JPS63169994A - 組換え宿主によつて生成された膵臓分泌トリプシン阻害剤およびその変異型、方法、発現ベクターおよびそのための組換え宿主およびその製薬学的使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒト膵臓分泌トリプシン阻害剤（ｈ−ＰＳＴ
Ｉ）のアミノ酸配列を有する、微生物的に生産されたペ
プチドに関する。本発明は、さらに、もとの配列中のア
ミノ酸の１または２以上が他のアミノ酸によって置換さ
れている、このようなペプチドの変異型に関する。これ
らのペプチドは、それらの阻害作用において有利に変更
された特異性を示す。ペプチド類の調製法およびそれら
の製薬学的使用を、また、説明する。

多形核の顆粒球からのりソソームのエラスターゼ（白血
球エラスターゼ）、Ｊ、Ｇ、　ビ・−ス（Ｂｉｅｔｈ）
　　（１９８６）　２１７−３２０ページ［レギュレイ
ション・オブ・マｉ・リツクス・アキュムンイション（
Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｍａｔｒｉｘ　　Ａ
ｃｃｕｍｌａｔｉｏｎ）、メカム（Ｍ　ｅｃｈａｍ）編
、アカデミツク・プレス（Ａ　ｃａｄｅｍｉｃ　　Ｐ　
ｒｅｓｓ）　、オーランド（Ｏｒｌａｎｄ）　１は、効
力のある細胞内プロテアーゼであり、リソソーム中に貯
蔵され、そしてファゴリソソーム中においてその生理学
的機能の細胞内蛋白質破壊を遂行する。リソソームプロ
テアーゼの主要な機能的役割（エラスターゼ、カテブシ
ンＧなど；Ｈ，フリッノ（Ｆ　ｒｉＬｚ）ら（１９８４
）［臨床酵素学における選択したトピックス（Ｓ　ｅｌ
ｅｃｔｅｄＴｏｐｉｃｓ　　ｉｎ　　Ｃ１１ｎｉｃａｌ
　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、ゴールドバーブ（Ｇ　ｏ
ｌｄｂｅｒｇ）および・クエルナー（Ｗ　ｅｒｎｅｒ）
編、ワルター・デ・グルイタ−（Ｇ　ｒｕｙｔｅｒ）、
ベルリン（Ｂｅｒｌｉｎ）　ｖｏｌ、　２．３０５−３
２８ページ）は、有機体自体（例えば、代謝生成物、傷
を受けた組織）からあるいは侵入性有機体（例えば、バ
クテリア、ウィルス、かびなど）の食作用を受けた（　
ｐｈａｇｏｃｙｔ　１ｚｅｄ）物質のデグラデーション
（ｄｅｇｒａｄａｔ　１ｏｎ）である。

細胞外（血液または間質性流体）中に解放されると、エ
ラスターゼは、血漿中において効力のある内因性阻害剤
、例えば、α、−ＰＩ（α１−プロテアーゼ阻害剤；Ｊ
、ｌ−ラビス（Ｔｒａｖｉｓ）およびＧ、Ｓ、サルベー
セン（Ｓ　ａｌｖｅｓｅｎ）、（１９８３）、Ａｎｎ、
　　・Ｒｅｖ、　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　ｐ、６５５−
７０９］、および／または粘膜の分泌物中において杭内
血球プロテアーゼ（いわゆるＨＵＳＩ−１，ヒト精液プ
ロテアーゼ阻害剤；Ｈ，ジ−スラー（Ｓ　ｃｈｉｅｓｓ
ｌｅｒ）ら（１９７８）ｐ、−１９５−２０７、ヒト多
形核白血球の中性プロテアーゼ（Ｎｅｕｔｒａｌ　　Ｐ
　ｒｏｔｅａｓｅｓ　　ｏｆ　　Ｈｕｍａｎ　　Ｐ　ｏ
ｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ　　Ｌｅｕｋｏｃｙｔ
ｅｓ）　、ヘイブマン（Ｈａｖｅｍａｎ）およびジヤツ
ク（Ｊ　ａｎｏｆｆ）　ｌ１ｉｓアーバン・アンド―シ
ュワルゼンバーグＣＵ　ｒｂａｎ　　＆　　Ｓ　ｃｈｗ
ａｒｚｅｎｂｅｒｇ）　、バルチモア］によって急速に
結合される。

遺伝のσ、−ＰＩの欠乏のため［Ｊ、Ｂ、ピース（Ｂ　
１ｅｔｈ）、ｌ　９８６］あるいはエラスターゼの大量
の細胞外放出の結果［急性および慢性の炎症、多数の外
傷またはショックにおいて；Ｈ，フリッツ（Ｆ　ｒｉｔ
ｚ）ら、１９８４］、天然プロテアーゼ阻害剤によるエ
ラスターゼの退化的ポテンシャル（ｄｅｇｒａｄａｔｉ
ｖｅ　　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）に対する有機体の保護は
不十分である。内因性プロテアーゼ阻害剤の過度の消費
および局所的な全体にさえ及ぶ消費は、（ｉ）エラスタ
ーゼとの複合体の形成、（ｉｉ）種々のりソソームのプ
ロテアーゼによる蛋白質分解的不活性化、および（ｉｉ
ｉ）とくに酸化的不活性化（α＋ｐｒ）によって生ずる
［Ｊ、Ｂ、ピース（Ｂ　１ｅｔｈ）、（１９８６）；Ｈ
，フリッツ（Ｆｒｉｔｚ）ら、（１９８４）；Ｊ、ｌ−
ラビス（Ｔ　ｒａｖｉＳ）およびＧ、Ｓ、サルベーセン
（Ｓ　ａｌｖｅｓｅｎ）、（１９８３）；上を参照］。

結果は結合組織の過度の蛋白質分解的デグラデーション
、ならびに凝固因子、ブイプリン溶解因子および補体因
子を包含する体液性蛋白質のエラスターゼおよび他のり
ソソームのプロテアーゼ（例えば、カテプシンＧ）によ
る過度の蛋白質分解的デグラデーションであり、重い臨
床的症候、例えば、気腫、ショック肺、大人の呼吸困難
症候群、凝固傷害、腎臓および肝臓の不全などに導く　
［上の文献に加えて、次の文献を参照：ノイエ・ウェッ
ジ・イン・デル・エントズングスジアグノスチク（Ｎｅ
ｕｅ　　Ｗｅｇｅ　　ｉｎ　　ｄｅｒ　　Ｅｎｔｚｕｎ
ｄｕｎｇｓｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ）　、ＰＭＮ　　エラ
スターゼ；Ｍ、ジョチャム（Ｊ　ｏｃｈｕｍ）ら（編）
、（１９８５）、ＧＩＴフェルラーグ（Ｖｅｒｌａｇ）
　、ダームシュタット；Ｃ，Ｔ、　　リー（Ｌ　ｅｅ）
ら、（１９８１）、ニュー・イングランド・ジャーナル
・オブ・メディシン（Ｎ、　　Ｅｎｇｌ、　　Ｊ、　　
Ｍｅｄ、）、３０４．１９２−１９５；ｗ、ｗ、マクグ
イヤー（ＭｃＧｕｉｒｅ）ら、（１９８２）、ジャーナ
ル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊ、
　　Ｃ１１ｎ。

Ｉ　ｎｖｅｓｔ、）　、６９．５４３１　。

エラスターゼは、また、リウマチ性関節炎、例えば、結
合組織の構成成分のデグラデーション、に進ケする局所
的炎症の事象の一因となる［Ｋ。

クリーシイク（Ｋ　１ｅｅｓｉｅｋ）ら（１９８５）、
ノイエ・ウェッジ・イン・デル・エントズングスジアグ
ノスチク（Ｎｅｕｅ　　Ｗｅｇｅ　　ｉｎ　　ｄｅｒ　
　ＥｎｔｚＬｌｎｄｕｎｇｓｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ）　
、ＰＭＮ　　エラスターゼ、ｐ。

７１−８２１゜ 重い傷を受けた後の、あるいは敗血症ショック、ショッ
ク肺などのような病気における、エラスターゼの細胞外
放出は、酵素イムノアッセイによって日常的に監視でき
る［Ｓ、ノイマン（Ｎ　ｅｕｍａｎｎ）およびＭ、ジョ
チャム（Ｊ　ｏｃｈｕｍ）　、（１９８４）、ｐ、１８
４−１９５、酵素分析の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓｏｆ　　
Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　　Ａｎａｌｙｓｉｓ）　、ベルグ
メイヤ−（Ｂ　ｅｒｇｍｅｙｅｒ）　　（編）、フエル
ラーグ・ヘミ−（Ｖｅｒｌａｇ　　Ｃｈｅｍｉｅ）　、
ワインハイム］。

セプシスおよび気腫の実験的モデルにおいて、合成エラ
スターゼ阻害剤［Ｊ、Ｃ，バワーズ（Ｐｏｗｅｒｓ）　
％アメリカン・リビュー・オブ・レスビレイタリー・デ
ィシーズ（Ａｍ、　　　Ｒｅｖ、　　　Ｒａ５ｐｉｒ、
　　Ｄｉｓ、　）、（１９８３）、１２７．５５４−５
５８１および動物からの天然阻害剤、例えば、ニグリン
Ｃ［Ｈ，Ｐ、シュネブリ（Ｓ　ｃｈｎｅｂｌｉ）ら、（
１９８５）、ユーロピアン・ジャーナル・オブ・レスピ
レイタリー・ディシーズ（Ｅｕｒ。

Ｊ　、　　Ｒｅ５ｐｉｒ、　　Ｄｉｓ、　）　、６６．
５ｕｐｐｌ。

１３９　　ｐ、６６−７０］　は、治療学的に有用であ
ることが証明された。ヒト起源のプロテアーゼ阻害剤の
適用は、毒性の副作用、ことに延長された治療が、例え
ば、α、−ＰＩ欠乏（気腫）の処置において指示される
とき、アレルギー性反応を回避するたＱめに、好ましい
であろう。ヒトα１−ＰＩは高分子量の糖蛋白質である
ので、遺伝子技術による十分な量のその生産は近い将来
において不可能であろう。

杭内血球プロテアーゼすなわちＨＵＳＩ−Ｉ　　［Ｈ、
ジ−スラー（Ｓ　ｃｈｉｅｓｓｌｅｒ）ら、１９７８；
およびＵ、シーミュラー（Ｓ　ｅｅｍＬｉｌｌｅｒ）ら
（１９８５）ＦＥＢＳ　　レターズ（Ｌ　ｅｔｔｅｒｓ
）、１９９．４３−４８１　は、１４，０００ダルトン
の分子量を有し、そして２つの活性ドメインから成り、
その一方はエラスターゼに対して向けられ、そして他方
はトリプシンに対して向けられている。それゆえ、この
タイプの阻害剤は比較的低い選択性を有し、そして特異
的なエラスターゼ阻害剤ではない。トリプシンまたはト
リプシン様酵素の阻害は、通常上に記載した適用におい
て意図されない。

ヒト膵臓はＰＳＴＩ、すなわち、低分子量（６゜２ｋｄ
）のプロテアーゼ阻害剤を分泌し、それはトリプシンを
特異的に阻害する、すなわち、それはブチアーゼの１つ
の特定のタイプに対して高い選択性を有する。

本発明において提供される１つの利点は、ＰＳＴＩ中の
１つ（または数個）のアミノ酸のみを組換えＤＮＡ技術
によって置換してＰＳＴＩ変異型を生成することにあり
、これらの変異型は白血球エラスターゼに対して高い特
異性を有する、高度に有効なプロテアーゼ阻害剤である
ことが示された。その上、その低い分子量のため、エラ
スターゼＰＳＴＩ誘導複合体は腎臓を同様によく通過す
るであろう。したがって、細胞外に放出されたエラスタ
ーゼの排除は高度に効率的であろう。ＰＳＴｌはヒト起
源であるという事実は、その低い分子量と一緒になって
、ＰＳＴＩ誘導体を免疫系が異質蛋白質として認識する
ことによる合併症を、これらの誘導体の適用は回避する
であろうという期待される。

α、−ＰＩおよび杭内血球プロテアーゼ類と比較したＰ
ＳＴＩの他の本質的な利点は、強い酸化剤が生成さかつ
細胞外に放出される、炎症の過程の間における、酸化的
不活性化に対してＰＳＴ、Ｉが不感受性であるというこ
とである。結局、α１−ＰＩおよび杭内血球プロテアー
ゼ類に比較して、ＰＳＴＩ誘導体類の低い投与量は、同
様な保護的作用を達成するために十分であろう。

したがって、本発明の１つの目的は、プロテアーゼ阻害
活性を有し、好ましくは改良された特異性および／また
は改良された阻害効能を有する、製薬学的に有用なペプ
チド類を提供することである。前記ペプチド類は、組換
えＤＮＡ技術によって生成された、膵臓分泌トリプシン
阻害剤（ＰＳＴｌ）の配列を有するペプチド類およびそ
れらの変異型である。用語「変異型（ｖａｒｉａｎｔｓ
）　Ｊは、親配列中のアミノ酸の１または２以上が天然
に産出するアミノ酸の他のものによって置換された、ペ
プチド類を呼ぶ。親配列として、ヒト膵臓トリプシン阻
害剤（ｈ−ＰＳＴＩ−ＰＳＴＩ　　Ｏ）の配列を使用す
る。アミノ酸の置換にかけるべき好ましい位置は、ペプ
チド中の位置１７．１８．１９．２０．２１２９．３２
および３６である。

より詳しくは、本発明は、次のアミノ酸からなるＰＳＴ
Ｉ　　Ｏの配列（Ｌ、Ｊ、グリーン（Ｇ　ｒｅｅｎｅ）
、１９７６、酵素学における方法（ＭｅｔｈｏｄｓＥｎ
ｚｙｍｏｌ、’）　、４５．８１３−８２５に報告され
ているような〕を本質的に有するペプチド類に関する： 位置１３におけるＧｌｕ、ＡｓｐまたはＬ　ｅｕ、位置
１４におけるＧｌｕＳＡｓｐまたはＡ　ｓｎ、位置１７
におけるＴｈｒ、　　Ｐｒｏ、Ｓ　ｅｒｓ　Ａ　ｒｇ、
　Ｌ　ｅｕまたはＭｅｔ。

位置１８におけるＬｅｕ、　Ｍｅｔ、　Ｖａｌ、　Ｇ１
ｎ５　Ｓｅｒ。

ＡｌａＳＴｈｒ、　　Ｉ　１ｅＳＴｙｒ、　　Ｐｈｅ、
　　Ａｒｇ、　　ＴｒｐまたはＬｙｓ、位置１９におけ
るＧ　ＩｕＳＡ　ｓｐ、　Ｌ　ｅｕまたはＩｌｅおよび
位置２０におけるＴ　ｙｒ、　Ｐ　ｈｅ、　Ａ　５ｐｓ
Ａ　ｓｎ、　Ｌ　ｅｕ、　Ｇ　Ｉｕ、　Ｇ　Ｉｎ、　Ｈ
ｉｓまたはＡ　ｒｇ、位置２１におけるＧｌｕ、　Ａｒ
ｇｓ　Ｍｅｔ、　Ｐｈｅ、　ＬｙｓＳＶａｌ、Ｔ　ｈｒ
ＳＧ　ｉｎ、　Ｌ　ｅｕｓ　Ａ　ＳｐまたはＡ　ｓｎ、
位置２９におけるＬ　ｙｓｓ　Ｇ　ｌｕ、　　Ｉ　ｌｅ
、　Ｇ　ＩｎＸＡ　ＳｐまたはＡＳｎｘ位置３２におけ
るＰ　ｒｏＳＧ　ｌｙ、　Ｓ　ｅｒｓ　Ａ　ｓｎ。

Ａ　ｌａ、　Ａ　ｓｐ、　Ｖ　ａｌ、　Ａ　ｒｇまたは
Ｈｉｓおよび位置３６におけるＡｓｎ、　Ａｓｐ、　Ａ
ｌａ、　５ｅｒＳＧｌｙｑ　ＴｙｒｓＶａｌまたはＧｌ
ｕのアミノ酸、ただしＬｅｕ＋３−Ａｓｎ”　−Ｔｈｒ
”　−Ｌ　ｙｓ”　−Ｉ　ｌｅ”　−Ｔｙｒ”°−Ａｓ
ｎ”−Ａｓｐ”−Ｐｒｏ”−ＶａｌｏおよびＬｅｕ１３
−Ａｓｎ”−ＴｈｒＩ７−　Ｌｙｓ”　−Ｉ　Ｉｅ”　
−Ｔｙｒ”　−Ａｓｐ”　−Ａｓｎ”　−Ｐ　ｒｏ”　
−Ｖａ１３６の組み合わせを除外する。

下表１は変異型のいくつかを示し、位置３２および３６
におけるアミノ酸が、それぞれ、プロリンおよびバリン
である場合、ＰＳＴＩ　　Ｏは親配列である。

表１に開示する変異型は、位置３２および３６において
上に列挙するアミノ酸によって、さらに変化させること
ができる。

本発明は、また、位置−１にメチオニンまたは先導ペプ
チドをさらに含有する、上に概説した配列を有するペプ
チドに関する。本発明に関連して用語「先導ペプチド」
は、発現生成物の分泌を促進するシグナル配列［Ｓ、Ｄ
、エムル（Ｅ　ｍｒ）ら、細胞生物学雑誌（Ｊ　、　　
ｏｆ　　Ｃｅ１ｌ　　Ｂｉｏｌ、　）、１９８０．８６
、ｐ、７０１−７１１］　を意味するばかりでなく、か
つまたＰＳＴＩ配列の前にシグナル配列およびリンカ−
配列を含有するペプチドを意味する。

