JP2000041688A - プロモ―タ―活性を有するｄｎａ断片 - Google Patents
プロモ―タ―活性を有するｄｎａ断片Info
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- JP2000041688A JP2000041688A JP11196728A JP19672899A JP2000041688A JP 2000041688 A JP2000041688 A JP 2000041688A JP 11196728 A JP11196728 A JP 11196728A JP 19672899 A JP19672899 A JP 19672899A JP 2000041688 A JP2000041688 A JP 2000041688A
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- gene
- promoter activity
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 植物細胞において高プロモーター活性を
有する、西洋ワサビペルオキシダーゼアイソザイム遺伝
子由来のＤＮＡ断片、該断片を含むベクター、異種遺伝
子を該断片の転写制御下に配置したベクター、並びに該
ベクターで形質転換された植物。 【効果】 本発明のＤＮＡ断片は、従来の植物細胞用プ
ロモーターと比較して極めて高いプロモーター活性を有
するので、植物細胞における異種遺伝子の高発現ベクタ
ーの構築に有用である。
有する、西洋ワサビペルオキシダーゼアイソザイム遺伝
子由来のＤＮＡ断片、該断片を含むベクター、異種遺伝
子を該断片の転写制御下に配置したベクター、並びに該
ベクターで形質転換された植物。 【効果】 本発明のＤＮＡ断片は、従来の植物細胞用プ
ロモーターと比較して極めて高いプロモーター活性を有
するので、植物細胞における異種遺伝子の高発現ベクタ
ーの構築に有用である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、植物細胞内等で異
種蛋白遺伝子を発現させる時、好適に使用されるプロモ
ーター活性を保持するＤＮＡ断片、該ＤＮＡ断片が導入
されたベクター及び該ベクターにより形質転換された宿
主に関する。
種蛋白遺伝子を発現させる時、好適に使用されるプロモ
ーター活性を保持するＤＮＡ断片、該ＤＮＡ断片が導入
されたベクター及び該ベクターにより形質転換された宿
主に関する。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子組換え技術の分野では、遺伝子の
発現量を増大させるために強力なプロモーターにより、
産生ｍＲＮＡ量を増大させることが行われている。植物
においては、その様な例としてカリフラワーモザイクウ
ィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターが多用されてい
る。しかしながら、このプロモーターを使用して異種蛋
白遺伝子を発現させた場合、必ずしも期待通りの発現量
が得られないことが多い。そこで、更に強力なプロモー
ターの開発が望まれていた。
発現量を増大させるために強力なプロモーターにより、
産生ｍＲＮＡ量を増大させることが行われている。植物
においては、その様な例としてカリフラワーモザイクウ
ィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターが多用されてい
る。しかしながら、このプロモーターを使用して異種蛋
白遺伝子を発現させた場合、必ずしも期待通りの発現量
が得られないことが多い。そこで、更に強力なプロモー
ターの開発が望まれていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターに代わるより強力
な植物プロモーターを提供することであり、該プロモー
ターを利用して異種遺伝子を高発現する形質転換植物を
提供することである。
目的は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターに代わるより強力
