KR950012900B1 - 항바이러스성 단백질 발현벡터와 이것으로 형질전환된 식물체의 제조방법 - Google Patents

항바이러스성 단백질 발현벡터와 이것으로 형질전환된 식물체의 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR950012900B1
KR950012900B1 KR1019920014895A KR920014895A KR950012900B1 KR 950012900 B1 KR950012900 B1 KR 950012900B1 KR 1019920014895 A KR1019920014895 A KR 1019920014895A KR 920014895 A KR920014895 A KR 920014895A KR 950012900 B1 KR950012900 B1 KR 950012900B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
pap
gene
plant
tobacco
transformed
Prior art date
Application number
KR1019920014895A
Other languages
English (en)
Other versions
KR940004056A (ko
Inventor
김만근
이관호
나병국
정한승
최규환
문영호
전홍섭
Original Assignee
주식회사진로
장기화
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사진로, 장기화 filed Critical 주식회사진로
Priority to KR1019920014895A priority Critical patent/KR950012900B1/ko
Priority to JP5128222A priority patent/JP2522151B2/ja
Priority to DE69306067T priority patent/DE69306067T2/de
Priority to EP93110445A priority patent/EP0585554B1/en
Publication of KR940004056A publication Critical patent/KR940004056A/ko
Priority to US08/373,858 priority patent/US5633155A/en
Application granted granted Critical
Publication of KR950012900B1 publication Critical patent/KR950012900B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8283—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for virus resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

내용 없음.