ＰＳＴＩ　　ＯＴｈｒ　　Ｌｙｓ　　Ｉｌｅ　　Ｔｙｒ
　　Ａｓｎ　　ＡｓｐＰＳＴＩ　　Ｉ　　Ｔｈｒ　　Ｌ
ｅｕ　　Ｉｌｅ　　Ｔｙｒ　　Ａｓｎ　　ＡｓｐＰＳＴ
Ｉ　　２　　Ｔｈｒ　　Ｌｅｕ　　ＩＩｓ　　Ｔｙｒ　
　Ａｓｐ　　ＡｓｎＰＳＴＩ　　３　　Ｔｈｒ　　Ｔｙ
ｒ　　Ｇｌｕ　　Ｔｙｒ　　Ａｒｇ　　ＡｓｐＰＳＴＩ
　　４　　　Ｔｈｒ　　　Ｌｅｕ　　　Ｇｌｕ　　　Ｔ
ｙｒ　　　Ａｒｇ　　　ＡｓｐＰＳＴＩ　　５　　　Ｔ
ｈｒ　　　Ｖａｔ　　　Ｇｌｕ　　　Ｔｙｒ　　　Ａｒ
ｇ　　　ＡｓｐＰＳＴＩ　　６　　　Ｔｈｒ　　　Ｌｅ
ｕ　　　Ｇｌｕ　　　Ｔｙｒ　　　Ａｓｎ　　　Ａｓｐ
ＰＳＴＩ　　７　　　Ｔｈｒ　　　Ｌｅｕ　　　Ｉｌｅ
　　　Ｔｙｒ　　　Ａｒｇ　　　ＡｓｐＰＳＴＩ　　８
　　　Ｔｈｒ　　　Ｖａｌ　　　Ｇｌｕ　　　Ｌｅｕ　
　　Ａｓｎ　　　ＡｓｐＰＳＴＩ　　９　　　Ｔｈｒ　
　　Ｖａｌ　　　Ｇｌｕ　　　Ｌｅｕ　　　Ａｒｇ　　
　ＡｓｐＰＳＴＩＩＯＰｒｏ　　　Ｌｙｓ　　　Ｉｌｅ
　　　Ｔｙｒ　　　Ａｓｐ　　　ＡｓｎＰＳＴＩＩＩ　
　　Ｐｒｏ　　　Ｌｅｕ　　　Ｇｌｕ　　　Ｔｙｒ　　
　Ａｒｇ　　　ＡｓｐＰＳＴ１１２　　　Ｐｒｏ　　　
Ｖａｌ　　　Ｇｌｕ　　　Ｔｙｒ　　　Ａｒｇ　　　Ａ
ｓｐＰＳＴ１１３　　　Ｔｈｒ　　　Ｉｌｅ　　　Ｇｌ
ｕ　　　Ｔｙｒ　　　Ａｓｎ　　　ＡｓｐＰＳＴ１１４
　　　Ｔｈｒ　　　Ａｒｇ　　　Ｇｌｕ　　　Ｔｙｒ　
　　Ａｓｎ　　　ＡｓｐＰＳＴｌ１５　　　Ｔｈｒ　　
　Ｐｈｅ　　　Ｇｌｕ　　　Ｔｙｒ　　　Ａｓｎ　　　
ＡｓｐＰＳＴＩ１６　　　Ｔｈｒ　　　Ａｌａ　　　Ｇ
ｌｕ　　　Ｔｙｒ　　　Ａｓｎ　　　ＡｓｐＰＳＴＩ１
７　　　Ｔｈｒ　　　Ｖａｔ　　　ｌｉｅ　　　Ｔｙｒ
　　　Ａｓｎ　　　ＡｓｐＰＳＴ１１８　　　Ｔｈｒ　
　　ｌｉｅ　　　ｌｌｅ　　　Ｔｙｒ　　　Ａｓｎ　　
　ＡｓｐＰＳＴ＋１９　　　Ｔｈｒ　　　Ｖａｔ　　　
Ｉｌｅ　　　Ｔｙｒ　　　Ａｓｐ　　　ＡｓｎＰＳＴＩ
２０　　　Ｔｈｒ　　　ｌｌａ　　　Ｉｌｅ　　　Ｔｙ
ｒ　　　Ａｓｐ　　　ＡｓｎＰＳＴ＋２１　　　Ｔｈｒ
　　　Ｉｌｅ　　　Ｇｌｕ　　　Ｔｙｒ　　　Ａｒｇ　
　　ＡｓｐＰＳＴＩ２２　　　Ｔｈｒ　　　Ｔｙｒ　　
　Ｉｌｅ　　　Ｔｙｒ　　　、Ａｓｎ　　　ＡｓｐＰＳ
ＴＩ２３　　　Ｔｈｒ　　　Ｐｈｅ　　　Ｉｌｅ　　　
Ｔｙｒ　　　Ａｓｎ　　　ＡｓｐＰＳＴＮ２４　　　Ｔ
ｈｒ　　　Ｌｙｓ　　　Ｇｌｕ　　　Ｔｙｒ　　　Ａｒ
ｇ　　　Ａｓｐ本発明は、また、前記ペプチドの遺伝情
報を指定する（ｃｏｄｉｎｇ　　ｆｏｒ）　Ｄ　Ｎ　Ａ
に関する。とくに、本発明は、次の配列を有する、以後
「マスター遺伝子」と呼ぶＤＮＡおよびその機能的同等
体に関する： Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ａ
ｌａ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　ＴＹｒ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｌｅ
ｕ　Ａｓｎ　ＧｌｙＴｈｒ　Ｓｅｒ　ｌｉｅ　Ｌｅｕ　
ｌｉｅ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｃ
ｙｓ　帯・拳１８６醇竺愚 「機能的同等体」は、上のＤＮＡ配列の誘導体が、また
、同一蛋白質の発現に有用でありうることを意味する。

当業者に知られているように、あるコドンにおいて、所
定の蛋白質中に組込むべきアミノ酸に作用を存さない他
の塩基によって、塩基の１１または２、または３を置換
することができる。

ペプチドを生成するために、マスター遺伝子を、ＤＮＡ
技術によって、特定の位置におけるアミノ酸のためのコ
ドンが他のアミノ酸のためのコドンで置換されるような
方法で、修飾する。本発明による変異型ペプチドの１つ
の遺伝情報を指定するＤＮＡを得るために、位置１７．
１８．１９．２０．２１．２９．３２および３６におけ
るアミノ酸のためのコドンを他のコドンで置換すること
ができる。

このような置換において好ましいコドンは、上に列挙し
たアミノ酸の遺伝情報を指定するコドンである。用いる
発現系に依存して、本発明のＤＮＡは、また、先導ペプ
チドの遺伝情報を指定する配列を上流にさらに有する、
上のペプチドの１つの遺伝情報を指定するＤＮＡである
ことができる。

本発明の他の目的は、本発明のペプチドの１つの遺伝情
報を指定するＤＮＡからなる、また、プラスミドと呼ぶ
発現ベクターである。このプラスミドは宿主有機体の形
質転換のために使用する。

本発明は、また、このような形質転換された微生物に関
する。形質転換に適当な、多数の種々の微生物がこの分
野において知られている。このプラスミドの性質は、主
として、使用すべき宿主有機体に依存する。

本発明のＤＮＡからなるプラスミドで形質転換された宿
主有機体は、上のペプチドおよびその変異型の生成に使
用される。生成は、工程ａ）適当な条件下に宿主有機体
を培養し、ｂ）前記培養物からペプチドを回収し、そし
てＣ）前記ペプチドを精製する、 からなる。

ペプチドの精製は、蛋白質化学の既知の方法により、例
えば、沈殿、クロマトグラフィーおよび電気泳動によっ
て達成することができる。前述のリンカ−ペプチドはこ
のような精製のためにすぐれた道具であることができる
。なぜなら、それは精製ハンドルとして有利に使用でき
るからである。

例工ば、リンカ−ペプチドが主として塩基性または酸性
のアミノ酸からなる場合、イオン交換クロマトグラフィ
ーは発現された生成物の精製において非常に有用である
ことがある。

本発明は、まｔ；、上に概説したペプチドを含んでなる
製薬学的組成物および調製物ならびに製薬学的組成物の
調製における前記ペプチドの使用に関する。このような
組成物は、前述の適用に非常に有用である。

このような製薬学的調製物は、無毒の不活性な製薬学的
に適当な賦形剤に加えて、本発明による化合物の１種ま
たは２種以上を含有するか、あるいは本発明による活性
化合物の１種または２種以上から成る。

本発明は、また、投与単位の形態の製薬学的調製物を包
含する。これは、製薬学的調製物が個々の部分の形態、
例えば、錠剤、被覆された錠剤、カプセル剤、ピノ呟坐
薬およびアンプル剤の形態であることを意味し、その活
性化合物の含量は個々の投与量の数分の１あるいは多数
倍に相当する。

投与単位は、例えば、１．２．３または４倍の個々の投
与量、あるいは個々の投与量の１／２、ｌ／３またはｌ
／４を含有することができる。個々の投与量は、好まし
くは、１回の投与で与えられかつ通常１日量の全部、半
分または３分の１または４分の１に相当する量の活性化
合物を含有する。

無毒の不活性の製薬学的に適当な賦形剤とは、すべての
種類の固体、半固体または液体の希釈剤、充填剤および
配答助剤であると解釈すべきである。

錠剤、被覆された錠剤、カプセル剤、ビル、丸剤、坐薬
、溶液、懸濁液および乳濁液、泥膏、軟膏、ゲノ呟　ク
リーム、ローション、粉末およびスプレーを好ましい製
薬学的調製物として述べることができる。

錠剤、被覆された錠剤、カプセル剤および顆粒剤は、活
性化合物の１種または２種以上を、次の普通の賦形剤と
一緒に含有できる：（ａ）充填剤および増量剤、例えば
、澱粉、ラクトース、グルコース、マンニトールおよび
シリカ、（ｂ）結合剤、例えば、カルボキシメチルセル
ロース、アルギン酸塩類、ゼラチンおよびポリビニルピ
ロリドン、（ｃ）保湿剤、例えば、グリセロール、（ｄ
）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウムおよび重炭酸
ナトリウム、（ｅ）溶解遅延剤、例えば、パラフィン、
および（ｆ）吸収促進剤、例えば、第四アンモニウム化
合物、（ｇ）湿潤剤、例えば、セチルアルコールまたは
グリセロールモノステアレート、（！１）吸着剤、例え
ば、カオリンおよびベントナイト、および（ｉ）潤滑剤
、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリ
ン酸マグネシウムおよび固体のポリエチレングリコール
、または上の（ａ）〜（ｉ）に記載した物質の混合物。

錠剤、被覆された錠剤、カプセル剤、ピルおよび顆粒剤
は、普通の被膜および外殻を含有することができ、これ
らは不透明化剤を含むことができ、そして、また、活性
化合物の１種または２種以上のみを、あるいは優先的に
、腸管の特定の部分において、必要に応じて遅延した方
法で、放出するような組成物であることができ、ここで
使用できる埋め込み組成物の例はポリマー物質およびワ
ックスである。

活性化合物の１種または２種以上は、必要に応じて前述
の賦形剤の１種または２種以上と一緒に、マイクロカプ
セル化した形態にすることもできる。

坐薬は、活性化合物の１種または２種以上に加えて、普
通の水溶性または水不溶性の賦形剤、例えば、ポリエチ
レングリコール、脂肪、例えば、カカオ脂肪、高級エス
テル、（例えば、Ｃｌ４−アルコールとＣｌ８−脂肪酸
とのエステル）またはこれらの物質の混合物を含有する
ことができる。

軟膏、泥膏、クリームおよびゲルは、活性化合物の１種
または２種以上に加えて、普通の賦形剤、例えば、動物
性および植物性の脂肪、ワックス、パラフィン、澱粉、
トラガカント、セルソース誘導体、ポリエチレングリコ
ール、シリコーン、ベントナイト、シリカ、タルクおよ
び酸化亜鉛またはこれらの混合物を含有することができ
る。

散剤およびスプレーは、活性化合物の１種または２種以
上に加えて、普通の賦形剤、例えば、ラクトース、タル
ク、シリカ、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムお
よびポリアミド粉末またはこれらの物質の混合物を含有
することができる。スプレーは、慣用の噴射剤、例えば
、クロロフルオロ炭化水素をさらに含有することができ
る。

溶液および乳濁液は、活性化合物の１種または２種以上
に加えて、慣用の賦形剤、例えば、溶媒、可溶化剤およ
び乳化剤、例えば、水、エチルアルコール、イソプロピ
ルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアル
コール、安息香酸ヘンシル、プロピレングリコール、１
．３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油
、ことに綿実油、落花生油、トウモロコシ肝油、オリー
ブ油、ヒマシ油およびごま油、グリセロール、グリセロ
ールホルマール、テトラヒドロフルフリルアルコール タンの脂肪酸エステル、またはこれらの混合物を含有す
ることができる。

非経口的投与のために、溶液および乳濁液は、また、血
液と等張性の無菌の形態にすることができる。

懸濁液は、活性化合物の１種または２種以上に加えて、
慣用の賦形剤、例えば、液状希釈剤、例えば、水、エチ
ルアルコールまたはプロピレングリコール、懸濁剤、例
えば、エトキシル化インステアリルアルコール、ポリオ
キシエチレンソルビトールおよびソルビタンのエステル
、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベン
トナイト、寒天およびトラガカント、またはこれらに混
合物を含有することができる。

前述の配合形態は、また、染料、防腐剤および、芳香お
よび風味を改良する添加剤、例えば、ペパーミント油お
よびユーカリ油、および甘味剤、例えば、サッカリンを
含有することができる。　　、治療学的に活性な化合物
は、好ましくは、前述の製薬学的調製物中に、全混合物
の約０．１〜９９．５重量％、好ましくは約０．５〜９
５重量％の量で存在する。

前述の製薬学的調製物は、また、本発明による化合物に
加えて、他の製薬学的に活性な化合物を含有することが
できる。

前述の製薬学的調製物は、既知の方法に従い通常の方法
で、活性化合物の１種または２種以上を賦形剤の１種ま
たは２種以上と混合することによってつくられる。

活性化合物または製薬学的調製物は、局所的、経口的、
非経口的、腹腔内および／または経直腸的に、好ましく
は経２的または非経口的に、例えば、静脈内または筋肉
内に投与することができる。

一般に、人間の医学および獣医学において、所望の結果
を得るためには、本発明による活性化合物の１種または
２種以上を２４時間毎に約０．５〜約５００　ｍｇ／　
ｋｇ体重、好ましくは５−１００ｍｇ／ｋｇ体重の合計
量で、適当ならば数回に分けて投与することが有利であ
ることがわかった。個々の投薬物は、好ましくは、本発
明による活性化合物の１種または２種以上を約１〜約２
５０　ｍｇ／　ｋｇ体重、とくに３〜６０ｍｇ／ｋｇ体
重の量で含有する。

しかしながら、前述の投薬量からはずれなければならな
いことがあり、特にそのことは処置すべき患者の性質お
よび体重、病気の性質および重さ、調製物の性質および
薬剤の投与方法、投与を行う時間または間隔に依存する
。

かくして、ある場合には、活性化合物は前述の量よりも
少量で十分であり、−力値の場合には前記量を超えなけ
ればならない場合も起こるであろう。必要な特定の最適
な投与量および活性化合物の投与方法は、この分野に精
通するものにとっては、その専門知識に基づき容易に決
定することができる。

ＰＳＴＩは膵臓から分離することができるが、ことにヒ
ト起源のこのようなＰＳＴＩは大量で入手することがで
きない。

したがって、組換えＤＮＡおよび関連する技術は、必要
な大量の高品質のｈ−ＰＳＴＩおよびこのようなペプチ
ドの変異型を得る有効な方法であろうことが考えられた
。組換えバクテリア中の異質蛋白質の生成は、多くの場
合に見出される既知の不安定性に照してつまらないこと
ではない［Ｂ。

Ｅ、バターワース（Ｂ　ｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ）および
Ｂ、Ｄ。

コバント（Ｋ　ｏｖａｎｔ）　　：ウイルス学雑誌（Ｊ
。

Ｖｉｒｏｌ、　）　、上１、　（１９８４）、２８２−
２９１、Ｄ、Ｖ、ゲラデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）ら：プロ
シーデインダス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ
・サイエンシズ（Ｐ　ｒｏｃ、　　Ｎ　ａｔｎ、　　Ａ
　ｃａｄ。

Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、７６、　（１９７９）、１ｏａ−１
１０、Ｍ、イノウニ（Ｉ　ｎｏｙｅ）も、「核酸の研究
における将来（Ｔ　ｈｅ　　ｆｕｔｕｒｅ　　ｉｎ　　
ｎｕｃｒｅｉｃａｃｉｄ　　ｒｅｓｅａｒｃｈ）　Ｊ、
１、ワタナベ（Ｗａｔａｎａｂｅ）編、（東京、アカデ
ミツク・プレス）、（１９８３）］。不安定性は、とく
に、比較的短い鎖長を有するペプチドの発現において問
題である。

ヒト膵臓はＰＳＴＩ、すなわち、低分子量（６゜２　ｋ
ｂ）のプロテアーゼ阻害剤を分泌し、このＰＳＴＩはト
リプシンを特異的に阻害する、すなわち、それはプロテ
アーゼの１つのタイプに対して高い選択性を有する。

本発明において提供される１つの利点は、ＰＳＴ【中の
１つ（または数個）のアミノ酸のみを組換えＤＮＡ技術
によって置換してＰＳＴＩ変異型を生成することにあり
、これらの変異型は白血球エラスターゼに対して高い特
異性を有する、高度に有効なプロテアーゼ阻害剤である
ことが示された。その上、その低い分子量のため、エラ
スターゼＰＳＴＩ誘導複合体は腎臓を同様によく通過す
るであろう。したがって、細胞外に放出されたエラスタ
ーゼの排除は高度に効率的であろう。ＰＳＴＩはヒト起
源であるという事実は、その低い分子量と一緒になって
、ＰＳＴＩ誘導体を免疫系が異質蛋白質として認識する
ことによる合併症を、これらの誘導体の適用は回避する
であろうという期待される。

