NO178870B - Fremgangsmåte for fremstilling av modifisert Eglin B eller C samt DNA, ekspresjonsvektor og vertsmikroorganisme - Google Patents
Fremgangsmåte for fremstilling av modifisert Eglin B eller C samt DNA, ekspresjonsvektor og vertsmikroorganisme Download PDFInfo
- Publication number
- NO178870B NO178870B NO890932A NO890932A NO178870B NO 178870 B NO178870 B NO 178870B NO 890932 A NO890932 A NO 890932A NO 890932 A NO890932 A NO 890932A NO 178870 B NO178870 B NO 178870B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- eglin
- dna
- expression
- mutants
- formula
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims description 16
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 12
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 39
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 35
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 10
- 125000000218 acetic acid group Chemical group C(C)(=O)* 0.000 claims description 8
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 4
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 39
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 abstract description 9
- 108010031145 eglin proteinase inhibitors Proteins 0.000 abstract description 4
- DVCSNHXRZUVYAM-BQBZGAKWSA-N leu-asp Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O DVCSNHXRZUVYAM-BQBZGAKWSA-N 0.000 abstract description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 38
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 32
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 32
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 29
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 25
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 23
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 21
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 19
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 16
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 14
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 12
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 12
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 11
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 11
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 10
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 10
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 10
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 10
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 9
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 9
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 9
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 8
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 8
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 8
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 6
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 6
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 description 6
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 6
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 6
- 239000002585 base Substances 0.000 description 6
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- -1 halogen hydrogen acids Chemical class 0.000 description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 6
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 5
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 5
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 5
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 5
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 5
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 5
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 5
- LKDMKWNDBAVNQZ-UHFFFAOYSA-N 4-[[1-[[1-[2-[[1-(4-nitroanilino)-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]carbamoyl]pyrrolidin-1-yl]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)NC(C)C(=O)NC(C)C(=O)N1CCCC1C(=O)NC(C(=O)NC=1C=CC(=CC=1)[N+]([O-])=O)CC1=CC=CC=C1 LKDMKWNDBAVNQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101150111062 C gene Proteins 0.000 description 4
- 102100025975 Cathepsin G Human genes 0.000 description 4
- 108090000617 Cathepsin G Proteins 0.000 description 4
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 4
- 101000851058 Homo sapiens Neutrophil elastase Proteins 0.000 description 4
- 108010028275 Leukocyte Elastase Proteins 0.000 description 4
- 102000016799 Leukocyte elastase Human genes 0.000 description 4
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 4
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 4
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 4
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 4
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 4
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 4
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 4
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 4
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- KDELTXNPUXUBMU-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid boric acid Chemical compound OB(O)O.OB(O)O.OB(O)O.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KDELTXNPUXUBMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 3
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091028026 C-DNA Proteins 0.000 description 3
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 102100033174 Neutrophil elastase Human genes 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 3
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 3
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N n-(2-chloroethyl)-n-nitrosomorpholine-4-carboxamide Chemical compound ClCCN(N=O)C(=O)N1CCOCC1 LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 3
- TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 4-nitroaniline Chemical compound NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 2
- 206010001052 Acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 206010014561 Emphysema Diseases 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000000028 adult respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 2
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N guanidine group Chemical group NC(=N)N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N n-hexadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000003032 phytopathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000003380 propellant Substances 0.000 description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 description 2
- 235000008522 spreadable oils and fats Nutrition 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N toluene-4-sulfonic acid Chemical compound CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZORQXIQZAOLNGE-UHFFFAOYSA-N 1,1-difluorocyclohexane Chemical compound FC1(F)CCCCC1 ZORQXIQZAOLNGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 1-monostearoylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)CO VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 description 1
- XZIIFPSPUDAGJM-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-2-n,2-n-diethylpyrimidine-2,4-diamine Chemical compound CCN(CC)C1=NC(N)=CC(Cl)=N1 XZIIFPSPUDAGJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 102000004411 Antithrombin III Human genes 0.000 description 1
- 108090000935 Antithrombin III Proteins 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 206010003402 Arthropod sting Diseases 0.000 description 1
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 1
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 1
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 description 1
- 208000003014 Bites and Stings Diseases 0.000 description 1
- 241000094396 Bolitoglossa carri Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100024539 Chymase Human genes 0.000 description 1
- 108090000227 Chymases Proteins 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- 241000489977 Diabrotica virgifera Species 0.000 description 1
- 241000489947 Diabrotica virgifera virgifera Species 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 1
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 1
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 description 1
- 241000702224 Enterobacteria phage M13 Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 101150009006 HIS3 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000032456 Hemorrhagic Shock Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000545744 Hirudinea Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- 102100027612 Kallikrein-11 Human genes 0.000 description 1
- 101150007280 LEU2 gene Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N Manganese Chemical compound [Mn] PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 206010033645 Pancreatitis Diseases 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 208000013616 Respiratory Distress Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 101100394989 Rhodopseudomonas palustris (strain ATCC BAA-98 / CGA009) hisI gene Proteins 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 241000702208 Shigella phage SfX Species 0.000 description 1
- 206010049771 Shock haemorrhagic Diseases 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- HVUMOYIDDBPOLL-XWVZOOPGSA-N Sorbitan monostearate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O HVUMOYIDDBPOLL-XWVZOOPGSA-N 0.000 description 1
- 240000006394 Sorghum bicolor Species 0.000 description 1
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 description 1
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 description 1
- 101150006914 TRP1 gene Proteins 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 208000001435 Thromboembolism Diseases 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 206010044541 Traumatic shock Diseases 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 101710152431 Trypsin-like protease Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxysuccinic acid Natural products OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- CEGOLXSVJUTHNZ-UHFFFAOYSA-K aluminium tristearate Chemical compound [Al+3].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O CEGOLXSVJUTHNZ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940063655 aluminum stearate Drugs 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 108010045723 anhydrochymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001741 anti-phlogistic effect Effects 0.000 description 1
- 229940019748 antifibrinolytic proteinase inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 229960005348 antithrombin iii Drugs 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 239000003139 biocide Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 229960000182 blood factors Drugs 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 150000001793 charged compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 235000015165 citric acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000000280 densification Methods 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-N diphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(O)=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000009190 disseminated intravascular coagulation Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 125000004494 ethyl ester group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000004992 fast atom bombardment mass spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001997 free-flow electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 229940093915 gynecological organic acid Drugs 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000010985 leather Substances 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000001630 malic acid Substances 0.000 description 1
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000013160 medical therapy Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229940098779 methanesulfonic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Al]O[Al]=O TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- NUVBSKCKDOMJSU-UHFFFAOYSA-N para-hydroxybenzoic acid ethyl ester Natural products CCOC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 NUVBSKCKDOMJSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004810 partition chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000013379 physicochemical characterization Methods 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 description 1
- 229940005657 pyrophosphoric acid Drugs 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 201000003068 rheumatic fever Diseases 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 239000003001 serine protease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 229940035044 sorbitan monolaurate Drugs 0.000 description 1
- 239000001593 sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 235000011069 sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229940035049 sorbitan monooleate Drugs 0.000 description 1
- 239000001587 sorbitan monostearate Substances 0.000 description 1
- 235000011076 sorbitan monostearate Nutrition 0.000 description 1
- 229940035048 sorbitan monostearate Drugs 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- 150000003460 sulfonic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/55—Protease inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
- C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/855—Proteins from animals other than mammals or birds
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Mycology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Immunology (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av modifisert Eglin B eller C, DNA som koder for en modifisert Eglin B eller C samt ekspresjonsvektor og vertsmikroorganisme egnet for ekspresjon derav.
I det tyske utleggingsskriftet 2808396 er to proteaseinhibi-torer, betegnet som Eglin B og Eglin C, isolert fra blodigle (Eirudo medicinalis) beskrevet. Disse polypeptidene består av bare 70 aminosyrer med en molekylvekt på ca. 8100 og er sterke inhibitorer for chymotrypsin, subtilisin, for granulo-sytt-proteasene elastase fra dyr og menneske og katepsin G samt mastcelle-proteasechymase. Derimot blir trypsin-lignende proteaser bare hemmet i uvesentlig grad.
Eglin C har følgende primærstruktur:
Eglin C inneholder i forhold til de fleste kjente protease-inhibitorene ingen disulfid-broer. Den er til tross for den relativt lave molekylstørrelsen uvanlig stabil overfor denaturering med syre, lut eller varme og overfor proteo-lytisk nedbryting. Primærstrukturen til Eglin B er forskjel-
lig fra den til Eglin C ved erstatning av aminosyren 35, tyrosin, med histidin.
Eglinet hører til den sterkeste for tiden kjente hemmeren av humant og dyrisk granulocytt-elastase, samt av humant granulocyttkatepsin G. Ukontrollert henholdsvis umåtelig frigjøring av disse cellulære proteasene i organismen kan forsterke et betennelsesforløp og nedbrytning av vev ved uspesifikk proteolyse. Enzymene er kompetente for intracellu-
lær nedbrytning er optimalt virkningsfulle i fysiologisk miljø (nøytralt til svakt alkalisk) og har muligheten til å
raskt ødelegge native vevsubstanser (f.eks. elastin) og humorale faktorer (f.eks. blodkoagulerings- og komplement-faktorene) og å inaktivere disse. På grunn av de til nå kjente egenskapene til egl ine er de av stor interesse for anvendelse i medisinsk terapi (antiinflammasjon, antiflogi-stikk, septisk sjokk, lungeemfysem, mukoviscidose osv.).
I det siste er Eglin blitt tilgjengelig ved hjelp av rekombinante genteknikkfremgangsmåter (jfr. Europeisk patentmelding nr. 146785).
Hensikten med oppfinnelsen er å fremstille nye protease-inhibitorer ut i fra Eglin B eller Eglin C.
