisk ekspresjon som beskrevet ovenfor. Denne sekvens dirigerer syntesen av metionyl-SLPI i cytoplasmaet av E. coli. Et partielt diagram av pSGE8 er vist på fig. 2. I sekvensen kalt "ompA-tc-met-SLPl" er initieringskodonet for ompA ved posisjon 62-64, avslutningskodonet er ved 95-97 og initieringskodonet for metionyl-SLPI er ved 98-100. DNA-sekvensen av ompA-tc-met-SLPI er som følger:

D. Organisering av pCJ- met- SLPI

Plasmid pCJ-met-SLPI er det samme som pSGE8, bortsett fra at det inneholder det fullstendige (snarere enn det partielle) tetracyklinmotstands-gen. Plasmid CJ-met-SLPI ble konstruert analogt med pSGE8, bortsett fra at EcoRl/Pstl-fragmentet inneholdende DNA som koder for ompA-tc-met-SLPI ble klonet inn i vektor pCJl snarere enn pKK223-3.

E. Konstruksjon av gjærekspresjonsplasmider

Plasmidet pUC8 ble digestert med Hindlll og ligatisert til

en Hindlll/ Smal-adapter (fra Amersham, Cat. No. DA1006). Tilføy-elsen av denne adapter til et Hindlll-sete rekonstruerer ikke Hindlll-setet. DNA ble deretter digestert med Smal og ligatisert i fortynnet oppløsning fulgt av transformasjon av E. Coli JM83. Det korrekte plasmid, dvs. et plasmid som mangler restriksjons-setene i polylinkeren fra Hindlll-setet til Smal-setet ble identifisert ved digestering av plasmid DNA isolert fra transformanter med EcoRI, Smal eller Hindlll. En transformant inneholdende et plasmid som manglet Hindlll-setet men inneholdt EcoRI-setet og Smal-setet ble identifisert på denne måte. Dette plasmid er pGS185.

Et EcoRI-fragment inneholdende gjær-MF-1-genet ble renset med gel-elektroforese fra plasmid pCY17 som beskrevet av J. Kurjan & I. Herskowitz i Cell 30.:933 (1982) og ligatisert inn i EcoRI-skåret pGS185. Denne ligasjonsblanding ble brukt til å transformere E. coli HB101 idet man selekterte for ampicillinmotstand. Plasmid DNA ble isolert fra transformanter og nærværet av det riktige innføyde materiale bekreftet ved digestioner av DNA med EcoRI. Dette er plasmid pGS285, og er vist på fig. 3.

Plasmid pGS285 ble fordøyet til fullstendighet med Hindlll og religatisert under fortynnede betingelser for å eliminere tre av de fire interne Hindlll-seter i MF 1-genet som angitt av Kurjan & Herskowitz ibid. Det riktige konstruerte materiale ble valgt som beskrevet ovenfor. Dette er plasmid pGS385.

M13 AaBCD klonen som beskrevet i eksempel 2, som bærer nukleotidsekvenser som koder for aminosyrer 4 t.o.m. 107 av det syntetiske SLPI-gen, ble digestert med Hindlll. Dette DNA ble ligatisert med den følgende oligonukleotid-adapter:

Denne adapter var blitt dannet ved herding av de to oligonukleotider: 5' GCT GAA GCT TCA GGT AAG og 5' AGC TCT TAC CTG AAG CTT CAGC

først ved 70°C for 2' fulgt av langsom avkjøling over natten.

Etter ligasjon av adapteren til Hindlll-skåret M1 3 AaBCD, ble ligasjonsblandingen digestert med Hindlll og Sali for å frigjøre et fragment renset ved agarosegel-elektroforese og elektro-eluering. Dette fragment ble digestert en gang til med Hindlll og deretter ligatisert med pGS385 DNA som var blitt kuttet med Hindlll og Sali. E. coli i HB101 ble transformert med ligasjonsblandingen og ampicillinresistente transformanter ble valgt. Transformanter inneholdende plasmider med det riktige innføyde DNA ble identifisert ved fremstilling av plasmid DNA og digestion av dette med Hindlll og Sali. Et plasmid konstruert og isolert på denne måte er blitt gitt betegnelsen pGS485 og er vist på fig. 4. Dette plasmid inneholder MF 1-genet sammenføyd, i rammen, til det syntetiske SLPI-gen ved Hindlll-setet i det første avstands-dannende (spacer) område av MF 1-genet. Slike konstruerte materialer, når de plasseres i gjær, er vist å dirigere syntesen, bearbeidelsen og sekresjonen av de heterologe proteiner som vist ved A.J. Brake et al. i PNAS (USA) 81_:4642. Sammenføyningen av MF 1-genet og SLPI er inneholdt på et EcoRI-fragment i pGS435. Dette EcoRI-fragment ble klonet inn i vektoren YIp5 som beskrevet i eksempel 8.