Description

항바이러스성 단백질 발현벡터와 이것으로 형질전환된 식물체의 제조방법
제 1 도는 cDNA 라이브러리로부터 순수분리한 PAP 유전자의 완전한 염기서열을 나타내고,
제 2 도는 발현벡터 pJRM100을 제조하는 일련의 순서를 도식화한 그림이며,
제 3 도는 발현벡터 pJRM100을 제한효소로 처리하여 아가로스 겔 전기영동한 결과를 나타내는 사진이며,
제 4 도는 발현벡터 pJRM100을 이용한 담배세포의 형질전환 과정을 순서대로 보여주고 있으며,
제 5 도는 형질전환된 담배로부터 전체 단백질을 분리하고 anti-PAP항체를 이용하여 면역확산 측정법(immunodiffusion assay)을 수행한 결과를 나타내며,
제 6 도는 항바이러스성 단백질 유전자를 도입시킨 담배로부터 분리한 DNA를 BamH I 제한효소로 절단하여 서던(Southern) 분석을 한 결과를 나타내며,
제 7 도는 항바이러스성 단백질 유전자를 도입시킨 담배로부터 분리한 전체 RNA를 분리하여 노턴(Northern) 분석을 한 결과를 나타내며,
제 8 도는 형질전환된 담배의 국부손상 측정법(local lesion assay)을 나타낸다.
본 발명은 항바이러스성 단백질 발현벡터와 이것으로 형질전환된 식물의 제조방법에 관한 것이다. 좀더 구체적으로, 본 발명은 양자리공(Phytolacca americana L.)에서 발현되는 항바이러스성 단백질이 PAP(phytolacca anti-viral protein) 유전자를 cDNA 라이브러리로부터 순수분리하여 재조합 유전자를 제조한후, 식물 세포내로 도입하여 발현시키는 방법에 관한 것이다.
대부분의 식물들은 환경에 적응하면서 침입하는 바이러스에 대한 나름대로의 방어기작을 지니고 있다. 특히 양자리공에서는 항바이러스성 단백질을 발현시켜서 여러 바이러스의 침입으로부터 자신을 보호하는 것으로 알려져 있다. 양자리공의 항바이러스성 단백질에 대한 연구는 양자리공의 잎추출액에서 생체내의 폴리펩타이드 합성(polypeptide synthesis)을 저해하는 물질이 있음이 밝혀지면서 이루어졌다[참조 : Owens, R.A. et al., Virology, 56, 390-393(1973)]. 그후 PAP는 봄에 주로 발현되는 PAP-I, 여름에 많이 생성되는 PAP-II, 그리고 종자에서만 발현되는 PAP-S로 대별되는 단백질이 분리되었다[참조 : Irvin, J.D. et al., Arch. Biochem. Biophys., 169, 522-528(1975) ; Irvin, J.D. et al., Arch. Biochem. Biophys., 200, 418-425(1980) ; Barbieri. I. et a1., Biochem. J., 203, 55-59(1982)].
PAP가 순수하게 분리되어 분자수준에서의 세포내 기작에 대한 연구가 진행된 결과, 다른 라이보좀 불활성화 단백질들(ribosome-Inactivating proteins : RIPs)처럼 진핵생물의 60S 리보좀 서브유닛(RIBOSOMAL SUBUNIT)을 불활성화 하는 작용을 하는 것으로 알려졌다[참조 : Houston, L.L. et al., J. Biol. Chem., 258, 9601-9604(1983)]. 또한 PAP는 세포내에서 합성되어 세포 밖으로 전달되는 단백질로서 바이러스가 침입하면 이들과 함께 유입되어 바이러스의 억제에 관여하는 것으로 알려지고 있으나[참조 : Ready, M.P. etal., Proc. Natl. Acad. Sci., 83, 5053-5056(1986)]. 이들의 세포내에서의 정확한 기작과 바이러스의 저해작용에 대한 정확한 정보는 아직도 알려져 있지 않다.
최근에 들어서는 PAP를 암호화하고 있는 유전자의 염기서열이 밝혀지고 [참조 : Lin, Q. et al., PlantMol. Biol., 17, 609-614(1991)]. PAP 유전자체(multigene fami1y)로 존재함이 알려짐에 따라, 이 유전자의 발현기작 및 정확한 세포내에서의 기작의 규명에 박차를 가하고 있는 실정이며, 또한 PAP 유전자를 이용한 식물체의 형질전환에도 관심이 고조되고 있다.
따라서, 본 발명의 첫번째 목적은 양자리공의 cDNA 라이브러리로 부터 순수분리한 PAP 유전자를 식물세포로 유전자를 운반하는 적당한 벡터에 삽입하여 식물세포를 형질전환시키기에 적합한 재조합 벡터를 제공하는데 있다.
또한, 본 발명은 상기의 재조합 벡터로 형질전환되어 세포에서 항바이러스성 단백질인 PAP를 생성하는 식물체를 제조하는 방법을 제공하여, 바이러스에 내성이 약한 식물을 바이러스에 내성이 있는 식물로 형질전환하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명을 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.
PAP 유전자를 순수분리하기 위하여 양자리공의 잎으로부터 mRNA를 분리하여 정제하고 이로부터 cDNA 라이브러리(library)를 제조한 다음, 제조한 anti-PAP 항체를 이용하여 면역검색법(Immuno-screening)으로 PAP 유전자를 순수분리 한다. 분리 한 PAP 유전자를 Erase-a-Base system(Promega사 제품)을 이용하여 결실변이체(deletion mutant)들을 만들고, 이들 각각에 대하여 생거(Sanger)의 디데옥시사슬 종결방법(dideoxy chain termination)으로 전체 염기서열을 결정한다[참조 : Sanger.F., Science, 214, 1205-1210(1981)].
