TW211522B - - Google Patents

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五、發明説明： 、本發明與蛋白酶抑制劑egli…eglin c之突變證， 通口製造該突變體之ί昆種载體，被該混種载體轉形之傲生 物寄主，及該混種载體，轉形寄主傲生物，egHn突變體 之製造方法等有關。 德國專利申請書第28〇8396號中敍述由水蛭cHirud〇 〕分離二種蛋白酶抑制劑定名為egli~及 egUn C。其多腹月太各含70個久基酸，分子量.約8100，為 陕臟乳蛋白酶，枯草桿菌溶素，人及動物有粒細胞蛋白酶 類彈性蛋白酶與組織蛋白酶G及肥大細胞蛋白酶凝乳酶之 强烈抑制劑。但如瞋蛋白酶等蛋白酶則不被抑制或只被抑 制不顯著程度。 egl i n C之初級結構如下： H-ThrGluPheGlySerGluLeuLysSerPheProGluValValGlyLysThrVal

AspGlnAlaArgGluTyrPheThrLeuHisTyrPr〇GlnTyrAspValTyrpheLeuPr〇GluGiy_

SerPr〇ValThrLeUAspLouArgTyrAsnArgValArgValphcTyrAsnpr〇GiyThrAsriVai_

ValAsnHisValProliisValGly*-〇n egIin C不同於—般所知蛋白酶抑制劑，不具有饪何雙硫 橋鍵。考慮及其較小之分子量，—般對酸、檢氛氡化物溶 液，及蚊變性，及解蛋白性降階作用#不安定。…h B之初級結構與egIin (：不同之處在於第拓個氣基醆，其 骆氣醆被組織氤駿取代。 、 至目前為止，egl in為人與動物有粒細胞彈性蛋白酶及 人有粒細胞組織蛋白酶G之最强烈抑制劑。於器官内來控 制或過量釋故此等細胞蛋白酶可增强發炎過程而被扑特^ (21X29.7) WENPING & C〇 2115^2 性蛋白質分解引起組織破壞。 有時在生理中性或微酸性媒液中、"細胞内消化之酵素 質（如彈性硬蛋白）及液 、活性而能使天然組織物 因素 C" __ )急速破壞並不活化。由 /因素，補體因素 ;〃、已知特性 慮用於醫蔡治療C如抗炎性、 因此eglin被考 氣瞳、黏稠液疾等）。 、退熱、睃毒性休克、肺 egl in最近可應用重組基 申嗜當笛"Μ。 阁技衡而製成（參照歐洲專利 申清書第146785號）。而本

^ A ^ *之理渝基礎為由eglinB 或egl ln C製造新穎蛋白酶 ^ , 制幻。依據本發明该問题已 獲解決》將天然egl in B及η η Γ為 glin C之活性中心區域之— 、二、或三個么基酸（第45良基酸、第46瓦基酸、A” )用m基㈣替而獲得與天然eglin B或训n ^ 同之egl in突變體。如此依據本發明所獲得之egiin突變 證表現絮人特性：在抑制各種蛋白酶方面增加特異性，並 抑制eglin Ueglin C無法或甚少抑制之蛋白酶，如陕 蛋白酶、凝血酵素。 本發明特別與下列分子式之eg丨i η突變蹬有關： R-ThrGluPhoGlySerGluLeuLysSerPheProGluValValGlyLysThrVal

AspGlnAluArgGluTyrPheThrLeuHisTyrProGlnTyrAspVal-W-PheLeu

ProGluGlySerProVal-X-Y-2-LeuArgTyrAanArgValArgValPheTyrAan

ProGlyThrAsnValValAsnHisValProHieValGly-OH ( I), 其中R為氬原子或己醯基* W為Tyr或His ，X為Thr 、 Ser 或 Pro ， Y 為 Leu 、 Met 、 Arg 、 LyS 、 Phe 、 Tyr 、或 Trp ， Z 為 Asp 、 Glu 、 Gin 、 Asn 、 Ala 、 Ser 或

Thr ，旦其先決條件為當Y為Leu ，Z為Asp時X為Thr 4 (21x29.7) WENPING & CO. 211522 以外，並其鹽類。 本發明特別與分子式ϊ之化合物有關，其中乙醯基 ’ W 為 Tyr 而 χ 為 Thr，γ 為 Arg 或 Lys ? z 為 Asp、Glu Gln、Asn、Ala、Ser 、Thr ;或 X 為；pro ，γ 為 Met 為 Asp ;或 χ 為 Thr ’ Y 為 Phe、.. Tyr、Trp、Met ’ 2為As P »並其鹽類。 本發明主要與分子式I之化合物有關，其中R為乙驢基 ，W 為 Tyr，X 為 Thr ，Y 為 Arg，z 為 Asp 或 Ser·，並 其鹽類。 本發明特別與分子式I之化合物有關，其中R為乙醯基 為Tyr ，X為Thr，Y為Arg，Z為Asp，益其鹽類。 分子式I之新穎化合物不僅可為游離狀態，亦可為其鹽 類狀4 ’尤其是其藥學上可接受之鹽類。由於其含許多具 游離良基或脈基之氟基酸殘基，故本發明之化合物可為醆 成·=·類狀態。逍合之酸加成鹽類特別為生理學上可容忍 <鹽類及習慣上治療學可接受之鹽類。適合之無機醆類為 氫崗醆類（如鹽醆），但硫醆，磷醆，焦磷醆亦可。逍合 之有機駿類為磺酸類（如笨、對曱笨磺酸、及泜級烷磺醆 甲！^續酸），駿酸類（如醋酸、乳酸、棕櫚酸、硬眧酸 歸發、酒石酸、禪橡酸、抗壞血酸）。由於eglin 物亦含具游離狡基之氣基酸殘基，故亦可為金屬鹽類 尤其驗金屬鹽或驗土金屬鹽，如納、狎、鈣、鎮鹽；或 良或生理學上可容忍之有機含氟鹽基衍生之氬鹽類。由 万、其可能同時含游離羧基與游離氡基C及胍基），故亦可 (21Χ29·7) WENPING & CO. 5 2115^2

