TW205070B - - Google Patents

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TW205070B TW076103196A TW76103196A TW205070B TW 205070 B TW205070 B TW 205070B TW 076103196 A TW076103196 A TW 076103196A TW 76103196 A TW76103196 A TW 76103196A TW 205070 B TW205070 B TW 205070B
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human lysozyme
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    • Y10S435/942—Saccharomyces cerevisiae

Description

是以iS -配糖酶（glucoeidaee )活性使細菌細多醣水解 •在難蛋白中含有相當多的溶菌酶，由此抽提具高純度之溶 菌醜比較容黑》溶菌酶因而加在乳酪、香腸及海產製品做爲 防腐用，或k爲將牛奶轉變爲人類母奶用〔Katenya Hayaehi andTaiji Imoto, ^Lysozyme* » Nankodo, Japan C1974) · 再者*若傲爲治嫌藥劑，溶蔺酶可僦爲止血，抗發炎，組織 再生，抗繊觸等〔參看* Saifcin - no-Shinyaku 〃（日本新藥 品）34卷，107，業事日報（Yakuji Nippo )，東京》日本， 1983〕，同時也有以抗鷇炎酵素劑販資畚。 當以得自_蛋白的溶菌酶做爲醫藥用時》常導斌Μ疹、 泛紅等遒敏症狀·道些現象一般認撝係由外來蛋白質的免疫 反應引起的副作用•爲了克魬上述缺點，本發明人乃著手硏 究以建立一種大量颯造人類溶國鶸的方法° 人纊溶菌鷗的胺基酸序列已知由130個胺基酸構成〔 生化歡據香 * Biochemical Data Book * 上· 189C1979) » 日 本生物化學會編印〕•根據此胺基酸序列*指令合成人類溶 醸罐的一段DNA片段已用化學法舍成〔I kelwra，M·等》化 學藥學 _告（Chem· Pharm· Bull· )ϋ» 2202(1986)〕· 用重組DNA技術，以製造人類溶菌_，祕urafci等人曾嗜 試欲將其在大臊醏中表現*但無法以此種表親系統得到有活 性的人頻溶菌_〔 M•等人’農業生物化學（Agric.
Biol. Chem.) JO , 713(1986) D ° 以酵母分秘得到有活性的人類溶菌酶已被發現〔J Wami 等人，日本農業化學會摘要（Summary of Japane8e細1*101111111·*11 CheciigtryAseocUtion 1986,第 343 頁（1986) ·唯此產量甚 ~3 — «0·07· 低*僅爲600冲/^ *根據Jigami等人的報吿》將指令合成 一偁號胜肽（peptide »具有細胞外分秘所需之蛋白 質訊息者）的一互補DN A片段*與指令合成人類溶菌鷂而得 以表現人觖溶菌醻的另一 DNA片段互相組合使用•做爲指令 合成偁號胜肽用之互褊DNA片段》係用指令合成蛋白溶菌_ 之信號胜肽的一段互補DN A (自然型）〔此儀號胜肽序列與 鲅表在美酗_家科學院學報Pro· Natl. Acad. Sc i. USA!?, 57§0〜5763 (1980)者顏爲類似〕*但是，如此組合》由 酵母诚胞經細胞外分泌之溶類_*正如前述僅得到極少的童。 〔鉍明之概述〕 本滅明人為了使用重組UNA技術*以大釐鑠造具有活性 的人類溶繭_，面進行糌深的硏究•結果完成了本發明。 錐然人類溶躕酶基因目前尙未鞭選殖（cloned ) *但其 胺基酸序列已教決定。因此，Ikehara等人乃依_此胺基酸 序列·而以化學方法合成指令人類溶蔺鯓的一段DNA〔 Ikehmra· M·等人（爹照前文）〕· 所以*由道種經化學法合成的DNA，用1[組DNA技術， 以大最製造人類溶菌_是可行的。 