JPH09308489A - フィトラカ・インシュラリス・ナカイ由来の抗ウィルス性タンパク質の新規な遺伝子およびこれを発現する組換え微生物 - Google Patents
フィトラカ・インシュラリス・ナカイ由来の抗ウィルス性タンパク質の新規な遺伝子およびこれを発現する組換え微生物Info
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- JPH09308489A JPH09308489A JP8320145A JP32014596A JPH09308489A JP H09308489 A JPH09308489 A JP H09308489A JP 8320145 A JP8320145 A JP 8320145A JP 32014596 A JP32014596 A JP 32014596A JP H09308489 A JPH09308489 A JP H09308489A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 フィトラカ・インシュラリス・ナカイ由来の
抗ウィルス性タンパク質の新規な遺伝子およびこれを発
現する組換え微生物の提供 【解決手段】 韓国産フィトラカ・インシュラリス・ナ
カイのゲノムＤＮＡから分離した抗ウィルス性タンパク
質をコードしているｇＰＩＰ２とｇＰＩＰ５０遺伝子、
それらから翻訳されるアミノ酸配列を有するｇＰＩＰ２
とｇＰＩＰ５０タンパク質、前記各抗ウィルス性タンパ
ク質の遺伝子を含む発現ベクターおよびそれで形質転換
された組換え微生物から抗ウィルス性タンパク質を製造
する方法。
抗ウィルス性タンパク質の新規な遺伝子およびこれを発
現する組換え微生物の提供 【解決手段】 韓国産フィトラカ・インシュラリス・ナ
カイのゲノムＤＮＡから分離した抗ウィルス性タンパク
質をコードしているｇＰＩＰ２とｇＰＩＰ５０遺伝子、
それらから翻訳されるアミノ酸配列を有するｇＰＩＰ２
とｇＰＩＰ５０タンパク質、前記各抗ウィルス性タンパ
ク質の遺伝子を含む発現ベクターおよびそれで形質転換
された組換え微生物から抗ウィルス性タンパク質を製造
する方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はフィトラカ・インシ
ュラリス・ナカイの抗ウィルス性タンパク質をコードす
る新規な遺伝子およびこれを発現する組換え微生物に関
し、より詳しくは、本発明は韓国産フィトラカ・インシ
ュラリス・ナカイのゲノムＤＮＡから分離した抗ウィル
ス性タンパク質をコードする遺伝子とこれから翻訳され
るアミノ酸配列を有する抗ウィルス性タンパク質、前記
抗ウィルス性タンパク質をコードする遺伝子を含む発現
ベクター、および該ベクターで形質転換された組換え微
生物から抗ウィルス性タンパク質を製造する方法に関す
る。
ュラリス・ナカイの抗ウィルス性タンパク質をコードす
る新規な遺伝子およびこれを発現する組換え微生物に関
し、より詳しくは、本発明は韓国産フィトラカ・インシ
ュラリス・ナカイのゲノムＤＮＡから分離した抗ウィル
ス性タンパク質をコードする遺伝子とこれから翻訳され
るアミノ酸配列を有する抗ウィルス性タンパク質、前記
抗ウィルス性タンパク質をコードする遺伝子を含む発現
ベクター、および該ベクターで形質転換された組換え微
生物から抗ウィルス性タンパク質を製造する方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】植物は移動できないので外部の病原性有
機体の侵入を避けることができない。このため、植物は
病原体の侵入に直接又は間接的に反応する防御メカニズ
ムを有しており、ほとんどの植物は菌類、バクテリア、
ウィルスのような感染性病原菌に対し、自身を保護する
防御メカニズムを現す。
機体の侵入を避けることができない。このため、植物は
病原体の侵入に直接又は間接的に反応する防御メカニズ
ムを有しており、ほとんどの植物は菌類、バクテリア、
ウィルスのような感染性病原菌に対し、自身を保護する
防御メカニズムを現す。
【０００３】この関係において、多くの種の植物から由
来した抗ウィルス性タンパク質に対する研究が行なわれ
ているが、これにはアメリカヤマゴボウ抗ウィルス性タ
ンパク質（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ａｎｔｉｖｉｒａｌ
ｐｒｏｔｅｉｎ：ＰＡＰ）（参照：Ｉｒｖｉｎ，Ｊ．
Ｄ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，
１６９：５２２〜５２８（１９７５）），リシヌス・コ
ミューニス（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）から
分離したリシン（Ｒｉｃｉｎ）（参照：Ｈａｌｌｉｎ
ｇ，Ｋ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
Ｒｅｓ．，１３：８０１９〜８０３３（１９８
５）），白粉花から由来したミラビリス抗ウィルス性タ
ンパク質（Ｍｉｒａｂｉｌｉｓ ａｎｔｉｖｉｒａｌ
ｐｒｏｔｅｉｎ：ＭＡＰ）（参照：Ｋａｔａｏｋａ，
Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６
６：８４２６〜８４３０（１９９１））およびトリコサ
ンテス・キリロイ（Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｅｓ ｋｉ
ｒｉｌｏｗｉｉ）にあるα−トリコサンチン（α−ｔｒ
ｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ）（参照：Ｚｈａｎｇ，Ｘ．ｅ
ｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：４７７〜４７８
（１９８６））などが挙げられる。
来した抗ウィルス性タンパク質に対する研究が行なわれ
ているが、これにはアメリカヤマゴボウ抗ウィルス性タ
ンパク質（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ａｎｔｉｖｉｒａｌ
ｐｒｏｔｅｉｎ：ＰＡＰ）（参照：Ｉｒｖｉｎ，Ｊ．
Ｄ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，
１６９：５２２〜５２８（１９７５）），リシヌス・コ
ミューニス（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）から
分離したリシン（Ｒｉｃｉｎ）（参照：Ｈａｌｌｉｎ
ｇ，Ｋ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
Ｒｅｓ．，１３：８０１９〜８０３３（１９８
５）），白粉花から由来したミラビリス抗ウィルス性タ
ンパク質（Ｍｉｒａｂｉｌｉｓ ａｎｔｉｖｉｒａｌ
ｐｒｏｔｅｉｎ：ＭＡＰ）（参照：Ｋａｔａｏｋａ，
Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６
６：８４２６〜８４３０（１９９１））およびトリコサ
ンテス・キリロイ（Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｅｓ ｋｉ
ｒｉｌｏｗｉｉ）にあるα−トリコサンチン（α−ｔｒ
ｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ）（参照：Ｚｈａｎｇ，Ｘ．ｅ
ｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：４７７〜４７８
（１９８６））などが挙げられる。
【０００４】これらの抗ウィルス性タンパク質はリボソ
ーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ：ｒｉｂｏｓｏｍｅ
ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）の一種で
あり、ＲＮＡ Ｎ−グリコシダーゼ活性（Ｎ−ｇｌｙｃ
ｏｓｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ）によりｒＲＮＡの
特定部位のアデニンを除去させることにより、リボソー
ソムを損傷させタンパク質合成を阻害することと知られ
ている（参照：Ｓｔｉｒｐｅ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉ
ｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：４０５〜４１２（１
９９２））。かかる活性を有するＲＩＰの影響を受けな
いでＲＩＰを合成する植物体が安全に存在できるメカニ
ズムは、自己ＲＩＰに対して相対的に抵抗性を有するリ
ボソームを生成するか、またはＲＩＰが活性化される前
にシグナルペプチドにより小胞体とゴルジ体を経て細胞
外に移動するためであると推測される。
ーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ：ｒｉｂｏｓｏｍｅ
ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）の一種で
あり、ＲＮＡ Ｎ−グリコシダーゼ活性（Ｎ−ｇｌｙｃ
ｏｓｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ）によりｒＲＮＡの
特定部位のアデニンを除去させることにより、リボソー
ソムを損傷させタンパク質合成を阻害することと知られ
ている（参照：Ｓｔｉｒｐｅ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉ
ｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：４０５〜４１２（１
９９２））。かかる活性を有するＲＩＰの影響を受けな
いでＲＩＰを合成する植物体が安全に存在できるメカニ
ズムは、自己ＲＩＰに対して相対的に抵抗性を有するリ
ボソームを生成するか、またはＲＩＰが活性化される前
にシグナルペプチドにより小胞体とゴルジ体を経て細胞
外に移動するためであると推測される。
【０００５】ＲＩＰがウィルスに対する抵抗性を動物と
植物に付与するという事実は広く知られているが、その
作用メカニズムは細胞膜の外部に存在するＲＩＰが、侵
入するウィルス粒子と共に細胞内部に入り感染された細
胞を死滅させることにより、ウィルス感染および拡散を
抑制することと推測されるばかりで（参照：Ｆｅｒｎａ
ｎｄｅｚ−Ｐｕｅｎｔｅｓ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌ
ｌ，２０：７６６〜７７５（１９８０））、その正確な
メカニズムはまだ明らかでなくてこれに対する研究が継
続されている実情である。
植物に付与するという事実は広く知られているが、その
作用メカニズムは細胞膜の外部に存在するＲＩＰが、侵
入するウィルス粒子と共に細胞内部に入り感染された細
胞を死滅させることにより、ウィルス感染および拡散を
抑制することと推測されるばかりで（参照：Ｆｅｒｎａ
ｎｄｅｚ−Ｐｕｅｎｔｅｓ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌ
ｌ，２０：７６６〜７７５（１９８０））、その正確な
メカニズムはまだ明らかでなくてこれに対する研究が継
続されている実情である。
【０００６】一方、前記ＲＩＰが有しているウィルス抵
抗性を用い、遺伝子工学技術によるウィルス抵抗性植物
の製造やＲＩＰのＡＩＤＳおよび癌治療剤としての利用
可能性が模索されており（参照：Ｌｏｄｇｅ，Ｊ．Ｋ．
ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．，ＵＳＡ，９０：７０８９〜７０９３（１９９
３）；Ｒａｍａｒｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｓ．Ｄ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘ
ｉｃｏｌ．，３２：５７９〜６２１（１９９２）；Ｔａ
ｙｌｏｒ，Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，
５：８２７〜８３５（１９９４））、特にウィルス感染
による作物の被害が甚だしいにもかかわらず、注目すべ
き特効薬がなくてお手上げである現実に鑑みると、ウィ
ルス抵抗性が付与された形質転換植物体の製造は非常に
重要な意義を有しているとみられる。
抗性を用い、遺伝子工学技術によるウィルス抵抗性植物
の製造やＲＩＰのＡＩＤＳおよび癌治療剤としての利用
可能性が模索されており（参照：Ｌｏｄｇｅ，Ｊ．Ｋ．
ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．，ＵＳＡ，９０：７０８９〜７０９３（１９９
３）；Ｒａｍａｒｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｓ．Ｄ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘ
ｉｃｏｌ．，３２：５７９〜６２１（１９９２）；Ｔａ
ｙｌｏｒ，Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，
５：８２７〜８３５（１９９４））、特にウィルス感染
による作物の被害が甚だしいにもかかわらず、注目すべ
き特効薬がなくてお手上げである現実に鑑みると、ウィ
ルス抵抗性が付与された形質転換植物体の製造は非常に
重要な意義を有しているとみられる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】これに、本発明者らは
フィトラカ・インシュラリス・ナカイ（Ｐｈｙｔｏｌａ
ｃｃａ ｉｎｓｕｌａｒｉｓ Ｎａｋａｉ）、アメリカ
ヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ａｍｅｒｉｃａｎ
ａ Ｌ．）、ふくべ科植物であるかぼちゃ（Ｃｕｃｕｒ
ｂｉｔａ ｍｏｓｃｈａｔａ）など各種植物の抗ウィル
ス性タンパク質に関し、深度ある研究を進行していると
ころ、新規な抗ウィルス性タンパク質遺伝子を分離し、
これらを含む発現ベクターで形質転換させた抗ウィルス
性形質転換植物体を製造したことがある（参照：ＵＳＰ
５，３４８，８６５；日本国特許公報第２５２２１５１
号；およびＡｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｐａｔｅｎｔ６６３
０３１）。
フィトラカ・インシュラリス・ナカイ（Ｐｈｙｔｏｌａ
ｃｃａ ｉｎｓｕｌａｒｉｓ Ｎａｋａｉ）、アメリカ
ヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ａｍｅｒｉｃａｎ
ａ Ｌ．）、ふくべ科植物であるかぼちゃ（Ｃｕｃｕｒ
ｂｉｔａ ｍｏｓｃｈａｔａ）など各種植物の抗ウィル
ス性タンパク質に関し、深度ある研究を進行していると
ころ、新規な抗ウィルス性タンパク質遺伝子を分離し、
これらを含む発現ベクターで形質転換させた抗ウィルス
性形質転換植物体を製造したことがある（参照：ＵＳＰ
５，３４８，８６５；日本国特許公報第２５２２１５１
号；およびＡｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｐａｔｅｎｔ６６３
０３１）。
【０００８】さらに、本発明者らは公知のフィトラカ・
インシュラリス・ナカイ抗ウィルス性タンパク質（ＰＩ
Ｐ）の遺伝子とは異なる抗ウィルス性タンパク質の遺伝
子を韓国産フィトラカ・インシュラリス・ナカイのゲノ
ムＤＮＡから分離し、これを組換え微生物から発現させ
た後、収得した組換えタンパク質がＲＩＰの活性である
タンパク質合成阻害能を有しており、新規な抗ウィルス
性タンパク質であることを発見し、本発明を完成に至っ
た。
インシュラリス・ナカイ抗ウィルス性タンパク質（ＰＩ
Ｐ）の遺伝子とは異なる抗ウィルス性タンパク質の遺伝
子を韓国産フィトラカ・インシュラリス・ナカイのゲノ
ムＤＮＡから分離し、これを組換え微生物から発現させ
た後、収得した組換えタンパク質がＲＩＰの活性である
タンパク質合成阻害能を有しており、新規な抗ウィルス
性タンパク質であることを発見し、本発明を完成に至っ
た。
【０００９】従って、本発明の目的は、韓国産フィトラ
カ・インシュラリス・ナカイ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ
ｉｎｓｕｌａｒｉｓ Ｎａｋａｉ）抗ウィルス性タンパ
ク質の遺伝子およびそれから翻訳されるアミノ酸配列を