Hensikten ble ifølge oppfinnelsen oppnådd ved fremstilling av Eglinmutanter, som skiller seg fra naturlige Eglin B og C ved at en, to eller tre aminosyrer innenfor det aktive sentrumet (aminosyre 45 og 46, Leu-Asp) ble erstattet med andre aminosyrer. De ifølge oppfinnelsen tilveiebragte Eglin-mutantene utviser overraskende egenskaper: De fremhever seg i forhold til Eglin B og Eglin C ved at de har en høyere spesifisitet når det gjelder inhibering av bestemte proteaser eller ved inhibering av proteaser, som ikke eller nesten ikke ble inhibert av Eglin B og C, for eksempel trypsin eller trombin.
Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig en fremgangsmåte for fremstilling av modifisert Eglin B eller C ifølge formel
hvor R betyr hydrogen eller acetyl, W betyr Tyr eller His, X betyr Thr eller Pro, Y betyr Leu eller Arg og Z betyr Asp eller Ser, og salter derav, kjennetegnet ved at man
fremstiller mutert DNA som koder for modifisert Eglin B eller C ifølge ovennevnte formel, kloner dette kodende DNA i en ekspresjonsvektor transformerer en vertscelle dermed, dyrker de transformerte vertscellene og isolerer modifisert Eglin B eller C eller et salt derav.
Oppfinnelsen vedrører spesielt en fremgangsmåte for fremstilling av forbindelser med formel I kjennetegnet ved at R er acetyl, W er Tyr, X er Thr, Y er Arg og Z er Asp eller Ser, og salter derav.
De nye forbindelsene med formel I foreligger ikke bare i fri form, men også i form av deres salter, spesielt farmasøytisk akseptable salter. På grunn av at de inneholder flere aminosyrerester med frie aminogrupper henholdsvis guanidin-grupper, kan forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen, f.eks. foreligge i form av syreaddisjonssalter. Som syreaddisjonssalter kommer spesielt fysiologiske anvendbare salter med vanlig, terapeutisk anvendbare syrer i betrakt-ning. Som uorganiske syrer kan halogenhydrogensyrene, såsom klorhydrogensyre nevnes, men også svovelsyre og fosfor-henholdsvis pyrofosforsyre; som organiske syrer er sulfon-syrer (såsom benzen- eller p-toluensulfonsyre eller lavere-alkansulfonsyre, såsom metansulfonsyre) samt karboksylsyre, såsom eddiksyre, melkesyre, palmitin- og stearinsyre, eplesyre, vinsyre, askorbinsyre og sitronsyre egnede. På grunn av at Eglin-forbindelsene også inneholder aminosyrerester med frie karboksylgrupper, kan de også foreligge som metallsalter, spesielt som alkalimetall- eller jordalkali-metallsalter, f.eks. natrium-, kalium-, kalsium- eller magnesiumsalter, eller også som ammoniumsalt, avledet fra ammoniakk eller en fysiologisk godtagbar organisk nitrogen-holdig base. På grunn av at de både inneholder frie karboksylgrupper og frie amino (og guanidin)-grupper, kan de også foreligge som indre salter.
Eglin-mutantene og deres salter kan for eksempel bli fremstilt ved hjelp av i seg selv kjente fremgangsmåter, for eksempel genteknologisk fremgangsmåte, f.eks. idet man dyrker en transformert vertsorganisme, som inneholder et DNA, som koder for den nevnte Eglin-mutanten, og isolerer Eglin-mutanten eller et salt derav. Spesielt blir Eglin-mutantene og deres salter fremstilt i det man
a. fremstiller DNA som koder for Eglin-mutanten,
b. fører dette DNA i en vektor,
c. fører den tilveiebragte hybridvektoren ved transformasjon inn i en vertsmikroorganisme, d. dyrker den transformerte vertsorganismen under betingelser
som muliggjør en ekspresjon av Eglin-mutanten, og
e. isolerer Eglin-mutanten eller et salt derav.
DNA som koder for Eglin- mutanter
Oppfinnelsen vedrører også DNA, kjennetegnet ved at det koder for en modifisert Eglin B eller C med formel som angitt i krav 1.
DNA inneholder fortrinnsvis flankerende, egnede restrik-sjonssete tilknyttende sekvenser i deres ender, som muliggjør innsetting av DNA i en vektor.
DNA ifølge oppfinnelsen kan bli fremstilt ifølge i seg selv kjente fremgangsmåter. Man kan dermed fremstille DNA for eksempel kjemisk, eller man kan fremstille fragmenter ved kjemisk syntese og koble disse enzymatisk sammen på en forutbestemt måte, eller man kan mutere et DNA som koder for Eglin B eller Eglin C i et eller flere trinn.
Kjemisk syntese av DNA foregår ved hjelp av kjent fremgangsmåte. Egnede fremgangsmåter er beskrevet av S.A. Narang (Tetrahedron 39, 3 (1983)) og i europeisk patentskrift nr. 146785.
Fremstilling av DNA ifølge oppfinnelsen kan også foregå ved mutasjon av DNA som koder for Eglin B eller Eglin C. Fortrinnsvis anvendes "seterettet mutagenese"-fremgangsmåten (jfr. M.J. Zoller et al., Meth. Enzym. 100, 468 (1983)). Dermed blir Eglin-enkelttrådet-DNA klonet inn i bakteriofag M13, hybridisert med et komplementært oligonukleotid, som inneholder det (de) mutasjonsdirigerende nukleotid(ene), hybridiseringsproduktet blir ifylt til dobbelttråder, den oppnådde dobbelttrådete bakteriofagen blir ved transformasjon ført inn i en egnet Escherichia coli-vert, og etter dyrking av de transformert E. coli-cellene blir de cellene som inneholder DNA som koder for Eglin-mutantene, identifisert ved hybridisering med det ovenfor nevnte oligonukleotidet.
Fremstilling av ekspresjonsvektorer som inneholder et DNA som koder for en Eglin- mutant
Oppfinnelsen vedrører videre ekspresjonsvektorer som inneholder DNA-sekvenser som koder for en Eglin-mutant, som blir regulert av en ekspresjonskontrollsekvens derav, hvori Eglin-mutantene blir uttrykt i en av vertscellene som er transformert med disse ekspresjonsvektorene.
Ekspresjonsvektorene ifølge foreliggende oppfinnelse blir f.eks. fremstilt idet man i et vektor-DNA som inneholder en ekspresjonskontrollsekvens, innfører en DNA-sekvens som koder for Eglin-mutanten, hvori ekspresjonskontrollsekvensen regulerer DNA-sekvensen.
Valg av en egnet vektor avhenger av vertscellen som skal bli transformert. Egnede verter innbefatter f.eks. mikroorganismer, såsom gjær, f.eks. Saccharomyces cerevisiae, og spesielle bakteriestammer, hovedsakelig Escherichia coli-stammer eller Bacillus subtilis, eller celler fra høyere organismer, spesielt etablerte humane eller dyrecellelinjer. Foretrukne vertsceller innbefatter E. coli-stammer. Hovedsakelig er alle vektorer egnede som replikerer og uttrykker i den valgte verten DNA-sekvensen ifølge oppfinnelsen som koder for Eglin-mutantene.
Eksempler på vektorer som er egnede for ekspresjon i en E. coli-stamme av Eglin-mutanten, er bakteriofager, f.eks. derivater av bakteriofag X, eller plasmider, såsom spesielt plasmid colEl og derivater derav, f.eks. pMB9, pSF2124, pBR317 eller pBR322. De foretrukne vektorer ifølge foreliggende oppfinnelse er avledet fra plasmid pBR322. Egnede vektorer inneholder et fullstendig replikon og et markørgen, som muliggjør seleksjon og identifisering på grunn av en fenotypisk markør av organismen transformert med ekspresjonsplasmidet. Egnede markørgener gjør mikroorganismen for eksempel resistent overfor tungmetaller, antibiotika og lignende. Videre inneholder foretrukne vektorer ifølge foreliggende oppfinnelse også replikon- og markørgen-region-gjenkjenningssekvenser for restriksjonsendonukleaser, slik at de DNA-sekvensene som koder for Eglin-mutantene og de tilsvarende ekspresjonskontrollsekvensene kan bli ført inn i disse setene.
Flere ekspresjonskontrollsekvenser kan bli satt inn for regulering av ekspresjonen. Spesielt blir ekspresjonskontrollsekvensen til den transformerte vertscellen anvendt for sterkt uttrykte gener. Når det gjelder pBR322 som hybridvektor og E. coli som vertsorganisme er for eksempel egnede ekspresjonskontrollsekvenser (som blant annet inneholder promoteren og de ribosomale bindingssetene) laktose-operoner, tryptofanoperoner, arabinoseoperoner og lignende, 3-laktamasegener, de tilsvarende sekvensene til fag XN-genene eller fag fd-sjikt-proteingenene og andre. På grunn av at promoteren til e-laktamasegenene (g-lac-gen) allerede er i plasmid pBR322 må de andre ekspresjonskontrollsekvensene bli ført inn i plasmidet. Foretrukne ekspresjonskontrollsekvenser i foreliggende oppfinnelse er de til tryptofanoperoner (trp po). For replikasjon og ekspresjon i gjær inneholder egnede vektorer et gjær-replikasjonsorigo og en selektiv genetisk markør for gjær. Hybridvektorer, som inneholder et gjær-replikasjonsorigo, f.eks. det kromosomale autonome repliker-ende segment (ars), blir holdt ekstrakromosomalt innenfor gjærcellen etter transformeringen og blir ved mitosen autonomt replikert. Videre kan hybridvektorer, som inneholder gjaer-2u-plasmid-DNA homologe sekvenser bli anvendt. Slike hybridvektorer får etter rekombinasjon innenfor cellene inkorporert det eksisterende 2>j-plasmidet eller så replikeres de autonomt. Egnede markørgener for gjær er først og fremst slike som gjør at verten blir resistent ovenfor antibiotika, eller når det gjelder auksotrofe gjærmutanter, gener som kompiementerer vertsdefekten. Tilsvarende gener gir f.eks. resistens overfor cykloheksimidantibiotika eller sørger for prototrofi i en auksotrof gjærmutant, f.eks. URA3—, LEU2-, HIS3- eller spesielt TRPl-genet. Gjærhybridvektorene inneholder videre fortrinnsvis et replikasjonsorigo og et markørgen for en bakteriell vert, spesielt E. coli, slik at konstruk-sjonen og kloningen av hybridvektoren og forløperene kan foregå i en bakteriell vert. For ekspresjon i gjær er egnede ekspresjonskontrollsekvenser for eksempel de til TRP-, ADHI-, ADHII- eller PE05-genet, videre promoteren innbefattet i glykolytisk nedbrytning, f.eks. PGK- og GAPDH-promoteren.