當一段指令合成信號胜肽的DNA片段，欲與另一段指令 舍成人類溶菌鳙的DNA片段組食時》道段由DNA片段所指令 合成的信號胜肽具有如下所示的化學式： M—R— S — F — L— L — L — A— i* — C — F—L — P — L—A—A — L — G 至於在酵母中的表現•指令合成僑號胜呔的DN A片段已 可選擇使用酵母中霞蓋叛苹高的密碼加以製造❶用此種DNA 片段*已逐漸接近完成所想要的目的一部大量得到人類溶 MM?· 菌醸。而所用的密碼則發表於生物化學期刊The Journal of Biol呢！leal Chemistry 257· 3026 〜3031(1982) ·酵毋中較 隹密碼之資例，以RNA的密碼列舉如下》 胺基酸 密 碼 胺基酸 密碼 胺基酸 密 媽 Ala GCU.GCC His CAC Tyr UAC Se r UCU,UCC Glu GAA Cy 8 UGU Thr ACU,ACC Gly GGU Asn AAC Val GUU,GUC Gin CAA Pro CCA lie AUU, AUC Ly s AAG Met AUG 參 Aep GAC Leu UUG Trp UGG Phe UUC 圖示的簡述： Arg AGA ti 麵1鐽收集並接舍寡孩苷酸（oligonucleot ides )以合成 人_溶菌-之方法示意_ *
幽2爲人類溶__基因經TaqI - Xliol紉取所得之DNA 序列； 圖3撝循號胜肽的DNA序列； tt!4爲構樂人類_菌_分泌質髏的_解。 〔較隹貿例的敍述〕 依據Ikehara等人的方法製取合成基因，由下列各點選取 DNA系列： i)酵母中所使用最合遍的密碼*係以適合作合成基因之 表現者撝考慮 ΜΜ9· U)所使用鍾截酶C Mfttrletioft euyo嫌）C此傷甩Xba I )的特定鼸饋霱位》保歡爵钃酿之權鑼（議成打）》或在 __資玀韉職（▼«SUMT )之後镳助基因之重鑪· iil)避兔傻用吞鴯身1：雄》戚崔躍艟金藝或其中之一股 敏此系判_瓦械（暴難錄當祖舍）曲系列· 入頫癯蘭酶基因如J:贩雄¥以化畢法舍成· 鷀舍成麄因麻入親當齙戴_以再次禪藏C 丨MlUg ) 謝鋤以親化最有瓤裏的《鼸籲麴基因可Μ狭入任傷麟饞中* «大腸綣酶（gMditrichU e«U )穩獷pACYC177，大鱗鑤菌 嫌之交艚麟鑛（·&«Η^ν·βΐ:οι> ) »P勒以7» PIQUI⑽6及 pGLD»9e-l C 3本專ϋ公_公_嫩秘，49分》1 )及檎摹襻薦 (BuciUm »i〇itUi·)麟讎 pTEX 2WL C Υβ·1»Ι幽，》#Κ· ·人 ，雇用徵生鲰生_技術（Appl· Mier岫i*l · BieUelwel·) ;2S(K1»86)湖在特定實_中被引用· «[截癱主生_a專裱食睿鱷舍成龜因之鵰驁所轉形•轉 形停用_方法3相當镛鼇*俚當以大攤難籀儀爲楢主生物時 t則依CA«·等人_方法遵行轉鬃《C«fcwi· S· N.等人•美_ 家轉學鷗學# ·璽· naouwr2) > *當以籌毋歉篇檐主生 馨時》搛用Hinntn等人曲方法C Hien··, A#人丨美爵國家 轉學職》» · 1抑7Cier#) 3 »而當使用枯草榉蔺做爲宿 主生物時*刻分别用原生質儀法（〔 S· ACek«i »· N. G«麄· Ge«*t·· 1ϋ» ul(197*)〕 或扉任濂 C _ΙΜΛ ) C INlkaw* 仄聚麟《1ιΝΜ1· R· 0··分子生物學期驟（J·他1· BUU)至· 20Κ1»71)〕· 至於宿主生_ •倒如*大騰禅酶（ I c•瀑蓋)294 »大臃棒 —4 — ttt070 菌W 3110 *大腸樨菌C600 ,釀酒酵母菌（Saccharomyees ccrevisiac ) AH22R_，祜草榉菌（色· siibtilie ) 1A3L，祜 草禅菌1A3 39 ·枯草桿菌1A340，均可使用。 其次•爲袠現此基因·對含有入基因之質體DNA，首 先由轉形細胞（tra⑽formant )依纊抽取法分醮之〔Birnboiir • Η· C ·.及 Doly· J.:核酸硏究 Ntic leic Acids Ree.，_2，1513 C1979)〕·將所得質體DNA以適當的鑑識酶處埋，可將眹 入的基因切除*然後以瓊脂膠體戴泳法或聚丙烯醣胺膠體電 泳法分_得之•所有道些手績均已洞悉》且其詳情均已在文 獻中述及〔如可參考*分子選殖♦ ( Molecular Cloni播：）一 書（1982)，冷果港資驗室（Cold Spring Harbor Laboratory ) 出版〕*經分離之基因再於一適合的表現載饞中，在正確方 向之啓動子（promoter )及信號胜肽之指令合成區的下游方 向攮合之》以構築一表現質讎。 