以内鹽類狀態存在。 本發明之eglin突變體 如依遺傳工程技術，如培養含I:二依…法製造’ 種之隱之轉㈣生物寄主 突變體之- 。本發明之eglin突變體…f eglid變體或其鹽類 ⑻製造編ί%丨·々 〃、皿肩特別由下列方法製成： JI达編碼egl ln突變體之dna， (b)插入该ΜΑ於一載體， ⑹以轉形方法將所得混種载證導入寄主微生物中， 允許表現eglin突變體狀態下培養轉形寄主傲生物， ⑹/刀離eglin突變體或其鹽類。 (A)编碼eg 1 iη突變體之DNa : 本發明與含編碼一 egl in突變證之核苷酸序列之DNA有 關，尤其前述特別適合<eglin突變體中之一種。 本發明之MA最好於其禾端側翼序列含適合之㈣部位 使其DNA能夠插入於载體。 本發明之MA可依據本技藝已知方法製成。如該dna可 以化學方法製造，或其沣段可以化學合成方法製造後以酵 素方法連接成預先所知狀態，或編碼eg丨i n B或eg丨丨n c 之ΜΑ以一或數個步取予以突變。 DNA之化学合成以已知方法進行，適合之方法叙述於

Narang〔 Tetrahedron 39 : 3 (1983)〕及歐洲專利申請 書第146785號。 本發明之DNA之製迻亦可促使編碼egl in B或egi iri C 之DNA突變而製成。最好使用所謂「位點導向誘變」方法 6 (21X29.7) WENPING & C0. 211522 ' Ζ〇1ΐ6Γ et al , Methods in Enzymology IDO ： 4 68 ^1983)〕 &其方法中，單股egl in DNA複殖於M13噬菌 &與含導向x變之核昔酸之互補纸聚核昔酸雜交（混成 )’其混成產物補加私#顧r β(- 、.仰加形成雙S又，所得雙股噬菌體以轉形方 Alt S ^ilH_L£hi_a coj丄寄主中，於培養該轉形 一1_ 細胞後’含編碼eg 1 i n突變體MA之細胞以上述 低聚核苷酸雜交予以鑑別。 ⑻含編碼egl ίη突變蹬MA之表現载體之製造： 本發明更與含編碼一 egl in突變體隱序列之表現载體 有關，該匪序列被表現控制序列調節而使eglin突變體 在被該表現载體轉形之寄主細胞中表現。 本發月之表現载體由插入編碼eglin突變體抓八序列於 含表現控制序列之载體職而製成，此表現控制序列調節 該DNA序列。 選揮適合之载體係根據提供轉形之寄主細胞而定。適合 之寄王如微生物中之酵母餡C ^ Sacharomyces cerevisiae )’細菌之各“(如 ~~~ 之各箇系），以及高等生物之細胞（如已建立之 人或動物細胞系〕。較適合之寄主細胞為^ c〇u之菌系 佐何载只要能夠在選定之寄主Μ製發明之 編碼eglin突變體DNA序列者均可謂逋合。 一 —土2^·1菌系中逋合表現eglin突變體之载體為噬菌 …物之衍生體或質體mc〇1 El及其衍生證 ，如_，P_24，pBR317《pBR322。本發明之較逍

WENPING & C〇i 2115^2 栽體為由質體pBR322衍生者。適合之载體 整之 複·製子& I-, _ 丁，、一榡纪基因，使被表現質體轉形之徽生物以表型 _、1己選祓並鑑別。供給微生物之適合標記基因為如抗重金 卜| 或抗生素性等。再者，本發明之較通合载體除含複製 ―、標4基因外尚含鑑識内核酸酶之識別序列區域，使编 :g 11 η突變體DNA序列及表現控制序列能夠插入於其部 位〇 、、 各種表現控制序列均可使用於調節表現。使用之表现控 J序列特別為欲被轉形之寄主細胞之强烈表現基因。於使 合為混成载體，為寄主傲生物情形下，逋 糖楛嫩現k制序列（含起動區及核糖體結合點）為刿如乳 ，—子、色Μ操縱子、，糖操縱子等’月内越按酶 正固體Ν基因或噬菌體fd 由於…_基… 質基因…序列等。 _322中 "μ0之起動區已含於質證 本發明中較遥1 其他表現控制序列必須插入於質體中。於

適合複製m2現㈣序列為色^操縱子ctrp po〕。 t皮·表現於酵母茵中之载人 A 及一酵母箇選擇性遺# a 母菌複製起點 體自動複製沣段Urs 製起點〔如杀色 ^ars)〕之混成綦鞞 .._ 細胞内以梁色料保留 …1轉形後在酵母菌 ，含與酵母菌“質二：…'分裂時自動複製。再者 ”困2卢質體DNA相同序列之 。此種混成载體與先前已存在之成载體亦可使用 而導入細胞中。訝酵 卢質體重組或自動複製 a 囷適合之標記基因Do 素抗性者’而於螯* 為k供寄主抗生 於詈養突變型酵母菌而言 則為互補寄主缺 (21X29.7) WENPING & C0. ,、基因。列如抗生素亞按環己西同抗性基因及於營養突變 型酵母菌提供原養型之基目，如ura3、leu2、his… ___Ei基因彳。再者，酵母菌混成载體最好含有—複製起點 '囷寄王（尤其! )之標記基因，而使混成载體 及其前雕證之構萘與複殖能夠在細菌寄主中進行。逍合表 現於酵母菌中之表現控制序列為如⑽、adhl、刪、

Ph〇5等基因，及從事解醣降階之起動區，如_與_仳 起動區。 、本發月特別與含表現控制序列與編碼e g Η n突變體⑽a Ή正肯b複製及表型選拔之表現载體冑關。该DNA序列與 轉錄起始信號及終止信號，轉譯起始信號及終止信號以此 順序於該表現控制序列調節下排列於該表現質證中，而使 egl in突變體在被該表現質體轉形之寄主細胞中表現。 為達成有政表現，编碼egl i n突變體之基因應與表現控 J乎】正確排列。表現控制序列與e g〗丨η突變體基因之連 結最好在主mRNA起始部位與基因編料列之應密碼子之 間，後者與表現控制序列自然連結（如使用卢—uc起動區 時為θ—lac編碼序列），而eglin突變體基因最好帶有其 本身之轉譯起始信號CAT(〇#轉譯終止信號（如tag)。藉 如上述方法可確保有效轉錄與轉譯。 (C)餱生物之轉形： 本發明亦與轉形寄主細胞之製法有關，其方法包括以含 编碼eglin突變體DNA序列之表現载體轉形寄主細胞，而 該DNA序列被表現控制序列調節。 (21x29.7) WENPING & C0. 適合之寄主細胞為如則述之徽生物，如Sa c cha r omy c e s cerevisiae 、Bacillus subt i1i s、Escherichia coli 之菌系。以本發明之表現質體轉形係以文獻获述方法進行 ，^ S. cerevisiae 〔 Hinnen et al ， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 : 1929 ( 19 78 )〕、B. sutilis〔