분리한 PAP 유전자를 식물체에서 발현시키기 위하여 PAP 유전자의 5'부위를 번역시작점인 ATG앞까지 결실시켜 BamHⅠ링커(linker)와 연결(ligation)하며, 3'부위는 HindⅢ로 절단하여 클레노우 절편(Klenow's fragment)을 처리하고 BamHⅠ 링커와 함께 연결시킨다. 이원벡터(binary vector)인 pBⅡI21(Clonetech사 제품, Lot # 6019-2)의 BamHⅠ 절편을 연결시켜 식물체의 형질전환에 사용할 벡터 pJRM100을 완성한다. 이 벡터는 1992년 8월 7일 한국과학기술연구원 부설 유전공학연구소(KCTC)에 기탁번호(KCTC 0052BP)로 기탁되었다.
PAP 유전자를 식물체에서 발현시키기 위하여 pJRM100을 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens LBA 4404)로 도입하고, 이 아그로박테리움으로 식물세포를 형질전환한다. 형질전환된 식물세포는 200μg/ml 카나마이신(kanamycin)과 500μg/ml 카베니실린(carbenicillin)이 함유된 슈트(shoot) 유도 MS 선택 배지에서 슈트를 유도한다. 유도된 슈트를 MS 선택배지에 치상하여 뿌리를 유도하고, 뿌리가 유도된 식물을 포트에 옮겨 순화시키고 계속 생육시킨다. 식물세포로 도입된 PAP 유전자가 발현되는지의 여부를 검정하기 위하여 anti-PAP 항체를 이용하여 면역확산측정법(immunodiffusion assay)을 수행한다. 또한 서던 블롯(Southern blot) 방법으로 PAP 유전자가 도입되었는지의 여부를 검정하고, 노던 블롯(Northern blot) 방법으로 PAP 유전자가 전사되는지의 여부를 확인한다. 형질전환된 식물체를 국부손상측정법(local lesion assay)을 수행하여 바이러스에 대한 내성을 검정한다.
이하 본 발명을 다음 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명하기로 한다. 하기 실시예는 본 발명의 설명을 위해 제공되는 것일 뿐이고, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
[실시예 1]
PAP 유전자의 분리
순수정제된 PAP를 어빈(Irvin)의 방법[참조 J.D. Irvin, J.D. et al., Arch. Biochem. Biophys., 169, 522-528(1795)]에 따라 수득하며, 정제된 480μg PAP를 PBS 용액에 용해시켜 퓨루엔드의 완전 보조제(Freund's complete adjuvant)와 동량으로 혼합하여 약 3kg의 토끼에 근육주사하였다. 3주 후에 소량의 혈액을 채취하여 항체 형성여부를 확인한 후, 순수하게 정제된 750μg PAP를 동량의 불완전 보조제(incomplete adjuvant)와 혼합하여 부스팅(boosting)시켰다. 이로부터 약 1주 후에 채혈하여 혈장을 분리하고, Protein-A 아가로스 컬럼 크로마토그래피(Protein-A agarose column chromatography)에 의하여 항혈청을 분리, 정제하였다. 이때 항체의 형성여부는 면역확산법으로, 순수분리 정도는 전기영동법으로 확인하였다. 순수분리한 PAP 항체는 cDNA 라이브러러에서 PAP 유전자를 분리하기 위하여 -70℃에 보관하여 사용하였다.
양자리공의 잎에서부터 mRNA를 분리하기 위하여 엽조직을 액체질소를 이용하여 마쇄한 다음, RNA 추출용 완충액을 첨가하여 원심분리하였다. 상동액을 취하여 LICl를 이용하여 침전시켜서 총 RNA를 분리하였다. 이렇게 분리된 총 RNA를 올리고(dT) 셀룰로스 컬럼(oligo(dT) cellulose column)을 이용하여 mRNA를 분리하고 정제하였으며, 분리한 mRNA 양은 정량하여 DNA 합성에 사용하였다.
양자리공의 업조직에서 분리하고 정제된 mRNA로부터 M-MuLV 역전사 효소를 이용하여 첫번째 가닥(1st strand)의 DNA를 합성하고 대장균 DNA 합성효소(E. coli DNA polymerase)로 두번째 가닥(2nd strand)을 합성하였다. 합성된 cDNA에 EcoRⅠ 어댑터(adapter)를 붙인 후 세파크릴 S-400 스펀컬럼(Sephacryl S-400 spun column)으로 합성된 cDNA의 크기에 따라 분획하였다. 분획된 cDNA를 Uni-Zap XR vector(Stratagence Co.사 제품, U.K.)에 결합시킨 후, 패키징 익스트랙트(packaging extranct)를 사용하여 실험실 조건에서의 패키징(in vitro packaging)을 수행하였다. 제조된 cDNA 라이브러리는 면역확산법에 사용하였다.