镢爲捆令合成儀號胜肽之合適DNA者，可述及依據酵母 使用之密碼*而以化學法合成的DNA者· ϋ然醜母中竈組頻 率嫒高之密碼適合戚爲化學法合成DN Α的密碼•而較低重組 頻率的密碼則可用來製備鑑誠酶的確認部位•此DNA可以化 學方法含成，例如，用Crea等人的方法〔Crea, R.等人，美 國國家科學院學報互，5765(1978)〕* 一 DNA片段，其中指令舍成信號胜肽的一 DNA部分，係 與指令合成人類溶菌酶的一 DNA部分的5'-端結合*如前面 所述》可將指令合成信號胜呔的一 DNA片段，與指令合成人 類溶菌酶的另一 DNA片段的5'-端結合而製得之。 此DNA片段亦可依下列方法製取：⑻將指令合成僑號胜 •Μ·?· 狀及人類溶菌醻之Ν 端部分的一DNA片段，取之與指令 合成缺少其Ν孀部分之人類溶菌酶的另一 DNA片段互相結合 之*⑼將指令合成缺少其C孀部分之信號胜肽的一 DNA片段 *取之與指令合成僂號胜肽的C端部分及人類溶菌酶的另一 DNA片段互相結舍之》或⑹將指令合成缺少其C竭部分之僑 號胜肽的一 DNA片段，指令合成僑號胜肽之C端部分及人類 溶藺齷之Ν端部分的另一 DNA片段，及指令合成缺少其Ν端 部分之人類溶蔺_的再一 DNA片段•三者互相結合之》 在本項技術上坷使用的表現載饞已知者甚多•只要能用 以表現此基因者，任何一種均可使用*可當私j證之合適表現 載體爲 PPH017，pQLD 906，pGLD 906 — 1 C 如前）， pCDX〔 Okayama，H·及 Berg· P·,分子細胞生物（Mol · Cell. Biol·)立，280C1983)及 pKSV _ 10 ( Pharmacia Inc.公司製遒）。 至於啓動子》若以臃母做宿主，則可用例如PH05啓動子 ，GLD啓動子，PGK啓廳子，ADH啓_子，PH081啓勦子》 如以動物細胞爲宿主》則可使用例如SV 40早期基因啓動子》 金觸基組胺酸三甲內鹽C metalloUiionein )啓動子及熱体 克啓幽子》 使用强化劑C enhancer )亦對表現作用有效果〇 至於用以表現的宿主*可使用酵母如釀酒酵母蔺、鼠L 細胞及中國腮鼠卵母細胞•而其他眞核細胞亦可使用。 對酵母進行轉形的方法已在前面述及β至於眞核細胞如 :勒物細胞的轉形方法，則述於例如♦蛋白質、核酸與酵素显》 (1983)，重組DNA之導入細胞及其表現*( Proteins , ~8 _ 鵞 #Β#7·
Nucleic Acids and Eazymes, Introduction of Reccmibinant 撕八 Into Celle and Eaqpreeeion Thereof ) » 共立出版社（Kyoritgu Sbuppan )出版。 使用所得之分秘質體》將宿主細胞予以轉形*因而得到 所要的轉形細胞•再將此轉形細胞依已知方式培養之· 傲爲酵母的培養基可爲，例如，巴克厚德氏C Burkholde* )最低培養基〔Boetian, K.L.等人·美國國家科學院學報！， 4505(1 抑0)，美國植物學期刊 Aroer. J.Bot.里，206(1943)〕 或其改良之培養基•培養條件，一般在溫度15〜40Ό C最好 在24〜37 1C )下培養W〜％小時（最好是24〜72小時）》如 有需要可同時加以通氣及（或）振盪· 當以眞核細胞如勤物細胞爲宿主而得到的轉形細胞進行 培養時》Eagle 氏 MEM〔 H. EagU,科學（Science ) 130. 432(1959)〕》改良的 Eagle 氏 Dulbecoolb 方〔Orgad Larb 及William J. Kitter, J.生物化举期刊，258, 6043(1983)： 等》均可敏爲培養基·培養條件一般在龙〜c敢好撝怒 〜下培養約1〜丨0天〇 在培養完成後*細胞及上淸液以已知方法分_之°爲收 集留在細胞內的人類溶菌酶*將細胞以傳統方法破壞，如以 趙誉波法或F reach鰌榨法破壤》機械性破壊法如粉碎》及以 分解酵素破壞❶進一步如有要*所得之人類溶蔺_亦可用 表面活性劑如Triton - X 100及去氧膽酸鹽C deoxyciiolate ) 抽提之•存在於上淸液或抽提物中的人頻溶®釀*經用傳統 的蛋白質純化法如鹽析，等電點沉澱，膠質過璩，離子交換 層析及高效液相層析（HPLC、FPLC等）方法進行純化丽得 裝 訂 線 之· 人類瀋蔺_具有轚藥活性，例如抗發炎、止血、組嫌再 生及抗腫痼，因而可僦爲眼藥水的消炎_素劑或馬食品的防 腐劑•當做爲榘_上的用途時》人類溶菌贿並不會有如使用 麯蛋白溶躕醸由於免疫反朧而引起的副作用。