NO178870B - Fremgangsmåte for fremstilling av modifisert Eglin B eller C samt DNA, ekspresjonsvektor og vertsmikroorganisme - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av modifisert Eglin B eller C, DNA som koder for en modifisert Eglin B eller C samt ekspresjonsvektor og vertsmikroorganisme egnet for ekspresjon derav.

I det tyske utleggingsskriftet 2808396 er to proteaseinhibi-torer, betegnet som Eglin B og Eglin C, isolert fra blodigle (Eirudo medicinalis) beskrevet. Disse polypeptidene består av bare 70 aminosyrer med en molekylvekt på ca. 8100 og er sterke inhibitorer for chymotrypsin, subtilisin, for granulo-sytt-proteasene elastase fra dyr og menneske og katepsin G samt mastcelle-proteasechymase. Derimot blir trypsin-lignende proteaser bare hemmet i uvesentlig grad.

Eglin C har følgende primærstruktur:

Eglin C inneholder i forhold til de fleste kjente protease-inhibitorene ingen disulfid-broer. Den er til tross for den relativt lave molekylstørrelsen uvanlig stabil overfor denaturering med syre, lut eller varme og overfor proteo-lytisk nedbryting. Primærstrukturen til Eglin B er forskjel-

lig fra den til Eglin C ved erstatning av aminosyren 35, tyrosin, med histidin.

Eglinet hører til den sterkeste for tiden kjente hemmeren av humant og dyrisk granulocytt-elastase, samt av humant granulocyttkatepsin G. Ukontrollert henholdsvis umåtelig frigjøring av disse cellulære proteasene i organismen kan forsterke et betennelsesforløp og nedbrytning av vev ved uspesifikk proteolyse. Enzymene er kompetente for intracellu-

lær nedbrytning er optimalt virkningsfulle i fysiologisk miljø (nøytralt til svakt alkalisk) og har muligheten til å

raskt ødelegge native vevsubstanser (f.eks. elastin) og humorale faktorer (f.eks. blodkoagulerings- og komplement-faktorene) og å inaktivere disse. På grunn av de til nå kjente egenskapene til egl ine er de av stor interesse for anvendelse i medisinsk terapi (antiinflammasjon, antiflogi-stikk, septisk sjokk, lungeemfysem, mukoviscidose osv.).

I det siste er Eglin blitt tilgjengelig ved hjelp av rekombinante genteknikkfremgangsmåter (jfr. Europeisk patentmelding nr. 146785).

Hensikten med oppfinnelsen er å fremstille nye protease-inhibitorer ut i fra Eglin B eller Eglin C.

Hensikten ble ifølge oppfinnelsen oppnådd ved fremstilling av Eglinmutanter, som skiller seg fra naturlige Eglin B og C ved at en, to eller tre aminosyrer innenfor det aktive sentrumet (aminosyre 45 og 46, Leu-Asp) ble erstattet med andre aminosyrer. De ifølge oppfinnelsen tilveiebragte Eglin-mutantene utviser overraskende egenskaper: De fremhever seg i forhold til Eglin B og Eglin C ved at de har en høyere spesifisitet når det gjelder inhibering av bestemte proteaser eller ved inhibering av proteaser, som ikke eller nesten ikke ble inhibert av Eglin B og C, for eksempel trypsin eller trombin.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig en fremgangsmåte for fremstilling av modifisert Eglin B eller C ifølge formel

hvor R betyr hydrogen eller acetyl, W betyr Tyr eller His, X betyr Thr eller Pro, Y betyr Leu eller Arg og Z betyr Asp eller Ser, og salter derav, kjennetegnet ved at man

fremstiller mutert DNA som koder for modifisert Eglin B eller C ifølge ovennevnte formel, kloner dette kodende DNA i en ekspresjonsvektor transformerer en vertscelle dermed, dyrker de transformerte vertscellene og isolerer modifisert Eglin B eller C eller et salt derav.

Oppfinnelsen vedrører spesielt en fremgangsmåte for fremstilling av forbindelser med formel I kjennetegnet ved at R er acetyl, W er Tyr, X er Thr, Y er Arg og Z er Asp eller Ser, og salter derav.

De nye forbindelsene med formel I foreligger ikke bare i fri form, men også i form av deres salter, spesielt farmasøytisk akseptable salter. På grunn av at de inneholder flere aminosyrerester med frie aminogrupper henholdsvis guanidin-grupper, kan forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen, f.eks. foreligge i form av syreaddisjonssalter. Som syreaddisjonssalter kommer spesielt fysiologiske anvendbare salter med vanlig, terapeutisk anvendbare syrer i betrakt-ning. Som uorganiske syrer kan halogenhydrogensyrene, såsom klorhydrogensyre nevnes, men også svovelsyre og fosfor-henholdsvis pyrofosforsyre; som organiske syrer er sulfon-syrer (såsom benzen- eller p-toluensulfonsyre eller lavere-alkansulfonsyre, såsom metansulfonsyre) samt karboksylsyre, såsom eddiksyre, melkesyre, palmitin- og stearinsyre, eplesyre, vinsyre, askorbinsyre og sitronsyre egnede. På grunn av at Eglin-forbindelsene også inneholder aminosyrerester med frie karboksylgrupper, kan de også foreligge som metallsalter, spesielt som alkalimetall- eller jordalkali-metallsalter, f.eks. natrium-, kalium-, kalsium- eller magnesiumsalter, eller også som ammoniumsalt, avledet fra ammoniakk eller en fysiologisk godtagbar organisk nitrogen-holdig base. På grunn av at de både inneholder frie karboksylgrupper og frie amino (og guanidin)-grupper, kan de også foreligge som indre salter.

Eglin-mutantene og deres salter kan for eksempel bli fremstilt ved hjelp av i seg selv kjente fremgangsmåter, for eksempel genteknologisk fremgangsmåte, f.eks. idet man dyrker en transformert vertsorganisme, som inneholder et DNA, som koder for den nevnte Eglin-mutanten, og isolerer Eglin-mutanten eller et salt derav. Spesielt blir Eglin-mutantene og deres salter fremstilt i det man

a. fremstiller DNA som koder for Eglin-mutanten,

b. fører dette DNA i en vektor,

c. fører den tilveiebragte hybridvektoren ved transformasjon inn i en vertsmikroorganisme, d. dyrker den transformerte vertsorganismen under betingelser

som muliggjør en ekspresjon av Eglin-mutanten, og

e. isolerer Eglin-mutanten eller et salt derav.

DNA som koder for Eglin- mutanter

Oppfinnelsen vedrører også DNA, kjennetegnet ved at det koder for en modifisert Eglin B eller C med formel som angitt i krav 1.

DNA inneholder fortrinnsvis flankerende, egnede restrik-sjonssete tilknyttende sekvenser i deres ender, som muliggjør innsetting av DNA i en vektor.

DNA ifølge oppfinnelsen kan bli fremstilt ifølge i seg selv kjente fremgangsmåter. Man kan dermed fremstille DNA for eksempel kjemisk, eller man kan fremstille fragmenter ved kjemisk syntese og koble disse enzymatisk sammen på en forutbestemt måte, eller man kan mutere et DNA som koder for Eglin B eller Eglin C i et eller flere trinn.

Kjemisk syntese av DNA foregår ved hjelp av kjent fremgangsmåte. Egnede fremgangsmåter er beskrevet av S.A. Narang (Tetrahedron 39, 3 (1983)) og i europeisk patentskrift nr. 146785.