제조된 cDNA 라이브러리로부터 PAP 유전자를 분리하기 위하여 제조된 anti-PAP 항체를 이용하여 면역검색법을 수행하였다. 먼저 82-mm 페트리 디쉬(petri dish)에 약 2×104pfu의 플라크(plaque)가 형성되도록 형질전환 가능한(competent) 대장균(E. coli)인 XL1-Blue에 파아지(phage)를 감염(infection)시켰다. 37℃에서 15분간 배양한 후 3ml의 톱 아가(top agarose)와 섞어 도포한 뒤 42℃에서 3.5시간 배양하였다. 배양된 플레이트(plate)에 Hybond-N+(Amersham사 제품)을 위에 얹어서 5시간 더 배양하였다. 배양후 Hybond-N+을 소혈청 알부민(bovine serum albumin)으로 봉쇄(blocking)하고 5μg/ml anti-PAP 항체를 처리하였다. PAP와 결합하지 않은 Anti-PAP 항체를 제거한 후, 퍼옥시다제 보족 2차 항체(peroxidase conjugated 2nd antibody)를 anti-PAP 항체에 부착시키고 클로로나프톨(chloronaphtol)로 발색시켜 항원-항체 복합체를 확인하였다.
1차 면역검색법으로 얻은 클론(colne)중 15개의 클론을 2차 면역검색법에 사용하였다. 2차 면역검색법은 위와 같은 방법으로 수행하였으나 플라크 수를 5×103pfu로 조정하여 수행하였다. 2차 면역검색법으로부터 얻은 클론을 취하여 3차 면역검색법을 수행하였다. 순수하게 분리된 8개의 플라크를 취하여 다음의 실험을 수행하였다.
3차 면역검색법으로부터 얻은 8개의 재조합 Uni-ZAP XR 파아지들이 지니고 있는 파아지미드(phagemid)를 대장균 균주인 XL1-Blue로 옮기기 위하여, R408 헬퍼파아지(helper phage)을 이용하여 생체내 절단(in vivo excision)을 수행하였으며, 생성된 콜로니(colony)들를 각각 4개씩 선별하여 알칼리변성방법[참조 : Maniatis et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, PP 368-369, Cold Spring Harbor Laboratory(1982)]으로 플라스미드를 분리하고 여러 제한효소로 절단하여 PAP 유전자를 지니고 있는 클로니를 선별하였다.
순수분리된 콜론 중 2개의 클론으로부터 플라스미드를 분리하여 디데옥시 사슬 종결방법으로 PAPc DNA 삽입체(insert)의 염기서열을 결정하였다. PAP 유전자의 완전한 염기서열을 결정하기 위하여 cDNA 라이브러리로부터 분리한 PAP 유전자를 지니고 있는 균주를 배양하여 DNA를 순수분리하였다. 분리한 DNA Sac II와 BamH I 으로 이중절단하고 Erase-a-Base system(Promega사 제품, U.S.A.)을 이용하여 Exo III를 시간별로 처리하여 결실(deletion)을 수행하였다. 결실된 DNA를 T4 DNA 연결효소(ligase)로 연결하여 CaCl2용액으로 제조한 형질전환 능력을 지닌 XL1-BLUE 균주에 형질전환하였다. 생성된 결실변이체(deletion mutant)들을 염기서열을 결정에 사용하기 위하여 적당한 크기별로 분리하여 염기서열을 결정하였다.
PAP 유전자의 염기서열은 알칼리 변성방법으로 한가닥(single strand)을 만들고 프라이머(primer)로는 T7 촉진 유전자 프라이머(promoter primer) 또는 유니버셜 역 프라이머(universal reverse primer)를 사용하여 SEQUENASE VERSION 2.0(United States Biochemical사 제품 U.S.A.)으로 전체 염기서열을 결정하였다. 그 결과는 제 1 도에 나타내었는데, PAP 유전자는 크기가 1195bp로 이루어진 하나의 개방해독틀(open reading frame)로 되어 있다. 염기서열로부터 PAP의 cDNA 삽입체는 313개의 아미노산을 코딩(coding)하고 있음을 알 수 있었으며, 그중 22개 아미노산은 신호서열(signal peptide)로 작용하는 것으로 확인되었다. 대부분의 식물이나 동물의 mRNA에서 볼 수 있는 폴리아데닐레이션 시그널(polyadenylation signal : AATAAA)이 폴리아데닐레이션 부위(polyadenylation site)에서 17bp위에 있음을 볼 수 있었다. 현재까지 알려진 리보솜 비활성화 단백질(ribosome-inactivating protein, RIP : Abrin A. Luffin-a, MAP. Ricin A., Trichosanthin 그리고 SO6)에서 볼 수 있는 아미노산 서열이 분리한 PAP 유전자에서도 존재함을 알 수 있으며 (Ile-Gln-Met-Val-Ser-Glu-Ala-Arg-Phe-Lys-Tyr-Ile), 이 부위가 RIP가 효소적 활성을 나타내는 활성부위로 알려져 있다. 이 결과도 제 1 도에 나타내었다.
PAP 유전자가 양자리공에서 어떻게 존재하는가 알아보기 위하여 서던 블롯(Southern blot) 분석을 수행하였다. 양자리공으로부터 전체 DNA를 추출하고 Hind III와 EcoR I으로 절단하여 0.8(v/w)% 아가로스겔(agarosegel) 전기영동을 한 후, Hybond-N+로 DNA를 옮기고 분리한 PAP cDNA 삽입체의 0.25kb EooR I 절편을 프로브로 사용하여 혼성화 반응을 수행하였다. 프로브는 닉 트랜스레이션 키트(nicktranslation kit : Promega사 제품 U.S.A.)를 사용하여 제조하였으며, 프로브(probe)의 표지는 α-32P) dATP를 사용하여 표지하였다.