α＋ＰＩおよび杭内血球プロテアーゼ類と比較したＰＳ
Ｔ　Ｉの他の本質的な利点は、強い酸化剤が生成さかつ
細胞外に放出される、炎症の過程の間における、酸化的
不活性化に対してＰＳＴＩが不感受性であるということ
である。結局、α１−ＰＩおよび杭内血球グロテアーゼ
類に比較して、ＰＳＴＩ誘導体類の低い投与量は、同様
な保護的作用を達成するために十分であろう。

遺伝子の配列 ｈ−ＰＳＴＩのアミノ酸配列は、高度に発現された大腸
菌（以後、Ｅ　、　ｃｏｌｔ）遺伝子中に最も頻繁に見
出されるコドンを使用して、ＤＮＡマスター遺伝子の配
列に逆翻訳された〔グウウ・　（Ｇｏｕｙ）、Ｍ、およ
びガラチア−（Ｇａｕｔｉｅｒ）　、Ｃ、、（１９８２
）、核酸の研究（Ｎ　ｕｃｌ、　　Ａ　ｃｉｄｓＲｅｓ
、）第１図参照。ＰＳＴ　Ｉ変異型のアミノ酸置換（表
１）のため、対応するコドンをマスター遺伝子において
交換した（下表２参照）。

表２において星印を付したコドンを、次の例外を除いて
、全体を通じて使用した： Ｔｈｒ２６　　すべての遺伝子において、位置７（ＡＣ
Ｃ）　　２〜７７においてＫｐｎ１部位をつくるため。

Ｌｙｓ、１８　　ＰＳＴＩ−０および−１０において（
ＡＡＧ）　　で、位置５３〜５８においてＢｇ１１１部
位をつくるため。

Ｇｌｙ　　２８　　ＰＳＴＩ−２、−１０、−１９およ
（ＧＧＣ）　　よび−２０において、対応するオリリボ
ヌクレオチドの断片の適切なハ イブリダイゼーションを達成するた め（下を参照）。

Ｐｒｏ　　１７　　ＰＳＴＩ　　１１において、位置５
（ＯＣＴ）＋　　１〜５６においてＸ　ｂａ　１部位を
Ｌｅｕ１８　　つくるため。

（ＣＴＡ） 遺伝子の５°末端　第１コドン、Ｈｉｎｃ１１部位の第
２半分ＧＴＰｙＰｕＡＣを を含む。

遺伝子の３′末端　停止コドンＴＧＡ、ＥｃｏＲ１部位
（位置１７０〜１７５） および引続＜ＨｉｎｄｌＩＩ位 １部位（位置１７６〜１８１） およびＮｃａｌ接着末端（位置 １８２〜１８６）と重複する。

筒単に、ＰＳＴＩ遺伝子の構成は次の通りである： １．２５の短いオリゴヌクレオチド（各相補的鎖につい
て、それぞれ１２および１３）の合成２　　・・・・・
・　２２　　　　２４ここである変異型について特定の
断片を合成した（下表３を参照）。イオン交換高性能液
体クロマトグラフィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）による正しい大
きさの断片の精製。

２、断片の結合は、成熟ＰＳＴＩ　（アミノ酸１〜５６
）のための解読領域のために二本鎖の分子を与え、ここ
で成熟ＰＳＴＩはアミノ末端の解読末端に「平滑」末端
およびカルボキシ末端の解読末端にＧＡＴＣ−末鎖の５
′延長テイルを有する。