Anagnostopoulos et al·， J. Bacteriol· 81 : 741C1961) ^ ~— 1 I C Mandel et al , J. Mol. Biol. 53 ： 159 (I9 70)〕。轉形寄主細胞最好由選擇性營養培養基分離， 該培養基加有對抗表現質體中所含標記基因之殺生物劑。 不含表現質體之細胞在此種蛣養基中被毂死。 本發明亦與以該方法所獲得之轉形寄主細胞有關。 (D)培養轉形寄主細胞並间收eglin突變體： 被轉形寄王細胞用以生產egHn突變體。其生產方法包 括培養上述轉％寄主細胞’並由該寄主細胞游離及分離該 生產物。 本發明特別與分子式1及其鹽類之eglin突變體之製造 方法有關’包括於含可同切、素源與氣素源之液證培養基 -«養被a編碼分子式：之eg i i η突變證舰序列技祓 表現控制序列調節之表現質體轉形之寄主細胞，由該寄主 广離及分離其產物；且如有需要將依本法獲得分于式 二：合…合物分離為各單獨成分，並將所得鹽類轉 又、、離，肢月太，或將所得多敗肽轉變為鹽類。 可主細胞依已知方法培養。各種破素源均 … ^轉形寄m物。較通合之破素源為 (21X29.7) WENPING & C0. —10 2UK2 可同化域水化合物，如葡萄糖 。適合之氮素源如氤基酸類（ 蛋白質，多胜肽及其降解產物 ，及酵母抽出物，麥茅抽出物 ，碲酸氮）等等。可使用之I 之硫酸鹽、氟化鹽、麟酸鹽、 再者 、鏟） 之物質 黴素。 之污染 、麥芽糖、乳糖、甘露醇等 加隆蜜酸（a s ami η〇 a c i d〕， (腺、色氡腺、肉抽出物） ’良鹽類（氟化氣，硫酸氟 機鹽類則如納、鉀、鎂、鈣 域醆鹽等。 溆生物之效果 ，培養液可含生長促逸你呀 返物質，如餱量元素C鐵、辞 ，及能施加選拔壓力及p日L ^ A P且止生長細胞漏失表現質體 。如表现質體具ampR其阳 μ I因時，培養液內添加·安苄 洛加此種抗生素活性物皙十士 < * |：£御贤亦有段死對该抗生素敏戚 培養依已知方法進行。培養條件如溫度、ΡΗ質及醱酵時 間等均設定獲取最高濃度eglin突變體。如^^或酵 母菌而言，培養以需氧狀態下進行振逢或挽拌浸沒培養， 溫度約2°m，最好約Μ，PH值約…，最好约 7，培養時間約4 hr〜20 hr，最好8〜丨2 hr。其表現產 物積聚於細胞内。 當細胞密度遠到適當值時郎停止培養而由傲生物細胞游 離產物。為此，細胞以清潔劑處理（sds、h丨Μη )或以 溶菌酶溶解…卜亦可應用機械力如努力（χ麼淚、 French墨濾、Dyno^iU等），與坡璃珠或氧化銘攪拌， 交替冷球（液態氣）與解束〇0〜40〇，及超音波處理 等以破壤細胞。經達心分離後’其含蛋白質、核酸、及其 他細胞成分之品合液’以巳知方法加濃其中之蛋白質。如 (21x29.7；) WENPING & C0. ~ 11 211522 二:胺:理增蛋白質成分，再以硫安飯和 含egUn突變體）。細菌蛋白質亦可以错駿（〇 = P 3 5)醆化沈澱。eglin突變體之進一步 用正丁醇抽出醋酸…清液以達成。其他純化步二濃可 析芩法’如離子交換色析、谬體過濾色析、疹體滲透 轉$配色析、HPLC、逆相啦。等。以修體員荷或無 ^电水後，其混合成分利用適當Sepha deX管柱根據分 大小進行透析分離，或以親和性色析（如抗證，尤 抗體或偶合於载體之無水陕凝蛋白酶或凝血酶）分離。 分離表現之eglin突變體包括下列步驟： 以U離法内培養液分離細胞；破壞細胞（用〜nq 二以製成粗杜出液，遠心分離去除不溶性成分；醋酸 〜滅細每性蛋白質；SephadexG5〇 (或防體過減 亚如有而要吧相HPLC。至於鹽類則以Sephadex G25去 除。 檢卜glln<變體之不法可採用抗eglin抗證試驗或目 標蛋白酶抑制.後給.々i , i γ J式知，則者如由兔子獲得之多株抗體或由混 種瘤細胞獲得之單株抗體〔如由混種瘤細胞系299S18-20 C CNCM 1-361 )、(CNCM 工―362 )、或 賴㈣〇⑽MI—363)等分泌之單株抗到，後者如 人曰血球彈性蛋白酶卿幻或細胞自您酵素（Cat G)〔參 照 Seemiil ler et ai . π c , al 3 Hoppe-Seyler^s Z. physiol Chem. 358 : 11〇5 (i9771 . ς , Seemuller et al ; Methods in

Enzymoloyy 80 : 804 (198i〕〕〇

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合物不同於天hUn，㈣蛋白酶表現顯著的抑 2 ί有粒細胞彈性蛋白酶及組織蛋白酶G僅有 :二種特性尤其於Μ。喊、……為^作 為q、UAsp之分于^之化合物特別顯著 :阿普羅定寧C a P r。t i n i n )可用於治療陕腺炎、姨性外如 傷、及出血性休克。分子式…及χ如前述 甚Υ為Arg《Lys、以Asp之化合物，對礙血酶表 奢抑制作用，故可與抗凝血酶夏 ·.頁