Oppfinnelsen vedrører spesielt replikasjon og fenotypisk seleksjon av egnede ekspresjonsvektorer, som inneholder en ekspresjonskontrollsekvens og en DKA-sekvens som koder for Eglin-mutanten, slik at nevnte DNA-sekvens med transkrip-sjonsstartsignal og -terminasjonssignal, samt translasjons-startsignal og -stoppsignal i nevnte ekspresjonsplasmid under regulering av nevnte ekpresjonskontrollsekvens er ordnet slik at Eglin-mutanten blir uttrykt i en vertscelle • som er transformert med nevnte ekspresjonsplasmid.
For å oppnå en effektiv ekspresjon, må genet som koder for Eglin-mutanten være ordnet riktig (i "fase") med ekspresjonskontrollsekvensen. Det er fordelaktig å knytte ekpresjons-kontrollsekvensen rett mellom hoved-mRNA-start og ATG-sekvensen til sekvensen som koder for genet, som er naturlig knyttet sammen med ekspresjonskontrollsekvensen (f.eks. e-lac-kodende sekvensen ved anvendelse av e-lac-promotere), med Egl in-mutant-genet, som fortrinnsvis har med det egnede translasjonsstartsignalet (ATG) og translasjonsstoppsignalet (f.eks. TAG). Dermed blir en effektiv transkripsjon og translasjon mulig.
Transformering av mikroorganismer
Oppfinnelsen vedrører også en vertsmikroorganisme egnet for ekspresjon av modifisert Eglin B eller C som er kjennetegnet ved at den inneholder en ekspresjonsvektor som nevnt ovenfor.
Egnede vertsceller er for eksempel mikroorganismer, såsom stammer av Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis og spesielt Escherichia coli. Transformering med ekspresjons-plasmidene ifølge oppfinnelsen foregår for eksempel som beskrevet i litteraturen, for S. cerevisiae (A. Hinnen et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75, 1929 (1989)), B. subtilis (Anagnostopoulos et al., J. Bacteriol. 81, 741 (1961)) og E.
coli (M. Mandel et al., J. Mol. Biol. 53, 159 (1970 )). Isolering av den transformerte vertscellen foregår fortrinns-
vis ut av et selektivt næringsmedium som biocidet tilsettes til, og som markørgenet i ekspresjonsplasmidet gir resistens overfor. Celler som ikke holder ekspresjonsplasmidet dør i et slikt medium.
Dyrking av den transformerte vertscellen og utvinning av Eglin- mutanter
De transformerte vertscellene blir anvendt for fremstilling
av Eglin-mutanter. Fremgangsmåten for fremstilling av Eglin-mutantene karakteriseres ved at den ovenfor nevnte transform-
erte vertscellen blir dyrket og at produktet blir frigjort fra vertscellen og isolert.
Oppfinnelsen vedrører spesielt en fremgangsmåte for fremstilling av Egl in-mutanter med formel I og salter av slike forbindelser karakterisert ved at man dyrker den transformerte vertscellen som inneholder et ekspresjonsplasmid, som regulerer en ekspresjonskontrollsekvens, og som inneholder en DNA-sekvens som koder for en Eglin-mutant med formel I, i et flytende næringsmedium som inneholder assimilerbar karbon- og nitrogenkilde, og hvori produktet frigjøres fra vertscellen og isoleres, og, hvis ønskelig, skilles blandingen av forbindelser med formel I som oppnåes ifølge fremgangsmåten, i enkelte komponenter og, hvis ønskelig, overføres et oppnådd salt til det frie polypeptidet eller et oppnådd polypeptid til et salt.
Dyrkingen av de transformerte vertscellene ifølge oppfinnelsen foregår på i seg selv kjent måte. For dyrkingen av de transformerte vertsorganismene ifølge oppfinnelsen kan forskjellige karbonkilder anvendes. For eksempel er foretrukne karbonkilder assimilerbare karbohydrater, som glukose, mal tose, mannit eller' laktose, eller et acetat, som enten kan anvendes alene eller i egnede blandinger. Egnede nitrogen-kilder er for eksempel aminosyrer, såsom kasaminosyrer, peptider og proteiner og deres nedbrytningsprodukter, såsom trypton, pepton eller fleskeekstrakter; videre gjæreks-trakter, maltekstrakt, såsom ammoniumsalt, f.eks. ammonium-klorid, -sulfat eller -nitrat, som enten kan anvendes alene eller i egnede blandinger. Uorganiske salter, som også kan bli anvendt, er f.eks. sulfat, klorid, fosfat og karbonat av natrium, kalium, magnesium og kalsium.
Videre inneholder mediet f.eks. vekstkrevende forbindelser, såsom sporelementer, f.eks. jern, sink, mangan og lignende, og foretrukne forbindelser, som utøver et seleksjonstrykk og som forhindrer veksten av celler som har mistet ekspresjonsplasmidet. Dermed blir for eksempel ampicillin tilsatt til mediumet, når ekspresjonsplasmidet inneholder et amp^-gen. En slik tilsetning av antibiotiske virksomme forbindelser fører også til at kontaminerende, antibiotikaømfindtlige mikroorganismer blir drept.
Dyrkingen utføres ved en i seg selv kjent fremgangsmåte. Dyrkingsbetingelsene, såsom temperatur, pH-verdi til mediumet og fermenteringstid, blir valgt på en slik måte at maksimale titere av Eglin-mutanter blir oppnådd. I en E.coli- eller en gjær-stamme fortrinnsvis dyrket under aerobe betingelser i submers kultur under rysting eller røring ved en temperatur på omtrent 20 til 40°C, fortrinnsvis omtrent 30"C, og en pH verdi på 4 til 9, fortrinnsvis ved pH 7, i omtrent 4 til 20 t, fortrinnsvis 8 til 12 t. Dermed blir ekspresjonsproduktet samlet intracellulært.
Når celletettheten har oppnådd en tilstrekkelig verdi, avbrytes dyrkingen og produktet frigjøres fra cellene til mikroorganismene. Dermed blir cellen ødelagt, f.eks. lysert ved behandling med en detergent, såsom SDS eller triton, eller med lysozym eller et enzym som virker på lignende måte. Man kan alternativt eller i tillegg anvende mekaniske krefter, såsom skjærkrefter (f.eks. X-presse, French-presse, Dyno-Mill) eller rysting med glassperler eller aluminium-oksyd, eller vekselsvis frysing, f.eks. i flytende nitrogen, og opptining, f.eks. i 30° til 40°, samt ultralyd for å åpne cellene. Den resulterende blandingen som inneholder proteiner, nukleinsyrer og andre cellebestanddeler, blir etter sentrifugeringen på kjent fremgangsmåte anriket for proteinene. Slik kan f.eks. den største delen av ikke-protein-bestanddelene bli adskilt ved polyetylenimin-behandling og proteinene til Eglin-forbindelsene kan til slutt bli utfelt f.eks. ved metting av oppløsningen med ammoniumsulfat eller med andre salter. Bakterielle proteiner kan også bli utfelt ved hjelp av surgjøring med eddiksyre (f.eks. 0, 1%, pH 3-5). En videre anrikning av Eglin-mutantene kan oppnås ved ekstraksjon av eddiksyresupernatantene med n-butanol. Ytterligere rensningstrinn omfatter f.eks. kromatografiske fremgangsmåter, såsom ionebyttekromatografi, gelfiltrering, gelpermeasjonskromatografi, fordelingskromatografi, HPLC, reversert fase-HPLC og lignende. Deretter følger adskilling av blandingsbestanddelene ved dialyse, ifølge ladning ved hjelp av gel- eller bærerfri elektroforese, ifølge molekyl-størrelse ved hjelp av en egnet sephadex-søyle, ved affinitetskromatografi, f.eks. med antistoff, spesielt monoklonale antistoffer, eller anhydrochymotrypsin eller trombin koblet til en egnet bærer for affinitetskromatografi, eller ved hjelp av andre fremgangsmåter kjent innenfor litteraturen.
Isolering av de uttrykte Eglin-mutantene foregår for eksempel ved hjelp av følgende trinn: Separering av cellene fra kulturløsningen ved hjelp av sentrifugering, fremstilling av et råekstrakt ved ødelegging av cellene, f.eks. ved hjelp av Dyno-Mill, sentrifugere ut de uløselige bestanddelene; utfelling av de bakterielle proteinene ved hjelp av 1% eddiksyre, gelfiltrering på Sephadex G50 (eller G75), og eventuelt reversert fase-HPLC. TJtsaltingen foregår for eksempel på Sephadex G25.