노던 블롯(Northern blot) 분석을 양자리공의 poly(A)+ mRNA를 10(v/v)% 포름알데히드(formalde-hyde)가 함유된 1(v/w)% 아가로스 겔에서 전기영동한 후 Hybond-N+로 RNA를 옮기고 서던 블롯 분석에서 사용한 0.52kb EcoR I 절편을 사용하여 혼성화 반응을 수행하였다.
[실시예 2]
PAP 유전자의 5'부위와 3' 부위의 조작
분리한 PAP 유전자를 CaMV 35S 촉진 유전자에서 발현시키기 위하여 PAP 유전자의 5'부위를 번역시작점인 ATG앞까지 결실을 하여야 하는데, 이 조작은 먼저 Sac II와 BamH I으로 이중절단하고 Exo III를 처리하여 30℃에서 10초간 결실시킨 후, S1헥산가수분해효소(nuclease)를 처리하여 약 30bp 정도 결실된 DNA BamH I 링커와 섞어 T4 DNA 연결효소로 연결하여 형질전환 능력이 있는 XL1-BLUE 균주에 형질전환시켰다. 생성된 콜로니를 선별하고 정확한 종말점을 알아보기 위하여 염기서열을 결정하였다. 적당하게 결실된 DNA를 선택하여 다음의 실험에 사용하였다. PAP 유전자의 3'부위를 노팔린 합성효소 종결인자(nopaline synthase terminator ; Nos terminator)와 결합하기 위하여 이 유전자를 HInd III로 절단한 후 클레노우 단편(Klenow's fragment)을 처리하고 BamH I 링커와 함께 연결하여 원하는 DNA를 선별하였다.
[실시예 3]
이원벡터(binary vector) pBI121의 조작 및 발현벡터 pJRm100의 제조
이원벡터 pBI121(Clonetech사 제품, Lot. #6019-2)에 조작된 PAP 유전자의 1.0kb BamH I 절편을 콜로닝하기 위하여, Nos 종결인자(terminator) 부위에 있는 Sst I 제한효소 절단부위를 BamH I로 치환하였다. 이를 위하여 pBI121을 Sst I으로 절단하고 클레노우 단편을 처리한 후, BamH I 링커와 함께 연결하여 원하는 DNA를 선별하였다. 조작된 PAP 유전자의 1.0kb BamH I 절편을 아가로스 겔에서 분리하고, 단방향 전기용출(unidirectional electroelution)을 수행하여 이 절편을 순수분리하였다. 같은 방법으로, pBI121의 11.06kb의 BamH I 절편을 순수분리하여 함께 섞어 T4DNA 연결효소로 연결하여 발현벡터 pJRM100을 제조하였다. pJRM100을 CaCl2용액으로 형질전환 능력을 부여한 XL1-BLUE 균주에 형질전환하였다. 아울러, 상술한 바와 마찬가지로 1.0kb BamH I 절편을 지니고 있는 pBI121을 선별하고 DNA를 분리하였다.
상기 실시예 2와 실시예 3에서 실시한 일련의 과정은 제 2 도에 도식으로 나타내었다. 제 3 도는 이와 같이하여 제조된 식물체 형질전환용 벡터인 pJRM100을 Hind III와 Xho 1으로 동시에 절단한 후 아가로스 겔 전기영동한 결과를 나타낸 것이다(제 1레인은 λ DNA를 Hind III로 자른 것이다.
[실시예 4]
아그로박테리움(Agrobacterium) 매개에 의한 식물세포의 형질전환
PAP 유전자가 CaMV 35S 촉진유전자 하에서 발현이 조절되도록 제조한 실시예 3에서 수득한 식물체 형질전환용 이원벡터인 pJRNI100를 아그로 박테리움 투메파시엔스 LBA 4404로 형질전환하기 위하여 손쉬운 방법인 동결-용해(freeze-thawing) 방법을 사용하였다. 이원벡터로 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA 4404로 선별하기 위하여, 아그로박테리움 플라스미드 퀵스크린(quick-screen) 방법으로 DNA를 분리하고 BamH I으로 절단하여 형질전환 여부를 확인하였다[참조 : Stanton B.G. et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers(1988)]. pJRM100으로 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA 4404는 1992넌 8월 7일 국제기탁기관인 한국과학기술연구원 부설 유전공학연구소(KCTC)에 기탁번호 KCTC 0052BP로 기탁되었다.
담배세포의 형질전환에는 Nicotiana tabacum NC2326과 Nicotiana tabacum xanthi를 사용하였다. 담배 종자를 70(v/v)% 에탄올에 5분간 처리한 후 50(v/v)% 산업용 표백제(유한락스, 유한양행사 제품)에 20분간 침적하여 표면살균하고 멸균증류수로 3회 세척하여 MS 기본배지에서 발아시켰다. 냉장고에서 1개월동안 생육시킨 잎을 적당한 크기로 잎절편을 만들어 담배세포의 형질전환용 재료로 사용하였다. 식물체 형질전환용 벡터 pJRM100을 지니고 이는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens LBA 4404, KCTC 0052BP)는 LB배지에서 28℃, 200rpm으로 18시간 진탕배양하였다. 배양 후 원심분리하여 균체를 회수하고 MS 기본배지로 세포수가 ml당 약 1 내지 2×103이 되도록 현탁하여 담배세포의 형질전환에 사용하였다.