EKSEMPEL 4

Ekspresjon og rensing av sekresjons-leukocyttproteaseinhibitor (SLPI) ved bruk av plasmid pSGE6.

E. coli-celler inneholdende plasmid pSGE6 (SGE10-celler) ble dyrket i 6 timer i 10 liter M9-media med 2% trypton, 0.5% gjær-ekstrakt, 20g/l glukose, 200 mg/l Vitamin B1 og 100 mg/l ampicillin tilsatt. IPTG ble tilsatt til 0,2mM og kulturen dyrket i ytterligere 6 timer. 10 liter E. coli SGE10-celler ved 8 gram per liter ble pelletert ved 18000 x g og resuspendert i 50mM Tris.HCl (pH 7,5), 4mM EDTA-buffer (heretter T50E4), og pelletert. Pelleten ble resuspendert i 2,7 liter T50E4 og frosset i 150ml porsjoner. Hver av disse porsjoner (ekvivalent med 36 gram celler) ble slått sammen og lysert ved en enkelt passasje gjennom en fransk presse ved 82,7MPa og 4<0> C. Lysatet ble sentrifugert i 1 ,5 timer ved 20000 x g. En sjettedel av pelleten inneholdende de uoppløselige materialer i cellen (ekvivalent med 6 gram celler) ble vasket to ganger med 125ml T50E4, og det resterende materiale ble frosset over natten.

Den frosne pellet ble ekstrahert med 25ml av 100mM Tris.HCl (pH 8,0), 4mM EDTA (heretter T100E4) inneholdende 20mM DTT (fra Sigma kat. nr. D-0632), 4mM PMSF (fra Sigma kat. nr. P-7626) og 8M urea (ultrarent, fra BRL, kat. nr. 5505UA) i 1 time ved 37° C og sentrifugert ved 10000 x g i ti minutter. Den resulterende ovenpåflytende væske ble blandet med 10ml pakket Sephadex SP-C25 (fra Pharmacia) som var blitt for-ekvilibrert med ekstraksjons-bufferen T100E4 inneholdende 20mM DTT og 8M urea og blandet på en valse i ti minutter ved 37° C for å absorbere SLPI på SP-Sephadex.

Harpiksen med det absorberte SLPI ble pelletert ved en ti minutters sentrifugering ved 3000 x g og den ovenpåflytende væske dekantert. Det resterende harpiks ble vasket to ganger med 25ml T100E4 inneholdene 20mM DTT og 8M urea, fulgt av to vaskinger med 25ml T100E4 inneholdende 20mM DTT. Harpiksen ble deretter ekstrahert en gang med en blanding av 0,6ml 5 M NaCl og 25ml T100E4 inneholdende 20mM DTT og 0,3 M NaCl. Dette ekstrakt inneholdt ca. 0,15mg/ml protein og mer enn 0,04mg/ml SLPI. Det SLPI som ble oppnådd ved denne fremgangsmåte ble funnet å være mer enn 70% rent ved høytrykks-væskekromatografi.

EKSEMPEL 5

Ved bruk av fremgangsmåten ifølge eksempel 4 ble en andre frossen pellet ekstrahert med T100E4 inneholdende 1% Triton x-100 (fra Sigma, kat. nr. T-6878) istedenfor den første T100E4/DTT/ PMSF/urea-vask. Det resulterende SLPI var litt renere enn det som ble oppnådd ved eksempel 4 og gav høyere aktivitet i refoldings-prøven angitt i eksempel 6 nedenunder.

EKSEMPEL 6

Refolding av renset SLPI.