For påvising av Eglin-mutantene kan testen med anti-Eglin-antistoffene, såsom polyklonale antistoffer fra kanin eller monoklonale antistoffer fra hybridomceller, f.eks. monoklonale antistoffer fra hybridom-cellelinjen 299S18-20 (CNCM I-361), 299S20-1 (CNCM 1-362) eller 299S20-10 (CNCM 1-363) eller hemming av målproteåsene, f.eks. humanleukocytt-elastase (HLE) eller katepsin G (Cat G) (jfr. LT. Seemiiller et al., Hoppe-Seyler<*>s Z- physiol. Chem. 358, 1105 (1977 ); U. Seemiiller et al., Meth. Enzym. 80, 804 (1981)) utføres.
Blanding av forbindelser med formel I oppnådd ifølge oppfinnelsen, eventuelt bestående av forbindelser med formel I, hvori R enten står for H eller acetyl, kan bli adskilt på kjent måte i de enkelte komponentene. Egnede fremgangsmåter for adskilling innbefatter f.eks. kromatografiske fremgangsmåter, f.eks. adsorpsjons-kromatografi, ionebyttekromatografi, HPLC eller reverst-fase HPLC, ytterligere multiplika-tive fordeling eller elektroforetiske fremgangsmåter, f.eks. elektroforese på celluloseacetat eller gelelektroforese, spesielt polyakrylamid-gelelektroforese ("PAGE").
Ifølge hvilken fremgangsmåte som ble anvendt oppnår man forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen i fri form eller i form av syreaddisjonssalter, indre salter eller salter med baser. Ut i fra syreaddisjonssaltene kan de frie forbindelsene bli utvunnet ved hjelp av i seg selv kjent måte. De sistnevnte kan oppnåes ved omsetting med syrer eller baser, f.eks. med slike, som danner de ovennevnte saltene, og inndamping eller frysetørring av terapeutisk anvendbare syreaddisjonssalter eller metallsalter. De indre saltene kan bli utvunnet ved innstilling av pHen til egnet nøytralpunkt.
Farmasøytiske preparater
De nye Eglin-mutantene med formel I utviser verdifulle farmakologiske egenskaper og kan bli anvendt til profylakse eller terapi av sykdomstilstander som krever tilsetting av protease-inhibitorer.
De nye Eglin-mutantene viser en virkningsprofil som protease-inhibitorer, som adskiller seg fra de samme naturlige Eglin B og C ved at inhiberingsvirkningen overfor bestemte proteaser blir forsterket, samt at bestemte proteaser som ikke blir inhibert av de naturlige Eglinen blir sterkt inhibert, mens inhiberingsvirknigen overfor noen naturlige målproteaser for egliner, såsom f.eks. granulocytt-elastase bli svekket eller forsvinner. Dermed tilveiebringer eksempelvis forbindelser med formel I, hvori R står for hydrogen eller acetyl, W står for Tyr eller His, X står for Pro, Y står for Met og Z står for Asp en forsterket inhibering av humant og fra dyr granulocytt-elastase i forhold til de naturlige Egliner og kan dermed bli anvendt såsom de naturlige Eglinen f.eks. til behandling av lungeemfysem, ARDS ("acute respiratory distress syndrome"'), septisk sjokk, reumatisk leddgikt og mukoviski-dose. Forbindelser med formel I, hvori R og W har betydningene som i formel I, X står for Thr, Y står for Arg eller Lys og Z står for Asp, har i forhold til de naturlige Eglinen en utpreget inhibisjonsvirkning på trypsin og bare en svak virkning ovenfor granulocytt-elastase og katepsin G. Dette vedrører spesielt forbindelsen med formel I, hvori R står for acetyl, W står for Tyr, X står for Thr, Y står for Arg og Z står for Asp. Slike forbindelser kan, i analogi til apro-tinin, f.eks. bli anvendt for behandling av pankreatitis og de traumatiske, pankreatogene og hemoragiske sjokk. Forbindelser med formel I, hvori R, W og X har de under formel I angitte betydningene, Y står for Arg eller Lys og Z står for Asp, viser en utpreget inhibisjonsvirkning overfor trombin og kan fortrinnsvis bli anvendt i kombinasjon med antitrombin-III, f.eks. for behandling av trombose, tromboemboli, septisk og posttraumatisk sjokk og forbrukskoagulopati.
Farmasøytiske sammensetninger, som i det minste inneholder en av forbindelsene ifølge oppfinnelsen eller deres anvendbare farmasøytiske salter, eventuelt sammen med en konvensjonell farmasøytisk anvendbar bærer og/eller hjelpestoffer kan fremstilles. Disse sammensetningene kan spesielt finne anvendelse ved de ovenfor angitte indikasjonene, når de f.eks. blir gitt parenteralt, såsom intravenøst, intrakutant, subkutant eller intramuskulært eller topisk.
Doseringen avhenger i første rekke av den spesifikke admini-streringsformen og hensikten med terapien, henholdsvis profylaksen. Størrelsen på enkeltdosen samt administrerings-skjemaet kan best bestemmes med hensyn på en individuell bedømmelse av det aktuelle sykdomstilfellet; de i til dette nødvendige fremgangsmåtene for bestemming av relevante faktorer, såsom blodfaktorer er kjent for fagmannen.
Kår det gjelder trombin-inhiberende Eglin-mutanter innbefatter en injeksjon av den terapeutiske virksomme mengden i et doseområde på omtrent 0,005 til omtrent 0,1 mg/kg kroppsvekt. Et område på omtrent 0,01 til omtrent 0,05 mg/kg kroppsvekt er foretrukket. Administreringen utføres ved intravenøs, intramuskulaer eller subkutan injeksjon. Tilsvarende oppnådde farmasøytiske preparater for parenteral administrering i enkeltdose-form avhenger av applikasjonsart pr. dose er på 0,4 til omtrent 7,5 mg av forbindelsen ifølge oppfinnelsen. Ved siden av den aktive forbindelsen inneholder disse farmasøytiske sammensetningene også enda en buffer, f.eks. en fosfatbuffer, som skal holde pE-verdien mellom omtrent 3,5 og 7, og videre natriumklorid, mannit eller sorbit for fremstilling av isotoni. De kan foreligge i frysetørret eller oppløst form, hvorved oppløsningen med fordel kan inneholde et antibakterielt virkende konserveringsmiddel, f.eks. 0,2 til 0, 3% 4-hydroksybenzosyre-metylester eller -etylester.
Et preparat for topisk anvendelse av trombin-inhiberende Eglin-mutanter kan også foreligge som vandig oppløsning, lotion eller gel, oljeaktig oppløsning eller suspensjon, eller fettholdig eller spesielt emulsjonssalve. Et preparat i form av en vandig oppløsning tilveiebringes eksempelvis ved at man løser de aktive forbindelsene ifølge oppfinnelsen eller et terapeutisk anvendbart salt derav i en vandig buffer løsning ved pE 4 til 6,5, og hvis ønskelig tilsetter et ytterligere virkestoff, f.eks. et anti-inflammatorikum, og/eller et polymerholdig heftemiddel, f.eks. polyvinylpyrro-lidon, og/eller et konserveringsmiddel. Konsentrasjonen til de aktive forbindelsene inneholder omtrent 0,1 til omtrent 1,5 mg, fortrinnsvis 0,25 til 1,0 mg, i 10 ml av en oppløs-ning henholdsvis 10 g av en gel. En oljeaktig applikasjons-form for topisk administering oppnår man eksempelvis ved suspendering av de aktive forbindelsene ifølge oppfinnelsen eller et terapeutisk anvendbart salt derav i en olje, eventuelt under tilsetting av svellemidler, såsom aluminium-stearat, og/eller overflateaktive midler (tensider), hvori HLB-verdien ("hydrofilisk-lipofilisk-balanse") ligger under 10, såsom fettsyremonoester flerverdig alkohol, f.eks. glycerinmonostearat, sorbitanmonolaurat, sorbitanmonostearat eller sorbitanmonooleat. En fettholdig salve oppnår man f.eks. ved suspendering av den aktive forbindelsen ifølge oppfinnelsen eller saltet derav i et smørbart fettgrunnlag, eventuelt under tilsetting av et tensid med HLB-verdi under 10. En emulsjonssalve oppnår man ved pulverisering av en vandig oppløsning av den aktive forbindelsen ifølge oppfinnelsen eller saltet derav i et svakt, smørbart fettunderlag under tilsetting av et tensid, hvori HLB-verdien ligger under 10. «Alle disse topiske applikasjonsformene kan også inneholde konserveringsmiddel. Konsentrasjonen til de aktive forbindelsene utgjør omtrent 0,1 til omtrent 1,5 mg, fortrinnsvis 0,25 til 1,0 mg, i omtrent 10 g av grunnmassen.
Administrering av elastase-inhiberende Eglin-mutantene foregår ved intravenøs injeksjon eller intrapulmonalt, ved inhalering, f.eks. med et Bird-apparat. De oppnådde farmasøy-tiske preparatene for parenteral administrering i enkeltdose-form avhenger av applikåsjonsart pr. dose er på omtrent 10 til 50 mg av forbindelsen ifølge oppfinnelsen. Bortsett fra den aktive forbindelsen inneholder disse farmasøytiske sammensetningene eventuelt enda natriumklorid, mannit eller sorbit for å innstille isotonien. De kan foreligge i fryse-tørket eller oppløst form, hvori oppløsningen med fordel kan inneholde et antibakterielt virkende konserveringsmiddel, f.eks. 0,2 til 0, 3% 4-hydroksybenzosyre-metylester eller
—etylester.
Preparatet for topisk anvendelse av elastase-inhiberende Eglin-mutanter tilsvarer i store trekk beskrivelsen ovenfor.