담배 잎절편을 pJRM100을 지니고 있는 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA 4404 현탁액에 30분간 처리하여 접종한 후, 1.0mg/ℓ BAP(benzyl aminopurine)와 0.1mg/ℓ NAA(α-Naphthalene acetic acid)를 첨가한 MS 고형배지에 치상하여 26℃, 암소에서 48시간 공조배양하였다. 공조배양후 1.0mg/ℓ BAP, 100mg/ℓ 카나마이신 그리고 500mg/ℓ 카베니실린을 첨가한 MS 선발배지에 치상하여 슈트를 유도하였다. 배양조건은 온도가 26℃, 300Lux, 일장은 16시간 주기로 하였으며, 잎절편에서 분화된 슈트는 잎절편의 배양 때와 같은 조건의 배지에서 2주마다 계대배양하였다.
MS 선발배지에서 재분화된 형질전환 담배는 100mg/ℓ 카나마이신과 250mg/ℓ 카베니실린이 첨가된 MS 기본배지에 이식하여 뿌리형성을 유도하였으며, 뿌리가 형성된 형질전환 담배는 포트에 이식하여 순화시켜 다음 실험에 사용하였다. 상기의 결과는 제 4 도에 나타내었는데, 제 4(a)도는 감염시킨 후 슈트를 유도한 것이며 ; 제 4(b)도는 뿌리를 유도한 것이고 ; 제 4(c)도는 순화 후 포트(pot) 배양한 것을 각각 사진으로 나타낸 것이다.
[실시예 5]
형질전환된 담배에서 PAP 검정
형질전환된 담배에서 PAP 유전자의 발현여부를 알아보기 위하여 anti-PAP 항체를 이용한 면역확산 측정법을 수행하였다. 먼저 1% 아가를 페트리 디쉬에 코팅하고 0.8(v/w)% 아가와 5μg/ml anti-PAP 항체를 함께 섞어 페트리 디쉬에 부어 고형화시켰다. 고형화된 아가 플레이트에 파스퇴르 피펫을 이용하여 시료를 로딩(loading)할 수 있게 구멍을 내어 사용하였다. 형질전환된 담배에서 전체 단백질을 분리하여 상기에서 기술한 방법으로 만든 아가 플레이트에 각각의 시료를 로딩하고, 48시간 확산시킨 후 염색액으로 탈염색하여 침전물을 확인하였다. 그 결과를 제 5 도에 나타내었는데, C는 양자리공의 전체 단백질이고 ; B는 형질전환되지 않은 담배의 전체 단백질이며 ; 그외는 형질전환된 담배에서 추출한 전체 단백질로 검정한 것을 나타낸다.
[실시예 6]
형질전환된 담배의 서던 블롯(Southern blot) 분석
PAP 유전자가 담배의 유전자에 삽입되었는지의 여부를 알아보기 위하여 서던 블롯 분석을 수행하였다. 형질전환된 담배로부터 전체 DNA를 추출하고 BamHI으로 절단하여 0.8(v/w)% 아가로스 겔에서 전기영동을 한 후 Hybond-N+(Ameraham사 제품, U.K.)로 DNA를 옮기고, 상기 실시예 3에서 기술한 1.0kbp BamHI 절편을 프로브로 사용하여 혼성화 반응을 수행하였다. 프로브는 닉 트랜스레이션 키트(Promega사 제품, U.S.A.)를 이용하여 제조하였으며 프로브의 표지는 α-32P dATP를 사용하여 표지하였다. 그 결과를 제 6 도에서 보여주고 있다 : 제 1 레인은 형질전환되지 않은 담배에서 추출한 DNA를 BamH I으로 절단한 것을 나타내며, 크기가 1.0kbp에서 하나의 밴드가 나타남을 볼 수 있으며 ; 제 2, 3 및 4레인은 각각 형질전환된 담배에서 추출한 DNA를 BamH I으로 절단한 것을 나타내고 ; 제 5 레인은 pJRM100을 BamH I 처리한 것을 각각 나타내며 ; 제 2,3 및 4레인의 밴드와 일치하는 밴드가 있는 것을 알 수 있다.
[실시예 7]
형질전환된 담배의 노던 블롯(Northern blot)분석
PAP 유전자가 도입된 담배에서 PAP 유전자의 전사도(transcription level)를 알아보기 위하여, 형질전환된 담배로부터 전체 RNA를 추출하고 10(v/v)% 포름알데히드가 함유된 1(v/w)% 아가로스 겔에서 전기영동한 후 Hybond-N+로 RNA를 옮기고 서던 블롯 분석에서 사용한 1.0kbp BamH I 절편을 사용하여 혼성화 반응을 수행하였다. 그 결과를 제 7 도에 나타내었는데, 형질전환되지 않은 대조구(A)에서는 밴드가 없는 형질전환된 담배(B)에서만 하나의 밴드가 나타남을 볼 수 있다.
[실시예 8]
형질전환된 담배의 국부손상 측정법(local lesion assay)
ATCC로부터 구입한 동결건조된 TMV 이병조직(ATCC PV226)을 인산환충액을 이용하여 마쇄한 후, 원심분리하여 상층액을 취하고 바이러스 접종액을 만들어 바이러스 접종액을 4 내지 6엽기의 지표식물에 접종하였다. 접종 후, 7일간 생장시험고 내에서 국부손상 측정법을 수행하였다. 그 결과를 제 8 도에 나타내었는데, 형질전환되지 않은 대조구(B)에서는 반점이 생성되는 반면 형질전환된 담배(A)에서는 반점이 생기지 않았음을 확인하였다.
이상에서 상세히 설명되고 입증되었듯이, 본 발명은 식물세포내에서 외래유전자의 발현을 가능하게 하는 벡터에 양자리공의 cDNA 라이브러리에서 분리한 항바이러스성 단백질을 암호화하는 유전자를 삽입하여 제조한 항바이러스성 단백질 유전자 발현벡터를 식물세포에 형질전환시키고 배양함으로써, 항바이러스성 단백질을 생성하는 식물체를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 의하여 항바이러스성 단백질을 생성하고 발현되는 형질전환 식물체를 제조함으로써, 여러 종류의 바이러스에 대하여 내성이 강한 식물체를 개발할 수 있으며, 아울러 형질전환 생물체에서 항바이러스성 단백질을 생산, 제조할 수 있을 것이다.