この工程のため、誤った生成物を最小にするために、合
成すべきオリゴヌクレオチドの配列を最適化することが
重要であった。

３、種々ノベクター、例えば、ｐＵＣ３、ｐｃｖ４５１
、Ｍｌ　３ｍｐｌ　８中における配列決定のだめのクロ
ーニング（方法のテキストを参照）。

４、特別の合成オリゴヌクレオチドを使用するＭ１３フ
ァージのベクター中の一本鎖突然変異誘発による、それ
以上の変異型の生成。

表３ 番号の意味 第１欄 断片の番号（第１図参照）。

第２および３欄　マスター遺伝子内の断片の最初および
最後のヌクレオチドの位 置（５′→３′）。

第４欄　　　　　断片のヌクレオチド配列（５′→３′
）。

点は、マスター遺伝子の配列と異なりかつ遺伝子の変異
型の構成に要求される断片を示す。

ＰＳＴＩ　Ｏ（セグメント■）−マスター遺伝子断片１
〜１１のリスト： １　　７　　１　　　ＧＡＧＡＧＴＣ ２１１３ＧＡＣＴＣＴＣＴＧＧＧＴＣ ３２３８ＴＴＡＧＣＴＴＣＡＣＧＡＣＣＣＡ４　　１４
　３０　　　ＧＴＧＡＡＧＣＴＡＡＡＴＧＣＴＡＣ５３
９２４ＣＡＧＴＴＣＧＴＴＧＴＡＧＣＡＴ６　　３１　
４７　　　ＡＡＣＧＡＡＣＴＧＡＡＣＧＧＴＴＧ７　　
５４　４０　　　ＣＴＴＡＧＴＧＣＡＡＣＣＧＴＴ８　
　４８　６０　　　ＣＡＣＴＡＡＧＡＴＣＴＡＣ９６６
５５ＣＧＧＧＴＴＧＴＡＧＡＴ ｔｏ　　６１．　７４　　　ＡＡＣＣＣＧＧＴＴＴＧＣ
ＧＧｌｌ　　８１　６７　　　ＧＴＣＧＧＴＡＣＣＧＣ
ＡＡＡＣＰＳＴＩ　−０（セグメント■）−マスター遺
伝子断片１２〜２５のリスト： １２　７５　８９　　　ＴＡＣＣＧＡＣＧＧＴＧＡＣＡ
Ｃ１３９７８２ＴＣＧＧＧＴＡＡＧＴＧＴＣＡＣＣ１４
９０１０５ＴＴＡＣＣ：ＣＧＡＡＣＧＡＡＴＧＣ１５１
１３９８ＣＡＣＡＧＡＡＣＧＣＡＴＴＣＧＴ１６　　１
０６　１２１　　　ＧＴＴＣＴＧＴＧＣＴＴＣＧＡＡＡ
１７　　１２９　１１．４　　　ＴＴＴＡＣＧＧＴＴＴ
ＴＣＧＡＡＧ１８　　１２２　１３７　　　ＡＣＣＧＴ
ＡＡＡＣＧＴＣＡＧＡＣ１９１４５１３０ＧＧＡＴＡＧ
ＡＡＧＴＣＴＧＡＣＧ２０　　１３８　１５２　　　Ｔ
ＴＣＴＡＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡ２１　　１６０　１４６
　　　ＣＡＧＡＴＴＴＣＴＧＧＡＴＣＡ２２　　１５３
　１６７　　　ＧＡＡＡＴＣＴＧＧＴＣＣＧＴＧ２３　
　１７４　１６１　　　ＡＡＴＴＣＡＧＣＡＣＧＧＡＣ
２４１６８１８２ＣＴＧＡＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＣ２５
１８６１７５ＣＡＴＧＧＡＡＧＣＴＴＧＰＳＴＩＩ（セ
グメント■） 断片１〜１１のリスト； １　　７　　１　　　ＧＡＧＡＧＴＣ ２１１３ＧＡＣＴＣＴＣＴＧＧＧＴＣ ３２３８ＴＴＡＧＣＴＴＣＡＣＧＡＣＣＣＡ４　　１４
　３０　　　ＧＴＧＡＡＧＣＴＡＡＡＴＧＣＴＡＣ５３
９２４ＣＡＧＴＴＣＧＴＴＧＴＡＧＣＡＴ６　　３１　
４７　　　ＡＡＣＧＡＡＣＴＧＡＡＣＧＧＴＴＧ・７　
　　５４　　４０　　　　ＣＡＧＡＧＴＧＣＡＡＣＣＧ
ＴＴ・８　　　４８　　６０　　　　ＣＡＣＴＣＴＧＡ
ＴＣＴＡＣ９６６５５ＣＧＧＧＴＴＧＴＡＧＡＴ ｌｏ　　　６１　　７４　　　　ＡＡＣＣＣＧＧＴＴＴ
ＧＣＧＧｌｌ　　　８１　　６７　　　　ＧＴＣＧＧＴ
ＡＣＣＧＣＡＡＡＣＰＳＴＩ　　２（セグメントＩ） 断片１−１１のリスト＝ １　　７　　１　　　ＧＡＧＡＧＴＣ ２１１３ＧＡＣＴＣＴＣＴＧＧＧＴＣ ３２３８ＴＴＡＧＣＴＴＣＡＣＧＡＣＣＣＡ４　　１４
’３０　　　ＧＴＧＡＡＧＣＴＡＡＡＴＧＣＴＡＣ５３
９２４ＣＡＧＴＴＣＧＴＴＧＴＡＧＣＡＴ６　　３１　
４７　　　ＡＡＣＧＡＡＣＴＧＡＡＣＧＧＴＴＧ・７　
　５４　４０　　　ＣＡＧＡＧＴＧＣＡＡＣＣＧＴＴ・
８　　４８　６０　　　ＣＡＣＴＣＴＧＡＴＣＴＡＣ・
９　　６６　５５　　　ＣＧＧＧＴＣＧＴＡＧＡＴ・１
０　６１　７４　　　ＧＡＣＣＣＧＧＴＴＴＧＣＧＧｌ
ｌ　　８１　６７　　　ＧＴＣＧＧＴＡＣＣＧＣＡＡＡ
ＣＰＳＴＩ　　３（セグメントＩ） 断片１〜１１のリスト： １　　７　　１　　　ＧＡＧＡＧＴＣ ２１１３ＧＡＣＴＣＴＣＴＧＧＧＴＣ：３　　２３　８
　　　ＴＴＡＧＣＴＴＣＡＣＧＡＣ：ＣＣＡ４　　１４
　３０　　　ＧＴＧＡＡＧＣＴＡＡＡＴＧＣＴＡＣ５３
９２４ＣＡＧＴＴＣＧＴＴＧＴＡＧＣＡＴ６　　３１　
４７　　　ＡＡＣＧＡＡＣＴＧＡＡＣＧＧＴＴＧ・７　
　５４　４０　　　ＧＴＡＡＧＴＧＣＡＡＣＣＧＴＴ・
８　　４８　６０　　　ＣＡＣＴＴＡＣＧＡＡＴＡＣ・
９　　６６　５５　　　ＣＧＧＡＣＧＧＴＡＴＴＣ・１
０　６１　７４　　　ＣＧＴＣＣＧＧＴＴＴＧＣＧＧｌ
ｌ　　８１　６７　　　ＧＴＣＧＧＴＡＣＣＧＣＡＡＡ
ＣＰＳＴＩ　　４（セグメント■） 断片１〜１１のリスト＝ １　　７　　１　　　ＧＡＧＡＧＴＣ ２１１３ＧＡＣＴＣＴＣＴＧＧＧＴＣ ３２３８ＴＴＡＧＣＴＴＣＡＣＧＡＣＣＣＡ４　　１４
　３０　　　ＧＴＧＡＡＧＣＴＡＡＡＴＧＣＴＡＣ５３
９２４ＣＡＧＴＴＣＧＴＴＧＴＡＧＣＡＴ６　　　３１
　　４７　　　　ＡＡＣＧＡＡＣＴＧＡＡＣＧＧＴＴＧ
・７　　　５４　　４０　　　　ＣＡＧＡＧＴＧＣＡＡ
ＣＣＧＴＴ・８　　　４８　　６０　　　　ＣＡＣＴＣ
ＴＧＧＡＡＴＡＣ・９　　　６６　　５５　　　　ＣＧ
ＧＡＣＧＧＴＡＴＴＣ＃１０　　６１　　７４　　　　
ＣＧＴＣＣＧＧＴＴＴＧＣＧＧｌｌ　　　８１　　６７
　　　　ＧＴＣＧＧＴＡＣＣＧＣＡＡＡＣＰＳＴＩ　　
５（セグメントり 断片１−１１のりスト： １　　７　　１　　　ＧＡＧＡＧＴ（１：２　　１　　
１３　　　ＧＡＣＴＣＴＣＴＧＧＧＴＣ３２３８丁ＴＡ
ＧＣＴ丁ＣＡＣＧＡＣＣＣＡ４　　１４　３０　　　Ｇ
ＴＧＡＡＧＣＴＡＡＡＴＧＣＴＡＣ５３９２４ＣＡＧＴ
ＴＣＧＴＴＧＴＡＧＣＡＴ６　　３１　４７　　　ＡＡ
ＣＧＡＡＣＴＧＡＡＣＧＧＴＴＧ・７　　５４　４０　
　　ＡＡＣＡＧＴＧＣＡＡＣＣＧＴＴ・８　　４８　６
０　　　ＣＡＣＴＧＴＴＧＡＡＴＡＣ・９　　６６　５
５　　　ＣＧＧＡＣＧＧＴＡＴＴＣ・１０　６１　７４
　　　ＣＧＴＣＣＧＧＴＴＴＧＣＧＧｌｌ　　　８１　
　６７　　　　ＧＴＣＧＧＴＡＣＣＧＣＡＡＡＣＰＳＴ
Ｉ　　６（セグメントＩ） 断片１〜１１のリスト： １　　７　　１　　　ＧＡＧＡＧＴＣ ２１１３ＧＡＣＴＣＴＣＴＧＧＧＴＣ ３２３８ＴＴＡＧＣＴＴＣＡＣＧＡＣＣＣＡ４　　１４
　３０　　　ＧＴＧＡＡＧＣＴＡＡＡＴＧＣＴＡＣ５３
９２４ＣＡＧＴＴＣＧＴＴＧＴＡＧＣＡＴ６　　３１　
４７　　　ＡＡＣＧＡＡＣＴＧＡＡＣＧＧＴＴＧ・７　
　５４　４０　　　ＣＡＧＡＧＴＧＣＡＡＣＣＧＴＴ・
８　　４８　６０　　　ＣＡＣＴＣＴＧＧＡＡＴＡＣ・
９　　６６　５５　　　ＣＧＧＧＴＴＧＴＡＴＴＣｌｏ
　　６１　７４　　　ＡＡＣＣＣＧＧＴＴＴＧＣＧＧｌ
ｌ　　８１　６７　　　ＧＴＣＧＧＴＡＣＣＧＣＡＡＡ
ＣＰＳＴＩ　　７（セグメントｌ） 断片１−１１のりスト： １　　７　　１　　　ＧＡＧＡＧＴＣ ２１１３ＧＡＣＴＣＴＣＴＧＧＧＴＣ ３　　　２３　　８　　　　　ＴＴＡＧＣＴＴＣＡＣＧ
ＡＣＣＣＡ４　　　１４　　３０　　　　ＧＴＧＡＡＧ
ＣＴＡＡＡＴＧＣＴＡＣ５３９２４ＣＡＧＴＴＣＧＴＴ
ＧＴＡＧＣＡＴ６　　　３１　　４７　　　　ＡＡＣＧ
ＡＡＣＴＧＡＡＣＧＧＴＴＧ・７　　　５４　　４０　
　　　ＣＡＧＡＧＴＧＣＡＡＣＣＧＴＴ・８　　　４８
　　６０　　　　ＣＡＣＴＣＴＧＡＴＣＴＡＣ・９　　
　６６　　５５　　　　ＣＧＧＡＣＧＧＴＡＧＡＴ・１
０　　６１　　７４　　　　ＣＧＴＣＣＧＧＴＴＴＧＣ
ＧＧｌｌ　　　８１　　６７　　　　ＧＴＣＧＧＴＡＣ
ＣＧＣＡＡＡＣＰＳＴＩ　１３（セグメントエ） 断片１〜１１のリスト： １　　７　　１　　　ＧＡＧＡＧＴＣ ２１１３ＧＡＣＴＣＴＣＴＧＧＧＴＣ ３２３８ＴＴＡＧＣＴＴＣＡＣＧＡＣＣＣＡ４　　１４
　３０　　　ＧＴＧＡＡＧＣ’ＴＡＡＡＴＧＣＴＡＣ５
３９２４ＣＡＧＴＴＣＧＴＴＧＴＡＧＣＡＴ６　　３１
　４７　　’　ＡＡＣＧＡＡＣＴＧＡＡＣＣ，ＧＴＴＧ
・７　　５４　４０　　　ＧＡＴＡＧＴＧＣＡＡＣＣＧ
ＴＴ・８　　４８　６０　　　ＣＡＣＴＡＴＣＧＡＡＴ
ＡＣ・９　　　６６　　５５　　　　ＣＧＧＧＴＴＧＴ
ＡＴＴＣｌｏ　　　６１　　７４　　　　ＡＡＣＣＣＧ
ＧＴＴＴＧＣＧＧｌｌ　　　８１　　６７　　　　ＧＴ
ＣＧＧＴＡＣＣＧＣＡＡＡ、ＣＰＳＴＩ　１４（セグメ
ント■） 断片１〜１１のリスト： １　　７　　１　　　ＧＡＧＡＧＴＣ ２１１３ＧＡＣＴＣＴＣＴＧＧＧＴＣ ３２３８ＴＴＡＧＣＴＴＣＡＣＧＡＣＣＣＡ４　　１４
　３０　　　ＧＴＧＡＡＧＣＴＡＡＡＴＧＣＴＡＣ５３
９２４ＣＡＧＴＴＣＧＴＴＧＴＡＧＣＡＴ６　　３１　
４７　　　ＡＡＣＧＡＡＣＴＧＡＡＣＧＧＴＴＧ・７　
　５４　４０　　　ＡＣＧＡＧＴＧＣＡＡＣＣＧＴＴ・
８　　４８　６０　　　ＣＡＣＴＣＧＴＧＡＡＴＡＣ−
９６６５５ＣＧＧＧＴＴＧＴＡＴＴＣｌｏ　　６１　７
４　　　ＡＡＣＣＣＧＧＴＴＴＧＣＧＧｌｌ　　８１　
６７　　　ＧＴＣＧＧＴＡＣＣＧＣＡＡＡＣＰＳＴＩ　
１５（セグメントエ） 断片１〜１１のりスト： １　　　７　　　１　　−ＧＡＧＡＧＴＣ２１１３ＧＡ
ＣＴＣＴＣＴＧＧＧＴＣ ３２３８ＴＴＡＧＣＴＴＣＡＣＧＡＣＣＣＡ４　　　１
４　　３０　　　ＧＴＧＡＡＧＣＴＡＡＡＴＧＣＴＡＣ
５３９２４ＣＡＧＴＴＣＧＴＴＧＴＡＧＣＡＴ６　　３
１　　４７　　　ＡＡＣＧＡＡＣＴＧＡＡＣＧＧＴＴＧ
−７５４４０ＧＡＡＡＧＴＧＣＡＡＣＣＧＴＴ−８４８
６０ＣＡＣＴＴＴＣＧＡＡＴＡＣ−９６６５５ＣＧＧＧ
ＴＴＧＴＡＴＴＣｌｏ　　　６１　　７４　　　　ＡＡ
ＣＣＣＧＧＴＴＴＧＣＧＧｌｌ　　　８１　　６７　　
　ＧＴＣＧＧＴＡＣＣＧＣＡＡＡＣＰＳＴＩ　１６（セ
グメントＩ） 断片１〜１１のリスト＝ １　　７　　１　　０ＡＧＡＧＴＣ ２１１３ＧＡＣＴＣＴＣＴＧＧにＴＣ ３２３８ＴＴＡＧＣＴＴＣＡＣＧＡＣＣＣＡ４　　１４
　３０　　　ＧＴＧＡＡＧＣＴＡＡＡＴＧＣＴＡＣ５３
９２４ＣＡＧＴＴＣＧＴＴＧＴＡＧＣＡＴ６　　３１　
４７　　　ＡＡＣＧＡＡＣＴＧＡＡＣＧＧＴＴＧ・７　
　　５４　　４０　　　　ＡＧＣＡＧＴＧＣＡＡＣＣＧ
ＴＴ・８　　　４８　　６０　　　　ＣＡＣＴＧＣＴＧ
ＡＡＴＡＣ・９　　　６６　　５５　　　　ＣＧＧＧＴ
ＴＧＴＡＴＴＣｌｏ　　　６１　　７４　　　　ＡＡＣ
ＣＣＧＧＴＴＴＧＣＧＧｌｌ　　　８１　　６７　　　
　ＧＴＣＧＧＴＡＣＣＧＣＡＡＡＣＰＳＴＩ　１７（セ
グメント■） 断片１〜１１のリスト： １　　７　　１　　　ＧＡＧＡＧＴＣ ２１１３ＧＡＣＴＣＴＣＴＧＧＧＴＣ ３２３８ＴＴＡＧＣＴＴＣＡＣＧＡＣＣＣＡ４　　１４
　３０　　　ＧＴＧＡＡＧＣＴＡＡＡＴＧＣＴＡＣ５３
９２４ＣＡＧＴＴＣＧＴＴＧＴＡＧＣＡＴ６　　３１　
４７　　　ＡＡＣＧＡＡＣＴＧＡＡＣＧＧＴＴＧ・７　
　５４　４０　　　ＡＡＣＡＧＴＧＣＡＡＣＣＧＴＴ・
８　　４８　６０　　　ＣＡＣＴＧＴＴＡＴＣＴＡＣ９
６６５５ＣＧＧＧＴＴＧＴＡＧＡＴ ｌｏ　　６１　７４　　　ＡＡＣＣＣＧＧＴＴＴＧＣＧ
Ｇｌｌ　　８１　６７　　　ＧＴＣＧＧＴＡＣＣＧＣＡ
ＡＡＣＰＳＴＩ　１８（セグメントＩ） 断片１−１１のりスト： １　　７　　１　　　ＧＡＧＡＧＴＣ ２１１３ＧＡＣＴＣＴＣＴＧＧＧＴＣ ３２３８ＴＴＡＧＣＴＴＣＡＣＧＡＣＣＣＡ４　　１４
　３０　　　ＧＴＧＡＡＧＣＴＡＡＡＴＧＣＴＡＣ５３
９２４ＣＡＧＴＴＣＧＴＴＧＴＡＧＣＡＴ６　　３１　
４７　　　ＡＡＣＧＡＡＣＴＧＡＡＣＧＧＴＴＧφ７　
　５４　４０　　　ＧＡＴＡＧＴＧＣＡＡＣＣＧＴＴ・
８　　４８　６０　　　ＣＡＣＴＡＴＣＡＴＣＴＡＣ９
６６５５ＣＧＧＧＴＴＧＴＡＧＡＴ ｌｏ　　６１　７４　　　ＡＡＣＣＣＧＧＴＴＴＧＣＧ
Ｇｌｌ　　８１　６７　　　ＧＴＣＧＧＴＡＣＣＧＣＡ
ＡＡＣＰＳＴＩ　１９（セグメントＩ） 断片１−１１のリスト＝ １　　７　　１　　　ＧＡＧＡＧＴＣ ２１１３ＧＡＣＴＣＴＣＴＧＧＧＴＣ ３２３８ＴＴＡＧＣＴＴＣＡＣＧＡＣＣＣＡ４　　１４
　３０　　　ＧＴＧＡＡＧＣＴＡＡＡＴＧＣＴＡＣ５３
９２４ＣＡＧＴＴＣＧＴＴＧＴＡＧＣＡＴ６　　　３１
　　４７　　　　ＡＡＣＧＡＡＣＴＧＡＡＣＧＧＴＴに
・７　　　５４　　４０　　　　ＡＡＣＡＧＴＧＣＡＡ
ＣＣＧＴＴ・８　　　４８　　６０　　　　ＣＡＣＴＧ
ＴＴＡＴＣＴＡＣ・９　　　６６　　５５　　　　ＣＧ
ＧＧＴＣＧＴＡＧＡＴ・１０　　６１　　７４　　　　
ＧＡＣＣＣＧＧＴＴＴＧＣＧＧｌｌ　　　８１　　６７
　　　　ＧＴＣＧＧＴＡＣＣＧＣＡＡＡＣＰＳＴＩ　２
０（セグメントＩ） 断片１〜１１のリスト＝ １　　７　　１　　　ＧＡＧＡＧＴＣ ２１１３ＧＡＣＴＣＴＣＴＧＧＧＴＣ ３２３８ＴＴＡＧＣＴＴＣＡＣＧＡＣＣＣＡ４　　１４
　３０　　　ＧＴＧＡＡＧＣＴＡＡＡＴＧＣＴＡＣ５３
９２４ＣＡＧＴＴＣＧＴＴＧＴＡＧＣＡＴ６　　３１　
４７　　　ＡＡＣＧＡＡＣＴＧＡＡＣＧＧＴＴＧ・７　
　５４　４０　　　ＧＡＴＡＧＴＧＣＡＡＣＣＧＴＴ・
８　　４８　６０　　　ＣＡＣＴＡＴＣＡＴＣＴＡＣ・
９　　６６　５５　　　ＣＧＧＧＴＣＧＴＡＧＡＴ・１
０　６１　７４　　　ＧＡＣＣＣＧＧＴＴＴＧＣＧＧｌ
ｌ　　　８１　　６７　　　　ＧＴＣＧＧＴＡＣＣＧＣ
ＡＡＡＣＰＳＴＩ−Ａ（セグメント■） 断片１２〜２５のリスト： １２　７５　８９　　　ＴＡＣＣＧＡＣＧＧＴＧＡＣＡ
Ｃ・１３　９７　８２　　　ＴＡＧＣＧＴＡＡＧＴＧＴ
ＣＡＣＣ・１４　９０　１０５　　ＴＴＡＣＧＣＴＡＡ
ＣＧＡＡＴＧＣ１５１１３９８ＣＡＣＡＧＡＡＣＧＣＡ
ＴＴＣＧＴ１６　１０６　１２１　　ＧＴＴＣＴＧＴＧ
ＣＴＴＣＧＡＡＡ１７　１２９　１１４　　ＴＴＴＡＣ
ＧＧＴＴＴＴＣＧＡＡＧ１８　１２２　１３７　　ＡＣ
ＣＧＴＡＡＡＣＧＴＣＡＧＡＣ１９１４５１３０ＧＧＡ
ＴＡＧＡＡＧＴＣＴＧＡＣＧ２０　１３８　１５２　　
ＴＴＣＴＡＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡ２１　１６０　１４６
　　ＣＡＧＡＴＴＴＣＴＧＧＡＴＣＡ２２　１５３　　
ｉ６７　　ＧＡＡＡＴＣＴＧＧＴＣＣＧＴＧ２３　１７
４　１６１　　ＡＡＴＴＣＡＧＣＡＣＧＧＡＣ２４１６
８１８２ＣＴＧＡＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＣ２５１８６１
７５ＣＡＴＧＧＡＡＧＣＴＴＧＰＳＴＩ　−Ｓ（セグメ
ント■） 断片１２〜２５のリスト： １２　７５　８９　　　ＴＡＣＣＧＡＣＧＧＴＧＡＣＡ
Ｃ・１３　９７　８２　　　ＴＡＧＡＧＴＡＡＧＴＧＴ
ＣＡＣＣ・１４　９０　１０５　　ＴＴＡＣＴＣＴＡＡ
ＣＧＡＡＴＧＣ１５１１３９８ＣＡＣＡＧＡＡＣＧＣＡ
ＴＴＣＧＴ１６　１０６　１２１　　ＧＴＴＣＴＧＴＧ
ＣＴＴＣＧＡＡＡ１７　１２９　１１４　　ＴＴＴＡＣ
ＧＧＴＴＴＴＣＧＡＡＧ１８　１２２　１３７　　ＡＣ
ＣＧＴＡＡＡＣＧＴＣＡＧＡＣ１９１４５１３０ＧＧＡ
ＴＡＧＡＡＧＴＣＴＧＡＣＧ２０　１３８　１５２　　
ＴＴＣＴＡＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡ２１　１６０　１４６
　　ＣＡＧＡＴＴＴＣＴＧＧＡＴＣＡ２２　１５３　１
６７　　ＧＡＡＡＴＣＴＧＧＴＣＣＧＴＧ２３　１７４
　１６１　　ＡＡＴＴＣＡＧＣＡＣＧＧＡＣ２４１６８
１８２ＣＴＧＡＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＣ２５１８６１７
５ＣＡＴＧＧＡＡＧＣＴＴＧＰＳＴｌ　２．１０．１９
および２０（セグメント■）断片１２〜２５のリスト： ・１２　７５　８９　　　ＴＡＣＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣ
ＡＣ・１３　９７　８２　　　ＴＣＧＧＧＴＡＡＧＴＧ
ＴＴＧＣＣ１４　　９０　　１０５　　　ＴＴＡＣＣＣ
ＧＡＡＣＧＡＡＴＧＣ１５１１３９８ＣＡＣＡＧＡＡＣ
ＧＣＡＴＴＣＧＴ１６　　１０６　１２１　　　ＧＴＴ
ＣＴＧＴＧＣＴＴＣＧＡＡＡ１７　　１２９　１１４　
　　ＴＴＴＡＣＧＧＴＴＴＴＣＧＡＡＧ１８　　１２２
　１３７　　　ＡＣＣＧＴＡＡＡＣＧＴＣＡＧＡＣ１９
１４５１３０ＧＧＡＴＡＧＡＡＧＴＣＴＧＡＣＧ２０　
　１３８　１５２　　　ＴＴＣＴＡＴＣＣＴＧＡＴＣＣ
Ａ２１　　１６０　１４６　　　ＣＡＧＡＴＴＴＣＴＧ
ＧＡＴＣＡ２２　　１５３　１６７　　　ＧＡＡＡＴＣ
ＴＧＧＴＣＣＧＴＧ２３　　　＋７４　１６１　　　Ａ
ＡＴＴＣＡＡＧＣＡＣＧＧＡＣ２４１６８１８２ＣＴＧ
ＡＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＣ２５１８６１７５ＣＡＴＧＧ
ＡＡＧＣＴＴＧＰＳＴＩ　２１（セグメントＩ） 断片１から１１のりスト： １　　７　　１　　　ＧＡＧＡＧＴＣ ２１１３ＧＡＣＴＣＴＣＴＧＧＧＴＣ ３２３８ＴＴＡＧＣＴＴＣＡＣＧＡＣＣＣＡ４　　１４
　３０　　　ＧＴＧＡＡＧＣＴＡＡＡＴＧＣＴＡＣ５３
９２４ＣＡＧＴＴＣＧＴＴＧＴＡＧＣＡＴ６　　３１　
　４７　　　ＡＡＣＧＡＡＣＴＧＡＡＣＧＧＴＴＧ・７
　　５４　　４０　　　ＧＡＴＡＧＴＧＣＡＡＣＣＧＴ
Ｔ・８　　４８　　６０　　　ＣＡＣＴＡＴＣＧＡＡＴ
ＧＣ・９　　　６６　　５５　　　　ＣＧＧＡＣＧ（１
；ＴＡＴＴＣ・１０　　６１　　７４　　　ＣＧＴＣＣ
ＧＧＴＴＴＧＣＧＧｌｌ　　　８１　　６７　　　ＧＴ
ＣＧＧＴＡＣＣＧＣＡＡＡＣＰＳＴＩ　２２（セグメン
トＩ） 断片ｌから１１のりスト： １　　７　　１　　　ＧＡＧＡＧＴＣ ２１１３ＧＡＣＴＣＴＣＴＧＧＧＴＣ ３２３８ＴＴＡＧＣＴＴＣＡＣＧＡＣＣＣＡ４　　１４
　３０　　　ＧＴＧＡＡＧＣＴＡＡＡＴＧＣＴＡＣ５３
９２４ＣＡＧＴＴＣＧＴＴＧＴＡＧＣＡＴ６　　３１　
４７　　　ＡＡ、ＣＧＡＡＣＴＧＡＡＣＧＧＴＴＧ・７
　　５４　４０　　　ＧＴＡＡＧＴＧＣＡＡＣＣＧＴＴ
・８　　４８　６０　　　ＣＡＣＴＴＡＣＡＴＣＴＡＣ
９６６５５ＣＧＧＧＴＴＧＴＡＧＡＴ ｌｏ　　６１　７４　　　ＡＡＣＣＣＧＧＴＴＴＧＣＧ
Ｇｌｌ　　８１　６７　　　ＧＴＣＧＧＴＡＣＣＧＣＡ
ＡＡＣＰＳＴＩ　２３（セグメントエ） 断片１から１１のりスト： １　　７　　１　　　ＧＡＧＡＧＴＣ ２１１３ＧＡＣＴＣＴＣＴＧＧＧＴＣ ３２３８ＴＴＡＧＣＴＴＣＡＣＧＡＣＣＣＡ４　　１４
　３０　　　ＧＴＧＡＡＧＣＴＡＡＡＴＧＣＴＡＣ５３
９２４ＣＡＧＴＴＣＧＴＴＧＴＡＧＣＡＴ６　　３１　
４７　　　ＡＡＣＧＡＡＣＴＧＡＡＣＧＧＴＴＧ・７　
　５４　４０　　　ＧＡＡＡＧＴＧＣＡＡＣＣＧＴＴ・
８　　４８　６０　　　ＣＡＣＴＴＴＣＡＴＣＴＡＣ９
６６５５ＣＧＧＧＴＴＧ’ＴＡＧＡＴ１０　６１　７４
　　　ＡＡＣＣＣＧＧＴＴＴＧＣＧＧｌｌ　　８１　６
７　　　ＧＴＣＧＧＴＡＣＣＧＣＡＡＡＣＰＳＴＩ　２
４（セグメントエ） 断片ｌから１１のりスト： １　　７　　１　　　ＧＡＧＡＧＴＣ ２１１３ＧＡＣＴＣＴＣｔＧＧＧＴＣ ３２３８ＴＴＡＧＣＴＴＣＡＣＧＡＣＣＣＡ４　　　１
４　　３０　　　　ＧＴＧＡＡＧＣＴＡＡＡＴＧＣＴＡ
Ｃ５３９２４ＣＡＧＴＴＣＧＴＴＧＴＡＧＣＡＴ６　　
　３１　　４７　　　　ＡＡＣＧＡＡＣＴＧＡＡＣＧＧ
ＴＴＧ・７　　　５４　　４０　　　　ＴＴＴＡＧＴＧ
ＣＡＡＣＣＧＴＴ・８　　　４８　　６０　　　ＣＡＣ
ＴＡＡＡＧＡＡＴＡＣ・９　　　６６　　５５　　　　
ＣＧＧＡＣＧＧ、ＴＡ、ＴＴＣ・１０　　６１　　７４
　　　　ＣＧＴＣＣＧＧＴＴＴＧＣＧＧｌｌ　　　８１
　　６７　　　　ＧＴＣＧＧＴＡＣＣＧＣＡＡＡＣ遺伝
子の構成 設計した遺伝子の配列はオリゴヌクレオチドに分割され
た（第１図）。これらの断片は、多成分反応においてＤ
　Ｎ　Ａ二本鎖の正しい酵素のアセブリーを可能とする
重複を有する。

ＰＳＴＩ遺伝子変異型の構成のために基本的計画は、遺
伝子の２つの断片の別々のアセンブリーを包含する： 断片１〜１１からのセグメント１１可変アミノ酸位置１
７〜２１を包含する。

断片１２〜２５からのセグメント！１１可変アミノ酸位
置２９および３２を包含する。

表３は、異なるセグメントＩおよびＩＩをアセンブリン
グするために使用するオリゴヌクレオチドの断片の組み
合わせを示す。点はマスター遺伝子の断片と異なる断片
を示す。

セグメントＩおよびＩＩの対応する対の酵素的結合は、
所望の完全な遺伝子変異型を生成するであろう。遺伝子
のマルチマー（ｍｕｌｔｉｍｅｒ）は、また、セグメン
トＩの５′−末端における平滑末端の結合およびセグメ
ントＩＩの３′−末端における接着末端の結合を許すこ
とによって、最初に生成した。七ツマ−の遺伝子は、マ
ルチマーから、Ｈ４ｎｃｌｌおよびＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ
、ＥｃｏＲＩまたはＮ　ｃｏ　Ｉで切断することによっ
て切除した。