Cantlthrombin I )配合 用〜6療血栓症、栓塞性血松症、 、血礙㈣。 冑4及外傷後休克 本發明亦與至少含—種本發明之化合物或其萘理學上可 又〈鹽類之㈣組成分有關，並含適當之傳 可接受之载髖及/或佐藥。 、于上 此等組成分特別使用分_ μ、+、4 #、 使用於上述各種症狀，而投萘通常㈣ 投無’如鉀脈内、皮内、皮下、肌内、或局部投蔡。 劑Hr亦與使用本發明之新顏化合物及含該化合物之蔡 症。。於預防及治療人證或動物有關，尤其前述各種病 蔡劑投萘量與投萘方式及治療或預防之目的而不同。每 二：量及投蔡計劃應根據各病患所有特珠症狀而定。至 :、'、i有關因子如血潘阳斗* - 者應遇知。 …子所需方法’則斜熟於本技藝 投单2制凝血酶Ieglin突變想而言’其有效治療之注射 '里為母公斤體重約0· 005至0·〖邮範圍，而以每公 —w — WENPING & C0. 522 :體重投萘約心至。，… 内、軋内、或皮下注射，隹并 遇口 投蔡以靜脈 齊1丨量之箏劑製口每：。因此’於朴口服投蔡用單-萘二每，約含。·…·… l 口物，旦因投单六弋 供λ < >[.-s ^ / 異。此等喿劑組成物除有效$ a 卜通常亦含緩衡液以維持 有… 辦液），及氣化納、甘露酵 t3.5至7 (如罐醆緩 其製品或㈣料透愿。 抗細菌性防腐㉟，如含。二為溶液狀態則最好含 基蜡或乙基醑。 κ 4 -羥基笨甲醆甲 局部用凝血酶抑制e g 1 i n六仿 f劑、料、油性溶液或懸；液體可為水溶液、乳狀 耳。水溶液狀製品可溶解本發=肪軟"、或乳化軟 可接取夕抽丄 <有效成分或其蔡理學上 祛又之鹽類於ph4至6i5之 于上 發炎劑，；衝液，亚如有需要再加抗 人Μ，及/或聚合性贼粘 及/或防腐劑。其有效成分、農户/W比略酮）、 轉約U至’最好約0每10ml倍液或每10g 萘用油狀製品可懸浮本發明之方、·25/ u mg。局部投 告之鹽類於油中而製得，並如—成々及其蔡理學上可接 心W /或㈣值c親水性：要：加膨脹劑C如硬脂 表雨活性劑c界面活化劑，如夕親性平衡）泜於10之 尸丨J ’如多辦、 硬脂醆廿油、單硬脂醆山梁醇、w 之眧肪駿單醋（單 山梁醇）。含脂肪軟膏製品可懸單月桂酸山梁醇、單油酸 鹽類於伸展性脂肪基料而成7浮本發明之有故成分及其 活化㈣速合。乳化油膏製品則稀釋Π值低於1〇之界面 禪本發明之有故成分及

WENPING & C0. 2115L2 、风類芡水溶液於軟性、伸 於丨0乏R石 展性《目肪基科，並加HLB值泜 炙界面活化劑而製成。所有 ' 可含砀腐η 4上述各局邵投無用製品岣 3 '万腐劑。有效成分波度則為每丨〇8基 %，最好 〇.25il.0mg。 ^·5 内：酶抑制egnn突變…蔡以静脈内注射或肺 使二it烏狀工具〕進行。因此其單劑量蔡劑製品依 蔡劑二=約1…^每劑量之本發明之化合物。此 維心Γ有故成分外亦含氣化納、甘露醇、山梁醇以 最好含二Γ品可為冷准乾燥狀或水溶液狀，而溶液 與前述者相：:卩制…π突變體之局部投萘用製品基本上 市内投蔡處理呼吸管道之吸入制口 能絢以溶液志、為噴霧劑或霧劑， 萘劑有效成I:浮液之滴狀分散蔡劑有效成分。此製品除 劑及/或安1a於溶液中外，尚含適當之推進劑及附加溶 需要利用適=】。推進劑瓦斯亦可用壓縮空氣代替，可依 合投蔡，有及釋t工具而製成。烏狀呼吸器特別適 耩患者呼吸導入：在液裝入級工具後以小壓力使其蒸發， 人爷入肺内。 ^彈〖生蛋白酶抑制eglin突變體 、個體情亇 TZ 、剜里而5 ，雖该年齡 血動物C人及Γ病症性質而…一般約7°公斤搜重之溫 mg，每曰J物〕’如以肺内投蔡時每次吸入約丨〇至30 〜2次，如以靜脈内投蔡時則約1〇至1〇〇() mg (21X29.7〕

WENPING 2115£2

。疫及血號之有故'、A猫_增廢-•γ· m s 測定p 免疫學方法（如紅心） ，其祀團為丨0至100哗01/1〕。 咦蛋白酶抑制egHn突變體之投举可用 下注射等方法進行。有效治療量二…、皮 有效成八边 〒里馮母公斤體重約1 — 20 mg 溶液。二Τ;Γ製品含有效成分濃度為約ο.1…g/mi US有效成分外亦含㈣霞衝液及氣化納 甘路醇、或山梁醇如同前述。 (F)農用蔡劑： 式1之新顏“Η11突變體亦可作為蛋白質分解酶抑 ::担制枝物病蟲害。由於許多植物天無含絲按酸蛋白 劑’吾人推測其提供有效保護以對抗植物病原性見 二;：^、及其他徽生物。再者，單子葉植物及雙子葉植 、八編碼異性蛋白酶抑制劑C如eglin B、eglin c 分子式I之egl in突變體）之職轉形。相對應之有效 $日抑㈣之表現，可提供轉形植物對抗植物病 原嵌生物之攻擊。 本技藝之已知方法均可應用於以適當含表現控制序列虚 編碼本發明之化合物之峨之表現载體轉形植㈣。如原 生質體或組織分料段與含適當载體之草原样狀細菌（ agr〇bacteria )共同培養隨後再生完整植物，或藉適當 修飾或未修飾病毒（烟草嵌纹病毒辦、甘藍嵌纹病毒

CaMV〕轉移戴f# „甘、丄 Η移氧也。其他不法如藉觸直接轉移分離之_ C早子葉植杨如木稻、玉米、大麥、小麥、族麥、高梁、

甘蔗等較適合）：雷穿；Jf .何里、.W 电穿孔，微垔汪射法將分離MA注入分 (21x29.7) WENPING & C〇. 2ii啦

'、生質體，肚胺、鄉場組織等等。 編碼本發明之化合物之— 體m . 種〈難分于適合轉形於植物 醯基、w * '丄< ^1ιη突變體其中R為已 W 為 Tyr 、 X 為 Thr 、 γ 為