Claims (6)

  1. 항바이러스성 단백질 유전자를 식물체에서 발현시키는 재조합 유전자 pJRM100(KCTC 0052BP).
  2. 제 1 항의 재조합 유전자로 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens LBA 4404).
  3. 제 1 항의 재조합 유전자로 형질전환된 아그로박테리움을 매개로 형질전환된 식물세포를 배양함으로써 항바이러스성 단백질을 생성하는 식물체를 제조하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 항바이러스성 단백질은 PAP(phytolacca anti-viral protein)인 방법.
  5. 제 3 항에 있어서, 식물체는 담배인 방법.
  6. 제 3 항의 방법에 의해 제조된 식물체로부터 생산되는 항바이러스성 단백질 PAP(phytolacca anti-vira1 protein) .
KR1019920014895A 1992-08-16 1992-08-19 항바이러스성 단백질 발현벡터와 이것으로 형질전환된 식물체의 제조방법 KR950012900B1 (ko)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1019920014895A KR950012900B1 (ko) 1992-08-19 1992-08-19 항바이러스성 단백질 발현벡터와 이것으로 형질전환된 식물체의 제조방법
JP5128222A JP2522151B2 (ja) 1992-08-19 1993-04-30 抗ウィルス性タンパク質発現ベクタ―およびそれにより形質転換された植物体の製造方法
DE69306067T DE69306067T2 (de) 1992-08-19 1993-06-30 Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze, die das antivirale Protein aus Phytolacca exprimiert
EP93110445A EP0585554B1 (en) 1992-08-16 1993-06-30 Process for preparing a transgenic plant expressing phytolacca antiviral protein
US08/373,858 US5633155A (en) 1992-08-19 1995-01-18 Expression vector for phytolacca antiviral protein and process for preparing transgenic plant transformed therewith