方法 オリゴヌクレオチド断片の化学的合成 すべての必要なオリゴデオキシヌクレオチドは、確立さ
れたホスホトリエステル化学によりセグメントの支持体
としてセルロースのディスク上で合成した［フランク（
Ｆ　ｒａｎｋ）ら（１９８３）核酸の研究（Ｎｕｃｌ、
　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、）、１１．（４３６５−４３
７７）］。オリゴデオキシヌクレオチドは、ワットマン
・バーチシル（Ｗ　ｈａｔｍａｎ　　Ｐ　ａｒｔｉｓｉ
ｌ）　ＳＡＸ　−１０カラムのイオン交換ＨＰＬＣによ
り、６０％の水性ホルムアルデヒド中のリン酸トリエチ
ルアンモニウム（ｐＨ６，３）の勾配を用いて精製した
。

オリゴヌクレオチドのセグメント■およびＩＩのＤＮＡ
二本鎖へのオリゴヌクレオチドの結合 等モル量（５０ピコモル）の各オリゴヌクレオチド断片
（表３参照）をシリコーン化プラスチック管中で一緒に
した（管Ａ：上の鎖からなる断片；管Ｂ：下の鎖からな
る断片）。断片１および１１゜ならびにホスホリル化し
ないであろう断片１２および２５を別の管（管Ｃ）中で
一緒にした。この物質を乾燥した。管ＡおよびＢのオリ
ゴヌクレオチドを、３倍過剰量の［γ−”Ｐｌ　ＡＴＰ
　（約２Ｃｉ／ミリモル）で５′−ヒドロキシ末端にお
いて、６０ミリモルのトリス・ＭＣＩ　（ｐＨ８）　、
６ミリモルのＭｇＣＩ、、ｌＯミリモルのＤＴＥおよび
２単位の７４　　ＰＮＫを含有するｌＯμｌの反応混合
物中で、３７℃において３０分間ホスホリル化した。定
量的ホスホリル化後、Ｔ４　　ＰＮＫを管ＡおよびＢを
９５°Ｃに２分間加熱することによって不活性化し、そ
して内容物を管Ｃに移した。１０モルのＤＴＥ、０．２
ミリモルのＡＴＰおよび２単位のＴ４　　ＤＮＡリガー
ゼを添加し、そしてこの混合物を４０°Ｃで１時間イン
キュベーションした。３７℃に冷却後、さらに２単位の
Ｔ４　　ＤＮＡリガーゼを添加し、そしてインキュベー
ションを３７℃で１時間、３０℃で３時間そして１５℃
で一夜続けた。次いで、この混合物のアリコートを、０
．０４Ｘ２０Ｘ４０ｃｍの１０％の非変性ポリアクリル
アミドゲル［アクリルアミド：メチレン−ビスアクリル
アミド−２９＝１，５０ミリモルのトリス・ポレート（
ｐＨ８，３）、１ミリモルＥＤＴＡＩの電気泳動により
精製し、ここで２５℃にサーモスタット制御し、１００
ＯＶにおいて、ＢＰＢが２５ｃｍ動くまで展開した。ゲ
ル電気泳動のための試料は、０．０５％のＸＣ，０，０
５％のＢＰＢ、１０ミリモルのＥＤＴＡおよび４モルの
尿素を含有する混合物中の配合し、そして装入前に加熱
しなかった。ゲル電気泳動からの結果が期待する長さの
生成物を生成するまで、もとの反応混合物を一２０°Ｃ
で貯蔵した。

次いで、ＤＮＡリガーゼを６５℃に１５分間加熱するこ
とによって不活性化した。結合生成物は、反応混合物か
ら、厚さｌ　ｍｍのゲルの調製用ゲル電気泳動によって
上の条件下に単離した。

完全ＰＳＴｒ遺伝子変異型のアセンブリー１０ピコモル
の対応するセグメントＩおよび■ＩのＤＮＡを一緒にし
、そして６０ピコモルの［γ−３２Ｐ］　　ＡＴＰ　（
２００Ｃ４／ミリモル）、６０ミリモルのトリス・ＨＣ
Ｉ（ｐＨ８）　、６ミリモルのＭｇＣｌ、、１０ミリモ
ルのＤＴＥおよび２単位のＴ４　　ＰＮＫを含有する２
０μｌの反応混合物中で３７℃で３０分間ホスホリル化
した。次いで、２μｌの１ミリモルのＡＴＰおよび２単
位のＴ４　　ＤＮＡリガーゼを添加し、次いで１５°Ｃ
で一夜インキユベーションした。次いで、この混合物を
、制限酵素による硝化に適切な緩衝条件に調節すること
によって、５０μｌに希釈した。

例えば、ＰＳＴＩの遺伝子変異型 ＰＳＴＩ−１−Ａｌａ−３２（ＩＡ）、ＰＳＴＩ　　３
−Ｐｒｏ−３２−（−３Ｐ）、ＰＳＴＩ　　６−５ｅｒ
−３２（４Ａ）およびｐｓＴＴ　　５−Ｐｒｏ−３２（
５Ｐ） を上のプロトコールに従って構成した。

ＰＳＴ　Ｉ変異型遺伝子のクローニング計画遺伝子は、
前述のように、アミノ酸１７．１８．１９．２０．２１
２９および３２の遺伝情報を指定する位置において種々
の配列を有する合成遺伝子断片から合成した。名称ＰＳ
ＴＴ−０−ＰＳＴｌ−２４（表１参照）は、アミノ酸１
７〜２１゜および引続く位置３２におけるＡ（アラニン
について）、Ｓ　（セリンについて）、Ｇ（グリシンに
ついて）、またはＰ（プロリンについて）の領域のため
の特定の解読配列を意味する。

遺伝子の構成は、セグメントＩにおける変異型がセグメ
ン１−１１における変異型（例えば、位置３２における
変異型）と、位置７２〜７６におけるＫｐｎ１部位の開
裂後、再結合できるように計画を立てる（第１図）。

それ以上の変異型は、合成オリゴヌクレオチドを使用す
る、Ｍ１３ｍｐ−一本鎖バクテリオファージ中でクロー
ニングした遺伝子断片上の部位特異性突然変異誘発によ
ってつくるか、あるいは前述のように全体の遺伝子の合
成によってつくる。

クローニング ５′−末端にフラッシュエンド（ｆｌｕｓｈ　　ｅｎｄ
）（アミノ末端解読末端）および３″−末端にＨ４ｎｄ
Ｉ１１部位を有するＰＳＴＩ−変異型（例えば、ＰＳＴ
Ｉ−ＩＡおよびＰＳＴＩ−３Ｆ）のための遺伝子を、Ｈ
ｉｎｃＩ　ｌ５Ｈ４ｎｄｌ　Ｉ　Ｉ制限プラスミドｐＵ
Ｃ８（ｐＵＣ−ＰＳＴＩ　　ＩＡおよびｐＵＣ−ＰＳＴ
Ｉ−３Ｐ）中にクローニングした。

追加のメチオニンをＮＨ２−末端に含有するＰＳＴＩ変
異型（例えば、Ｍｅｔ−’　−Ｐ　Ｓ　Ｔ　Ｉ　−４Ａ
）を、同様にｐＵＣ８−ＮｃｏＩ　（Ｈｉｎｃｌ　１部
位中に導入されたＮｃｏＩ−リンカ−ＣＣＣＡＴＧＧＧ
を含有する）中にクローニングした。ｐＵＣ８−Ｎｃｏ
ｌをＮｃｏｌで制限ル、ＤＮＡ　　Ｐｏｌ　Ｉ　（大き
い断片）の存在下にｄＮＴＰで充填し、そしてさらにＨ
ｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉで制限した。ＰＳＴＩ−４Ａ変異型の
遺伝子をこのベクター中にクローニングすることによっ
て、Ｎ　ｃｏ　Ｉ制限部位を再構成する（ｐＵＣ−Ｍｅ
ｔ−ＰＳＴ　ｌ−４Ａ）　。制限酵素の開裂（ｃｌｅａ
ｖａｇｅ）　、結合、形質転換およびβ−ガラクトシダ
ーゼ活性の「挿入不活性化」についてのスクリーニング
は、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、Ｔ３、フリトシ
（Ｆ　ｒｉｔｓｃｈ）　、Ｅ　、　Ｇ　、およびサムプ
ルツク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）　、Ｊ　、、分子クローニ
ング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃｔｏｎｉｎｇ）　、コ
ールド昏スプリング・ハーバ−・パブリケイションズ（
Ｃｏｌｄ　　Ｓ　ｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　　Ｐｕ
ｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）　、コールド・スプリング＋ハ
ーバ−（Ｃｏｌｄ　Ｓ　ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）、
１９８２に記載されている。

組換えによる追加の変異型の調製 制限エンドヌクレアーゼＫｐｎｌは、すべての構成のＰ
ＳＴＩ遺伝子を上の鏡上の塩基７６後および下の鏡上の
塩基７２後において開裂して、４ｂｐの一本鎖の３′−
突起（ｐｒｏｔｒｕｄｉｎｇ）末端（ＧＴＡＣ）を生成
する。

ｐＵＣ８−ＰＳＴＩ雑種のＫｐｎｌ、５ｃａＴの二重の
開裂後、２つのＰ断片が得られ、一方の断片はアミノ酸
残基１７〜２１の変異型配列をもつ遺伝子の５′−末端
を含有し、そして他方の断片はアミノ酸２９および３２
中に変異をを有する遺伝子の３′−末端を含有する。異
なるプラスミドからの断片の再結合は、再分類された（
　ｒｅａｓｓｏｒｔｅｄ）５′および３′の両者を有す
る新規な組換えｐＵＣ８−ＰＳＴＩ変異型を生成する（
例えば、ＰＳＴＩ　　ＯＰおよびＰＳＴＩ−ＩＡから出
発して、ＰＳＴ［ＯＡおよびＰＳＴＩ−ＩＰを誘導でき
る）。

大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）　Ｋ　
−１２菌株ΔＭ１５およびＤＨｌを、再配置されたｐＵ
Ｃ８−ＰＳＴ　Ｉ変異型のための受容宿主として使用し
た（参照ＡＴＣＣ３１３４３および３３６２５）。

部位特異的突然変異誘発による追加の変異型の調製　′ この突然変異誘発手順のだめの出発物質はＭ１３　　ｍ
ｐ９−ＰＳＴＩクローンであり、このクローンはｐＵＣ
８−ＰＳＴＩ変異型からのＨｉｎｃｌｌ−Ｈ４ｎｄＩＩ
Ｉ　　ＰＳＴＩ−断片を、メッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ
）　、Ｊおよびビエラ（Ｖ　１ｅｒａ）、Ｊ（１９８２
）、遺伝子（Ｇｅｎｅ）、上ユ、２６９−２７６の方法
に従い、二本鎖Ｍ１３ｍｐ９バクテリオバクテリオ７７
−ジ中ングすることによってつくる。−末鎖の雑種バク
テリオファージを分離し、そしてバクテリオ７７−ジＭ
１３ｍｐ９ｒｅｖの線状のネガティブ（ｎｅｇａｔ　１
ｖｅ）鎖に対して交雑した。次いで、突然変異誘発部位
に新しい変異型の配列を含有する合成オリゴヌクレオチ
ドを、このいわゆる［グラップド・デユープレックス（
ｇｒａｐｐｅｄ　　ｄｕｐｌｅｘ）　Ｊに対して交雑し
、そしてポリメラーゼ■　［クレノー断片、ベーリンガ
ー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　　Ｍａｎｎｈ
ｅｉｍ）　］およびＤＮＡリガーゼを連続的に作用させ
ることによって、充填および結合して、突然変異誘発部
位に塩基の不一致を含有する閉じた円形二重らせんを形
成する。不一致修復欠乏Ｅ　、　ｃｏｌｉ　　Ｍｕｔｓ
菌株ＢＭＨ７１−１８中のこのＤＮＡの形質転換は、合
成「突然変異誘発プライマー」によって決定される新し
い配列を含有するＭ１３　　ｍｐ９　　ｒｅｖ−ＰＳＴ
Ｉ変異型を高い頻度で生成し、それらは引続いてＥ、　
ｃｏｌｉ　　ｓａ−［琥珀色サプレッサー（ａｍｂｅｒ
ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ）−マイナス１菌株ＭＫ３０−３
中で選択する。実験のプロトコールはクラマー（Ｋｒａ
ｍｅｒ）　、Ｗ−ら、核酸の研究（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１
ｄｓＲｅｓ、）、±２（１９８４）に記載されるものに
従う。このようにして、ＰＳＴＩ−８Ｐ、−９Ｐ。

−ＩＯＰ、−１ＩＰ、−１２Ｐ、−１５Ｐ、−１７Ｐ、
−１８、Ｐおよび一１９Ｐが構成された。

ＤＮＡ−配列決定 ＤＮＡの配列決定は、−末鎖のＭ１３ｍｐ８、Ｍ１３ｍ
ｐ９、Ｍ１３ｍｐ１８、Ｍ１３ｍｐ９（ｒｅｖ）−ＰＳ
ＴＩ分子について、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）　、Ｆ　
、ら（１９７７）、プロシーデインダス・オブ・ナショ
ナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　
Ｎａｔｎ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ。

Ｌ玉、５４６３−５４６７に記載されているデオキシ法
に従い実施し、あるいはｐＧＶ４５１の構成について、
ポカート（Ｖ　ｏｃｋａｅｒｔ）　Ｇ　、ら、（１９８
４）、遺伝子分析技術（Ｇｅｎｅ　　Ａｎａｌｙｓｉｓ
Ｔ　ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）　、土、５２−５９の特異的
末端−標識および化学的劣化法に従い実施した。

発現ベクター中のクローニング ＰＳＴＩ変異型ペプチドの生成は、σ−アミラーゼ（ｂ
、　５ｕｂｔｉｌｉｓ）またはペニシリンアシラーゼ（
Ｅ　、　ｃｏｌｉ）のシグナル配列を含有するＥ。

ｃｏｌｉ分泌ベクター中にクローニングすることによっ
て達成した。ＰＳＴＩに類似するヒト分泌ペプチドの発
現のためにＥ、ｃｏｌｉ分泌ベクターを使用すると、融
合したシグナルペプチドは遺伝子生成物を細胞質膜を横
切って細胞形質空間中に導き、同時にシグナルペプチド
を処理し［Ｇ、フレイル（Ｋｒｅｉｌ）、（１９８１）
、Ａ　ｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、、ｌユ、
３１７−３４８］かつ活性ＰＳＴＩを、その成熟形態で
、あるいはそのアミン末端に数個のアミノ酸のリンカ−
ペプチドを含有する融合生成物として、放出するという
、利点が得られる。

制限酵素の開裂の方法：ＤＮＡ　　ｐｏｌ　　ｌ　（大
きい断片）の存在下のｄＮＴＰによる５′突起末端の充
填、ｓｌヌクレアーゼによる消化、ＤＮＡのゲル電気泳
動、ＤＮＡ断片の分離、結合および形質転換は、Ｔ、マ
ニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、分子クローニング（
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃｔｏｎｉｎｇ）　、コールド
・スプリング・ハーバ−（Ｃｏｌｄ　　Ｓ　ｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ）、（１９８２）に記載されている。

Ｂ　、　５ｕｂｔｉｌｉｓからのα−アミラーゼシグナ
ル配列を、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｕＭｉｌｉｓ　　Ｄ
ＳＭ　　７０４　　［トイチェ　スタンムスアンムルン
グ・ヒュール・ミクロオルガニスメン（Ｄ　ｅｕｔｓｃ
ｈｅ　Ｓ　ｔａｍｍｓａｍｍｌｕｎｇｆｕｒ　　Ｍ　ｉ
ｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ）　、ゲッチンゲン］から
、染色体ＤＮＡの部分的５ａｕ３Ａ消化物をｐＭＫ　３
のＢａｍＨ１部位中にクローニングすることによって誘
導した［Ｍ、Ａ、サリバン（Ｓ　ｕｌｌｉｖａｎ）ら、
遺伝子（Ｇｅｎｅ（１９８４）　２９．２１−２６１゜
α−アミラーゼ遺伝子をもつ３ｋｂのＤＮＡ断片を含有
するクローンの１つを、α−アミラーゼの構造遺伝子の
一部を欠失してｐＡＬＫｌを生成することによって修飾
した。ｐＡＬＫｌのＤＮＡ配列は、２３０ｂｐのＥｃｏ
Ｒｒ　−ＢｓｔＥ　Ｉ　Ｉ断片上に可能なリポソーム結
合部位（ＲＢＳ）およびシグナル配列を明らかにし、Ｂ
、５ｕｂｔｉｌｉｓ　　ｌＡ２８９からのα−アミラー
ゼと広い範囲にわなって相同性を有した［第２図中のＤ
ＮＡ配列とＭ。