な植物プロモーターを提供することであり、該プロモー
ターを利用して異種遺伝子を高発現する形質転換植物を
提供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の目
的を達成すべく各種研究を重ねた結果、西洋ワサビの培
養細胞で生産されるペルオキシダーゼに着目した。ペル
オキシダーゼには多くのアイソザイムが存在すると言わ
れ、ペルオキシダーゼを高生産する西洋ワサビの培養細
胞が既に獲得されている[Yamada, Y., et al., J. Che
m. Tech. Bioch., 38: 31 (1987)]。また、この西洋ワ
サビ培養細胞から得たペルオキシダーゼアイソザイムの
ゲノム遺伝子の構造が決定され、その５’上流にプロモ
ーター配列が存在することが確認されている（昭和62年
度日本醗酵工学会講演要旨集, p21)。本発明者らは、こ
の西洋ワサビの培養細胞から、多種のペルオキシダーゼ
アイソザイム遺伝子のクローンを取得し、各クローンの
５’上流部分の下流にリポーター遺伝子を機能的に連結
した発現カセットを含むベクターを構築し、それらを植
物の培養細胞および各種組織に導入してプロモーター活
性について分析したところ、それらのうちの１つが、Ｃ
ａＭＶ３５Ｓプロモーターよりも数倍高いプロモーター
活性を有することを見い出し、本発明の完成に至った。
的を達成すべく各種研究を重ねた結果、西洋ワサビの培
養細胞で生産されるペルオキシダーゼに着目した。ペル
オキシダーゼには多くのアイソザイムが存在すると言わ
れ、ペルオキシダーゼを高生産する西洋ワサビの培養細
胞が既に獲得されている[Yamada, Y., et al., J. Che
m. Tech. Bioch., 38: 31 (1987)]。また、この西洋ワ
サビ培養細胞から得たペルオキシダーゼアイソザイムの
ゲノム遺伝子の構造が決定され、その５’上流にプロモ
ーター配列が存在することが確認されている（昭和62年
度日本醗酵工学会講演要旨集, p21)。本発明者らは、こ
の西洋ワサビの培養細胞から、多種のペルオキシダーゼ
アイソザイム遺伝子のクローンを取得し、各クローンの
５’上流部分の下流にリポーター遺伝子を機能的に連結
した発現カセットを含むベクターを構築し、それらを植
物の培養細胞および各種組織に導入してプロモーター活
性について分析したところ、それらのうちの１つが、Ｃ
ａＭＶ３５Ｓプロモーターよりも数倍高いプロモーター
活性を有することを見い出し、本発明の完成に至った。
【０００５】即ち、本発明は、植物細胞においてプロモ
ーター活性を有する西洋ワサビペルオキシダーゼ（以
下、ＨＲＰと略称する場合もある）アイソザイム遺伝子
由来のＤＮＡ断片であって、タバコ培養細胞において
は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの約４倍またはそれ以
上のプロモーター活性を有することを特徴とするＤＮＡ
断片、該ＤＮＡ断片を含むベクター、特に異種遺伝子、
好ましくは生理活性を有するポリペプチドをコードする
遺伝子、就中ベータ−グルクロニダーゼ、ペルオキシダ
ーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼまたはルシフェラー
ゼをコードする遺伝子が、該ＤＮＡ断片の転写制御下に
ある上記ベクター、並びに上記のいずれかのベクターに
より形質転換された植物である。
ーター活性を有する西洋ワサビペルオキシダーゼ（以
下、ＨＲＰと略称する場合もある）アイソザイム遺伝子
由来のＤＮＡ断片であって、タバコ培養細胞において
は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの約４倍またはそれ以
上のプロモーター活性を有することを特徴とするＤＮＡ
断片、該ＤＮＡ断片を含むベクター、特に異種遺伝子、
好ましくは生理活性を有するポリペプチドをコードする
遺伝子、就中ベータ−グルクロニダーゼ、ペルオキシダ
ーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼまたはルシフェラー
ゼをコードする遺伝子が、該ＤＮＡ断片の転写制御下に