Fremstilling av DNA ifølge oppfinnelsen kan også foregå ved mutasjon av DNA som koder for Eglin B eller Eglin C. Fortrinnsvis anvendes "seterettet mutagenese"-fremgangsmåten (jfr. M.J. Zoller et al., Meth. Enzym. 100, 468 (1983)). Dermed blir Eglin-enkelttrådet-DNA klonet inn i bakteriofag M13, hybridisert med et komplementært oligonukleotid, som inneholder det (de) mutasjonsdirigerende nukleotid(ene), hybridiseringsproduktet blir ifylt til dobbelttråder, den oppnådde dobbelttrådete bakteriofagen blir ved transformasjon ført inn i en egnet Escherichia coli-vert, og etter dyrking av de transformert E. coli-cellene blir de cellene som inneholder DNA som koder for Eglin-mutantene, identifisert ved hybridisering med det ovenfor nevnte oligonukleotidet.

Fremstilling av ekspresjonsvektorer som inneholder et DNA som koder for en Eglin- mutant

Oppfinnelsen vedrører videre ekspresjonsvektorer som inneholder DNA-sekvenser som koder for en Eglin-mutant, som blir regulert av en ekspresjonskontrollsekvens derav, hvori Eglin-mutantene blir uttrykt i en av vertscellene som er transformert med disse ekspresjonsvektorene.

Ekspresjonsvektorene ifølge foreliggende oppfinnelse blir f.eks. fremstilt idet man i et vektor-DNA som inneholder en ekspresjonskontrollsekvens, innfører en DNA-sekvens som koder for Eglin-mutanten, hvori ekspresjonskontrollsekvensen regulerer DNA-sekvensen.

Valg av en egnet vektor avhenger av vertscellen som skal bli transformert. Egnede verter innbefatter f.eks. mikroorganismer, såsom gjær, f.eks. Saccharomyces cerevisiae, og spesielle bakteriestammer, hovedsakelig Escherichia coli-stammer eller Bacillus subtilis, eller celler fra høyere organismer, spesielt etablerte humane eller dyrecellelinjer. Foretrukne vertsceller innbefatter E. coli-stammer. Hovedsakelig er alle vektorer egnede som replikerer og uttrykker i den valgte verten DNA-sekvensen ifølge oppfinnelsen som koder for Eglin-mutantene.

Eksempler på vektorer som er egnede for ekspresjon i en E. coli-stamme av Eglin-mutanten, er bakteriofager, f.eks. derivater av bakteriofag X, eller plasmider, såsom spesielt plasmid colEl og derivater derav, f.eks. pMB9, pSF2124, pBR317 eller pBR322. De foretrukne vektorer ifølge foreliggende oppfinnelse er avledet fra plasmid pBR322. Egnede vektorer inneholder et fullstendig replikon og et markørgen, som muliggjør seleksjon og identifisering på grunn av en fenotypisk markør av organismen transformert med ekspresjonsplasmidet. Egnede markørgener gjør mikroorganismen for eksempel resistent overfor tungmetaller, antibiotika og lignende. Videre inneholder foretrukne vektorer ifølge foreliggende oppfinnelse også replikon- og markørgen-region-gjenkjenningssekvenser for restriksjonsendonukleaser, slik at de DNA-sekvensene som koder for Eglin-mutantene og de tilsvarende ekspresjonskontrollsekvensene kan bli ført inn i disse setene.

Flere ekspresjonskontrollsekvenser kan bli satt inn for regulering av ekspresjonen. Spesielt blir ekspresjonskontrollsekvensen til den transformerte vertscellen anvendt for sterkt uttrykte gener. Når det gjelder pBR322 som hybridvektor og E. coli som vertsorganisme er for eksempel egnede ekspresjonskontrollsekvenser (som blant annet inneholder promoteren og de ribosomale bindingssetene) laktose-operoner, tryptofanoperoner, arabinoseoperoner og lignende, 3-laktamasegener, de tilsvarende sekvensene til fag XN-genene eller fag fd-sjikt-proteingenene og andre. På grunn av at promoteren til e-laktamasegenene (g-lac-gen) allerede er i plasmid pBR322 må de andre ekspresjonskontrollsekvensene bli ført inn i plasmidet. Foretrukne ekspresjonskontrollsekvenser i foreliggende oppfinnelse er de til tryptofanoperoner (trp po). For replikasjon og ekspresjon i gjær inneholder egnede vektorer et gjær-replikasjonsorigo og en selektiv genetisk markør for gjær. Hybridvektorer, som inneholder et gjær-replikasjonsorigo, f.eks. det kromosomale autonome repliker-ende segment (ars), blir holdt ekstrakromosomalt innenfor gjærcellen etter transformeringen og blir ved mitosen autonomt replikert. Videre kan hybridvektorer, som inneholder gjaer-2u-plasmid-DNA homologe sekvenser bli anvendt. Slike hybridvektorer får etter rekombinasjon innenfor cellene inkorporert det eksisterende 2>j-plasmidet eller så replikeres de autonomt. Egnede markørgener for gjær er først og fremst slike som gjør at verten blir resistent ovenfor antibiotika, eller når det gjelder auksotrofe gjærmutanter, gener som kompiementerer vertsdefekten. Tilsvarende gener gir f.eks. resistens overfor cykloheksimidantibiotika eller sørger for prototrofi i en auksotrof gjærmutant, f.eks. URA3—, LEU2-, HIS3- eller spesielt TRPl-genet. Gjærhybridvektorene inneholder videre fortrinnsvis et replikasjonsorigo og et markørgen for en bakteriell vert, spesielt E. coli, slik at konstruk-sjonen og kloningen av hybridvektoren og forløperene kan foregå i en bakteriell vert. For ekspresjon i gjær er egnede ekspresjonskontrollsekvenser for eksempel de til TRP-, ADHI-, ADHII- eller PE05-genet, videre promoteren innbefattet i glykolytisk nedbrytning, f.eks. PGK- og GAPDH-promoteren.

Oppfinnelsen vedrører spesielt replikasjon og fenotypisk seleksjon av egnede ekspresjonsvektorer, som inneholder en ekspresjonskontrollsekvens og en DKA-sekvens som koder for Eglin-mutanten, slik at nevnte DNA-sekvens med transkrip-sjonsstartsignal og -terminasjonssignal, samt translasjons-startsignal og -stoppsignal i nevnte ekspresjonsplasmid under regulering av nevnte ekpresjonskontrollsekvens er ordnet slik at Eglin-mutanten blir uttrykt i en vertscelle • som er transformert med nevnte ekspresjonsplasmid.

For å oppnå en effektiv ekspresjon, må genet som koder for Eglin-mutanten være ordnet riktig (i "fase") med ekspresjonskontrollsekvensen. Det er fordelaktig å knytte ekpresjons-kontrollsekvensen rett mellom hoved-mRNA-start og ATG-sekvensen til sekvensen som koder for genet, som er naturlig knyttet sammen med ekspresjonskontrollsekvensen (f.eks. e-lac-kodende sekvensen ved anvendelse av e-lac-promotere), med Egl in-mutant-genet, som fortrinnsvis har med det egnede translasjonsstartsignalet (ATG) og translasjonsstoppsignalet (f.eks. TAG). Dermed blir en effektiv transkripsjon og translasjon mulig.

Transformering av mikroorganismer

Oppfinnelsen vedrører også en vertsmikroorganisme egnet for ekspresjon av modifisert Eglin B eller C som er kjennetegnet ved at den inneholder en ekspresjonsvektor som nevnt ovenfor.

Egnede vertsceller er for eksempel mikroorganismer, såsom stammer av Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis og spesielt Escherichia coli. Transformering med ekspresjons-plasmidene ifølge oppfinnelsen foregår for eksempel som beskrevet i litteraturen, for S. cerevisiae (A. Hinnen et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75, 1929 (1989)), B. subtilis (Anagnostopoulos et al., J. Bacteriol. 81, 741 (1961)) og E.

coli (M. Mandel et al., J. Mol. Biol. 53, 159 (1970 )). Isolering av den transformerte vertscellen foregår fortrinns-

vis ut av et selektivt næringsmedium som biocidet tilsettes til, og som markørgenet i ekspresjonsplasmidet gir resistens overfor. Celler som ikke holder ekspresjonsplasmidet dør i et slikt medium.