ヤング（Ｙ　ａｎｇ）ら、核酸の研究（Ｎｕｃｌ、　Ａ
ｃ１ｄｓＲｅｓ、）（１９８３）、２３７−２４９とを
比較せよ１゜Ｂ　、　５ｕｂｔｉｌｉｓ中のび一アミラ
ーゼのシグナル配列の処理はアミノ酸位置４１において
起こることが期待された（第２図参照）ので、シグナル
配列のＰＳＴＩリーディングフレームへの融合はＢｓｔ
Ｅ１１部位において実施した。この目的で、われわれは
、ｐＡＬＫｌから、可能なシャイ〕／−ダルガノ（Ｓ　
ｈｉｎｅ　−Ｄ　ａｌｇａｎｏ）部位およびα−アミラ
ーゼのシグナル配列を含有する２３０ｂｐの断片を分離
した（第３八図中の断片Ａ）。Ｍｅｔ−ＰＳＴＩ−ＩＡ
またはＭｅｔ−ＰＳＴ’１−４Ａのいずれかのリーディ
ングフレームを含有する断片Ｂを、ｐＵＣ−Ｍｅｔ−Ｐ
ＳＴ　Ｉ　−ＩＡまたはｐｕｃ−Ｍｅｔ−ＰＳＴＩ−４
Ａから分離した（ｒＰＳＴＩ変異型遺伝子のクローニン
グ」を参照）。断片Ａの平滑末端をＢの平滑末端へ結合
すると、σ−アミラーゼのシグナル配列のリーディング
フレームはＭｅｔ−ＰＳＴＩ　　１．Ａまたは（Ｍｅｔ
−ＰＳＴｌ−４Ａ）のそれへ融合し、こによってＢｓｔ
ＥＩＩ−およびＮｃｏＩ−制限部位が再構成される（第
３Ｂ図参照）。ｌａｃ　　ｚプロモーターに関して八−
Ｂ−断片の向きを補正する（第３Ａ図）と、ＰＳＴＩ前
駆体の遺伝子はＩａｃ　　Ｚ”の制御下に１ａｃＺ′の
リーディングフレームの背後に配置され、Ｉａｃ　　ｚ
’のリーディングフレームはＴＡＡ−停止コトンにおい
て停止するであろう（第２図、断片ＡのＤＮＡ中の位置
−５８／−５６）、同−ｍＲＮＡ上の蛋白質合成の再開
始は、リポソームが停止コドンから約５０塩基下流のα
−アミラーゼの可能なシャイン−ダルガノ（Ｓ　ｈｉｎ
ｅ　−Ｄ　ａｌｇａｎｏ）部位に位置−１Ｏにおいて結
合した後起こるであろう（第２図参照）。

ｐＣ’Ｈ２３３（ＰＳＴＩ−ＩＡ）またはｐＣＨ２３３
、、、ｌ　（Ｐ　Ｓ　Ｔ　Ｉ　−４Ａ　）で形質転換し
たＥ。

ｃｏｌｉ　　６Ｍ１５からのＰＳＴＩ生成物は、蛋白質
の精製およびアミノ酸の配列決定後、１３アミノ酸がＰ
ＳＴ　１分子へ融合したことを明らかにした（実施例１
および３参照）　、　ａｓｎ　−−ａｌａ−ｇｌｕ−Ｌ
ｈｒ・・・・を使用して出発したこれらの追加のアミノ
酸は、第３Ｂ図においてアミノ酸３２から出発したσ−
アミラーゼのシグナル配列中のものと同一であることが
発見され、Ｅ、ｃｏｌｉのシグナルペプチドによるＰＳ
ＴＩ前駆体の処理（ｐｒｏｃｅｓｓ　ｉｎｇ）は、バシ
ルス（ｂａｃｉｌｌｕｓ）　ａ−アミラーゼのシグナル
配列中のアミノ酸配列・・・・ｐｒ。

−ａｌａ、−ａｌａ−ａｌａＢ↓後に起こることが示さ
れた。

ＰＳＴｉ変異型の生成のだめのそしてのシグナル配列ヲ
、Ｅ、ｃＯ１ｉペニシリンアシラーゼ（ＰＥＮＡＣ）、
Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＡＴＣＣ１１１０５からの細胞形質酵
素から誘導した。

ペニシリンアシラーゼ遺伝子のＤＮＡ配列［Ｗ。

ブルンス（Ｂ　ｒｕｎｓ）ら、（１９’８５）、ジャー
ナル・オブ・モレキュラー・アンド・アプライド・ジェ
不チックス（Ｊ　、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅ
ｔ、）、３．３６−４４］に従い、シャイン−ダルガノ
（Ｓ　ｈｉｎｅ　−Ｄ　ａｌｇａｎｏ）部位およびＰＥ
ＮＡＣのシグナル配列を含有するＤＮＡ断片を合成し、
これを第４図において配列の位置４０におけるシャイン
−ダルガノ（Ｓ　ｈｉｎｅ　−Ｄ　ａｌｇａｎｏ）部位
、Ｂｃｌ■部位より上流にＥｃｏＲＩ部位および下流に
ＥｃｏＲＶ部位を導入することによって修飾し、これに
よってもとのＰＥＮＡＣシグナル配列のアミノ酸９をバ
リンからメチオニンに変えた。Ｎｈｅ■部位をアミノ酸
２６におけるＰＥＮＡＣシグナル配列の処理部位に導入
した。ＰＥＮＡＣ−ＤＮＡ断片を、ＰＳＴＩ遺伝子につ
いて説明したように４つのＤＮＡ断片からアセンブリソ
ゲし、そしてＥｃｏＲＩおよびＮｈｅｌで制限したｐＢ
Ｒ３２２中にクローニングした（ｐＰＥ、ＮＡＣ１、第
５図）。ＤＮＡ断片バス（ｐａｓｓ）　１〜４のオリゴ
ヌクレオチドの合成は、アプライド・バイオシステムス
（Ａｐｐｌｉｅｄ　　Ｂ　１ｏｓｙｓｔｅａ＋ｓ）　３
８０型合成装置により製造業者の指示に従い実施した。

次いで、ＰＥＮＡＣシグナル配列を、ｌａｃ”の制御下
に、ｐＰＥＮＡＣＩからのＥｃｏＲＩ　−ＢａｍＨｒ断
片をｐＵＣ８中にクローニングすることによって動かし
た（ｐＵＣ２３６、第５図）。

ＰＳＴＩ−５Ｐ　（ｐＣＨ２３６１）の遺伝子およびＰ
ＳＴＩ−３Ｐ　（ｐＣＨ２３６２）の遺伝子をもつＰＥ
ＮＡＣ発現ベクターを構成するため１．）ＣＨ２３６を
制限し、モしてＮｈｅ　　Ｉ部位で修飾しく第５Ａ図参
照）そしてさらにＨｉｎｃＩＩＩで制限した。調製した
ｐＣＨ２３６中にＰＳＴＩ−５Ｐ　（またはＰＳＴＩ−
３Ｐ）の遺伝子を結合すると、ＰＥＮＡＣシグナル配列
はＰＳＴＩリーディングフレームに融合し、発現ベクタ
ーＩ）ＣＨ２３６１（またはｐＣＨ２３６２）が生成す
る。再びここでｐＣＨ２３３について前述Ｑたように、
ｌａｃ　　ｚ’ソリ−ィングフレームはＰＥＮＡＣのシ
ャイン−ダルガノ（Ｓ　ｈｉｎｅ　−Ｄ　ａｔｇａｎｏ
）部位の前のＴＡＧコドンにおいて停止するであろう（
位置７〜９、第４図）。

Ｍｅｔ−ＰＳＴＩ−４ＡＣ実施例４）を生成するため、
ｐＣＨ２３６３を前述のようにｐＣＨ２３６を調製する
ことによって構成した。Ｍｅｔ−ＰＳＴＩ−４Ａの遺伝
子はｐＵＣ−Ｍｅｔ−ＰＳＴＩ−４Ａから分離した（第
５Ａ図）。

質転換 標準の手順［Ｔ、マニアチス（ＭａｎｉａｔｉＳ）ら、
１９８２、分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　
Ｃｌ。

ｎｉｎｇ）　ｎｉｎｇ）−ア・ラボラトリ−・マニュア
ル（Ａ　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍａｎｎｕａｌ）
　；コールドφスプリング・ハーバ−（Ｃｏｌｄ　　Ｓ
　ｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク］を使
用して、能力（（Ｈ□ＩＩＩｐｅｔｅｎｔ）Ｅ、ｃｏｌ
ｉ　　ＤＨｌまたはＲＲＩ　　６Ｍ１５をｐＣＨ２３３
，２３３１，２３６１−２３６３で形質転換し、選択培
地（５０１１ｇ／ｍｌのアンピシリンを含むい寒天平板
）上で平板培養し、微小調製（＋＋＋１ｎｉｐｒｅｐａ
ｒａｔｉｏｎ）　Ｌ／、そして単一コロニーからプラス
ミドＤＮＡを制限分析した。遺伝子のセグメント中にあ
るいは発現ベクター中に存在する制限部位についてスク
リーニングした後、挿入したＤＮＡ断片のＤＮＡ配列を
合成遺伝子について前述したようにして決定した。

び誘発 ６Ｍ１５形質転換ｐＣＨ２３３，２３３１゜２３６１．
２３６２および２３６３を一夜の培養として増殖した。

この培地は蒸留水（ｐＨ７，０）中に３％に牛肉エキス
［ギプコ（Ｇ　１ｂｃｏ）　］、１゜５％の酵母エキス
（ギプコ）および０．５％のＫ。

ＨＰＯ，および５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有し
た。１００ｍ１の培地を充填した１０１００Ｏ容のエル
レンマイヤーフラスコ内で培養物をインキユベーシミン
することによって、すぐれた通気を達成するように注意
した。

フラスコをキューナー（Ｋｕｈｎｅｒ）　ＲＣ−６−Ｕ
上で２８℃または３７℃およびｌ　９０　ｒｐｍにおい
て振盪した。

ＰＳＴＩ変異型を生成するため、−夜の培養物を新鮮な
媒質中に３７℃でｌ：１００に希釈し、そして１．５Ａ
５５０ｎｍの光学濃度に約３時間増殖した。１ミリモル
のイソプロピルチオガラクトシド［シグマ（Ｓ　ｉｇｍ
ａ）　］　を培養物に添加することによって、ｌａｃプ
ロモーターの誘発（１ｎｄｕｃｔｉｏｎ）を実施した。

発酵を２０時間約４〜６Ａ５５０に統け、そして８００
０　ｒｐｍにおける遠心［１０分、４°Ｃ１コントロン
・セントリコン（Ｋ　ｏｎｔｒｏｎ　　Ｃｅｎｔｒｉｋ
ｏｎ）　Ｈ−４０１、ローターＡ６．１４］　によって
軽鎖を収穫した。

阻害剤の分離および特性づけ 酵素 ヒト白血球エラスターゼ（ＨＬＥ）およびブタ膵臓エラ
スターゼ（ＰＰＥ）を、エラスチン・プロダクツ・カン
パニー・インコーホレーテッド（Ｅｌａｓｔｉｎ　　Ｐ
ｒｏｄｕｃｔｓ　　Ｃｏｍｐａｎｙ、　　Ｉｎｃ、　Ｐ
、Ｏ。

Ｂｏｘ１４７、Ｐａｃｉｆｆｉｃ、　Ｍｉｓｓ、　５３
０６９／ＵＳＡ］　から入手した。

ウシα−キモトリプシン（ＣＨＴ　）をＥ、メルク（Ｅ
　、　Ｍｅｒｃｋ、　Ｄａｒｍａｓｔａｄｔ）から入手
した。

基ｌ 基質：　ＭｅＯＳ　ｕｃ　−Ａ　ｌａ　−Ａ　ｌａ　−
Ｐ　ｒｏ　−Ｖａｌ　−ｐＮＡ　　（ＨＬＥ）　　、Ａ
ｃ−Ａｌａ−Ａｌａ、−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ｐＮＡおよび
Ｓ　ｕｃ　−Ａ　Ｉａ　−Ａ　ｌａ　−Ａ　Ｉａ　−ｐ
Ｎ　Ａ（Ｐ　Ｐ　Ｅ）およびＳ　ｕｃ　−Ａ　Ｉａ　−
Ａ　ｌａ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｐ　ｈｅ−ｐＮＡ　（ＣＨＴ
）を、ペイチェム（Ｂ　ａｃｈｅｍ、　Ｂｕｉ）６１ｄ
□ｒｆ／　’３　ｖｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から入手した
。

クロマトグラフィーのための材料 セファデックス（Ｓ　ｅｐａｄｅｘ■）Ｇ−２５；セフ
７デツクス（Ｓ　ｅｐａｄｅｘ■）Ｇ−５０；セファロ
ース（Ｓ　ｅｐｈａｒｏｓｅ■）４Ｂ−ＣＩ、ＳＰ−セ
ファデックス（ＳｅｐａｄｅｘＯ）　Ｇ　−２５は、ト
イチェ・ファーマシア（Ｄ　ｅｕｔｃｈｅ　　Ｐ　ｈａ
ｒｍａｃｉａ、　Ｆ　ｒｅｉｂｕｒｇ）から入手した。

疏水性樹脂ＬＧＰ　　４４２９は、バイエル社（Ｂ　ａ
ｙｅｒ　　Ａ　Ｇ　、、Ｌ　ｅｖｅｒｋｕｓｅｎ）の製
品である。

方法 Ｇ、Ｂ、Ｏ−ゲル（Ｒｏｇｅｒ）ら、（１９７５）、バ
イオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・
コミュニケーションズ（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　Ｂ　ｉ。

ｐｈｙｓ　、　Ｒｅｓ　、　Ｃｏｍｍｕｎ、）、１６４
．４７８−４８４の方法に従って、セファロース（Ｓ　
ｅｐｈａｒｏｓｅ■）４Ｂ−ＣＩを過ヨウ素酸ナトリウ
ムで酸化した後、キモトリプシンと形成したシッフ塩基
をＮａ　［ＣＨＢ　Ｈ３１で還元することによって、キ
モトリプシンをセファロース（Ｓ　ｅｐｈａｒｏｓｅ■
）４Ｂ−ＣＩ上に固定化した。

ＨＰ　Ｌ　Ｃは適当なカラムを使用して実施した。

これらはテキストおよび／または対応する図面の凡例に
記載されている。

アミノ酸配列の決定 約０．５〜２ナノモルの蛋白質を３０μｌのＴＦＡ中に
溶解した。３ｍｇのポリブレンで予備処理したガラス繊
維のフィルターに試料を適用しｔ；。配列の分析は、ア
プライド・バイオシステムズ・インコーホレーテッドか
ら入手した気相蛋白質配列決定装置（５ｅｑｕｅｎｃｅ
ｒ）により、ヘイウィック［Ｒ，Ｍ、ヘイライ７り（Ｈ
ｅｗ＋ｃｋ）　、Ｍ　−Ｗ　。

フンカビラー（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌａｒ）　、Ｌ　、　
Ｅ　、　７−ド（Ｈｏｏｄ）　、Ｗ、　　ドレガー（Ｄ
　ｒｅｇｅｒ）、１９８１、ジャーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリー　（Ｊ　、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ
ｅｍ、）　、２５６．７９９０−７９９７１に従い実施
した。各段階で遊離したアミノ酸フェニルチオヒダント
イン誘導体を、シアノ−ＨＰＬＣカラム（デュポン）８
よびベイレウサー［Ｋ、ペイレウサ−（Ｂｅｙｒｅｕｔ
ｈｅｒ）　、Ｂ　。

ビースラー（Ｂ　１ｅｓｌｅｒ）、Ｊ、ボウエンス（Ｂ
　ｏｗｅｎｓ）、Ｒ−ジルドロップ（Ｄｉｌｄｒｏｐ）
　、Ｋ、ネウ７　ｙ　−（Ｎｅｒｆｅｒ）　、　Ｋ　、
スチューバ−（Ｓ　ｔｉｊｂｅｒ）、Ｓ、ザイス（Ｚａ
ｉｓ）　、Ｒ，ニーリング（Ｅ　ｈｒｉｎｇ）　、Ｐ−
ザベル（Ｚ　ａｂｅｔ）、１９８３、蛋白質化学におけ
る現代的方法（Ｍ　ｏｄｅｒｎ　　Ｍ　ｅｔｈｏｄｓ　
　ｉｎ　　Ｐ　ｒｏｔｅｉｎ　　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）
、３０３−３２５ページ、ワルター・デ・グルイタ−（
Ｗａｉｔｅｒｄ６　　Ｑ　ｒｕｙｔｅｒ）十カンパニー
　（Ｃｏ、）　、ベルリンｊが記載する分離システムを
使用して分析した。

Ｍ　　５１０ポンプ、ＷＩＳＰ　　７１０オートインゼ
クター、ＬＣ分光光度計Ｍ　４８１およびＳＨＩＭＡＤ
Ｕ積分計Ｃ−Ｐ３Ａを含むＷＡＴＥＲ３ＨＰＬＣシステ
ムを使用した。

酸性加水分解およびアミノ酸分析 約１ナノモルの蛋白質をパイレックス管に加え、これに
０．０５％の２−メルカプトエタノールを含有する６モ
ルのＨＣＩ　［１，Ｔ、ボッツ（ＰＯｔｔｓ）Ｊｒ、１
９６９、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａ　ｎ
ａｌ、　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、）、１３１、ｌ−１５〕の
２００μｍを添加した。管を真空下に密閉し、そして１
１０℃で２２時間インキュベーションした。加水分解物
を急速に乾燥し、１５０μｌの０．２モルのクエン酸ナ
トリウム緩衝液、ｐＨ２゜２、中に再溶解し、そしてろ
過した。蛍光検出器およびＳＨＩＭＡＤＵ積分計Ｃ−Ｐ
積分計装備するＢＩＯＴＲＯＮＩＣＬＣ５０００アミノ
酸分析装置で、アミノ酸分析を実施した。アミノ酸は、
ベンツン［Ｊ、Ｒ，ベンツン（Ｂ　ｅｎｓｏｎ）、Ｐ、
Ｅ、ヘアー（Ｈａｒｅ）、１９７５、プロシーデインダ
ス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシ
ズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）
ＵＳＡ、７又、６１９−６２２］が本質的に記載するよ
うにして、０−フタルジアルデヒドとの反応後、定量し
た。

酵素試験および培養物ろ液中の阻害活性のアッセイ 培養物ろ液は次のように試験した： ｌＯμｌのツイーン（ＴＷＥＥＮ）８０溶液（０゜５％
）および５０μｌの過塩素酸（７０％）を、１ｍｌの培
養物ろ液に添加した。２０分後、これらの試料を遠心し
、そして透明上澄みを２２５μｌのトリス塩基の飽和溶
液の添加によって中和した。