ある上記ベクター、並びに上記のいずれかのベクターに
より形質転換された植物である。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明のＤＮＡ断片は、ＨＲＰア
イソザイム遺伝子に由来し且つ植物細胞内でプロモータ
ー活性を示すものである。該ＤＮＡ断片の植物細胞にお
けるプロモーター活性は、従来公知の強力な植物細胞用
プロモーターであるＣａＭＶ３５Ｓプロモーターと比較
しても有意に高く、例えば、タバコ培養細胞において
は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの約４倍またはそれ以
上のプロモーター活性を有する。もちろん、該ＤＮＡ断
片が高いプロモーター活性を発揮し得る宿主植物はこれ
に限定されるものではない。
イソザイム遺伝子に由来し且つ植物細胞内でプロモータ
ー活性を示すものである。該ＤＮＡ断片の植物細胞にお
けるプロモーター活性は、従来公知の強力な植物細胞用
プロモーターであるＣａＭＶ３５Ｓプロモーターと比較
しても有意に高く、例えば、タバコ培養細胞において
は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの約４倍またはそれ以
上のプロモーター活性を有する。もちろん、該ＤＮＡ断
片が高いプロモーター活性を発揮し得る宿主植物はこれ
に限定されるものではない。
【０００７】本発明のＤＮＡ断片の好ましい一実施態様
として、配列表配列番号１に示される塩基配列を有する
ＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つプ
ロモーター活性を有するＤＮＡ断片が挙げられる。本発
明では、配列番号１に示されるＤＮＡ塩基配列は、プロ
モーター活性を損なわない範囲内で一部を削除あるいは
改変してもよい。
として、配列表配列番号１に示される塩基配列を有する
ＤＮＡ断片、またはそれと均等な塩基配列を有し且つプ
ロモーター活性を有するＤＮＡ断片が挙げられる。本発
明では、配列番号１に示されるＤＮＡ塩基配列は、プロ
モーター活性を損なわない範囲内で一部を削除あるいは
改変してもよい。
【０００８】本発明のＤＮＡ断片はいかなる方法により
得られてもよいが、例えば、次のようにして調製でき
る。まず、本発明の出発遺伝子である各種ペルオキシダ
ーゼアイソザイム遺伝子は西洋ワサビの培養細胞から常
法に従い、例えば、Molecular Cloning,(1989), p.8,
3,(Cold Spring Harbor Labs.) に記載の方法に従い、
ｃＤＮＡライブラリーを調製し、Welinderの報告したFE
BS Letters, (1976), 72, 19記載の西洋ワサビのペルオ
キシダーゼのアミノ酸配列に基づき調製したＤＮＡプロ
ーブを用いて、遺伝子を選択することができる。また、
例えば、Molecular Cloning, (1989), p.9,4,(ColdSpri
ng Harbor Labs.)に記載の方法に従い、西洋ワサビの培
養細胞からゲノムライブラリーを調製し、既に得られて
いるアイソザイム遺伝子をプローブにして、更に多くの
ペルオキシダーゼアイソザイム遺伝子を選択することが
できる。なお、これらのペルオキシダーゼアイソザイム
遺伝子の選択方法は、既に本発明者等により発表されて
いる。すなわち、Fujiyama et al., Eur.J.Biochem. 17
3,(1988),681-687において、ｐｒｘＣ１ａ及びｐｒｘＣ
１ｂと命名されたペルオキシダーゼアイソザイム遺伝子
が単離されたことが記載されており、またFujiyama et
al., Gene, 89, (1990), 163-169 において、ｐｒｘＣ
２及びｐｒｘＣ３と命名されたペルオキシダーゼアイソ
ザイム遺伝子が単離されたことが記載されている。
得られてもよいが、例えば、次のようにして調製でき
る。まず、本発明の出発遺伝子である各種ペルオキシダ
ーゼアイソザイム遺伝子は西洋ワサビの培養細胞から常
法に従い、例えば、Molecular Cloning,(1989), p.8,