Dyrking av den transformerte vertscellen og utvinning av Eglin- mutanter

De transformerte vertscellene blir anvendt for fremstilling

av Eglin-mutanter. Fremgangsmåten for fremstilling av Eglin-mutantene karakteriseres ved at den ovenfor nevnte transform-

erte vertscellen blir dyrket og at produktet blir frigjort fra vertscellen og isolert.

Oppfinnelsen vedrører spesielt en fremgangsmåte for fremstilling av Egl in-mutanter med formel I og salter av slike forbindelser karakterisert ved at man dyrker den transformerte vertscellen som inneholder et ekspresjonsplasmid, som regulerer en ekspresjonskontrollsekvens, og som inneholder en DNA-sekvens som koder for en Eglin-mutant med formel I, i et flytende næringsmedium som inneholder assimilerbar karbon- og nitrogenkilde, og hvori produktet frigjøres fra vertscellen og isoleres, og, hvis ønskelig, skilles blandingen av forbindelser med formel I som oppnåes ifølge fremgangsmåten, i enkelte komponenter og, hvis ønskelig, overføres et oppnådd salt til det frie polypeptidet eller et oppnådd polypeptid til et salt.

Dyrkingen av de transformerte vertscellene ifølge oppfinnelsen foregår på i seg selv kjent måte. For dyrkingen av de transformerte vertsorganismene ifølge oppfinnelsen kan forskjellige karbonkilder anvendes. For eksempel er foretrukne karbonkilder assimilerbare karbohydrater, som glukose, mal tose, mannit eller' laktose, eller et acetat, som enten kan anvendes alene eller i egnede blandinger. Egnede nitrogen-kilder er for eksempel aminosyrer, såsom kasaminosyrer, peptider og proteiner og deres nedbrytningsprodukter, såsom trypton, pepton eller fleskeekstrakter; videre gjæreks-trakter, maltekstrakt, såsom ammoniumsalt, f.eks. ammonium-klorid, -sulfat eller -nitrat, som enten kan anvendes alene eller i egnede blandinger. Uorganiske salter, som også kan bli anvendt, er f.eks. sulfat, klorid, fosfat og karbonat av natrium, kalium, magnesium og kalsium.

Videre inneholder mediet f.eks. vekstkrevende forbindelser, såsom sporelementer, f.eks. jern, sink, mangan og lignende, og foretrukne forbindelser, som utøver et seleksjonstrykk og som forhindrer veksten av celler som har mistet ekspresjonsplasmidet. Dermed blir for eksempel ampicillin tilsatt til mediumet, når ekspresjonsplasmidet inneholder et amp^-gen. En slik tilsetning av antibiotiske virksomme forbindelser fører også til at kontaminerende, antibiotikaømfindtlige mikroorganismer blir drept.

Dyrkingen utføres ved en i seg selv kjent fremgangsmåte. Dyrkingsbetingelsene, såsom temperatur, pH-verdi til mediumet og fermenteringstid, blir valgt på en slik måte at maksimale titere av Eglin-mutanter blir oppnådd. I en E.coli- eller en gjær-stamme fortrinnsvis dyrket under aerobe betingelser i submers kultur under rysting eller røring ved en temperatur på omtrent 20 til 40°C, fortrinnsvis omtrent 30"C, og en pH verdi på 4 til 9, fortrinnsvis ved pH 7, i omtrent 4 til 20 t, fortrinnsvis 8 til 12 t. Dermed blir ekspresjonsproduktet samlet intracellulært.

Når celletettheten har oppnådd en tilstrekkelig verdi, avbrytes dyrkingen og produktet frigjøres fra cellene til mikroorganismene. Dermed blir cellen ødelagt, f.eks. lysert ved behandling med en detergent, såsom SDS eller triton, eller med lysozym eller et enzym som virker på lignende måte. Man kan alternativt eller i tillegg anvende mekaniske krefter, såsom skjærkrefter (f.eks. X-presse, French-presse, Dyno-Mill) eller rysting med glassperler eller aluminium-oksyd, eller vekselsvis frysing, f.eks. i flytende nitrogen, og opptining, f.eks. i 30° til 40°, samt ultralyd for å åpne cellene. Den resulterende blandingen som inneholder proteiner, nukleinsyrer og andre cellebestanddeler, blir etter sentrifugeringen på kjent fremgangsmåte anriket for proteinene. Slik kan f.eks. den største delen av ikke-protein-bestanddelene bli adskilt ved polyetylenimin-behandling og proteinene til Eglin-forbindelsene kan til slutt bli utfelt f.eks. ved metting av oppløsningen med ammoniumsulfat eller med andre salter. Bakterielle proteiner kan også bli utfelt ved hjelp av surgjøring med eddiksyre (f.eks. 0, 1%, pH 3-5). En videre anrikning av Eglin-mutantene kan oppnås ved ekstraksjon av eddiksyresupernatantene med n-butanol. Ytterligere rensningstrinn omfatter f.eks. kromatografiske fremgangsmåter, såsom ionebyttekromatografi, gelfiltrering, gelpermeasjonskromatografi, fordelingskromatografi, HPLC, reversert fase-HPLC og lignende. Deretter følger adskilling av blandingsbestanddelene ved dialyse, ifølge ladning ved hjelp av gel- eller bærerfri elektroforese, ifølge molekyl-størrelse ved hjelp av en egnet sephadex-søyle, ved affinitetskromatografi, f.eks. med antistoff, spesielt monoklonale antistoffer, eller anhydrochymotrypsin eller trombin koblet til en egnet bærer for affinitetskromatografi, eller ved hjelp av andre fremgangsmåter kjent innenfor litteraturen.

Isolering av de uttrykte Eglin-mutantene foregår for eksempel ved hjelp av følgende trinn: Separering av cellene fra kulturløsningen ved hjelp av sentrifugering, fremstilling av et råekstrakt ved ødelegging av cellene, f.eks. ved hjelp av Dyno-Mill, sentrifugere ut de uløselige bestanddelene; utfelling av de bakterielle proteinene ved hjelp av 1% eddiksyre, gelfiltrering på Sephadex G50 (eller G75), og eventuelt reversert fase-HPLC. TJtsaltingen foregår for eksempel på Sephadex G25.

For påvising av Eglin-mutantene kan testen med anti-Eglin-antistoffene, såsom polyklonale antistoffer fra kanin eller monoklonale antistoffer fra hybridomceller, f.eks. monoklonale antistoffer fra hybridom-cellelinjen 299S18-20 (CNCM I-361), 299S20-1 (CNCM 1-362) eller 299S20-10 (CNCM 1-363) eller hemming av målproteåsene, f.eks. humanleukocytt-elastase (HLE) eller katepsin G (Cat G) (jfr. LT. Seemiiller et al., Hoppe-Seyler<*>s Z- physiol. Chem. 358, 1105 (1977 ); U. Seemiiller et al., Meth. Enzym. 80, 804 (1981)) utføres.

Blanding av forbindelser med formel I oppnådd ifølge oppfinnelsen, eventuelt bestående av forbindelser med formel I, hvori R enten står for H eller acetyl, kan bli adskilt på kjent måte i de enkelte komponentene. Egnede fremgangsmåter for adskilling innbefatter f.eks. kromatografiske fremgangsmåter, f.eks. adsorpsjons-kromatografi, ionebyttekromatografi, HPLC eller reverst-fase HPLC, ytterligere multiplika-tive fordeling eller elektroforetiske fremgangsmåter, f.eks. elektroforese på celluloseacetat eller gelelektroforese, spesielt polyakrylamid-gelelektroforese ("PAGE").

