FI97139B - Menetelmä haiman erittämän trypsiini-inhibiittorivarianttien valmistamiseksi ja menetelmässä käytettävä DNA, vektori ja isäntäsolu - Google Patents

Description

97139

Menetelmä haiman erittämän trypsiini-inhibiittorivariant-tien valmistamiseksi ja menetelmässä käytettävä DNA, vektori ja isäntäsolu 5 Keksintö koskee menetelmää peptidin valmistamisek si, joka oleelliselta osin käsittää ihmishaiman erittämän trypsiini-inhibiittorin (h-PSTI) aminohapposekvenssin variantteja, joissa yksi tai useampi alkuperäisen aminohapposekvenssin jäännöksistä on korvattu muulla aminohappo-10 jäännöksellä tai muilla aminohappojäännöksillä. Tarkemmin ilmaistuna keksintö koskee menetelmää peptidin valmistamiseksi, joka oleellisesti käsittää ihmisen haiman erittämän trypsiini-inhibiittorin (PSTI:n) sekvenssin variantin ryhmästä 15 PSTI 1 Thr-17 Leu-18 Ile-19 Tyr-20 Asn-21 Asp-29 PSTI 2 Thr-17 Leu-18 Ile-19 Tyr-20 Asp-21 Asn-29 PSTI 4 Thr-17 Leu-18 Glu-19 Tyr-20 Arg-21 Asp-29 PSTI 5 Thr-17 Val-18 Glu-19 Tyr-20 Arg-21 Asp-29 20 PSTI 6 Thr-17 Leu-18 Glu-19 Tyr-20 Asn-21 Asp-29 PSTI 7 Thr-17 Leu-18 Ile-19 Tyr-20 Arg-21 Asp-29 PSTI 8 Thr-17 Val-18 Glu-19 Leu-20 Asn-21 Asp-29 PSTI 9 Thr-17 Val-18 Glu-19 Leu-20 Arg-21 Asp-29 PSTI 11 Pro-17 Leu-18 Glu-19 Tyr-20 Arg-21 Asp-29 25 PSTI 12 Pro-17 Val-18 Glu-19 Tyr-20 Arg-21 Asp-29 PSTI 13 Thr-17 Ile-18 Glu-19 Tyr-20 Asn-21 Asp-29 PSTI 17 Thr-17 Val-18 Ile-19 Tyr-20 Asn-21 Asp-29 PSTI 18 Thr-17 Ile-18 Ile-19 Tyr-20 Asn-21 Asp-29 PSTI 19 Thr-17 Val-18 Ile-19 Tyr-20 Asp-21 Asn-29 30 PSTI 20 Thr-17 Ile-18 Ile-19 Tyr-20 Asp-21 Asn-29 PSTI 21 Thr-17 Ile-18 Glu-19 Tyr-20 Arg-21 Asp-29 jolloin variantti käsittää edelleen asemassa 32 ryhmän Pro, Ser tai Ala. Näiden peptidien inhibitiovaikutus on 35 spesifisyytensä osalta edullisesti modifioitunut. Lisäksi 97139 2 keksintö koskee mentelmässä käytettyä DNA:ta, ilmaisuvek-toria sekä bakteeri-isäntä-organismia.

Polymorfitumagranulosyyttien lysosomaalinen elas-taasi (leukosyyttielastaasi), J.G. Bieth, Regulation of 5 Matrix Accumulation, Mecham, julk., Academic Press, Orlando, 1986, s. 217-320, on tehokas solunsisäinen proteaasi, joka varastoituu lysosomeihin ja joka suorittaa fysiologisia toimintojaan, solunsisäistä proteiinien hajottamista, fagolysosomeissa. Tärkein lysosomaalisten proteaasien 10 (elastaasin, katepsiini G:n jne., H. Fritz et. ai., Selected Topics in Clinical Enzymology, Goldberg ja Werner, julk., Walter de Gruyter, Verliini, Bd. 2, 1984, s. 305-328) suorittama funktionaalinen toiminto on organismin itsensä muodostaman fagosytoosimateriaalin (esim. aineen-15 vaihduntatuotteet, vaurioitunut kudos) ja vieraiden organismien (bakteerien, viruksien, homesienten jne.) muodostaman materiaalin hajottaminen.

Kun elastaasia on vapautunut solunulkoiseen tilaan (vereen tai soluvälinesteeseen), sen sitovat nopeasti ak-20 tiiviset endogeeniset inhibiittorit, kuten Oj-PI (a,-pro-teaasi-inhibiittori, J. Travis ja G.S. Salvesen, Ann. Rev. Biochem. (1983) 655-709) plasmassa ja/tai antileukopro- teaasi (kutsutaan myös nimellä HUSI-I, ihmisen siemennesteen proteinaasi-inhibiittori, H. Schiessler et ai., 25 Neutral Proteases of Human Polymorphonuclear Leukocytes, Haveman ja Janoff, julk., Urban & Schwarzenberg, Baltimore, 1978, s. 195-207) limaeritteissä.

Huomattavan α,-ΡΙ-vajauksen (J.G. Bieth, 1986) kyseessä ollessa tai elastaasin runsaan vapautumisen solun-30 ulkoiseen tilaan seurauksena (akuuteissa ja kroonisissa tulehdustiloissa, polytrauma- ja shokkitiloissa, H. Fritz et ai., 1984) ei luontaisten proteaasi-inhibiittorien elimistölle hajottavaa elastaasivaikutusta vastaan antama suoja ole riittävä. Seurauksena on endogeenisten proteaa-35 si-inhibiittorien liiallinen kulutus ja paikallisesti jopa 97139 3 täydellinen loppuun käyttö, mitkä johtuvat (i) kompleksin-muodostuksesta elastaasin kanssa, (ii) proteolyyttisestä inaktivoitumisesta useiden lysosomaalisten proteaasien toimesta ja (iii) erityisesti inaktivoitumisesta hapettu-5 misen kautta (cr,-PI) (J.G. Bieth, 1986, H. Fritz et ai.

1984, J. Travis ja G.S. Salvesen, 1983, ks. edellä).

Tästä on seurauksena sidekudoksien laajamittaista proteolyyttistä hajoamista, kuten myös nesteproteiinien, mukaan lukien koagulaatio-, fibrinolyysi- ja komplementti-10 tekijöiden, elastaasin ja muiden lysosomaalisten proteaasien (esim. katepsiini G:n) vaikutuksesta, mikä johtaa vakaviin kliinisiin oireisiin, kuten iimapöhöön, shokkikeuh-koon, hengityshäiriöihin (ARDS-hengenahdistus, engl. Acquired Respiratory Distress Syndrome), koaguloitumishäi-15 riöihin, munuaisten ja maksan toiminnanvajaukseen jne.

(edellä mainittujen viitteiden ohella: Neue Wege in der Entziindungsdiagnostik, PMN Elastase, M. Jochum et ai., julk., GIT Verlag, Darmstadt, 1985, C.T. Lee et ai., N. Engl. J. Med. 304 (1981) 192-196, W.W. McGuire et ai., J.

20 elin. Invest. 69 (1982) 543).

Elastaasi myötävaikuttaa niin ikään paikallisissa tulehduksissa, kuten nivelreumassa esim. sidekudoksen rakenneosien hajoamisessa (K. Kleesiek et ai. (1985), kirjassa Neue Wege in der Entziindungsdiagnostik. PMN Elas-* 25 tase, s. 71-82).

Elastaasin vapautumista solunulkoiseen tilaan vaikeiden haavoittumisten jälkeen tai sairaustilojen, kuten verenmyrkytysshokin, shokkikeuhkon jne. yhteydessä voidaan seurata tavanomaisten entsymaattisten immuunimääritysten 30 avulla (S. Neumann ja M. Jochum, Methods of Enzymatic Analysis, Bergmeyer, julk., Verlag Chemie, Weinheim, 1984, s. 184-195).

Verenmyrkytyksen ja ilmapöhön kokeellisissa malleissa ovat synteettiset elastaasi-inhibiittorit (J.C.

35 Powers Am. Rev. Respir. Dis. 127 (1983) 554-558) ja 97139 4 luontaiset eläimistä peräisin olevat inhibiittorit, kuten egliini C (H.P. Schnebli et ai., Eur. J. Respir. Dis. 66: 139 (1985) 66-70) osoittautuneet terapeuttisesti hyödyl lisiksi. Toksisten sivuvaikutusten ja erityisesti herki-5 tysreaktioiden välttämiseksi olisi edullisempaa käyttää ihmisestä peräisin olevaa proteaasi-inhibiittoria silloin, kun hoitoindikaatio on pitkäaikaisterapia, esim. a,-PI-va-jausta hoidettaessa (ilmapöhö). Humaani-at-PI: n ollessa korkean molekyylipainon omaava glykoproteiini ei sen mää-10 rällisesti riittävään valmistukseen todennäköisesti pystytä lähitulevaisuudessa.

Antileukoproteaasin eli HUSI-I:n (H. Schiessler et ai., 1978 ja U. Seemiiller et ai., Febs Letters 199 (1986) 43-48) molekyylipaino on 14 000 Daltonia ja se koostuu 15 kahdesta aktiivisesta alueesta, joista toinen on aktiivinen elastaasin ja toinen trypsiinin suhteen. Tämän vuoksi kyseinen inhibiittorilaji ei ole erityisen selektiivinen eikä se siis ole spesifinen elastaasi-inhibiittori. Muutoinkaan trypsiinin tai trypsiinin kaltaisten entsyymien 20 inhibitioon ei edellä mainituissa hoitoyhteyksissä pyritä.

Ihmishaima erittää PSTI:tä, proteaasi-inhibiittoria, jonka molekyylipaino on alhainen (6,2 kD) ja joka inhiboi spesifisesti trypsiiniä eli jonka selektiivisyys tietyn proteaasilajin suhteen on korkea.

25 Eräs kyseisen keksinnön etu on, että korvaamalla DNA-rekombinaatiotekniikan avulla vain yksi PSTI:n amino-happojäännös (tai muutamia harvoja), saadaan PSTI-variant-teja, jotka ovat osoittautuneet erittäin tehokkaiksi pro-teaasi-inhibiittoreiksi, joiden spesifisyys leukosyytti-30 elastaasin suhteen on korkea. Lisäksi elastaasi-PSTI-joh-dannaiskompleksi pystynee suhteellisen alhaisen molekyyli-painonsa ansiosta läpäisemään myös munuaiset. Tällöin so-lunulkoiseen tilaan vapautuneen elastaasin eliminoituminen on erittäin tehokasta. Otettaessa huomioon, että PSTI on 35 alunperin ihmisestä eristetty, minkä lisäksi sen molekyy- 5 97139 lipaino on alhainen, arveltiin, ettei PSTI-johdannaisten kliiniseen käyttöön liittyisi komplikaatioita sen johdosta, että immuunijärjestelmä tunnistaisi nämä yhdisteet elimistölle vieraiksi proteiineiksi.

5 a,-PI:hin ja antileukoproteaasiin verrattuna PSTI:n oleellinen lisäetu on niin ikään sen epäherkkyys hapettumisen aiheuttamalle inaktivoitumiselle tulehdustilan eri vaiheissa, joissa muodostuu ja vapautuu solunulkoiseen tilaan voimakkaasti hapettavia yhdisteitä. Täten <*,-PI:hin ja 10 antileukoproteaasiin verrattuna tulisi PSTI-johdannaisen alhaisempina annoksina kyetä tarjoamaan samanarvoinen suojavaikutus.

Kyseisen keksinnön tehtävä on täten tarjota käyttöön farmaseuttisesti hyödyllisiä peptidejä, joilla on 15 proteinaasi-inhibiittorivaikutusta, edullisesti sellaisia, joiden spesifisyys on parempi ja/tai inhibitiovaikutus tehokkaampi (kuin edellä mainittujeni). Mainitut peptidit ovat DNA-rekombinaatiotekniikan avulla tuotettuja peptidejä, jotka käsittävät PSTI:n sekvenssin tai variantteja. 20 Sanonnalla "variantit" tarkoitetaan peptidejä, joissa pe-rusaminohapposekvenssin jäännöksistä yksi tai useampia on korvattu muulla tai muilla luontaisesti esiintyvien aminohappojen jäännöksillä. Perussekvenssillä tarkoitetaan hu-maani-PSTI:n aminohapposekvenssiä (h-PSTI = PSTI-0). Ami-25 nohappojäännösasemia, joissa korvaus edullisesti suorite taan, ovat peptidin asemat 17, 18, 19, 20, 21, 29 ja 32. Kyseisen keksinnön mukaan valmistetaan erityisesti edullisia peptidejä, joiden sekvenssi on oleellisesti sama kuin PSTI-0:n (sellaisena kuin sen on esittänyt L.J. Greene, 30 Methods Enzymol. 45 (1976) 813-825) ja jotka sisältävät seuraavat aminohappojäännökset:

Thr tai Pro asemassa 17;

Leu, Vai tai Ile asemassa 18;

Glu tai Ile asemassa 19; 35 Tyr tai Leu asemassa 20; 6 97139

Arg, Asp tai Asn asemassa 21;

Asp tai Asn asemassa 29;

Pro, Ser tai Ala asemassa 32.

Taulukossa 1 on esitetty eräitä variantteja PSTI-5 0:n ollessa perussekvenssi ja aminohappojäännöksien ase massa 32 ja 36 ollessa proliini ja vastaavasti väliini.

Taulukossa 1 esitettyjä variantteja voidaan edelleen muuntaa sijoittamalla asemaan 32 jokin aminohappo-jäännöksistä Ser tai Ala.

10 Esillä olevassa hakemuksessa kuvataan myös edellä kuvatun mukaisen sekvenssin omaavia peptidejä, jotka lisäksi käsittävät asemassa 1 metioniinin tai johtopeptidin. Sanonnalla johtopeptidi ei kyseisen keksinnön yhteydessä tarkoiteta ainoastaan ilmaisutuotteiden eritystä edistäviä 15 signaalisekvenssejä (S.D. Emr et ai. J. of Cell Biol.

(1980) 701-711), vaan myös peptidejä, jotka omaavat PSTI-sekvenssiä edeltävän signaalisekvenssin ja liittosekvens-sin.