分子。鈿唞® δ Z為Asp之DNA 相對應eglin突變體之丄 根部雙…曰酶抑制活性可利用玉米 古 A JJiabrotica v i rg i f er a .-Bl, ^ 均質别毛。egl in突變體之 Λ腹加入該昆蟲之腸組織結 實洌. ,心果顯奪抑制蛋白質分解活性 ，其編碼DNA 主傲生物，及 本發明特別與敍述於實洌之eglin突變體 ，含該DNA之表現質體，含該表現質體之寄 其製造方法等有關。 下述實洌説明本發明，但不據以限制本發明之範圍。 貫洌1 : eg 1 in C基因之M13複殖： 約〇·5洲之230 bp ECORl-BamH工坪段（含完整之egHn c基因）由ίο糾之質證pMLl47以EcoRI及BamHi限制內 核醆酶消化及1 · 5 %泜融點瓊脂糖電泳分離。該DNA片段 C 10 ng )與預先以 EcoRI 及 BamHl 消化之 Ml 3mp8 DNA ( 40 ng )後於T4 ΜΑ粘接酶（0.125單位）存在下，於含 10 mM MgC 1 2 ，丨〇 mM ATP，10 mM 二破蘇糖醇之 5〇 祕

Tr i S4C1 pH7.4 C 15供1 〕中反應〔Z〇ller et al.， Methods Enzymology 100 : 468 C1983)〕，所得溶液用 於轉形 E. co 1 i JMlOl ( Zoller et al·，同上），轉形 混合液塗抹於Kal C IPTG指示洋策）平板（Z〇 1 1 e r e t a 1.，同上），卽得W悃籃色野生型及650個無色噬菌斑。 (21X29.7) ——18 — WENPING & C0. 2115^2 f列2 : Ml3mp8單股ΜΑ之製造：取貫刿1所得嵌色噬菌斑接種於2 ml e_ c〇ii JMl 01培 養液 C L 培養液：Bacto—tryptone 1〇 g、Bact〇__yeastextract 5 g 、 NaCl 5 g 、 Glucose 5 g 、 Ampicillin 0 · 1 g/ 1 1 ;培養密度 〇D 6 2 3 =約 0. 5〕，於 37 ci 8 〇 revS/min狀態下培養4 — 5 hr ，隨後以Eppend〇rf遠心 管遠心分離5 min。上清液移至新遠心管，再度遠心分離 後加20 %聚乙二醇（2 0 0芦1 )及χ · 5 M NaC 1 ，於笙溫維 抟20 mi η後达心分離。去紊上清液，沈澱溶於咖卢丄之叨 mM TrisJICl pH 7.8、1 mM EDTA (以下簡稱 TE )，此 /昆合液於至皿與50卢1盼/1瓦混合〗5 111111後，以瓦口口611<1〇犷（ 遠心管遠心分離5 mi η。對伽上清液加1〇卢1醋酸鈉pH 6及3倍量絕對酒精（250卢1 )，於—2〇<1〇過夜後遠心 分難丨0 min，沈澱以80 %乙醇C i ml )洗滌後再遠心分 離，其沈澱於室溫於乾10 mi η後溶於50 pi TE，該溶液約 含 5 eg 之 Ml3mp8 單股 DNA。 貫例3 :製造編碼〔Ar g45〕一 eglin C之基因： (A)誘變泜聚核苷醆之激化： 下列核苷酸以化學合成方法製造，用以引變： 5 dCTCCTTGTTACTCGGGACC—3， 10 卢 1 ί氐聚核苷酸（1 OD/tnl = 500 ng〕於 20只1 0.07 Μ Tr i s-HC 1 pH 7 _ 6 ，0 . 0 1 M MgC 12 ，50mM 二硫蘇糖醇中 以〔_3 2P〕ATP及T4浆核苷醆激酶（Boehr inger)激化 〔參照 Molecular Cloning , A Laboratory Manual， (21X29.7) WENPING & CO. -!9 211522

Maniatis et al·，（Eds·)，ρρ·125〕，激化之泜聚核 苷醆溶於 10 //1 TE ( 50 ng/jul ) 〇 (B)eglinC基因之突變： eg i i n C基因之誘變依下列流程圖進行： 3'-GA GGA CAA TGA GAC CIG G-51 * (I) + 5'-CT CCT GTT ACT CGG GAC C-3_ (oligo primer) . * 5'-CT CCT GTT ACT CGG GAC C-3' 3'-GA GGA CAA TGA GAC CTG G-5' (11) mutation k2 Pro Val Thr Arg Asp b'-CT CCT GTT ACT CGG GAC C-31 3'-GA GGA CAA TGA GCC CTG G-5， （III) 1只g M13mp8單股DNA與50 ng激化泜聚核苷醆引發物， 於 Η) #1 50 mM Tris-BCl pH 7· 8，100 mM MgCl2 中，於 45 Ό 反應30 mi n後於宣温反應5 rni n以完成對合，龙加下列各 試桌於該混合物： 10 mM dATP，dGTP，dCTP，dTTP 各 i ul， T4 DNA粘接酶i #1 ， 50 mM二硫蘇糖醇2 #1 ， 10 mM ATP 1 μ\ , 5 mg/ml 明修 i #1 ， 10倍濃度Klenow緩衡液i芦1 ( (KM MpH 7 6 3 50 mM MgC 1 2 ，50 mM 二硫蘇糖醇） DNA象合酶enow片段）1 〇 混合液於π反應5min後於反應iehr ，再於i%瓊