これらの溶液のアリコートを採取して阻害活性を決定し
た。

酵素のアッセイの条件は表４に記載されている。

一般に、試料を適当な緩衝液の体積で希釈し、そして酵
素を添加した。予備インキュベーション時間後、基質を
添加した（基質をＤＭＳＯ中に０９１モルの濃度で溶解
し、そして緩衝液で希釈して原溶液の濃度にした）。基
質からのｐ−ニトロアニリンの解放は、４０５ｎｍにお
いて、連続的に測定するか、あるは酢酸の添加により反
応をクエンチング（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）　した後に測
定した。１００％の値は、阻害剤を含有しない、展開試
料によって決定した。阻害百分率は、次の式によって計
算した： 阻害剤の絶対量は検量線によって、少量の精製された物
質が入手可能になるようになった後はじめて、計算する
ことができた。

この出願の実施例３および６の微生物は、ザ・ナショナ
ル・コレクション・オブ・インダストリアル・バクテリ
ア（Ｎ　ＣＩ　Ｂ　）（Ｔ　ｈｅ　　Ｎ　ａｔｉｏｎａ
ｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　　Ｏｆ　Ｉ　ｎｄｕｓｔｒｉ
ａｌ　　Ｂ　ａｃｔｅｒｉａ。

Ｔｏｒｒｙ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　５ｔａｔｉｏｎ、
　Ｐ、　Ｏ，Ｂｏｘ３１、ｌ　３５　　Ａｂｂｅｙ　　
Ｒｏａｄ、　Ａｂｅｒｄｅａｎ　　Ａ　Ｂ９　８　Ｄ　
Ｇ　ＳＳ　ｃｏＬｌａｎｄ、　Ｕ　ｎ１ｔｅｄ　　Ｋ　
ｉｎｇｄｏｍ）に、それぞれ、表示ＮＣＩＢ　　１２３
６５およびＮＣＩＢ　　１２３６４で受託されている。

実施例１ Ａｓｎ−”　−Ａ　ｌａ−”　−Ｇ　ｌｕ−目−Ｔｈｒ
−１０−Ａ　ｌａ−’−Ｈｉｓ−”−Ｌｙｓ−’−５ｅ
ｔ−’−Ａｓｎ−’−Ｇｌｕ−’−Ｖａｌ−”−Ｔｈｒ
−”−Ｍｅｔ−’−Ｌｅｕ”−Ｇ　ｌｕ”−Ａｒｇ”−
Ａｌａ”−ＰＳＴ　Ｉ　　（ＰＳＴ　ｌ−４Ａ［微小融
合（ｍｉ　　ｎ１ｆｕｓｉｏｎ）　］　）の分離ｌＯリ
ットルの６Ｍ１５／ｐＣＨ２３３１の発酵ブロスを、３
５０ｍ１の過塩素酸（７０％）で処理した。沈殿を遠心
によって除去した。上澄みを８ＮのＫＯＨ溶液で中和し
た。４°Ｃで放置後、ブフナー漏斗を使用してＫ　Ｃ１
０、の沈殿を吸引ろ過した。

６液をキモトリプシン−セファロース（Ｓ　ｅｐｈａｒ
ｏｓｅ■）４Ｂ−ＣＩ接合体のゲルのベッド（７×９　
ｃｍ）に４℃において通した。流出液の２８０ｎｍにお
ける光学濃度がゼロに到達するまで、ゲルを水で洗浄し
た。ゲルを、さらに、５００ｍ１の０゜２モルの酢酸塩
緩衝液（ｐＨ５）および５００ｍ１の水で洗浄した。最
後に、ゲルを０．２モルの酢酸で溶離し、ＨＣＩでｐＨ
２，０に調節した。溶離のプロフィルを第６図に記載す
る。活性の分画（白血球エラスターゼの阻害アッセイに
おいて測定したように）をプールし、固体の酢酸ナトリ
ウムの添加によってｐＨ４に調節し、そして回転蒸発に
よって濃縮する。塩類および少量の不純物を、最後に、
ＲＰ−３１８カラムの調製用ＨＰＬＣによって除去した
。溶離のプロフィルを第７図に示す。各分画の純度は分
析用ＨＰＬＣによって検査した。これらの結果に従い、
３つのプール、管４２−４４．４５−４６および４７−
４９をつくり、これらは凍結乾燥後６ｍｇ、１２ｍｇお
よび５ｍｇを与えた。最高の純度は中央の分画において
達成され、その分析用ＨＰＬＣの線図を第８図に示す。

アミノ酸組成、配列分析および阻害スペクトルについて
のデータを表５〜７に記載する。

実施例２ ＢｒＣＮ開裂による微小融合蛋白質からのＬｅｕ”−Ｇ
ｌｕ”−Ａｒｇ”−Ａｌａ”　　−ＰＳＴＩ　（ＰＳＴ
Ｉ−４Ａ）の調製 ２．９３ｍｇ（０，４６フイクロモル）のＰＳＴ　１−
４Ａ微小融合生成物（実施例１）を、１ｍｌの７０％の
ギ酸中に溶解した。それを、３ｍｇの臭化シアンの添加
および暗所中の窒素雰囲気下の室温における１８時間の
インキュベーションによって、開裂した。この反応を１
０ｍ１の水の希釈によって停止した。水および揮発性副
生物を凍結乾燥によって除去した。Ｌｅｕ”　−Ｇ　Ｉ
ｕ”　−Ａｒｇ”　−Ａ　Ｉａ”　−ＰＳＴＩ　　（Ｐ
ＳＴＩ−４Ａ）を、副生物および開裂しない融合蛋白質
から、１％のギ酸中のセファデックス（Ｓｅｐａｄｅｘ
’）　Ｇ　−５０（超微細）カラム（２，５Ｘ９０ｃｍ
）のゲルクロマトグラフィーによって分離した。分画は
、それらの保持時間に従い、パイロラド（Ｂｉｏｒａｄ
）　ＲＰ−３１８（４゜６Ｘ２５０ｍｍ）大型カラム上
にプールした、溶液Ａ：Ｑ、１％のＴＦＡ、溶液Ｂ　；
　０．１％のＴＦＡ／６０％のアセトニトリル、流れｌ
　ｍｌ／分、室温、２１０ｎｍにおける検出；勾配：　
０−６０％。

分画を凍結乾燥し、そして同一条件下の同一カラムの再
クロマトグラフィーによって精製した。

活性の分画を集め、そして凍結乾燥した。純度は、実施
例１に記載したように、Ｌ　ｅｕ”　−Ｇ　ｌｕ”　−
Ａｒｇ”−Ａｌａ”−ＰＳＴ　Ｉ　（ＰＳＴＩ−４Ａ）
の分析用ＨＰＬＣの層間によって検査した。阻害剤は、
表５〜７に記載するように、アミノ酸分析、Ｎ−末端配
列決定、ＨＰＬＣおよびエラスターゼ阻害アッセイによ
って特徴づけた。

実施例３ Ａｓｎ−１３−Ａ　Ｉｓ−”　−Ｇ　Ｉｕ−”　−Ｔｈ
ｒ−”　−Ａ　ｌａ−’−Ｈｉｓ”’　−Ｌ　ｙｓ−’
　−Ｓ　ｅｒ−’　−Ａｓｎ−’　−Ｇ　Ｉｕ−’　−
Ｖａｌ−３−Ｔｈｒ−”　−Ｍｅじ１、Ｌ　ｅｕ”　−
Ａ　Ｉａ”　−ＰＳＴＩ　（ＰＳＴＩ−Ｉ　　Ａ　［微
小融合］）の分離 ４リツトルの６Ｍ　ｌ　５／ｐＣＨ２３３の発酵ブロス
を１２０ｍ１の過塩素酸（７０％）で処理し、そして形
成した沈殿を遠心［３０分、４℃、４０００　ｒｐｍ、
ベックマン（Ｂ　ｅｃｋｍａｎ）　Ｊ　−６］によって
除去した。上澄みを８ＮのＮａＯＨ溶液でｐＨ８，６に
調節し、そしてキモトリプシン−セファロース（Ｓ　ｅ
ｐｈａｒｏｓｅ■）４Ｂ−Ｃ１接合体（８×ｌＯｃｍ）
に通過させた。流出液の２８０ｎｍにおける光学濃度が
基線のレベルに到達するまで、ゲルを０．２モルのトリ
ス−ＭＣＩ緩衝液（ｐＨ８，６）で洗浄した。次に、ゲ
ルを順次に水および０．１モルの酢酸で溶離し、ＨＣＩ
でｐＨ２に調節した。

阻害活性を含有する分画（白血球エラスターゼに対して
測定した）をプールし、８ＮのＮａＯＨ溶液でｐＨ２，
７に調節し、そして、前もって０゜１５％のトリフルオ
ロ酢酸（ＮａＯＨ溶液でｐＨ２，７に調節した）と平衡
化したＳＰ−セファデックス（Ｓ　ｅｐａｄｅｘ■）　
Ｇ　−２５（２，５Ｘ　３５ｃｍ）に適用した。

出発緩衝液で洗浄した後、このカラムを出発緩衝液中の
０−１モルのＮａＣ１の直線の勾配で展開した。分画を
、それらの阻害活性および分析用ＨＰＬＣ展開（ＲＰ−
３１８、Ｂ　ｌｏ−ＲＡＤ）の結果に従い、プールした
。プールをＵＭ２膜［アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）　］　
を使用する限外ろ過によって濃縮し、そして最終の精製
をＲＰ　　３１８の調製用クロマトグラフィー（勾配、
０．１５％のトリフルオロ酢酸中の０−６０％のアセト
ニトリル、６０分）によって達成した。２つのプールを
形成し、凍結乾燥し、８．７ｍｇの均質な物質および１
゜９ｍｇの少量の不純物を含む物質が得られた。分析の
データ（アミノ酸分析、配列の分析および阻害活性）を
表５〜７に記載する。

ＰＳＴＩ−ＩＡ微小融合蛋白質の臭化シアンの開裂を、
実施例２に記載するようにして実施し、そしてＬｅｕ”
−Ａｌａ”−ＰＳＴＩ　（ＰＳＴＩ−ＩＡ）を得た。

実施例４ Ｍｅｔ−’　　Ｌｓｕ”　　Ｇ　ｌｕ”−Ａｒｇ”　　
Ａ　ｌａ”−ＰＳＴＩ（Ｍｅｔ−ＰＳＴ　　ｌ−４Ａ）
の分離１リツトルの６Ｍ１５／ｐＣＨ２３６３の発酵ブ
ロスを、実施例１に記載するように、過塩素酸で処理し
、遠心し、そして中和し、そして最後に、キモトリプシ
ン−セファ０−ス（Ｓ　ｅｐｈａｒｏｓｅ’ｌＤ　）４
Ｂ−ＣＩ接合（２，５ＸｌＯｃｍ）に通過させた。

ゲルを、実施例１に記載するように、水、酢酸塩緩衝液
、および水で洗浄した。０．２モルの酢酸、ｐＨ２（Ｈ
ＣＩで調節）で溶離することによって、阻害剤を脱着し
た。阻害剤を含有する分画をプールし、ＮａＯＨ溶液の
添加によってｐＨ４に調節し、そして回転蒸発によって
５ｍｌに濃縮した。最終の精製をＲＰ　　３１８の調製
用クロマトグラフィー（勾配、０．１５％のトリフルオ
ロ酢酸中の０−６０％のアセトニトリル）によって達成
した。プールした活性分画の凍結乾燥により１．８ｍｇ
の物質が得られた。それ以上のデータ（アミノ酸組成、
配列の分析および阻害活性）を表５〜７に記載する。

実施例５ Ｔｙｒ”−Ｇｌｕ”−Ａｒｇ”−ＰＳＴ　　Ｉ　（ＰＳ
ＴＩ−３Ｐ）の分離 ７５０ｍ１の６Ｍ１５／ｐＣＨ２３６２の発酵ブロスを
、２５ｍ１の過塩素酸で処理し、そして３０分後遠心し
た。上澄みを４ＮのＫＯＨの添加によって中和し、そし
て６時間後、ＫＣｌ０．をろ過によって除去した。ろ液
をキモトリプシン−セファロース（Ｓ　ｅｐｈａｒｏｓ
ｅＯ）　−４８−ＣＩカラム（２，５Ｘ　７　ｃｍ）に
装入し、これを順次に水および０．２モルの酢酸で洗浄
した。０．２モルの酢酸（Ｈ，ＣＩでｐＨ１，８に調節
した）によって阻害剤を脱着した。活性分画をプールし
、ＮａＯＨ溶液の添加によってｐＨ３，５に調節し、そ
して回転蒸発によって濃縮した。わずかの沈殿を遠心に
よって除去し、そして上澄みをＲＰ−８の調製用ＨＰＬ
Ｃに通過させた。活性分画を凍結乾燥すると、約０．８
ｍｇの阻害剤が得られ、これは分析用ＨＰＬＣにおいて
均質であった。分析データ（アミノ酸組成、配列の分析
および阻害活性）を表５〜７に記載する。

実施例６ Ｖａｌ”−Ｇｌｕ”−Ａｒｇ”−ＰＳＴ　　Ｉ　（ＰＳ
Ｔｌ−５Ｐ）の分離 ３リツトルの６Ｍ１５／ｐＣＨ２３６１の発酵ブロスに
、ｌｏＯｍｌの過塩素酸（７０％）を添加した。３０分
後、沈殿をろ過し、そして上澄みを８ＮのＮａＯＨ溶液
でｐＨ７にした。次いで、それを、前もって０．ＩＮの
ＨＣＩ、メタノールおよび水で洗浄した疎水性樹脂（Ｌ
ｅｗａｐｏｌ　　Ｌ　Ｇ　Ｐ４４２９、バイエル社）（
直径：３ｃｍ、ベッドの高さ：４０ｃｍ）に通過させｔ
；。この樹脂を水で洗浄し、引続いて０〜７０％のメタ
ノールの直線の勾配で溶離した。阻害活性を各分画にお
いて決定した（蒸発によりメタノールの除去後、白血球
エラスターゼの阻害アッセイ）。活性分画をプールし、
そして真空蒸発により濃縮した。濃縮物をトリフルオロ
酢酸の添加によってｐＨ２，７に酸性化し、そして、０
．１５％のトリフルオロ酢酸（ＮａＯＨでｐＨ２，７に
調節した）と平衡化したｓＰ−セファデックス（Ｓ　ｅ
ｐａｄｅｘ■）Ｇ−２５（２，５ＸＩＯｃｍ）に適用し
た。

このカラムを出発緩衝液中の０〜１モルのＮａＣ１の直
線の勾配で展開した。阻害活性の分画をプールし、中和
し、濃縮し、そしてセファデックス（Ｓ　ｅｐａｄｅｘ
■）Ｇ−２５のろ過により、０．０１モルのリン酸塩緩
衝液、ｐＨ７，０，を溶離剤として使用して脱塩した。

活性分画をｐＨ２，７に調節し、再びｓｐ−セファデッ
クス（Ｓ　ｅｐａｄｅｘ■）Ｇ−２５のクロマトグラフ
ィーにかけ、０．１〜０゜５モルのＮａＣｌ、ｐＨ２，
７、の直線の勾配を使用した。

活性溶離液をｐＨ４，０に調節し、濃縮し、そして、Ｒ
Ｐ−３１８の調製用ＨＰＬＣに通過させることによって
さらに精製した。この工程を１回反復した。最後の精製
は、ファーマシア（Ｐ　ｈａｒｍａｃｉａ）からのモノ
（Ｍｏｎｏ）　−８−カラムの調製用ＨＰＬＣおよび引
続＜ＲＰ−３１８の再クロマトグラフィーによって達成
した（第９図）。精製した生成物の分析用ＨＰＬＣ線図
を第１Ｏ図に示す。

それ以上のデータ（アミノ酸組成、配列、阻害活性）を
表５〜７に記載する。

図面についての凡例 第１図：　　　ＰＳＴＩマスター遺伝子のヌクレオチド
および対応するアミノ酸配列。

カッコおよび番号は遺伝子をアセン ブリングするために使用した合成オ リゴヌクレオチドを示す。ダッシュ を付した線は、遺伝子のセグメント ■（第１部分）およびセグメント■ Ｉ（第２部分）の分割を示す。

第２図：　　位置−ＩＯ付近に可能なシャイン−ダルガ
ノ（Ｓ　ｈｉｎｅ　−Ｄ　ａｌｇａｎｏ）部位部位（Ｓ
Ｄ）およびα−アミラーゼ からのシグナル配列しアンダークラ インド（ｕｎｄｅｒｃ　Ｉ　１ｎｅｄ）アミノ酸配列、
位置ｌにおいて出発する］を含 有するｐＡＬＫｌからの２３０ｂｐの ＥｃｏＲＩ　−ＢｓｔＥ　Ｉ　ｌのＤＮＡ配列。

外酵素について可能な処理部位はシ グナル配列のアミノ酸４１に示され ている。

第３Ａ図：　プラスミドをＢｓＬＥ　Ｉ　Ｔで切断し、
そしてＤＮＡｐｏｌＩ　（大きい断片）の存布下にｄＮ
ＴＰを充填すること によって、断片ＡをｐＡｃＫＩから 分離した。ＤＮＡをフェノール化し、 エタノール沈殿し、モしてＥｃｏＲＴ でさらに制限した。２％のアガロー スゲル上の分離後、２３０ｂｐのＤＮ Ａ断片を分離した。同様に、ｐＵＣ −Ｍｅｔ−ＰＳＴｆ−ＩＡから（また はｐＣＨ２３３１の構成のためｐＵ Ｃ−Ｍｅｔ−ＰＳＴＩ−４Ａ）　、Ｎｃ。

工による制限、ｄＮ　Ｔ　Ｐの充填、エタノール沈殿、
およびそれ以上のＥ ｃｏＲＩによる制限によって、１８０ ｂｐの断片Ｂを分離した。断片Ａおよ びＢの両者を結合してＥｃｏＲＩ制限 ｐＵｃ８にした。