«. · 11 1 < Mil I I < 4· 7 97"39

Taulukko 1 PSTI-variantteja

Asema 17 18 19 20 21 29 5 x)PSTI 0 Thr Lys Ile Tyr Asn Asp PSTI 1 Thr Leu Ile Tyr Asn Asp PSTI 2 Thr Leu Ile Tyr Asp Asn x)PSTI 3 Thr Tyr Glu Tyr Arg Asp 1Q PSTI 4 Thr Leu Glu Tyr Arg Asp PSTI 5 Thr Vai Glu Tyr Arg Asp PSTI 6 Thr Leu Glu Tyr Asn Asp PSTI 7 Thr Leu Ile Tyr Arg Asp PSTI 8 Thr Vai Glu Leu Asn Asp , c PSTI 9 Thr Vai Glu Leu Arg Asp x)PSTI 10 Pro Lys Ile Tyr Asp Asn PSTI 11 Pro Leu Glu Tyr Arg Asp PSTI 12 Pro Vai Glu Tyr Arg Asp PSTI 13 Thr Ile Glu Tyr Asn Asp 20 χ) PSTI 14 Thr Arg Glu Tyr Asn Asp x)PSTI 15 Thr Phe Glu Tyr Asn Asp x)PSTI 16 Thr Ala Glu Tyr Asn Asp PSTI 17 Thr Vai Ile Tyr Asn Asp PSTI 18 Thr Ile Ile Tyr Asn Asp __ PSTI 19 Thr Vai Ile Tyr Asp Asn • · 25 PSTI 20 Thr Ile Ile Tyr Asp Asn PSTI 21 Thr Ile Glu Tyr Arg Asp x)PSTI 22 Thr Tyr Ile Tyr Asn Asp x)PSTI 23 Thr Phe Ile Tyr Asn Asp 30 X)PSTI 24 Thr Lys Glu Tyr Arg Asp x) vertailu

Kyseinen keksintö koskee myös keksinnön mukaisesti valmistettavia aminohapposekvenssejä kooodaavia DNA-sek-35 venssejä. Jatkotekstissä seuraavaa sekvenssiä kutsutaan päägeeniksi: 97139 8

Asp Ser Leu Cly Arg C!u Ala lys Cys Tyr Asn du leu Asn dy 2_4 o_

1 'CACTCTCTCCCTC'GICAAGCTAAAIGCTAC'AACCAACTCAACCCT

45 jCTGACAQCCCACCACTTCGAMJACGATCTTGCTTCACJIGCCA

1 Λ 5

Cys Thr lys He Tyr Asn Pro Vai Cys dy Thr /jp Cly Asp Thr _ _u_8_ 10 · 12__

5 46 TCCACT AACATCTAC’AACCCCCI 1 I C C G G^ A C C C A CC G T G A C A CT

90 acgtcattctagatgttgcg c.c aaacgccaTggct G*,C CACTGTGA

7 9 n · u

Tyr Pro Asn du Cys Vai leu Cys Phe du Asn Arg lys Arg Cln _M___16__18_

91 TaCCCCAACGAATGC'GTTCTGTGCTTCCAAA'ACCGTAAACGTCAG

135 ATGGGCUGCTTACGCAAGACAC.GAAGCTTTTGGCATTT.GCaGTC

15 17 10 77ir Ser /7e Leu He Cln Lys Ser Cly Pro Cys ·«· _20__22 __24 136 acttctatcctcatccaOaaatcicgtccgtgotcaattcaagct

180 TGAAGATAG CA CTaGGTCTTTAGA C.C AGGCACGaCTT A A.C T T C G A

19 21 23 181 TC1 186 AGGTAC.

25 15

Kuvio 1: PSTI-päägeenin nukleotidi- ja vastaava aminohapposekvenssi. Sulkumerkinnöillä ja liittyvillä numeroilla viitataan geeniä rakennettaessa käytettyihin synteettisiin oligonukleotideihin. Katkoviivalla osoitetaan 20 geenin jakaantumiskohta segmenttiin I (ensimmäinen osa) ja segementtiin II (toinen osa) sekä mainitun DNA-sekvenssin funktionaalisia ekvivalentteja. Funktionaalisilla ekvivalenteilla tarkoitetaan tällöin saman proteiinin ilmaisuun mahdollisesti soveltuvia edellä esitetyn DNA-sekvenssin ·· 25 johdannaisia. Alan ammattilaisille on tuttua, että tie tyissä kodoneissa yksi emäs tai kaksi tai kolme emästä voi olla korvattu muulla emäksellä, ilman että tällä on vaikutusta tiettyyn proteiiniin rakentuvaan aminohappoon. Peptidi johdannaisten valmistamiseksi päägeeniä modifioidaan 30 DNA-teknologian avulla siten, että tietyn aminohapon kodo-ni tietyssä asemassa korvataan toisen aminohapon kodonil-la. DNA:n saamiseksi, joka koodaa jotain kyseisen keksinnön mukaisesti valmistettavaa peptidijohdannaista, voidaan asemissa 17, 18, 19, 20, 21, 29 ja 32 sijaitsevien amino-35 happojen kodoneja korvata muilla kodoneilla.

97139 9

Korvauksessa käytettäviksi edullisia kodoneja ovat ne, jotka koodaavat edellä lueteltuja aminohappojäännöksiä. Käytetystä ilmaisujärjestelmästä riippuen voi keksinnön mukainen DNA olla myös sekvenssi, joka koodaa jotain 5 edellä esitettyä peptidiä ja käsittää lisäksi johtopepti-diä koodaavan NH2-päätysekvenssin.

Keksintö koskee edelleen ilmaisuvektoria, jota nimitetään myös plasmidiksi ja joka sisältää jotain kyseisen keksinnön mukaisesti valmistettavaa peptidiä koodaavan 10 DNA:n. Plasmidia käytetään isäntäorganismien transformoin- nissa. Keksintö koskee myös näin transformoituja bakteeri-isäntäorganismeja. Alan ammattilaisten tiedossa on lukuisia transformoitaviksi soveltuvia mikro-organismeja. Käytettävän plasmidin tyyppi valitaan pääasiallisesti käytet-15 tävän isäntäorganismin mukaan.

Keksinnön mukaista DNA:ta sisältävällä plasmidilla transformoitavaa isäntäorganismia käytetään edellä mainittuja peptidivarlanttien valmistuksessa. Keksinnön mukaiselle menetelmälle PSTI:n varianttien valmistamiseksi on 20 tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään.

Valmistus käsittää seuraavat vaiheet: (a) isäntämikro-organismin tartuttaminen sopivissa olosuhteissa, (b) peptidin talteenotto viljelmästä, ja 25 (c) peptidin puhdistus.

Peptidin puhdistus voidaan suorittaa tavanomaisilla proteiinikemian menetelmillä, esim. seostamalla tai kroma-tografian tai elektroforeesin avulla. Edellä mainittu liittopeptidi voidaan rakentaa sellaiseksi, että rakenne 30 helpottaa fuusioproteiinin puhdistusta. Liittopeptidin sisältäessä esimerkiksi pääasiallisesti joko emäksisiä tai happamia aminohappojäännöksiä voi ilmaistun tuotteen puhdistuksessa ioninvaihtokromatografia osoittautua erityisen edulliseksi.

10 97139

Edellä kuvattuja peptidejä voidaan käyttää farmaseuttisten valmisteiden valmistuksessa. Näitä farmaseuttisia valmisteita käytetään erityisesti aiemmin mainittujen hoitoindikaatioiden yhteydessä.

5 Farmaseuttiset valmisteet sisältävät yhden tai useamman edellä kuvatun peptidin ohella myrkyttömiä, inerttejä ja farmaseuttisesti hyväksyttäviä kantajia ja/ tai lisäaineita tai ne voivat koostua pelkästään yhdestä tai useammasta keksinnön mukaisesta vaikuttavasta ainees- 10 ta.

PSTI:tä voidaan eristää haimasta, josta sitä kuitenkaan ei ole saatavissa vähäistä suurempia määriä, erityisesti ei eristettäessä sitä ihmishaimasta.

Tämän vuoksi todettiin DNA-rekombinaatiotekniikan 15 sekä liittyvien teknologioiden tarjoavan tehokkaan tien valmistaa riittävän suuria määriä sekä korkealaatuista h-PSTI:tä että kyseisen peptidin variantteja. Vieraspro-teiinin tuottaminen rekombinanttibakteereissa ei ole yksinkertaista viitaten useissa tapauksissa ilmenneeseen 20 epästabiilisuuteen (B.E. Butterworth ja B.D. Kovant, J.

Virol. 14 (1984) 282-291, D.V. Goeddel et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76 (1979) 106-110, M. Inouye et. ai. kirjassa The Future in Nucleic Acid Research, I. Watanabe, julk., Academic Press, Tokio, 1983). Epästabiilisuus on “ 25 ongelma erityisesti ilmaistaessa peptidejä, joiden ketju on verraten lyhyt.

Ihmisen haima erittää PSTI:tä, proteaasi-inhibiit-toria, jonka molekyylipaino on alhainen (6,2 kD) ja joka spesifisesti inhiboi trypsiinin, eli jonka selektiivisyys 30 tietyn proteaasityypin suhteen on korkea.

Eräs keksinnön mukaisen käytännön etu on, että korvaamalla ainoastaan yksi PSTI:n aminohappojäännös (tai muutamia harvoja) DNA-rekombinaatiotekniikan avulla, saadaan PSTI-variantteja, jotka ovat osoittautuneet erittäin 35 tehokkaiksi proteaasi-inhibiittoreiksi, joiden spesifisyys 97139 11 leukosyyttielastaasin suhteen on korkea. Lisäksi verraten alhaisen molekyylipainonsa ansiosta elastassi-PSTI-johdan-naiskompleksi läpäissee myös munuaiset. Tällä perusteella voidaan odottaa solunulkoiseen tilaan vapautuneen elastaa-5 sin eliminoituvan erityisen tehokkaasti. Koska PSTI on peräisin ihmisestä sen molekyylipainon ollessa lisäksi alhainen, voidaan olettaa, ettei PSTI-johdannaisten kliinisessä käytössä ilmene komplikaatioita sen johdosta, että immuunijärjestelmä tunnistaisi nämä yhdisteet vieraiksi 10 proteiineiksi.

aj-PIihin ja antileukoproteaasiin verrattuna PSTI:n toinen huomattava etu on sen epäherkkyys inaktivoivalle hapettumiselle tulehdustilan eri vaiheissa, joissa muodostuu ja vapautuu voimakkaasti hapettavia aineita. Täten 15 a,-PI:hin tai antileukoproteaasiin verrattuna pienempien PSTI-johdannaismäärien tulisi riittää tuottamaan rinnastettavissa oleva suojavaikutus.

Geenisekvenssit h-PSTI:n aminohapposekvenssi translatoitiin takai-20 sin DNA-päägeenisekvenssiin tehokkaasti ilmaistuvissa E.

coli -geeneissä yleisimmin tavattujen kodonien avulla (M. Gouy ja C. Gautier, Nucleic Acids Res. 10 (1982) 7055- 7074), ks. kuvio l. PSTI-varianttien aminohapposubstituu-tiota varten (taulukko 1) korvattiin vastaavat kodonit • 25 päägeenissä (ks. taulukko 2).

Taulukossa 2 tähdellä merkittyjä kodoneja käytettiin kautta linjan seuraavin poikkeuksin:

Thr 26 (ACC) kaikissa geeneissä Kpnl-kohdan tuottamiseksi asemaan 72 - 77, 30 Lys 18 (AAG) PSTI-0:ssa ja -10:ssä Bglll-kohdan tuottamiseksi asemaan 53 - 58,

Gly 28 (GGC) PSTI-2:ssa, -10:ssä, -19:ssä ja -20: ssa vastaavien oligonukleotidifragmenttien oikeansuuntaiseksi hybridisoimiseksi (ks. alla), 97139 12

Pro 17 (CCT) + Leu 18 (CTA) PSTI-ll:ssä Xbal-kohdan tuottamiseksi asemaan 51 - 56, geenin 5'-päädyssä: ensimmäinen kodoni käsittää

HincII-kohdan GTPyPuAC jälkimmäisen puolikkaan, 5 geenin 3'-päädyssä: lopetuskodoni TGA, joka limit tyy EcoRI-kohtaan (asemat 170 - 175), jota seuraavat Hind- III-kohta (asemat 176 - 181) ja Ncol-tarttuva pääty (asemat 182 - 186).

*· · 13 97139 n * ρ -Γ- < id <

4J C < < ID

<a c s s s ftt 0 c η^ λ: *

<rjo <-i < U (D S

0) E3D3 It S S S S

* < < < > CD ID O ID

pH

* in US t ^ 2 »H fd£ »dj ^ ^

Ϊ U CJ H S S

* >, < ο CD s α ϋ

<-> cd to cd cd «- CD

O CD CD CD CD H

c < 0 L<UO=> ^ < «< £2222 UUU {-h<<<< * *

3 < CD «- O S < U CD S

^ < < ai oouuuy

(5 1010 W <! < S S S S

tnUD O «< U CD S

P >, DO u U O U U

-H udS o-uuuu c 0 Ό o V u COS φ o s ·· Ί^υι<!Λ; .css >i c k < a. s s <u

-P

>1 :rö * « a us -J cd

U) -< -< (VS

< CD CD X <

(N

o y

-¾ D> < CD < U CD S «η < CD

3 u CD CD CD CD CD CD S* << < -π < << «e o o o u o «<<

P

(0 E-·

rt * U CD S 3 ^ ΰ < U O D

r* UOOO Φ g 5 R R R Pi

< CD CD CD CD J SSOUOU

< 14 97139 PSTI-geeni rakennettiin seuraavasti: (1) 25 lyhytketjuisen oligonukleotidin synteesi (12 ja 13 kutakin komplementoivaa säiettä kohden) 5 _2 .......... 22 24 13 23 25 10 jolloin muutamille varianteille syntetisoitiin spesifisiä fragmentteja (ks. taulukko 3) . Oikeankokoisen fragmentin eristys ja puhdistus suoritettiin ioninvaihtokromatogra-fian ja HPLC:n avulla.