然而*迄今人 類溶麵鷗僅能得到少黴* 本濮明使供給大量之人類溶蔺酸倣爲如前所述之菜劑上 的使用成爲可能·本鷇明中傲爲分泌生産人類溶菌醵所使用 的侰號胜肽比鑲蛋白溶菌醜的價號胜肽優良· 賁例 本發明將在下面以_考例及實例倣更詳細的說明。然而 »並不以通麄實例限镧本發明的範圍。 在實例3所揭示的釀酒酵母轉形細胞AH22R_/pGFL 735 »以IFO-10227編號存放在IFO (日本大阪醱_硏究所） ，而從1卵7年2月5日起以FERM Ρ-9173編號存放在FKI C日本通商產業省工業技術院微生物工業技術硏究所）。又 此編號已根據布達佩斯（Budapest )條約續編爲FERM BP-1346 ， 存放在 FRI · 參考例1 選殖用戰體PBR322X的_築： 將5柯大腸蔺載髏pBR322與1.5單位鑑誠酶Bail，於 40芦1反應緩衝液〔W mM Tris -鹽酸（pH 7.5)，10 ιϊΜ氣化 鎂，lmM二確蘇糖_〕中，於37t：下反應5小時後，反應液 以酚抽取，再依傳統方法加乙醇沉澱出DNA »加50 ng磷化 Xho I接頭子C 1 inker ) d〔 pCCTCGAGG〕（新英格_生物實 一 10—— *〇8〇**® 驗所》New Eng丨and Bi 〇丨abs )於此DNA中*再依傅統方法 以T4 DNA接合_ ( 1 igase )將彼此接合之•用道種反應溶 液對大腸菌DH1加以轉形，由所得到對安比西林（ampicillin )及四瓚徽素（tetracycl ine)具抗性之菌落群，以鹼抽取法 (前已述及）製得以Xhol取代Ball部位的質饞PBR322X · 參考例2 在N端附近具Taq I部位之人類溶菌麵基因片段的製備： 在I kehar a等人（前述）報告中，人類溶菡鳙基因係由 52個寡核苷酸塊段製得•如表一所示。 (接次頁）
-II 205070
Ul 上股號數 TCGAGATGAAGGTTT L26 下股號數 TCGAGCTATTAAAC U2 TTGAGAGATGCGAAT L25 ACCACAACCTTGAAC U3 TAGCCAGAACTTTGAAG L24 GTATTGTCTGACATC U4 AGATTGGGTATGGAC L23 TCTATTTTGGCATCT U5 GGCTACCGTGGTATT L22 GTTTCTCCAAGCGAC U6 TCTTTAGCCAACTGG L21 CCAGGCTCTAATACCCTG U7 ATGTGTCTTGCTAAG L20 TGGGTCACGGACAAC U8 TGGGAATCCGGCTATAAC L19 TCTCTTAGCGCAGGC U9 ACTAGAGCTACCAAT L18 AACAGCATCAGCAAT U10 TACAACGCTGGCGAC L17 GTTGTCCTGAAGC Ull CGTTCTACAGACTATGG LI 6 AAAGCTGAGCAAGAT U12 TATTTTCCAAATTAACT L15 AAGTGACAGGCGTTGAC U13 CTAGATATTGGTG LI 4 GGCACCTGGAGTCTTGC U14 TAACGATGGCAAGACTC L13 CATCGTTACACCAATAT U15 GAGGTGCCGTCAACGCC L12 CTAGAGTTAATTTGG U16 TGTCACTTATCTTGC Lll AAAATACCATAGTCTGT U17 TCAGCTTTGCTTCAG L10 AGAACGGTCGCCAGC U18 GACAACATTGCTGAT L9 GTTGTAATTGGTAGC U19 GCTGTTGCCTGCGCT L8 TCTAGTGTTATAGCCG U20 AAGAGAGTTGTCCGT L7 GATTCCCACTTAGCAAG U21 GACCCACAGGGTATT L6 ACACATCCAGTTGGC