Ca. 40pg av delvis renset SLPI fra eksempel 4 eller 5 ble brakt på 8M i urea eller 5M i guanidinhydroklorid (fra Pierce Chemical Co., nr. 24110) og 4mM i DTT og inkubert i en time ved værelsetempe-ratur. Oksydert gluation (fra Sigma, kat. nr. G-4626) ble tilsatt til 13,5mM, og blandingen ble igjen inkubert i en time ved værelsetemperatur. Blandingen ble fortynnet 10 ganger med en oppløsning av 50mM Tris i NaOH, pH 10,7 og inkubert i ytterligere 4 timer ved værelsetemperatur. Blandingen ble deretter fortynnet 5 ganger med 50mM Tris, pH 8.0 og 0,15M NaCl og ført til en 1 x 2 cm kolonne av Sephadex SP-C25 for-ekvilibrert med 50mM Tris,

pH 8,0, og 0,25M NaCl. Harpiksen ble vasket med 50mM Tris, pH 8,0, inneholdende 0,25M NaCl og deretter med 50mM Tris, pH 8,0, inneholdende 0,5M NaCl. Fraksjonen som ble eluert med 0,5M saltvasken var fullt aktiv og representerte ca. 30% av det SLPI som ble ført til kolonnen.

EKSEMPEL 7

Rensing av SLPI fra oppløselige og uoppløselige fraksjoner av SGE30-cellelysat.

Ekspresjon av plasmidet pSGES i E. coli SGE30-celler produserte SLPI i både de oppløselige og uoppløselige fraksjoner av celle-lysatet. Ved 1% av det samlede celleprotein var SLPI fordelt ca. 80% i de oppløselige og ca. 20% i de uoppløselige fraksjoner.

A. Rensing av SLPI fra den uoppløselige fraksjon

E. coli SGE30-cellene inneholdene pSGE8 ble dyrket i LB-media inneholdende 50ng/ml ampicillin i en ristekolbe til en OD600 på 0,7 og indusert ved tilsetningen av IPTG til 0.2mM. Etter 3 timer ble cellene pelletert og suspendert i to ganger deres vekt av 50mM Tris.HCl (pH 7,5) og 4mM EDTA (heretter T50E4). Cellene ble oppbrutt ved behandling med lyd (sonication) ved 4° C og eks-traktet ble sentrifugert i 20 minutter ved 4° C ved 12000 x g.

Pelleten ble vasket i tre volumer T50E4 og ble gjort oppløselig ved værelsetemperatur i en oppløsning inneholdende enten 10M urea eller 6M guanidinhydroklorid og 5mM redusert DTT. Etter en inkubasjon på en time ved værelsetemperatur ble oksidert glutation tilsatt ved en konsentrasjon på 17,5mM, og blandingen ble inkubert i ytterligere en time. Blandingen ble deretter fortynnet til 10 volumer av 50mM Tris.HCl, pH 10,7. Den fortynnede blanding ble tillatt å stå i fire timer ved værelsetemperatur fulgt av pH-justering til 8 ved tilsetting av 5 N HC1. Denne blanding ble sentrifugert for å fjerne utfelt protein.

Den ovenpåflytende væske produsert på denne måte inneholdt SLPI som oppviste sekresjons-leukocyttproteaseinhibitor-aktivitet. Dette protein ble renset ved kromatografi på en Sephadex SP-C25 kolonne som beskrevet ovenfor.

B. Rensing av SLPI fra oppløselig fraksjon

E. coli SGE30-celler inneholdende plasmid pSGE8 ble dyrket i en ristekolbe til en OD600 på 0,7 og indusert ved tilsetningen av IPTG til 0,2mM. Ved en OD600 på 1,1 ble cellene pelletert ved 25000 x g i 15 minutter. Pelleten ble resuspendert i T50E4 og ble lysert ved to passasjer gjennom en fransk presse ved 138MPa ved 4° C. Lysatet ble sentrifugert ved 25000 x g i 15 minutter.

Den ovenpåflytende væske ble gjort til 25mM i DTT. Denne blanding ble inkubert ved 0° C i en time, og tilstrekkelig mengde HC1 ble tilsatt for å nå en endelig konsentrasjon på 5%. Etter 30 minutters inkubering ved 0 0 C ble blandingen sentrifugert ved 25000 x g i 15 minutter, og den ovenpåflytende væske fjernet for videre behandling. PH-verdien av den ovenpåflytende væske ble justert til 8,0 med 10M NaOH og analysert ved SDS-side, revers-fase HPLC-kromatografi og ELISA, hvilket antydet minst 0,7 pg SLPI pr. 130 ug samlet protein. Det SLPI som ble skaffet på denne måte ble ytterligere renset på en Sephadex SP-C25 kromatografisk kolonne. Det ble refoldet til aktivt SLPI i henhold til eksempel 6.