有する抗ウィルス性タンパク質を提供することにある。
カ・インシュラリス・ナカイ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ
ｉｎｓｕｌａｒｉｓ Ｎａｋａｉ）抗ウィルス性タンパ
ク質の遺伝子およびそれから翻訳されるアミノ酸配列を
有する抗ウィルス性タンパク質を提供することにある。
【００１０】さらに、本発明の目的は、前記抗ウィルス
性タンパク質の遺伝子を含む発現ベクターおよびそれで
形質転換された微生物を提供することにある。
性タンパク質の遺伝子を含む発現ベクターおよびそれで
形質転換された微生物を提供することにある。
【００１１】さらに、本発明の他の目的は、前記形質転
換された微生物から組換え抗ウィルス性タンパク質の製
造方法を提供することにある。
換された微生物から組換え抗ウィルス性タンパク質の製
造方法を提供することにある。
【００１２】以下、本発明をより具体的に説明する。
【課題を解決するための手段】フィトラカ・インシュラ
リス・ナカイ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ｉｎｓｕｌａｒ
ｉｓ Ｎａｋａｉ）葉から分離したゲノムＤＮＡを鋳型
とし、アミノ末端プライマー５’−ＣＣＡＡＧＣＴＴＧ
ＴＧＡＡＴＡＣＣＡＴＣＡＴＣＴＡＣ−３’（配列番号
５）およびカルボキシ末端プライマー５’−ＧＧＡＡＧ
ＣＴＴＴＧＡＴＣＡＧＡＡＡＣＣＣＴＣＡＡＡ−３’
（配列番号６）を用いてポリメラーゼ鎖反応（ｐｏｌｙ
ｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣ
Ｒ）させた。
リス・ナカイ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ｉｎｓｕｌａｒ
ｉｓ Ｎａｋａｉ）葉から分離したゲノムＤＮＡを鋳型
とし、アミノ末端プライマー５’−ＣＣＡＡＧＣＴＴＧ
ＴＧＡＡＴＡＣＣＡＴＣＡＴＣＴＡＣ−３’（配列番号
５）およびカルボキシ末端プライマー５’−ＧＧＡＡＧ
ＣＴＴＴＧＡＴＣＡＧＡＡＡＣＣＣＴＣＡＡＡ−３’
（配列番号６）を用いてポリメラーゼ鎖反応（ｐｏｌｙ
ｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣ
Ｒ）させた。
【００１３】前記において増幅されたほぼ１ｋｂのＤＮ
Ａ切片を制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断してｐＵＣ１９ベ
クターにクローニングした後、制限酵素マップを作成し
その塩基配列を決めた。その結果、増幅された遺伝子の
成熟タンパク質（ｍａｔｕｒｅｐｒｏｔｅｉｎ）のコー
ディング部分は翻訳開始コドンを含む８８２個の塩基で
構成されていたが、この遺伝子を便宜上‘ｇＰＩＰ２遺
伝子’と命名した。さらに、ｇＰＩＰ２遺伝子のオープ
ンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ
ｆｒａｍｅ）は、開始アミノ酸メチオニンを含む２９２
個のアミノ酸からなる、分子量がほぼ３２．８ｋＤａで
あるタンパク質をコードしていることが確認されたが、
このタンパク質を便宜上‘ｇＰＩＰ２タンパク質’と命
名した。
Ａ切片を制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断してｐＵＣ１９ベ
クターにクローニングした後、制限酵素マップを作成し
その塩基配列を決めた。その結果、増幅された遺伝子の
成熟タンパク質（ｍａｔｕｒｅｐｒｏｔｅｉｎ）のコー
ディング部分は翻訳開始コドンを含む８８２個の塩基で
構成されていたが、この遺伝子を便宜上‘ｇＰＩＰ２遺
伝子’と命名した。さらに、ｇＰＩＰ２遺伝子のオープ
ンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ
ｆｒａｍｅ）は、開始アミノ酸メチオニンを含む２９２
個のアミノ酸からなる、分子量がほぼ３２．８ｋＤａで
あるタンパク質をコードしていることが確認されたが、
このタンパク質を便宜上‘ｇＰＩＰ２タンパク質’と命
名した。
【００１４】前記ｇＰＩＰ２遺伝子から翻訳されるアミ
ノ酸配列を、公知の抗ウィルス性タンパク質をコード化
している遺伝子であるｃＰＡＰおよびｃＰＩＰ遺伝子か
ら翻訳されるアミノ酸配列（参照：Ｌｉｎ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ，１７（４）：６０９〜６１４（１９９１）；ＵＳＰ
５，３４８，８６５）と比較した結果、ｃＰＡＰ遺伝子
から翻訳されるアミノ酸配列とは９３．１％，ｃＰＩＰ
遺伝子から翻訳されるアミノ酸配列とは８２．５％の高
い相同性が現れた。従って、ｇＰＩＰ２タンパク質はｃ
ＰＡＰおよびｃＰＩＰ遺伝子から翻訳される抗ウィルス
性タンパク質と非常に類似した抗ウィルス活性を有して
いるだろうと予測でき、ｇＰＩＰ２遺伝子の塩基配列を
公知の各種の他の抗ウィルス性タンパク質の遺伝子と比
較した結果、ｇＰＩＰ２遺伝子は新規であることが明ら
かとなった。
ノ酸配列を、公知の抗ウィルス性タンパク質をコード化
している遺伝子であるｃＰＡＰおよびｃＰＩＰ遺伝子か
ら翻訳されるアミノ酸配列（参照：Ｌｉｎ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ，１７（４）：６０９〜６１４（１９９１）；ＵＳＰ
５，３４８，８６５）と比較した結果、ｃＰＡＰ遺伝子
から翻訳されるアミノ酸配列とは９３．１％，ｃＰＩＰ
遺伝子から翻訳されるアミノ酸配列とは８２．５％の高
い相同性が現れた。従って、ｇＰＩＰ２タンパク質はｃ
ＰＡＰおよびｃＰＩＰ遺伝子から翻訳される抗ウィルス
性タンパク質と非常に類似した抗ウィルス活性を有して
いるだろうと予測でき、ｇＰＩＰ２遺伝子の塩基配列を
公知の各種の他の抗ウィルス性タンパク質の遺伝子と比
較した結果、ｇＰＩＰ２遺伝子は新規であることが明ら
かとなった。
【００１５】一方、韓国産フィトラカ・インシュラリス
・ナカイ葉からゲノムＤＮＡを分離し（参照：Ｊ．Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ，Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ，１９８９）、ゲノムジーンバンクを製造し
た後、［α−32Ｐ］ｄＡＴＰで標識されたｃＰＩＰ遺伝
子をＤＮＡプローブとして用いて陽性反応を現す９個の
プラークを選別した。これらプラークからファージＤＮ
Ａを分離し、制限酵素ＳａｃＩとＸｈｏＩでそれぞれ切
断した後、前記と同一のＤＮＡプローブを用いてサザン
ハイブリダイゼーション（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｈｙｂｒ
ｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を行った。その結果、ほぼ５．０
ｋｂのＸｈｏＩ断片およびほぼ４．８ｋｂと３．５ｋｂ
の二つのＳａｃＩ切片において最も明瞭にハイブリダイ
ゼーションが確認される５０番クローンを選択した。
・ナカイ葉からゲノムＤＮＡを分離し（参照：Ｊ．Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ，Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ，１９８９）、ゲノムジーンバンクを製造し
た後、［α−32Ｐ］ｄＡＴＰで標識されたｃＰＩＰ遺伝
子をＤＮＡプローブとして用いて陽性反応を現す９個の
プラークを選別した。これらプラークからファージＤＮ
Ａを分離し、制限酵素ＳａｃＩとＸｈｏＩでそれぞれ切
断した後、前記と同一のＤＮＡプローブを用いてサザン
ハイブリダイゼーション（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｈｙｂｒ
ｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を行った。その結果、ほぼ５．０
ｋｂのＸｈｏＩ断片およびほぼ４．８ｋｂと３．５ｋｂ
の二つのＳａｃＩ切片において最も明瞭にハイブリダイ
ゼーションが確認される５０番クローンを選択した。
【００１６】前記において選択した５０番クローンの
５．０ｋｂ ＸｈｏＩ断片を各種の制限酵素で切断して
再度サザンハイブリダイゼーションを行った結果、Ｂａ
ｍＨＩで切断された３．４ｋｂ ＤＮＡ断片から一つの
陽性反応が現れた。この３．４ｋｂ ＢａｍＨＩ断片を
ｐＵＣ１９ベクターにサブクローニングし、制限酵素マ
ップを作成し、その塩基配列を決めた。その結果、遺伝
子の成熟タンパク質コーディング部分は翻訳開始コドン
を含む９５１個の塩基で構成されていたが、この遺伝子
を便宜上‘ｇＰＩＰ５０遺伝子’と命名した。さらに、
ｇＰＩＰ５０遺伝子のオープリーディングフレームは開
始アミノ酸メチオニンを含む３１５個のアミノ酸からな
る、分子量がほぼ３５．７ｋＤａであるタンパク質をコ
ードしていることが確認されたが、このタンパク質を便
宜上‘ｇＰＩＰ５０タンパク質’と命名した。
５．０ｋｂ ＸｈｏＩ断片を各種の制限酵素で切断して
再度サザンハイブリダイゼーションを行った結果、Ｂａ
ｍＨＩで切断された３．４ｋｂ ＤＮＡ断片から一つの
陽性反応が現れた。この３．４ｋｂ ＢａｍＨＩ断片を
ｐＵＣ１９ベクターにサブクローニングし、制限酵素マ
ップを作成し、その塩基配列を決めた。その結果、遺伝
子の成熟タンパク質コーディング部分は翻訳開始コドン
を含む９５１個の塩基で構成されていたが、この遺伝子
を便宜上‘ｇＰＩＰ５０遺伝子’と命名した。さらに、
ｇＰＩＰ５０遺伝子のオープリーディングフレームは開
始アミノ酸メチオニンを含む３１５個のアミノ酸からな
る、分子量がほぼ３５．７ｋＤａであるタンパク質をコ
ードしていることが確認されたが、このタンパク質を便
宜上‘ｇＰＩＰ５０タンパク質’と命名した。
【００１７】前記ｇＰＩＰ５０遺伝子から翻訳されるア
ミノ酸配列を公知の抗ウィルス性タンパク質をコードし
ている遺伝子であるｃＰＩＰおよびα−ＰＡＰ遺伝子か
ら翻訳されるアミノ酸配列（参照：ＵＳＰ５，３４８，
８６５；Ｊ．Ｋａｔａｏｋａｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ
Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ．，２０：８７９〜８８６（１９９
２））と比較した結果、ｃＰＩＰ遺伝子から翻訳される
アミノ酸配列とは６９．４％，α−ＰＡＰ遺伝子から翻
訳されるアミノ酸配列とは８４％の高い相同性が現れ
た。従って、ｇＰＩＰ５０タンパク質は抗ウィルス活性
を有しているだろうと予測でき、ｇＰＩＰ５０遺伝子の
塩基配列を公知の各種の他の抗ウィルス性タンパク質の
遺伝子と比較した結果、ｇＰＩＰ５０遺伝子は新規であ
ることが明らかとなった。
ミノ酸配列を公知の抗ウィルス性タンパク質をコードし
ている遺伝子であるｃＰＩＰおよびα−ＰＡＰ遺伝子か
ら翻訳されるアミノ酸配列（参照：ＵＳＰ５，３４８，
８６５；Ｊ．Ｋａｔａｏｋａｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ
Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ．，２０：８７９〜８８６（１９９
２））と比較した結果、ｃＰＩＰ遺伝子から翻訳される
アミノ酸配列とは６９．４％，α−ＰＡＰ遺伝子から翻
訳されるアミノ酸配列とは８４％の高い相同性が現れ
た。従って、ｇＰＩＰ５０タンパク質は抗ウィルス活性
を有しているだろうと予測でき、ｇＰＩＰ５０遺伝子の
塩基配列を公知の各種の他の抗ウィルス性タンパク質の
遺伝子と比較した結果、ｇＰＩＰ５０遺伝子は新規であ
ることが明らかとなった。
【００１８】前記において分離したｇＰＩＰ２またはｇ
ＰＩＰ５０遺伝子を、抗−ＦＬＡＧモノクローナル抗体
の結合とエンテロキナーゼ切断に関与するオクタペプチ
ドのＦＬＡＧ配列およびコーディング配列の挿入に関与
する多重クローニング部位のマーカーを含むベクターに
挿入して組換え発現ベクターを製造し、これを形質転換
可能な大腸菌に導入した後、その形質転換体を培養し組
換えｇＰＩＰ２またはｇＰＩＰ５０タンパク質の発現を
誘導した。培養された形質転換体を超音波破砕して組換
えｇＰＩＰ２またはｇＰＩＰ５０タンパク質の発現を確
認した結果、前記タンパク質は形質転換体から成功的に
生産され、封入体を形成することがわかった。
ＰＩＰ５０遺伝子を、抗−ＦＬＡＧモノクローナル抗体
の結合とエンテロキナーゼ切断に関与するオクタペプチ
ドのＦＬＡＧ配列およびコーディング配列の挿入に関与
する多重クローニング部位のマーカーを含むベクターに
挿入して組換え発現ベクターを製造し、これを形質転換
可能な大腸菌に導入した後、その形質転換体を培養し組
換えｇＰＩＰ２またはｇＰＩＰ５０タンパク質の発現を
誘導した。培養された形質転換体を超音波破砕して組換
えｇＰＩＰ２またはｇＰＩＰ５０タンパク質の発現を確
認した結果、前記タンパク質は形質転換体から成功的に
生産され、封入体を形成することがわかった。
【００１９】前記において予測した組換えｇＰＩＰ２ま
たはｇＰＩＰ５０タンパク質の抗ウィルス活性を検定す
るため、一般の抗ウィルス性タンパク質と同様にタンパ
ク質合成阻害能があるかを試みた。すなわち、前記形質
転換体の封入体から収得した総タンパク質から組換えｇ
ＰＩＰ２またはｇＰＩＰ５０タンパク質を単離し、この
組換えタンパク質を無細胞タンパク質合成系に添加した
場合（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ａ
ｓｓａｙ）、組換えｇＰＩＰ２またはｇＰＩＰ５０タン
パク質はタンパク質合成を阻害することを確認した。
たはｇＰＩＰ５０タンパク質の抗ウィルス活性を検定す
るため、一般の抗ウィルス性タンパク質と同様にタンパ
ク質合成阻害能があるかを試みた。すなわち、前記形質
転換体の封入体から収得した総タンパク質から組換えｇ
ＰＩＰ２またはｇＰＩＰ５０タンパク質を単離し、この
組換えタンパク質を無細胞タンパク質合成系に添加した
場合（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ａ
ｓｓａｙ）、組換えｇＰＩＰ２またはｇＰＩＰ５０タン
パク質はタンパク質合成を阻害することを確認した。
【００２０】従って、本発明のフィトラカ・インシュラ
リス・ナカイから分離した抗ウィルス性タンパク質をコ
ードしているｇＰＩＰ２またはｇＰＩＰ５０遺伝子は、
植物形質転換を通じてウィルス抵抗性を帯びた有用植物
体の製造に用いられる。さらに、ｇＰＩＰ２またはｇＰ
ＩＰ５０遺伝子を含む発現ベクターで形質転換された微
生物から量産された組換えｇＰＩＰ２またはｇＰＩＰ５
０タンパク質は、植物体のウィルス防除剤の有効成分と
して用いられるか、ＡＩＤＳおよび癌治療に用いられる
免疫結合体などの製造に用いられる。
リス・ナカイから分離した抗ウィルス性タンパク質をコ
ードしているｇＰＩＰ２またはｇＰＩＰ５０遺伝子は、
植物形質転換を通じてウィルス抵抗性を帯びた有用植物
体の製造に用いられる。さらに、ｇＰＩＰ２またはｇＰ
ＩＰ５０遺伝子を含む発現ベクターで形質転換された微
生物から量産された組換えｇＰＩＰ２またはｇＰＩＰ５
０タンパク質は、植物体のウィルス防除剤の有効成分と
して用いられるか、ＡＩＤＳおよび癌治療に用いられる
免疫結合体などの製造に用いられる。
【００２１】本発明のアミノ酸配列において、‘機能的
に同等なタンパク質’とは、ｇＰＩＰ２またはｇＰＩＰ
５０タンパク質のアミノ酸配列の中で、Ｇｌｙ，Ａｌ
ａ；Ｖａｌ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ；Ａｓｐ，Ｇｌｕ；Ａｓ
ｎ，Ｇｌｎ；Ｓｅｒ，Ｔｈｒ；Ｌｙｓ，Ａｒｇ；および
Ｐｈｅ，Ｔｙｒと同様の組合せで置換されたすべてのタ
ンパク質を意味する。さらに、本発明の塩基配列におい
て、‘機能的等価物’とは、ｇＰＩＰ２またはｇＰＩＰ
５０遺伝子の塩基配列の中で前記組合せのアミノ酸を提
供できる塩基配列を有するすべての遺伝子を意味する。
に同等なタンパク質’とは、ｇＰＩＰ２またはｇＰＩＰ
５０タンパク質のアミノ酸配列の中で、Ｇｌｙ，Ａｌ
ａ；Ｖａｌ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ；Ａｓｐ，Ｇｌｕ；Ａｓ
ｎ，Ｇｌｎ；Ｓｅｒ，Ｔｈｒ；Ｌｙｓ，Ａｒｇ；および
Ｐｈｅ，Ｔｙｒと同様の組合せで置換されたすべてのタ
ンパク質を意味する。さらに、本発明の塩基配列におい
て、‘機能的等価物’とは、ｇＰＩＰ２またはｇＰＩＰ