U22 AGAGCCTGGGTCGCT L5 TAAAGAAATACCACG 023 TGGAGAAACAGATGC L4 GTAGCCGTCCATACC U24 CAAAATAGAGATGTC L3 CAATCTCTTCAAAGT U25 AGACAATACGTTCAAGG L2 TCTGGCTAATTCGCATC U26 TTGTGGTGTTTAATAGC, LI TCTCAAAAACCTTCATC S0S070 在表1中，根據Ikehara等人的報告，可用CGAGA CGAGAGATGCGAAT 取代 U2 •及以 TCTGGCTAATTCGCATCTC” 取代L2 »而分別合成U2 — taq及L2-taq *然後用毎段U2 一taq，U3 至 U26，L2-taq，L3 至 L26，依 Ikehara 等人的 報告（圓1 )產生寡核苷醵塊段的癱合物（hybrid ) »在根 據實例2所述方法將這些基群分別接合後》兩個Υ -端均以 酵素法磷酸化》 參考例3 含TaqI部位之人類溶菌_基因片段的再次選殖 將參考例1所構築的質體PBR32 2X取2.6仰*與6單 位的鑑識酶Xhol及6單位的鑑鉍醜Clal »在35的反應溶 液〔BmM酸酸鹽緩衝液，ρΗ7·9，秘αοΜ酷酸鉀》10mM醋酸 鎂，0·5πιΜ二硫麄糖酵，0.01% BSA (牛妞淸白蛋白）〕 中*在37TC下反應1小時·次以酚去除溶液中的蛋白質*再 以冷乙_沉灘•此DNAC200 ng)再與由羧考例2製得之人類 溶菌鷗基因片段Iffing混合之，並將其在丨0^1反廳液〔66 mM Tris — 盥酸（ρΗ7·6)，腺苷三磷酸（ATP) ，10 πΜ 亜精胺（Spermidine ) »胧ηιΜ鷇化鎂，150 ηΜ二硫蘇糖酴 ，2 mg/inl牛血淸白蛋白· 5單位之Τ4 DNA接合_〕中， 於M<C下過夜使之互相接合之•使用此反應溶液，依Cohen等 人的方法將大腸菌Ml轉形•由此所得之轉形細胞，依鑰抽 取_ (前巳述及）而分離得到質體❶硏究其分子量及經鑑識酶 作用的切割圖_，獲得已有人_溶薄_基因入之p LYS221。 經分離PLYS221之EcoFl — Xh6I片段·及配合雙去氣核苷酸 ..麟II 史:法（dideoxyimcleotide chain termination method )決 —B — 镛 定其廳基順序》而得人類溶菌酶基因之Tiiql — Xh〇I片段， 列示於圖2中1 2 此鹽基序列指令合成人類溶菌酶之第四號胺基醸Glu至 第130號胺基酸Va丨的胺基酸序列。 實例1 指令舍成信號序列之DNA片段的製造 裝 訂 線 —14 — 1 將難蛋白溶菌酿之信號胜肽巳知的胺基酸序列中，第四 號白胺酸（Leu) »第六號興白胺酸（Πε)及第八號纈胺酸 (Val)〔 Jung· A·等人》美國國家科學院學報H · 5759 ( 1980)〕，分別以苯丙胺酸（Ph〇、白胺_ (leu)及內铵酸 (Ala)取代2更前一步》爲了海慮下列各點以達高度表現， 將核苷酸序列加以決定： ⑴在酵母中重組頻毕高的密碼優先被選取。 ⑵爲了强化表現性，酵母PGK基因序列蔹用於ATG之 上游；和 ⑶構築一雜合物信號是可飴的。 由此合成的核苷酸序列表示於圖3 ·如圖所示》含溶菌 酶指令合成區之V端有一Xhol部位及V端有一 Taq I部位 2 全部序列包含八個褰核苷酸塊段（#1〜眷8)，而可依 磷醣胺法 C phoephamide method )製得之〔Caruthers, Μ»Η· 等人；四面髅通訊（Tetrahedron Letters)!^, 1859(1981)〕2
核苷醸塊段#2至#7〔各丨0 «1(5仲）〕互相混合，又 加入10倍满度之20 //1激_緩衝液（0.5 M Tris -鹽酸，0.1 Μ 氣化鎂，0 ·1 Μ 基乙 _，pH 7 ·6 )，20 ρ 1 之 10 πΜ 腺 苷三璘酸，20 ( 50單位）之Τ4聚核苷酸;發酿C寶酒造C 耆0黪070