(2) Fragmenttien ligatointi valmiin PSTI:n (amino- 15 hapot 1 - 56) koodausalueen kaksisäikeisen molekyylin tuottamiseksi aminopäädyn koodisekvenssistään "litteään" ketjupäätyyn ja karboksyylipäätysekvenssistään GAT-yksi-säikeiseen 5'-ylijäämäketjupäätyyn. Virheellisten liga-tointituotteiden määrän pitämiseksi mahdollisimman pienenä 20 oli tässä vaiheessa tärkeää optimoida syntetisoitavat oli-gonukleotidisekvenssit.

(3) Kloonaus useisiin vektoreihin, esim. pUC8:aan, pGV451:een, M13mpl8:aan sekvenssoinnin suorittamiseksi (ks. menetelmän osalta oheista tekstiä).

' 25 (4) Uusien varianttien muodostaminen paikkaohjau- tuvan mutageneesin avulla M13-fagivektoreissa spesifisiä synteetisiä oligonukleotidejä käyttäen.

Taulukko 3

Numeroiden merkitys: 30 Sarake 1: fragmentin järjestysnumero (ks. kuvio 1)

Sarakkeet 2 ja 3: fragmentin ensimmäinen ja viimeinen nukleotidiaseraa päägeenisekvenssissä (5' -* 3')

Sarake 4: fragmentin nukleotidisekvenssi (5' -► 3') Päägeenin sekvenssistä poikkeavat fragmentit, jotka 35 ovat geenivarianttien rakentamiseksi tarpeellisia, on merkitty pisteillä.