Ifølge hvilken fremgangsmåte som ble anvendt oppnår man forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen i fri form eller i form av syreaddisjonssalter, indre salter eller salter med baser. Ut i fra syreaddisjonssaltene kan de frie forbindelsene bli utvunnet ved hjelp av i seg selv kjent måte. De sistnevnte kan oppnåes ved omsetting med syrer eller baser, f.eks. med slike, som danner de ovennevnte saltene, og inndamping eller frysetørring av terapeutisk anvendbare syreaddisjonssalter eller metallsalter. De indre saltene kan bli utvunnet ved innstilling av pHen til egnet nøytralpunkt.

Farmasøytiske preparater

De nye Eglin-mutantene med formel I utviser verdifulle farmakologiske egenskaper og kan bli anvendt til profylakse eller terapi av sykdomstilstander som krever tilsetting av protease-inhibitorer.

De nye Eglin-mutantene viser en virkningsprofil som protease-inhibitorer, som adskiller seg fra de samme naturlige Eglin B og C ved at inhiberingsvirkningen overfor bestemte proteaser blir forsterket, samt at bestemte proteaser som ikke blir inhibert av de naturlige Eglinen blir sterkt inhibert, mens inhiberingsvirknigen overfor noen naturlige målproteaser for egliner, såsom f.eks. granulocytt-elastase bli svekket eller forsvinner. Dermed tilveiebringer eksempelvis forbindelser med formel I, hvori R står for hydrogen eller acetyl, W står for Tyr eller His, X står for Pro, Y står for Met og Z står for Asp en forsterket inhibering av humant og fra dyr granulocytt-elastase i forhold til de naturlige Egliner og kan dermed bli anvendt såsom de naturlige Eglinen f.eks. til behandling av lungeemfysem, ARDS ("acute respiratory distress syndrome"'), septisk sjokk, reumatisk leddgikt og mukoviski-dose. Forbindelser med formel I, hvori R og W har betydningene som i formel I, X står for Thr, Y står for Arg eller Lys og Z står for Asp, har i forhold til de naturlige Eglinen en utpreget inhibisjonsvirkning på trypsin og bare en svak virkning ovenfor granulocytt-elastase og katepsin G. Dette vedrører spesielt forbindelsen med formel I, hvori R står for acetyl, W står for Tyr, X står for Thr, Y står for Arg og Z står for Asp. Slike forbindelser kan, i analogi til apro-tinin, f.eks. bli anvendt for behandling av pankreatitis og de traumatiske, pankreatogene og hemoragiske sjokk. Forbindelser med formel I, hvori R, W og X har de under formel I angitte betydningene, Y står for Arg eller Lys og Z står for Asp, viser en utpreget inhibisjonsvirkning overfor trombin og kan fortrinnsvis bli anvendt i kombinasjon med antitrombin-III, f.eks. for behandling av trombose, tromboemboli, septisk og posttraumatisk sjokk og forbrukskoagulopati.

Farmasøytiske sammensetninger, som i det minste inneholder en av forbindelsene ifølge oppfinnelsen eller deres anvendbare farmasøytiske salter, eventuelt sammen med en konvensjonell farmasøytisk anvendbar bærer og/eller hjelpestoffer kan fremstilles. Disse sammensetningene kan spesielt finne anvendelse ved de ovenfor angitte indikasjonene, når de f.eks. blir gitt parenteralt, såsom intravenøst, intrakutant, subkutant eller intramuskulært eller topisk.

Doseringen avhenger i første rekke av den spesifikke admini-streringsformen og hensikten med terapien, henholdsvis profylaksen. Størrelsen på enkeltdosen samt administrerings-skjemaet kan best bestemmes med hensyn på en individuell bedømmelse av det aktuelle sykdomstilfellet; de i til dette nødvendige fremgangsmåtene for bestemming av relevante faktorer, såsom blodfaktorer er kjent for fagmannen.

Kår det gjelder trombin-inhiberende Eglin-mutanter innbefatter en injeksjon av den terapeutiske virksomme mengden i et doseområde på omtrent 0,005 til omtrent 0,1 mg/kg kroppsvekt. Et område på omtrent 0,01 til omtrent 0,05 mg/kg kroppsvekt er foretrukket. Administreringen utføres ved intravenøs, intramuskulaer eller subkutan injeksjon. Tilsvarende oppnådde farmasøytiske preparater for parenteral administrering i enkeltdose-form avhenger av applikasjonsart pr. dose er på 0,4 til omtrent 7,5 mg av forbindelsen ifølge oppfinnelsen. Ved siden av den aktive forbindelsen inneholder disse farmasøytiske sammensetningene også enda en buffer, f.eks. en fosfatbuffer, som skal holde pE-verdien mellom omtrent 3,5 og 7, og videre natriumklorid, mannit eller sorbit for fremstilling av isotoni. De kan foreligge i frysetørret eller oppløst form, hvorved oppløsningen med fordel kan inneholde et antibakterielt virkende konserveringsmiddel, f.eks. 0,2 til 0, 3% 4-hydroksybenzosyre-metylester eller -etylester.

Et preparat for topisk anvendelse av trombin-inhiberende Eglin-mutanter kan også foreligge som vandig oppløsning, lotion eller gel, oljeaktig oppløsning eller suspensjon, eller fettholdig eller spesielt emulsjonssalve. Et preparat i form av en vandig oppløsning tilveiebringes eksempelvis ved at man løser de aktive forbindelsene ifølge oppfinnelsen eller et terapeutisk anvendbart salt derav i en vandig buffer løsning ved pE 4 til 6,5, og hvis ønskelig tilsetter et ytterligere virkestoff, f.eks. et anti-inflammatorikum, og/eller et polymerholdig heftemiddel, f.eks. polyvinylpyrro-lidon, og/eller et konserveringsmiddel. Konsentrasjonen til de aktive forbindelsene inneholder omtrent 0,1 til omtrent 1,5 mg, fortrinnsvis 0,25 til 1,0 mg, i 10 ml av en oppløs-ning henholdsvis 10 g av en gel. En oljeaktig applikasjons-form for topisk administering oppnår man eksempelvis ved suspendering av de aktive forbindelsene ifølge oppfinnelsen eller et terapeutisk anvendbart salt derav i en olje, eventuelt under tilsetting av svellemidler, såsom aluminium-stearat, og/eller overflateaktive midler (tensider), hvori HLB-verdien ("hydrofilisk-lipofilisk-balanse") ligger under 10, såsom fettsyremonoester flerverdig alkohol, f.eks. glycerinmonostearat, sorbitanmonolaurat, sorbitanmonostearat eller sorbitanmonooleat. En fettholdig salve oppnår man f.eks. ved suspendering av den aktive forbindelsen ifølge oppfinnelsen eller saltet derav i et smørbart fettgrunnlag, eventuelt under tilsetting av et tensid med HLB-verdi under 10. En emulsjonssalve oppnår man ved pulverisering av en vandig oppløsning av den aktive forbindelsen ifølge oppfinnelsen eller saltet derav i et svakt, smørbart fettunderlag under tilsetting av et tensid, hvori HLB-verdien ligger under 10. «Alle disse topiske applikasjonsformene kan også inneholde konserveringsmiddel. Konsentrasjonen til de aktive forbindelsene utgjør omtrent 0,1 til omtrent 1,5 mg, fortrinnsvis 0,25 til 1,0 mg, i omtrent 10 g av grunnmassen.