Takara Slm*o )公司製造）及8〇 pi蒸餾水•混合物再於37Χ： 下反應2小時*然後於65 X：處理20分鏟Μ停止反應*加核苷 酸塊段#1及參8各Κ)户1 ( 5仰），及Τ4接合酶C ΝΕΒ 公司製造）10 至反應混合物*混舍物於Μ X：下反應過夜* 所得到的反應混合物以10%聚內烯鏟胺膨進行電泳*次由膠 髏中切下％鹽基衡片段*再以電溶麵法分離得之•將所得者 溶於45 蒸餾水》並加入10倍襄度的缴醜緩衡液（前述）6 芦1 » 10 mM腺苷三_酸6 »及Τ4聚核苷酸激酿C前述）2 C 5單位）。混台物於下反應一小時，然後貯存在 -20 X： 〇 在圈3中以單一字母袠示胺基酸（依據國際純粹與痕用 化學會一國際生化學禽- 1UB ’生物化學命名）β (接次Μ ) 205070 A: Alanine 丙胺酸 B ： Aspartic acid or Asparagine天門冬酸或天冬酿胺 C： Cysteine半胱胺酸 D: Aspartic acid 天門冬綠 > E: Glutamic acid 魅胺酸 F: Phenylalanine 苯丙胺酸 G: Glycine甘胺酸 H： Histidine組胺酸 I: 工soleucine異白胺酸 K: Lysine離胺酸 L: Leucine白胺酸 M: Methionine甲硫胺酸 N: Asparagine天冬醯胺 P: Proline脯胺酸 0: Glutamine魅胺醯胺 R: Arginine 精胺酸 S: Serine絲胺酸 T: Threonine 蘇胺酸 V·· Valine纈胺酸 w： Tryptophan 色胺酸 Y: Tyrosine 酿胺酸 Z: Glutamic acid or Glutamine 麩胺酸或麩咹醯胺 X: Unknown or other amino acids 未知或其他胺基酸 20δ〇7β 實例2 分糍表現質髖的構築 將由參考例3製得之質體j>LTS221(236 ng)，以120單 位之EcoRI C日本遺傳公司（Nippon Gene Inc.)製造〕及 120單位之Xhol (日本遺傳公司瓤造），在37*C下作用2小 時，以切取含人類溶蔺醸指令匾之片段•此片段進一步以26 單位之TaqI C日本遒傳公司製造）處理，在下作用一小 時》以獲得指令合成人類溶菌鷗匾但缺少N端部分的片段· 將製得之片段約1柯與由實例1製得之具僑號序列指令 之DNA 0.5 混合，並在800單位之T4接合鏞（前述） 存在下》於16X：下反應16小時，接著再以Xhol (42單位）處 理之。 所得之Xho I片段ClOng ) ·與將酵母表現載鳢pdD 906-1 (日本專利袋肩公報第61 - 43991號），以Xho I 作用而得之DNA 1 ng相涵合，阐者以T4接舍_接合之· 大勝菌DH1利用前述相间之方法獲得之反應涵合物予以 轉形》得到含GLD啓動子的若干質饞》其下游並跃入有與啓 勤子相同方向的信號序列指令匾及人類溶菌殲基因·其中的 一個質體命名爲PGFL735而用於下列試驗中（見圖4 ) · 資例3 _母鶫形細胞的製造 將由實例2製得之質鼸pGFL735 »依Hinnen等人的方法 (前述）轉形於釀酒薄母蔺AH2 2R-中，而製得釀酒酵母轉 形細胞 AH2 2R-/PGFL735 * — 17 — 305070
實例4 轉形細胞的培綦 將5 ral巴克厚德改良培養基夏〔美國植物學會誌及 206(1943);磯酸二氬鉀〇·44 v，葡萄糖u ,天冬 裝 鐮胺5·6 sf// ,蔗_槌〕注入試管中，再將接種_ _ 酵母轉形細胞AH^tr/pGFxns ,並於3〇1下搖逢培養 •再將1以培養液轉入另一含4毫升相闻培養基之試管中， 再於30C下振譫培養一天•二毫升的培養液又再轉入另〜裝 有垅毫升巴克厚德改良培養基I的200毫升三角瓶中，海合 液又於30X：下搐盪培養4天。在培養過程中，經24、50及72 小時進行取樣。 賁例5 人類溶菌_產生量的澜定： 寅例4製得之培養液經離心以收取上淸液，而進行人類 ___之涵足· 人類溶蔺鴯活性的測定係依照美_ worthigtoii生物化學 公司Worthigton醇素手册（1972)第細頁中所戴方法進行•以 Sigma公司製迤的人類溶蔺酶做爲嫌準·* 一單位♦定義爲 爲：以溶壁微球菌 Micrococcus lyeodeikticus ( sigma )爲基 質•在0.1M磷酸鹽緩衝液C ΡΗ6·2)中》251C下經1分鐘 ，能使450 nm吸光度滅少〇·〇〇1所需之_素量《人頻溶菌 酶之產生量如下： 培養時間 人頻溶菌酶（毫克/升） 上淸液 — _ _ ""« 18 S0SO70 24 0.8 50 3.2 72 5 .2 資例6 表現型人類溶繭祕的抽取與純化： 將釀酒酵母轉形細胞AH22IT/pGFL735先依實例4所述 類似方法培養。 