> ·

Taulukko 3 97139 15 PSTI-0 (segmentti I) - päägeeni Fragmentit 1-11

171 GAGAGTC

5 2 1 13 GACTCTCTCGGTC

3 23 8 TTAGCTTCACGACCCA

4 14 30 GTGAAGCTAAATGCTAC

5 39 24 CAGTTCGTTCTAGCAT

6 31 47 AACGAACTGAACGGTTG

7 54 40 CTTAGTCCAACCGTT

8 48 60 CACTAAGATCTAC

9 66 55 CGGGTTGTAGAT

10 10 61 74 AACCCGGTTTGCGG

11 81 67 GTCGGTACCGCAAAC

PSTI-0 (segmentti II) - päägeeni fragmentit 12 - 25

15 12 75 89 TACCGACGGTGACAC

13 97 82 TCGGGTAAGTGTCACC

14 90 105 TTACCCGAACCAATCC

15 113 98 CACAGAACGCATTCGT

16 106 121 GTTCTCTCCTTCCAAA

17 129 114 TTTACGGTTTTCGAAG

18 122 137 ACCCTAAACGTCAGAC

on 19 145 130 GGATAGAAGTCTGACG

20 138 152 TTCT ATCCTC AT CCA

21 160 146 CAGATTTCTCCATCA

22 153 167 GAAATCTGCTCCGTC

23 174 161 AATTCAGCACGCAC

24 168 182 CTGAATTCAAGCTTC

25 186 175 CATGCAAGCTTC

25 PSTI-1 (segmentti I) fragmentit 1-11

171 GAGAGTC

2 1 13 GACTCTCTCGGTC

3 23 8 TTAGCTTCACGACCCA

4 14 30 GTGAAGCTAAATGCTAC

30 5 39 24 CAGTTCGTTCTAGCAT

6 31 47 AACGAACTGAACGGTTG

• 7 54 40 CAGAGTGCAACCGTT

• 8 48 60 CACTCTCATCTAC

9 66 55 CGGGTTGTAGAT

10 61 74 AACCCGGTTTGCGG

11 81 67 GTCGGTACCGCAAAC

97139 16

Taulukko 3 (jatkoa) PSTI-2 (segmentti I) fragmentit 1-11

171 GAGAGTC

5 2 1 13 CACTCTCTCCCTC

3 23 8 TTAGCTTCACGACCCA

A IA 30 CTGAACCTAAATGCTAC 3 39 2A CAGTTCGTTGTACCAT

6 31 A7 AACGAACTGAACGGTTG

• 7 54 AO CAGAGTGCAACCGTT

• 8 A8 60 CACTCTGATCTAC

• 9 66 53 CGGGTCGTAGAT

1U * 10 61 7A GACCCGGTTTGCGG

11 81 67 GTCGGTACCGCAAAC

PSTI-3 (segmentti I) fragmentit 1-11

15 171 GAGAGTC

2 1 13 GACTCTCTGGCTC

3 23 8 TTAGCTTCACGACCCA

A IA 30 CTGAACCTAAATGCTAC

5 39 2A CACTTCGTTCTAGCAT

6 31 A7 AACGAACTGAACGGTTG

• 7 5A AO GTAAGTGCAACCGTT

2Q « B 48 60 CACTTACGAATAC

• 9 66 55 CGGACCGTATTC

*10 61 7A CGTCCGGTTTGCGG

11 81 67 GTCGGTACCGCAAAC

PSTI-4 (segmentti I) 25 fragmentit 1-11

171 GAGAGTC

2 1 13 GACTCTCTGGCTC

3 23 8 TTAGCTTCACGACCCA

A IA 30 GTGAAGCTAAATGCTAC

5 39 2A CAGTTCGTTGTACCAT

6 31 A7 AACGAACTGAACGGTTG

30 · 7 5A AO CAGAGTGCAACCGTT

• 8 A8 60 CACTCTGCAATAC

• 9 66 55 CGGACCGTATTC

•10 61 7A CGTCCGGTTTGCGG

11 81 67 GTCGGTACCGCAAAC

Taulukko 3 (jatkoa) 17 97139 PSTI-5 (segmentti I) fragmentit 1-11

171 GAGAGTC

5 2 1 13 GACTCTCTGGCTC

3 23 8 TTAGCTTCACCACCCA

4 14 30 GTGAAGCTAAATGCTAC

5 39 24 CAGTTCGTTGT AGCAT

6 31 47 AACGAACTGAACGGTTG

‘ 7 54 40 AACACTCCAACCCTT

• 8 48 60 CACTGTTGAATAC

• 9 66 55 CGGACGGTATTC

10 ·10 61 74 CGTCCCCTTTCCGC

11 81 67 CTCGGTACCGCAAAC

PSTI-6 (segmentti I) fragmentit 1-11 15

1 7 1 GAGAGTC

2 1 13 GACTCTCTGGGTC

3 23 8 TTAGCTTCACCACCCA

4 14 30 GTGAAGCTAAATGCTAC

5 39 24 CAGTTCGTTGTAGCAT

6 31 47 AACGAACTGAACGGTTG

« 7 54 40 CAGAGTCCAACCGTT

20 « 8 48 60 CACTCTGGAATAC

- 9 66 55 CGGGTTGTATTC

10 61 74 AACCCGGTTTGCGG

11 81 67 GTCGGTACCGCAAAC

PSTI-7 (segmentti I) 25 fragmentit 1-11

171 GAGAGTC

2 1 13 GACTCTCTGGGTC

3 23 8 TTACCTTCACGACCCA

4 14 30 GTGAAGCTAAATGCTAC

5 39 24 CAGTTCGTTGTAGCAT

30 6 31 47 AACGAACTGAACGGTTG

• 7 54 40 CAGAGTGCAACCGTT

• 8 48 60 CACTCTGATCTAC

• 9 66 55 CGGACGGTAGAT

• 10 61 74 CGTCCGGTTTGCGG

11 81 67 GTCGGTACCGCAAAC

Taulukko 3 (jatkoa) 18 97139 PSTI-13 (segmentti I) fragmentit 1-11

171 GAGAGTC

5 2 1 13 GACTCTCTCGGTC

3 23 8 TTAGCTTCACGACCCA

4 14 30 GTGAACCTAAATGCTAC

5 39 24 CAGTTCGTTGTAGCAT

6 31 A7 AACGAACTGAACGGTTG

• 7 54 40 GATACTGCAACCGTT

• 8 48 60 CACTATCGAATAC

• 9 66 55 CGGGTTGTATTC

10 10 61 74 AACCCGGTTTGCGG

11 81 ,67 GTCGGTACCGCAAAC

PSTI-14 (segmentti I) fragmentit 1-11

15 171 GAGAGTC

2 1 13 GACTCTCTCGGTC

3 23 8 TTAGCTTCACGACCCA

4 14 30 GTGAAGCTAAATCCTAC

5 39 24 CAGTTCGTTGTAGCAT

6 31 47 AACGAACTGAACGGTTG

• 7 54 40 ACGAGTGCAACCGTT

2o · 8 48 60 CACTCGTGAATAC

• 9 66 55 CGGGTTGTATTC

10 61 74 AACCCGGTTTGCGG

11 81 67 GTCGGTACCGCAAAC

PSTI-15 (segmentti I) 25 fragmentit 1-11

171 GAGAGTC

2 1 13 GACTCTCTCGGTC

3 23 8 TTAGCTTCACGACCCA

4 14 30 GTGAACCTAAATGCTAC

5 39 24 CAGTTCGTTGTAGCAT

30 6 31 47 AACGAACTGAACGGTTG

• Ί 54 40 GAAACTGCAACCGTT

• 8 48 60 CACTTTCGAATAC

• 9 66 55 CGGGTTGTATTC

10 61 74 AACCCGGTTTGCGG

11 81 67 GTCGGTACCGCAAAC

19 97139

Taulukko 3 (jatkoa) PSTI-16 (segmentti I) fragmentit 1-11

171 CAGAGTC

5 2 1 13 GACTCTCTGGGTC

3 23 8 TTAGCTTCACGACCCA

4 14 30 CTGAAGCTAAATGCTAC

5 39 24 CAGTTCGTTGTAGCAT

6 31 47 AACGAACTGAACGGTTG

• 7 54 40 AGCAGTGCAACCGTT

• 8 48 60 CACTGCTGAATAC

• 9 66 55 CGGCTTGTATTC

10 10 61 74 AACCCGCTTTGCCG

11 81 67 GTCGGTACCGCAAAC

PSTI-17 (segmentti I) fragmentit 1-11

171 GAGAGTC

15 2 1 13 GACTCTCTGGGTC

3 23 8 TTAGCTTCACGACCCA

4 14 30 CTGAAGCTAAATGCTAC

5 39 24 CAGTTCGTTGTAGCAT

6 31 47 AACGAACTGAACGGTTG

*7 54 40 AACAGTGCAACCGTT

• 8 48 60 CACTCTTATCTAC

9 66 55 CGGGTTGTAGAT

20 10 61 74 AACCCGGTTTGCGG

11 81 67 GTCGGTACCGCAAAC

PSTI-18 (segmentti I) fragmentit 1-11

25 171 GAGAGTC

2 1 13 GACTCTCTGGGTC

3 23 8 TTAGCTTCACGACCCA

4 14 30 GTGAAGCTAAATGCTAC

5 39 24 CAGTTCGTTGTAGCAT

6 31 47 AACGAACTGAACGGTTG

• 7 54 40 GATAGTGCAACCGTT

30 # 8 48 60 CACTATCATCTAC

9 66 55 CGGGTTGTAGAT

10 61 74 AACCCGGTTTGCGG

11 81 67 CTCCCTACCGCAAAC

Taulukko 3 (jatkoa) 20 97139 PSTI-19 (segmentti I) fragmentit 1-11

I 7 1 GAGACTC

5 2 1 13 GACTCTCTGGGTC

3 23 8 TTACCTTCACGACCCA

A IA 30 GTGAAGCTAAATGCTAC

5 39 2A CAGTTCGTTGTAGCAT

6 31 A7 AACGAACTGAACGGTTG

• 7 5A AO AACAGTGCAACCGTT

• 8 A8 60 CACTGTTATCTAC

• 9 66 55 CGGGTCGTAGAT

10 *10 61 7A GACCCGGTTTCCGG

11 81 67 GTCGGTACCGCAAAC

PSTI-20 (segmentti I) fragmentit 1-11 15

1 7 1 GAGACTC

2 1 13 GACTCTCTGGGTC

3 23 8 TTACCTTCACGACCCA

A IA 30 GTGAAGCTAAATGCTAC

5 39 2A CAGTTCGTTGTAGCAT

6 31 A7 AACGAACTGAACGGTTG

• 7 5A AO GATAGTGCAACCGTT

20 · 8 A8 60 CACTATCATCTAC

• 9 66 55 CGGGTCGTAGAT

• 10 61 7A GACCCGGTTTCCGG

II 81 67 GTCGGTACCGCAAAC

PSTI-A (segmentti II) 25 fragmentit 12 - 25

12 75 89 TACCGACGGTCACAC

• 13 97 82 TAGCCTAAGTCTCACC

• IA 90 105 TTACGCTAACGAATCC

15 113 98 CACAGAACGCATTCGT

16 106 121 CTTCTGTGCTTCCAAA

17 129 HA TTTACGGTTTTCGAAG

30 18122137 ACCGTAAACGTCAGAC

19 1A5 130 GGATAGAAGTCTGACG

20 138 152 TTCTATCCTCATCCA

21 160 1A6 CAGATTTCTCGATCA

22 153 167 GAAATCTGGTCCGTG

23 17A 161 AATTCAGCACGGAC 2A 168 182 CTGAATTCAACCTTC

25 186 175 CATGGAAGCTTG

35

Taulukko 3 (jatkoa) 21 97139 PSTI-S (segmentti II) fragmentit 12 - 25

12 75 89 TACCGACGGTGACAC

5 · 13 97 82 TAGAGTAAGTGTCACC

• 14 90 105 TTACTCTAACGAATGC

15 113 98 CACAGAACGCATTCGT

16 106 121 GTTCTGTGCTTCGAAA

17 129 114 TTTACGGTTTTCGAAG

18 122 137 ACCGTAAACGTCAGAC

19 145 130 GGATAGAAGTCTGACG

20 138 152 TTCTATCCTGATCCA

10 21 160 146 CAGATTTCTGCATCA

22 153 167 CAAATCTGGTCCGTG -

23 174 161 AATTCAGCACGGAC

24 168 182 CTGAATTCAAGCTTC

25 186 175 CATGGAAGCTTG

PSTI-2, -10, -19 ja -20 (segmentti II) 15 fragmentit 12 - 25

#12 75 89 TACCGACGGCAACAC

• 13 97 82 TCGGGTAAGTGTTGCC

14 90 105 TTACCCGAACGAATGC

15 113 98 CACAGAACGCATTCGT

16 106 121 GTTCTGTGCTTCGAAA

17 129 114 TTTACGGTTTTCGAAG

20 18 122 137 ACCGTAAACGTCAGAC

19 145 130 CGATAGAACTCTGACC

20 138 152 TTCTATCCTGATCCA

21 160 146 CAGATTTCTGCATCA

22 153 167 GAAATCTGCTCCCTC

23 174 161 AATTCAGCACGGAC

24 168 182 CTGAATTCAACCTTC

25 186 175 CATGGAAGCTTG

25

PST-2I (segmentti I) fragmentit 1-11 1 7 1 CACACTC

30 2 1 13 CACTCTCTCCCTC

3 23 8 TTAGCTTCACCACCCA

4 14 30 GTCAACCTAAATCCTAC

5 39 24 CACTTCCTTCTACCAT

6 31 47 AACGAACTCAACCCTTG

• 7 54 40 GATACTCCAACCGTT

• 8 48 60 CACTATCGAATAC

• 9 66 55 CGCACGGTATTC

35 »10 61 74 CGTCCGGTTTGCCG

11 81 67 CTCGGTACCCCAAAC

«

Taulukko 3 (jatkoa) 22 97139 PSTI-22 (segmentti I) fragmentit 1-11

I 7 1 GAGAGTC

5 2 1 13 CACTCTCTGCGTC

3 23 8 TT ACCTTCACCACCCA

4 14 30 gtgaagctaaatcctac

3 39 24 CAGTTCGTTGTAGCAT

6 31 47 AACCAACTGAACCCTTG

• 7 54 40 GTAAGTGCAACCGTT

• 8 48 60 CACTTACATCTAC

9 66 55 CCCGTTGTAGAT

10 106174 AACCCGGTTTGCGG

11 81 67 GTCGGTACCCCAAAC

PSTI-23 (segmentti I) fragmentit 1-11

15 171 GAGAGTC

2 1 13 CACTCTCTGCGTC

3 23 8 TTAGCTTCACCACCCA

4 14 30 GTGAAGCTAAATCCTAC

5 39 24 CAGTTCGTTGTAGCAT

6 31 47 AACCAACTGAACGGTTG

• 7 54 40 GAAAGTCCAACCCTT

20 · 8 48 60 CACTTTCATCTAC

9 66 55 CCCGTTCTAGAT

10 61 74 AACCCCGTTTCCCG

II 81 67 GTCGGTACCCCAAAC

PSTI-24 (segmentti I) 25 fragmentit 1-11

171 GAGAGTC

2 1 13 CACTCTCTGGGTC

3 23 8 TTAGCTTCACGACCCA

4 14 30 GTGAAGCTAAATCCTAC

5 39 24 CAGTTCGTTGTAGCAT

3q 6 31 47 AACCAACTGAACCCTTG

, 7 54 40 TTT AGTGCAACCGTT

. 8 48 60 CACTAAAGAATAC

. 9 66 55 CCGACGGTATTC

• 10 61 74 CGTCCCGTTTGCCG

11 81 67 CTCCCTACCCCAAAC

23 97139

Geen irakenteet

Kuvatut geenisekvenssit jaettiin oligonukleotidi-fragmenteiksi (kuvio 1). Nämä fragmentit limittyvät selvästi, millä mahdollistetaan DNA-kaksoissäikeiden moittee-5 ton rakentuminen entsymaattisessa monikomponenttireaktios- sa.

PSTI-geenivarianttien rakentamisen perusstrategia edellyttää geenien rakentamista kahtena erillisenä segmenttinä: 10 Segmentti I: fragmenteista 1-11; käsittää muut tuvat aminohapot asemissa 17-21

Segmentti II: fragmenteista 12 - 25; käsittää muuttuvat aminohapot asemissa 29 ja 32 sekä 36.

Taulukossa 3 esitetään eri segmenttejä I ja II ra-15 kennettaessa käytetyt oligonukleotidifragmenttiyhdistel- mät. Päägeenistä poikkeavat fragmentit on merkitty pisteillä.

Ligatoimalla entsymaattisesti toisiaan vastaavat segmenttiparit I ja II saadaan halutut täydelliset geeni-20 variantit. Ensin valmistettiin geenimultimeerejä sallimal la myös litteiden päätyjen ligatoituminen segmenttien I 5'-päätyihin ja tarttuvien päätyjen ligatoituminen segmenttien II 3'-päätyihin. Monomeerisiä geenejä tuotettiin sitten pilkkomalla Hindi:11a ja joko HindIII:lla, 25 EcoRI:lla tai NcoI:llä.

Menetelmät

Oliaonukleotidifraamenttien kemiallinen synteesi

Kaikki tarvittavat oligodeoksiribonukleotidit syntetisoitiin tunnetulla fosfotriesterimenetelmällä käyttäen 30 selluloosalevyjä segmenttien tukipintana (Frank et. ai.

Nucleic Acids Res. 11 (1983) 4365-4377). Ne puhdistettiin ioninvaihto-HPLC:n avulla Whatman-Partisil SAX-10 -kolonnissa käyttäen eluoinnissa trietyyliammoniumfosfaattigra-dienttia (pH 6,3) 60-%:isessa formamidin vesiliuoksessa.

« 24 9 7 1 39

Oliaonukleotidien liaatointi segmentti I- ia segmentti II -DNA-kaksoissäikeiksi

Ekvimolaariset määrät (50 pmol) kutakin oligonuk-leotidifragmenttia (ks. taulukko 3) yhdistettiin siliko-5 noiduissa muoviputkissa (putki A: ylemmän säikeen muodostavat fragmentit, putki B: alemman säikeen muodostavat fragmentit). Fragmentit 1 ja 11 sekä 12 ja 25, joiden ei tullut fosforyloitua (esim. kaksoisjuosteiden päät) yhdistettiin erillisessä putkessa (putki C) . Kuivattiin saatu 10 materiaali. Putkien A ja B oligonukleotidejä fosforyloi-tiin 37 °C:ssa 30 minuutin ajan 5'-hydroksyylipäätyihin nähden kolminkertaisella [7~32P]APT-ylimäärällä (noin 2 Ci/ mmol) 10 /xl:n reaktiotilavuusseoksissa, jotka sisälsivät 60 mM tris-HCl (pH 8) , 6 mM MhCl2, 10 mM DTE ja 2 yksikköä 15 T4 PNK (polynukleotidikinaasia). Kvantitatiivisen fosfory-laation jälkeen inaktivoitiin T4 PNK lämmittämällä putkia A ja B kahden minuutin ajan 95 °C:ssa ja siirrettiin sitten putkien sisällöt putkeen C. Lisättiin 10 mM DTE:tä, 0,2 mM ATP:tä ja kaksi yksikköä T4 DNA-ligaasia ja inku-20 boitiin seosta tunnin ajan 40 °C:ssa. Seoksen jäähdyttyä 37 °C:seen lisättiin edelleen kaksi yksikköä T4 DNA-ligaasia ja jatkettiin inkubointia tunnin ajan 37 °C:ssa, sitten kolmen tunnin ajan 30 °C:ssa ja lopuksi yön yli 15 °C:ssa. Sitten seoksista otettiin näytteitä, jotka ana-25 lysoitiin elektroforeettisesti 0,04 x 20 x 40 cm:n 10-%-:isessa ei-denaturoivassa polyakryyliamidigeelissä (akryy-liamidi:metyleenibisakryyliamidi 29:1, 50 mM Tris-boraat-ti, pH 8,3, 1 mM EDTA), joka pidettiin termostaatin avulla 25 °C:sena, jännitteen ollessa 1 000 volttia (BPB = bromi-30 fenolisininen kulkee 25 cm:n matkan). Geelielektroforeesi-näytteet otettiin seokseen, joka sisälsi 0,05 % XC:tä, 0,05 % BPBrtä, 10 mM EDTA ja 4 M ureaa eikä niitä lämmitetty näyteapplikaatiota edeltävästi. Alkuperäisiä reak-tioseoksia säilytettiin -20 °C:ssa, kunnes geelielektrofo-35 reesilla oli osoitettu halutun ketjupituuden omaavan tuot-, teen muodostuminen.

i 97139 25

Sitten DNA-ligaasi inaktivoitiin lämmittämällä 15 minuutiksi 65 °C:seen. Ligatointituotteet eristettiin re-aktioseoksista preparatiivisella geelielektroforeesilla käyttäen 1 mm:n paksuista geeliä ja muutoin edellä kuvatun 5 kaltaisia reaktio-olosuhteita.

Täydellisten PSTI-aeenivarianttien rakentaminen Yhdistettiin 10 pmol vastaavia DNA-segmenttejä I ja II ja fosforyloitiin 30 minuutin ajan 37 °C:ssa 20 μ1:η reaktiotilavuusseoksessa, joka sisälsi 60 pmol [7~32P]ATP-10 :tä (200 Ci/mmol), 60 mM Tris-HCl, pH 8, 6 mM MgCl2:ta, 10 mM DTE:tä ja kaksi yksikköä T4 PNK:ta. Sitten lisättiin 2 μΐ 1 mM ATP:tä ja kaksi yksikköä T4 DNA-ligaasia, minkä jälkeen inkuboitiin 15 °C:ssa yön yli. Reaktioseos laimennettiin sitten 50 μΐ^εί, jolloin seoksen puskuriominai-15 suuksista tuli restriktioentsyymeillä pilkkomiselle otol liset.

Esimerkiksi PSTI-geenivariantit PSTI-l-Ala-32(-1A), PSTI-3-Pro-32-(-3P) , 20 PSTI-6-Ser-32-(-4A) ja PSTI-5-Pro-32(5P) rakennettiin edellä esitetyn menettelyn mukaan. PSTI-aeenivarianttien kloonaus Toimintaperiaate 25 Kuten edellä on kuvattu syntetisoitiin geenejä syn teettisistä geenifragmenteista, jotka käsittivät aminohap-pojäännöksiä 17, 18, 19, 20, 21, 29 ja 32 koodaavissa asemissa eri sekvenssejä. Geenivarianttien PSTI-0 PSTI-24 (ks. taulukko 1) systemaattinen nimeäminen perustuu amino-30 happojäännöksien 17 ja 29 välisen alueen erityiseen koodi- . sekvenssiin, jota seuraa joko A (alaniinille), s (serii- nille), G (glysiinille) tai P (proliinille) asemassa 32.

Geenirakenteet ovat siten suunnitellut, että segmentti I -variantit voidaan liittää segmentti II -variant-35 teihin (esim. asema 32 -variantteihin) Kpnl-kohdassa asemassa 72 - 76 suoritetun pilkkomisen jälkeen (kuvio 1).

26 97139

Edelleen muita variantteja valmistettiin niiden geenifragmenttien paikkaohjautuvan mutageneesin avulla, jotka kloonattiin M13-bakteriofagivektoreissa synteettisiä nukleotidejä käyttämällä tai alusta lähtevän geenisyntee-5 sin avulla, kuten edellä on kuvattu.

Kloonaus

Litteän 5'-päädyn (aminopään koodipääty) ja Hindlll-kohdan 3'-päädyssä käsittävien PSTI-varianttien (esim. PSTI-1A ja PSTI-3P) geenit kloonattiin restriktio-10 entsyymeillä Hindi ja Hindlll sulatettuun plasmidiin pUC8 (pUCPSTI-IA ja pUC-PSTI-3P).

PSTI-variantit, jotka käsittivät lisäksi NH2-päädys-sä metioniinijäännöksen (esim. Met'-PSTI-4A), kloonattiin vastaavalla tavalla pUC8-NcoI:een (joka sisältää HincII-15 kohtaan insertoituna Ncol-liittäjän CCCATGGG). pUC8NcoI:tä käsiteltiin Ncol-restriktioentsyymillä, käsiteltiin dNTP-:llä DNA-PolI:n (suurikokoinen fragmentti) läsnä ollessa ja käsiteltiin edelleen Hindlllrlla. Kloonaamalla PSTI-4A-variantin geeni tähän vektoriin rakennettiin uudelleen 20 Ncol-restriktiokohta (pUC-Met-PSTI-4A).

Restriktioentsyymipilkkomisen, ligatoinnin, trans-formoinnin ja β-galaktosidaasiaktiivisuuden "insertaatio-inaktivoitumisen·' määrittämisen menetelmiä ovat kuvanneet T. Maniatis, EKG. Fritsch ja J. Sambrook kirjassa Mole-25 cular Cloning, Cold Spring Harbor Publications, Cold

Spring Harbor, 1982.

Tiettyjen varianttien lisäanalyysejä ja DNA-sek-venssointia silmällä pitäen kloonattiin HincII-Hindlll-PSTI-fragmentit M13mp(-8, -9, -18 tai -19)vektoreihin nou-30 dattaen valmistajan (Boehringer, Mannheim) antamia ohjei ta.

Muiden varianttien muodostaminen rekombinaatiotek- niikan avulla

Restriktioendonukleaasi Kpnl lohkaisee PSTI-geenin 35 kaikki muodot ylemmässä säikeessä emäksen 76 jälkeen ja :| lil-i jlli l.i I M i ; l 27 97139 alemmassa säikeessä emäksen 72 jälkeen, jolloin muodostuu 4 bp:n yksisäikeisiä 3'-ylijääraäpäätyjä (GTAC).

Lohkaisemalla pUC8-PSTI-hybridejä sekä Kpnlrllä että Scal:llä saadaan kaksi fragmenttia, joista toinen 5 käsittää geenin 5'-päädyn, johon sisältyvät aminojäännöksien 17 - 21 muuttuvat sekvenssit ja toinen geenin 3'-päädyn, johon sisältyvät muuttuvat aminohappojäännökset asemissa 29 ja 32. Eri plasmideista peräisin olevien fragmenttien uudelleenligatoinnilla tuotetaan uusia pUC8PSTI-10 rekombinaatiovariantteja, joiden 5'- ja 3'-alueet ovat järjestäytyneet toisella tavalla (esim. lähtemällä PSTI-0P:stä ja PSTI-lA:sta voidaan tuottaa PSTI-OA ja PSTI-1P). Uudelleen järjestäytyneiden pUC8-PSTI-varianttien lisääntymiskykyisenä isäntänä käytettiin Escherichia coli K-12-15 kantoja RR1AM15 ja DH1 (ATCC 31343 ja 33625).