Inhalasjonspreparater for behandling av luftveiene ved intrapulmonal administrering innbefatter f.eks. aerosol eller spray, hvori den farmakologiske aktive forbindelsen kan bli fordelt i form av dråper av en oppløsning eller suspensjon. Preparater hvori den farmakologiske aktive forbindelsen foreligger i løsning inneholder også et egnet drivmiddel, videre, hvis nødvendig, et ytterligere oppløsningsmiddel og/eller en stabilisator. Istedenfor drivgass kan man også anvende trykkluft, hvorved disse ved hjelp av et egnet fortetnings- og avspenningsapparat etter behov kan bli anvendt. Spesielt egnede for administrering er Bird-inn-åndingsapparater, kjent innenfor medisinen; dermed blir en oppløsning av de aktive forbindelsene ført inn i apparatet og med lett overtrykk damplagt og ført inn i lungen til den åndende pasienten.
Dosering av elastase-inhiberende Eglin-mutanter avhenger av alder, individuell tilstand og sykdomstype, til et varmblodig (menneske eller dyr) på omtrent 70 kg vekt ved intrapulmonal administering på 10 til omtrent 30 mg pr. inhalering (en- til to ganger daglig) og ved intravenøs administrering, og ved kontinuerlig infusjon, på omtrent 10 til omtrent 1000 mg pr. dag. Terapeutisk virksomme spytt- og plasmakonsentrasjoner som ved hjelp av immunologiske fremgangsmåter, såsom ELISA kan bli bestemt, ligger mellom 10 og 100 jjg/ml (ca. 1 til 10
>imol/l).
Administrering av trypsin-inhiberende Eglin-mutanter foregår f.eks. ved parenteral, såsom intravenøs, intramuskulær eller subkutan injeksjon. Den terapeutiske virksomme mengden ligger innenfor doseområdet på omtrent 1 til 20 mg aktiv forbindelse/kg kroppsvekt. De farmasøytiske preparatene som inneholder den aktive forbindelsen i en konsetrasjon på ca. 0,1 til ca. 100 mg/ml oppløsning. Bortsett fra den aktive forbindelsen inneholder disse farmasøytiske preparatene enda en buffer, f.eks. en fosfatbuffer (se ovenfor), samt natriumklorid, mannit eller sorbit for innstilling av isotoni.
Skadedvrbek. i empelsesmiddel
De nye Eglin-mutantene med formel I kan også anvendes som proteinase-inhibitorer ved skadedyrbekjempelse av planter. De naturlig forekommende Serin-protease-inhibitorene i forskjellige plantearter antas å utgjøre et effektivt vern mot fytopatogene insekter, sopp og andre mikroorganismer idet de hemmer serinproteasen i den nevnte organismen. Dermed kan både monokotyledon og dikotyledone planter bli transformert med et DNA som koder for en heterolog protease-inhibitor som f.eks. for Eglin B eller C, eller for en Eglin-mutant med formel I. Ekspresjonen av det nevnte aktive proteinase-inhibitoren gir den transformerte planten vern overfor fytopatogene angrep.
For transformering av planter med egnede ekspresjonsvektorer, som inneholder DNA som koder for en forbindelse ifølge oppfinnelsen og ekspresjonskontrollsekvensen, står til rådighet ved hjelp av kjente metoder såsom f.eks. kokultiver-ing av protoplaster eller isolerte vevfragmenter med agro-bakterier, som inneholder de tilsvarende vektorene og den etterfølgende regenerering til fullstendige planter eller overføring av vektorer ved hjelp av egnede, tilsvarende modifiserte virus, såsom f.eks. TMV (Tobakkmosaikkvirus) eller CaMV ("cauliflower mosaic virus"). Ytterligere fremgangsmåter innbefatter f.eks. direkte overføring av isolerte DNA, (spesielt når det gjelder monokotylene planter såsom mais, havre, bygg, ris, sorgum, hvete, sukkerroer og andre) ved hjelp av PEG, gjennom elektroporasjon, ved mikroinjeksjon av DNA i isolerte protoplaster, plantekalli eller embryoer eller gjennom "mikroprosjektilbombardement" og andre.
For transformering i planter egner DNA-molekyler seg som koder for en forbindelse fremstilt ifølge oppfinnelsen. Foretrukne DNA-molekyler innbefatter de som koder for en Eglin-mutant med formel I, hvori R er acetyl, W er Tyr, X er Thr, Y er Arg og Z er Asp. Den protease-inhiberende virk-ningen til de foretrukne Eglin-mutantene kan bli undersøkt i forsøk med maispatogene Diabrotica virgifera ("western corn root worm"). Tilsetting av de foretrukne Eglin-mutanter til homogenater bestående av tarmvev fra patogener fører til en sterk hemming av den proteolytiske aktiviteten.
Eksempel 1: M13- kloning av Eglin C- gener
10 pg plasmid pML 147 ble spaltet med restriksj ons-endo-nukleasene EcoRI og BamHI og deretter ble det kjørt en elektroforese i 1,556 laveresmeltende agarose og ca. 0,5 ug av det 230 bp store EcoRI-BamHI-fragmentet (inneholder hele Eglin C-genet) isolert. Dette DNA-fragmentet (10 ng) blir blandet med 40 ng M13mp8 DNA (spaltet med EcoRI og BamHI) og inkubert i 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM MgCl2, 10 mM ATP, 10 mM ditiotreitol ved tilstedeværelse av 0,125 enheter T4-DNA-ligase i et volum på 15 ul (Zoller et al., Methods Enzym. 100, 468-500 (1983)). Denne oppløsningen blir anvendt for transformering av E. coli-stammen JM101 (Zoller et al., s.o.). Transformeringsblandingen blir sådd på X-Gal (IPTG-Indikator)-Agarplater (Zoller et al., s.o.). Man oppnår 40 blå (villtype) og 650 farveløse plaque.
Eksempel 2: Fremstilling av M13mp8 enkelttrådet- DNA
2 ml av en kultur av E. coli JM101 (dyrket i L-medium: 10 g bacto-tryptone, 5 g bacto-gjærekstrakt, 5 g NaCl, 5 g glukose, 0,1 g ampicillin pr. 1 1, til en 0D^23 = ca- °»5) blir blandet med en farveløs plaque (plukket fra agarskålen, se eksempel 1) og holdt i ca. 4-5 timer ved 37° C, 180 upm. Deretter blir den voksende kulturen sentrifugert i 5 minutter i en Eppendorf-sentrifuge. Supernatanten blir overført til et nytt sentrifugerør, sentrifugert en gang til og omsatt med 200 ul 20% polyetylenglykol, 1,5 M NaCl, holdt i 20 minutter ved romtemperatur og til slutt på ny sentrifugert. Supernatanten blir kastet og pelleten blir løst opp i 100 pl 50 mM Tris-HCl pH 7,8, 1 mM EDTA (TE). Blandingen blir blandet med 50 pl fenol/TE (15 minutter ved romtemperatur) og deretter sentrifugert i 5 minutter i en Eppendorf-sentrifuge. 100 ul av supernatanten blir omsatt med 10 pl natriumacetat pH 6 og 3 volum absolutt etanol (250 pl), og holdt over natt ved
—20°C og deretter sentrifugert som ovenfor i 10 minutter. Pelleten blir vasket med 1 ml 80% etanol og på ny sentrifugert. Pelleten blir tørket i 10 minutter ved romtemperatur
og deretter løst opp i 50 pl TE. Oppløsningen inneholder ca.
5 pg M13 mp8 enkelttrådet DNA.
Eksempel 3: Fremstilling av gener som koder for fArg45~ l-Eglin C
a. Kinasebehandling av de nmtagene oligonukleotidene
For mutagenesen blir følgende oligonukleotid fremstilt ved hjelp av kjemisk syntese: 10 pl av oligonukleotidene (1 OD/ml = 500 ng) blir kinase-behandlet i 20 pl 0,07 M Tris-HCl pH 7,6, 0,01 M MgCl2, 50 mM ditiotreitol med ["y-<32>P]ATP og T4 polynukleotid-kinase (Boehringer) [jfr. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, ed. T. Maniatis et al., S. 125]. Det kinasebehandlede oligonukleotidet blir løst i 10 pl TE (50 ng/pl).
b. Mutas. ion av Eglin C- gener
MLTASJONSSKJEMA
1 pg M13mp8 enkelttrådet-DNA blir holdt med 50 ng av den kinasebehandlede oligonukleotid-primeren i 10 pl 50 mM Tris-HCl pH 7,8, 100 mM MgCl2 ved 45°C (30 minutter) og deretter ved romtemperatur (5 minutter) ("sammensmelting"). Deretter blir følgende satt til blandingen:
1 ul 10 mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP,
1 pl T4-DNA-ligase
2 pl 50 mM ditiotreitol
1 pl 10 mM ATP
1 pl 5 mg/ml gelatin
1 pl 10 x kons. Klenow-buffer (0,66 M Tris-HCl pH 7,6,
50 mM MgCl2, 50 mM ditiotreitol)
1 pl DNA-polymerase (Klenow-fragment) = 2,5 enheter
Blandingen blir holdt i 5 minutter ved 22°C og deretter i 16 timer ved 15°C og deretter til slutt separert elektroforetisk i en 1% agarose. Det oppnådde sirkulære, dobbelttrådete DNA blir gjort synlig med etidiumbromid og isolert ut av gelen ved elektroeluering (ca. 10 ng i 15 pl TE). 5 pl (= ca. 3,5 ng) av på denne måten utvunnede DNAet blir transformert i E. coli-stammen JM101 og sådd ut på X-Gal/IPTG indikatorskåler (se eksempel 1). Ca. 100 farveløse plaque blir tilveiebragt. 40 av disse plaquene blir anvendt for koding av en 2 ml E. coli JMlOl-kultur (se eksempel 2). E. coli-cellene blir etter dyrkingen (eksempel 2) sentrifugert for å fjerne supernatanten (inneholder fag og enkelttrådet-DNA, cellepelleten inneholder det nevnte, muterte dobbelttrådete DNAet).