５０遺伝子の塩基配列の中で前記組合せのアミノ酸を提
供できる塩基配列を有するすべての遺伝子を意味する。
【００２２】
【実施例】以下、実施例によって本発明をより詳しく説
明する。これらの実施例は、本発明の実施例を限定する
ものではない。 実施例１：フィトラカ・インシュラリス・ナカイからｇ
ＰＩＰ２遺伝子分離およびそれを含む発現ベクターの製
造 韓国産フィトラカ・インシュラリス・ナカイ（Ｐｈｙｔ
ｏｌａｃｃａ ｉｎｓｕｌａｒｉｓ Ｎａｋａｉ）の葉
からゲノムＤＮＡを分離し、それを鋳型としてＰＣＲ反
応させることによりｇＰＩＰ２遺伝子を増幅した後、分
離したｇＰＩＰ２遺伝子をベクターｐＦＬＡＧ−１TMに
挿入してｇＰＩＰ２タンパク質の生産のための発現ベク
ターを製造した。
明する。これらの実施例は、本発明の実施例を限定する
ものではない。 実施例１：フィトラカ・インシュラリス・ナカイからｇ
ＰＩＰ２遺伝子分離およびそれを含む発現ベクターの製
造 韓国産フィトラカ・インシュラリス・ナカイ（Ｐｈｙｔ
ｏｌａｃｃａ ｉｎｓｕｌａｒｉｓ Ｎａｋａｉ）の葉
からゲノムＤＮＡを分離し、それを鋳型としてＰＣＲ反
応させることによりｇＰＩＰ２遺伝子を増幅した後、分
離したｇＰＩＰ２遺伝子をベクターｐＦＬＡＧ−１TMに
挿入してｇＰＩＰ２タンパク質の生産のための発現ベク
ターを製造した。
【００２３】実施例１−１：フィトラカ・インシュラリ
ス・ナカイのゲノムＤＮＡ分離 シューア（Ｓｈｕｒｅ）らの方法に従い、韓国産フィト
ラカ・インシュラリス・ナカイ葉からゲノムＤＮＡを分
離した（参照：Ｓｈｕｒｅ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌ
ｌ，３５：２２５〜２３３（１９８３））。すなわち、
フィトラカ・インシュラリス・ナカイの葉１ｇを液体窒
素下において粉砕した後、ＤＮＡ抽出用緩衝溶液をフィ
トラカ・インシュラリス・ナカイ葉１ｇ当り５ｍｌ入れ
てよく混合し、タンパク質分解酵素Ｋ（ｐｒｏｔｅｉｎ
ａｓｅ Ｋ）含有溶液（５ｍｇ／ｍｌ）２５０μｌを加
え、６５℃において１５分間反応させた。その後、フェ
ノール／クロロホルム抽出を行なって遠心分離して上澄
液を収得した。前記上澄液に、上澄液と等量のフェノー
ル／クロロホルム／イソアミルアルコール混合溶液（フ
ェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール＝２
５：２４：１（ｖ／ｖ／ｖ）で混合された溶液）を添加
し、遠心分離して上澄液を収得した後、ＮａＣｌを１．
５Ｍになるように添加し、１０％ＣＴＡＢ（ｃｅｔｙｌ
ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄ
ｅ）を全量の１／１０となるように加え６５℃において
５分間反応させた。クロロホルムで２回抽出した後、抽
出した上澄液に試料１ｇ当り０．５ｍｌの４．４Ｍ Ｎ
Ｈ4ＯＡｃ（ｐＨ５．２）を添加し、上澄液と等量のイ
ソプロピルアルコールを添加し徐々によく混合した。こ
のとき、沈澱されるゲノムＤＮＡを分離し、０．７５ｍ
ｌのＴＥ溶液（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ：１ｍＭ ＥＤＴＡ
を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液、ｐＨ８．
０）に溶解させ、ＲＮａｓｅ Ａを１０μｇ／ｍｌの濃
度で添加し６０℃において３０分間放置した後、前述し
たようにフェノール／クロロホルム抽出を行なった。そ
の後、０．６ＭになるようにＮＨ4ＯＡｃ（ｐＨ５．
２）を添加し、上澄液と等量のイソプロピルアルコール
を添加し、沈澱されたゲノムＤＮＡを分離した。
ス・ナカイのゲノムＤＮＡ分離 シューア（Ｓｈｕｒｅ）らの方法に従い、韓国産フィト
ラカ・インシュラリス・ナカイ葉からゲノムＤＮＡを分
離した（参照：Ｓｈｕｒｅ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌ
ｌ，３５：２２５〜２３３（１９８３））。すなわち、
フィトラカ・インシュラリス・ナカイの葉１ｇを液体窒
素下において粉砕した後、ＤＮＡ抽出用緩衝溶液をフィ
トラカ・インシュラリス・ナカイ葉１ｇ当り５ｍｌ入れ
てよく混合し、タンパク質分解酵素Ｋ（ｐｒｏｔｅｉｎ
ａｓｅ Ｋ）含有溶液（５ｍｇ／ｍｌ）２５０μｌを加
え、６５℃において１５分間反応させた。その後、フェ
ノール／クロロホルム抽出を行なって遠心分離して上澄
液を収得した。前記上澄液に、上澄液と等量のフェノー
ル／クロロホルム／イソアミルアルコール混合溶液（フ
ェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール＝２
５：２４：１（ｖ／ｖ／ｖ）で混合された溶液）を添加
し、遠心分離して上澄液を収得した後、ＮａＣｌを１．
５Ｍになるように添加し、１０％ＣＴＡＢ（ｃｅｔｙｌ
ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄ
ｅ）を全量の１／１０となるように加え６５℃において
５分間反応させた。クロロホルムで２回抽出した後、抽
出した上澄液に試料１ｇ当り０．５ｍｌの４．４Ｍ Ｎ
Ｈ4ＯＡｃ（ｐＨ５．２）を添加し、上澄液と等量のイ
ソプロピルアルコールを添加し徐々によく混合した。こ
のとき、沈澱されるゲノムＤＮＡを分離し、０．７５ｍ
ｌのＴＥ溶液（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ：１ｍＭ ＥＤＴＡ
を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液、ｐＨ８．
０）に溶解させ、ＲＮａｓｅ Ａを１０μｇ／ｍｌの濃
度で添加し６０℃において３０分間放置した後、前述し
たようにフェノール／クロロホルム抽出を行なった。そ
の後、０．６ＭになるようにＮＨ4ＯＡｃ（ｐＨ５．
２）を添加し、上澄液と等量のイソプロピルアルコール
を添加し、沈澱されたゲノムＤＮＡを分離した。
【００２４】実施例１−２：フィトラカ・インシュラリ
ス・ナカイのゲノムＤＮＡからのｇＰＩＰ２遺伝子分離
およびその塩基配列の決定 実施例１から分離したフィトラカ・インシュラリス・ナ
カイのゲノムＤＮＡを鋳型とし、下記のようなオリゴヌ
クレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲ反応させ
た。 アミノ末端プライマー５’−ＣＣＡＡＧＣＴＴＧＴＧＡ
ＡＴＡＣＣＡＴＣＡＴＣＴＡＣ−３’（配列番号５） カルボキシ末端プライマー５’−ＧＧＡＡＧＣＴＴＴＧ
ＡＴＣＡＧＡＡＡＣＣＣＴＣＡＡＡ−３’（配列番号
６） すなわち、フィトラカ・インシュラリス・ナカイのゲノ
ムＤＮＡ１μｇとそれぞれのプライマー２００ｎｇずつ
を混合し、９５℃において５分間変性させた後、ＤＮＡ
熱循環器（Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ，Ｃｅｔｕｓ
／Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，ＵＳＡ）を使用してＶｅ
ｎｔTMＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ，ＵＳＡ）を用いて
変性（９５℃，１分）、結合（５５℃，１分）、伸長
（７２℃，１分）を３０回行なって遺伝子を増幅させ
た。このようにして増幅されたｇＰＩＰ２遺伝子を含む
ほぼ１ｋｂのＤＮＡ断片を制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断
してｐＵＣ１９ベクターにクローニングした後、制限酵
素マップを作成した。次いで、ｇＰＩＰ２遺伝子の全体
塩基配列を決めるため、この遺伝子内に存在するＥｃｏ
ＲＩおよびＸｈｏＩ制限酵素部位を切断し、各ＤＮＡ断
片をエレイズ−ア−ベース・システム（Ｅｒａｓｅ−ａ
−ＢａｓｅＳｙｓｔｅｍ，Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）を
用いて多重クローニング部位のＥｃｏＲＩおよびＳａｌ
Ｉ切断部位に連結させることにより、一連の欠失変異体
（ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｓｅｒｉｅｓ）を製造した。その
後、これら欠失変異体の塩基配列を、Ｓｅｑｕｅｎａｓ
ｅTM，（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌ Ｃｏ．，ＵＳＡ）を用いたジデオキシ鎖終結
法（ｄｉｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｃｈａｉｎ
ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）（参照：Ｓａｎｇｅｒ，
Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．，ＵＳＡ，７４：５４６３〜５４６７（１９７
７））に従い決定した。その結果、成熟タンパク質をコ
ードしているｇＰＩＰ２遺伝子は、翻訳開始コドンを含
む８８２個の塩基で構成されており（配列番号１）、そ
のオープンリーディングフレームは開始アミノ酸メチオ
ニンを含む２９２個のアミノ酸からなる（配列番号
２）、分子量がほぼ３２．８ｋＤａであるタンパク質を
コードしていることと明らかとなった（図１参照）。図
１は、ｇＰＩＰ２遺伝子の塩基配列およびそれから翻訳
されるアミノ酸配列を表す（配列番号１及び配列番号
２）。図１において、ボルドタイプのアミノ酸は暫定的
な（ｐｕｔａｔｉｖｅ）活性部位に関与するアミノ酸を
現し、（＊）は翻訳終結部位をそれぞれ表す。前記ｇＰ
ＩＰ２遺伝子から翻訳されるアミノ酸配列を、公知の抗
ウィルス性タンパク質をコード化している遺伝子である
ｃＰＡＰおよびｃＰＩＰ遺伝子から翻訳されるアミノ酸
配列と比較した結果、ｃＰＡＰ遺伝子から翻訳されるア
ミノ酸配列とは９３．１％、ｃＰＩＰ遺伝子から翻訳さ
れるアミノ酸配列とは８２．５％の高い相同性が現れ
た。従って、ｇＰＩＰ２タンパク質は、ｃＰＡＰおよび
ｃＰＩＰ遺伝子から翻訳される抗ウィルス性タンパク質
と非常に類似した抗ウィルス活性を有しているだろうと
予測できた。
ス・ナカイのゲノムＤＮＡからのｇＰＩＰ２遺伝子分離
およびその塩基配列の決定 実施例１から分離したフィトラカ・インシュラリス・ナ
カイのゲノムＤＮＡを鋳型とし、下記のようなオリゴヌ
クレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲ反応させ
た。 アミノ末端プライマー５’−ＣＣＡＡＧＣＴＴＧＴＧＡ
ＡＴＡＣＣＡＴＣＡＴＣＴＡＣ−３’（配列番号５） カルボキシ末端プライマー５’−ＧＧＡＡＧＣＴＴＴＧ
ＡＴＣＡＧＡＡＡＣＣＣＴＣＡＡＡ−３’（配列番号
６） すなわち、フィトラカ・インシュラリス・ナカイのゲノ
ムＤＮＡ１μｇとそれぞれのプライマー２００ｎｇずつ
を混合し、９５℃において５分間変性させた後、ＤＮＡ
熱循環器（Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ，Ｃｅｔｕｓ
／Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，ＵＳＡ）を使用してＶｅ
ｎｔTMＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ，ＵＳＡ）を用いて
変性（９５℃，１分）、結合（５５℃，１分）、伸長
（７２℃，１分）を３０回行なって遺伝子を増幅させ
た。このようにして増幅されたｇＰＩＰ２遺伝子を含む
ほぼ１ｋｂのＤＮＡ断片を制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断
してｐＵＣ１９ベクターにクローニングした後、制限酵
素マップを作成した。次いで、ｇＰＩＰ２遺伝子の全体
塩基配列を決めるため、この遺伝子内に存在するＥｃｏ
ＲＩおよびＸｈｏＩ制限酵素部位を切断し、各ＤＮＡ断
片をエレイズ−ア−ベース・システム（Ｅｒａｓｅ−ａ
−ＢａｓｅＳｙｓｔｅｍ，Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）を
用いて多重クローニング部位のＥｃｏＲＩおよびＳａｌ
Ｉ切断部位に連結させることにより、一連の欠失変異体
（ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｓｅｒｉｅｓ）を製造した。その
後、これら欠失変異体の塩基配列を、Ｓｅｑｕｅｎａｓ
ｅTM，（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌ Ｃｏ．，ＵＳＡ）を用いたジデオキシ鎖終結
法（ｄｉｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｃｈａｉｎ
ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）（参照：Ｓａｎｇｅｒ，
Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．，ＵＳＡ，７４：５４６３〜５４６７（１９７
７））に従い決定した。その結果、成熟タンパク質をコ
ードしているｇＰＩＰ２遺伝子は、翻訳開始コドンを含
む８８２個の塩基で構成されており（配列番号１）、そ
のオープンリーディングフレームは開始アミノ酸メチオ
ニンを含む２９２個のアミノ酸からなる（配列番号
２）、分子量がほぼ３２．８ｋＤａであるタンパク質を
コードしていることと明らかとなった（図１参照）。図
１は、ｇＰＩＰ２遺伝子の塩基配列およびそれから翻訳
されるアミノ酸配列を表す（配列番号１及び配列番号
２）。図１において、ボルドタイプのアミノ酸は暫定的
な（ｐｕｔａｔｉｖｅ）活性部位に関与するアミノ酸を
現し、（＊）は翻訳終結部位をそれぞれ表す。前記ｇＰ
ＩＰ２遺伝子から翻訳されるアミノ酸配列を、公知の抗
ウィルス性タンパク質をコード化している遺伝子である
ｃＰＡＰおよびｃＰＩＰ遺伝子から翻訳されるアミノ酸
配列と比較した結果、ｃＰＡＰ遺伝子から翻訳されるア
ミノ酸配列とは９３．１％、ｃＰＩＰ遺伝子から翻訳さ
れるアミノ酸配列とは８２．５％の高い相同性が現れ
た。従って、ｇＰＩＰ２タンパク質は、ｃＰＡＰおよび
ｃＰＩＰ遺伝子から翻訳される抗ウィルス性タンパク質
と非常に類似した抗ウィルス活性を有しているだろうと
予測できた。
【００２５】実施例１−３：ｇＰＩＰ２遺伝子を含む発
現ベクターの製造 実施例１−２において増幅されたほぼ１ｋｂのＤＮＡ断
片を制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断し、抗−ＦＬＡＧモノ
クローナル抗体の結合とエンテロキナーゼ切断に関与す
るオクタペプチドのＦＬＡＧ配列およびコーディング配
列の挿入に関与する多重クローニング部位（ＭＣＳ）マ
ーカーを含むベクターであるｐＦＬＡＧ−１TM（Ｉｎｔ
ｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）に挿入した（図２参照）。図２
はフィトラカ・インシュラリス・ナカイのゲノムＤＮＡ
からｇＰＩＰ２遺伝子を分離し、それを含む発現ベクタ
ーの製造過程を示す。このようにして製造された発現ベ
クターと、ＣａＣｌ2に処理されて形質転換可能な大腸
菌ＪＭ１０１とを混合し、氷浴上において６０分間放置
した後、４２℃において２分間熱処理し、ＬＢ培地（Ｌ
当り１０ｇペプトン、５ｇ酵母抽出物、１０ｇ ＮａＣ
ｌ）を添加して１時間の間３７℃で培養した。次いで、
１．５％（ｗ／ｖ）の寒天、１００μｇ／ｍｌアンピシ
リンおよび０．１ｍＭのＩＰＴＧが添加された固形ＬＢ
培地に接種し３７℃で一晩培養し、生長が抑制されたコ
ロニーを選別した。改変アルカリ溶解方法（参照：Ｂｒ
ｕｓｈ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ
ｌ．，５：１３０７〜１３１７（１９８５））を用い、
前記において選別されたコロニーからプラスミドを分離
し、制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断し、アガロースゲル電
気泳動によりほぼ１ｋｂの位置においてＤＮＡバンドを
確認した（図３参照）。下記のようなアミノ末端プライ
マー（２６マー）およびカルボキシ末端プライマー（２
４マー）を用いてベクターｐＦＬＡＧ−１TMに導入され
たＤＮＡ両末端の塩基配列を決定することにより、所望
するｇＰＩＰ２遺伝子が正確に挿入されたことがわか
る。 アミノ末端プライマー５’−ＧＴＡＧＴＡＴＴＧＣＣＡ