Muiden uusien varianttien valmistus paikkaohiautu-van mutaaeneesin avulla Lähtömateriaalina tässä mutatointimenettelyssä käytetään M13mp9-PSTI-klooneja, jotka valmistetaan pUC8-PSTI-20 varianteista peräisin olevia HincII-Hindlll-PSTI-fragment-teja kaksisäikeiseen M13mp9-bakteriofagiin J. Messingin ja J. Vieran, Gene 19 (1982) 269-276, menetelmän mukaan.

Eristettiin yksisäikeistä hybridibakteriofagia ja hybridi-soitiin sitä bakteriofagin M13mp9 rev. lineaariseen nega- • * ‘ 25 tiiviseen säikeeseen. Sitten hybridisoitiin mutaatiokoh- dassa uusien varianttien sekvenssin käsittäviä synteettisiä oligonukleotidejä tähän ns. aukkodupleksiin, minkä jälkeen muodostunutta hybridiä täytettiin polymeraasi I:n (Klenow-fragmentti, Boehringer, Mannheim) avulla sekä li-30 gatoitiin DNA-ligaasin avulla, jolloin muodostui mutaatio- . . kohdassa poikkeavia emäspareja käsittävä suljettu, ympyrän muotoinen kaksoiskierre. Transformoimalla tätä DNA:ta epä-parien korjausmekanismia vaillisessa E. coli-MutS-kannassa BMH 71 - 18 saadaan korkealla taajuudella M13mp9 rev.-35 PSTI-variantteja, jotka käsittävät epäilemättä synteetti- t 97139 28 sen mutageneesiprimerin myötävaikutuksesta kyseisen uuden sekvenssin ja jotka seuraavaksi valikoidaan E. coli su” (amber-suppressorimiinus) kannassa MK 30-3. Käytetty koejärjestely vastasi W. Kramerin et ai., Nucl. Acids Res. 12 5 (1984), kuvaamaa. Tällä tavalla rakennettiin variantit PSTI-8P, -9P, -10P, -IIP, -12P, -15P, -17P, -18P ja -19P.

DNA-sekvenssointi

Yksisäikeisten M13mp8-, M13mp9-, M13mpl8- ja M13mp9 (rev.)-PSTI-molekyylien DNA-sekvenssointi suoritettiin 10 käyttäen F. Sangerin et ai., Proc. Natl. Acad. Sei USA 74 (1977) 5463-5467, kuvaamaa dideoksimenetelmää tai pGV451-rakenteiden kyseessä ollessa G. Volckaertin et ai., Gene Analysis Techniques 1 (1984) 52-59, kemiallisen hajotus-menetelmän mukaan käyttäen spesifisiä ketjunpäätymerkkejä. 15 Kloonaus ilmaisuvektoreissa PSTI-peptidivarlantteja valmistettiin kloonaamalla E. coli -eritysvektoreissa, jotka sisälsivät a-amylaasin (B. subtilis) tai penisilliiniasylaasin (E. coli) signaa-lisekvenssit. Käyttämällä E. coli -eritysvektoreita ihmi-20 sen erittämän proteiinin, kuten PSTI:n ilmaisemiseksi, saavutetaan se etu, että fuusioitunut signaalipeptidi kuljettaa halutun geenituotteen sytoplasmamembraanin läpi solunulkoiseen tilaan, jolloin samanaikaisesti tapahtuu signaalipeptidin solutyöstö (G. Kreil, Ann. Rev. Biochem. 25 50 (1981) 317-348) ja aktiivisen PSTI:n vapautuminen joko valmiissa muodossa tai muutamasta aminohappojäännöksestä koostuvan liittopeptidin aminopäädyssään sisältävän fuu-siotuotteen muodossa.

T. Maniatis et ai. ovat kirjassa Molecular Cloning, 30 Cold Spring Harbor (1982) kuvanneet menetelmiä restriktio-entsyymeillä pilkkomiseksi, 5'-ylijäämäpäätyjen täyttämiseksi dNTP:n avulla DNA-pol I:n (suurikokoinen fragmentti) läsnä ollessa, ketjun hajottamiseksi S,-nukleaasin avulla, DNA:n geelielektroforeesin suorittamiseksi sekä DNA-frag-35 menttien eristämiseksi ja ligatoinnin sekä transformoinnin suor ittamiseks i.

97139 29 α-amvlaasieritvsvektorien pCH 233 ia pCH 2331 rakentaminen B. subtiliksen α-amylaasisignaalisekvenssi saatiin Bacillis subtilis -kannasta DSM 704 (talletuslaitoksesta, 5 Deutsche Sammlung flir Mikroorganismen, Göttingen) kloonaamalla Sau3A:lla osittain sulatettua kromosomi-DNA:ta pMK 3:n BamHI-keskukseen (M.A. Sullivan et. ai. Gene 29 (1984) 21-26). Yhtä klooneista, joka sisälsi a-amylaasigeenin käsittävän 3 kb:n DNA-fragmentin, modifioitiin poistamalla 10 osia a-amylaasin rakennegeenistä pALKl:n saamiseksi (henkilökohtainen tiedonanto, Dr. M.A. Courtney, Rochesterin yliopisto, N.Y., Mikrobiologian laitos). pALKl:n DNA-sek-vensseistä todettiin mahdollinen ribosomaalinen sitoutumiskohta (RBS) sekä 230 bp:n EcoRIBstEII-fragmentissa sig-15 naalisekvenssi, jonka homologia B. subtilis lA289:n a-amy-laasiin nähden oli silmiinpistävä (vrt. DNA-sekvenssiä kuviossa 2 M. Yangin et. ai., Nucleic Acids Res. (1983) 237-249, esittämään). Koska oli odotettavissa, että a-amy-laasisignaalisekvenssin prosessointi B. subtiliksessa ta-20 pahtuu aminohapossa asemassa 41 (ks. kuvio 2) , suoritettiin signaalisekvenssin liittäminen PSTI-lukukehykseen BstEII-kohdassa. Tästä syystä eristettiin pALKl:stä (joka saatiin Dr. M.A. CourtneyItä, Rochester) 230 bp:n fragmentin, joka sisälsi mahdollisen Shine-Dalgano-kohdan sekä 25 α-amylaasin signaalisekvenssin (fragmentti A kuviossa 3A). Lukukehyksen joko Met-PSTI-1A:lie tai Met-PSTI-4A:lie sisältävä fragmentti B eristettiin pUC-Met-PSTI-ΙΑ:sta tai pUC-Met-PSTI-4A:sta (ks. kohti PSTI-geenivarianttien kloonaus) . Fragmentin A litteän 3'-päädyn ligatointi B:n lit-30 teään 5'-päätyyn liittää a-amylaasisignaalisekvenssin lukukehyksen Met-PSTI-lA:n tai Met-PSTI-4A:n lukukehykseen, jolloin BstEII- ja Ncol-restriktiokohdat uudelleenraken-tuvat (kuvio 3B). A-Bfragmentin oikealla suuntaamisella lac z-promoottoriin nähden (ks. kuvio 3) saatetaan PSTI-35 prekursorigeeni lac z^rn säätelyn alaiseksi lac z':n luku- 97139 30 kehyksen taakse, jonka viimeksi mainitun puolestaan tulisi päättyä TAAlopetuskodoniin (fragmentin A DNA-sekvenssiase-mat -58/-56, kuvio 2) . Proteiinisynteesin saman mRNA:n mukaan tulisi käynnistyä uudestaan ribosomin sitoutumisen 5 α-amylaasin mahdolliseen Shine-Dalgano-kohtaan jälkeen noin 50 emästä alavirtaan lopetuskodonista asemasta -10 (ks. kuvio 2).

pCH 233:11a (PSTI-1A) tai pCH 2331:llä (PSTI-4A) transformoidusta E. coli RRlAM15:stä saaduissa PSTI-tuot-10 teissä todettiin proteiinien puhdistuksen jälkeen amino-happosekvenssoinnilla 13 aminohapon liittyneen PSTI-mole-kyylin aminopäätyyn (ks. esimerkit 1 ja 3) . Nämä ylimääräiset aminohapot, joiden sekvenssi alkaa asn-ala-glu-thr ..., todettiin identtisiksi a-amylaasisignaalisekvenssin 15 aminohappoihin nähden, jotka alkavat aminohaposta 32 kuviossa 3B, mikä osoittaa, että PSTI-prekursorin prosessointi E. coli -signaalipeptidaasin toimesta tapahtuu Bacillus α-amylaasin signaalisekvenssissä aminohapposekvenssin .. .pro-Ala29-ala-ala3Ii jälkeisessä osassa.

20 Penisilliiniasvlaasieritvsvektoreiden pCH 2361, pCH

2362 ia pCH 2363 rakentaminen

Toinen signaalisekvenssi PSTI-varianttien valmistamiseksi saatiin E. coli -penisilliiniasylaasista (PENAC), joka on E. coli -kannan ATCC 11105 solunulkoinen entsyymi. 25 Penisilliiniasylaasigeenin DNA-sekvenssin (W. Bruns et ai., J. of Mol. and Appi. Genetics 3 (1985) 36-44) mukaisesti syntetisoitiin DNA-fragmentti, joka sisälsi Shi-ne-Dalgano-kohdan ja PENAC:in signaalisekvenssin, jota modifioitiin sijoittamalla Shine-Dalgano-kohdasta ylävir-30 taan EcoRI-kohta ja siitä alavirtaan EcoRV-kohta sekä . BclI-kohta kuviossa 4 esitetyn sekvenssin asemaan 40, jol loin alkuperäisessä PENAC-signaalisekvenssissä asemassa 9 sijainnut aminohappovaliini saatiin muutetuksi metionii-niksi. PENAC-signaalisekvenssin prosessointikohtaan amino-35 happoasemaan 26 insertoitiin Nhel-kohta. PENAC-DNA-frag- 97139 31 mentti rakennettiin neljästä DNA-fragmentista (ketjut 1 -4, kuvio 4). kuten kuvattiin PSTI-geeneille; tämä fragmentti kloonattiin pBR 322:een, jota oli pilkottu EcoRI:lla ja Nhel:llä (pPENAC 1, kuvio 5A). DNA-fragment-5 tiketjujen 1-4 oligonukleotidisynteesi suoritettiin Applied Biosystemsin DNA-syntetisaattorilla malli 380 valmistajan toimittamien ohjeiden mukaan. PENAC-signaalisek-venssi saatettiin sitten lac z^in säätelyn alaiseksi kloonaamalla pPENACl:stä peräisin oleva EcoRI-BamHI-fragmentti 10 pUC8:aan (pCH 236 kuviossa 5A).

PSTI-5P:n ja PSTI-3P:n geenin sisältävien PENAC-il-maisuvektoreiden (pCH 2361 ja vastaavasti pCH 2362) rakentamiseksi modifioitiin pCH 236:n Nhel-keskusta (ks. kuvio 5A) ja pilkottiin sitä lisäksi tämän jälkeen HindIII:lla.

15 PSTI-5P:n (tai PSTI-3P:n) geenin ligatointi täten esikäsi-teltyyn pCH 236:een liittää PENAC-signaalisekvenssin PSTI-lukukehykseen, jolloin muodostuu ilmaisuvektori pCH 2361 (tai pCH 2362). Myös tässä yhteydessä tulisi, kuten edellä pCH 233:lie kuvattiin, lac z' -lukukehyksen päättyä 20 PENAC:in Shine-Dalgano-kohtaa edeltävään TAG-kodoniin (asemat 7-9 kuviossa 4) .

Met-PSTI-4A:n (esimerkki 4) valmistamiseksi rakennettiin pCH 2363, jota varten pCH 236:ta esikäsiteltiin, kuten edellä on kuvattu. Met-PSTI-4A:n geeni eristettiin 25 pCU-Met-PSTI-4A:sta (kuvio 5B) .

pCH 233:n. 2331:n. 2361:n. 2362:n ia 2363:n trans-formointi E. coli -kannassa RR1ÄM15 tai PH, Transformoitaessa transformoitumiskykyisiä E. coli DH,- tai RRlAM15-SOluja pCH 233:11a, 2331:llä, 2361-2363-30 :11a siirrostuksissa valikoivaan kasvualustaan (50 μg/ml ampisilliiniä sisältävä agar-agar), yksisäikeisten pesäkkeiden plasmidi-DNA:n restriktioanalyyseissä ja minily-saattien valmistuksessa käytettiin tavanomaisia menetelmiä (T. Maniatis et ai., Molecular Cloning - A Laboratory 35 Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. 1982). Geenisegmentissä 97139 32 tai ilmaisuvektorissa esiintyvien restriktiokohtien esiin-seulonnan jälkeen määritettiin insertoidun DNA-fragmentin DNA-sekvenssi, kuten edellä kuvattiin synteettisille geeneille.

5 pCH 233:11a. 2331:llä. 2361:llä. 2362:11a tai 2363- :11a transformoidun E. coli -kannan RR1AM15 fermen- tointi ia indusointi pCH 233:11a, 2331:llä, 2361:llä, 2362:11a tai 2363-:11a transformoitua RRlAM15:tä viljeltiin yön yli kestävi-10 nä kasvatuksina. Kasvualusta sisälsi 3 % nautauutetta (Gibco), 1,5 % hiivauutetta (Gibco) ja 0,5 % K2HP04 tislatussa vedessä (pH 7,0) sekä Mg:n/ml ampisilliiniä. Hyvän ilmastuksen saavuttamiseen kiinnitettiin huomiota, minkä vuoksi viljelmiä inkuboitiin 1 litran erlenmeyerkolveissa, 15 jotka sisälsivät 100 ml kasvualustaa.

Kolveja ravisteltiin Ktihner RC-6-U -ravistelulait-teessa 28 ja 37 °C:ssa ravistelutaajuudella 190 kpl/min.

PSTI-varianttien valmistamiseksi yön yli kasvaneita viljelmiä laimennettiin suhteessa 1:100 tuoreella 37 °C-20 :eisella kasvualustalla ja kasvatettiin sitten noin kolmen tunnin ajan, kunnes optinen tiheys 550 nm:n aallonpituudella oli 1,5. Lac-promoottorin indusointi suoritettiin lisäämällä viljelmiin 1 mM isopropyylitiogalaktodidia (Sigma). Fermentointia jatkettiin 20 tunnin ajan, kunnes 25 optinen tiheys 550 nm:n aallonpituudella oli 4-6, minkä jälkeen solut otettiin talteen sentrifugoimalla 8 000 kierrosta/min kierrosnopeudella (10 min, 4 °C, laitteena Kontron Centrikon H-401, roottori A 6.14).