Porsjoner på 50 pl av 40 fag-supernatantene blir filtrert over nitrocellulose, vasket (2 x TE), holdt i 2 timer ved 80°C i vakuum og ifølge Southern [J. Mol. Biol. 98, 503-517
(1975)] hybridisert med oligonukleotidprimeren som radioaktiv markør for undersøkelse for tilstedeværelse av den muterte DNA-sekvensen (III, se skjema). L"t av dette resulterte 12 potensielle fagsupernatanter inneholdende [Arg45]-Eglin-C-genet. Fire av disse positive fagsupernatantene ble fortynnet (ca. 1:10<5>), blandet med E. coli-stamme JM101 og sådd ut på indikator-agar. Fag ut av hver av tre av de oppståtte plaquene ble isolert. Som beskrevet ovenfor ble enkelttrådet DNA isolert. Disse 12 enkelttrådete-DNAene ble sekvensert i Sanger [Science 214, 1205 (1981); Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74, 5463 (1977)]. Alle 12 enkelttrådete-DNAene viser de ønskede muterte Eglin C-sekvensene.
Fra de tilsvarende E. coli-cellepelletene (se ovenfor) blir det tilsvarende, muterte dobbelttrådete-DNA ([Arg45]-Eglin C-genet i plasmid M13mp8) fremstilt i et miniprep.
Ved restriksjons-spalting med restriksjonsendonukleasene EcoRI og BamHI blir EcoRI-BamHI-innskuddet inneholdende det muterte genet spaltet ut av vektoren, isolert og klonet inn i vektor pHRil48/EcoRI/BamHI (europeisk patentskrift nr. 146785). Det oppnådde plasmid pJB618 blir isolert og transformert inn i E. coli-stamme HB101. Stammen som er blitt transformert med plasmid pJB618 blir betegnet som E. coli HB101/pJB618.
Eksempel 4: Fremstilling av gener som koder for fPro44]- Egl in
C .
På en analog måte som i eksempel 3 blir [Thr44]-*[Pro44]-mutasjonen utført. Det anvendte mutagene oligonukleotidet har følgende struktur
Mutasjon av Eglin C-genet blir oppnådd ifølge følgende skj ema.
Ved opparbeiding av mutasjonsblandingen blir 18 potensielle [Pro44]-Eglin C-mutanter oppnådd.
Med kloning av [Pro44]-Eglin C-DNA i vektoren pHEil48/EcoRI/-
BamEI oppnår man på analog måte, som beskrevet i eksempel 3, plasmidet pJB591. E. coli EBlOl-stammen som er blitt transformert med dette plasmidet blir E. coli HB101/pJB591.
Eksempel 5; Fremstilling av genene som koder for TArg45. Ser46l- Eglin C
På analog måte som beskrevet i eksempel 3 blir [Leu45 ,Asp46]-»[Arg45 ,Ser46]-mutasjonen utført. Det anvendte mutagene oligonukleotidet har følgende struktur
Mutasjon av Eglin C-genet blir utført ifølge følgende skjema.
Ved opparbeiding av mutasjonsblandingen blir 12 potensielle [Arg45,Ser46]-Eglin C-mutanter oppnådd.
Ved kloning av [Arg45,Ser46]-Eglin C-DNA i vektoren pHRi148/EcoRI/BamHI oppnår man på analog måte som beskrevet i eksempel 3 plasmid pML147/b. E. coli HBlOl-stammen som er transformert med dette plasmidet blir betegnet som E. coli HB101/pML147/b.
Eksempel 6: Dyrking av de transformerte E. coli- stammene
De transformerte E. coli HBlOl-stammene blir dyrket over natt ved 37°C og 250 upm i 5 ml L-medium (se eksempel 2). 1 ml av denne overnatt-kulturen blir deretter overført i 25 ml M9-medium. M9-medium er sammensatt som følger (pr. 11):
Kulturen blir dyrket ved 37° C og 250 upm. Etter 8-10 timer har kulturen det høyeste titer av Eglin C-mutanter [bestemt ifølge målingen av proteasehumanleukocytt-elastase ifølge L". Seemuller et al., Hoppe-Seyleræs Z. Physiol. Chem. 358,
(1977)] oppnådd.
Eksempel 7: Isolering og rensing av Egl in- mutanter
De overproduserende E. coli-cellene blir åpnet mekanisk ved hjelp av en Dyno-Mill. Cellerestene blir sentrifugert ut i en Sorval-sentrifuge ved 9000 upm i 30 minutter.
På grunn av den høye stabiliteten til Eglin-mutantene i forhold til syrene kan det meste av fremmedproteinene i supernatanten bli fjernet ved felling med ca. 2056 eddiksyre: 10 ml 4056 vandig eddiksyre blir dråpevis pipettert i løpet av 10 minutter til 100 ml av supernatanten. Den sure oppløs-ningen (pH 3,4) blir rørt i 1 time under isavkjøling. De presipiterte fremmedproteinene og andre cellebestanddeler blir sentrifugert i en Sorval-sentrifuge ved 9000 upm i 30 minutter. Supernatanten blir frysetørret over natt i en Virtis-frysmobil.
Det inntørkede gulaktige frysetørrede materialet blir løst i 10 ml 10 mM Tris-HCl pH 7,8 og for oppklaring kort sentrifugert (Sorval SS34: 15000 upm, 10 minutter). Den klare gule supernatanten blir applisert på en ekvilibrert Sephadex G-50 superfin-søyle (Pharmacia) med en lengde på 100 cm og en diameter på 2,5 cm. Det blir eluert med 10 mM Tris-HCl pH 7,8 og en strømningshastighet på maks. 20 ml/t. Absorpsjonen av eluatet ved 280 nm blir registrert. Fraksjoner å 10 ml blir oppsamlet. Elueringsdiagrammet viser en høy topp (fraksjonene 31-40), som inneholder de nevnte Eglin-mutantene. Renheten av Eglin-mutantene i denne fraksjonen blir bestemt ved SDS-gelelektroforese og HPLC. Etter gelfiltreringen viser Eglin-mutantene en renhet på ca. 9956.
Fjerning av bufferen fra Eglin-mutant-fraksjonene foregår med en AMICON-konsentrasjonscelle med YM-2-membran (MWCO 2000). Etter ultrafiltreringen blir probene påny frysetørret. Man oppnår et farveløst pulver (ca. 250 mg/100 ml Dyno-Mill-oppslemming), som blir lagret ved —20°C.
Eksempel 8: Fysiokiemisk karakterisering av Eglin- mutantene
a. rPro44l- Eglin C
Det ifølge eksempel 7 rensede [Pro44]-Eglin C blir under-kastet en molekylvektsmestemmelse ved hjelp av FAB-MS. Molekyliontoppen [M-H<+>] blir vist ved 8130,6. Deretter dreier det seg om produktet tilveiebragt ifølge oppfinnelsen, dvs. N-acetyl-[Pro44]-Eglin C (teoretisk verdi for M-H+: 8130,07).
Ved tryptisk nedbryting av Eglin-mutantene ble 7 fragmenter oppnådd, disse skiller seg bare fra det tilsvarende fragmentet til Na<->Acetyl-Eglin C (jfr. europeisk patentskrift nr. 146785) med fragment 4 som inneholder mutasjonen Thr44->Pro44. Eglin-mutantene blir betegnet som Na<->acetyl-[Pro44]-Eglin C.
I PAGE-SDS-gelelektroforese (jfr. U.K. Laemmli, Nature 227, 680-685 (1970)) forholder Na<->acetyl-[Pro44]-Eglin C seg som Na<->acetyl-eglin C.
b. rArg45l- Eglin C
Molekylvektsbestemmelsen av det rensede [Arg45]-Egl in C tilveiebringer en verdi på 8175,4 [M-H<+>]. Dermed er en N-acetyl-forbindelse også tilstedeværende her (teoretisk verdi for M—H<+>: 8175). Den enzymatiske nedbrytningen med trypsin bekrefter at det dreier seg om Na<->acetyl-[Arg45]-Eglin C.
I PAGE-SDS-gelelektroforesen forholder Na<->acetyl-[Arg45]-Eglin C seg også som Na<->acetyl-eglin C.
c. fArg45, Ser46l- Eglin C
Molekylvektsbestemmelsen av renset [Arg45,Ser46]-Eglin C tilveiebringer en verdi på 8148,7 [M-H+] . Dermed foreligger også her en N-acetyl-forbindelse (teoretisk verdi for M-H+: 8149,1). Tryptisk nedbrytning av Eglin-mutantene viser at det dreier seg om Na<->acetyl-[Arg45,Ser46]-eglin C.
I PAGE-SDS-gelelektroforesen forholder Na<->acetyl-[Arg45,Ser46]-eglin C seg også som Na<->acetyl-eglin C.
Eksempel 9: Kinetisk karakterisering av eglin- mutantene Bestemmelse av inhibisjonskonstanten K-^ foregår ifølge N. Braun et al. [Biol. Chem. Hoppe-Seyler 368, 299-308 (1987)] ved måling av steady-state reaksjonshastigheten ved fri-gjøringen av p-nitroanilin fra proteinase-inhibitor-substrat-blandinger. Bare inhibitor-konsentrasjonen blir variert. Frigjøring av p-nitroanilin blir, etter at OD405~kurven som funksjon av tiden var lineær, tegnet opp i 10 til 20 minutter. Ut i fra de forskjellige stigningene kan Kj bli bestemt. Som proteaser anvendes humanleukocytt-elastase (ELE), chymotrypsin og trypsin. Eksemplariske inhibisjonskonstanter er satt opp i følgende tabell:
Resultatene viser at ved utbytting av Leu45 mot Arg45 blir en Eglin C-mutant oppnådd, som i motsetning til naturlig Eglin C er en sterk trypsin-inhibitor, men bare en svak ELE-inhibitor.