ＡＧＡＣＣＧＴＴＴＡＴＡＡＧ−３’（配列番号７） カルボキシ末端プライマー５’−ＧＡＣＡＴＡＧＴＣＣ
ＧＡＣＴＴＴＴＡＧＡＡＧＡＧ−３’（配列番号８） 図３において、第１レーンはＤＮＡサイズのマーカーで
あってλＤＮＡをＨｉｎｄIIIで切断した結果を、第２
レーンはｇＰＩＰ２遺伝子を含む発現ベクターをＨｉｎ
ｄIIIで切断した結果を、第３レーンは後述する実施例
２−４において製造したｇＰＩＰ５０遺伝子を含む発現
ベクターをＨｉｎｄIIIで切断した結果をそれぞれ示
す。前記において、製造された発現ベクターで大腸菌
（Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅを
形質転換させ、その形質転換体を大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕ
ｅ ＭＲＦ’ｇＰＩＰ２と命名し、１９９６年４月１０
日付、国際寄託機関である社団法人韓国種菌協会付設韓
国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に寄託番号ＫＣＣＭ
−１００８０で寄託された。
現ベクターの製造 実施例１−２において増幅されたほぼ１ｋｂのＤＮＡ断
片を制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断し、抗−ＦＬＡＧモノ
クローナル抗体の結合とエンテロキナーゼ切断に関与す
るオクタペプチドのＦＬＡＧ配列およびコーディング配
列の挿入に関与する多重クローニング部位（ＭＣＳ）マ
ーカーを含むベクターであるｐＦＬＡＧ−１TM（Ｉｎｔ
ｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）に挿入した（図２参照）。図２
はフィトラカ・インシュラリス・ナカイのゲノムＤＮＡ
からｇＰＩＰ２遺伝子を分離し、それを含む発現ベクタ
ーの製造過程を示す。このようにして製造された発現ベ
クターと、ＣａＣｌ2に処理されて形質転換可能な大腸
菌ＪＭ１０１とを混合し、氷浴上において６０分間放置
した後、４２℃において２分間熱処理し、ＬＢ培地（Ｌ
当り１０ｇペプトン、５ｇ酵母抽出物、１０ｇ ＮａＣ
ｌ）を添加して１時間の間３７℃で培養した。次いで、
１．５％（ｗ／ｖ）の寒天、１００μｇ／ｍｌアンピシ
リンおよび０．１ｍＭのＩＰＴＧが添加された固形ＬＢ
培地に接種し３７℃で一晩培養し、生長が抑制されたコ
ロニーを選別した。改変アルカリ溶解方法（参照：Ｂｒ
ｕｓｈ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ
ｌ．，５：１３０７〜１３１７（１９８５））を用い、
前記において選別されたコロニーからプラスミドを分離
し、制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断し、アガロースゲル電
気泳動によりほぼ１ｋｂの位置においてＤＮＡバンドを
確認した（図３参照）。下記のようなアミノ末端プライ
マー（２６マー）およびカルボキシ末端プライマー（２
４マー）を用いてベクターｐＦＬＡＧ−１TMに導入され
たＤＮＡ両末端の塩基配列を決定することにより、所望
するｇＰＩＰ２遺伝子が正確に挿入されたことがわか
る。 アミノ末端プライマー５’−ＧＴＡＧＴＡＴＴＧＣＣＡ
ＡＧＡＣＣＧＴＴＴＡＴＡＡＧ−３’（配列番号７） カルボキシ末端プライマー５’−ＧＡＣＡＴＡＧＴＣＣ
ＧＡＣＴＴＴＴＡＧＡＡＧＡＧ−３’（配列番号８） 図３において、第１レーンはＤＮＡサイズのマーカーで
あってλＤＮＡをＨｉｎｄIIIで切断した結果を、第２
レーンはｇＰＩＰ２遺伝子を含む発現ベクターをＨｉｎ
ｄIIIで切断した結果を、第３レーンは後述する実施例
２−４において製造したｇＰＩＰ５０遺伝子を含む発現
ベクターをＨｉｎｄIIIで切断した結果をそれぞれ示
す。前記において、製造された発現ベクターで大腸菌
（Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅを
形質転換させ、その形質転換体を大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕ
ｅ ＭＲＦ’ｇＰＩＰ２と命名し、１９９６年４月１０
日付、国際寄託機関である社団法人韓国種菌協会付設韓
国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に寄託番号ＫＣＣＭ
−１００８０で寄託された。
【００２６】実施例２：フィトラカ・インシュラリス・
ナカイからｇＰＩＰ５０遺伝子分離およびそれを含む発
現ベクターの製造 韓国産フィトラカ・インシュラリス・ナカイ（Ｐｈｙｔ
ｏｌａｃｃａ ｉｎｓｕｌａｒｉｓ Ｎａｋａｉ）の葉
のゲノムＤＮＡのジーンバンクから、［α−32Ｐ］ｄＡ
ＴＰで標識されたｃＰＩＰ遺伝子をプローブとして用
い、ｇＰＩＰ５０遺伝子を含むＤＮＡ断片を分離し、そ
れを鋳型としてＰＣＲ反応させることによりｇＰＩＰ５
０遺伝子の成熟タンパク質をコードする部位のみを増幅
した後、それをベクターｐＦＬＡＧ−１TMに挿入してｇ
ＰＩＰ５０タンパク質の発現ベクターを製造した。
ナカイからｇＰＩＰ５０遺伝子分離およびそれを含む発
現ベクターの製造 韓国産フィトラカ・インシュラリス・ナカイ（Ｐｈｙｔ
ｏｌａｃｃａ ｉｎｓｕｌａｒｉｓ Ｎａｋａｉ）の葉
のゲノムＤＮＡのジーンバンクから、［α−32Ｐ］ｄＡ
ＴＰで標識されたｃＰＩＰ遺伝子をプローブとして用
い、ｇＰＩＰ５０遺伝子を含むＤＮＡ断片を分離し、そ
れを鋳型としてＰＣＲ反応させることによりｇＰＩＰ５
０遺伝子の成熟タンパク質をコードする部位のみを増幅
した後、それをベクターｐＦＬＡＧ−１TMに挿入してｇ
ＰＩＰ５０タンパク質の発現ベクターを製造した。
【００２７】実施例２−１：フィトラカ・インシュラリ
ス・ナカイのゲノムＤＮＡの分離およびゲノムジーンバ
ンクの製造 韓国産フィトラカ・インシュラリス・ナカイの葉からゲ
ノムＤＮＡを分離するため、葉１０ｇを液体窒素下にお
いて粉末で摩砕した後、３０ｍｌのＤＮＡ抽出用緩衝溶
液（１００ｍＭ ＥＤＴＡ，２５０ｍＭ ＮａＣｌおよ
び１００μｇ／ｍｌタンパク質加水分解酵素Ｋを含有し
た１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））を加
え、１０％（ｗ／ｖ）サコシルを最終濃度１％になるよ
うに添加した。次いで、５５℃において２時間放置し、
４℃の温度条件で５５００ｘｇで１０分間遠心分離して
上澄液を収得した後、上澄液量の０．６倍に相当する量
でイソプロパノールを加え、７，５００ｘｇで１０分間
遠心分離して収得した沈澱物を９ｍｌのＴＥ緩衝溶液に
溶解させた。この溶液に９．７ｇのＣｓＣｌを添加し氷
浴上において３０分間放置し、４℃の温度条件で７，５
００ｘｇで１０分間遠心分離し上澄液を収得した。この
上澄液に０．５ｍｌの１％（ｗ／ｖ）臭素化エチジウム
（ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）を加えて前記と
同一の条件下において遠心分離し、このようにして収得
した上澄液を６０，０００ｒｐｍで１６時間超高速遠心
分離してＤＮＡを沈澱させた。沈澱されたＤＮＡをＣｓ
Ｃｌで飽和されたイソプロパノールを用いて繰返し洗浄
して臭化エチジウムを除去した後、蒸留水とエタノール
を加えて−２０℃で１時間放置し、４℃の温度条件で
７，５００ｘｇで１０分間遠心分離した。収得したＤＮ
Ａの沈澱物をＴＥ緩衝溶液に再懸濁し、懸濁液量の１／
１０に相当する量で３Ｍ酢酸ナトリウムを添加し、さら
には前記懸濁液量の２倍に該当するエタノールを添加
し、前記と同様の条件で遠心分離してフィトラカ・イン
シュラリス・ナカイのゲノムＤＮＡを分離した。このよ
うにして分離したゲノムＤＮＡからフィトラカ・インシ
ュラリス・ナカイのゲノムジーンバンクを製造するた
め、ゲノムＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分切断
し、大きさが１０ｋｂに至るＤＮＡ断片を収得した。こ
のようにして収得した０．９μｇの１０ｋｂ ＤＮＡ断
片と１．０μｇのラムダＧＥＭ−１１ＢａｍＨＩ ａｒ
ｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）をＴ４ ＤＮＡ連結酵素
で互いに連結させた。連結されたＤＮＡはパッケージン
（Ｐａｃｋａｇｅｎｅ；Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）を用
いることにより、インビトロパッケージング（ｉｎｖｉ
ｔｒｏ ｐａｃｋａｇｉｎｇ）を行った。
ス・ナカイのゲノムＤＮＡの分離およびゲノムジーンバ
ンクの製造 韓国産フィトラカ・インシュラリス・ナカイの葉からゲ
ノムＤＮＡを分離するため、葉１０ｇを液体窒素下にお
いて粉末で摩砕した後、３０ｍｌのＤＮＡ抽出用緩衝溶
液（１００ｍＭ ＥＤＴＡ，２５０ｍＭ ＮａＣｌおよ
び１００μｇ／ｍｌタンパク質加水分解酵素Ｋを含有し
た１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））を加
え、１０％（ｗ／ｖ）サコシルを最終濃度１％になるよ
うに添加した。次いで、５５℃において２時間放置し、
４℃の温度条件で５５００ｘｇで１０分間遠心分離して
上澄液を収得した後、上澄液量の０．６倍に相当する量
でイソプロパノールを加え、７，５００ｘｇで１０分間
遠心分離して収得した沈澱物を９ｍｌのＴＥ緩衝溶液に
溶解させた。この溶液に９．７ｇのＣｓＣｌを添加し氷
浴上において３０分間放置し、４℃の温度条件で７，５
００ｘｇで１０分間遠心分離し上澄液を収得した。この
上澄液に０．５ｍｌの１％（ｗ／ｖ）臭素化エチジウム
（ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）を加えて前記と
同一の条件下において遠心分離し、このようにして収得
した上澄液を６０，０００ｒｐｍで１６時間超高速遠心
分離してＤＮＡを沈澱させた。沈澱されたＤＮＡをＣｓ
Ｃｌで飽和されたイソプロパノールを用いて繰返し洗浄
して臭化エチジウムを除去した後、蒸留水とエタノール
を加えて−２０℃で１時間放置し、４℃の温度条件で
７，５００ｘｇで１０分間遠心分離した。収得したＤＮ
Ａの沈澱物をＴＥ緩衝溶液に再懸濁し、懸濁液量の１／
１０に相当する量で３Ｍ酢酸ナトリウムを添加し、さら
には前記懸濁液量の２倍に該当するエタノールを添加
し、前記と同様の条件で遠心分離してフィトラカ・イン
シュラリス・ナカイのゲノムＤＮＡを分離した。このよ
うにして分離したゲノムＤＮＡからフィトラカ・インシ
ュラリス・ナカイのゲノムジーンバンクを製造するた
め、ゲノムＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分切断
し、大きさが１０ｋｂに至るＤＮＡ断片を収得した。こ
のようにして収得した０．９μｇの１０ｋｂ ＤＮＡ断
片と１．０μｇのラムダＧＥＭ−１１ＢａｍＨＩ ａｒ
ｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）をＴ４ ＤＮＡ連結酵素
で互いに連結させた。連結されたＤＮＡはパッケージン
（Ｐａｃｋａｇｅｎｅ；Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）を用
いることにより、インビトロパッケージング（ｉｎｖｉ
ｔｒｏ ｐａｃｋａｇｉｎｇ）を行った。
【００２８】実施例２−２：フィトラカ・インシュラリ
ス・ナカイのゲノムジーンバンクにおいてｇＰＩＰ５０
遺伝子の選別 実施例１において製造されたゲノムジーンバンクからｇ
ＰＩＰ５０遺伝子を選別するため、総６００，０００個
のプラーク（ｐｌａｑｕｅ）を３回にわたって選別した
結果、総９個の陽性プラークを確認できた。このとき、
ＤＮＡプローブはｃＰＩＰのコーディング部位全体を含
んでいるＰＣＲ産物を［α−32Ｐ］ｄＡＴＰで標識して
（ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ）
用いた。最終的に選別された９個のプラークを大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＷ２５１を宿主として用いてＬＢ液
体培地において多量に培養した後、宿主細胞のデブリス
（ｄｅｂｒｉｓ）を沈澱させて除去した上澄液を超高速
遠心分離器で２５，０００ｒｐｍで２時間再沈澱させて
ファージ粒子を収得した。ファージ粒子にＳＤＳ，ＲＮ
ａｓｅおよびタンパク質分解酵素Ｋを添加し、フェノー
ル抽出を行なってファージＤＮＡを分離した。純粋分離
されたファージＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩとＸｈｏＩで
それぞれ切断し、前記の同一のＤＮＡプローブを用いて
サザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、制
限酵素ＸｈｏＩを処理した場合にはほぼ５．０ｋｂのＤ
ＮＡ断片において、制限酵素ＳａｃＩを処理した場合に
はほぼ４．８ｋｂおよび３．５ｋｂの二つのＤＮＡ断片
においてハイブリダイゼーションの陽性シグナルが確認
されるクローンが発見された。その中で、最も強い陽性
シグナルを示す５０番クローン（図４参照）を選択し
た。図４において、第１レーンはＤＮＡ大きさのマーカ
ーであってＨｉｎｄIIIで切断したラムダＤＮＡであ
り、第２および第３レーンはＳａｃＩおよびＸｈｏＩで
それぞれ切断されたファージＤＮＡを１％アガロースゲ
ル電気泳動した結果であり、第４および第５レーンは前
記の電気泳動の結果をナイロン膜に移してサザンハイブ
リダイゼーションを行った結果をそれぞれ示す。前記に
おいて、選択した５０番クローンの５．０ｋｂのＤＮＡ
断片をＳａｌＩで切断したｐＵＣ１９ベクターにサブク
ローニングし、このプラスミドをｐＰＩＰ５０と命名し
た。ｐＰＩＰ５０の制限酵素マップを作成するため、ｐ
ＰＩＰ５０をＢａｍＨＩ，ＥｃｏＲＩ，ＫｐｎＩ，Ｓａ
ｃＩの制限酵素それぞれで切断したり、ＢａｍＨＩ＋Ｈ
ｉｎｄIII，ＥｃｏＲＩ＋ＫｐｎＩで２重切断した後、
前記と同様の方法でサザンハイブリダイゼーションを行
なった。その結果、制限酵素ＢａｍＨＩで切断された
３．４ｋｂ ＤＮＡ断片からは一つのバンドにおいて陽
性反応を示し、制限酵素ＥｃｏＲＩ，ＫｐｎＩおよびＳ
ａｃＩでそれぞれ切断されたＤＮＡ断片からは二つのバ
ンドにおいて陽性反応を示した。従って、３．４ｋｂ
ＢａｍＨＩ断片内に前記プローブとハイブリダイズする
完全な遺伝子ｇＰＩＰ５０が存在し、この遺伝子内部に
ＥｃｏＲＩ，ＫｐｎＩ，ＳａｃＩ制限酵素認識部位が存
在することがわかった。
ス・ナカイのゲノムジーンバンクにおいてｇＰＩＰ５０
遺伝子の選別 実施例１において製造されたゲノムジーンバンクからｇ
ＰＩＰ５０遺伝子を選別するため、総６００，０００個
のプラーク（ｐｌａｑｕｅ）を３回にわたって選別した
結果、総９個の陽性プラークを確認できた。このとき、
ＤＮＡプローブはｃＰＩＰのコーディング部位全体を含
んでいるＰＣＲ産物を［α−32Ｐ］ｄＡＴＰで標識して
（ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ）
用いた。最終的に選別された９個のプラークを大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＷ２５１を宿主として用いてＬＢ液
体培地において多量に培養した後、宿主細胞のデブリス
（ｄｅｂｒｉｓ）を沈澱させて除去した上澄液を超高速
遠心分離器で２５，０００ｒｐｍで２時間再沈澱させて
ファージ粒子を収得した。ファージ粒子にＳＤＳ，ＲＮ
ａｓｅおよびタンパク質分解酵素Ｋを添加し、フェノー
ル抽出を行なってファージＤＮＡを分離した。純粋分離
されたファージＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩとＸｈｏＩで
それぞれ切断し、前記の同一のＤＮＡプローブを用いて
サザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、制
限酵素ＸｈｏＩを処理した場合にはほぼ５．０ｋｂのＤ
ＮＡ断片において、制限酵素ＳａｃＩを処理した場合に
はほぼ４．８ｋｂおよび３．５ｋｂの二つのＤＮＡ断片
においてハイブリダイゼーションの陽性シグナルが確認
されるクローンが発見された。その中で、最も強い陽性
シグナルを示す５０番クローン（図４参照）を選択し
た。図４において、第１レーンはＤＮＡ大きさのマーカ
ーであってＨｉｎｄIIIで切断したラムダＤＮＡであ
り、第２および第３レーンはＳａｃＩおよびＸｈｏＩで