第３Ｂ図：　　第３Ｂ図は、Ｍｅｔ−ＰＳＴＩ−ＩＡま
たは−４へのための、α−アミラ −ゼシグナル配列（断片Ａ）とＭｅｔ −ＰＳＴＩ遺伝子（断片Ｂ）との間 の接合における配列を示す。

第４図：　　第４図は、可能なシャイン−ダルガノ（Ｓ
　ｈｉｎｅ　−Ｄ　ａｌｇａｎｏ）部位（位置ｌＯ付近
）およびアミノ酸Ａｌａ！１における処理部位をもつＥ
、ｃｏｌｉのペニシリンアシラーゼの修飾シグナル 配列を含有する、合成ＥｃｏＲＩ−Ｎ ｈｅｌ　　ＤＮＡ断片を示す。

第５Ａ図：　　　ＥｃｏＲＩおよびＮｈｅｌで制限した
、）ＢＲ３２２中に、合成ＰＥＮＡ Ｃ配列（９６ｂｐのＥｃｏＲＩ　−Ｎｈｅｌ断片、第４
図参照）をクローニング して、ｐＰＥＮＡｃｌを生成した。ｐ ＰＥＮＡＣＩをＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨｌで制限し、
そしてシャイン−ダ ルガノ（Ｓ　ｈｉｎｅ　−Ｄ　ａｌｇａｎｏ）部位およ
びＰＥＮＡＣシグナル配列を含有 する２５０ｂｐのＤＮＡ断片を、Ｅｃ。

Ｒ１およびＢａｍＨＩで制限したｐＵ Ｃ８中に結合してｐＣＨ２３６を 生成した。

ｐＣＨ２３６１（またはｐＣＨ３ ６２）を構成するため、ｐＣＨ２３ ６をＮｈｅ　　Ｉで制限し、そしてＤＮＡｐｏｌＩ（大
きい断片）の存在下にｄＣＴＰおよびｄＴＴＰを充填し
た。

ＤＮＡをフェノール化し、エタノー ル沈殿し、そしてＳｌヌクレアーゼ 反応を実施して、ＰＥＮＡＣシグナ ル配列中のシグナルペプチダーゼの 開裂部位にＡｌａ、、のための平滑末端のコドンをつく
った（第４図参照）。

ＤＮＡ沈殿後、ｐＣＨ２３６をＨｉ ｎｄｌｌｌでさらに制限し、そしてベ クターを０．８％のアガロースゲル 上の電気泳動後分離した。

ＨｉｎｃＩＩおよびＨｉｎｄＩ　Ｉ　ＩでｐＵＣ−ＰＳ
ＴＩ−５Ｐを制限するこ とによってＰＳＴＩ−５Ｐの遺伝子 を分離し、そして１８０ｂｐの断片を ２％のアガロースゲルの電気泳動後 分離した。ＰＳＴＩ−３０の遺伝子 を同様にｐＵＣ−ＰＳＴＩ−３Ｐか ら分離した。ｐＵＣ−ＰＳＴＩ−５ Ｐ（またはｐＵＣ−ＰＳＴＩ−３） からの１８０ｂｐのＨｉｎｃＩ　Ｉ　−Ｈ１ｎｄＩＩＩ
断片をｐＣＨ２３６中に結合 して、ｐＣＨ２３６１（またはｐｃ Ｈ２３６２）を生成した。

第５Ｂ図：　　ｐＣＨ２３６をＮｈｅＩで制限し、そし
てＤＮＡｐｏｌｌ　（大きい断片）の存在下にｄＣＴ　
Ｐで充填した。Ｄ ＮＡ沈殿後、Ｓ１ヌクレアーゼ処理 を実施して平滑末端を生成した。ベ クターをさらにＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉで制限し、そして０
．８％のアガロースゲ ル上の電気泳動後分離した。Ｍ　ｓ　ｔ　−ＰＳＴＩ−
４Ａの遺伝子をｐＵＣ− Ｍｅｔ−ＰＳＴＩ−４ＡからＮｃｏＩの制限によって分
離し、モしてｄＮＴ Ｐで充填した。エタノール沈殿後、 ＤＮＡをＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉでさらに制限し、モして１
８０ｂｐの断片を２％の アガロースゲル上の電気泳動後分離 した。

第６図：　　固定化したキモトリプシンを有するカラム
（７％９ｃｍ）を使用する４℃ における親和性クロマトグラフィー による、ＰＳＴＩ−４，Ａ　［微小融合］の分離。１１
ｍ１の分画を集めた。横 座標は管の番号を示し、そして縦座 標は２８０ｎｍにおける吸収を示す。

カラムは水で（管４０まで）、次い で０．２モルの酢酸塩緩衝液ｐＨ５。

０で（管７０まで）次いで蒸留水で （管８５まで）展開した。最後の脱 着は０．２モルの酢酸−塩酸、ｐＨ２。

０、で達成した。阻害剤は管９２− １０８中に溶離された。

第７図：　　　ＲＰ−３１８−カラム（２５０−４゜６
ｍｍ）　　（Ｂ　Ｉ　０−ＲＡＤ）のキモトリプシン−
親和性カラム（管９２− １０８）の溶離液を含有するＰＳＴ ｌ−４Ａ　［微小融合１の調製用ＨＰ ＬＣ，溶離は、０．１５％のトリフ ルオロ酢酸および０．１５％のトリ フルオロ酢酸を含有する６０％のア セトニトリルの直線の勾配を使用し て実施した（２時間）。流れ：１ｍ１ Ｚ分、１５０バール；２２０ｎｍにお ける検出。縦座標は２２０ｎｍにおけ る吸収を示し、そして横座標は管の 番号を示す。阻害剤は管４４−５０ 中に溶離された。

第８図二　　予備カラム（７５Ｘ　７．５ｍｍＸＬＫＢ
）を使用するウルトラ−パック （ｕｌｔｒａ　−ｐａｋ）　Ｔ　Ｓ　Ｋ　　Ｓ　Ｐ　−
５ＰＷ−カラムによるＰＳＴｉ−４Ａ ［微小融合］の分析用ＨＰＬＣ。

条件： 溶媒Ａ−０，１５％のトリフルオ ロ酢酸および０．１モル のＮａ、Ｓｏい １０％のメタノール ｐＨ２，７゜ 溶媒Ｂ−０，１５％のトリフルオ ロ酢酸；０．６モルの Ｎａ、ＳＯい １０％のメタノール ｐＨ２，７゜ 勾配：　　０〜５分　５％のＢ１ ５〜３０分　１５〜１０ ０％の８１ ３０〜３３分　１００〜 １５％のＢ１ ３３〜４０分　１５％の 流れ：　　　１．５ｍｌ／分、２０バール。

検出：　　　２１５ｎｍ０ 第９図：　　　　ＲＰ−３１８（２５０Ｘ４．６ｍｍ）
（ＢＩＯ−ＲＡＤ）の調製用ＨＰ ＬＣによるＰＳＴＩ−５Ｐの最後の 精製。溶離は０．１５％のトリフル オロ酢酸および０．１５％のトリフ ルオロ酢酸を含有する６０％のアセ トニトリルの直線の勾配を使用して 実施した（２時間）。流れ：１ｍ１ ／分、１５０バール；２８０ｎｍに おける検出。阻害剤は管２０−２７ 中に溶離された。

第１０図：　バイオ−シル（Ｂｉｏ−３ｉｌ■）ＴＳＫ
　　ＣＭ−３−３Ｗカラム（７５× ７．５ｍｍ）（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を使 用するＰＳＴＩ−５Ｐの分析用ＨＰ ＬＣ。

条件： 溶媒Ａ−０，１５％のトリフルオ ロ酢酸、１０％のメタノ ール、０．１モルのＮａ２ Ｓ　Ｏｓ。

溶媒Ｂ−０，１５％のトリフルオ ロ酢酸、１０％のメタノ ール、０．６モルのＮａ２ ５Ｏ１゜ 勾配二　　０〜５分　１５％のＢ１ ５〜３０分　１５〜１０ ０％のＢ１ ３０〜３２分　１００〜 １５％のＢ１ ３２〜４０分　１５％の 流れ：　　　１．５ｍｌ／分、２２バール。

検出：　　　２１５ｎｍ。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＰＳＴＩマスター遺伝子のヌクレオトドおよ
び対応するアミノ酸配列を示す。 第２図は、ｐＡＬＫＩＫらあのα−アミラーゼシグナル
配列を示す。 第３Ａ図は、ｐＣＨ２３３の構成を示す。 第３Ｂ図は、Ｍｅｔ−ＰＳＴ　Ｉ　−Ｉ　Ａまたは一４
Ａのための、σ−アミラーゼシグナル配列（断片Ａ）と
Ｍｅｔ−ＰＳＴＩ遺伝子（断片Ｂ）との間の接合におけ
る配列を示す。 第４図は、ＰＥＮＡＣの配列を示す。 第５Ａ図は、ｐＣＨ２３６およびｐＣＨ２３６１（ｐＣ
Ｈ２３６２）の構成を示す。 第５Ｂ図は、ｐＣＨ２３６３の構成を示す。 第６図は、固定化したキモトリプシンを有するカラム（
７Ｘ９ｃｍ）を使用する４℃における親和性クロマトグ
ラフィーによる、ＰＳＴＩ−４Ａ　［微小融合１の分離
を示す。 第７図は、ＲＰ−３１８−カラム（２５０−４゜６ｍｍ
）　　（Ｂ　Ｉ　０−ＲＡＤ）のキモトリプシン−親和
性カラム（管９２−１０８）の溶離液を含有するＰＳＴ
Ｉ−４Ａ　［微小融合］の調製用ＨＰＬＣを示す。 第８図は、予備カラム（７５Ｘ　７．５ｍｍ）（ＬＫＢ
）を使用するウルトラ−パック（ｕｌｔｒａ　−ｐａｋ
）ＴＳＫ　　５Ｐ−５ＰＷ−カラムによるＰＳＴＩ−４
Ａ［微小融合］の分析用ＨＰＬＣを示す。 第９図は、ＲＰ−３１８（２５０Ｘ４．６ｍｍ）（Ｂ１
０−ＲＡＤ）の調製用ＨＰＬＣによるｐｓＴｌ−５Ｐの
最後の精製を示す。 第１０図は、パイオーシル（Ｂｉｏ−５ｉｌ■）ＴＳＫ
　　ＣＭ−３−ＳＷカラム（７５Ｘ　７．５ｍｍ）（Ｂ
　Ｉ　０−ＲＡＤ）を使用するＰＳＴＩ−５Ｆの分析用
ＨＰＬＣを示す。 ｐＣＨ２３６３の槙べ ＦＩＧ、　５　Ｂ ＦＩＧ、７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、膵臓分泌トリプシン阻害剤の配列を本質的に有する
   ペプチドであって、前記配列中に存在するアミノ酸の１
   または２以上が１つの他の天然に産出するアミノ酸によ
   って置換されていることを特徴とする前記ペプチド。 ２、前記配列はヒト膵臓トリプシン阻害剤の配列から誘
   導される特許請求の範囲第１項記載のペプチド。 ３、位置１７、１８、１９、２０、２１、２９、３２お
   よび３６におけるアミノ酸の１または２以上が天然に産
   出するアミノ酸によって置換されている特許請求の範囲
   第１または２項記載のペプチド。 ４、位置１３におけるＧｌｕ、ＡｓｐまたはＬｅｕ、位
   置１４におけるＧｌｕ、ＡｓｐまたはＡｓｎ、位置１７
   におけるＴｈｒ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｌｅｕまた
   はＭｅｔ、位置１８におけるＬｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、
   Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、Ｐ
   ｈｅ、Ａｒｇ、ＴｒｐまたはＬｙｓ、位置１９における
   Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ＬｅｕまたはＩｌｅおよび位置２０に
   おけるＴｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｇｌ
   ｕ、Ｇｌｎ、ＨｉｓまたはＡｒｇ、位置２１におけるＧ
   ｌｕ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ｔｈ
   ｒ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、ＡｓｐまたはＡｓｎ、位置２９に
   おけるＬｙｓ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、Ａｓｐまたは
   Ａｓｎ、位置３２におけるＰｒｏ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａ
   ｓｎ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、ＡｒｇまたはＨｉｓお
   よび位置３６におけるＡｓｎ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｓｅｒ
   、Ｇｌｙ、Ｔｙｒ、ＶａｌまたはＧｌｕのアミノ酸を含
   有してなるが、Ｌｅｕ＾１＾３−Ａｓｎ＾１＾４−Ｔｈ
   ｒ＾１＾７−Ｌｙｓ＾１＾８−Ｉｌｅ＾１＾９−Ｔｙｒ
   ＾２＾０−Ａｓｎ＾２＾１−Ａｓｐ＾２＾９−Ｐｒｏ＾
   ３＾２−Ｖａｌ＾３＾８およびＬｅｕ＾１＾３−Ａｓｎ
   ＾１＾６−Ｔｈｒ＾１＾７−Ｌｙｓ＾１＾８−Ｉｌｅ＾
   １＾９−Ｔｙｒ＾２＾０−Ａｓｐ＾２＾１−Ａｓｎ＾２
   ＾９−Ｐｒｏ＾３＾２−Ｖａｌ＾３＾６の組み合わせを
   除外する特許請求の範囲第１または３項記載のペプチド
   。 ５、群 【遺伝子配列があります】 から選択され、さらに位置１３におけるＧｌｕ、Ａｓｐ
   またはＬｅｕ、位置１４におけるＧｌｕ、Ａｓｐまたは
   Ａｓｎ、位置３２におけるＰｒｏ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａ
   ｓｎ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、ＡｒｇまたはＨｉｓお
   よび位置３６におけるＡｓｎ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｓｅｒ
   、Ｇｌｙ、Ｔｙｒ、ＶａｌまたはＧｌｕを含む特許請求
   の範囲第１〜３項のいずれかに記載のペプチド。 ６、位置１におけるＡｓｐより前に存在するアミノ酸ま
   たはペプチド配列を有する特許請求の範囲第１〜４項の
   いずれかに記載のペプチド。 ７、組換えＤＮＡ技術によって生成された特許請求の範
   囲第１〜６項のいずれかに記載のペプチド。 ８、特許請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載のペプ
   チドの遺伝情報を指定するＤＮＡ。 ９、配列 【遺伝子配列があります】 およびその変異型および機能的同等体を有するＤＮＡ。 １０、位置１３、１４、１７、１８、１９、２０、２１
   および２９、３２および３６におけるアミノ酸の遺伝情
   報を指定する１または２以上のコドンが天然に産出する
   アミノ酸の遺伝情報を指定するコドンによって置換され
   ている特許請求の範囲第７項記載のＤＮＡ。 １１、位置１３におけるＧｌｕ、ＡｓｐまたはＬｅｕ、
   位置１４におけるＧｌｕ、ＡｓｐまたはＡｓｎ、位置１
   ７におけるＴｈｒ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｌｅｕま
   たはＭｅｔ、位置１８におけるＬｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ
   、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、
   Ｐｈｅ、Ａｒｇ、ＴｒｐまたはＬｙｓ、位置１９におけ
   るＧｌｕ、Ａｓｐ、ＬｅｕまたはＩｌｅおよび位置２０
   におけるＴｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｇ
   ｌｕ、Ｇｌｎ、ＨｉｓまたはＡｒｇ、位置２１における
   Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ｔ
   ｈｒ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、ＡｓｐまたはＡｓｎ、位置２９
   におけるＬｙｓ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、Ａｓｐまた
   はＡｓｎ、位置３２におけるＰｒｏ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、
   Ａｓｎ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、ＡｒｇまたはＨｉｓ
   および位置３６におけるＡｓｎ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｓｅ
   ｒ、Ｇｌｙ、Ｔｙｒ、ＶａｌまたはＧｌｕのアミノ酸の
   遺伝情報を指定するコドンからなるが、Ｌｅｕ＾１＾３
   −Ａｓｎ＾１＾４−Ｔｈｒ＾１＾７−Ｌｙｓ＾１＾８−
   Ｉｌｅ＾１＾９−Ｔｙｒ＾２＾０−Ａｓｎ＾２＾１−Ａ
   ｓｐ＾２＾３−Ｐｒｏ＾３＾２−Ｖａｌ＾３＾６および
   Ｌｅｕ＾１＾３−Ａｓｎ＾１＾４−Ｔｈｒ＾１＾７−Ｌ
   ｙｓ＾１＾８−Ｉｌｅ＾１＾９−Ｔｙｒ＾２＾０−Ａｓ
   ｐ＾２＾１−Ａｓｎ＾２＾９−Ｐｒｏ＾３＾２−Ｖａｌ
   ＾３＾６の組み合わせを除外する特許請求の範囲第７ま
   たは８項記載のＤＮＡ。 １２、下流にメチオニンの遺伝情報を指定するコドンま
   たは先導ペプチドの遺伝情報を指定するＤＮＡをさらに
   含む特許請求の範囲第７〜９項のいずれかに記載のＤＮ
   Ａ。 １３、特許請求の範囲第７〜１０項記載の１または２以
   上のＤＮＡを含んでなる発現ベクター。 １４、特許請求の範囲第１１項記載の発現ベクターで形
   質転換された宿主有機体。 １５、特許請求の範囲第１〜７項のいずれかに記載のペ
   プチドを生成するときの特許請求の範囲第１４項記載の
   宿主有機体の使用。 １６、工程 ａ）適当な条件下に宿主有機体を培養し、 ｂ）前記培養物からペプチドを回収し、そしてｃ）前記
   ペプチドを精製する、 を含んでなる特許請求の範囲第１〜６項のいずれかに記
   載のペプチドを調製する方法であって、前記宿主有機体
   は特許請求の範囲第１３項記載の発現ベクターで形質転
   換されていることを特徴とする前記方法。 １７、製剤の調製における特許請求の範囲第１〜７項の
   いずれかに記載のペプチドの使用。 １８、特許請求の範囲第１〜７項のいずれかに記載のペ
   プチドを含んでなる製薬学的組成物。