Administrering av elastase-inhiberende Eglin-mutantene foregår ved intravenøs injeksjon eller intrapulmonalt, ved inhalering, f.eks. med et Bird-apparat. De oppnådde farmasøy-tiske preparatene for parenteral administrering i enkeltdose-form avhenger av applikåsjonsart pr. dose er på omtrent 10 til 50 mg av forbindelsen ifølge oppfinnelsen. Bortsett fra den aktive forbindelsen inneholder disse farmasøytiske sammensetningene eventuelt enda natriumklorid, mannit eller sorbit for å innstille isotonien. De kan foreligge i fryse-tørket eller oppløst form, hvori oppløsningen med fordel kan inneholde et antibakterielt virkende konserveringsmiddel, f.eks. 0,2 til 0, 3% 4-hydroksybenzosyre-metylester eller

—etylester.

Preparatet for topisk anvendelse av elastase-inhiberende Eglin-mutanter tilsvarer i store trekk beskrivelsen ovenfor.

Inhalasjonspreparater for behandling av luftveiene ved intrapulmonal administrering innbefatter f.eks. aerosol eller spray, hvori den farmakologiske aktive forbindelsen kan bli fordelt i form av dråper av en oppløsning eller suspensjon. Preparater hvori den farmakologiske aktive forbindelsen foreligger i løsning inneholder også et egnet drivmiddel, videre, hvis nødvendig, et ytterligere oppløsningsmiddel og/eller en stabilisator. Istedenfor drivgass kan man også anvende trykkluft, hvorved disse ved hjelp av et egnet fortetnings- og avspenningsapparat etter behov kan bli anvendt. Spesielt egnede for administrering er Bird-inn-åndingsapparater, kjent innenfor medisinen; dermed blir en oppløsning av de aktive forbindelsene ført inn i apparatet og med lett overtrykk damplagt og ført inn i lungen til den åndende pasienten.

Dosering av elastase-inhiberende Eglin-mutanter avhenger av alder, individuell tilstand og sykdomstype, til et varmblodig (menneske eller dyr) på omtrent 70 kg vekt ved intrapulmonal administering på 10 til omtrent 30 mg pr. inhalering (en- til to ganger daglig) og ved intravenøs administrering, og ved kontinuerlig infusjon, på omtrent 10 til omtrent 1000 mg pr. dag. Terapeutisk virksomme spytt- og plasmakonsentrasjoner som ved hjelp av immunologiske fremgangsmåter, såsom ELISA kan bli bestemt, ligger mellom 10 og 100 jjg/ml (ca. 1 til 10

>imol/l).

Administrering av trypsin-inhiberende Eglin-mutanter foregår f.eks. ved parenteral, såsom intravenøs, intramuskulær eller subkutan injeksjon. Den terapeutiske virksomme mengden ligger innenfor doseområdet på omtrent 1 til 20 mg aktiv forbindelse/kg kroppsvekt. De farmasøytiske preparatene som inneholder den aktive forbindelsen i en konsetrasjon på ca. 0,1 til ca. 100 mg/ml oppløsning. Bortsett fra den aktive forbindelsen inneholder disse farmasøytiske preparatene enda en buffer, f.eks. en fosfatbuffer (se ovenfor), samt natriumklorid, mannit eller sorbit for innstilling av isotoni.

Skadedvrbek. i empelsesmiddel

De nye Eglin-mutantene med formel I kan også anvendes som proteinase-inhibitorer ved skadedyrbekjempelse av planter. De naturlig forekommende Serin-protease-inhibitorene i forskjellige plantearter antas å utgjøre et effektivt vern mot fytopatogene insekter, sopp og andre mikroorganismer idet de hemmer serinproteasen i den nevnte organismen. Dermed kan både monokotyledon og dikotyledone planter bli transformert med et DNA som koder for en heterolog protease-inhibitor som f.eks. for Eglin B eller C, eller for en Eglin-mutant med formel I. Ekspresjonen av det nevnte aktive proteinase-inhibitoren gir den transformerte planten vern overfor fytopatogene angrep.

For transformering av planter med egnede ekspresjonsvektorer, som inneholder DNA som koder for en forbindelse ifølge oppfinnelsen og ekspresjonskontrollsekvensen, står til rådighet ved hjelp av kjente metoder såsom f.eks. kokultiver-ing av protoplaster eller isolerte vevfragmenter med agro-bakterier, som inneholder de tilsvarende vektorene og den etterfølgende regenerering til fullstendige planter eller overføring av vektorer ved hjelp av egnede, tilsvarende modifiserte virus, såsom f.eks. TMV (Tobakkmosaikkvirus) eller CaMV ("cauliflower mosaic virus"). Ytterligere fremgangsmåter innbefatter f.eks. direkte overføring av isolerte DNA, (spesielt når det gjelder monokotylene planter såsom mais, havre, bygg, ris, sorgum, hvete, sukkerroer og andre) ved hjelp av PEG, gjennom elektroporasjon, ved mikroinjeksjon av DNA i isolerte protoplaster, plantekalli eller embryoer eller gjennom "mikroprosjektilbombardement" og andre.

For transformering i planter egner DNA-molekyler seg som koder for en forbindelse fremstilt ifølge oppfinnelsen. Foretrukne DNA-molekyler innbefatter de som koder for en Eglin-mutant med formel I, hvori R er acetyl, W er Tyr, X er Thr, Y er Arg og Z er Asp. Den protease-inhiberende virk-ningen til de foretrukne Eglin-mutantene kan bli undersøkt i forsøk med maispatogene Diabrotica virgifera ("western corn root worm"). Tilsetting av de foretrukne Eglin-mutanter til homogenater bestående av tarmvev fra patogener fører til en sterk hemming av den proteolytiske aktiviteten.

Eksempel 1: M13- kloning av Eglin C- gener

10 pg plasmid pML 147 ble spaltet med restriksj ons-endo-nukleasene EcoRI og BamHI og deretter ble det kjørt en elektroforese i 1,556 laveresmeltende agarose og ca. 0,5 ug av det 230 bp store EcoRI-BamHI-fragmentet (inneholder hele Eglin C-genet) isolert. Dette DNA-fragmentet (10 ng) blir blandet med 40 ng M13mp8 DNA (spaltet med EcoRI og BamHI) og inkubert i 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM MgCl2, 10 mM ATP, 10 mM ditiotreitol ved tilstedeværelse av 0,125 enheter T4-DNA-ligase i et volum på 15 ul (Zoller et al., Methods Enzym. 100, 468-500 (1983)). Denne oppløsningen blir anvendt for transformering av E. coli-stammen JM101 (Zoller et al., s.o.). Transformeringsblandingen blir sådd på X-Gal (IPTG-Indikator)-Agarplater (Zoller et al., s.o.). Man oppnår 40 blå (villtype) og 650 farveløse plaque.

Eksempel 2: Fremstilling av M13mp8 enkelttrådet- DNA

2 ml av en kultur av E. coli JM101 (dyrket i L-medium: 10 g bacto-tryptone, 5 g bacto-gjærekstrakt, 5 g NaCl, 5 g glukose, 0,1 g ampicillin pr. 1 1, til en 0D^23 = ca- °»5) blir blandet med en farveløs plaque (plukket fra agarskålen, se eksempel 1) og holdt i ca. 4-5 timer ved 37° C, 180 upm. Deretter blir den voksende kulturen sentrifugert i 5 minutter i en Eppendorf-sentrifuge. Supernatanten blir overført til et nytt sentrifugerør, sentrifugert en gang til og omsatt med 200 ul 20% polyetylenglykol, 1,5 M NaCl, holdt i 20 minutter ved romtemperatur og til slutt på ny sentrifugert. Supernatanten blir kastet og pelleten blir løst opp i 100 pl 50 mM Tris-HCl pH 7,8, 1 mM EDTA (TE). Blandingen blir blandet med 50 pl fenol/TE (15 minutter ved romtemperatur) og deretter sentrifugert i 5 minutter i en Eppendorf-sentrifuge. 100 ul av supernatanten blir omsatt med 10 pl natriumacetat pH 6 og 3 volum absolutt etanol (250 pl), og holdt over natt ved

—20°C og deretter sentrifugert som ovenfor i 10 minutter. Pelleten blir vasket med 1 ml 80% etanol og på ny sentrifugert. Pelleten blir tørket i 10 minutter ved romtemperatur

og deretter løst opp i 50 pl TE. Oppløsningen inneholder ca.