それぞれ切断されたファージＤＮＡを１％アガロースゲ
ル電気泳動した結果であり、第４および第５レーンは前
記の電気泳動の結果をナイロン膜に移してサザンハイブ
リダイゼーションを行った結果をそれぞれ示す。前記に
おいて、選択した５０番クローンの５．０ｋｂのＤＮＡ
断片をＳａｌＩで切断したｐＵＣ１９ベクターにサブク
ローニングし、このプラスミドをｐＰＩＰ５０と命名し
た。ｐＰＩＰ５０の制限酵素マップを作成するため、ｐ
ＰＩＰ５０をＢａｍＨＩ，ＥｃｏＲＩ，ＫｐｎＩ，Ｓａ
ｃＩの制限酵素それぞれで切断したり、ＢａｍＨＩ＋Ｈ
ｉｎｄIII，ＥｃｏＲＩ＋ＫｐｎＩで２重切断した後、
前記と同様の方法でサザンハイブリダイゼーションを行
なった。その結果、制限酵素ＢａｍＨＩで切断された
３．４ｋｂ ＤＮＡ断片からは一つのバンドにおいて陽
性反応を示し、制限酵素ＥｃｏＲＩ，ＫｐｎＩおよびＳ
ａｃＩでそれぞれ切断されたＤＮＡ断片からは二つのバ
ンドにおいて陽性反応を示した。従って、３．４ｋｂ
ＢａｍＨＩ断片内に前記プローブとハイブリダイズする
完全な遺伝子ｇＰＩＰ５０が存在し、この遺伝子内部に
ＥｃｏＲＩ，ＫｐｎＩ，ＳａｃＩ制限酵素認識部位が存
在することがわかった。
【００２９】実施例２−３：ｇＰＩＰ５０遺伝子の塩基
配列の決定 プラスミドｐＰＩＰ５０の制限酵素マップから確認され
た３．４ｋｂ ＢａｍＨＩ断片内に存在するｇＰＩＰ５
０遺伝子の塩基配列を決定した。その結果、ｇＰＩＰ５
０遺伝子の成熟タンパク質コーディング部分は翻訳開始
コドンを含む９５１個の塩基で構成されており（配列番
号３）、そのオープンリーディングフレームは開始アミ
ノ酸メチオニンを含む３１５個のアミノ酸からなる（配
列番号４）、分子量がほぼ３５．７ｋＤａであるタンパ
ク質をコードしていることを確認した（図５参照）。さ
らに、前記３１４個のアミノ酸の中でアミノ末端の２４
個の疏水性アミノ酸配列はシグナルペプチドを表すこと
を確認した。図５において、真核生物において共通に現
れる５’部位（５’フランキング領域）の暫定的なＣＡ
ＡＴボックス、二つのＴＡＴＡボックスおよび３’部位
のｐｏｌｙ（Ａ）＋シグナル（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａ
ｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）は下線で示し、シグナルペプ
チドの暫定的な切断部位は（▲）で示し、暫定的な活性
部位のアミノ酸配列は陰影を付し終結コドンは（＊）で
示す。前記ｇＰＩＰ５０遺伝子から翻訳されるアミノ酸
配列を、公知の抗ウィルス性タンパク質をコードしてい
る遺伝子であるｃＰＩＰおよびα−ＰＡＰ遺伝子から翻
訳されるアミノ酸配列と比較した結果、ｃＰＩＰ遺伝子
から翻訳されるアミノ酸配列とは６９．４％，α−ＰＡ
Ｐ遺伝子から翻訳されるアミノ酸配列とは８４％の相同
性を表すことを確認した。また、ｇＰＩＰ５０遺伝子か
ら翻訳されるアミノ酸の場合、公知のＲＩＰタンパク質
の間で共通的によく保存されているリボゾーム不活性化
部位の１３個のアミノ酸の中で、単に２個のアミノ酸に
おいてのみ差異があることを確認した。すなわち、ｇＰ
ＩＰ５０タンパク質の２００番目と２０３番目に該当
し、ｃＰＡＰやｃＰＩＰ遺伝子から翻訳されるアミノ酸
は大部分がセリンとアラニンであることに比べ、ｇＰＩ
Ｐ５０タンパク質の場合はそれぞれプロリンとトレオニ
ンが位置していた。しかしながら、かかるアミノ酸の差
異は電気的性質が同様なアミノ酸間の置換であるため、
ＲＩＰタンパク質の活性には大きい影響を及ぼさないこ
とが予想される。従って、ｇＰＩＰ５０タンパク質はｃ
ＰＩＰ、α−ＰＡＰおよびｃＰＡＰなどの遺伝子から翻
訳されるＲＩＰタンパク質と同様に、抗ウィルス活性を
有しているだろうと予測することができた。
配列の決定 プラスミドｐＰＩＰ５０の制限酵素マップから確認され
た３．４ｋｂ ＢａｍＨＩ断片内に存在するｇＰＩＰ５
０遺伝子の塩基配列を決定した。その結果、ｇＰＩＰ５
０遺伝子の成熟タンパク質コーディング部分は翻訳開始
コドンを含む９５１個の塩基で構成されており（配列番
号３）、そのオープンリーディングフレームは開始アミ
ノ酸メチオニンを含む３１５個のアミノ酸からなる（配
列番号４）、分子量がほぼ３５．７ｋＤａであるタンパ
ク質をコードしていることを確認した（図５参照）。さ
らに、前記３１４個のアミノ酸の中でアミノ末端の２４
個の疏水性アミノ酸配列はシグナルペプチドを表すこと
を確認した。図５において、真核生物において共通に現
れる５’部位（５’フランキング領域）の暫定的なＣＡ
ＡＴボックス、二つのＴＡＴＡボックスおよび３’部位
のｐｏｌｙ（Ａ）＋シグナル（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａ
ｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）は下線で示し、シグナルペプ
チドの暫定的な切断部位は（▲）で示し、暫定的な活性
部位のアミノ酸配列は陰影を付し終結コドンは（＊）で
示す。前記ｇＰＩＰ５０遺伝子から翻訳されるアミノ酸
配列を、公知の抗ウィルス性タンパク質をコードしてい
る遺伝子であるｃＰＩＰおよびα−ＰＡＰ遺伝子から翻
訳されるアミノ酸配列と比較した結果、ｃＰＩＰ遺伝子
から翻訳されるアミノ酸配列とは６９．４％，α−ＰＡ
Ｐ遺伝子から翻訳されるアミノ酸配列とは８４％の相同
性を表すことを確認した。また、ｇＰＩＰ５０遺伝子か
ら翻訳されるアミノ酸の場合、公知のＲＩＰタンパク質
の間で共通的によく保存されているリボゾーム不活性化
部位の１３個のアミノ酸の中で、単に２個のアミノ酸に
おいてのみ差異があることを確認した。すなわち、ｇＰ
ＩＰ５０タンパク質の２００番目と２０３番目に該当
し、ｃＰＡＰやｃＰＩＰ遺伝子から翻訳されるアミノ酸
は大部分がセリンとアラニンであることに比べ、ｇＰＩ
Ｐ５０タンパク質の場合はそれぞれプロリンとトレオニ
ンが位置していた。しかしながら、かかるアミノ酸の差
異は電気的性質が同様なアミノ酸間の置換であるため、
ＲＩＰタンパク質の活性には大きい影響を及ぼさないこ
とが予想される。従って、ｇＰＩＰ５０タンパク質はｃ
ＰＩＰ、α−ＰＡＰおよびｃＰＡＰなどの遺伝子から翻
訳されるＲＩＰタンパク質と同様に、抗ウィルス活性を
有しているだろうと予測することができた。
【００３０】実施例２−４：ｇＰＩＰ５０遺伝子を含む
発現ベクターの製造 まず、ｇＰＩＰ５０遺伝子の成熟タンパク質をコードす
る部位のみをクローニングするため、実施例２において
収得した３．４ｋｂ ＢａｍＨＩ断片を鋳型とし、両端
に制限酵素ＨｉｎｄIIIの認識部位が位置する下記のよ
うなオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて実施
例１−２と同一の条件でＰＣＲ反応を行った。 アミノ末端プライマー５’−ＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＡ
ＧＴＣＣＡＡＡＴＣＣＡＡＴＣ−３’（配列番号９） カルボキシ末端プライマー５’−ＧＧＡＡＧＣＴＴＴＧ
ＡＴＣＡＧＡＡＡＣＣＣＴＣＡＡＡ−３’（配列番号
６） このようにして増幅されたＰＣＲ反応産物を０．８％ア
ガロースゲル電気泳動し、ｇＰＩＰ５０遺伝子を含むほ
ぼ１ｋｂのＤＮＡ断片を電気溶出した後、制限酵素Ｈｉ
ｎｄIIIで切断し、同一の制限酵素で切断されたｐＦＬ
ＡＧ−１TMにクローニングした（図６参照）。図６はプ
ラスミドｐＰＩＰ５０の３．４ｋｂ ＢａｍＨＩ断片か
らｇＰＩＰ５０遺伝子をＰＣＲ増幅し、それを含む発現
ベクターを構築する過程を表す。このようにして製造さ
れた組換え発現ベクターで大腸菌を形質転換させ、その
形質転換体を実施例１−３のＬＢ固形培地に接種し、成
長が抑制されたコロニーを選別した。このとき、ＬＢ固
形培地は１．５ｍＭ ＩＰＴＧが添加された培地を用い
た。選別されたコロニーからプラスミドを分離し、制限
酵素ＨｉｎｄIIIで切断し、アガロースゲル電気泳動し
てほぼ１ｋｂの位置からＤＮＡバンドを確認することに
より（図３参照）、なお実施例１−３と同一のＮ−末端
プライマー（２６マー）およびＣ−末端プライマー（２
４マー）を用いてベクターｐＦＬＡＧ−１TMに導入され
たＤＮＡ挿入体の塩基配列を決定することにより、所望
するｇＰＩＰ５０遺伝子が正確に挿入されたことを確認
した。前記において製造された組換え発現ベクターで大
腸菌（Ｅｐｉｃｕｒｉａｎｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ
を形質転換させ、その形質転換体を大腸菌ＸＬ１−Ｂｌ
ｕｅ ＭＲＦ’ｇＰＩＰ５０と命名し、１９９６年４月
１０日付、国際寄託機関である社団法人韓国種菌協会付
設韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に寄託番号ＫＣ
ＣＭ−１００８１で寄託された。
発現ベクターの製造 まず、ｇＰＩＰ５０遺伝子の成熟タンパク質をコードす
る部位のみをクローニングするため、実施例２において
収得した３．４ｋｂ ＢａｍＨＩ断片を鋳型とし、両端
に制限酵素ＨｉｎｄIIIの認識部位が位置する下記のよ
うなオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて実施
例１−２と同一の条件でＰＣＲ反応を行った。 アミノ末端プライマー５’−ＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＡ
ＧＴＣＣＡＡＡＴＣＣＡＡＴＣ−３’（配列番号９） カルボキシ末端プライマー５’−ＧＧＡＡＧＣＴＴＴＧ
ＡＴＣＡＧＡＡＡＣＣＣＴＣＡＡＡ−３’（配列番号
６） このようにして増幅されたＰＣＲ反応産物を０．８％ア
ガロースゲル電気泳動し、ｇＰＩＰ５０遺伝子を含むほ
ぼ１ｋｂのＤＮＡ断片を電気溶出した後、制限酵素Ｈｉ
ｎｄIIIで切断し、同一の制限酵素で切断されたｐＦＬ
ＡＧ−１TMにクローニングした（図６参照）。図６はプ
ラスミドｐＰＩＰ５０の３．４ｋｂ ＢａｍＨＩ断片か
らｇＰＩＰ５０遺伝子をＰＣＲ増幅し、それを含む発現
ベクターを構築する過程を表す。このようにして製造さ
れた組換え発現ベクターで大腸菌を形質転換させ、その
形質転換体を実施例１−３のＬＢ固形培地に接種し、成
長が抑制されたコロニーを選別した。このとき、ＬＢ固
形培地は１．５ｍＭ ＩＰＴＧが添加された培地を用い
た。選別されたコロニーからプラスミドを分離し、制限
酵素ＨｉｎｄIIIで切断し、アガロースゲル電気泳動し
てほぼ１ｋｂの位置からＤＮＡバンドを確認することに
より（図３参照）、なお実施例１−３と同一のＮ−末端
プライマー（２６マー）およびＣ−末端プライマー（２
４マー）を用いてベクターｐＦＬＡＧ−１TMに導入され
たＤＮＡ挿入体の塩基配列を決定することにより、所望
するｇＰＩＰ５０遺伝子が正確に挿入されたことを確認
した。前記において製造された組換え発現ベクターで大
腸菌（Ｅｐｉｃｕｒｉａｎｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ
を形質転換させ、その形質転換体を大腸菌ＸＬ１−Ｂｌ
ｕｅ ＭＲＦ’ｇＰＩＰ５０と命名し、１９９６年４月
１０日付、国際寄託機関である社団法人韓国種菌協会付
設韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に寄託番号ＫＣ
ＣＭ−１００８１で寄託された。
【００３１】実施例３：組換えｇＰＩＰ２およびｇＰＩ
Ｐ５０タンパク質の発現 実施例１−３および２−４において製造された発現ベク
ターで形質転換された大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲ
Ｆ’ｇＰＩＰ２および大腸菌ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ’
ｇＰＩＰ５０をそれぞれ５００ｍｌ ＬＢ液体培地で３
７℃、２００ｒｐｍで培養し、細胞の濃度がＯＤ600が
０．７に到達したとき、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−
Ｄ−チオガラクトシド）を最終濃度０．７５ｍＭになる
ように添加した後、組換えタンパク質合成を誘導するた
め３時間培養した。培養された細胞を４℃、８，０００
ｒｐｍで８分間遠心分離して収得し、３５ｍｌのＰＢＳ
緩衝溶液（０．０１Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4および０．１５Ｍ
ＮａＣｌで構成された溶液，ｐＨ８．４）で懸濁させ
た後、細胞を超音波破砕した。次いで、４℃，１５，０
００ｒｐｍで２０分間遠心分離して収得した上澄液（以
下、‘上澄液Ｉ’という）に最終濃度１．０ｍＭになる
ように１Ｍ ＣａＣｌ2を加えた。さらに、沈澱物には
５ｍｌの８Ｍウレアを添加し、８，０００ｒｐｍで１０
分間遠心分離し上澄液を収得した後、４℃でＰＢＳ緩衝
溶液で一晩透析し（以下、‘上澄液II’という）、最終
濃度１．０ｍＭになるように１Ｍ ＣａＣｌ2を加え
た。その後、上澄液IIから組換えタンパク質を分離する
ため、５ｍｌグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ３．０）溶液にア
ンチフレグ（ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ）Ｍ１親和性ゲル（Ｉ
ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）カラムを３回洗浄し、さら
に、５ｍｌのＰＢＳ緩衝溶液で３回洗浄した後、ＣａＣ
ｌ2が添加された前記上澄液IIを前記カラムに注入し
た。次いで、カラムを１２ｍｌのＰＢＳ／Ｃａ溶液
（１．０ｍＭ ＣａＣｌ2が含まれたＰＢＳ緩衝溶液）
で３回洗浄し、０．５ｍｌ ＰＢＳ／ＥＤＴＡ溶液
（２．０ｍＭ ＥＤＴＡが含まれたＰＢＳ緩衝溶液）を
注入して３０分間静置させカルシウムイオンをキレート
させた後、１０分置きに０．５ｍｌのＰＢＳ／ＥＤＴＡ
溶液を用いて純粋な組換えタンパク質の溶出分画を得
た。このようにして収得した前記上澄液と溶出分画とを
１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥした結果、ほぼ３３ｋＤａに至
る組換えｇＰＩＰ５０またはｇＰＩＰ２タンパク質が形
質転換体から成功的に発現され（ｇＰＩＰ５０タンパク
質の分子量がｇＰＩＰ２タンパク質より若干大きい）、
また前記組換えタンパク質の大部分が上澄液IIに存在す
ることからみて、発現された組換えタンパク質は封入体
を形成することがわかる（図７参照）。図７において、
第１レーンは対照区であってベクターｐＦＬＡＧ−１TM
で形質転換された大腸菌をＩＰＴＧ誘導過程下において
培養して収得した上澄液Ｉ、第２レーンは大腸菌ＸＬ１
−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’ｇＰＩＰ５０の上澄液Ｉ、第３レ
ーンは大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’ｇＰＩＰ２の
上澄液Ｉ；第４レーンはベクターｐＦＬＡＧ−１TMで形
質転換された大腸菌をＩＰＴＧ誘導過程下において培養
して収得した上澄液II、第５レーンは大腸菌ＸＬ１−Ｂ
ｌｕｅ ＭＲＦ’ｇＰＩＰ５０の上澄液II、第６レーン
は大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’ｇＰＩＰ２の上澄
液II、第７レーンは大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’
ｇＰＩＰ５０から精製した組換えｇＰＩＰ５０タンパク
質、第８レーンは大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’ｇ
ＰＩＰ２から精製した組換えｇＰＩＰ２タンパク質をそ
れぞれ示し、矢印は組換えタンパク質を示す。
Ｐ５０タンパク質の発現 実施例１−３および２−４において製造された発現ベク
ターで形質転換された大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲ
Ｆ’ｇＰＩＰ２および大腸菌ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ’
ｇＰＩＰ５０をそれぞれ５００ｍｌ ＬＢ液体培地で３
７℃、２００ｒｐｍで培養し、細胞の濃度がＯＤ600が
０．７に到達したとき、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−