Inhibiittorien eristys ia luonnehdinta 30 Entsyymit

Ihmisen leukosyyttielastaasi (HLE) ja sianhaima-elastaasi (PPE) hankittiin valmistajalta Elastin Products Company, Inc., P.O. Box 147, Pacific, Miss. 63609, USA.

Nauta-a-kymotrypsiini (CHT) hankittiin E. Merckil-35 tä, Darmstadt.

> i 97139 33

Substraatit

Substraatit MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA (HLE), Ac-Ala-Ala-Pro-Ala-pNA ja Suc-Ala-Ala-Ala-pNA (PPE) ja Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA (CHT) hankittiin Bachemilta, 5 Budendorf, Sveitsi.

Kromatoarafiaväliaineet

Sephadex® G-25, Sephadex® G-50, Sepharose® 4B-C1 ja SP-Sephadex C-25 hankittiin valmistajalta Deutsche Pharmacia, Freiburg. Hydrofovinen hartsi LGP 4429 on Bayer AG:n, 10 Leverkusen, oma tuote.

Menetelmät

Kymotrypsiini immobilisoitiin Sepharose® 4B-Cl:ään pelkistämällä Na[CHBH3]: 11a kymotrypsiinistä muodostettua Schiffsin emästä, kun kantoaine oli ensin hapetettu nat-15 riumperjodaatilla (G.B. Royer et ai. Biochem. Biophys.

Res. Commun. 164 (1975) 478-484).

HPLC:ssä käytettiin soveltuvia kolonneja. Nämä on erikseen määritetty vastaavassa tekstiyhteydessä ja/tai oheisten kuvioiden selvitysten yhteydessä.

20 Aminohapposekvenssin määritys

Liuotettiin noin 0,5-2 nmol proteiinia 30 μίζββη TFA:ta. Näyte siirrettiin lasikuitusuodattimelle, jota oli esikäsitelty 3 mg:11a Polybreniä. Sekvenssianalyysi suoritettiin Applied Biosystemsin (Inc., USA) kaasufaasipro-25 teiinisekvenssorilla Hewickin mukaan (R.M. Hewick, M.W.

Hunkapillar, L.E. Hood, W. Dreger, J. Biol. Chem. 256 (1981) 7990-7997). Kussakin vaiheessa vapautuneet amino- happofenyylitiohydantoiinijohdannaiset analysoitiin käyttämällä syaani-HPLC-kolonnia (DuPont) ja Beyreutherin ku-30 vaarnaa erotysjärjestelyä (K. Beyreuther, B. Biesler, J.

Bowens, R. Dildrop, K. Neufer, K. Stiiber, S. Zais, R. Ehring, P. Zabel, Modern Methods in Protein Chemistry, Walter de Gruyter & Co., Berliini, 1983, s. 303-325). Käytettiin Watersin HPLC-järjestelyä, joka käsitti M 520 35 -pumpun, WISP 710B -autoinjektorin, LC-spektrofotometrin tyyppi M 481 ja SHIMADZU-integraattorin tyyppi CR-3A.

97139 34

Happohvdrolvvsi ia aminohappoanalvvsi Mitataan noin 1 nmol proteiinia pyrex-lasiseen koeputkeen ja lisätään 200 μΐ 6M HC1, joka sisältää 0,05 % 2-merkaptoetanolia (I.T. Potts Jr. Anal. Biochem. 131 5 (1969) 1-15). Koeputkisisällöt sulatetaan vakuumissa ja inkuboidaan 42 tunnin ajan 110 °C:ssa. Hydrolysaatit kuivataan nopeasti, liuotetaan uudelleen 150 ^l:aan 0,2M natriums itraattipuskuria, pH 2,2 ja suodatetaan. Aminohappo-analyysit suoritettiin Biotronic LC 5000 -aminohappoanaly-10 saattorilla, joka oli varustettu fluoresenssidetektorilla ja SHIMADZU CR-2A -integraattorilla. Aminohapot saatettiin reagoimaan o-ftaalidialdehydin kanssa ja kvantitoitiin sitten oleellisesti Bensonin kuvaaman menetelmän mukaan (J.R. Benson, P.E. Hare, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 72 15 (1975) 619-622).

Entsvvmianalvvsit ia inhibitiovaikutuksen määritykset vilielmäsuodoksista

Viljelmäsuodoksia käsiteltiin seuraavasti: Lisättiin 10 μΐ Tween 80 -liuosta (0,5 %) ja 50 μΐ 20 perkloorihappoa (70 %) 1 ml:aan viljelmäsuodosta. 20 minuutin kuluttua kyseiset näytteet sentrifugoitiin ja neutraloitiin kirkkaat supernatantit lisäämällä 225 μΐ kyllästettyä Tris-emäsliuosta. Näistä liuoksista otettiin määrä-suuruisia näytteitä inhibitiovaikutuksen määrittämiseksi. 25 Entsyymimäärityksissä käytetyt olosuhteet on esi tetty taulukossa 4. Yleensä ottaen näytteitä laimennettiin sopivalla puskuritilavuudella, minkä jälkeen lisättiin entsyymi. Esi-inkuboinnin jälkeen lisättiin substraatti (substraatit oli liuotettu DMSO:hon 0,lM:n pitoisuudeksi 30 sekä laimennettu puskurilla perusliuoksen pitoisuuteen). p-nitroanaliinin vapautuminen substraateista määritettiin 405 nm: n aallonpituudella joko jatkuvasti tai reaktion pysäytyksen etikkahappoa lisäämällä jälkeen. 100 %:n lukema annettiin niille näytteille, joihin ei ollut lisätty 35 inhibiittoreita. Prosentuaalinen inhibitio laskettiin seu-raavasta kaavasta: 97139 35 optinen tiheys, kun inhi-biittoreita läsnä inhibitio-% = 100 x ( 1--) optinen tiheys, kun inhi- 5 biittoreita ei läsnä

Absoluuttiset inhibiittorimäärät pystyttiin laskemaan kalibrointikäyrien avulla vasta sitten, kun käytettävissä oli pieniä määriä puhtaita yhdisteitä.

10 Tämän hakemusjulkaisun esimerkeissä 3 ja 6 käytetyt mikro-organismit talletettiin talletuslaitokseen National Collection of Industrial Bacteria (NCIB), Torry Research Station, P.O. Box 31, 135 Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, Skotlanti, Englanti, talletusnumeroilla NCIB 12 365 ja 15 NCIB 12 364.

Esimerkki 1

Asn'13-Ala',2-Glu',l-Thr‘l0-Ala"9-His‘8-Lys'7-Ser'6-Asn"5-Glu'4-

Val‘3-Thr‘2-Met'I-Leu,8-Glu19-Arg2,-Ala32-PSTI:n (PSTI-4A- minifuusiotuotteen eristys 20 Käsiteltiin 10 litraa RRlAM15/pCH 2331:n fermentaa- tiolietettä 350 ml:lla perkloorihappoa (70-%:ista). Sakka poistettiin sentrifugoimalla. Supernatantti neutraloitiin 8N KOH-liuoksella. KCl04-sakka erotettiin suodattamalla bUchnersuppilolla imun avulla seisotuksen 4 °C:ssa jäl-25 keen.

Suodos suodatettiin kymotrypsiini-Sepharose-4B-Cl -konjugaattigeelikerroksen (7x9 cm) läpi 4 °C:ssa. Geeliä pestiin vedellä, kunnes eluaatin ekstinktio 280 nm:n aallonpituudella lähestyi nollaa ja sitten 500 ml:11a 0,2M 30 asetaattipuskuria (pH 5) ja 500 ml:11a vettä. Lopuksi geeliä eluoitiin 0,2M etikkahapolla, jonka pH oli HCl:llä säädetty 2,0:aan. Eluutioprofiili on esitetty kuviossa 6. Aktiiviset fraktiot (määritettyinä leukosyyttielastaasin inhiboitumismäärityksellä) yhdistettiin, pH säädettiin 35 neljään lisäämällä kiinteää natriumasetaattia sekä konsen troitiin pyöröhaihduttimella. Lopuksi suolat ja vähäiset määrät epäpuhtauksia poistettiin preparatiivisen HPLC:n 97139 36 avulla RP-318-kolonnia käyttäen. Eluutioprofiili on esitetty kuviossa 7. Kunkin fraktion puhtausaste määritettiin analyyttisen HPLCrn avulla.

Näiden tuloksien mukaisesti valmistettiin fraktio-5 yhdistelmät fraktioista 42-44, 45 - 46 ja 47-49, jotka kylmäkuivattuina tuottivat 6, 12 ja vastaavasti 6 mg tuotetta. Korkeimpaan puhtausasteeseen päästiin keskifrak-tioissa, diagrammi näiden alayyttisestä HPLC-ajosta on esitetty kuviossa 8.

10 Tiedot aminohappokoostumuksesta ja sekvenssianalyy seistä sekä inhibitiospektri on esitetty taulukoissa 5 - 7.

Esimerkki 2

Leu,g-Glul9-Arg2l-Ala32-PSTI:n (PSTI-4A:n) valmistus 15 minifuusioproteiinista BrCNrn avulla pilkkomalla

Liuotettiin 2,93 mg (0,46 μιηοΐ) PSTI-4A-minifuusiotuotetta (esimerkki 1) l ml:aan 70-%:ista muurahaishappoa. Lohkaisu suoritettiin lisäämällä 3 mg bromisyaania ja in-kuboimalla 18 tuntia huoneen lämpötilassa typpiilmakehässä 20 sekä pimeässä. Reaktio pysäytettiin laimentamalla seosta 10 ml:lla vettä. Vesi sekä haihtuvat sivutuotteet poistettiin kylmäkuivaamalla. Leu18-Glu19-Arg2l-Ala32-PSTI (PSTI-4A) erotettiin sivutuotteista ja lohkeamattomasta fuusiopro-teiinista geelikromatografiän avulla käyttäen Sephadex® 25 G50 (Superfine) -kolonnia (2,5 x 90 cm) l-%:isella muura haishapolla eluoiden. Fraktiot yhdistettiin niiden reten-tioaikojen hienohuokoisessa Biorad RP-318 -kolonnissa (4,6 x 250 mm) perusteella; liuos A: 0,l-%:inen TFA, liuos B: 0,l-%:inen TFA/60-%:inen asetonitriili; virtausnopeus 1 30 ml/min; huoneen lämpötila; fraktioiden toteaminen 210 nm:n aallonpituudella; gradientti 0 - 60 % liuosta B.

Fraktiot kylmäkuivattiin ja niitä puhdistettiin toistamiseen suoritetun kromatografian avulla käyttäen samaa kolonnia ja samoja olosuhteita. Aktiiviset fraktiot 35 kerättiin talteen ja kylmäkuivattiin. Puhtaus varmistet- 97139 37 tiin suorittamalla Leu,8-Glu19-Arg21-Ala32-PSTI:n (PSTI-4A:n) analyyttinen HPLC-ajo, kuten on kuvattu esimerkissä 1. Inhibiittoria karakterisoitiin aminohappoanalyysin, N-pääty-sekvenssoinnin sekä HPLC:n ja elastaasiinhibitiomäärityk-5 sen avulla (taulukot 5 - 7).

Esimerkki 3

Asn'13-Als'I2-Glu',,-Thr',0-Ala'9-His'8-Lys‘7-Ser'6-Asn's-Glu'4-Val^-Thr^-Met'1, Leul8-Ala32-PSTI: n (PSTI-lA-minif uusiotuotteen) eristys 10 Käsiteltiin neljää litraa RRlÄM15/pCH 233:n fermen- taatiolietettä 120 ml:11a perkloorihappoa (70-%:ista) ja poistettiin muodostunut sakka sentrifugoimalla (30 min, 4 °C, 4 000 kierr./min, Beckman J-6). Supernatantin pH säädettiin 8N NaOH-liuoksella 8,6:een ja suodatettiin super-15 natantti sitten kymotrypsiini-Sepharose-4B-Cl-konjugaatti-kerroksen (8 x 10 cm) läpi. Geeliä pestiin 0,2M Tris-HCl-puskurilla (pH 8,6), kunnes suodoksen ekstinktio 280 nm:n aallonpituudella palautui perustasolle. Tämän jälkeen geeliä eluoitiin toisiaan seuraten vedellä ja 0,1M etikkaha-20 polla, jonka pH oli HCl:llä säädetty kahteen.

Inhibiittoriaktiivisuutta sisältävät fraktiot (tunnistettuina leukosyyttielastaasin avulla) yhdistettiin, pH säädettiin 8N NaOH-liuoksella 2,7:ään ja fraktiot kaadettiin SP-Sephadex C-25 -kolonniin (2,5 x 35 cm), joka oli *« 25 edeltä käsin tasapainotettu 0,15-%:isella trifluorietikka- hapolla (jonka pH oli säädetty 2,7:ään NaOH-liuoksella).

Kolonni pestiin lähtöpuskurilla ja sitä eluoitiin sitten käyttäen lineaarista 0 - IM NaCl-gradienttia läh-töpuskurissa. Yhdistettävät fraktiot valittiin inhibiit-30 toriaktiivisuuden ja analyyttisen HPLC-ajon (RP-318, Bio-rad) perusteella. Yhdistetyt fraktiot konsentroitiin ul-trasuodattamalla käyttäen UM2-kalvoa (Amicon) ja lopullinen puhdistus suoritettiin preparatiivisella HPLC-kromato-grafiällä käyttäen RP-318-kolonnia (gradientti 0 - 60 % 35 asetonitriiliä 0,15-%:isessa trifluorietikkahapossa 60 mi- 97139 38 nuutin aikana). Saatiin kaksi fraktiota, jotka kylmäkui-vattiin ja saatiin 8,7 mg homogeenistä tuotetta sekä 1,9 mg vähäisiä määriä epäpuhtauksia sisältävää tuotetta. Analyyttiset tiedot (aminohappoanalyysi, sekvenssianalyysi ja 5 inhibitiovaikutus) on esitetty taulukoissa 5-7.