5 pg M13 mp8 enkelttrådet DNA.

Eksempel 3: Fremstilling av gener som koder for fArg45~ l-Eglin C

a. Kinasebehandling av de nmtagene oligonukleotidene

For mutagenesen blir følgende oligonukleotid fremstilt ved hjelp av kjemisk syntese: 10 pl av oligonukleotidene (1 OD/ml = 500 ng) blir kinase-behandlet i 20 pl 0,07 M Tris-HCl pH 7,6, 0,01 M MgCl2, 50 mM ditiotreitol med ["y-<32>P]ATP og T4 polynukleotid-kinase (Boehringer) [jfr. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, ed. T. Maniatis et al., S. 125]. Det kinasebehandlede oligonukleotidet blir løst i 10 pl TE (50 ng/pl).

b. Mutas. ion av Eglin C- gener

MLTASJONSSKJEMA

1 pg M13mp8 enkelttrådet-DNA blir holdt med 50 ng av den kinasebehandlede oligonukleotid-primeren i 10 pl 50 mM Tris-HCl pH 7,8, 100 mM MgCl2 ved 45°C (30 minutter) og deretter ved romtemperatur (5 minutter) ("sammensmelting"). Deretter blir følgende satt til blandingen:

1 ul 10 mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP,

1 pl T4-DNA-ligase

2 pl 50 mM ditiotreitol

1 pl 10 mM ATP

1 pl 5 mg/ml gelatin

1 pl 10 x kons. Klenow-buffer (0,66 M Tris-HCl pH 7,6,

50 mM MgCl2, 50 mM ditiotreitol)

1 pl DNA-polymerase (Klenow-fragment) = 2,5 enheter

Blandingen blir holdt i 5 minutter ved 22°C og deretter i 16 timer ved 15°C og deretter til slutt separert elektroforetisk i en 1% agarose. Det oppnådde sirkulære, dobbelttrådete DNA blir gjort synlig med etidiumbromid og isolert ut av gelen ved elektroeluering (ca. 10 ng i 15 pl TE). 5 pl (= ca. 3,5 ng) av på denne måten utvunnede DNAet blir transformert i E. coli-stammen JM101 og sådd ut på X-Gal/IPTG indikatorskåler (se eksempel 1). Ca. 100 farveløse plaque blir tilveiebragt. 40 av disse plaquene blir anvendt for koding av en 2 ml E. coli JMlOl-kultur (se eksempel 2). E. coli-cellene blir etter dyrkingen (eksempel 2) sentrifugert for å fjerne supernatanten (inneholder fag og enkelttrådet-DNA, cellepelleten inneholder det nevnte, muterte dobbelttrådete DNAet).

Porsjoner på 50 pl av 40 fag-supernatantene blir filtrert over nitrocellulose, vasket (2 x TE), holdt i 2 timer ved 80°C i vakuum og ifølge Southern [J. Mol. Biol. 98, 503-517

(1975)] hybridisert med oligonukleotidprimeren som radioaktiv markør for undersøkelse for tilstedeværelse av den muterte DNA-sekvensen (III, se skjema). L"t av dette resulterte 12 potensielle fagsupernatanter inneholdende [Arg45]-Eglin-C-genet. Fire av disse positive fagsupernatantene ble fortynnet (ca. 1:10<5>), blandet med E. coli-stamme JM101 og sådd ut på indikator-agar. Fag ut av hver av tre av de oppståtte plaquene ble isolert. Som beskrevet ovenfor ble enkelttrådet DNA isolert. Disse 12 enkelttrådete-DNAene ble sekvensert i Sanger [Science 214, 1205 (1981); Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74, 5463 (1977)]. Alle 12 enkelttrådete-DNAene viser de ønskede muterte Eglin C-sekvensene.

Fra de tilsvarende E. coli-cellepelletene (se ovenfor) blir det tilsvarende, muterte dobbelttrådete-DNA ([Arg45]-Eglin C-genet i plasmid M13mp8) fremstilt i et miniprep.

Ved restriksjons-spalting med restriksjonsendonukleasene EcoRI og BamHI blir EcoRI-BamHI-innskuddet inneholdende det muterte genet spaltet ut av vektoren, isolert og klonet inn i vektor pHRil48/EcoRI/BamHI (europeisk patentskrift nr. 146785). Det oppnådde plasmid pJB618 blir isolert og transformert inn i E. coli-stamme HB101. Stammen som er blitt transformert med plasmid pJB618 blir betegnet som E. coli HB101/pJB618.

Eksempel 4: Fremstilling av gener som koder for fPro44]- Egl in

C .

På en analog måte som i eksempel 3 blir [Thr44]-*[Pro44]-mutasjonen utført. Det anvendte mutagene oligonukleotidet har følgende struktur

Mutasjon av Eglin C-genet blir oppnådd ifølge følgende skj ema.

Ved opparbeiding av mutasjonsblandingen blir 18 potensielle [Pro44]-Eglin C-mutanter oppnådd.

Med kloning av [Pro44]-Eglin C-DNA i vektoren pHEil48/EcoRI/-

BamEI oppnår man på analog måte, som beskrevet i eksempel 3, plasmidet pJB591. E. coli EBlOl-stammen som er blitt transformert med dette plasmidet blir E. coli HB101/pJB591.

Eksempel 5; Fremstilling av genene som koder for TArg45. Ser46l- Eglin C

På analog måte som beskrevet i eksempel 3 blir [Leu45 ,Asp46]-»[Arg45 ,Ser46]-mutasjonen utført. Det anvendte mutagene oligonukleotidet har følgende struktur

Mutasjon av Eglin C-genet blir utført ifølge følgende skjema.

Ved opparbeiding av mutasjonsblandingen blir 12 potensielle [Arg45,Ser46]-Eglin C-mutanter oppnådd.

Ved kloning av [Arg45,Ser46]-Eglin C-DNA i vektoren pHRi148/EcoRI/BamHI oppnår man på analog måte som beskrevet i eksempel 3 plasmid pML147/b. E. coli HBlOl-stammen som er transformert med dette plasmidet blir betegnet som E. coli HB101/pML147/b.

Eksempel 6: Dyrking av de transformerte E. coli- stammene

De transformerte E. coli HBlOl-stammene blir dyrket over natt ved 37°C og 250 upm i 5 ml L-medium (se eksempel 2). 1 ml av denne overnatt-kulturen blir deretter overført i 25 ml M9-medium. M9-medium er sammensatt som følger (pr. 11):

Kulturen blir dyrket ved 37° C og 250 upm. Etter 8-10 timer har kulturen det høyeste titer av Eglin C-mutanter [bestemt ifølge målingen av proteasehumanleukocytt-elastase ifølge L". Seemuller et al., Hoppe-Seyleræs Z. Physiol. Chem. 358,

(1977)] oppnådd.

Eksempel 7: Isolering og rensing av Egl in- mutanter

De overproduserende E. coli-cellene blir åpnet mekanisk ved hjelp av en Dyno-Mill. Cellerestene blir sentrifugert ut i en Sorval-sentrifuge ved 9000 upm i 30 minutter.