EKSEMPEL 8

EcoRI-fragmentet inneholdende det sammenføyde SLPI-MFi-gen (se eks. 3.E) ble ligatisert til EcoRI-setet av gjærvektoren YIp5 som beskrevet av D. Botstein og R.W. Davis i The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Cold Spring Harbor Laboratory, pp.

607-636 (1982), for å danne YIpSLPI-1 og er blitt integrert inn i URA3-genet av S. cerevisiae BS214 (MAT , Ura3-52, pep4, prbl ) ved setedirigert rekombinasjon som beskrevet av T. Orr-Weav-er et. al. i Methods in Enzymology 101 :228 (1983). Denne stamme, S. cervisiae SGY-1, avsondrer fullt aktivt SLPI inn i kulturens ovepåflytende væske.

En annen stamme, SGY-3, produserer og avsondrer også aktivt SLPI. Denne stamme bærer MF 1::SLPI-sammenføyningen på replikasjons-gjærplasmidet pGS585. Dette plasmid ble konstruert fra pJDB207, som beskrevet av J.R. Roach i Methods in Enzymology 101:307

(1983), ved tilsetningen av gjær URA3-genet, isolert fra plasmidet YEp24 som beskrevet av D. Botstein og R.W. Davis i The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Cold Spring Harbor Laboratory, pp 607-636, og klonet inn i Hindlll-setet av pJDB207 for å konstruere pGS585. MF 1::SLPI-fusjonsgenet, inneholdt på et EcoRI-fragment, ble klonet inn i Sall-setet av pGS585 ved bruk av EcoRl/ XhoI-adaptere (fra Amersham kat. nr. DA1007) for å generere YEpSLPI-1. Dette plasmid ble innført i S. cerevisiae DBY746 (MAT , Ura3-52, leu2-3, his3 1, trp 1-289) ved transformasjon som beskrevet av Ito et. al. i J. Bacteriology 153:163

(1983).

Saccharomyces cerevisiae-stammer SGY-1 og SGY-3 ble dyrket ved 30°C til stasjonær fase i SD-medium som manglet uracil ved fremgangsmåten i henhold til F. Sherman et.al. beskrevet i Methods in Yeast Genetics, p.62, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York (1981). Celler ble fjernet fra dyrknings-mediet ved sentrifugering, og den ovenpåflytende væske av kulturen ble analysert for SLPI-aktivitet ved måling av (1) protease-inhiberende aktivitet og (2) mengden materiale som spesielt reagerer med anti-SLPI-antistoffer ved en enzymkoblet immunanalyse. Rensemetoder kan utvikles på samme måte som for tidligere metoder beskrevet heri.

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en rekombinant serinproteaseinhibitor som omfatter en enkel polypeptidkjede, hvor nevnte inhibitor har minst ett aktivt sete som besitter serinproteaseinhibitor-aktivitet, og utviser minst 40% homologi med en nativ serinproteaseinhibitor isolert fra spyttkj ertelsekre-sjoner, hvor nevnte native serinproteaseinhibitor har følgende aminosyre sekvens; karakterisert veda) dyrking av en vertscelle transformert med en vektor som inneholder en DNA-sekvens som koder for nevnte inhibitor under betingelser som er egnet for uttrykk av nevnte inhibitor og b) isolering av den uttrykte inhibitoren.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at den videre inneholder et trinn for refolding av inhibitoren uttrykt av en bakteriell vertscelle for å fremstille en aktiv tertiær struktur som utviser serinproteaseaktivitet.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at nevnte DNA-sekvens er en syntetisk DNA-sekvens.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at nevnte DNA-sekvens er en naturlig DNA-sekvens.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at fremgangsmåten videre omfatter rensing av den isolerte inhibitoren.

6. Fremgangsmåté som angitt i krav 5, karakterisert ved at rensing utføres før inhibitoren refoldes for å fremstille en aktiv form.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 5, karakterisert ved at rensing utføres etter inhibitoren refoldes for å fremstille en aktiv form.

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at DNA-sekvensen er innsatt i en vektor som omfatter deler av vektorer selektert fra gruppen som består av pBR322 og pIQ.

9. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at vertsmikroorganismen er selektert fra gruppen som består av slektene Escherichia, Bacillus og Saccharomyces.