3,(Cold Spring Harbor Labs.) に記載の方法に従い、
ｃＤＮＡライブラリーを調製し、Welinderの報告したFE
BS Letters, (1976), 72, 19記載の西洋ワサビのペルオ
キシダーゼのアミノ酸配列に基づき調製したＤＮＡプロ
ーブを用いて、遺伝子を選択することができる。また、
例えば、Molecular Cloning, (1989), p.9,4,(ColdSpri
ng Harbor Labs.)に記載の方法に従い、西洋ワサビの培
養細胞からゲノムライブラリーを調製し、既に得られて
いるアイソザイム遺伝子をプローブにして、更に多くの
ペルオキシダーゼアイソザイム遺伝子を選択することが
できる。なお、これらのペルオキシダーゼアイソザイム
遺伝子の選択方法は、既に本発明者等により発表されて
いる。すなわち、Fujiyama et al., Eur.J.Biochem. 17
3,(1988),681-687において、ｐｒｘＣ１ａ及びｐｒｘＣ
１ｂと命名されたペルオキシダーゼアイソザイム遺伝子
が単離されたことが記載されており、またFujiyama et
al., Gene, 89, (1990), 163-169 において、ｐｒｘＣ
２及びｐｒｘＣ３と命名されたペルオキシダーゼアイソ
ザイム遺伝子が単離されたことが記載されている。
【０００９】本発明のＤＮＡ断片は、この様にして単離
されたｐｒｘＣ１ａ，ｐｒｘＣ１ｂ，ｐｒｘＣ２及びｐ
ｒｘＣ３等のクローンを種々の制限酵素によって切断
し、異種蛋白を発現させ、その量を測定することによっ
て、最も高いプロモーター活性を示した５’非翻訳領域
の一部である。
されたｐｒｘＣ１ａ，ｐｒｘＣ１ｂ，ｐｒｘＣ２及びｐ
ｒｘＣ３等のクローンを種々の制限酵素によって切断
し、異種蛋白を発現させ、その量を測定することによっ
て、最も高いプロモーター活性を示した５’非翻訳領域
の一部である。
【００１０】ｐｒｘＣ１ａの５’非翻訳領域について
は、制限酵素 XbaＩ（塩基配列−525)と制限酵素 EcoRI
（塩基配列−5)で切断した断片を調製した。ｐｒｘＣ１
ｂについては、制限酵素 EcoRI（塩基配列−533)と制限
酵素 NSiＩ（塩基配列＋1)で切断した断片を調製した。
ｐｒｘＣ２については、制限酵素 XbaＩ（塩基配列−52
7)と制限酵素 NSiＩ（塩基配列＋5)で切断した断片を調
製した。ｐｒｘＣ３については、制限酵素 EcoRI（塩基
配列−484)と制限酵素HindIII(塩基配列＋63) で切断
し、更に修飾酵素Exonuculease IIIでHind IIIサイトか
ら−５の位置まで分解した断片を調製した。これらの各
遺伝子の５’非翻訳領域のプロモーター活性の検索は、
レポータ遺伝子としてベータ−グルクロニダーゼ（ＧＵ
Ｓ）遺伝子を用い、それと５’非翻訳領域とのキメラ遺
伝子を作製し、それらとｐＵＣ系プラスミドまたはｐＢ
Ｉ系プラスミドとから発現プラスミドを構築し、これら
を植物プロトプラストに導入することにより、または、
植物形質転換体を作製し、ＧＵＳ遺伝子の発現量を測定
することにより行うことができる。その結果、第１図に
示すｐｒｘＣ２の５’非翻訳領域がＣａＭＶ３５Ｓプロ
モーターよりも高い活性を示し、更にｐｒｘＣ１ａ，ｐ
ｒｘＣ１ｂ，ｐｒｘＣ３の５’非翻訳領域よりも高い活
性を示すことが見出された。
は、制限酵素 XbaＩ（塩基配列−525)と制限酵素 EcoRI
（塩基配列−5)で切断した断片を調製した。ｐｒｘＣ１
ｂについては、制限酵素 EcoRI（塩基配列−533)と制限
酵素 NSiＩ（塩基配列＋1)で切断した断片を調製した。
ｐｒｘＣ２については、制限酵素 XbaＩ（塩基配列−52
7)と制限酵素 NSiＩ（塩基配列＋5)で切断した断片を調
製した。ｐｒｘＣ３については、制限酵素 EcoRI（塩基
配列−484)と制限酵素HindIII(塩基配列＋63) で切断
し、更に修飾酵素Exonuculease IIIでHind IIIサイトか
ら−５の位置まで分解した断片を調製した。これらの各
遺伝子の５’非翻訳領域のプロモーター活性の検索は、
レポータ遺伝子としてベータ−グルクロニダーゼ（ＧＵ
Ｓ）遺伝子を用い、それと５’非翻訳領域とのキメラ遺