所得之培養骹（1.9升）進行離心》所得之上淸液败著 於CM_«|錐素管柱（口徑1·6胤米X 12·5厘米），以50H1M 磷酸鈉緩衡液（pH 6.5 )平衡之•在以150毫升上述緩衡液 淋洗後》再用含（K5M氣化納的上述鎂衝液溶離而得到幾乎 爲舉一峯面的人_溶菌_•圆收亭測得約W%· 上述所得之人領溶菌餐再用HPLC镞進一步純化•所得 含0.2邀克人類溶S酶之溶離物〇·2δ最升注入TSKij嬤ODS 120 T ·在以水+ 0.1%三氟乙酸（TFA )淋洗後•再用含乙 蹌（CH3CN ) 0〜脚％於〇·1 % TFA而成之溶液以梯度法 溶離》而得均質化的人類溶菌醻。 資例7 人類溶菌酶的性質： (i)分子量： 由實例6製得之蛋白質先以2 — 乙醇處理，再注於 S3DS —聚丙媒醱胺嘐體（15 % )耀泳（180 V » 2小時）。 經考馬斯輝藍染色（Coomaseie Brilliant Blue staining ) 顏現出蛋白質之單帶•且此單帶與進行電泳同時加入的人類 裝 訂 線 _!9 鵞_1 · 溶菌酶樣品表現相當一致的泳動距離。因而*此蛋白質具有 與人類溶菌酶相同的分子量14.7 led · Cii)鲛基蝈胺基酸序列： 取由賁例6製得之蛋白質進行黉得曼（£dman )自動分 解〔生物化學期刊256, 7990(1981) » Μ以氣相蛋白質定序 裝翻：〔470Α型》應用生物系統公司（Applied Bioeyatem Inc, )製造〕》以分析胺基端胺基酸序列*產生的乙內醣苯硫脲 (PTH) —胺基酸以驀效液相層析儀（VarUn公司製造），颳 合Micropack SPC » — 3管柱而得到如下表的結果β故，其胺 基酸序列爲 Η- Ly 8—V"a 1 - Pfci e~G 1 u_Arg-X-G1 u-Le u~Α 1 &_ Arg-（ X :未定）* 徧 醭 P TH -胺基酸 裝 訂
Cpmole) (%) 1 Lys 1071 57.4 2 Val 1176 63.0 3 Phe 1013 54.3 4 Giu 1043 55.9 5 Arg • * 一 6 X ** 一 一 7 G1 u 1046 56.0 8 Leu 1106 59.2 9 A 1 a 1246 66.7 10 Arg _ ♦ 一 線 —20 — 20Β07Φ (μ)胺基酸組成： 將由實例6製得之蛋白質置於玻瑱管中進行水解，並於 眞空中乾嫌之《接著加入6 N鹽酸或含4 基乙酸之6 N 鹽酸於管中，並在眞空中封口 β水解反臘於110*C進行24小 時。水解後，在輿空中除去鹽醜，留物溶於〇·〇2 N鹽酸中 •以進行鲛基酸分析*胺基酸分析値是將兩種分析的平均値 表示之•而就色胺酸言，則以用含4% 基乙酸之鹽酸進行 水解肋#之。結果示於下表。 胺基_組成 胺基酸 分析値 實驗值（*> 埋論値
Asp 0,74750 moi) Thr 0.2153 Se r 0.2324 Glu 0.3972 Pro 0.0561 Gly 0,4652 A1 a 0.5925 半Cy» _ ** Val 0.3550 Me t 0.0823 lie 0.2025 Leu 0.3415 Tyr 0.2550 Phe 0.0839 Ly s Hi 8 0.2168 0.0412 Arg 0.5723 Trp 0.2032 18 18 5.2 5 5.6 6 9.6 9 1.4 2 11.2 11 14.3 14 一 8 8.5 9 2.0 2 4.9 5 8.2 8 6.1 6 2.0 2 5.2 5 1.0 1 13.8 14 4.9 5
線 ~21~ 206070 •:以Asp値爲18計算 〜：未測定 由上所述》由賁例製得之人鎮瀋菌酶的胺基酸組成，與其理 論値相當一致。據此可知•由實例製得之人類溶繭酶可規撝 一種自然型的人類溶蔺_。 裝 訂 線 ~22 — 附 件 30S〇?〇 第76103196號專利申請案^ 補充實施例8 (77年1〇月#) 貢施例8 (1) Western斑迹雜合法 貪施例6獲得之蛋白質l〇〇ng »依Laemmli法〔Nature ，227 » 680 ( 1970)〕，在邇原條件下以含〇·1% SDS之 15%聚丙烯醢按膠進行電泳分析。Western斑迹雜合法依 Bur ne tt e 法〔Anal · B iochem· · 112，195 ( 1981 )〕進行 •將竜泳後在膠饈上之蛋白質轉移到硝基纖維素濾紙上，使 和兔子之抗一人類溶菌_抗艨相反臛》接著和抗一兔子IgG-HRP (辣根過氧化物酶）結合物〔Bio-Rad〕相反應。結果 ，該蛋白質和抗一人類溶菌酶抗霾相反應*骸蛋白質之分子 量和已確認之人類溶菌_〔 S igaia出鑷〕的分子量相同〔如 照片（附件四）所示，照片上第一棚示已確認2：人類溶菌酶 (100ng ;購自Sigma公司）·第二棚示貢施例6獲得之純 化蛋白質〕。 ⑵C端胺基酸 賁施例6獲得之蛋白質，以肼解法〔J. Biochem., 170 ( 1966 )〕決定属C端胺基酸序列，結果得知骸蛋白質 之C端胺基酸與已確認之人類溶菌鷗的c衊胺基酸均同爲纈 胺酸* ⑶溶裂活性 實施例6獲得之蛋白質的溶裂活性依實施例5所述之方 法測足，該蛋白質之溶裂活性爲130,00 0單位/毫克，和已 確認之人類溶菌酶〔Sigma出品〕的溶裂活性完全相同❶ 裝 訂 綵 ——1—— 205070 第七六一·〇二一九六號專利申請案 說明書勘誤表 C 78年8月21日） 原文說明書 頁 行 誤 正 13 16
Example 2
Example 1 裝 中文說明書 頁 行 誤 正 訂 13 6 據實例2 據實例 線

Claims (1)

  1. 205070 r ·*
    H3 V> prt±- 铕7 6 1 0 3 1 9 6號專利Ep 案 申請專利範圍修正本 (81年12月8曰） .一種製造人類溶菌酶之方法，包括將以含有指令合成如 下列化學式所示之信號胜肽的DMA片段之表現載體 M-R-S-F-L-L-L-A-L-C-F-L-P-L-A-A-L-G轉形至酵母菌 宿主細胞，並於培養液中將該D N A片段結合於指令合成 人類溶菌酶之9 一 DNA片段的V端，而蓄積人類溶菌.酶 及回收此人類溶菌酶。 .如申請專利範圍第1項所述之方法，其中指令合成信號 胜肽的D N A Η段，具有下列之塩基序列： Xhc hrsflllalcflplaalg Taq π η ICGAGTATAAAAACAATGAGATCTITCTTGTTGTTGGCTTTGTGTTTCTTGCGniGGCTGCTTTGGGTAAGGTTTT CATATTTTTGTTACTCTAGAAAGAACAACAACCGAAAC,\CAAAGAACGGTAACCGACGAAACCC,ITTCCAAAAGC η tl 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中之D N A序列為 PGFL 735。 甲 4 (210X297公爱）80. 5 5,000張(Η) 205070 附件三 # aE ,補充讓“V 第七六一〇三一九六號專利申請案 補充說明書 (78年β月21日） 就依申餹專利範圍第4項之方法，更具镰而宵倮依責施 例β所得之人類溶菌酶之精製品進行生物活性，安全性，以 及安定性之寶驗•獲得以下之結果。 1.生物活性 以對Mi c r©ce«€a· ifct i cu*之瀋菌作用作爲指 標之測定方法〔Y〇*himura et a丨 e Biochem. Biophye. Ree· C〇_un·，145· 712 (1987)]進 性測定，結 果顯示此人類濬菌酶之精製品之比活性與標準品（ Sigm·公司產品，由人乳中分離之天然溶菌酶）相同（ 130,000 Uni ti/mg ) · 2·安全性 以含有〇·5 %上述人類溶菌醮精製品之點眼液（配 方如下表所示）對老鼠及人之眼睛進行投藥試驗·結果顬 示無任何副作用。 含有〇·5 %人類瀋菌醮之點眼液配方： 裝 訂 線 10 ΟπΜ中舍有： 人類瀋菌醮 0.5g 氣化鈉 0.35g 氣化鉀 〇.l5g 硼 酸 0.7 g 硼矽 0.1 g 麩胺酸鈉 0.3 g 亞德酸鈉（sodi_ edetate) O.OOSg 塩酸 適量 氣丁酵 〇·ΐ g 氯化苯甲康（benzalkonium 0 .〇05g chloride) 無菌蒸皤水 適量 3.安定性 將上述點眼液於室溫下存放2個月，結果顯示溶菌醸 $ 之活性未降低》 一2 —
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