Ｄ−チオガラクトシド）を最終濃度０．７５ｍＭになる
ように添加した後、組換えタンパク質合成を誘導するた
め３時間培養した。培養された細胞を４℃、８，０００
ｒｐｍで８分間遠心分離して収得し、３５ｍｌのＰＢＳ
緩衝溶液（０．０１Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4および０．１５Ｍ
ＮａＣｌで構成された溶液，ｐＨ８．４）で懸濁させ
た後、細胞を超音波破砕した。次いで、４℃，１５，０
００ｒｐｍで２０分間遠心分離して収得した上澄液（以
下、‘上澄液Ｉ’という）に最終濃度１．０ｍＭになる
ように１Ｍ ＣａＣｌ2を加えた。さらに、沈澱物には
５ｍｌの８Ｍウレアを添加し、８，０００ｒｐｍで１０
分間遠心分離し上澄液を収得した後、４℃でＰＢＳ緩衝
溶液で一晩透析し（以下、‘上澄液II’という）、最終
濃度１．０ｍＭになるように１Ｍ ＣａＣｌ2を加え
た。その後、上澄液IIから組換えタンパク質を分離する
ため、５ｍｌグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ３．０）溶液にア
ンチフレグ（ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ）Ｍ１親和性ゲル（Ｉ
ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）カラムを３回洗浄し、さら
に、５ｍｌのＰＢＳ緩衝溶液で３回洗浄した後、ＣａＣ
ｌ2が添加された前記上澄液IIを前記カラムに注入し
た。次いで、カラムを１２ｍｌのＰＢＳ／Ｃａ溶液
（１．０ｍＭ ＣａＣｌ2が含まれたＰＢＳ緩衝溶液）
で３回洗浄し、０．５ｍｌ ＰＢＳ／ＥＤＴＡ溶液
（２．０ｍＭ ＥＤＴＡが含まれたＰＢＳ緩衝溶液）を
注入して３０分間静置させカルシウムイオンをキレート
させた後、１０分置きに０．５ｍｌのＰＢＳ／ＥＤＴＡ
溶液を用いて純粋な組換えタンパク質の溶出分画を得
た。このようにして収得した前記上澄液と溶出分画とを
１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥした結果、ほぼ３３ｋＤａに至
る組換えｇＰＩＰ５０またはｇＰＩＰ２タンパク質が形
質転換体から成功的に発現され（ｇＰＩＰ５０タンパク
質の分子量がｇＰＩＰ２タンパク質より若干大きい）、
また前記組換えタンパク質の大部分が上澄液IIに存在す
ることからみて、発現された組換えタンパク質は封入体
を形成することがわかる（図７参照）。図７において、
第１レーンは対照区であってベクターｐＦＬＡＧ−１TM
で形質転換された大腸菌をＩＰＴＧ誘導過程下において
培養して収得した上澄液Ｉ、第２レーンは大腸菌ＸＬ１
−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’ｇＰＩＰ５０の上澄液Ｉ、第３レ
ーンは大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’ｇＰＩＰ２の
上澄液Ｉ；第４レーンはベクターｐＦＬＡＧ−１TMで形
質転換された大腸菌をＩＰＴＧ誘導過程下において培養
して収得した上澄液II、第５レーンは大腸菌ＸＬ１−Ｂ
ｌｕｅ ＭＲＦ’ｇＰＩＰ５０の上澄液II、第６レーン
は大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’ｇＰＩＰ２の上澄
液II、第７レーンは大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’
ｇＰＩＰ５０から精製した組換えｇＰＩＰ５０タンパク
質、第８レーンは大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’ｇ
ＰＩＰ２から精製した組換えｇＰＩＰ２タンパク質をそ
れぞれ示し、矢印は組換えタンパク質を示す。
【００３２】実施例４：組換えｇＰＩＰ２およびｇＰＩ
Ｐ５０タンパク質のタンパク質合成阻害能確認 実施例３において精製した組換えタンパク質ｇＰＩＰ２
およびｇＰＩＰ５０がタンパク質合成阻害能を有してい
るかを確認するため、下記のような兎の網状赤血球溶血
システム（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）を用いた無細胞タ
ンパク質合成系でタンパク質合成反応を行なった。ルシ
フェラーゼｍＲＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）、兎の
網状赤血球溶血物（ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ ｌｙｓ
ａｔｅ）、メチオニンが含まれないアミノ酸混合物およ
び35Ｓが標識されたメチオニンを含む反応混合物に組換
えタンパク質などの目的物質を添加して３０℃で９０分
間反応させた後、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なってタ
ンパク質を分画し、Ｘ−ｒａｙフィルムに自家放射して
タンパク質合成程度を検定した（図８参照）。図８にお
いて、第１レーンは目的物質として抗−ＦＬＡＧ Ｍ１
吸着ゲルクロマトグラフィ行いの際用いられた溶出用緩
衝溶液（ＰＢＳ／ＥＤＴＡ溶液）２．５μｌを添加した
場合、第２および第３レーンは組換えｇＰＩＰ５０タン
パク質の最終濃度が１００ｐＭおよび１０ｐＭになるよ
うにそれぞれ添加した場合、第４レーンは組換えｇＰＩ
Ｐ２タンパク質の最終濃度が１０ｐＭになるように添加
した場合、第５レーンはｐＦＬＡＧ−１TMで形質転換さ
れた大腸菌をＩＰＴＧ誘導過程下において培養して収得
した４００ｎｇの上澄液IIにルシフェラーゼｍＲＮＡを
添加しない場合、第６レーンはルシフェラーゼｍＲＮＡ
を添加した場合をそれぞれ表す。図８に示すように、組
換えタンパク質ｇＰＩＰ５０またはｇＰＩＰ２が添加さ
れない第１および第６レーンにおいてはほぼ６１ｋＤａ
のルシフェラーゼタンパク質が合成されたが、組換えタ
ンパク質ｇＰＩＰ５０が１００ｐＭ添加された第２レー
ンにおいてはタンパク質が全く合成されず、組換えタン
パク質ｇＰＩＰ５０およびｇＰＩＰ２タンパク質がそれ
ぞれ１０ｐＭ添加された第３および第４レーンにおいて
はタンパク質の合成が大きく阻害されることを確認する
ことができた。従って、純粋分離された組換えｇＰＩＰ
２およびｇＰＩＰ５０タンパク質がタンパク質合成を阻
害することを確認した。
Ｐ５０タンパク質のタンパク質合成阻害能確認 実施例３において精製した組換えタンパク質ｇＰＩＰ２
およびｇＰＩＰ５０がタンパク質合成阻害能を有してい
るかを確認するため、下記のような兎の網状赤血球溶血
システム（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）を用いた無細胞タ
ンパク質合成系でタンパク質合成反応を行なった。ルシ
フェラーゼｍＲＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）、兎の
網状赤血球溶血物（ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ ｌｙｓ
ａｔｅ）、メチオニンが含まれないアミノ酸混合物およ
び35Ｓが標識されたメチオニンを含む反応混合物に組換
えタンパク質などの目的物質を添加して３０℃で９０分
間反応させた後、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なってタ
ンパク質を分画し、Ｘ−ｒａｙフィルムに自家放射して
タンパク質合成程度を検定した（図８参照）。図８にお
いて、第１レーンは目的物質として抗−ＦＬＡＧ Ｍ１
吸着ゲルクロマトグラフィ行いの際用いられた溶出用緩
衝溶液（ＰＢＳ／ＥＤＴＡ溶液）２．５μｌを添加した
場合、第２および第３レーンは組換えｇＰＩＰ５０タン
パク質の最終濃度が１００ｐＭおよび１０ｐＭになるよ
うにそれぞれ添加した場合、第４レーンは組換えｇＰＩ
Ｐ２タンパク質の最終濃度が１０ｐＭになるように添加
した場合、第５レーンはｐＦＬＡＧ−１TMで形質転換さ
れた大腸菌をＩＰＴＧ誘導過程下において培養して収得
した４００ｎｇの上澄液IIにルシフェラーゼｍＲＮＡを
添加しない場合、第６レーンはルシフェラーゼｍＲＮＡ
を添加した場合をそれぞれ表す。図８に示すように、組
換えタンパク質ｇＰＩＰ５０またはｇＰＩＰ２が添加さ
れない第１および第６レーンにおいてはほぼ６１ｋＤａ
のルシフェラーゼタンパク質が合成されたが、組換えタ
ンパク質ｇＰＩＰ５０が１００ｐＭ添加された第２レー
ンにおいてはタンパク質が全く合成されず、組換えタン
パク質ｇＰＩＰ５０およびｇＰＩＰ２タンパク質がそれ
ぞれ１０ｐＭ添加された第３および第４レーンにおいて
はタンパク質の合成が大きく阻害されることを確認する
ことができた。従って、純粋分離された組換えｇＰＩＰ
２およびｇＰＩＰ５０タンパク質がタンパク質合成を阻
害することを確認した。
【００３３】
【発明の効果】以上説明したように、本発明は韓国産フ
ィトラカ・インシュラリス・ナカイのゲノムＤＮＡから
分離した新規な抗ウィルス性タンパク質をコードしてい
るｇＰＩＰ２とｇＰＩＰ５０遺伝子、それらそれぞれか
ら翻訳されるアミノ酸配列を有するｇＰＩＰ２とｇＰＩ
Ｐ５０タンパク質およびこれらタンパク質を発現する組
換え微生物から組換えｇＰＩＰ２およびｇＰＩＰ５０タ
ンパク質を製造する方法を提供する。本発明のフィトラ
カ・インシュラリス・ナカイから分離した抗ウィルス性
ｇＰＩＰ２またはｇＰＩＰ５０遺伝子は、植物形質転換
を通じてウィルス抵抗性を帯びた有用植物体の製造に用
いられる。さらに、ｇＰＩＰ２またはｇＰＩＰ５０遺伝
子を含む発現ベクターで形質転換された微生物から量産
された組換えｇＰＩＰ２またはｇＰＩＰ５０タンパク質
は、植物のウィルス防除剤の有効成分に用いられるか、
ＡＩＤＳおよび癌治療に用いられる免疫結合体などの製
造に用いられる。
ィトラカ・インシュラリス・ナカイのゲノムＤＮＡから
分離した新規な抗ウィルス性タンパク質をコードしてい
るｇＰＩＰ２とｇＰＩＰ５０遺伝子、それらそれぞれか
ら翻訳されるアミノ酸配列を有するｇＰＩＰ２とｇＰＩ
Ｐ５０タンパク質およびこれらタンパク質を発現する組
換え微生物から組換えｇＰＩＰ２およびｇＰＩＰ５０タ
ンパク質を製造する方法を提供する。本発明のフィトラ
カ・インシュラリス・ナカイから分離した抗ウィルス性
ｇＰＩＰ２またはｇＰＩＰ５０遺伝子は、植物形質転換
を通じてウィルス抵抗性を帯びた有用植物体の製造に用
いられる。さらに、ｇＰＩＰ２またはｇＰＩＰ５０遺伝
子を含む発現ベクターで形質転換された微生物から量産
された組換えｇＰＩＰ２またはｇＰＩＰ５０タンパク質
は、植物のウィルス防除剤の有効成分に用いられるか、
ＡＩＤＳおよび癌治療に用いられる免疫結合体などの製
造に用いられる。
配列番号：１ 配列の長さ：８８２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 起源 生物名：フィトラカ・インシュラリス・ナカイ（Phytol
acca insularis Nakai) 直接の起源 ライブラリー名：genomic DNA library from Phytolacc
a insularis Nakai 配列： ATGGTGAATA CCATCATCTA CAATGTTGGA AGTACCACCA TTAGCAAATA 50 CGCCACTTTT CTGGATAATC TTCGTAATGA AGCAAAAGAT CCAAGTTTAA 100 AATGCTATGG AATACCAATG TTGCCCAATA CAAATCCAAA TCCAAAGTAC 150 GTGTTGGTTA AGCTCCAAGG TTCAAATGAA AAAACCATCA CACTAATGCT 200 GAGACGAAAC AATTTGTATG TGATGGGCTA TTCTGATCCC TTTGATACCA 250 ATAAGTGTCG TTACCATATC TTTAATGATA TCTCAGGTAC TGAACGCCAA 300 GATGTAGAGA CTACTCTTTG CCCAAATCCC AATTCTCGTG TTAGTAAAAA 350 CATAAACTAT GATAGTCGAT ATCCAACATT GGAATCAAAA GCGGGAGTAA 400 AATCAAGAAG TCAAGTTCAA CTGGGAATTC AAATACTCGA CAGTGACATT 450 GGAAAGATTT CTGGGGTGAC GTCATTCACT GAGAAAGTCG AAGCTGAATT 500 CCTACTGGTA GCCATACAAA TGGTATCAGA GGCAGCAAGA TTCAAGTACA 550 TAGAGAATCA GGTGAAAACG AATTTTAACA GAGCATTCAA CCCTAATCCC 600 AAAGTACTTA ATTTGGAAGA GACATGGGGT AAGATTTCTA CAGCAATTCA 650 TGATGCCAAG AATGGAGTTT TACCCAAACC TCTCGAGTTA GTGGATGCCA 700 GTGGTGCCAA TTGGATGGTG TTGAGAGTGG ATGATATCAA GCCTGATGTA 750 GCACTCTTAA ACTACGTTAG TGGGAGCTGC CAAACAAATT ATAACCAAAA 800 TGCCATGTTT CCTCAACTTA TAATGTCTAC TTATTATAAT TATATGGCTA 850 ATCATGGTGA TCAGTTTGAG GGTTTCTGAT CA 882 配列番号：２ 配列の長さ：２９２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列： Met Val Asn Thr Ile Ile Tyr Asn Val Gly Ser Thr Thr Ile 14 Ser Lys Tyr Ala Thr Phe Leu Asp Asn Leu Arg Asn Glu Ala 28 Lys Asp Pro Ser Leu Lys Cys Tyr Gly Ile Pro Met Leu Pro 42 Asn Thr Asn Pro Asn Pro Lys Tyr Val Leu Val Lys Leu Gln 56 Gly Ser Asn Glu Lys Thr Ile Thr Leu Met Leu Arg Arg Asn 70 Asn Leu Tyr Val Met Gly Tyr Ser Asp Pro Phe Asp Thr Asn 84 Lys Cys Arg Tyr His Ile Phe Asn Asp Ile Ser Gly Thr Glu 98 Arg Gln Asp Val Glu Thr Thr Leu Cys Pro Asn Pro Asn Ser 112 Arg Val Ser Lys Asn Ile Asn Tyr Asp Ser Arg Tyr Pro Thr 126 Leu Glu Ser Lys Ala Gly Val Lys Ser Arg Ser Gln Val Gln 140 Leu Gly Ile Gln Ile Leu Asp Ser Asp Ile Gly Lys Ile Ser 154 Gly Val Thr Ser Phe Thr Glu Lys Val Glu Ala Glu Phe Leu 168 Leu Val Ala Ile Gln Met Val Ser Glu Ala Ala Arg Phe Lys 182 Tyr Ile Glu Asn Gln Val Lys Thr Asn Phe Asn Arg Ala Phe 196 Asn Pro Asn Pro Lys Val Leu Asn Leu Glu Glu Thr Trp Gly 210 Lys Ile Ser Thr Ala Ile His Asp Ala Lys Asn Gly Val Leu 224 Pro Lys Pro Leu Glu Leu Val Asp Ala Ser Gly Ala Asn Trp 238 Ile Val Leu Arg Val Asp Asp Ile Lys Pro Asp Val Ala Leu 252 Leu Asn Tyr Val Ser Gly Ser Cys Gln Thr Asn Tyr Asn Gln 266 Asn Ala Met Phe Pro Gln Leu Ile Met Ser Thr Tyr Tyr Asn 280 Tyr Met Ala Asn His Gly Asp Gln Phe Glu Gly Phe 292 配列番号：３ 配列の長さ：９５１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 起源 生物名：フィトラカ・インシュラリス・ナカイ（Phytol