10. Fremgangsmåte som angitt i krav 9, karakterisert ved at vertsmikroorganismen er Escherichia coli.

11. Fremgangsmåte som angitt i krav 9, karakterisert ved at vertsmikroorganismen er Bacillus subtilis.

12. Fremgangsmåte som angitt i krav 9, karakterisert ved at vertsmikroorganismen er Saccharomyces cerevisiae.

13. Syntetisk DNA-sekvens som koder for en serinproteaseinhibitor som omfatter enkel polypeptidkjede, karakterisert ved at nevnte inhibitor har minst et aktivt sete som besitter serinproteaseinhibitoraktivitet og utviser minst 40% homologi til en nativ serinproteaseinhibitor isolert fra spyttkjertelsekresjoner, hvor nevnte native serinproteaseinhibitor har følgende aminosyresekvens;

14. Syntetisk DNA-sekvens som angitt i krav 13, karakterisert ved at proteinet som DNA-sekvensen koder for omfatter aminosyresekvensen; hvori R, og R7 er like eller forskjellige og blir selektert fra gruppen som består av en substituert eller usubstituert aminosyrerest eller derivat derav; R2, R3, R4, R5 og Rg er like eller forskjellige og blir selektert fra gruppen som består av metionin, valin, alanin, fenylalanin, tyrosin, tryptofan, lysin, glycin og arginin; og R8 og R9 er like eller forskjellige og er selektert fra gruppen som består av metionin, valin, alanin, fenylalanin, tyrosin, tryptofan, lysin, glycin, leucin og arginin.

15. Rekombinant vektor, karakterisert ved at den omfatter DNA-sekvensen angitt i krav 14, og operasjonelle elementer egnet til å uttrykke serinproteaseinhibitoren.

16. DNA-sekvensen som angis i krav 13, karakterisert ved at nevnte sekvens er selektert fra gruppen som består av en (1); eller (2) sekvenser som er ekvivalente til (1) som et resultat av degenerering av den genetiske kode.

17. Rekombinant vektor, karakterisert ved at den omfatter DNA-sekvensen i krav 13 eller 16, og operasjonelle elementer egnet til ekspresjon av serinproteaseinhibitoren.

18. Isolert DNA-sekvens som koder for en serinproteaseinhibitor som utviser minst 40% homologi med en nativ serinproteaseinhibitor isolert fra spyttkj ertelsekresj oner, karakterisert ved at den koder for et protein som har følgende aminosyresekvens;

19. DNA-sekvensen som angitt i krav 18, karakterisert ved at den er en cDNA.

20. DNA-sekvensen som angitt i krav 18, karakterisert ved at den er en genomisk DNA.

21. Rekombinant vektor, karakterisert ved at den omfatter DNA-sekvensen som angitt i krav 18, 19 eller 20, og operasjonelle elementer egnet til å uttrykke serinprotease inhibitoren.

22. Rekombinant vektor som angitt i krav 21, karakterisert ved at den er inneholdt i en vertscelle som er en mikroorganisme valgt fra gruppen som består av Escherichia, Bacillus og Saccharomyces.

23. Rekombinant vektor som angitt i krav 22, karakterisert ved at vertsmikroorganismen er Escherichia coli.

24. Rekombinant vektor som angitt i krav 22, karakterisert ved at vertsmikroorganismen er Bacillus subtilis.

25. Rekombinant vektor som angitt i krav 22, karakterisert ved at vertsmikroorganismen er Saccharomyces cerevisiae.

26. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at DNA-sekvensen omfatter en kodende region for et protein som omfatter aminosyresekvensen: hvori R, og R7 er like eller forskjellige og er valgt fra gruppen som består av serin, alanin eller en substituert aminosyrerest; R2, R3, R4, R5 og R6 er like eller forskjellige og er valgt fra gruppen som består av metionin, valin, alanin, fenylalanin, tyrosin, tryptofan, lysin, glycin og arginin; og R8 og R, er like eller forskjellige og er valgt fra gruppen som består av metionin, valin, alanin, fenylalanin, tyrosin, tryptofan lysin, glycin, leucin og arginin.