Eksempel 10: Ekspresjon av [ Arg45]- Egl in C og N^- acetvl-fArg45]- eglin C i gjær
En vektor for ekspresjon av fremmede gener i gjær inneholder en sterk, fortrinnsvis induserbar gjærpromoter og et til-knyttet transkripsjonstermineringssignal, som er forbundet med promoteren gjennom enkelte restriksjonssteder, som tillater innføring av fremmede gener. Videre inneholder en gjærekspresjonsvektr DNA-sekvenser som muliggjør autonom replikasjon av vektorene og som medfører et høyt kopiantall. En slik sekvens er fortrinnsvis gjær 2 jj DNA. Videre inneholder vektoren en selekterbar markør for gjær, fortrinnsvis gjær LEU2-genet, samt pBR322 DNA-sekvensen med replikasjons-start og ampicillin-resistensgenet for amplifikasjon i E. coli. Slike vektorer blir betegnet som skyttelvektorer, på grunn av at de kan bli anvendt både i gjær og E. coli.
En ekspresjonsvektor som med høy effektivitet kan bli satt inn i gjær, ble beskrevet i europeisk patentskrift nr. 100561. Ekspresjon av de fremmede genene foregår under kontroll av den regulerbare PH05-promoteren til det sure fosfatase-genet i gjær. PH05-promoteren, det fremmede genet og PH05 transkripsjons-termineringssignal-sekvensen ble satt inn etter hverandre i plasmid pJDB207, som inneholder gjær 2 u DNA, gjær LEL<T>2-genet, et E. coli replikasjonsorigo samt ampicillin-resistensgenet.
Ekspresjonsplasmid pJDB207R/[Arg45]EGL blir konstruert som følger:
a) Isolering av pJDB207 vektor- fragmentene
Seks pg av plasmidene pJDB207R/IF(a-3) (EP 100561) blir
fullstendig nedbrutt med restriksjonsenzymet BamHI. De oppnådde DNA-fragmentene på 6,85 kb og 1,15 kb blir presipitert med etanol og resuspendert i 400 ul 50 mM Tris-HCl, pH 8,0. 4,5 enheter alkalisk fosfatase (fra Kålberdårmen, Boehringer Mannheim) blir tilsatt, og blandingen blir inkubert i 1 time ved 37°C. Til slutt blir fosfatasen inaktivert ved inkubering ved 65°C i 1,5 timer. Oppløsningen blir innstilt til en konsentrasjon på 150 mM NaCl og til slutt ført gjennom en 100 ul DE 52 (Whatman) anionbyttesøyle, som var blitt ekvilibrert med en oppløsning på 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA. Etter vasking med den
samme bufferen blir DNAet eluert med 400 pl 10 mM Tris-HCl,
pH 7,5, 1,5 M NaCl, 1 mM EDTA og presipitert med etanol. Det 6,85 bp store BamHI-fragmentet blir isolert fra det lille fragmentet i en 0, 6% gel på en laveresmeltende agarose i Tris-Borat-EDTA-buffer, pH 8,3. b) Isolering av det 534 bp store PH05 promoter- fragmentet Ti pg av plasmid p31/R (EP 100561 )- blir spaltet med restrik-sjonsenzymene EcoRI og BamHI. De oppnådde 3 fragmentene blir adskilt på en 0, b% gel i laveresmeltende agarose i Tris-borat-EDTA-buffer, pH 8,3. Det 534 bp store BamHI-EcoRI-fragmentet, som inneholder PH05-promoteren, samt transkrip-sjonsstart, blir isolert. c) Isolering av 230 bp store DNA- fragmenter. som inneholder den kodende sekvensen for fArg45l- Eglin C
Åtte pg av plasmid pJB618 blir spaltet med restriksjons-enzymene BamHI og EcoRI. De oppnådde 2 fragmentene blir adskilt på en 0,656 gel av laveresmeltende agarose i Tris-Borat-EDTA buffer, pH 8,3. Det 230 bp store fragmentet blir isolert.
d) Ligering av DNA- fragmenter
De tre under a) - c) beskrevne DNA-fragmentene, som innehol-
der tilsvarende overhengende ender, blir knyttet sammen i en ligeringsreaksjon. 0,1 pmol (0,45 pg) av det 6,85 kb store BamHI vektor-f ragmentet, 0,2 pmol (70 ng) av 543 bp store BamHI-EcoRI PH05 promoter-f ragmentet og 0,2 pmol (29 ng) av
230 bp store EcoRI-BamHI-framgentet til pJB618 ble ligert.
Alle tre DNA-fragmentene ble tilveiebragt i små biter av laveresmeltende agarose. De tre agarosebitene ble blandet sammen, smeltet ved 65°C og fortynnet to ganger. Ligeringen ble gjennomført i et sluttvolum på 270 pl i 60 mM Tris-HCl,
pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP med 16 enheter T4 DNA-ligase (Boehringer Mannheim) ved 15 °C i løpet av 16 timer. 10 pl av liger ingsblandingen blir satt til 100 pl kalsiumbehandlede, kompetente E. coli HBlOl-celler. 24 transformerte, ampicillinresistente enkeltkolonier ble dyrket i LB-medium som inneholdt 100 pg/ml ampicillin. Plasmid-DNAet blir isolert ifølge Holmes et al. [Anal. Biochem. 114, 193 (1981)] og analysert ved Hindlll/EcoRI dobbeltrestriksjon. Tilveiebringelse av et 600 bp stort EcoRI/HindIII-fragment viser den klonen, som inneholder integrert i ekspresjonsvektoren PH05 promoter-[Arg45]-Egl in C-DNA-Fragmentet i riktig orientering. Som ventet inneholder 50% av klonene innskuddet i riktig orientering. En av klonene blir isolert og betegnet som pJDB207R/PH05-[Arg45]EGL. e) Transformering av Saccharomvces cerevisiae- stamme GRF18 Etter transformeringsprotokollen til Hinnen et al. [Proe.
Nati. Acad. Sei. TJSA 75, 1929 (1978)] blir plasmid pJDB207R/PH05-[Arg45]EGL transformert i Saccharomyces cerevisiae-stamme GRF18 (a, his3-ll, his3-15, leu2-3, leu2-112, can**). Transformerte celler blir selektert på gjær-minimalmedium-skåler, som ikke inneholder leucin. Enkeltvise transformerte gjærkolonier blir isolert og betegnet som Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/PH05-[Arg45]EGL.
f ) Fermenter ing av Saccharomvces cerevisiae GRF18/ pJDB207R/ PH05- rArg45lEGL og isolering av TArg45<l>- Eglin C og N0t- acetvl- rArg45l- eglin C
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/PH05-[Arg45]EGL-celler ble dyrket 13 1 minimalmedium med 0,03 g/l KH2PO4 i en mini-bioreaktor ved 30°C og ved oppnåelse av en celle-tetthet, som tilsvarer en OD^q på 1,9, høstet.
[Arg45]-Eglin C og Na<->acetyl-[Arg45]-eglin C blir dannet ut i fra de transformerte gjærcellene i vektforhold på omtrent 2:1. Begge produkter kan bli isolert fra gjærcellehomogenater tilsvarende fremgangsmåten angitt i eksempel 7 for E. coli.
Eksempel 11: Farmasøytisk preparat
En Na<->acetyl-[Arg45]-eglin C inneholdende oppløsning fremstilt ifølge eksempel 7, blir dialysert mot en 0, 9% NaCl-oppløsning. Konsentrasjonen til oppløsningen blir deretter etter fortynning med den samme NaCl-oppløsningen innstilt på 1 mg/ml eller 10 mg/ml. Disse løsningene blir sterilisert ved ultrafiltrering (membraner med 0,22 um porer).
De steriliserte oppløsningene er direkte anvendbare for intravenøs bearbeiding og for kontinuerlig dråpeinfusjon.
Deponering av mikroorganismer
Stammen E. coli HB101/pML147 ble 28. januar 1988 deponert til "der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Masche-roder Weg lb, D-3300 Braunschweig, med nummer DSM 4380.
Claims (6)
1.
Fremgangsmåte for fremstilling av modifisert Eglin B eller C ifølge formel
R-ThrGluPheGlySerGluLeuLysSerPheProGluValValGlyLysThrVal AspGlnAlaArgGluTyrPheThrLeuHisTyrProGlnTyrAspVal-W-PheLeu ProGluGlySerProVal-X-Y-Z-LeuArgTyrAsnArgValArgValPheTyrAsn ProGlyThrAsnValValAsnHisValProHisValGly-OH (I),
hvor R betyr hydrogen eller acetyl, W betyr Tyr eller His, X betyr Thr eller Pro, Y betyr Leu eller Arg og Z betyr Asp eller Ser, og salter derav, karakterisert ved at man fremstiller mutert DNA som koder for modifisert Eglin B eller C ifølge ovennevnte formel, kloner dette kodende DNA i en ekspresjonsvektor transformerer en vertscelle dermed, dyrker de transformerte vertscellene og isolerer modifisert Eglin B eller C eller et salt derav.
2 .
Fremgangsmåte for fremstilling av forbindelser med formel I ifølge krav 1,karakterisert ved at R er acetyl, W er Tyr, X er Thr, Y er Arg og Z er Asp eller Ser, og salter derav.
3.
Fremgangsmåte for fremstilling av J^-acetyl-[Arg45]-egl in C ifølge krav 1.
4 .
DNA, karakterisert ved at det koder for en modifisert Eglin B eller C med formel som angitt i krav 1.
5.
Ekspresjonsvektor som er egnet for ekspresjon av modifisert Eglin B eller C med formelen ifølge krav 1, k a r a k-terisert ved at den inneholder det i krav 4 angitte kodende DNA og en operabel koblbar ekspresjons-sekvens.