(21X29.7〕 ~ 20 —— WENPING & CO. 脂糖電泳分離。所得環狀雙股MA以Et Br (二溴啡啶） 顯色後由凝疹以電溶離分離（約10 ng W”i TE中卜 所得DNA 5卢1 C約等於3· 5 ng )轉形於E. col i JM101 後，依货列1塗抹於χ—^1/ΙρΤ(1指示平板，可得約伽個 無色嗔菌垃。 取此噬困斑40個用於接種2 ml Ε. C01 i JM101培養液 C同a列2 )。經培養後（同實问2 )由上清液遠心分難 E· C〇11細胞（上清液含噬菌體及單股DNA，細胞沈澱已 含相對應突變雙股DNA )。 上述40個哈菌體上清液昍卢丨經硝化纖維膜過濾，洗滌 C 2 X TE )，保抟於8〇 Ό，真空狀態2匕後依 S〇Uthern 氏方法〔Μ〇1· Biol· 98: 503 (1975)〕用 泜聚核苷醆引發物為故射性探針（雜交）測定突變皿八序 列之存在（見流程圖]|〕。其結果有丨2批噬菌體上清液含 〔Arg 45〕eg 1 1 n c基因，取其4批上清液經稀釋◊約1 :105 )，與E. c〇n jMl01混合後望抹於指示洋采平板 上。由所得噬菌斑各分離3個噬菌蹬，依前述方法由此分 離單股DNA，此丨2個單股DNA依Sanger氏方法〔Science 214 ： 1205 (1981) ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 .5463 Cl977)〕進行序列分析，所有丨2個單股均具 所需突變egl in C序列。 各突變雙股DNA (〔 Arg 45〕eglinC基因，在質髖 1 3mp8中）則由各相對應ε· co 1 i細胞沈滅製得。 含突變基因之EcoE^qamHI插入序段，用限制内核醆酶 WENPING & C0. —21 — 2115^2 内载髖切下、分離，再復殖於载體pHRi 148/Ec。RI/Bam HI (歐洲專利申請書笫Μ”85號）。由此所得質體pJB618 分離ϋ轉形於c上_1」HBio i 。被質體pJB6l8轉形菌系定 名 E. coli HBi〇l/pJB6 18。 賁间4 :製造编碼〔Pr ο 4 4〕— eg丨i n c之基因： 依實列3所敍述方法同樣進行〔Thr 44〕—〔 ρΓ〇 44〕 突變。誘變低聚核苷醆之結構如下： 5 ;-CT CCT GTT CCT CTG GAC—3 7 eg 1 i n C基因之誘變依下列流程圖進行： 3'-GA GGA CAA TGA GAC CTG-5' + 5^01 CCT GTT CCT CTG GAC-3' ⑴ (oligo primer) * 5'-CT CCT GTT CCT CTG GAC-3' 3'-GA GGA CAA TGA GAC CTG-5' (⑴ mutation ** 2 ProValProLeuAsp 5f-CT CCT GTT CCT CTG GAC-31 3'-GA GGA CAA GGA GAC CTG-5' (III) 突變混合液經處理後可得18個有故〔pr〇 44〕__ egl in c 突變基因。 將〔Pro 44〕一 eglic C MA 複殖於载體 pHRi i48/

Eco RI / Bam HI ’依實洌3所敍述相同方法可得質渡 pJB 591 ，以该質體轉形之coli HRini々々* ” --< 名為 E. col i HBl〇l/pJB591 〇 實洌 5 :製造编碼〔Arg 45，Ser46〕— _ . w -1 eglicC 之基 因： 依實例3所敍述方法同樣進行〔Leu 45 ，Asp 46〕— 22 (21x29.7〕 wenping & C0. 2115^^ 〔Ar g 45，S e r 46〕突變。誘變低聚核苷酸之結構如下： 5 ^TA ACG CAG AGA ACG AGT AAC AGG—3， eg 1 in C基因之誘變依下列流程圖進行： 3'-CAT TGC GTC CAG GTC TCA TTG TCC-5' ickic SWc· ( I ) + 5'-GTA ACG CAG AGA ACG AGT AAC AGG-3' (oligo primer) ***** 5'-GTA ACG CAG AGA ACG AGT AAC XGG-3' 3'-CAT TGC GTC CAG GTC TCA TTG TCC-5' (II) mutation 5’-GTA ACG CAG AGA ACG AGT MC AGG-3' 3’-CAT TGC GTC TCT TGC TCA TTG TCC-5' (III) Leu7Scr Arg Thr Val**3 突變混合液經處理後可得12個有效〔八^45，36『46〕一 eg 1 i n C突變基因。 將〔Arg 45，Ser 46〕一 eglin C DNA 複殖於载 If pHRi 1 48/EcoRI/BamHl ，依洌3所敍述相同方法可得質體 pMLl47/b，以該質體轉形之E. col i HB 10 1定名為E· cο 1 i HB 1 01/pMLl47/b 〇 f列6 :轉形E. co 1 i菌系之培養： 轉形之E. coli HB 1 〇 1於5 ml L培養液（麥照實例2 ) 中於37<€，250 ^乂5/11^11培養過夜，取其11111移至25〇11 M9培養液C其每公升所含成分如下）·· (21x29.7) 一 23 — WENPING & C0. 13.25 δ 3 0 g 0 5 g 1 0 g 0 015 g 0 25 g 2 5 ε 0 0099 g 5 0 ε 0 1 g 經 8 — 10 hr 時其 eg 1 in

NazHPOt* ·7Η2〇 KH2P〇u NaCl NIUCl

CaCl2·2ΗΖ0 HgSCH ·7Η20 casamino acids vitamin Bi glucose ampicillin 培養於37Ό，250 revs/min進行 C突變體濃度卽達最高〔依Seemuller ^ al

Hoppe-Seyler^s Z. Physiol. Chem. 358 ： 1105 C1977) 之方法測定人白血球彈性蛋白酶〕。 货洌7 : eg 1 i η突變體之分離與纯化： 培養之Ε1 i細胞使用Dyn〇mi 1丨以機械方法破瓌，細 胞殘渣用Sorral遠心分離機於9〇〇〇 rpm，3〇 min遠心分 離。 由於eglic突變體在酸性表現高度安定性，故上清液中 大部份之外來蛋白質可用約2〇 %醋醆沈澱去除，卽於w mi n 時間内對IDO ml上清液滴加丨〇 之4〇 %醋酸水溶液。此酸 性溶液（pH 3.4 )於冰冷狀態下攬拌1 hr ，沈澱之外來 蛋白質及其他細胞成份以sorval遠心分離析遠心分離（ 9000 rpm，30min )。其上清液用 Virtis Freezemobile 冷凍乾燥過夜。 上得黃色冷象乾燥扮束溶解於丨〇 mM Tr i s_flC i pH 7 . 8 C 10 ml ) ’並遠心分離使溶液澄清（3orval SS34 : ΙδΟΟΟ rpm，10 min )。此透明黃色上清液加入於平衡之 (21X29.7) WENPING & C0. 24 - 2115^2

Sephadex G—50 超細營柱（phamac i a，$ 2 5 ⑽ χ 伽 cm )，以 10 mM Tr ! s_HCl pH 7· 8 ，最大流速 2〇 ml/hr 進行溶 離，溶離液之吸光度於28〇 nm測定，以丨〇ml為一分劃收 集，由溶離曲線圖式顯示於第31至第40分劃為高輋，卽可 犯含所而eglin突變體。其中之egHn突變體纯度以SDS 修髖電氺及HPLC磾定’經膠體過濾後之純度為約99 %。 由eg 1 1 n突變體分劃去除緩衝液以AMICON濃縮器進行 C用YM-2濾膜，MWCO 2000 ),經超過濾後樣品再冷凍 乾燥，卽得無色扮末，貯存於一 20 Ό，其度量為每 Dynomi 1 1破瓌液約得250 mg。 實洌8 : eg 1 i n突變體之理化特性： (A)C Pro 44] — eglinC ： 依實例7所敍述方法純化之〔Pr〇 44〕— egHn c以 FAB-MS方法進行分子量測定，其分子離子条值（M — H+ ) 為8 130.6 ，由此可知其為N — I酿基—〔pr〇 44〕_ eglin C (Μ — H+ 理論值= 8130.07 )。 eg lin突變體用8夷蛋白酶降解得7個片段，其中僅有第 4 If段C含Thr 44 — Pro 44突變）與N« —乙酿基“丨^ c C參照歐洲專利申請書第146,785號）之對應片段不同， 故本eglin突變體：定名為Να —乙酿基—〔pr〇似〕—egUn C。其在PAGE _ SDS攀經電泳中之反應如同Να —乙酿基 eglin C 〔 Laemmli ， Nature 227 : 680 (1970)〕。 ⑻〔Arg 45〕一 eglin C : 純化之〔Arg 45〕一 egl in C經分于量測定後其〔μ (21x29.7) —25 — WENPING & C0. H++〕值為8175·4，因此可知舍N-乙酿基化合物c M — H+理論值：8175 )由姨蛋白酶降解獲知此化合物為 乙醯基一〔Arg 45〕一 egUn c 。 於PAG請S攀體電泳中酽―。越基_〔 — π〕—心 C之反應與浐一G醯基egUn c相同。 (0〔 Arg 45，Ser 46〕-eglill C : 純化之〔Arg 45，Ser Ί , . n /r v er 46〕—eglln c經分子量測定後其 (Μ — H+ )值為8148。7 9士入μ 珣此了知亦含Ν — ι醖基化合 物 CM — Η+ 理論值 814Q 1 λ . D± 1 9·1 )，由咦蛋白酶降解獲知此化 合物為1T — I鰱基—〔Αι·σ狀 〇 、 L Arg 45，Ser 46〕一 egiic C。 於PAGE~SDS疹體電泳中N« __ 不 T W 乙醯基〔Arg 45 3 Ser 46〕 -eg“n c之反應亦與Ν«—ι酿基egHn c相同。 實例9 : egl in突變體之激化特性： 抑制常數Ki之測定依Braun et ai.〔 Bi〇i.

Hoppeleyler 368 : 299 U987 )〕之方法進行，係測定 由蛋白酶—抑制劑基質混合物中釋敌p —辟基笨按之靜態 反應速率’而α改變抑制劑濃度。由於_〇5對時間；直 線關係’故P-辟基笨險之釋放以1〇至2〇分間隔進行。而 Ki可由各種斜率決定。所使用W白酶為人白卑球彈性 蛋白酶CHLE) ’陕乳蛋白酶，及睫蛋白酶。抑制常數之實 例如下表所列： 表一、抑制常數Ki㈣ (21X29.7) 26 — 26 WENPING & C0. a. HLE: a. HLE: £glin C 7·5 x 10-11

Ki (M) 4<A x 10-10 b睫乳蛋白酶 Ki (Μ) 10-9 C·嗅蛋白轉

Ki (Η) μ χ 無抑制 1·3χ1〇-1〇 由上結果獲知egl in C突變體由Leu 45取代心 ，此突變體與天無eg丨i n C比較時為極强 8 45而成 制劑’但對HLE則為弱抑制劑。 '· 5蛋白酶和 實洌10 : 〔 Arg 45〕一 egiin C及N« —乙醯芙〜 土 ~~ L Arg 45 ' 〜eg linC在酵母菌中之表現： ' 在酵母菌中外來基因之表現系統須要— c -, 大之酵母菌走 ^好為-可誘導性起動區），及—銜接之 鎵终止信號，而此兩者枝唯一之限制部位分開以困 來基因。-表現载體亦含酵母茵DNA序入外 内自：複製I導致高質…數。此等序列最好為酵母： =列。载渡亦具—酵母菌選揮性標記，如酵母菌咖 =因，其複製起點之_322職序列，及於& 汉大用之柷瓦年西林基因等均較適合。 ，上述適合之表現系統見歐料射請書第刚，Μ 並已證實於酵母菌中極為有效 ^ 締酿Η、* 1夕卜來基因於酵母菌醆性磷 酸私之誘導性卿5起動區控制下表現。咖5起動區 來基因，及脑轉鎵終止信號以街接狀態插入於質證夕 PJDB207。該質禮含酵母菌“序列，酵母菌而2基因 (21x29.7) WENPING & C0. ，Ε. co 1 i複製起點，及抗氣苄西林基因。 表現質體PJDB207R/PH05 —〔 Arg 45〕EGL以下述方法構 秦： ㈧分離PJDB207载體净段： 6 /ig之質體pJDB207R/IF〇 — 3 )C見歐洲專利申請書 100,561號）以內核酸限制酶BamHl消化完成，所得6 85 kb及1. 15 kb DNA片段以c醇沈澱後再懸浮於400只i叨 mM Tris-4IC1 pH 8·0。加4·5單位小牛腸鹼性磷酸酶（ Boehringer，Mannheim〕後混合液於 37 c 反應 i hr_。 隨後於65 X：反應1 · 5 h r蚌活化磷酸酶，此溶液調整於i 5〇 mM NaCl。將此DNA溶液故置於以1〇 mM Tr丨s_jjCl pH 7. 5 C 含 150 mM NaCl，1 mM EDTA )平衡之 DE 52 (Whatman) 陰離子交換管柱C床量K)〇存1 )。經以相同緩衝液洗滌後 ，：DNA 以 400 和1 10 mM Tris_^Cl pH 7. 5，1.5 M NaCl ，1 mM EDTA溶離並乙醇沈澱。6· 85 kb Β·Η工大片段於 0.6 %紙融點烫脂糖繆體電泳〔緩衝液EDTa pH 8. 3 )中與小坪段分離。 ⑻分雜5 34 bp PH05起動區片段. 10 //g之質證P31/R C見歐洲專利申請書第1〇〇561號） 以内核醆限制酶EcoRI及BamHl消化，所得3個片段於 〇.6 %低融點道脂糖修證中電泳分離（缓衡液Tr —EDTA pH 8·3 ：) ° 分得 534 bp BamHl_Ec〇RI 沣段，該净 段含PH05起動區並包括mRNA起始部位。 (C)分離含〔Arg 45〕egl in c编碼序列之23〇 bp DNA坪段：