På grunn av den høye stabiliteten til Eglin-mutantene i forhold til syrene kan det meste av fremmedproteinene i supernatanten bli fjernet ved felling med ca. 2056 eddiksyre: 10 ml 4056 vandig eddiksyre blir dråpevis pipettert i løpet av 10 minutter til 100 ml av supernatanten. Den sure oppløs-ningen (pH 3,4) blir rørt i 1 time under isavkjøling. De presipiterte fremmedproteinene og andre cellebestanddeler blir sentrifugert i en Sorval-sentrifuge ved 9000 upm i 30 minutter. Supernatanten blir frysetørret over natt i en Virtis-frysmobil.

Det inntørkede gulaktige frysetørrede materialet blir løst i 10 ml 10 mM Tris-HCl pH 7,8 og for oppklaring kort sentrifugert (Sorval SS34: 15000 upm, 10 minutter). Den klare gule supernatanten blir applisert på en ekvilibrert Sephadex G-50 superfin-søyle (Pharmacia) med en lengde på 100 cm og en diameter på 2,5 cm. Det blir eluert med 10 mM Tris-HCl pH 7,8 og en strømningshastighet på maks. 20 ml/t. Absorpsjonen av eluatet ved 280 nm blir registrert. Fraksjoner å 10 ml blir oppsamlet. Elueringsdiagrammet viser en høy topp (fraksjonene 31-40), som inneholder de nevnte Eglin-mutantene. Renheten av Eglin-mutantene i denne fraksjonen blir bestemt ved SDS-gelelektroforese og HPLC. Etter gelfiltreringen viser Eglin-mutantene en renhet på ca. 9956.

Fjerning av bufferen fra Eglin-mutant-fraksjonene foregår med en AMICON-konsentrasjonscelle med YM-2-membran (MWCO 2000). Etter ultrafiltreringen blir probene påny frysetørret. Man oppnår et farveløst pulver (ca. 250 mg/100 ml Dyno-Mill-oppslemming), som blir lagret ved —20°C.

Eksempel 8: Fysiokiemisk karakterisering av Eglin- mutantene

a. rPro44l- Eglin C

Det ifølge eksempel 7 rensede [Pro44]-Eglin C blir under-kastet en molekylvektsmestemmelse ved hjelp av FAB-MS. Molekyliontoppen [M-H<+>] blir vist ved 8130,6. Deretter dreier det seg om produktet tilveiebragt ifølge oppfinnelsen, dvs. N-acetyl-[Pro44]-Eglin C (teoretisk verdi for M-H+: 8130,07).

Ved tryptisk nedbryting av Eglin-mutantene ble 7 fragmenter oppnådd, disse skiller seg bare fra det tilsvarende fragmentet til Na<->Acetyl-Eglin C (jfr. europeisk patentskrift nr. 146785) med fragment 4 som inneholder mutasjonen Thr44->Pro44. Eglin-mutantene blir betegnet som Na<->acetyl-[Pro44]-Eglin C.

I PAGE-SDS-gelelektroforese (jfr. U.K. Laemmli, Nature 227, 680-685 (1970)) forholder Na<->acetyl-[Pro44]-Eglin C seg som Na<->acetyl-eglin C.

b. rArg45l- Eglin C

Molekylvektsbestemmelsen av det rensede [Arg45]-Egl in C tilveiebringer en verdi på 8175,4 [M-H<+>]. Dermed er en N-acetyl-forbindelse også tilstedeværende her (teoretisk verdi for M—H<+>: 8175). Den enzymatiske nedbrytningen med trypsin bekrefter at det dreier seg om Na<->acetyl-[Arg45]-Eglin C.

I PAGE-SDS-gelelektroforesen forholder Na<->acetyl-[Arg45]-Eglin C seg også som Na<->acetyl-eglin C.

c. fArg45, Ser46l- Eglin C

Molekylvektsbestemmelsen av renset [Arg45,Ser46]-Eglin C tilveiebringer en verdi på 8148,7 [M-H+] . Dermed foreligger også her en N-acetyl-forbindelse (teoretisk verdi for M-H+: 8149,1). Tryptisk nedbrytning av Eglin-mutantene viser at det dreier seg om Na<->acetyl-[Arg45,Ser46]-eglin C.

I PAGE-SDS-gelelektroforesen forholder Na<->acetyl-[Arg45,Ser46]-eglin C seg også som Na<->acetyl-eglin C.

Eksempel 9: Kinetisk karakterisering av eglin- mutantene Bestemmelse av inhibisjonskonstanten K-^ foregår ifølge N. Braun et al. [Biol. Chem. Hoppe-Seyler 368, 299-308 (1987)] ved måling av steady-state reaksjonshastigheten ved fri-gjøringen av p-nitroanilin fra proteinase-inhibitor-substrat-blandinger. Bare inhibitor-konsentrasjonen blir variert. Frigjøring av p-nitroanilin blir, etter at OD405~kurven som funksjon av tiden var lineær, tegnet opp i 10 til 20 minutter. Ut i fra de forskjellige stigningene kan Kj bli bestemt. Som proteaser anvendes humanleukocytt-elastase (ELE), chymotrypsin og trypsin. Eksemplariske inhibisjonskonstanter er satt opp i følgende tabell:

Resultatene viser at ved utbytting av Leu45 mot Arg45 blir en Eglin C-mutant oppnådd, som i motsetning til naturlig Eglin C er en sterk trypsin-inhibitor, men bare en svak ELE-inhibitor.

Eksempel 10: Ekspresjon av [ Arg45]- Egl in C og N^- acetvl-fArg45]- eglin C i gjær

En vektor for ekspresjon av fremmede gener i gjær inneholder en sterk, fortrinnsvis induserbar gjærpromoter og et til-knyttet transkripsjonstermineringssignal, som er forbundet med promoteren gjennom enkelte restriksjonssteder, som tillater innføring av fremmede gener. Videre inneholder en gjærekspresjonsvektr DNA-sekvenser som muliggjør autonom replikasjon av vektorene og som medfører et høyt kopiantall. En slik sekvens er fortrinnsvis gjær 2 jj DNA. Videre inneholder vektoren en selekterbar markør for gjær, fortrinnsvis gjær LEU2-genet, samt pBR322 DNA-sekvensen med replikasjons-start og ampicillin-resistensgenet for amplifikasjon i E. coli. Slike vektorer blir betegnet som skyttelvektorer, på grunn av at de kan bli anvendt både i gjær og E. coli.

En ekspresjonsvektor som med høy effektivitet kan bli satt inn i gjær, ble beskrevet i europeisk patentskrift nr. 100561. Ekspresjon av de fremmede genene foregår under kontroll av den regulerbare PH05-promoteren til det sure fosfatase-genet i gjær. PH05-promoteren, det fremmede genet og PH05 transkripsjons-termineringssignal-sekvensen ble satt inn etter hverandre i plasmid pJDB207, som inneholder gjær 2 u DNA, gjær LEL<T>2-genet, et E. coli replikasjonsorigo samt ampicillin-resistensgenet.