伝子を作製し、それらとｐＵＣ系プラスミドまたはｐＢ
Ｉ系プラスミドとから発現プラスミドを構築し、これら
を植物プロトプラストに導入することにより、または、
植物形質転換体を作製し、ＧＵＳ遺伝子の発現量を測定
することにより行うことができる。その結果、第１図に
示すｐｒｘＣ２の５’非翻訳領域がＣａＭＶ３５Ｓプロ
モーターよりも高い活性を示し、更にｐｒｘＣ１ａ，ｐ
ｒｘＣ１ｂ，ｐｒｘＣ３の５’非翻訳領域よりも高い活
性を示すことが見出された。
【００１１】本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡ
断片はｐＵＣ系プラスミド、ｐＢＩ系プラスミド等のプ
ラスミドベクター中に挿入され、異種蛋白遺伝子を発現
させるためのベクターとして使用される。
断片はｐＵＣ系プラスミド、ｐＢＩ系プラスミド等のプ
ラスミドベクター中に挿入され、異種蛋白遺伝子を発現
させるためのベクターとして使用される。
【００１２】プロモーター活性を有するＤＮＡ断片の各
種プラスミドへの挿入は、ＤＮＡ組換えの一般的方法、
例えば、Molecular Cloning, (1989),(Cold Spring Har
borLabs.)に記載の方法に従って行うことができる。例
えばｐｒｘＣ２の５’非翻訳領域を含む XbaＩ/NsiＩ断
片はｐＵＣ１８の XbaＩと PstＩで切断したマルチクロ
ーニングサイトとライゲーションすれば、プラスミドｐ
ＵＣ１８に挿入することができる。
種プラスミドへの挿入は、ＤＮＡ組換えの一般的方法、
例えば、Molecular Cloning, (1989),(Cold Spring Har
borLabs.)に記載の方法に従って行うことができる。例
えばｐｒｘＣ２の５’非翻訳領域を含む XbaＩ/NsiＩ断
片はｐＵＣ１８の XbaＩと PstＩで切断したマルチクロ
ーニングサイトとライゲーションすれば、プラスミドｐ
ＵＣ１８に挿入することができる。
【００１３】本発明のＤＮＡ断片を含有するベクター
は、ベータ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ペルオキシ
ダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、ルシフェラーゼ
等各種動植物、酵母等の異種生物由来の遺伝子を発現さ
せるのに好適である。また、本発明のベクターは、植物
細胞または、酵母細胞等の宿主を形質転換するのに好適
に用いられる。
は、ベータ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ペルオキシ
ダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、ルシフェラーゼ
等各種動植物、酵母等の異種生物由来の遺伝子を発現さ
せるのに好適である。また、本発明のベクターは、植物
細胞または、酵母細胞等の宿主を形質転換するのに好適
に用いられる。
【００１４】
【実施例】以下に実施例を示し、本発明を更に詳しく説
明するが、本発明はその要旨を越えない限り以下の実施
例に於いて限定されるものではない。
明するが、本発明はその要旨を越えない限り以下の実施
例に於いて限定されるものではない。
【００１５】実施例１ [1] ペルオキシダーゼアイソザイム遺伝子の調製 西洋ワサビゲノムＤＮＡライブラリーの調製 西洋ワサビの茎から誘導された培養細胞〔Fujiyama et
al., Structure of the horseradish peroxidase isozy
me c genes, Eur.,J.Biochem, 173,(1988),681-687〕か
ら〔Blin and Stafford Nucleic Acids Res.3, (197
6), 2303-2308]の方法で全ＤＮＡを調製した。次にこれ
らをManiatisの方法で制限酵素 Sau3AＩで部分分解し
た。この部分分解断片を10〜40％シュクロース密度勾配
遠心分離(33,000rpm, 16時間) で分画し、10〜20kbの長
さのＤＮＡ断片を回収した。これを更にアルカリフォス
ファターゼで処理し、脱リン化した後、あらかじめBamH