27. Fremgangsmåte som angitt i krav 26, karakterisert vedatR2ogR3er meteonin.

28. Fremgangsmåte som angitt i krav 26, karakterisert vedatR2ogR3er arginin.

29. Fremgangsmåte som angitt i krav 26, karakterisert vedR2er arginin og R3 er metionin.

30. Fremgangsmåte som angitt i krav 26, karakterisert ved R2, R3, R4, R5 og Rg er metionin og R8 og R, er leucin.

31. Fremgangsmåte som angitt i krav 26, karakterisert ved at en eller flere av R2, R3, R4, R5, Rg, Rg eller Rg er valin.

32. Fremgangsmåte som angitt i krav 26, karakterisert ved at en eller flere av R2, R3, R4, R5, Rg, Rg eller R, er alanin.

33. Fremgangsmåte som angitt i krav 26, karakterisert ved at en eller flere av R2, R3, R4, R5, Rg, R8 eller Rg er valgt fra gruppen som består av fenylalanin, tyrosin og tryptofan.

34. Fremgangsmåte som angitt i krav 26, karakterisert ved at en eller flere av R2, R3, R4, R^, Rg, Rg eller Rg er valgt fra gruppen som består av lysin eller arginin.

35. Fremgangsmåte som angitti krav 1, karakterisert ved at DNA-sekvensen koder for en serinprotease-inhibitoranalog som omfatter aminosyresekvensen:

36. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at DNA-sekvensen koder for en serinprotease-inhibitoranalog som omfatter aminosyresekvensen:

37. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at DNA-sekvensen koder for en serinprotease-inhibitoranalog som omfatter aminosyresekvensen:

38. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at DNA-sekvensen koder for en serinprotease-inhibitoranalog som omfatter aminosyresekvensen:

39. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at DNA-sekvensen koder for en serinprotease-inhibitoranalog i hvilken Leu<72> er substituert med en forbindelse valgt fra gruppen som består av fenylalanin, arginin og lysin.

40. DNA-sekvens som angitt i krav 14, karakterisert vedatR2ogR3er metionin.

41. DNA-sekvens som angitt i krav 14, karakterisert ved at ^ og R3 er arginin.

42. DNA-sekvens som angitt i krav 14, karakterisert ved at R2 er arginin og R3 er metionin.

43. DNA-sekvens som angitt i krav 14, karakterisert ved R2, R3, R4, R5 og Rg er metionin og R8 og Rg er leucin.

44. DNA-sekvens som angitt i krav 14, karakterisert ved en eller flere av R2, R3, R4, Rs, Rg, R8 eller Rg er valin.

45. DNA-sekvens som angitt i krav 14, karakterisert ved at en eller flere av R2, R3, R4, R5, Rg, R8 eller R, er valgt fra gruppen som består av fenylalanin, tyrosin og tryptofan.

46. DNA-sekvens som angitt i krav 14, karakterisert ved at en eller flere av R2, R3, R4, R5, Rg, Rg eller Rg er alanin.

47. DNA-sekvens som angitt i krav 14, karakterisert ved at en eller flere av R2, R3, R4, R5, Rg, R8 eller Rg er valgt fra gruppen som består av lysin eller arginin.

48. DNA-sekvens som angitt i krav 13, som koder en serinprotease-inhibitoranalog, karakterisert ved at proteinet omfatter aminosyresekvensen:

49. DNA-sekvens som angitt i krav 48, karakterisert ved at den omfatter:

50. DNA-sekvens som angitt i krav 13, som koder for en serinprotease-inhibitoranalog, karakterisert ved at proteinet omfatter aminosyresekvensen:

51. DNA-sekvens som angitt i krav 13, som koder for en serinprotease-inhibitoranalog, karakterisert ved at den omfatter aminosyresekvensen:

52. DNA-sekvens som angitt i krav 13, som koder for en serinprotease-inhibitoranalog, karakterisert ved at proteinet omfatter aminosyresekvensen:

53. DNA-sekvens som angitt i krav 13, karakterisert ved at Leu<72> er substituert med en forbindelse valgt fra gruppen som består av fenylalanin, arginin og lysin.

54. DNA-sekvens som angitt i krav 18, som koder for en serinprotease-inhibitoranalog, karakterisert ved at proteinet omfatter aminosyresekvensen:

55. DNA-sekvens som angitt i krav 18, som koder en serinprotease-inhibitoranalog, karakterisert ved at proteinet omfatter aminosyresekvensen:

56. DNA-sekvens som angitt i krav 18, som koder en serinprotease-inhibitoranalog, karakterisert ved at proteinet omfatter aminosyresekvensen:

57. DNA-sekvens som angitt i krav 18, som koder for en serinprotease-inhibitoranalog, karakterisert ved at proteinet omfatter aminosyresekvensen: