JPS626679A - ヒトリゾチ−ムの微生物学的製造法 - Google Patents
ヒトリゾチ−ムの微生物学的製造法Info
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- JPS626679A JPS626679A JP60139710A JP13971085A JPS626679A JP S626679 A JPS626679 A JP S626679A JP 60139710 A JP60139710 A JP 60139710A JP 13971085 A JP13971085 A JP 13971085A JP S626679 A JPS626679 A JP S626679A
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- gene
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- plasmid vector
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2462—Lysozyme (3.2.1.17)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、化学的に合成したヒトリゾチーム遺伝子を用
いた遺伝子工学的手法によるヒトリゾチームの製造法に
関する。
いた遺伝子工学的手法によるヒトリゾチームの製造法に
関する。
従来技術及び問題点
ヒトリゾチームはヒトの涙、唾液、鼻粘液、乳、リンパ
腺、白血球、血漿、軟骨、肺、腎臓、肺臓、肝臓、腸管
、耳下腺、皮膚、精液、白血病患者の尿中等に見い出さ
れる酵素蛋白質であり、Ｎ−アセチルグルコサミンとＮ
−アセチルムラミン波間のβ−１，４結合を加水分解す
るムラミダーゼ（ｍｕｒａｍｉｄａｓｅ ）としての酵
素活性を有している事が知られている。
腺、白血球、血漿、軟骨、肺、腎臓、肺臓、肝臓、腸管
、耳下腺、皮膚、精液、白血病患者の尿中等に見い出さ
れる酵素蛋白質であり、Ｎ−アセチルグルコサミンとＮ
−アセチルムラミン波間のβ−１，４結合を加水分解す
るムラミダーゼ（ｍｕｒａｍｉｄａｓｅ ）としての酵
素活性を有している事が知られている。
またヒト乳由来のリゾチームは下記の配列で示される１
８０４１のアミノ酸からなる事が知られている（例えば
、船津ら「溶菌酵素」５６〜５８頁、講談社すイエンテ
ィフイク（１９７７）参照）。
８０４１のアミノ酸からなる事が知られている（例えば
、船津ら「溶菌酵素」５６〜５８頁、講談社すイエンテ
ィフイク（１９７７）参照）。
Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｑ
ｌ ｕ−Ｌｅｕ−Ａｌ ａ−Ａｒｇ −Ｔｈｒ−Ｌｅｕ
−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−
Ｇｌｙ−’ｌ’ｙｒ−Ａｒｇ−Ｑｌｙ−ｉｌｅ−８ｅｒ
−Ｌｅｕ −Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ
−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｑｌｕ−８ｅｒ−
Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−ＴＷｒ −Ａｒｇ−Ａｌａ
−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ −Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ
−Ａｓｐ−Ａｒｇ −８ｅ ｒ−Ｔｈ ｒ−Ａｓ ｐ−
Ｔｙ ｒ−Ｇｌ ｙ −Ｉ １ ｅ−Ｐｈ ｅ−Ｑ
ｌ ｎ−Ｉ １ ｅ−Ａｓ ｎ −Ｓｅｒ−Ａｒ
ｇ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ −Ａｓ ｎ−Ａｓ ｐ−
Ｇｌ ｙ−Ｌｙ ５−Ｔｈ ｒ −Ｐｒｏ−Ｑｌｙ−Ａ
ｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｏ −Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｌ
ｅｕ−８ｅｒ −Ｃｙｓ−８ｅｔ−７ｋｌａ−Ｌｅｕ−
Ｌｅｕ −Ｇ ｌ ｎ−Ａｓ ｐ−Ａｓ ｎ−Ｉ
１ ｅ−Ａ １ ａ −Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−
Ａｌａ−Ｃｙｓ −Ａｌ ａ−Ｌｙｅ−Ａｒｇ−Ｖａ
１−Ｖａ １−Ａ ｒ ｇ−Ａ ｓ ｐ−Ｐ ｒｏｏ−
Ｇ ｌ ｎ−Ｇ ｌ ｙ −１１ｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ−
Ｔｒｐ−Ｖａｌ −Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−
Ａｒｇ −１２０“ Ｃｙ ５−Ｇｌ ｎ−Ａｓ ｎ−Ａｒ ｇ−Ａｓ ｐ
−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ −ＧＩ
ｎ−Ｇ１ ｙ−Ｃｙ ＠−Ｇｌｙ−Ｖａ １リゾチーム
は種々の細菌を溶解する作用を有するので、食品等の防
腐剤あるいは医薬品として、リゾチーム単独又は抗生物
質との併用による抗菌剤として利用する事ができる。
ｌ ｕ−Ｌｅｕ−Ａｌ ａ−Ａｒｇ −Ｔｈｒ−Ｌｅｕ
−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−
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−Ｌｅｕ −Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ
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Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−ＴＷｒ −Ａｒｇ−Ａｌａ
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Ａｌａ−Ｃｙｓ −Ａｌ ａ−Ｌｙｅ−Ａｒｇ−Ｖａ
１−Ｖａ １−Ａ ｒ ｇ−Ａ ｓ ｐ−Ｐ ｒｏｏ−
Ｇ ｌ ｎ−Ｇ ｌ ｙ −１１ｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ−
Ｔｒｐ−Ｖａｌ −Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−
Ａｒｇ −１２０“ Ｃｙ ５−Ｇｌ ｎ−Ａｓ ｎ−Ａｒ ｇ−Ａｓ ｐ
−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ −ＧＩ
ｎ−Ｇ１ ｙ−Ｃｙ ＠−Ｇｌｙ−Ｖａ １リゾチーム
は種々の細菌を溶解する作用を有するので、食品等の防
腐剤あるいは医薬品として、リゾチーム単独又は抗生物
質との併用による抗菌剤として利用する事ができる。
また、血液凝固及び止血作用、抗炎症作用、呼吸器疾患
者に対する喀痰喀出作用等をも有するのでそれらを対象
とした医薬品としても利用する事ができる。
者に対する喀痰喀出作用等をも有するのでそれらを対象
とした医薬品としても利用する事ができる。
ヒトリゾチームはヒトの乳、尿等から単離する事ができ
るが医療等を目的とする工業的生産の要求を満すには効
率が悪く実用的ではない。
るが医療等を目的とする工業的生産の要求を満すには効
率が悪く実用的ではない。
本発明は組換えＤＮＡ技術により、安価にしかも多量に
純粋なヒトリゾチームを生産する事を可能にしたもので
ある。
純粋なヒトリゾチームを生産する事を可能にしたもので
ある。
合成ヒトリゾチーム遺伝子を用いて組換えＤＮＡ技術に
よりヒトリゾチームを製造する方法は後により詳しく記
述するが基本的には下記の工程より成る。
よりヒトリゾチームを製造する方法は後により詳しく記
述するが基本的には下記の工程より成る。
（１）遺伝子の設計
（２）遺伝子の化学合成
（３）適当な発現用ベクターへの遺伝子の組込み（４）
得られた組換えプラズミドに依る適当な宿主の形質転換 （５）形質転換体の培養によるヒトリゾチームの産生及
び回収 上記の工程において、宿主として大腸菌を用いた場合の
製造法に関しては、すでに本発明者らの一部によってそ
の詳細が日本特許出願５９−２０１ｆｌ１６６号及び５
９−２０１８６７号明細書に開示されている。
得られた組換えプラズミドに依る適当な宿主の形質転換 （５）形質転換体の培養によるヒトリゾチームの産生及
び回収 上記の工程において、宿主として大腸菌を用いた場合の
製造法に関しては、すでに本発明者らの一部によってそ
の詳細が日本特許出願５９−２０１ｆｌ１６６号及び５
９−２０１８６７号明細書に開示されている。
宿主として酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）を用いた場合、大腸菌を用いた場合と
比較して（１） 培養が安全かつ容易であり、より高
密度で培養する事が可能である。
ｅｖｉｓｉａｅ）を用いた場合、大腸菌を用いた場合と
比較して（１） 培養が安全かつ容易であり、より高
密度で培養する事が可能である。
（２）発熱物質等の毒性物質の混入をさける事ができる
ため生産物の安全性がより高くなる。
ため生産物の安全性がより高くなる。
（３）高等動物由来の遺伝子産物が正しい構造をとりや
すい。
すい。
（４）酵母細胞はリゾチームに対して非感受性であるた
めより安定に生産し得る。
めより安定に生産し得る。
等の利点を有している。
しかしながら、外来遺伝子を効率良く発現させるために
は発現用ベクター内の転写と翻訳を支配している領域（
以下５端の非翻訳領域と呼ぶ）の適切な位置に外来遺伝
子を挿入する必要があるが、この５端の非翻訳領域の望
ましい化学構造（即ちヌクレオチド配列）は、大腸菌の
場合はどには明らかにされてなく、任意の構造遺伝子に
対して望ましい非翻訳領域の構造を予知する串は困難で
あって、試行錯誤的に最適構造を探索しなければならな
いという困難さを伴っている。
は発現用ベクター内の転写と翻訳を支配している領域（
以下５端の非翻訳領域と呼ぶ）の適切な位置に外来遺伝
子を挿入する必要があるが、この５端の非翻訳領域の望
ましい化学構造（即ちヌクレオチド配列）は、大腸菌の
場合はどには明らかにされてなく、任意の構造遺伝子に
対して望ましい非翻訳領域の構造を予知する串は困難で
あって、試行錯誤的に最適構造を探索しなければならな
いという困難さを伴っている。
本発明者らは、この様な状況の中で、酵母細胞を用いた
ヒトリゾチームの生産を目的として種々検討を重ねた結
果、本発明の方法によればヒトリゾチームを高レベルで
生産する事が可能である事を確認し本発明を完成するに
至った。
ヒトリゾチームの生産を目的として種々検討を重ねた結
果、本発明の方法によればヒトリゾチームを高レベルで
生産する事が可能である事を確認し本発明を完成するに
至った。
発明の構成
ｌ）遺伝子の取得
本発明のヒトリゾチーム遺伝子は通常用いられているヌ
クレオチド合成法によって取得される。
クレオチド合成法によって取得される。
（１）遺伝子の設計
１）構造遺伝子
ヒトリゾチームを構成するアミノ酸を指定するいくつか
のコドンのうちから下記の条件を満すものを選んでＤＮ
Ａを合成する。
のコドンのうちから下記の条件を満すものを選んでＤＮ
Ａを合成する。
囚 可能な限り酵母で高頻度に使用されているコドンを
選ぶ。
選ぶ。
但）後記する各々の合成フラグメントが分子内あるいは
分子間で望まない相補性配列を持たない様にする。
分子間で望まない相補性配列を持たない様にする。
１１）遺伝子全体
上記構造遺伝子の使用を容易にするためには、
囚 翻訳を開始終結せしめるため構造遺伝子の５端に翻
訳開始信号を８端に翻訳終止信号を付は加える。
訳開始信号を８端に翻訳終止信号を付は加える。
但） ブラズ疋ドへの組込み、プラズミドからの切り出
しを容易にするためＳ／ 、ａ／両端に制限酵素認識配
列をもたせる。
しを容易にするためＳ／ 、ａ／両端に制限酵素認識配
列をもたせる。
０ 形質転換体の検索を容易にするため遺伝子内に一つ
又は二つ以上の制限酵素認識配列をもたせる。
又は二つ以上の制限酵素認識配列をもたせる。
ことが望ましい。
この様にして設計された構造遺伝子の一興体例は下記の
ヌクレオチド配列式（１）で表わされる遺伝子であり、
同遺伝子を適当な発現ベクターに組込む事により酵母で
発現させる事が可能である。
ヌクレオチド配列式（１）で表わされる遺伝子であり、
同遺伝子を適当な発現ベクターに組込む事により酵母で
発現させる事が可能である。
ヌクレオチド配列式（１）
％式％
ＡＴＣＴＴＣＣＡＡ ＡＴＴ ＡＡＣＴＡ、Ｇ
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ＣＣＡ ＡＣＡ ＣＣＡ ＣＡＧ前記のヌ
クレオチド配列式（１）で表わされる構造遺伝子に翻訳
開始信号、翻訳終止信号及び５′。
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クレオチド配列式（１）で表わされる構造遺伝子に翻訳
開始信号、翻訳終止信号及び５′。
イ両端の制限酵素認識配列を付加した一例が下記のヌク
レオチド配列式（２）で表わされる遺伝子であり、同遺
伝子は翻訳開始信号及び翻訳終止信号を自からの内に含
んでいるため使用し得る発現ベクターの制限がより少な
くなっている。
レオチド配列式（２）で表わされる遺伝子であり、同遺
伝子は翻訳開始信号及び翻訳終止信号を自からの内に含
んでいるため使用し得る発現ベクターの制限がより少な
くなっている。
また同遺伝子を、例えばＣ１ａ１等の適当な制限酵素（
後記の表１を参照）で処理して適当な発現ベクターに挿
入する事も可能である。
後記の表１を参照）で処理して適当な発現ベクターに挿
入する事も可能である。
ヌクレオチド配列式（２）
％式％
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ＣＴ ＣＧＡ ＴＧＡ ＴＴＧ ＡＴ
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Ｇ ＴＴＧＡＣＡ ＡＧＡ ＣＧＡ
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Ｔ ＧＴＣＧＴＴ ＣＣＡ ＡＣＡ
ＣＣＡ ＣＡＧＴＡＡ Ｔ ＡＴＴ ＡＣＴ ＡＧ （２）遺伝子の合成 上記のように設計した遺伝子を合成するには、＋、−両
鎖のそれぞれについて、これをいくつかのフラグメント
に分けて、それらを化学的に合成し各々のフラグメント
を連結する方法によれば良い。
ＣＴ ＣＧＡ ＴＧＡ ＴＴＧ ＡＴ
ＧＡＡＣＧＣＣＧＧＴ ＧＡＣＣＧＴ ＴＴＧ ＣＧＧ ＣＣＡ ＣＴＧ Ｇ
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鎖のそれぞれについて、これをいくつかのフラグメント
に分けて、それらを化学的に合成し各々のフラグメント
を連結する方法によれば良い。
各鎖は１１〜１９塩基からなり各々が少くとも６塩基づ
つ重なる様に５６個程度のフラグメントに分けるのが好
ましい。
つ重なる様に５６個程度のフラグメントに分けるのが好
ましい。
フラグメントの合成、精製、５′−水酸基のリン酸化及
びフラグメントの連結はそれ自体公知の方法に従って行
う事ができる。
びフラグメントの連結はそれ自体公知の方法に従って行
う事ができる。
本発明で用いた遺伝子は、後記の表１に示される遺伝子
であるが、同遺伝子の取得法についてはすでに本発明者
らに依り日本特許出願５９−２０１８６７号明細書にそ
の詳細が開示されているので、それを参照されたい。
であるが、同遺伝子の取得法についてはすでに本発明者
らに依り日本特許出願５９−２０１８６７号明細書にそ
の詳細が開示されているので、それを参照されたい。
２）組換えプラズミドの調製
（１） ヒトリゾチーム遺伝子のプラズミドベクター
への導入 前記の様にして合成したヒトリゾチーム遺伝子を宿主内
で増殖可能なプラズミドベクター又は宿主内で増殖、発
現が可能な様に構成されたプラズミドベクターの適当な
挿入部位に組込む。
への導入 前記の様にして合成したヒトリゾチーム遺伝子を宿主内
で増殖可能なプラズミドベクター又は宿主内で増殖、発
現が可能な様に構成されたプラズミドベクターの適当な
挿入部位に組込む。
組込み操作そのものは分子生物学の分野で公知の常法に
従って行うことができる。
従って行うことができる。
具体的な方法については後記の実施例を参照されたい。
本発明によるヒトリゾチーム遺伝子の増殖はｐＢＲ８２
２、ｐＡＴ１５８（例えばＴｗｉｇｇら、Ｎａｔｕｒｅ
、２８８．２１６〜２１８ （１９８０）参照）等の
公知の種々のプラズミドベクターを用いて行う事ができ
る。また、プラズミドＤＮＡの単離精製も分子生物学の
分野で公知の常法に従って行う事ができる。
２、ｐＡＴ１５８（例えばＴｗｉｇｇら、Ｎａｔｕｒｅ
、２８８．２１６〜２１８ （１９８０）参照）等の
公知の種々のプラズミドベクターを用いて行う事ができ
る。また、プラズミドＤＮＡの単離精製も分子生物学の
分野で公知の常法に従って行う事ができる。
前記表１に示される合成遺伝子をｐＢＲ８２２のＢａｍ
ＨＩ切断部位に挿入して得られた’ｐＨＬＹ−１の取得
法に関しては日本特許出願５９−２０１８６７号明細書
を参照されたい。
ＨＩ切断部位に挿入して得られた’ｐＨＬＹ−１の取得
法に関しては日本特許出願５９−２０１８６７号明細書
を参照されたい。
本発明遺伝子によるヒトリゾチームの酵母での発現は、
ＡＤＨＩプロモーター（例えばＨｉｔｚｅｍａｎら、
Ｎａｔｕｒｅ ２９８ ７）７〜７２２（１９８１）
参照）、ＰＧＫプロモーター（例えばＨｉｔｚｅｍａｎ
ら、５ｃｉｅｎｃｅ ２１９６２０（１９８８）参照）
、ＧＡＰＤＨプロモーター（例えばＵｒｄｅａら、Ｐｒ
ｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。
ＡＤＨＩプロモーター（例えばＨｉｔｚｅｍａｎら、
Ｎａｔｕｒｅ ２９８ ７）７〜７２２（１９８１）
参照）、ＰＧＫプロモーター（例えばＨｉｔｚｅｍａｎ
ら、５ｃｉｅｎｃｅ ２１９６２０（１９８８）参照）
、ＧＡＰＤＨプロモーター（例えばＵｒｄｅａら、Ｐｒ
ｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。
ＵＳＡ −炙０ ７４６１〜７４６５（１９８８）参照
）、ＰＨ０５プロモーター（例えばＫｒａｍｅｒら、Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８１ ８
６７〜８７０（１９８４）参照）、ＥＮＯプロモーター
（例えば）（ｏｌｌａｎｄら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ
、２５６１８８５〜１８９５（１９８１）参照）及びＧ
ＡＬＩＯプロモーター（例えばＢｒｏａｃｈら、Ｅｘｐ
ｅｒｉ−ｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏ
ｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ８８〜１１７（１
９８８）参照）等を有する公知の種々の発現ベクターを
用いて行う事ができる。
）、ＰＨ０５プロモーター（例えばＫｒａｍｅｒら、Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８１ ８
６７〜８７０（１９８４）参照）、ＥＮＯプロモーター
（例えば）（ｏｌｌａｎｄら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ
、２５６１８８５〜１８９５（１９８１）参照）及びＧ
ＡＬＩＯプロモーター（例えばＢｒｏａｃｈら、Ｅｘｐ
ｅｒｉ−ｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏ
ｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ８８〜１１７（１
９８８）参照）等を有する公知の種々の発現ベクターを
用いて行う事ができる。
これらの発現ベクターのうちの一具体例はＹＥｐ５１（
例えば、Ｂｒｏａｃｈら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎ −電ａ
ｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｑｅｎｅ
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ 。
例えば、Ｂｒｏａｃｈら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎ −電ａ
ｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｑｅｎｅ
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ 。
８８〜１１７（１９８１）参照）である。
（２）方向性の判定
プラズミドに組込まれたヒトリゾチーム遺伝子の方向性
の判定は遺伝子内に含まれる特定の塩基配列をｇ識する
制限酵素（例えば、 Ｃ１ａｌ 、 ＢｓｔＥＩｌ 、
Ｘｂａ を等であり、前記の表１を参照されたい） でその部位を切断し、遺伝子外の特定部位を別の制限酵
素を用いて切断して、得られた断片のサイズをアガロー
スゲル電気泳動等の通常用いられている方法で分析する
事により行う墨ができる。
の判定は遺伝子内に含まれる特定の塩基配列をｇ識する
制限酵素（例えば、 Ｃ１ａｌ 、 ＢｓｔＥＩｌ 、
Ｘｂａ を等であり、前記の表１を参照されたい） でその部位を切断し、遺伝子外の特定部位を別の制限酵
素を用いて切断して、得られた断片のサイズをアガロー
スゲル電気泳動等の通常用いられている方法で分析する
事により行う墨ができる。
８）形質転換
（１）宿主菌
ヒトリゾチーム遺伝子を組込んだ組換えプラズミドの調
整、増殖は大腸菌を用いて行われるが、宿主細胞の大腸
菌での一興体例はＥ、 ｃｏｌｉｃ ６００ （例えば
、Ｎｅ１ｓｏｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １０８８８８〜
８５０（１９８１）参照）である。
整、増殖は大腸菌を用いて行われるが、宿主細胞の大腸
菌での一興体例はＥ、 ｃｏｌｉｃ ６００ （例えば
、Ｎｅ１ｓｏｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １０８８８８〜
８５０（１９８１）参照）である。
ヒトリゾチーム遺伝子を組込んだ組換えプラズミドによ
るヒトリゾチームの発現は酵母を用いて行われるが、宿
主細胞の酵母テノー具体例は、Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ ＫＫ ４（例えば、Ｎｏｇ ｉら、Ｍｏ１． Ｑ
ｅｎ 、 Ｇｅｎｅｔ 、 ｌ ９５２９〜８４ （１
９８４）参照）である。
るヒトリゾチームの発現は酵母を用いて行われるが、宿
主細胞の酵母テノー具体例は、Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ ＫＫ ４（例えば、Ｎｏｇ ｉら、Ｍｏ１． Ｑ
ｅｎ 、 Ｇｅｎｅｔ 、 ｌ ９５２９〜８４ （１
９８４）参照）である。
ヒトリゾチーム遺伝子を組込んだ組換えプラズミドによ
る形質′転換は上記の宿主に限定されるものではなく、
公知の神々の ８、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ誘導体（例えばイーストジ
ェネテイックストックセンター（ＹｅａｓｔＧｅｎｅｔ
ｉｃ ５ｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ ）カタログ参照）を
使用することができる。これらの８．ｃｅｒｅ−ｖｉｓ
ｉａｅ 誘導体の多（のちのはイーストジェネテイック
ストックセンター（ＹｅａｓｔＧｅｎｅｔｉｃ ５ｔｏ
ｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ ）及び公認の微生物機関、例えば
アメリカンタイプカルチャーコレクシ、ン（Ａｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ ）に寄託されておりそこから分線が可能である。
る形質′転換は上記の宿主に限定されるものではなく、
公知の神々の ８、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ誘導体（例えばイーストジ
ェネテイックストックセンター（ＹｅａｓｔＧｅｎｅｔ
ｉｃ ５ｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ ）カタログ参照）を
使用することができる。これらの８．ｃｅｒｅ−ｖｉｓ
ｉａｅ 誘導体の多（のちのはイーストジェネテイック
ストックセンター（ＹｅａｓｔＧｅｎｅｔｉｃ ５ｔｏ
ｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ ）及び公認の微生物機関、例えば
アメリカンタイプカルチャーコレクシ、ン（Ａｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ ）に寄託されておりそこから分線が可能である。
（２）形質転換
形質転換操作そのものは、分子生物学の分野で公知の常
法に従って行う事ができる、（大腸菌の形質に、換につ
いては、例えばＣｏｈｅｎら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ６９ ２１１０〜２１
１４（１９７２）及びＭａｎｉａ−ｔｉｓら、Ｍｏ１ｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２４９〜２５８（１９８
２）参照。酵母の形質転換については、例えば）（ｉｎ
ｎｅｎら、ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ。
法に従って行う事ができる、（大腸菌の形質に、換につ
いては、例えばＣｏｈｅｎら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ６９ ２１１０〜２１
１４（１９７２）及びＭａｎｉａ−ｔｉｓら、Ｍｏ１ｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２４９〜２５８（１９８
２）参照。酵母の形質転換については、例えば）（ｉｎ
ｎｅｎら、ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、ＵＳＡ ７５ １９２９（１９７８）及びＩ
ｔ。
ｔ。
ら、Ｊ 、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １５８ １６８
〜１６８（１９８Ｂ）参照）。
〜１６８（１９８Ｂ）参照）。
（３）形質転換体
酵母に於ける形質転換体の具体例は、
Ｓ 、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＫＫ ４をＭｈ：ｐＨ
ＬＹ −１又はＹＥｐＨＬＹ−２で形質転換させて得た
形質転換体であって１本発明ではそれらをＳ。
ＬＹ −１又はＹＥｐＨＬＹ−２で形質転換させて得た
形質転換体であって１本発明ではそれらをＳ。
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＫＫ４ ＣＹＥｐＨＬＹ−１）
％ Ｓ −ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＫＫ４ （ＹＥｐ
ＨＬＹ−２）と命名した。
％ Ｓ −ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＫＫ４ （ＹＥｐ
ＨＬＹ−２）と命名した。
１）ヒトリゾチームの生産
この様にして得た形質転換体を分子生物学及び発酵学の
分野で公知の常法に従って培養すればヒトリゾチームが
生産される。
分野で公知の常法に従って培養すればヒトリゾチームが
生産される。
ヒトリゾチームは公知の免疫沈降反応、ラジオイムノア
ッセイ（例えばＹｕｚｕｒｉｈａ らＣｈｅｍ、 Ｐ
ｈａｒｍ、 Ｂｕｌｌ−２７２８０２〜２８０６（１９
７９）及びＹｕｚｕｒｉｈａらＣｈｅｍ、 ｐｂａｒｒ
ｎ。
ッセイ（例えばＹｕｚｕｒｉｈａ らＣｈｅｍ、 Ｐ
ｈａｒｍ、 Ｂｕｌｌ−２７２８０２〜２８０６（１９
７９）及びＹｕｚｕｒｉｈａらＣｈｅｍ、 ｐｂａｒｒ
ｎ。
Ｂｕｌｌ、２６９０８〜９１４（１９７８）参照）、酵
素活性測定法（例えばＳ １ｄｈａｎら、Ａｇｒｉｃ。
素活性測定法（例えばＳ １ｄｈａｎら、Ａｇｒｉｃ。
Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ４５１８１７〜１８２Ｂ（１
９８１）及びＭｏｒｓｋｙ Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、 １２８ ７７〜８５（１９８８）参照）等を用い
て検出、定量することができる。
９８１）及びＭｏｒｓｋｙ Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、 １２８ ７７〜８５（１９８８）参照）等を用い
て検出、定量することができる。
また生産したヒトリゾチームは生化学及び醗酵学の分野
で公知の常法を適宜組合わせて回収、精製することがで
きる。
で公知の常法を適宜組合わせて回収、精製することがで
きる。
具体的事項に関しては後記の実施例を参照されたい。
実施例
プラズミドＹＥＩ）５１８μ２を緩衝液！（１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ −Ｈｃｌ ｐＨ７，５、１００ｍＭ Ｎａｃ
ｌ 、 ｌＯｍＭＭｇｃ１２．１ｍＭ ＤＴＴ）、１５
単位の制限酵素ＢａｍＨＩ及び１２．６単位の制限酵素
Ｈｉｎｄ ＩＩＩを含む５０μｊの反応液中で８７℃、
４時間反応させた後０．８％アガロースゲル電気泳動を
行いＧＡＬｌＯプロモーターを含む約７ Ｋｂｐの断片
を回収した。
Ｔｒｉｓ −Ｈｃｌ ｐＨ７，５、１００ｍＭ Ｎａｃ
ｌ 、 ｌＯｍＭＭｇｃ１２．１ｍＭ ＤＴＴ）、１５
単位の制限酵素ＢａｍＨＩ及び１２．６単位の制限酵素
Ｈｉｎｄ ＩＩＩを含む５０μｊの反応液中で８７℃、
４時間反応させた後０．８％アガロースゲル電気泳動を
行いＧＡＬｌＯプロモーターを含む約７ Ｋｂｐの断片
を回収した。
一方、プラズミドｐＨＬＹ−１８０μ２を上記緩衝液！
、１４０単位のＢａｍＨＩ 及び１１５単位のＨｉｎｄ
ｌｌｌを含む７０ Ａｌｌの反応液中で８７℃、４時間
反応させた後５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行
いＨＬＹ遺伝子を含む７６５ｂｐの断片を回収した。
、１４０単位のＢａｍＨＩ 及び１１５単位のＨｉｎｄ
ｌｌｌを含む７０ Ａｌｌの反応液中で８７℃、４時間
反応させた後５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行
いＨＬＹ遺伝子を含む７６５ｂｐの断片を回収した。
上記の約７ＫｂｐＤＮＡ断片０．３５μノと７６５ｂｐ
ＤＮＡ断片１．２１１９を緩？ｆＪ液ＩＴ （６６ｍＭ
ＴｒｉｓＨｃｌ ｐＨ７，５、ｌ ＯｍＭ Ｍｙｃ
１２ 、ｌ ＯｍＭ ＤＴＴ。
ＤＮＡ断片１．２１１９を緩？ｆＪ液ＩＴ （６６ｍＭ
ＴｒｉｓＨｃｌ ｐＨ７，５、ｌ ＯｍＭ Ｍｙｃ
１２ 、ｌ ＯｍＭ ＤＴＴ。
４ｍＭＡＴＰ）及び２．６単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ
を含む２２μｌの反応液中で１５℃、８時間反応して連
結させた。
を含む２２μｌの反応液中で１５℃、８時間反応して連
結させた。
次にこの反応液を用いてＥ、ｃｏｌｉＣ６００株を形質
転換しアンピシリン（８０μｆ／ｍｌ ）抵抗性の形質
転換体を得た。これらの形質転換体よりプラズミドＤＮ
Ａを調整し制限酵素切断パターンの分析を行って図面ｌ
に示される様な組換えプラズミドｙＨｐ５１−ＨＬＹを
含む形質転換体を選び出した。
転換しアンピシリン（８０μｆ／ｍｌ ）抵抗性の形質
転換体を得た。これらの形質転換体よりプラズミドＤＮ
Ａを調整し制限酵素切断パターンの分析を行って図面ｌ
に示される様な組換えプラズミドｙＨｐ５１−ＨＬＹを
含む形質転換体を選び出した。
プラズミドｙＦｐｓｔ−ＨＬＹ １２μ２を前述の緩衝
液１．４０単位のＢａｍＨＩ及び９０単位のＳａｔ Ｉ
を含む７０μｌの反応液中で８７℃５時間反応させた後
０．７％アガロースゲル電気泳動を行いＨＬＹ遺伝子を
含む約７．５ ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
液１．４０単位のＢａｍＨＩ及び９０単位のＳａｔ Ｉ
を含む７０μｌの反応液中で８７℃５時間反応させた後
０．７％アガロースゲル電気泳動を行いＨＬＹ遺伝子を
含む約７．５ ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
上記ＤＮＡ断片２μノを２５０ｍＭ酢酸ソーダｐＨ４，
５，１ｍＭＺｎｃ／２１１００ｍＭ Ｎａｃｌ及び最終
＃度１．５ μｙ／ｇ／の８＋ヌクレアーゼ（Ｓｉｇｍ
ａ社！＆りを含む１００μｌの反応液中で８℃、１０分
間反応させた後、８Ｍ酢酸ソーダｌＯμｌを加えフェノ
ール処理を８回行いエタノール沈澱でＤＮＡを回収した
。
５，１ｍＭＺｎｃ／２１１００ｍＭ Ｎａｃｌ及び最終
＃度１．５ μｙ／ｇ／の８＋ヌクレアーゼ（Ｓｉｇｍ
ａ社！＆りを含む１００μｌの反応液中で８℃、１０分
間反応させた後、８Ｍ酢酸ソーダｌＯμｌを加えフェノ
ール処理を８回行いエタノール沈澱でＤＮＡを回収した
。
続いて、このＤＮＡを前述の緩衝故■、２．６単位の’
ｒ ４ Ｄ Ｎ Ａリガーゼ及び２４単位のＴ４几ＮＡ
リガーゼを含む２０μｌの反応液中で１８’（：、１５
時間反応させて連結した。
ｒ ４ Ｄ Ｎ Ａリガーゼ及び２４単位のＴ４几ＮＡ
リガーゼを含む２０μｌの反応液中で１８’（：、１５
時間反応させて連結した。
次にこの反応液を用いてＥ、 ｃｏｌｉ Ｃ６００株を
形質転換し、アンピシリン（８０μｙ／ 欝／）抵抗性
の形質転換体を得た。これらの形質転換体よりブラズ疋
ドＤＮＡを調製し、制限酵素切断パターンの分析を行っ
て図面ｌに示される様な組換えプラズミドＹＥｐＨＬＹ
−１を含む形質転換体を選び出した。
形質転換し、アンピシリン（８０μｙ／ 欝／）抵抗性
の形質転換体を得た。これらの形質転換体よりブラズ疋
ドＤＮＡを調製し、制限酵素切断パターンの分析を行っ
て図面ｌに示される様な組換えプラズミドＹＥｐＨＬＹ
−１を含む形質転換体を選び出した。
プラズミドＹＥｐＨＬＹ−１８０μ９をｌＯｍＭＴｒｉ
ｓ−Ｈｃｌ ｐＨ７，５、１０ｍＭ Ｎａｃｌ２ 、８
０ｍＭＫｃ／、１ｍＭＤＴＴ及び２４０単位の制限酵素
Ｃ１ａ Ｉを含む、１５０μｊ の反応液中で８７℃、
２時間反応させた後エタノール沈澱を行ってＤＮＡを回
収した。
ｓ−Ｈｃｌ ｐＨ７，５、１０ｍＭ Ｎａｃｌ２ 、８
０ｍＭＫｃ／、１ｍＭＤＴＴ及び２４０単位の制限酵素
Ｃ１ａ Ｉを含む、１５０μｊ の反応液中で８７℃、
２時間反応させた後エタノール沈澱を行ってＤＮＡを回
収した。
次にこのＤＮＡｌ０μＦを１００ｍＭＴｒｉｓ−Ｈｃ／
ｐＨ８，０及び１単位のバクテリアルアルカラインホス
ファターゼを含む１００μｌの反応液中で８７°Ｃ１６
０分間反応させた後最終鏝度１００ｍＭになる様にＮａ
ｃｌを刃口えフェノール処理を５１１！ＩＮ点し、エタ
ノール沈澱を行ってＤＮＡを回収した。
ｐＨ８，０及び１単位のバクテリアルアルカラインホス
ファターゼを含む１００μｌの反応液中で８７°Ｃ１６
０分間反応させた後最終鏝度１００ｍＭになる様にＮａ
ｃｌを刃口えフェノール処理を５１１！ＩＮ点し、エタ
ノール沈澱を行ってＤＮＡを回収した。
上記ＤＮＡを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｈｃｔ ｐＨ７，
６ｍ１０ｍＭＭ５Ｊｃ／ｚ 、ｔｍＭＤＴＴ、Ｏ，１ｍ
Ｍスペルミジ：／ 、 ０．１ｍＭ ＥＤＴＡ 、 （
７”−Ｐ）ＡＴＰ （ニー 、 −イングランドヌクレ
アー社￥＠ ８，０００ Ｃｉ／ｍｍｏ／）６０ ｐｍ
ｏｒ（１８０μｃｉ）、及び１６単位のＴ４−ポリヌク
レオチドキナーゼを含む８０μｌの反応液中で８７℃、
４６分間反応させた後、フェノール処理エタノール沈澱
を行ってＤＮＡを回収した。
６ｍ１０ｍＭＭ５Ｊｃ／ｚ 、ｔｍＭＤＴＴ、Ｏ，１ｍ
Ｍスペルミジ：／ 、 ０．１ｍＭ ＥＤＴＡ 、 （
７”−Ｐ）ＡＴＰ （ニー 、 −イングランドヌクレ
アー社￥＠ ８，０００ Ｃｉ／ｍｍｏ／）６０ ｐｍ
ｏｒ（１８０μｃｉ）、及び１６単位のＴ４−ポリヌク
レオチドキナーゼを含む８０μｌの反応液中で８７℃、
４６分間反応させた後、フェノール処理エタノール沈澱
を行ってＤＮＡを回収した。
次にこのＤＮＡを前記緩衝液Ｉ及び８８単位の制限酵素
Ｅｃｏ几工を含む５０μｌの反応液中で８７°Ｃ２２時
間反応させた後１％アガロースゲル電気υに鯛を行って
３２ｐラベルされた約１．５ＫｂｐＤＮＡ 断片を回収
した。
Ｅｃｏ几工を含む５０μｌの反応液中で８７°Ｃ２２時
間反応させた後１％アガロースゲル電気υに鯛を行って
３２ｐラベルされた約１．５ＫｂｐＤＮＡ 断片を回収
した。
このＤＮＡの塩基配列を既知のＭａｘａｍ−Ｑｉ Ｉ−
ｂｅｒｔ法（例えばＭ ａｘ ａ ｍら、 Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、ＡｃａｄＳｃｉ、ＵＳＡ ７４５６０（１９
７７）参照）で解析した結果図面２で示される塩基配列
を有している串が確認された。
ｂｅｒｔ法（例えばＭ ａｘ ａ ｍら、 Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、ＡｃａｄＳｃｉ、ＵＳＡ ７４５６０（１９
７７）参照）で解析した結果図面２で示される塩基配列
を有している串が確認された。
発現用組換えプラズミドＶＨｐＨＬＹ−２の調製プラズ
ミドＹＨｐ５Ｌ−ＨＬＹ １２μノを前述の緩１１？ｆ
ｆｌ、４０単位のＢａｍＨＩ及び９０単位のＳａｔ ｘ
を含む７０μｊの反応液中で８７℃５時間反応させた後
０．７％アガロースゲル電気泳動を行いＨＬＹ遺伝子を
含む約７．５ＫｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
ミドＹＨｐ５Ｌ−ＨＬＹ １２μノを前述の緩１１？ｆ
ｆｌ、４０単位のＢａｍＨＩ及び９０単位のＳａｔ ｘ
を含む７０μｊの反応液中で８７℃５時間反応させた後
０．７％アガロースゲル電気泳動を行いＨＬＹ遺伝子を
含む約７．５ＫｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
上記ＤＮＡ断片１／ｊＦを５ＱｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
ｐＨ７、２、１０ｍＭ ＭＦＳＯ＜ 、 ０．１ｍＭ
ＤＴＴ、６０ｔｔｆＶｔｌのＢＡＡ 、各々２ｎｍｏ
ｊの４種のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、
ａＴＴＰ）、９ｐｍｏｊの（払−３２Ｐ）ｄＣＴＰ（ア
マ−ジャム社製８００Ｃｉ／ｍｍｏｊ ）及び１単位の
ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ
）を含む２５ｔｔｌの反応液中で室温８０分間反応さ
せた後、２μｌの２５０ｍＭ ＥＤＴＡを加え５ｅｐｈ
ａｄｅｘ Ｇ−５０を用いてゲルｉＰａを行い、縞分子
部分のＰラベルＤＮＡをフェノール処理エタノール沈澱
を行って回収した。
ｐＨ７、２、１０ｍＭ ＭＦＳＯ＜ 、 ０．１ｍＭ
ＤＴＴ、６０ｔｔｆＶｔｌのＢＡＡ 、各々２ｎｍｏ
ｊの４種のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、
ａＴＴＰ）、９ｐｍｏｊの（払−３２Ｐ）ｄＣＴＰ（ア
マ−ジャム社製８００Ｃｉ／ｍｍｏｊ ）及び１単位の
ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ
）を含む２５ｔｔｌの反応液中で室温８０分間反応さ
せた後、２μｌの２５０ｍＭ ＥＤＴＡを加え５ｅｐｈ
ａｄｅｘ Ｇ−５０を用いてゲルｉＰａを行い、縞分子
部分のＰラベルＤＮＡをフェノール処理エタノール沈澱
を行って回収した。
続いて、このＤＮＡを１ｒＬＩ述の費鉤液■、ＩＯ単位
のＴ４−ＤＮＡリガーゼ及び２４単位のＴ４−ＲＮＡリ
ガーゼを含む１０６μｊの反応液中で１８℃、１４時間
反応させて連結した。
のＴ４−ＤＮＡリガーゼ及び２４単位のＴ４−ＲＮＡリ
ガーゼを含む１０６μｊの反応液中で１８℃、１４時間
反応させて連結した。
次にこの反応液を用いてＥ、 ｃｏｌｉ ｃｅｏｏ株を
形質転換しアンピシリン（８０μｙ／ｍｌ＞抵抗性の形
質転換体を得た。
形質転換しアンピシリン（８０μｙ／ｍｌ＞抵抗性の形
質転換体を得た。
これらの形質転換体よりプラズミドＤＮＡを調製し、制
限酵素切断パターンの分析を行って図面ｌに示される様
な組換えプラズミドＹＥｐＨＬＹ−２を含む形質転換体
を選び出した。
限酵素切断パターンの分析を行って図面ｌに示される様
な組換えプラズミドＹＥｐＨＬＹ−２を含む形質転換体
を選び出した。
プラズミドＹＥｐＨＬＹ−２を用いてＹｇｐＨＬＹ−１
で行ったのと全く同様な方法でその塩基配列を解析した
ところ図面２で示される塩基配列を有している事が確認
された。
で行ったのと全く同様な方法でその塩基配列を解析した
ところ図面２で示される塩基配列を有している事が確認
された。
プラズミドＹＦ：ｐ ５１ 、 ＹＥｐＨＬＹ−１及び
ＹｇｐＨＬＹ−２各々５μ７を用いてＳ、 ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅＫＫ４株を既知のスフェロプラスト法（例え
ば、 Ｈｉｎｎｅｎら、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ７．
Ａｃａｄ、 ５ｃｉＵＳＡ ７５ １９２９（１９７
８）参照）で形質転換しロイシン非要求性の形′Ｒ転換
体を得た。
ＹｇｐＨＬＹ−２各々５μ７を用いてＳ、 ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅＫＫ４株を既知のスフェロプラスト法（例え
ば、 Ｈｉｎｎｅｎら、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ７．
Ａｃａｄ、 ５ｃｉＵＳＡ ７５ １９２９（１９７
８）参照）で形質転換しロイシン非要求性の形′Ｒ転換
体を得た。
これらの形質転換体を各々Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
ＫＫ４ （ＹＥｐ５１ ） 、 Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅＫＫ４ （ＹＥｐＨＬＹ−１） 、 Ｓ、 ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ ＫＫ４ （ＹＥｐＨＬＹ−２）と命
名した。
ＫＫ４ （ＹＥｐ５１ ） 、 Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅＫＫ４ （ＹＥｐＨＬＹ−１） 、 Ｓ、 ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ ＫＫ４ （ＹＥｐＨＬＹ−２）と命
名した。
ヒトリゾチーム遺伝子の発現
ロイシン及びメチオニンを除いた各種アミノ酸（終濃度
２０〜３７５η／ｊ）、アデニンサルフエイト（終濃度
２０η／ｌ）、ウラシル（終濃度２０■／ｊ）及び炭素
源として２％のガラクトースを含む最少培地（Ｓｈｅｒ
ｍａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｑｅｎ
ｅｔｉｃｓ ６２頁、 ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｕｒ （１９８２）参照）５ｇ／中で前記組換え体
（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＫＫ４ （ＹＥｐ５１
） 、 Ｓ 、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＫＫ４ （
ＹＥｐＨＬＹ−１）及びＳ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
ＫＫ４ （ＹＥｐＨＬＹ−２） ）を８０℃で対数増殖
中期（クレット２００）まで生育させた後、３５Ｓ−メ
チオニン（アマ−ジャム社製）５０μＣｉ を添加しさ
らに８０’Ｃ１１時間振盪培養した。
２０〜３７５η／ｊ）、アデニンサルフエイト（終濃度
２０η／ｌ）、ウラシル（終濃度２０■／ｊ）及び炭素
源として２％のガラクトースを含む最少培地（Ｓｈｅｒ
ｍａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｑｅｎ
ｅｔｉｃｓ ６２頁、 ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｕｒ （１９８２）参照）５ｇ／中で前記組換え体
（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＫＫ４ （ＹＥｐ５１
） 、 Ｓ 、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＫＫ４ （
ＹＥｐＨＬＹ−１）及びＳ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
ＫＫ４ （ＹＥｐＨＬＹ−２） ）を８０℃で対数増殖
中期（クレット２００）まで生育させた後、３５Ｓ−メ
チオニン（アマ−ジャム社製）５０μＣｉ を添加しさ
らに８０’Ｃ１１時間振盪培養した。
菌体を５．００Ｏｒｐｍ、 ５分間の遠心で集めＺｙｍ
ｏｌｙａｓｅ １００Ｔ （キリンビール社製）０．
６５”Ｐ及び２ Ｍ ５ｏｒｂｉｔｏｌ を含む祷衝
液中で３０℃、Ｂｏ分１ｉ！１インキュベートした後５
．０００ｒＪ）ｍ 、５分間の遠心で菌体を集めた。
ｏｌｙａｓｅ １００Ｔ （キリンビール社製）０．
６５”Ｐ及び２ Ｍ ５ｏｒｂｉｔｏｌ を含む祷衝
液中で３０℃、Ｂｏ分１ｉ！１インキュベートした後５
．０００ｒＪ）ｍ 、５分間の遠心で菌体を集めた。
上記菌体を４００μｌの溶菌用緩衝液（１０ｍＭＮａ３
ＰＯ４ｐＨ７，２、１ｍＭ フェニルメタンスルホニル
フルロライド、 ５０ ｍＭ ＦｉＤＴＡ 、 ０．９
％Ｎａｃｌ 、 １０％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、
０，５％ｄｅｏｘｙｃｈｏ−Ｉａｔｅ 、 ０．５％５
ＤＳ）中に懸濁して菌体がら蛋白質を抽出した。
ＰＯ４ｐＨ７，２、１ｍＭ フェニルメタンスルホニル
フルロライド、 ５０ ｍＭ ＦｉＤＴＡ 、 ０．９
％Ｎａｃｌ 、 １０％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、
０，５％ｄｅｏｘｙｃｈｏ−Ｉａｔｅ 、 ０．５％５
ＤＳ）中に懸濁して菌体がら蛋白質を抽出した。
蛋白抽出液８６０μｊに１０μｊのウサギ抗ヒトリゾチ
ーム抗体（ミドリ十字社製）を加え１０℃、１６時間イ
ンキュベートした後３６０μ／の８ＴＤＳ緩衝ｆｉ （
１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈｅ／ｐＨ８，０，１％Ｔｒｉｔｏ
ｎ×−１００、０，５％Ｓｏｄｉｕｍｄｅｏｘｙｃｈｏ
ｌａｔｅ 、 ９．５％５ＤＳ）及び９０ｐｌのｐｒｏ
ｔｅｉｎ Ａ−８ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４８（
Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）懸濁液（上記５ＴＤＳ暑衝欣
に１０％（Ｖ／Ｖ）で懸濁したもの）を加え室温で６０
分間インキュベートした。
ーム抗体（ミドリ十字社製）を加え１０℃、１６時間イ
ンキュベートした後３６０μ／の８ＴＤＳ緩衝ｆｉ （
１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈｅ／ｐＨ８，０，１％Ｔｒｉｔｏ
ｎ×−１００、０，５％Ｓｏｄｉｕｍｄｅｏｘｙｃｈｏ
ｌａｔｅ 、 ９．５％５ＤＳ）及び９０ｐｌのｐｒｏ
ｔｅｉｎ Ａ−８ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４８（
Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）懸濁液（上記５ＴＤＳ暑衝欣
に１０％（Ｖ／Ｖ）で懸濁したもの）を加え室温で６０
分間インキュベートした。
この反応液を１０ ％ ５ｕｃｒｏｓｅを含む５ＴＤＳ
緩衡液８００μ／上に重層し１２．００Ｏｒｌ）ｍ Ｉ
１分間の遠心を行い沈澱物を回収した後２００μｌの
８ＴＤ８緩衡液で４回洗浄した。
緩衡液８００μ／上に重層し１２．００Ｏｒｌ）ｍ Ｉ
１分間の遠心を行い沈澱物を回収した後２００μｌの
８ＴＤ８緩衡液で４回洗浄した。
上記沈澱物を５０μｊの緩衝液（６２，５ｍＭＴｒｉｓ
−Ｈｃｌ ｐＨ６，８、１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ 、
２．５％Ｓ Ｄ Ｓ 、 ２ｍＭ ２−ｍｅｒｃａ
ｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ 、 ５ｍＭＥＤＴＡ 、 ０．
００１％ＢＰＢ ）ｌｃ懸濁し１００’Ｃ。
−Ｈｃｌ ｐＨ６，８、１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ 、
２．５％Ｓ Ｄ Ｓ 、 ２ｍＭ ２−ｍｅｒｃａ
ｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ 、 ５ｍＭＥＤＴＡ 、 ０．
００１％ＢＰＢ ）ｌｃ懸濁し１００’Ｃ。
５分間の熱処理を行った後５ＤＳ−ポリアクリルアミド
（１５％）ゲル電気泳動を行いフルオログラフィーによ
って蛋白質を分析した。
（１５％）ゲル電気泳動を行いフルオログラフィーによ
って蛋白質を分析した。
その結果、図面８に示した如（、ＨＬＹ遺伝子を含む組
換え体Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｋ Ｋ ４（ＹＥ
ｐＨＬＹ −１） ＣＢ ）及びＳ、 ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅＫＫ ４ （ＹＥｐＨＬＹ −２） ［Ｃ）にの
みＨＬ Ｙ蛋白質に相当する１４．７にダルトンの蛋白
バンドが認められ、ＨＬＹ遺伝子を含まないＳ、 ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅＫＫ ４ （ＹＢｐ５１） （Ａ ］
には１４．７にダルトンの蛋白バンドは認められないこ
とからヒトリゾチーム遺伝子が発現している事が確認さ
れた。
換え体Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｋ Ｋ ４（ＹＥ
ｐＨＬＹ −１） ＣＢ ）及びＳ、 ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅＫＫ ４ （ＹＥｐＨＬＹ −２） ［Ｃ）にの
みＨＬ Ｙ蛋白質に相当する１４．７にダルトンの蛋白
バンドが認められ、ＨＬＹ遺伝子を含まないＳ、 ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅＫＫ ４ （ＹＢｐ５１） （Ａ ］
には１４．７にダルトンの蛋白バンドは認められないこ
とからヒトリゾチーム遺伝子が発現している事が確認さ
れた。
図面１は発現用組換えプラズミドＹＢｐＨＬＹ−１及び
ＹＥｐＨＬＹ−２の作成法を示した図である。 図面２はＹＢｐＨＬＹ−１及びＹＥｐＨＬＹ−２のＧＡ
Ｌ１０プロモーターと合成ＨＬＹ遺伝子間のＤＮＡ塩基
配列を示した図である。 図面８はヒトリゾチーム遺伝子の発現を示した電気泳動
の図である。 手続補正書（方式） 昭和６０年１０月４日 １、事件の表示 昭和６０年 特許願 第１３９７）０号２、発明の名称 ヒトリゾチームの微生物学的製造法 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 東京都千代田区霞が関−丁目３番１号 （１１４）工業技術院長 等々力 達 （ほか１名） ４、代理人 大阪市東区北浜５丁目１５番地 ５、補正命令の日付（発送日） ６、補正の対象 図面 ７、補正の内容 図面３に誤って不要な訂正印を押したので、訂正印を削
除する。
ＹＥｐＨＬＹ−２の作成法を示した図である。 図面２はＹＢｐＨＬＹ−１及びＹＥｐＨＬＹ−２のＧＡ
Ｌ１０プロモーターと合成ＨＬＹ遺伝子間のＤＮＡ塩基
配列を示した図である。 図面８はヒトリゾチーム遺伝子の発現を示した電気泳動
の図である。 手続補正書（方式） 昭和６０年１０月４日 １、事件の表示 昭和６０年 特許願 第１３９７）０号２、発明の名称 ヒトリゾチームの微生物学的製造法 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 東京都千代田区霞が関−丁目３番１号 （１１４）工業技術院長 等々力 達 （ほか１名） ４、代理人 大阪市東区北浜５丁目１５番地 ５、補正命令の日付（発送日） ６、補正の対象 図面 ７、補正の内容 図面３に誤って不要な訂正印を押したので、訂正印を削
除する。
Claims (7)
- （１）酵母細胞内で増殖可能であってかつ挿入された遺
伝子の転写、翻訳を可能にするプラズミドベクターの適
当な挿入部位に化学的に合成したヒトリゾチーム遺伝子
を挿入して当該宿主細胞中で増殖、発現可能な組換えプ
ラズミドを作成し、該宿主細胞を形質転換して得られた
形質転換体を適当な培地中で培養し産生されたヒトリゾ
チーム蛋白質を回収することからなるヒトリゾチームの
製造法。 - （２）ヒトリゾチーム遺伝子が下記のヌクレオチド配列
で表わされる構造遺伝子を含むヒトリゾチーム遺伝子で
ある特許請求の範囲第１項記載のヒトリゾチームの製造
法。 【遺伝子配列があります】 - （３）ヒトリゾチーム遺伝子が、構造遺伝子の５′端及
び３′端にそれぞれ翻訳開始信号ＡＴＧ及び２個の翻訳
終止信号ＴＡＡＴＧＡを有するヒトリゾチーム遺伝子で
ある特許請求の範囲第２項記載のヒトリゾチームの製造
法 - （４）プラズミドベクターが酵母のＧＡＬ１０プロモー
ターを含むプラズミドベクターである特許請求の範囲第
３項記載のヒトリゾチームの製造法 - （５）プラズミドベクターがＹＥｐ５１である特許請求
の範囲第４項記載のヒトリゾチームの製造法 - （６）組換えプラズミドがＹＥｐＨＬＹ−１である特許
請求の範囲第５項記載のヒドリゾチームの製造法 - （７）組換えプラズミドがＹＥｐＨＬＹ−２である特許
請求の範囲第５項記載のヒトリゾチームの製造法
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60139710A JPS626679A (ja) | 1985-06-26 | 1985-06-26 | ヒトリゾチ−ムの微生物学的製造法 |
| DE8686304951T DE3677421D1 (de) | 1985-06-26 | 1986-06-26 | Mikrobiologisches verfahren zur herstellung von menschlichem lysozym. |
| EP86304951A EP0208472B1 (en) | 1985-06-26 | 1986-06-26 | Microbiological process for production of human lysozyme |
| AT86304951T ATE60802T1 (de) | 1985-06-26 | 1986-06-26 | Mikrobiologisches verfahren zur herstellung von menschlichem lysozym. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60139710A JPS626679A (ja) | 1985-06-26 | 1985-06-26 | ヒトリゾチ−ムの微生物学的製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS626679A true JPS626679A (ja) | 1987-01-13 |
Family
ID=15251613
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60139710A Pending JPS626679A (ja) | 1985-06-26 | 1985-06-26 | ヒトリゾチ−ムの微生物学的製造法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0208472B1 (ja) |
| JP (1) | JPS626679A (ja) |
| AT (1) | ATE60802T1 (ja) |
| DE (1) | DE3677421D1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62163692A (ja) * | 1985-11-12 | 1987-07-20 | ベ−リンガ− インゲルハイム インタ−ナシヨナル ゲゼルシヤフト ミツト ベシユレンクテル ハフツンク | ヒトリゾチ−ム蛋白質 |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3587307T2 (de) * | 1984-12-06 | 1993-09-02 | Fina Research | Transformierte hefen die lysozym produzieren, fuer diese transformation zu verwendende plasmide und deren verwendung. |
| TW205070B (ja) * | 1986-06-30 | 1993-05-01 | Takeda Pharm Industry Co Ltd | |
| NO177065C (no) * | 1988-09-26 | 1995-07-12 | Labofina Sa | Framgangsmåte for framstilling av enzymatisk aktivt humant lysozym |
| CN104278017A (zh) * | 2013-07-11 | 2015-01-14 | 上海万特医药科技有限公司 | 一种重组表达人溶菌酶的方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61158793A (ja) * | 1984-11-14 | 1986-07-18 | Takeda Chem Ind Ltd | ヒト・リゾチ−ムの合成遺伝子 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0155189A3 (en) * | 1984-03-16 | 1987-09-16 | Genentech, Inc. | Expression of cell wall degrading proteins and host cells harboring dna encoding such protein |
-
1985
- 1985-06-26 JP JP60139710A patent/JPS626679A/ja active Pending
-
1986
- 1986-06-26 EP EP86304951A patent/EP0208472B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-06-26 DE DE8686304951T patent/DE3677421D1/de not_active Revoked
- 1986-06-26 AT AT86304951T patent/ATE60802T1/de not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61158793A (ja) * | 1984-11-14 | 1986-07-18 | Takeda Chem Ind Ltd | ヒト・リゾチ−ムの合成遺伝子 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62163692A (ja) * | 1985-11-12 | 1987-07-20 | ベ−リンガ− インゲルハイム インタ−ナシヨナル ゲゼルシヤフト ミツト ベシユレンクテル ハフツンク | ヒトリゾチ−ム蛋白質 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3677421D1 (de) | 1991-03-14 |
| ATE60802T1 (de) | 1991-02-15 |
| EP0208472A1 (en) | 1987-01-14 |
| EP0208472B1 (en) | 1991-02-06 |
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