Suoritettiin PSTI-lA-minifuusioproteiinin pilkkominen kromisyaanilla, kuten on kuvattu esimerkissä 2 ja saatiin Leu18-Ala32-PSTI (PSTI-1A)

Esimerkki 4 10 Met'l-Leu18-Glul9-Arg2t-Ala32-PSTI: n (Met-PSTI-4A: n) eristys Käsiteltiin yhtä litraa RRlAM15/pCH 2363:n fermen-taatiolietettä perkloorihapolla, sentrifugoitiin ja neutraloitiin, kuten on kuvattu esimerkissä 1 sekä kaadettiin 15 saatu liuos lopuksi kymotrypsiini-Sepharose-4B-Cl-konju- gaattikolonniin (2,5 x 10 cm). Geeliä pestiin vedellä, asetaattipuskurilla ja vedellä, kuten on kuvattu esimerkissä 1. Inhibiittorin desorptio suoritettiin eluoimalla 0,2M etikkahapolla, pH 2 (säädetty HCl-liuoksella). Yhdis-20 tettiin inhibiittoriaktiivisuutta sisältävät fraktiot, säädettiin pH neljään lisäämällä NaOH-liuosta ja konsentroitiin pyöröhaihduttimessa 5 ml:ksi. Lopullinen puhdistus suoritettiin preparatiivisella HPLC:llä käyttäen RP-318-kolonnia ja 0 - 60 % asetonitriiligradienttia 0,15-%-*' 25 :isessa trifluorietikkahapossa. Kylmäkuivaamalla yhdiste tyt aktiivisuutta sisältävät fraktiot saatiin 1,8 mg tuotetta. Muut tiedot (aminohappokoostumus, sekvenssianalyysi ja inhibitiovaikutus) on esitetty taulukoissa 5-7. Esimerkki 5 (vertailu) 3 0 Tyrl8-Glu,9-Arg21-PSTI:n (PSTI-3P:n) eristys Käsiteltiin 750 ml RRlAM15/pCH 2362:n fermentaatio-lietettä 25 ml:11a perkloorihappoa ja sentrifugoitiin 30 minuutin kuluttua. Supernatantti neutraloitiin lisäämällä 4N KOH-liuosta, muodostunut KC104 poistettiin kuuden tunnin 35 kuluttua suodattamalla. Suodos kaadettiin kymotrypsiini- 97139 39

Sepharose-4B-cl-kolonniin (2,5 x 7 cm), jota sitten pestiin vedellä ja 0,2M etikkahapolla. Inhibiittorin desorp-tio suoritettiin 0,2M etikkahapolla, jonka pH oli säädetty 1,8:aan HClrllä. Aktiiviset fraktiot yhdistettiin, pH sää-5 dettiin 3,5reen NaOH-liuoksella ja konsentroitiin pyörö-haihduttimessa. Vähäinen sakka poistettiin sentrifugoimal-la ja suoritettiin supernatantilla preparatiivinen HPLC-ajo RP-318-kolonnissa. Kylmäkuivaamalla aktiiviset fraktiot saatiin noin 0,8 mg inhibiittoria, joka analyyttisen 10 HPLCrn perusteella oli homogeenista, analyyttiset tiedot (aminohappoanalyysi, sekvenssianalyysi ja inhibitiovaiku-tus) on esitetty taulukoissa 5-7.

Esimerkki 6

Val'1-Glu,9-Arg21-PSTI:n (PSTI-5P:n) eristys 15 3 litraan RRlÄM15/pCH 2361:n fermentaatiolietettä lisättiin 100 ml:aan perkloorihappoa (70-%:ista). 30 minuutin kuluttua muodostunut sakka suodatettiin pois ja säädettiin supernatantin pH 7:ään 8N NaOH-liuoksella. Suo-dos kaadettiin sitten hydrofobiselle hartsikerrokselle 20 (Lewapol LGP 4429, Bayer AG; halkaisija 3 cm, kerroksen paksuus 40 cm), joka oli edeltä käsin pesty 0,1N HClrllä, metanolilla ja vedellä. Hartsi pestiin vedellä ja sitä eluoitiin sitten lineaarisella 0 - 70 % metanoligradien-tilla. Määritettiin kunkin fraktion inhibiittoriaktiivi-25 suus (leukosyyttielastaasin inhibitiomääritys metanolin poiston haihduttamalla jälkeen). Aktiiviset fraktiot yhdistettiin ja konsentroitiin vakuumihaihdutuksella. Kon-sentraatti tehtiin happamaksi pH 2,7:ään trifluorietikka-hapolla ja kaadettiin SP-Sephadex-25-kolonniin (2,5 x 10 30 cm), joka oli edeltä käsin tasapainotettu 0,15-%:isella trifluorietikkahapolla (pH 2,7, säädetty NaOH:11a).

Kolonnia eluoitiin sitten lineaarisella 0 - IM

NaCl-gradientilla lähtöpuskurissa. Inhibiittoriaktiivi-suutta sisältävät fraktiot yhdistettiin, neutraloitiin, 35 konsentroitiin ja poistettiin suolat suodattamalla Sepha- 97139 40 dex G-25:llä käyttäen Ο,ΟΙΜ fosfaattipuskuria, pH 7,0. Aktiivisten fraktioiden pH säädettiin 2,7:ään ja niillä suoritettiin toistamiseen kromatografia-ajo SP-Sephadex C-25 -kolonnissa käyttäen lineaarista 0,1 - 0,5 M NaCl-5 gradienttia, pH 2,7.

Aktiivisten fraktioiden pH säädettiin 4,0:aan, konsentroitiin ja puhdistettiin niitä edelleen suorittamalla preparatiivinen kromatografia-ajo RP-318-kolonnissa. Tämä vaihe toistettiin kerran. Lopullinen puhdistus suoritet-10 tiin preparatiivisen HPLC-ajon avulla Pharmacian Mono-S-kolonnissa ja tätä seuraavan toistamiseen suoritetun kromatograf ia-a j on RP-318-kolonnissa avulla (kuvio 9) . Puhdistetun tuotteen analyyttiset HPLC-diagrammit on esitetty kuviossa 10. Muut analyyttiset tiedot (aminohappokoostu-15 mus, sekvenssi, inhibitiovaikutus) on esitetty taulukoissa 5-7. 1 « 41 97139 N.

N

O

O'

---------- — —η «I

m o Nl - 00 CO *® •H · — e — - E n 3 o. § o ' ® _ S' -> — c 3 — z w u f- ^ w H E c oi ^ ί?1 ^ · ©n ^ ··* . _ S' -H <U ίΟ ' ' - . G ·Η — 2 n Ä ux o c g e cl 2 * ^ o) u rl is H *> *1 o o I sf«E« ra « : ^3 * ® ° ‘""^•ί,όβΟ S .§ “ S| iS ~° 5ioo n -

o *______ I

* Λ _, r u

•H O

«-, T-i «· — * ββ1 c «f e

•H w M (ON

“ o. e ^ 5 E

2 SF »e < is** 2 -k e m — c'1* « z * ~ “

w * k Z E o JS — CL E N C

2 u x m »n - g £ ' « Σ u VI f: .

® C m - . , S -s h < m E Λ o — · 23 r - o o Se <i^><v>w · .o g -¾ - ► in o 2 .5 .00- * o * λ n n o u ο-ο~ r«|s gw °*_r______“ « *~ « λ* n a U Λ£ <r jc < o i co o » . ®

o oo i ^ · O

5 “ S β o 3«! « O. c - Γ £ Γ - " «S 43' ^ a.» S w * £ *3 e e -n * < £.2n 5 ""St- » “ a S £ f* .« .

v, D H X in C S ft i) — £ O o · .*

“ , g £ — ~ O O 2 .£ S «e - o — BO

5'^c * o m p> 2 — w > m E — o — — -p1 § ro o j-γη i i «e «h n «*x:u 3 rt 3: I OOO— *J u Ό

11 rt tI - * mu ~ rt O O

J *i w “ £ CL O O IB — U

_______ uoa t o :rt w Ό I w 3 tn Λ in u 3 n 33 ·» 3 o *h c o tn 3 e py 3iiiHW3iw tn m «H<sjn 97139 42 N^nNin-iNONvv-ionrf

L· ν' VO V V VO VO VO VO VO VO VO vo VO VO VO

n I O — t"v TT TT «C <\i O tv O O tv o t— t*· +o — O' o &· tv vr m o «e«o

(h ♦- o- o o V o- o I o o o- | VV

to Ό P1 (M N V ^ H «I ro ro ^ PJ Γ0 φ ft- w

— . - - .H

Π3 c c

CO

5

s ^ n n ιλ h n n ^ n h n ^ ,JL

ft W ^ W ^ ^r

• n n co ^ tn ^ n h o ^ m —< ro sL

*-· cm no en u-> oo ro O n <si ro _p H -r χη N> CO CO N- 4Λ CM nf W H en ^ Jfi

_ft-__ rH

————————————— cc

•H

rH

CL

< 5 l ____________„ 7 H Ν«ηΜηΝΝ*<Νιηη·ι n « ° &4 li

I CO O T

λ» CNNOnNOHtONION « CO

φ V «h V V V V V V V V V V I V * , Ϊ onnsiANN^HinNO toto ’£ Λ

rH

I rH

O ra

4_l Ή Λ E

•H H © OV OV O—. IV O» ov ov OV OV OV Λ OV OV ^ m <3 *oe«®««f)Hnin(OHoMrn tr C H U ON vovovovovovovovovovovovovovovo f H tJ H-.

r-< »hhjj m o n >4 in ΟΜηπηιηιηιηιηΝ o « H -d o ΡΐΑΟΟΚΟ^ηΟΟΟΝχΟΝ v C (O e V VVVVVVV^OVVVVV. d n) tiu «ΊηηοοιηνηοπιηΝΗΗηη c a--s .g -s

1 M

-h < co v co no ir> (M ro n in n n to to ^

g 7* ---'VOVOVOVO VO VO------ e 4J

<-> rormsoo to ro m ro o S

e H o o n «o n n o tv ό ^ ro co ro T

Φ yj «L ·> «. *4 »r tk ·> | ^ *> ·- «4 | «V fr. ^ .

·« Oo βο 4T N «O in N N 00 « CO ·τ-ι COCO T ·Μ

•H--o W

M . HE

O L'-' ovovovovovovov^vovovovr^ovovov 11 h < 3 ΰ »««o^MntrnHNinn-i-cw - ‘d ^ ^ W> W> W W •W' w ^ w

•h Λ T- 2 «ccoomooNcocoiontMOinH ϊ! P

•3 H-h o trtts^inNOcosHHvtoNH tl £ ‘H (Ärt.vJ * *r ^ * »v«v·- »-»-#-#-·. fr Λ»” "e OuO-S cointo»inniQOHnfo«ia»» ™ ^

H ’H 'O

•h .< N«nNinNNONinnHon« 3 ? H M VO VO VO VO VO VO VO VO VO VO VO VO V. VO VO CT' w , e υ h m <e n n h to e o o «o o »* o u H « o to co r o o « o o o «o ^ -h m to VVVVVVV|»v*-*-«-|V«. Sm Λ o. ό ro ro ό rr co ro h ^ n - ro to Jj J2 ,S ] x, :0 H o o o e

3 C O. 5 -S

-h dB· aL L 3 sitHj « 3 L Kit It Dl S :2 2 I J W£ ® o* -H oO (0®rV φ >,£- >nL- 5£r 97139 43

o (0 O O» O) O O

CM U X U X U U U

NCLU O. O <(L.CU

o> n en u o> o> «4 i_ X n X X (- u (M < «J << «J H ·< < •H U M U M 9 £· t

x csj H << P «< O H H

r—ί* S 9 n 9 333 to ¢4 1-4,-1 1-4 1-4 O rl rl

e -4 0 0 *-< O «JOO

to tn 33)90)

tn «OOU eu ,e CO X

e -<«j< «j < F ► h > u X u X nuu I ^ i 5 e s u ί i 0 ie 3 w 3 >s » *® CL, U> x O >> Φ ^ S S υ *j o o u u

cO

"o X l. X U C ►» >< β |/) H φ H Φ w ^ -H -4 o en 0(0 < o o 1 cd. co. 3ce >. «f IA 10 1010 ΦΙ0Ι0 4J ^<<<< < < IS 3 *> 3 *» 3 5 2

Cu, fr) Q) Φ Φ Φ ^ Φ Φ i S JS s «jr o «j «j z e 3 U 3 t- C 9 9 <U (\J —4 .C i-ι J3 to ^ •h -op o P < o o 4-1 4j g <— e u e e e «4 te n ne ,Fnn to «-<> << > H < < ΐ u 9 u 9 n u u to o >s >* ** >* ,'Ί J’T'

> «n H O HO O H H

I n>

H S ne ne PPP

en x n >s n XX>» ¢)4 ro o» u *< u < «juu C ro te u te u rt n n tu - >> ® ►» ® r! 4-i ro eo «J (O «Jco <<«j«j tn •h re tn rt te 3 n n)

Cfl «4 X «4 X >-« 1-4 ·-< ^ X < «J <<«J O < < g 3 n 9 n 0)99 «H ·«< H «4 U *4 »4 e «coz ox «oo 4-1 3) M O) rt X OI O) CO U 1-4 U 44 rl U tr > u-> < < << << O < <

j2 X U X U 9 X X

«4 £ «4 _C · 4·* ««

m 41· O H OH «JOO

S 3999 fc22 en e, —4 te 44 ΦΟν o m«JO «jo io«j«j jd 3 UrtUrt Oul-u r—I φ H Φ H O Φ Φ

3 N (O < Ui < < (O (O

cO

h n. e n. e n.

|0 10 to 10 Φ Φ tO

< < < < £<< \D 1 " —" ......