acca insularis Nakai) 直接の起源 ライブラリー名：genomic DNA library from Phytolacc
a insularis Nakai 配列： ATGAAGATGA TGGTTGTGCT TGTGATGACA ATAACAGCAT GGCTAATTTT 50 TGCACCAGCT TCAACTTGGG CCGCAAGTCC AAATCCAATC ACCTTCGAGG 100 TTGGAAATGC GACCATTAAC AAGTACGCCA CTTTTATGAA ATCTCTCCGT 150 GATCAAGCGA AAGATCCAAA TCTACAGTGC TATGGCATAC CAATGTTGCC 200 CAATACTAGT TTGACCCCCA AGTACTTGTT GGTTGCGCTC CAAGATTCAA 250 GTTTAAAAAC CATCACACTA ATGTTGAAGC GAAATAACTT GTATGTTATG 300 GGTTATGCTG ACACCTATAA TAACAAGTGT CGTTATCATA TATTTAAGGA 350 TATCTCAAAT ACTACTGAAC GAAATGATGT GATGACTACT CTTTGTCCAA 400 ATATGAGTTC TCGTGTTGGT AAAAATATTA GCTATGATAG CAGTTATCCA 450 GCATTGGAAA AGAAAGTAGG ACGATCAAGA AGTAAAGTCC AACTCGGAAT 500 TCAAATACTC AACAGTGATA TTGGAAAGAT CTATGGAGTG GATACAGTCA 550 ATGAGAAAAC CGAGGCCGAA TTCTTGCTAG TAGCCATCCA AATGGTACCA 600 GAGGCAACAA GATTCAAGTA CATAGAAAAT CAGGTGAAGA CTAATTTTAA 650 TAGGGCATTC TATCCTAATG CCAAAGTACT TAACTTGGAG GAAACATGGG 700 GTAAGATTTC TACAGCAATT CATGATGCTA AGAATGGAGC TTTAACCAAA 750 CCTCTGGAGC TCATAAATGA AGATGGTACT AAGTGGATAG TGTTGAGAGT 800 GGATGAAATC AAACCTGATG TGGGACTCCT TAACTACGTT GATGGGACCT 850 GTCAGACAAC TTACCAAAGT GACATGTTCC CTCAACGTAT AATGTCTACT 900 TATTATAATT ATATAGTTAA TCTTGGTGAT CAGTTTGAGG GTTTCTGATC 950 A 951 配列番号：４ 配列の長さ：３１５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列： Met Lys Met Met Val Val Leu Val Met Thr Ile Thr Ala Trp 14 Leu Ile Phe Ala Pro Ala Ser Thr Trp Ala Ala Ser Pro Asn 28 Pro Ile Thr Phe Glu Val Gly Asn Ala Thr Ile Asn Lys Tyr 42 Ala Thr Phe Met Lys Ser Leu Arg Asp Gln Ala Lys Asp Pro 56 Asn Leu Gln Cys Tyr Gly Ile Pro Met Leu Pro Asn Thr Ser 70 Leu Thr Pro Lys Tyr Leu Leu Val Ala Leu Gln Asp Ser Ser 84 Leu Lys Thr Ile Thr Leu Met Leu Lys Arg Asn Asn Leu Tyr 98 Val Met Gly Tyr Ala Asp Thr Tyr Asn Asn Lys Cys Arg Tyr 112 His Ile Phe Lys Asp Ile Ser Asn Thr Thr Glu Arg Asn Asp 126 Val Met Thr Thr Leu Cys Pro Asn Met Ser Ser Arg Val Gly 140 Lys Asn Ile Ser Tyr Asp Ser Ser Tyr Pro Ala Leu Glu Lys 154 Lys Val Gly Arg Ser Arg Ser Lys Val Gln Leu Gly Ile Gln 168 Ile Leu Asn Ser Asp Ile Gly Lys Ile Tyr Gly Val Asp Thr 182 Val Asn Glu Lys Thr Glu Ala Glu Phe Leu Leu Val Ala Ile 196 Gln Met Val Pro Glu Ala Thr Arg Phe Lys Tyr Ile Glu Asn 210 Gln Val Lys Thr Asn Phe Asn Arg Ala Phe Tyr Pro Asn Ala 224 Lys Val Leu Asn Leu Glu Glu Thr Trp Gly Lys Ile Ser Thr 238 Ala Ile His Asp Ala Lys Asn Gly Ala Leu Thr Lys Pro Leu 252 Glu Leu Ile Asn Glu Asp Gly Thr Lys Trp Ile Val Leu Arg 266 Val Asp Glu Ile Lys Pro Glu Val Gly Leu Leu Asn Tyr Val 280 Glu Gly Thr Cys Gln Thr Thr Tyr Gln Ser Glu Met Phe Pro 294 Gln Arg Ile Met Ser Thr Tyr Tyr Asn Tyr Ile Val Asn Leu 308 Gly Glu Gln Phe Glu Gly Phe 315 配列番号：５ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 直接の起源 クローン名：5' PRIMER 配列： CCAAGCTTGT GAATACCATC ATCTAC 16 配列番号：６ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 直接の起源 クローン名：3' PCR PRIMER 配列： GGAAGCTTTG ATCAGAAACC CTCAAA 16 配列番号：７ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 直接の起源 クローン名：5' PRIMER 配列： GTAGTATTGC CAAGACCGTT TATAAG 16 配列番号：８ 配列の長さ：１４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 直接の起源 クローン名：3' PRIMER 配列： GACATAGTCC GACTTTTAGA AGAG 14 配列番号：９ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 直接の起源 クローン名：5' PRIMER 配列： CCAAGCTTGC AAGTCCAAAT CCAATC 16
acca insularis Nakai) 直接の起源 ライブラリー名：genomic DNA library from Phytolacc
a insularis Nakai 配列： ATGGTGAATA CCATCATCTA CAATGTTGGA AGTACCACCA TTAGCAAATA 50 CGCCACTTTT CTGGATAATC TTCGTAATGA AGCAAAAGAT CCAAGTTTAA 100 AATGCTATGG AATACCAATG TTGCCCAATA CAAATCCAAA TCCAAAGTAC 150 GTGTTGGTTA AGCTCCAAGG TTCAAATGAA AAAACCATCA CACTAATGCT 200 GAGACGAAAC AATTTGTATG TGATGGGCTA TTCTGATCCC TTTGATACCA 250 ATAAGTGTCG TTACCATATC TTTAATGATA TCTCAGGTAC TGAACGCCAA 300 GATGTAGAGA CTACTCTTTG CCCAAATCCC AATTCTCGTG TTAGTAAAAA 350 CATAAACTAT GATAGTCGAT ATCCAACATT GGAATCAAAA GCGGGAGTAA 400 AATCAAGAAG TCAAGTTCAA CTGGGAATTC AAATACTCGA CAGTGACATT 450 GGAAAGATTT CTGGGGTGAC GTCATTCACT GAGAAAGTCG AAGCTGAATT 500 CCTACTGGTA GCCATACAAA TGGTATCAGA GGCAGCAAGA TTCAAGTACA 550 TAGAGAATCA GGTGAAAACG AATTTTAACA GAGCATTCAA CCCTAATCCC 600 AAAGTACTTA ATTTGGAAGA GACATGGGGT AAGATTTCTA CAGCAATTCA 650 TGATGCCAAG AATGGAGTTT TACCCAAACC TCTCGAGTTA GTGGATGCCA 700 GTGGTGCCAA TTGGATGGTG TTGAGAGTGG ATGATATCAA GCCTGATGTA 750 GCACTCTTAA ACTACGTTAG TGGGAGCTGC CAAACAAATT ATAACCAAAA 800 TGCCATGTTT CCTCAACTTA TAATGTCTAC TTATTATAAT TATATGGCTA 850 ATCATGGTGA TCAGTTTGAG GGTTTCTGAT CA 882 配列番号：２ 配列の長さ：２９２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列： Met Val Asn Thr Ile Ile Tyr Asn Val Gly Ser Thr Thr Ile 14 Ser Lys Tyr Ala Thr Phe Leu Asp Asn Leu Arg Asn Glu Ala 28 Lys Asp Pro Ser Leu Lys Cys Tyr Gly Ile Pro Met Leu Pro 42 Asn Thr Asn Pro Asn Pro Lys Tyr Val Leu Val Lys Leu Gln 56 Gly Ser Asn Glu Lys Thr Ile Thr Leu Met Leu Arg Arg Asn 70 Asn Leu Tyr Val Met Gly Tyr Ser Asp Pro Phe Asp Thr Asn 84 Lys Cys Arg Tyr His Ile Phe Asn Asp Ile Ser Gly Thr Glu 98 Arg Gln Asp Val Glu Thr Thr Leu Cys Pro Asn Pro Asn Ser 112 Arg Val Ser Lys Asn Ile Asn Tyr Asp Ser Arg Tyr Pro Thr 126 Leu Glu Ser Lys Ala Gly Val Lys Ser Arg Ser Gln Val Gln 140 Leu Gly Ile Gln Ile Leu Asp Ser Asp Ile Gly Lys Ile Ser 154 Gly Val Thr Ser Phe Thr Glu Lys Val Glu Ala Glu Phe Leu 168 Leu Val Ala Ile Gln Met Val Ser Glu Ala Ala Arg Phe Lys 182 Tyr Ile Glu Asn Gln Val Lys Thr Asn Phe Asn Arg Ala Phe 196 Asn Pro Asn Pro Lys Val Leu Asn Leu Glu Glu Thr Trp Gly 210 Lys Ile Ser Thr Ala Ile His Asp Ala Lys Asn Gly Val Leu 224 Pro Lys Pro Leu Glu Leu Val Asp Ala Ser Gly Ala Asn Trp 238 Ile Val Leu Arg Val Asp Asp Ile Lys Pro Asp Val Ala Leu 252 Leu Asn Tyr Val Ser Gly Ser Cys Gln Thr Asn Tyr Asn Gln 266 Asn Ala Met Phe Pro Gln Leu Ile Met Ser Thr Tyr Tyr Asn 280 Tyr Met Ala Asn His Gly Asp Gln Phe Glu Gly Phe 292 配列番号：３ 配列の長さ：９５１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 起源 生物名：フィトラカ・インシュラリス・ナカイ（Phytol
acca insularis Nakai) 直接の起源 ライブラリー名：genomic DNA library from Phytolacc
a insularis Nakai 配列： ATGAAGATGA TGGTTGTGCT TGTGATGACA ATAACAGCAT GGCTAATTTT 50 TGCACCAGCT TCAACTTGGG CCGCAAGTCC AAATCCAATC ACCTTCGAGG 100 TTGGAAATGC GACCATTAAC AAGTACGCCA CTTTTATGAA ATCTCTCCGT 150 GATCAAGCGA AAGATCCAAA TCTACAGTGC TATGGCATAC CAATGTTGCC 200 CAATACTAGT TTGACCCCCA AGTACTTGTT GGTTGCGCTC CAAGATTCAA 250 GTTTAAAAAC CATCACACTA ATGTTGAAGC GAAATAACTT GTATGTTATG 300 GGTTATGCTG ACACCTATAA TAACAAGTGT CGTTATCATA TATTTAAGGA 350 TATCTCAAAT ACTACTGAAC GAAATGATGT GATGACTACT CTTTGTCCAA 400 ATATGAGTTC TCGTGTTGGT AAAAATATTA GCTATGATAG CAGTTATCCA 450 GCATTGGAAA AGAAAGTAGG ACGATCAAGA AGTAAAGTCC AACTCGGAAT 500 TCAAATACTC AACAGTGATA TTGGAAAGAT CTATGGAGTG GATACAGTCA 550 ATGAGAAAAC CGAGGCCGAA TTCTTGCTAG TAGCCATCCA AATGGTACCA 600 GAGGCAACAA GATTCAAGTA CATAGAAAAT CAGGTGAAGA CTAATTTTAA 650 TAGGGCATTC TATCCTAATG CCAAAGTACT TAACTTGGAG GAAACATGGG 700 GTAAGATTTC TACAGCAATT CATGATGCTA AGAATGGAGC TTTAACCAAA 750 CCTCTGGAGC TCATAAATGA AGATGGTACT AAGTGGATAG TGTTGAGAGT 800 GGATGAAATC AAACCTGATG TGGGACTCCT TAACTACGTT GATGGGACCT 850 GTCAGACAAC TTACCAAAGT GACATGTTCC CTCAACGTAT AATGTCTACT 900 TATTATAATT ATATAGTTAA TCTTGGTGAT CAGTTTGAGG GTTTCTGATC 950 A 951 配列番号：４ 配列の長さ：３１５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列： Met Lys Met Met Val Val Leu Val Met Thr Ile Thr Ala Trp 14 Leu Ile Phe Ala Pro Ala Ser Thr Trp Ala Ala Ser Pro Asn 28 Pro Ile Thr Phe Glu Val Gly Asn Ala Thr Ile Asn Lys Tyr 42 Ala Thr Phe Met Lys Ser Leu Arg Asp Gln Ala Lys Asp Pro 56 Asn Leu Gln Cys Tyr Gly Ile Pro Met Leu Pro Asn Thr