WENPING & CO. 2115^2 8卢g之質體pJB618以BamHl及EcoRI消化，所得2個 厗段於0.6 %低融點瓊脂糖繆體中電泳分離c緩衝液

Tris—borate—EDTA pH 8.3 )，卽分得 23〇 bp 片段。 (D) 粘接DNA 段： 上述3個DNA片段C A — C )具逍當粘頭，於一次反應 中枯接。卽取0. 1 pmole 10.45只g )之6.85 kb BamH工载 a互 V 段，〇 . 2 pmo 1 e C 70 ng )之 534 bp BamHI —EcoRI PH〇5 起勤區沣段，及 0 - 2 pm〇l e (29 ng)之 23〇 bp

EcoRI-BamHl PJB6 18片段予以粘接。上述所有3個MA 片段均含於泯融點瓊眧糖之小繆體塊中，取此三塊壤脂糖 修體於65 X：融化並稀釋2次。粘接於15 ，全量為2 7 〇 #丄 之 60 mM T r i sHC 1 pH 7.5 > 10 mM MgC 1 2 , 10 rnM DTT 1 mM ATP，16 單位 T4 DNA 粘接酶（B-〇ehringer，

Mannheim )中進行16小時。取i〇卢丨粘接混合液加入於伽 //1鈣處理並適合轉形之E. coli HB 1 〇 1細胞中。 24個轉％旦ampR菌落在含伽服/mi氩；西林之Lb培養 液中培養。質證 DNA 依 H〇lmes et al〔 Anal. Bi〇chem. 114 : 193 C1981)〕之方法製造並以Hind]|/Ec〇RI雙重 消化分析。600 bp EcoRI—Hindi!坪段之存在卽表示該菌 系具PH05起動區一〔Arg 45〕egl in C DNA片段，且以

正確取向插入於表現载體。如同預期，約有骀％菌系具正 確取向之插入。取其中一菌系定名pJDB2〇7R/pH〇5_^Arg奶 )EGL (E) Sacharomyces cerevisiae GRF18 之轉形： (21X29.7) WENPING & CO. 29 — 利用 Hinnen et al 〔 Pr〇c· Natl· Acad. Sci. USA75 :1929 C1978)〕所敍轉形方法將質體PJDB207R/PH05〔 Arg 45〕孤4 導入 S a c c h a r 〇my ces cerevisiae GRF1 8 困系 (a , his 3 — 11，his 3 15，Leu 2 — 3 } leu 2 ~~~ 112，camR )。轉形之酵母K細胞於缺亮氣酸CLeu )之酵 母菌最少營養培養基平板上選取。分得單一菌落定名 Sac cha r omy ce s c er ev i s i ae GRF 18/pJDB 207R/PH05 —.〔 Arg 45〕EGL ° (F) Saccharomyes cereviciae GRP 1 8/pJDB2 07R/PHO5 —〔 Arg 45〕EGL 之瞪酵及〔Arg 45〕一 egl in C 與 乙醮基 —〔Arg 45〕egl in C 之 13 收：

Saccharomyces cerevisiae GRP18/pJDB2〇7R/PH〇5—〔 Arg 45〕一EGL 於 30 Ό，含 0· 03 g/1 ΚΗ2Ρ04 之 3 1 最少營 養液以小型璇酵槽培養，細胞密度達0D6。。： 1. 9時卽田 收。 〔Arg 45〕一 egl in C 及 Να 己酺基〔Arg 45〕—egl in C以約2 : 1 C w/w )之比表現。此兩種產品均可由酵母 菌細胞萃取液依實例7所敍述方法分離之。 實洌11 :蔡劑製品 含N i驢基〔Arg 45〕~~ eglin C及依實例7..所得產品 之溶液斜〇. 9 % NaC 1溶液遠析，隨後其溶液濃度以〇. 9 % NaC 1 /合液稀釋為1 mg/mi或1〇 。此溶液以超過濃法 消毒C濾膜孔徑〇· 2 2 pm )。 此溶液可直接應用於靜脈注射投梁及長時間之點滴。 (21X29.7) —30 ~ WENPING & CO. 菌種保存： Ε· coli HB101/PML147菌系於1988年1月28日寄存於 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM)， Mascheroder Weg lb，D—3300 Braunschweig，其編號為 DSM 4380 。 (21X29.7〕 WENPING & CO. —31 —

Claims (1)

1. A7 i:; B7 C7 D7 六、申請專利範園 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 第78101663號「改良的蛋白質」專利案（82年7月修正） 1. 一種如下列分子式I之化合物： CH3CO ThrGluPheGlySerGluLeuLysSerPheProGluValValGlyLysThrVal AspGlnAlaArgGluTyrPheThrLeuHisTyrProGlnTyrAspVal^yrPheLeu ProGluGlySerProValThrArgAsp LeuArgTyrAsnArgValArgValPheTyrAsn ProGlyThrAsnValValAsnHisValProHisValdly-OH .外丨 及其鹽類。 \. \务~ 2. 依申請專利範圍第1項之式I化合物，乙蘼基- ' 、.> : |.、f . [Arg 45]-eglU C及其藥學上可接受之鹽 3. —種含申請専利範圍第1項之式I化合物或其藥學上可 接受之鹽類之轚藥組成物，其係使用在預防或治療需要 使用胰蛋白S6抑制劑之疾病。 4 一種含申請專利範圍第1項之式I化合物或其藥學上可 接受之鹽類之醫蕖組成物，其偽使用在治療胰炎-創傷 性胰原或出血性休克。 5. —種製備如申謓專利範圍第1項之式I化合物及其鹽類 之方法，包括供養表現載體编碼分子式I之化合物之 DNA轉形大腸桿菌或啤酒釀母菌細胞，其DNA偽由大腸 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 子 分 it 難 分 此 由 並 制 控 列 序 制 控 〇 現類 表鹽 ® 其 母及 釀物 酒合 啤化 或之 菌 I 桿式 之 物 合 化 之 I 式 子 分 之 項 Ί* β 0 圍 範 利 專 請 申 如 碼 编 種 1 6· 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4現格（210 X 297公釐）