O

*S I < -< 3 £ < ft- fc i-H cc «· ^ 3 o ^4 »h 3 o 1 ^ in n C CO) I | 14. 3 | · lm 3·* I I *

CO Ό C «-4 *H «U N y · n H

H Λ -H H H e o H Hco-^H H H

O ro K Ui .5 .H (O (O h -H ® (O w (p

KoC tu ft-geoO* O* c= w X ft* ft* (U

97139 44 w :cd u :cö &

U CO

0 >,

4J »H 4J

*H « O) 01 O) CT Ö)

•3 S:«CCCC C

5 m :g » id o n o a rH 60 •h m ^ c

to TO

4-> e Λ! O

>ι -H -H O

u to to in aj pc ^

4J

•Η 0) w

• -H

to to 3 to u to

3 4J

J*! to

•H tO tO

td rH

> tU +-1 ° TjuO»D>D»DIO»D» μ Jj^ceeeee 5 2 2 2 2 g 2 •H to c —- »-I σ ·-! jc o tu oo 5 Ö rH e c «Λ Η Ο Ή . CEO ^

d (0 Λ tM

<U ΜΉΗ •H O s—' -s^

4J

u ' d tO c

•H O

Μ Ή ,-—v

tO -Μ -H tO

> *H C Pi 1 Λ ·Η 4-1

M i-t ·Η -H

H .d tO (-1 c/3 d o, ;t0 CU -H S »0 »»»»»»

μ g C C C C C C

<C d μ ^ tutu 01000*® ** 2 00 ·* 2 4J to g 4J (3 ° ° ω i-i >, s ^ ·*

•H Λ to O

tO 6-8 I C to -¾ i W“^ 6 m ________________________________ d -u

tO to I

d > i-i o d m g -h

•H 4-1 >1 CO

to 4J >1 3 . M o to d /-i

• <U 3 4J C4—t r-H

« -M P -H

ω d · •h e ;

B *H Y

.3 ™ ^ H ^ a. a.

p«! *r «-« to t*> m

d E ^ E,H E ·Η .L -H E ·Η E

3 Ko Km fr to "to K to K

to P o 5f* <u ^tu ® <u iPtu SP

f—I CU 4_) Ori s—/ P* v £ Du ^ flu 97139 45

Kuvioiden selitys

Kuvio 1: PSTI-päägeenin nukleotidisekvenssi ja vastaava aminohapposekvenssi. Geeniä rakennettaessa käytetyt synteettiset oligonukleotidit on merkitty sulkeiden ja 5 järjestysnumeroiden avulla. Geenin jakautuminen segmenttiin I (ensimmäinen osa) ja segmenttiin II (jälkimmäinen osa) on osoitettu katkoviivalla.

Kuvio 2: pALKlrn 230 bp:n EcoRl-BstEll-fragmentin DNA-sekvenssi, joka käsittää mahdollisen Shine-Dalgano-10 kohdan (SD) asemassa -10 sekä x-amylaasin signaalisekvens-sin alkaen asemasta 1. Eksoentsyymin mahdollinen proses-sointikohta on aminohappojäännöksen 41 kohdalla.

Kuvio 3A: Fragmentti A eristettiin pALKlrstä sulattamalla plasmidia BstEII:lla, minkä jälkeen sitä täytet-15 tiin dNTP:llä DNApolI:n läsnä ollessa (suurikokoinen fragmentti). DNA:ta käsiteltiin fenolilla, saostettiin se etanolilla ja pilkottiin lopuksi EcoRIillä, 230 bp:n DNA-fragmentti (A) eristettiin elektroforeettisen erotuksen jälkeen 2-%:isesta agaroosigeelistä. 180 bp:n fragmentti B 20 eristettiin vastaavalla tavalla pUC-Met-PSTI-lA:sta (tai pCH 2331:n rakentamiseksi pUC-Met-PSTI-4A:sta) pilkkomalla restriktioentsyymillä Ncol, täyttämällä dNTP:llä, seostamalla etanolilla ja lopuksi pilkkomalla EcoRI:llä. Sekä fragmentti A että fragmentti B ligatoitiin EcoRI:lla pil-25 kottuun pUC8:aan.

Kuvio 3B: Esitetään Met-PSTI-1A:lie tai -4A:lle sekvenssi a-amylaasisignaalisekvenssin (fragmentti A) ja Met-PSTI-geenin (fragmentti B) välisessä sitoutumiskohdassa. E. colissa signaalisekvenssin prosessointi tapahtuu 30 aminohappojäännöksien 31 ja 32 välistä (ks. esimerkki 1).

: Kuvio 4: Esitetään synteettinen EcoRI-Nhel-DNA- fragmentti (PENAC), joka käsittää mahdollisen Shine-Dalga-no-kohdan (asemassa 10) sekä E. coli penisilliiniasylaasin modifioidun signaalisekvenssin prosessointikohtineen ami-35 nohappojäännöksen Ala26 kohdalla.

46 97139

Kuvio 5A: Synteettinen PENAC-sekvenssi (96 bp:n

EcoRI-Nhel-fragmentti, vrt. kuvio 4) kloonattiin pBR322:een, jota oli pilkottu EcoRI:llä ja Nhel:llä ja saatiin pPENACl. pPENACl:tä pilkottiin EcoRIillä ja BamHI-5 :llä; saatava Shine-Dalgano-kohdan sekä PENAC-signaali- sekvenssin käsittävä 250 bp:n DNA-fragmentti ligatoitiin EcoRIillä ja BamHIillä pilkottuun pUCSiaan ja saatiin pCH 236.

pCH 2361:n (tai pCH 2362:n) rakentamiseksi pCH 10 236:ta pilkottiin Nhel:llä ja täytettiin dCTPillä ja dTTPillä DNApolIrn (suurikokoinen fragmentti) läsnä ollessa. DNA:ta käsiteltiin fenolilla ja saostettiin se etanolilla; suoritettiin entsymaattinen S,-nukleaasireaktio lit-teäpäätyisen kodonin tuottamiseksi Ala26:lle signaalipep-15 tidaasin pilkkomiskohtaan PENAC-signaalisekvenssissä (vrt.

kuvio 4). DNA:n saostamisen jälkeen pCH 236:ta pilkottiin edelleen HindIII:lla ja eristettiin vektori elektroforeet-tisen erotuksen jälkeen 0,8-%:isesta agaroosigeelistä.

PSTI-5P:n geeni saatiin pUC-PSTI-5P:stä pilkkomalla 20 restriktioentsyymeillä Hindi ja Hindlll; saatava 180 bp:n fragmentti eristettiin elektroforeettisen erotuksen jälkeen 2-%lista agaroosigeelistä. PSTI-3P:n geeni eristettiin vastaavalla tavalla pUC-PSTI-3P:stä. pUC-PSTI5P:stä (tai pUC-PSTI-3P:stä) eristetyn 180 bp:n HincII-Hindlll-. 25 fragmentin ligatointi pCH 236:een tuotti pCH 2361:n (tai pCH 2362:n) .

Kuvio 5B: pCH 236:ta sulatettiin Nhel:llä ja täytettiin dCTP:llä DNApolI:n (suurikokoinen fragmentti) läsnä ollessa. DNA:n saostamisen jälkeen suoritettiin entsy-30 maattinen käsittely S,-nukleaasilla litteän päädyn muodos-: tamiseksi. Vektoria sulatettiin edelleen HindIII:lla ja eristettiin se elektroforeettisen erotuksen jälkeen 0,8-%-:isesta agaroosigeelistä. Met-PSTI-4A:n geeni saatiin pUC-Met-PSTI-4A:sta pilkkomalla restriktioentsyymillä Ncol ja 35 sitä täytettiin dNTP:llä. Etanolisaostuksen jälkeen DNA:ta !l ! Hit I t Htl 97139 47 pilkottiin edelleen HindIII:lla ja eristettiin 180 bp:n fragmentti elektroforeettisen erotuksen jälkeen 2-%:isesta agaroosigeelistä.

Kuvio 6: PSTI-4A-minifuusiotuotteen eristys affi-5 niteettikromatografiällä käyttämällä immobilisoitua kymo- trypsiiniä sisältävää kolonnia (7x9 cm) ja 4 °C:n lämpötilaa. Kerättiin tilavuudeltaan 11 ml:n suuruisia fraktioita. Abskissa-akselilla ovat koeputkien järjestysnumerot. Ordinaatta-akselille on merkitty vastaavat ekstink-10 tiot 280 nm:n aallonpituudella. Kolonnia eluoitiin vedellä (fraktioon 40 asti) sekä sitten 0,2M asetaattipuskurilla pH 5,0 (fraktioon 70 asti) ja tislatulla vedellä (fraktioon 85 asti). Lopullinen desorptio aikaansaatiin 0,2M etikkahappo/suolahapolla pH 2,0. Inhibiittori eluoitui 15 fraktioissa 92 - 108.

Kuvio 7: PSTI-4A-minifuusiotuotteen preparatiivinen HPLC-ajo käyttäen kymotrypsiiniaffiniteettikolonnieluaat-teja (fraktiot 92 - 108) ja RP-318-kolonnia (250 x 4,6 mm) (Biorad). Eluointi suoritettiin käyttäen lineaarista gra-20 dienttia systeemissä 0,15 % trifluorietikkahappoa ja 60 % asetonitriiliä, joka sisälsi 0,15 % trifluorietikkahappoa (2 tuntia); virtausnopeus 1 ml/min, paine 150 baaria; fraktioiden määritys 220 nm:n aallonpituudella. Ordinaat-tana on ilmoitettu ekstinktio 220 nm:n aallonpituudella, . 25 abskissana fraktion järjestysnumero. Inhibiittori eluoitui fraktioissa 44 - 50.

Kuvio 8: PSTI-4A-minifuusiotuotteen analyyttinen HPLC-ajo käyttäen esikolonnilla varustettua Ultra-pak TSK SP-5 PW -kolonnia (75 x 7,5 mm LKB).

30 Olosuhteet

Liuotin A: 0,15 trifluorietikkahappoa ja 0, IM Na2S04, 10 % metanolia, pH 2,7

Liuotin B: 0,15 % trifluorietikkahappoa ja 35 0,6M Na2S04, 10 % metanolia, pH 2,7 97139 48

Gradientti: 0-5 min 5 % B:tä 5-30 min 15 - 100 % B:tä 30 - 33 min 100 - 15 % B:tä 33 - 40 min 15 % B:tä 5 Virtausnopeus: 1,5 ml/min, paine 20 baaria

Detektio: 215 nm

Kuvio 9: PSTI-5P:n loppupuhdistus preparatiivisella HPLC:llä käyttäen RP-318-kolonnia (250 x 4,6 mm, Biorad). Eluointi käyttäen lineaarista gradienttia systeemissä 0,15 10 % trifluorietikkahappoa ja 0,15 % trifluorietikkahappoa, 60 % asetonitriiliä kahdessa tunnissa. Virtausnopeus: 1 ml/min, paine 150 baaria; detektio 280 nm. Inhibiittori eluoitui fraktioissa 20 - 27.

Kuvio 10: PSTI-5P:n analyyttinen HPLC-ajo käyttäen 15 Bio-Sil® TSK CM-3-SW -kolonnia (75 x 7,5 mm) (Biorad).

Olosuhteet

Liuotin A: 0,15 % trifluorietikkahappoa ja 0, IM Na2S04, 10 % metanolia 20 Liuotin B: 0,15 % trifluorietikkahappoa ja 0,6M Na2S04, 10 % metanolia

Gradientti: 0-5 min 15 % B:tä 5-30 min 15 - 100 % B:tä 25 30 - 32 min 100 - 15 % B:tä 32 - 40 min 15 % B:tä

Virtausnopeus: 1,5 ml/min, paine 22 baaria

Detektio: 215 nm *

Claims (5)

97139

1. Menetelmä peptidin valmistamiseksi, joka oleellisesti käsittää ihmisen haiman erittämän trypsiini-inhi-5 biittorin (PSTI:n) sekvenssin variantin ryhmästä PSTI 1 Thr-17 Leu-18 Ile-19 Tyr-20 Asn-21 Asp-29 PSTI 2 Thr-17 Leu-18 Ile-19 Tyr-20 Asp-21 Asn-29 PSTI 4 Thr-17 Leu-18 Glu-19 Tyr-20 Arg-21 Asp-29

10 PSTI 5 Thr-17 Val-18 Glu-19 Tyr-20 Arg-21 Asp-29 PSTI 6 Thr-17 Leu-18 Glu-19 Tyr-20 Asn-21 Asp-29 PSTI 7 Thr-17 Leu-18 Ile-19 Tyr-20 Arg-21 Asp-29 PSTI 8 Thr-17 Val-18 Glu-19 Leu-20 Asn-21 Asp-29 PSTI 9 Thr-17 Val-18 Glu-19 Leu-20 Arg-21 Asp-29

15 PSTI 11 Pro-17 Leu-18 Glu-19 Tyr-20 Arg-21 Asp-29 PSTI 12 Pro-17 Val-18 Glu-19 Tyr-20 Arg-21 Asp-29 PSTI 13 Thr-17 Ile-18 Glu-19 Tyr-20 Asn-21 Asp-29 PSTI 17 Thr-17 Val-18 Ile-19 Tyr-20 Asn-21 Asp-29 PSTI 18 Thr-17 Ile-18 Ile-19 Tyr-20 Asn-21 Asp-29

20 PSTI 19 Thr-17 Val-18 Ile-19 Tyr-20 Asp-21 Asn-29 PSTI 20 Thr-17 Ile-18 Ile-19 Tyr-20 Asp-21 Asn-29 PSTI 21 Thr-17 Ile-18 Glu-19 Tyr-20 Arg-21 Asp-29 jolloin variantti käsittää edelleen asemassa 32 ryhmän 25 Pro, Ser tai Ala, tunnettu siitä, että a) isäntämikro-organismi transformoidaan ilmaisu-vektorilla, joka sisältää DNA-sekvenssin, joka koodaa mainittua peptidiä; b) peptidi otetaan talteen viljelmästä; ja 30 c) peptidi puhdistetaan.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan peptidi, joka lisäksi käsittää ryhmää Asp asemassa 1 edeltävän aminohapon tai peptidisekvenssin, edellyttäen, että sen biologi-35 nen aktiivisuus säilyy. 97139

3. DNA, tunnettu siitä, että se koodaa jossakin patenttivaatimuksista 1-2 mainittua peptidiä.

4. Ilmaisuvektori, tunnettu siitä, että se käsittää patenttivaatimuksen 3 mukaisen DNA-sekvenssin.

5. Bakteeri-isäntäorganismi, tunnettu siitä, että se on transformoitu patenttivaatimuksen 4 mukaisella ilmaisuvektorilla. • < « 97139