Ser 70 Leu Thr Pro Lys Tyr Leu Leu Val Ala Leu Gln Asp Ser Ser 84 Leu Lys Thr Ile Thr Leu Met Leu Lys Arg Asn Asn Leu Tyr 98 Val Met Gly Tyr Ala Asp Thr Tyr Asn Asn Lys Cys Arg Tyr 112 His Ile Phe Lys Asp Ile Ser Asn Thr Thr Glu Arg Asn Asp 126 Val Met Thr Thr Leu Cys Pro Asn Met Ser Ser Arg Val Gly 140 Lys Asn Ile Ser Tyr Asp Ser Ser Tyr Pro Ala Leu Glu Lys 154 Lys Val Gly Arg Ser Arg Ser Lys Val Gln Leu Gly Ile Gln 168 Ile Leu Asn Ser Asp Ile Gly Lys Ile Tyr Gly Val Asp Thr 182 Val Asn Glu Lys Thr Glu Ala Glu Phe Leu Leu Val Ala Ile 196 Gln Met Val Pro Glu Ala Thr Arg Phe Lys Tyr Ile Glu Asn 210 Gln Val Lys Thr Asn Phe Asn Arg Ala Phe Tyr Pro Asn Ala 224 Lys Val Leu Asn Leu Glu Glu Thr Trp Gly Lys Ile Ser Thr 238 Ala Ile His Asp Ala Lys Asn Gly Ala Leu Thr Lys Pro Leu 252 Glu Leu Ile Asn Glu Asp Gly Thr Lys Trp Ile Val Leu Arg 266 Val Asp Glu Ile Lys Pro Glu Val Gly Leu Leu Asn Tyr Val 280 Glu Gly Thr Cys Gln Thr Thr Tyr Gln Ser Glu Met Phe Pro 294 Gln Arg Ile Met Ser Thr Tyr Tyr Asn Tyr Ile Val Asn Leu 308 Gly Glu Gln Phe Glu Gly Phe 315 配列番号：５ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 直接の起源 クローン名：5' PRIMER 配列： CCAAGCTTGT GAATACCATC ATCTAC 16 配列番号：６ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 直接の起源 クローン名：3' PCR PRIMER 配列： GGAAGCTTTG ATCAGAAACC CTCAAA 16 配列番号：７ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 直接の起源 クローン名：5' PRIMER 配列： GTAGTATTGC CAAGACCGTT TATAAG 16 配列番号：８ 配列の長さ：１４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 直接の起源 クローン名：3' PRIMER 配列： GACATAGTCC GACTTTTAGA AGAG 14 配列番号：９ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 直接の起源 クローン名：5' PRIMER 配列： CCAAGCTTGC AAGTCCAAAT CCAATC 16
【図１】本発明のｇＰＩＰ２遺伝子の塩基配列およびそ
れから翻訳されるアミノ酸配列を示す。
れから翻訳されるアミノ酸配列を示す。
【図２】フィトラカ・インシュラリス・ナカイ（Ｐｈｙ
ｔｏｌａｃｃａ ｉｎｓｕｌａｒｉｓ Ｎａｋａｉ）の
ゲノムＤＮＡからｇＰＩＰ２遺伝子を分離し、それを含
む発現ベクターの構築過程を示す概略図である。
ｔｏｌａｃｃａ ｉｎｓｕｌａｒｉｓ Ｎａｋａｉ）の
ゲノムＤＮＡからｇＰＩＰ２遺伝子を分離し、それを含
む発現ベクターの構築過程を示す概略図である。
【図３】ｇＰＩＰ２またはｇＰＩＰ５０遺伝子を含む発
現ベクターを制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断しアガロース
ゲル電気泳動した結果を示す写真である。
現ベクターを制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断しアガロース
ゲル電気泳動した結果を示す写真である。
【図４】フィトラカ・インシュラリス・ナカイのゲノム
ジーンバンクの中で５０番クローンから分離したファー
ジＤＮＡをＳａｃＩまたはＸｈｏＩで切断し、それを１
％アガロースゲル電気泳動およびサザンハイブリダイゼ
ーションを行った結果を示す写真である。
ジーンバンクの中で５０番クローンから分離したファー
ジＤＮＡをＳａｃＩまたはＸｈｏＩで切断し、それを１
％アガロースゲル電気泳動およびサザンハイブリダイゼ
ーションを行った結果を示す写真である。
【図５】本発明のｇＰＩＰ５０遺伝子の塩基配列および
それから翻訳されるアミノ酸配列を示す。
それから翻訳されるアミノ酸配列を示す。
【図６】プラスミドｐＰＩＰ５０の３．４ｋｂ Ｂａｍ
ＨＩ断片からｇＰＩＰ５０遺伝子をＰＣＲ増幅し、それ
を含む発現ベクターの構築過程を示す概略図である。
ＨＩ断片からｇＰＩＰ５０遺伝子をＰＣＲ増幅し、それ
を含む発現ベクターの構築過程を示す概略図である。
【図７】ｇＰＩＰ２またはｇＰＩＰ５０遺伝子を含む発
現ベクターで形質転換された大腸菌を破砕して収得した
上澄液と封入体の総タンパク質および純粋な組換えｇＰ
ＩＰ２とｇＰＩＰ５０タンパク質を１５％ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥした結果を示す電気泳動写真である。
現ベクターで形質転換された大腸菌を破砕して収得した
上澄液と封入体の総タンパク質および純粋な組換えｇＰ
ＩＰ２とｇＰＩＰ５０タンパク質を１５％ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥした結果を示す電気泳動写真である。
【図８】組換え大腸菌から純粋分離したｇＰＩＰ２また
はｇＰＩＰ５０タンパク質を無細胞タンパク質合成系に
添加したとき（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｌａｔｉ
ｏｎ ａｓｓａｙ）、タンパク質合成の阻害結果を示す
電気泳動写真である。
はｇＰＩＰ５０タンパク質を無細胞タンパク質合成系に
添加したとき（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｌａｔｉ
ｏｎ ａｓｓａｙ）、タンパク質合成の阻害結果を示す
電気泳動写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ０１Ｎ 63/00 Ａ０１Ｎ 63/00 Ａ 65/00 65/00 Ａ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 尹瑛▲さい▼ 大韓民国京畿道水原市長安區花西洞花西住 公アパート 41棟301號 (72)発明者 陳延勲 大韓民国京畿道水原市八逹區牛満１洞現代 ビラ11棟 301號 (72)発明者 洪銀珠 大韓民国京畿道龍仁市器興邑▲ぐ▼葛里 408−５號 (72)発明者 李正鎬 大韓民国京畿道龍仁市駒城面中里261−２ 韓林ビラ 402號 (72)発明者 崔奎煥 大韓民国京畿道抱川郡和懸面流動里一同病 院アパート 105號 (72)発明者 李鍾燮 大韓民国ソウル特別市瑞草區蠶院洞蠶院 韓新グリンアパートＡ棟1404號 (72)発明者 宋庠基 大韓民国ソウル特別市江南區狎鴎亭洞漢陽 アパート３棟 406號 (72)発明者 崔良▲とう▼ 大韓民国ソウル特別市瑞草區蠶院洞新盤浦 アパート 301棟907號 (72)発明者 金哲煥 大韓民国ソウル特別市瑞草區盤浦本洞盤浦 アパート 98棟110號 (72)発明者 金萬根 大韓民国ソウル特別市永登浦區文來洞菊花 アパート ２棟1007號
Claims (12)
- 【請求項１】 韓国産フィトラカ・インシュラリス・ナ
カイのゲノムＤＮＡから分離した抗ウィルス性タンパク
質をコード化する下記のｇＰＩＰ２遺伝子およびその機
能的等価物。 【化１】 - 【請求項２】 請求項１記載の遺伝子から翻訳される下
記のようなアミノ酸配列またはこれと機能的に同等なア
ミノ酸配列を有する抗ウィルス性ｇＰＩＰ２タンパク
質。 【化２】 - 【請求項３】 抗−ＦＬＡＧモノクローナル抗体の結合
とエンテロキナーゼ切断に関与するオクタペプチドのＦ
ＬＡＧ配列およびコーディング配列の挿入に関与する多
重クローニング部位のマーカーを含むベクターに、請求
項１記載のｇＰＩＰ２遺伝子を挿入して製造した発現ベ
クター。 - 【請求項４】 請求項３記載の発現ベクターで形質転換
された大腸菌（Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ ｃｏｌｉ）ＸＬ１
−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’ｇＰＩＰ２（ＫＣＣＭ−１００８
０）。 - 【請求項５】 （ａ）請求項４記載の形質転換された微
生物を培養し、ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ
−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）に抗ウィルス性組
換えｇＰＩＰ２タンパク質の発現を誘導する工程； （ｂ）前記において発現誘導された微生物を収得し破砕
して封入体を収得する工程；および、 （ｃ）前記において収得した封入体から組換えｇＰＩＰ
２タンパク質を分離する工程を含む抗ウィルス性組換え
ｇＰＩＰ２タンパク質の製造方法。 - 【請求項６】 請求項５記載の製造方法により製造され
た抗ウィルス性組換えｇＰＩＰ２タンパク質。 - 【請求項７】 韓国産フィトラカ・インシュラリス・ナ
カイのゲノムＤＮＡから分離した抗ウィルス性タンパク
質をコード化する下記のｇＰＩＰ５０遺伝子およびその
機能的等価物。 【化３】 - 【請求項８】 請求項７記載の遺伝子から翻訳される下
記のようなアミノ酸配列またはこれと機能的に同等なア
ミノ酸配列を有する抗ウィルス性ｇＰＩＰ５０タンパク
質。 【化４】 - 【請求項９】 抗−ＦＬＡＧモノクローナル抗体の結合
とエンテロキナーゼ切断に関与するオクタペプチドのＦ
ＬＡＧ配列およびコーディング配列の挿入に関与する多
重クローニング部位のマーカーを含むベクターに、請求
項７記載のｇＰＩＰ５０遺伝子を挿入して製造した発現
ベクター。 - 【請求項１０】 請求項９記載の発現ベクターで形質転
換された大腸菌（Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ ｃｏｌｉ）ＸＬ
１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’ｇＰＩＰ５０（ＫＣＣＭ−１０
０８１）。 - 【請求項１１】 （ａ）請求項１０記載の形質転換され
た微生物を培養し、ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β
−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）に抗ウィルス
性組換えｇＰＩＰ５０タンパク質の発現を誘導する工
程； （ｂ）前記において発現誘導された微生物を収得し破砕
して封入体を収得する工程；および、 （ｃ）前記において収得した封入体から組換えｇＰＩＰ
５０タンパク質を分離する工程を含む抗ウィルス性組換
えｇＰＩＰ５０タンパク質の製造方法。 - 【請求項１２】 請求項１１記載の製造方法により製造
された抗ウィルス性組換えｇＰＩＰ５０タンパク質。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR96-17404 | 1996-05-22 | ||
| KR1019960017404A KR970074934A (ko) | 1996-05-22 | 1996-05-22 | 섬자리공 항바이러스성 단백질의 신규한 유전자 및 그를 발현하는 재조합 미생물 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09308489A true JPH09308489A (ja) | 1997-12-02 |
Family
ID=19459451
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8320145A Pending JPH09308489A (ja) | 1996-05-22 | 1996-11-29 | フィトラカ・インシュラリス・ナカイ由来の抗ウィルス性タンパク質の新規な遺伝子およびこれを発現する組換え微生物 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0808902A3 (ja) |
| JP (1) | JPH09308489A (ja) |
| KR (1) | KR970074934A (ja) |
| AU (1) | AU6570696A (ja) |
| CA (1) | CA2186303A1 (ja) |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05137580A (ja) * | 1991-11-20 | 1993-06-01 | Japan Tobacco Inc | 新規なプロテインおよびそれをコードする遺伝子 |
| KR950012900B1 (ko) * | 1992-08-19 | 1995-10-23 | 주식회사진로 | 항바이러스성 단백질 발현벡터와 이것으로 형질전환된 식물체의 제조방법 |
| FR2699553B1 (fr) * | 1992-12-09 | 2002-10-11 | Innotherapie Lab Sa | Procédé d'obtention de mutants de protéines inactivant les ribosomes, gènes mutants ainsi obtenus et leurs applications. |
| KR960015747B1 (ko) * | 1993-07-02 | 1996-11-20 | 주식회사 진로 | 양자리공의 항바이러스성 단백질(pap)을 발현하는 미생물 |
| KR970001565B1 (ko) * | 1993-08-28 | 1997-02-11 | 장기하 | 섬자리공 항바이러스성 단백질(pip) 유전자 및 이를 발현하는 미생물 |
| KR970007864B1 (ko) * | 1994-07-21 | 1997-05-17 | 진로 주식회사 | 섬자리공의 항바이러스성 단백질(pip)을 발현하는 식물체의 제조방법 |
-
1996
- 1996-05-22 KR KR1019960017404A patent/KR970074934A/ko not_active Application Discontinuation
- 1996-09-19 AU AU65706/96A patent/AU6570696A/en not_active Abandoned
- 1996-09-24 CA CA002186303A patent/CA2186303A1/en not_active Abandoned
- 1996-09-30 EP EP96307159A patent/EP0808902A3/en not_active Withdrawn
- 1996-11-29 JP JP8320145A patent/JPH09308489A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2186303A1 (en) | 1997-11-23 |
| EP0808902A3 (en) | 1998-02-04 |
| KR970074934A (ko) | 1997-12-10 |
| EP0808902A2 (en) | 1997-11-26 |
| AU6570696A (en) | 1997-11-27 |
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