Ekspresjonsplasmid pJDB207R/[Arg45]EGL blir konstruert som følger:

a) Isolering av pJDB207 vektor- fragmentene

Seks pg av plasmidene pJDB207R/IF(a-3) (EP 100561) blir

fullstendig nedbrutt med restriksjonsenzymet BamHI. De oppnådde DNA-fragmentene på 6,85 kb og 1,15 kb blir presipitert med etanol og resuspendert i 400 ul 50 mM Tris-HCl, pH 8,0. 4,5 enheter alkalisk fosfatase (fra Kålberdårmen, Boehringer Mannheim) blir tilsatt, og blandingen blir inkubert i 1 time ved 37°C. Til slutt blir fosfatasen inaktivert ved inkubering ved 65°C i 1,5 timer. Oppløsningen blir innstilt til en konsentrasjon på 150 mM NaCl og til slutt ført gjennom en 100 ul DE 52 (Whatman) anionbyttesøyle, som var blitt ekvilibrert med en oppløsning på 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA. Etter vasking med den

samme bufferen blir DNAet eluert med 400 pl 10 mM Tris-HCl,

pH 7,5, 1,5 M NaCl, 1 mM EDTA og presipitert med etanol. Det 6,85 bp store BamHI-fragmentet blir isolert fra det lille fragmentet i en 0, 6% gel på en laveresmeltende agarose i Tris-Borat-EDTA-buffer, pH 8,3. b) Isolering av det 534 bp store PH05 promoter- fragmentet Ti pg av plasmid p31/R (EP 100561 )- blir spaltet med restrik-sjonsenzymene EcoRI og BamHI. De oppnådde 3 fragmentene blir adskilt på en 0, b% gel i laveresmeltende agarose i Tris-borat-EDTA-buffer, pH 8,3. Det 534 bp store BamHI-EcoRI-fragmentet, som inneholder PH05-promoteren, samt transkrip-sjonsstart, blir isolert. c) Isolering av 230 bp store DNA- fragmenter. som inneholder den kodende sekvensen for fArg45l- Eglin C

Åtte pg av plasmid pJB618 blir spaltet med restriksjons-enzymene BamHI og EcoRI. De oppnådde 2 fragmentene blir adskilt på en 0,656 gel av laveresmeltende agarose i Tris-Borat-EDTA buffer, pH 8,3. Det 230 bp store fragmentet blir isolert.

d) Ligering av DNA- fragmenter

De tre under a) - c) beskrevne DNA-fragmentene, som innehol-

der tilsvarende overhengende ender, blir knyttet sammen i en ligeringsreaksjon. 0,1 pmol (0,45 pg) av det 6,85 kb store BamHI vektor-f ragmentet, 0,2 pmol (70 ng) av 543 bp store BamHI-EcoRI PH05 promoter-f ragmentet og 0,2 pmol (29 ng) av

230 bp store EcoRI-BamHI-framgentet til pJB618 ble ligert.

Alle tre DNA-fragmentene ble tilveiebragt i små biter av laveresmeltende agarose. De tre agarosebitene ble blandet sammen, smeltet ved 65°C og fortynnet to ganger. Ligeringen ble gjennomført i et sluttvolum på 270 pl i 60 mM Tris-HCl,

pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP med 16 enheter T4 DNA-ligase (Boehringer Mannheim) ved 15 °C i løpet av 16 timer. 10 pl av liger ingsblandingen blir satt til 100 pl kalsiumbehandlede, kompetente E. coli HBlOl-celler. 24 transformerte, ampicillinresistente enkeltkolonier ble dyrket i LB-medium som inneholdt 100 pg/ml ampicillin. Plasmid-DNAet blir isolert ifølge Holmes et al. [Anal. Biochem. 114, 193 (1981)] og analysert ved Hindlll/EcoRI dobbeltrestriksjon. Tilveiebringelse av et 600 bp stort EcoRI/HindIII-fragment viser den klonen, som inneholder integrert i ekspresjonsvektoren PH05 promoter-[Arg45]-Egl in C-DNA-Fragmentet i riktig orientering. Som ventet inneholder 50% av klonene innskuddet i riktig orientering. En av klonene blir isolert og betegnet som pJDB207R/PH05-[Arg45]EGL. e) Transformering av Saccharomvces cerevisiae- stamme GRF18 Etter transformeringsprotokollen til Hinnen et al. [Proe.

Nati. Acad. Sei. TJSA 75, 1929 (1978)] blir plasmid pJDB207R/PH05-[Arg45]EGL transformert i Saccharomyces cerevisiae-stamme GRF18 (a, his3-ll, his3-15, leu2-3, leu2-112, can**). Transformerte celler blir selektert på gjær-minimalmedium-skåler, som ikke inneholder leucin. Enkeltvise transformerte gjærkolonier blir isolert og betegnet som Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/PH05-[Arg45]EGL.

f ) Fermenter ing av Saccharomvces cerevisiae GRF18/ pJDB207R/ PH05- rArg45lEGL og isolering av TArg45<l>- Eglin C og N0t- acetvl- rArg45l- eglin C

Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/PH05-[Arg45]EGL-celler ble dyrket 13 1 minimalmedium med 0,03 g/l KH2PO4 i en mini-bioreaktor ved 30°C og ved oppnåelse av en celle-tetthet, som tilsvarer en OD^q på 1,9, høstet.

[Arg45]-Eglin C og Na<->acetyl-[Arg45]-eglin C blir dannet ut i fra de transformerte gjærcellene i vektforhold på omtrent 2:1. Begge produkter kan bli isolert fra gjærcellehomogenater tilsvarende fremgangsmåten angitt i eksempel 7 for E. coli.

Eksempel 11: Farmasøytisk preparat

En Na<->acetyl-[Arg45]-eglin C inneholdende oppløsning fremstilt ifølge eksempel 7, blir dialysert mot en 0, 9% NaCl-oppløsning. Konsentrasjonen til oppløsningen blir deretter etter fortynning med den samme NaCl-oppløsningen innstilt på 1 mg/ml eller 10 mg/ml. Disse løsningene blir sterilisert ved ultrafiltrering (membraner med 0,22 um porer).

De steriliserte oppløsningene er direkte anvendbare for intravenøs bearbeiding og for kontinuerlig dråpeinfusjon.

Deponering av mikroorganismer

Stammen E. coli HB101/pML147 ble 28. januar 1988 deponert til "der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Masche-roder Weg lb, D-3300 Braunschweig, med nummer DSM 4380.

Claims (6)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av modifisert Eglin B eller C ifølge formel R-ThrGluPheGlySerGluLeuLysSerPheProGluValValGlyLysThrVal AspGlnAlaArgGluTyrPheThrLeuHisTyrProGlnTyrAspVal-W-PheLeu ProGluGlySerProVal-X-Y-Z-LeuArgTyrAsnArgValArgValPheTyrAsn ProGlyThrAsnValValAsnHisValProHisValGly-OH (I), hvor R betyr hydrogen eller acetyl, W betyr Tyr eller His, X betyr Thr eller Pro, Y betyr Leu eller Arg og Z betyr Asp eller Ser, og salter derav, karakterisert ved at man fremstiller mutert DNA som koder for modifisert Eglin B eller C ifølge ovennevnte formel, kloner dette kodende DNA i en ekspresjonsvektor transformerer en vertscelle dermed, dyrker de transformerte vertscellene og isolerer modifisert Eglin B eller C eller et salt derav.

2 . Fremgangsmåte for fremstilling av forbindelser med formel I ifølge krav 1,karakterisert ved at R er acetyl, W er Tyr, X er Thr, Y er Arg og Z er Asp eller Ser, og salter derav.

3. Fremgangsmåte for fremstilling av J^-acetyl-[Arg45]-egl in C ifølge krav 1.

4 . DNA, karakterisert ved at det koder for en modifisert Eglin B eller C med formel som angitt i krav 1.

5. Ekspresjonsvektor som er egnet for ekspresjon av modifisert Eglin B eller C med formelen ifølge krav 1, k a r a k-terisert ved at den inneholder det i krav 4 angitte kodende DNA og en operabel koblbar ekspresjons-sekvens.

6. Vertsmikroorganisme egnet for ekspresjon av modifisert Eglin B eller C, karakterisert ved at den inneholder en ekspresjonsvektor ifølge krav 5.