6.
Vertsmikroorganisme egnet for ekspresjon av modifisert Eglin B eller C, karakterisert ved at den inneholder en ekspresjonsvektor ifølge krav 5.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CH84088 | 1988-03-07 |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO890932D0 NO890932D0 (no) | 1989-03-06 |
NO890932L NO890932L (no) | 1989-09-08 |
NO178870B true NO178870B (no) | 1996-03-11 |
NO178870C NO178870C (no) | 1996-06-19 |
Family
ID=4196431
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO890932A NO178870C (no) | 1988-03-07 | 1989-03-06 | Fremgangsmåte for fremstilling av modifisert Eglin B eller C samt DNA, ekspresjonsvektor og vertsmikroorganisme |
Country Status (20)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5079229A (no) |
EP (1) | EP0332576B1 (no) |
JP (1) | JP2716191B2 (no) |
KR (1) | KR0134377B1 (no) |
AT (1) | ATE103930T1 (no) |
AU (1) | AU623881B2 (no) |
CA (1) | CA1339105C (no) |
DD (1) | DD283645A5 (no) |
DE (1) | DE58907373D1 (no) |
DK (1) | DK107389A (no) |
ES (1) | ES2063161T3 (no) |
FI (1) | FI96116C (no) |
HU (1) | HU209401B (no) |
IE (1) | IE62993B1 (no) |
IL (1) | IL89496A0 (no) |
NO (1) | NO178870C (no) |
NZ (1) | NZ228208A (no) |
PT (1) | PT89916B (no) |
TW (1) | TW211522B (no) |
ZA (1) | ZA891679B (no) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6342373B1 (en) * | 1983-11-21 | 2002-01-29 | Ucp Gen-Pharma Ag | Process for preparing recombinant eglin, protease inhibitor |
US5674833A (en) * | 1990-09-18 | 1997-10-07 | Novo Nordisk A/S | Detergent compositions containing protease and novel inhibitors for use therein |
US5604201A (en) * | 1993-01-08 | 1997-02-18 | State Of Oregon, Acting By And Through The Oregon State Board Of Higher Education On Behalf Of The Oregon Health Sciences University, A Non-Profit Organization | Methods and reagents for inhibiting furin endoprotease |
TW492975B (en) * | 1993-07-26 | 2002-07-01 | Novartis Ag | Tryptase inhibitor |
DE69722639T2 (de) | 1996-09-24 | 2004-04-29 | The Procter & Gamble Company, Cincinnati | Stabilisierte proteine mit protease-inhibitorfunktion und varianten davon |
US7001884B2 (en) * | 2001-06-18 | 2006-02-21 | Regents Of The University Of Michigan | Eglin c based drugs for treatment of disease |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB2125047B (en) * | 1982-08-09 | 1986-02-19 | Ciba Geigy Ag | Yeast hybrid vectors and their use for the production of polypeptides |
DE3324534A1 (de) * | 1983-07-07 | 1985-01-17 | Ciba-Geigy Ag, Basel | Modifizierte protease-inhibitoren, verfahren zu ihrer herstellung und daraus bereitete pharmazeutische mittel |
CA1297437C (en) * | 1983-11-21 | 1992-03-17 | Hans Rink | Process for the preparation of protease inhibitors |
US4711848A (en) * | 1984-03-14 | 1987-12-08 | Zymogenetics, Inc. | Site specific mutagenesis in alpha-1-antitrypsin |
EP0164719B1 (en) * | 1984-06-14 | 1992-05-06 | Chiron Corporation | Active site modified protease alpha-1-antitrypsin inhibitors and their production |
DE3587875T3 (de) * | 1984-12-06 | 2003-01-02 | Amgen Inc.(N.D.Ges D. Staates Delaware), Thousand Oaks | Rekombinantverfahren zur herstellung von serinproteaseinhibitoren, sowie dns-sequenzen dazu. |
GB2188322A (en) * | 1986-03-26 | 1987-09-30 | Bayer Ag | Aprotinin and analogues thereof produced by a recombinant host |
GB2199582A (en) * | 1987-01-07 | 1988-07-13 | Bayer Ag | Analogues of pancreatic secretory trypsin inhibitor |
-
1989
- 1989-02-28 AT AT89810152T patent/ATE103930T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-02-28 EP EP89810152A patent/EP0332576B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-02-28 ES ES89810152T patent/ES2063161T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-02-28 DE DE89810152T patent/DE58907373D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-03-03 AU AU30959/89A patent/AU623881B2/en not_active Ceased
- 1989-03-03 NZ NZ228208A patent/NZ228208A/xx unknown
- 1989-03-03 FI FI891020A patent/FI96116C/fi not_active IP Right Cessation
- 1989-03-03 CA CA000592686A patent/CA1339105C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-03-06 NO NO890932A patent/NO178870C/no not_active IP Right Cessation
- 1989-03-06 IL IL89496A patent/IL89496A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1989-03-06 PT PT89916A patent/PT89916B/pt not_active IP Right Cessation
- 1989-03-06 HU HU891101A patent/HU209401B/hu not_active IP Right Cessation
- 1989-03-06 DD DD89326310A patent/DD283645A5/de not_active IP Right Cessation
- 1989-03-06 DK DK107389A patent/DK107389A/da not_active Application Discontinuation
- 1989-03-06 IE IE71989A patent/IE62993B1/en not_active IP Right Cessation
- 1989-03-06 ZA ZA891679A patent/ZA891679B/xx unknown
- 1989-03-07 TW TW078101663A patent/TW211522B/zh active
- 1989-03-07 KR KR1019890002759A patent/KR0134377B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1989-03-07 JP JP1053065A patent/JP2716191B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-03-07 US US07/320,139 patent/US5079229A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
FI96116B (fi) | 1996-01-31 |
EP0332576B1 (de) | 1994-04-06 |
KR0134377B1 (ko) | 1998-04-20 |
NO890932L (no) | 1989-09-08 |
ES2063161T3 (es) | 1995-01-01 |
FI891020A0 (fi) | 1989-03-03 |
JP2716191B2 (ja) | 1998-02-18 |
AU623881B2 (en) | 1992-05-28 |
EP0332576A2 (de) | 1989-09-13 |
DE58907373D1 (de) | 1994-05-11 |
EP0332576A3 (en) | 1990-09-12 |
CA1339105C (en) | 1997-07-29 |
FI891020A (fi) | 1989-09-08 |
NO178870C (no) | 1996-06-19 |
TW211522B (no) | 1993-08-21 |
PT89916B (pt) | 1994-05-31 |
IL89496A0 (en) | 1989-09-10 |
HUT50503A (en) | 1990-02-28 |
IE62993B1 (en) | 1995-03-08 |
FI96116C (fi) | 1996-05-10 |
ATE103930T1 (de) | 1994-04-15 |
US5079229A (en) | 1992-01-07 |
AU3095989A (en) | 1989-09-07 |
ZA891679B (en) | 1989-10-25 |
DK107389D0 (da) | 1989-03-06 |
DK107389A (da) | 1989-09-08 |
DD283645A5 (de) | 1990-10-17 |
IE890719L (en) | 1989-09-07 |
KR890014735A (ko) | 1989-10-25 |
JPH029392A (ja) | 1990-01-12 |
NZ228208A (en) | 1990-08-28 |
PT89916A (pt) | 1989-11-10 |
NO890932D0 (no) | 1989-03-06 |
HU209401B (en) | 1994-05-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5631144A (en) | Application of novel DNA fragments as a coding sequence for a signal peptide for the secretion of mature proteins by recombinant yeast, expression cassettes, transformed yeast and corresponding process for the preparation of proteins | |
EP0339942B1 (en) | Aprotinin analogues and process for the production thereof | |
CA1339106C (en) | Hirullin polypeptides having anticoagulant activity | |
FI108943B (fi) | Menetelmiä seriiniproteaasi-inhibiittorien valmistamiseksi ja menetelmässä käytettävä synteettinen tai eristetty DNA-sekvenssi, yhdistelmävektori sekä bakteeri- tai hiivaisäntäsolu | |
HUT70292A (en) | Human kunitz-type protease inhibitor variants | |
CA2025070C (en) | Recombinant aprotinin variants genetically engineered process for the microbial preparation of homgeneously processed aprotinin variants and the therapeutic use thereof | |
NO178870B (no) | Fremgangsmåte for fremstilling av modifisert Eglin B eller C samt DNA, ekspresjonsvektor og vertsmikroorganisme | |
AU8172787A (en) | Human pancreatic secretory trypsin inhibitors produced by recombinant dna methods and processes for the production of same | |
FI104428B (fi) | Menetelmä aprotiniinin ja aprotiniinihomologien tuottamiseksi hiivassa | |
US5180667A (en) | Genes encoding eglin C mutants | |
US6291662B1 (en) | Recombinant methods for production of serine protease inhibitors and DNA sequences | |
US5268296A (en) | DNA vector and recombinant host cell for production of hirullin P6 and P18 | |
US5231010A (en) | Recombinant aprotinin variants genetically engineered process for the microbial preparation of homogeneously processed aprotinin variants and the therapeutic use thereof | |
US6132990A (en) | Recombinant methods for production of serine protease inhibitors and DNA sequences useful for same | |
JPH09500532A (ja) | トリプターゼ阻害剤 | |
JPH05308988A (ja) | 新規ポリペプチド、新規dna、新規ベクター、新規形質転換体、新規医薬組成物、および新規ポリペプチドの製造方法 | |
DK171239B1 (da) | Fremgangsmåde til fremstilling af aprotinin eller homologer deraf, vektor der er i stand til at replicere i gær samt gærstamme | |
JPH07196688A (ja) | 新規な生理活性ポリペプチド、その製造方法及び用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |
Free format text: LAPSED IN SEPTEMBER 2003 |