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1019920014895A KR950012900B1 (ko) 1992-08-19 1992-08-19 항바이러스성 단백질 발현벡터와 이것으로 형질전환된 식물체의 제조방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR940004056A KR940004056A (ko) 1994-03-14
KR950012900B1 true KR950012900B1 (ko) 1995-10-23

Family

ID=19338171

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019920014895A KR950012900B1 (ko) 1992-08-16 1992-08-19 항바이러스성 단백질 발현벡터와 이것으로 형질전환된 식물체의 제조방법

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP0585554B1 (ko)
JP (1) JP2522151B2 (ko)
KR (1) KR950012900B1 (ko)
DE (1) DE69306067T2 (ko)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6608241B1 (en) * 1985-10-29 2003-08-19 Monsanto Technology Llc Protection of plants against viral infection
KR970007864B1 (ko) * 1994-07-21 1997-05-17 진로 주식회사 섬자리공의 항바이러스성 단백질(pip)을 발현하는 식물체의 제조방법
KR970074934A (ko) * 1996-05-22 1997-12-10 문상목 섬자리공 항바이러스성 단백질의 신규한 유전자 및 그를 발현하는 재조합 미생물
KR100448189B1 (ko) 2001-11-19 2004-09-10 삼성전자주식회사 컴퓨터

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4921841A (en) * 1982-12-14 1990-05-01 Obrig Thomas G Immunoaffinity purification of phytolaccin proteins and their use in treating Herpes Simplex virus type II
KR910014790A (ko) * 1990-01-10 1991-08-31 한태희 랩탑 컴퓨터의 기능선택방법 및 인터페이스회로

Also Published As

Publication number Publication date
EP0585554A1 (en) 1994-03-09
KR940004056A (ko) 1994-03-14
DE69306067D1 (de) 1997-01-02
JP2522151B2 (ja) 1996-08-07
EP0585554B1 (en) 1996-11-20
DE69306067T2 (de) 1997-06-12
JPH0678775A (ja) 1994-03-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR0154872B1 (ko) 발아하는 식물종자의 아크로박테리움 매개된 형질전환
KR100228326B1 (ko) 토스포바이러스 rna를 암호화 하는 dna 서열을 포함하는 재조합 dna 구조체, 이 구조체로 형질전환된 식물 및 그 식물의 제조방법
KR970007864B1 (ko) 섬자리공의 항바이러스성 단백질(pip)을 발현하는 식물체의 제조방법
JPH07500970A (ja) 植物寄生線虫に対する低下された感受性を有する植物の生産方法
JPH10507913A (ja) ジャガイモ由来のプロモーター配列
US5633155A (en) Expression vector for phytolacca antiviral protein and process for preparing transgenic plant transformed therewith
EP1481061B1 (en) Denaturant stable and/or protease resistant, chaperone-like oligomeric proteins, polynucleotides encoding same and their uses
US5856127A (en) Antimicrobial peptides
JPH06500237A (ja) β―１，３―グルカナーゼ活性を有する新規蛋白質をコードする組換えＤＮＡ、このＤＮＡを含む細菌、形質転換植物細胞および植物
CN111574606B (zh) 小麦抗病与抽穗调控基因TaCOK及其相关生物材料与应用
KR950012900B1 (ko) 항바이러스성 단백질 발현벡터와 이것으로 형질전환된 식물체의 제조방법
FR2766207A1 (fr) Gene chimere codant pour la drosomycine, vecteur le contenant pour la transformation des cellules vegetales et plantes transformees obtenues resistantes aux maladies
KR0154495B1 (ko) 인체 락토페린 유전자로 형질전환된 항바이러스성 식물체의 제조방법
EP0843728A1 (en) Methods and materials for producing pathogen-resistant plants
Reggi et al. Seed-Specific Expression of Apolipoprotein AI Milano Dimer in Rice (Oryza Sativa L.) Transgenic Lines
KR0155453B1 (ko) 담배식물을 통해 사람 비이형 간염 바이러스 조립된 형태의 재조합 항체를 제조하는 방법
JP4431581B2 (ja) 植物に植物病原菌及び害虫に対する多重抵抗性を誘導するタンパク質
Song et al. Expression of anti-neuroexcitation peptide III of scorpion Buthus martensii Karsch BmK ANEP III in plants
WO1998044803A1 (en) Dna molecule encoding tomato ringspot virus proteins and uses thereof
WO1998044803A9 (en) Dna molecule encoding tomato ringspot virus proteins and uses thereof
CN117467669A (zh) 香蕉MaFLA27基因及其编码蛋白在植物抗旱中的应用
KR0121768B1 (ko) 담배식물을 통해 사람 b형 간염 바이러스 재조합 항체를 제조하는 방법
WO1989009776A1 (en) VirE OPERON-ENCODED POLYPEPTIDES THAT BIND SINGLE-STRANDED DNA
JP2000041688A (ja) プロモ―タ―活性を有するｄｎａ断片
MXPA98001153A (en) Methods and materials to produce resistant plants for patoge

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
G160 Decision to publish patent application
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
LAPS Lapse due to unpaid annual fee