Ｉと SalＩで処理したλEMBL4(プロメガ製) とライゲー
ションし、Horn(1979)の方法によりパッケージングし
た。組換えファージで感染のためE.coli NM539を使用し
た。
al., Structure of the horseradish peroxidase isozy
me c genes, Eur.,J.Biochem, 173,(1988),681-687〕か
ら〔Blin and Stafford Nucleic Acids Res.3, (197
6), 2303-2308]の方法で全ＤＮＡを調製した。次にこれ
らをManiatisの方法で制限酵素 Sau3AＩで部分分解し
た。この部分分解断片を10〜40％シュクロース密度勾配
遠心分離(33,000rpm, 16時間) で分画し、10〜20kbの長
さのＤＮＡ断片を回収した。これを更にアルカリフォス
ファターゼで処理し、脱リン化した後、あらかじめBamH
Ｉと SalＩで処理したλEMBL4(プロメガ製) とライゲー
ションし、Horn(1979)の方法によりパッケージングし
た。組換えファージで感染のためE.coli NM539を使用し
た。
【００１６】 西洋ワサビペルオキシダーゼゲノムの
選択 西洋ワサビペルオキシダーゼのｃＤＮＡクローンをｐＳ
Ｋ１（上記の文献の、PstＩで切り出した1.3 kbのＤＮ
Ａ) をマルチプライムＤＮＡラベリング系(Amersham)を
使用して32Ｐでラベルした。E.coli NM539に感染させて
生じたプラークをナイロン膜に移した後、上記のラベル
したｃＤＮＡプローブでプラークハイブリダイゼーショ
ンを行った。ポジティブクローンを精製後、ファージＤ
ＮＡの制限酵素切断断片をサザーンブロッティングを行
い、ｃＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡ断片をｐＵＣ
１９にサブクローンした。ｐＳＫ１に挿入されている32
Ｐ−ラベルｃＤＮＡとハイブリダイズする９個の組換え
λＥＭＢＬ４ファージを６×１０4 の組換えファージの
中から分離した。これらのファージのハイブリダイゼー
ションの強度は、３クラスに分離された。ハイブリダイ
ゼーションの強度が最も強いクローン（クラス１）のう
ち、１クローンがｐｒｘＣ１ａ、ｐｒｘＣ１ｂ遺伝子を
ランダムに含んでいることがわかった。ハイブリダイゼ
ーションの強度が余り強くないクローン（クラス２）の
４個の組換えクローンはｃＤＮＡプローブとハイブリダ
イズする EcoRI制限断片（４kb）を含んでいた。また、
ハイブリダイゼーション強度が最も弱いクラス（クラス
３）は、プローブとハイブリダイズする EcoRI（1.5 k
b、0.8 kb) を含んでいた。これらの EcoRI断片及びク
ラス２、クラス３のクローンから得られる他の制限酵素
切断断片とオーバーラップする断片をｐＵＣ１９にサブ
クローンし、塩基配列を決定した。これらの塩基配列を
ｐｒｘＣ１ａ及びｐｒｘＣ１ｂの塩基配列とそれから予
測されるアミノ酸配列比較した結果、ペルオキシダーゼ
アイソザイム遺伝子ｐｒｘＣ２及びｐｒｘＣ３と命名し
た
選択 西洋ワサビペルオキシダーゼのｃＤＮＡクローンをｐＳ
Ｋ１（上記の文献の、PstＩで切り出した1.3 kbのＤＮ
Ａ) をマルチプライムＤＮＡラベリング系(Amersham)を
使用して32Ｐでラベルした。E.coli NM539に感染させて
生じたプラークをナイロン膜に移した後、上記のラベル
したｃＤＮＡプローブでプラークハイブリダイゼーショ
ンを行った。ポジティブクローンを精製後、ファージＤ
ＮＡの制限酵素切断断片をサザーンブロッティングを行
い、ｃＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡ断片をｐＵＣ
１９にサブクローンした。ｐＳＫ１に挿入されている32
Ｐ−ラベルｃＤＮＡとハイブリダイズする９個の組換え
λＥＭＢＬ４ファージを６×１０4 の組換えファージの
中から分離した。これらのファージのハイブリダイゼー
ションの強度は、３クラスに分離された。ハイブリダイ
ゼーションの強度が最も強いクローン（クラス１）のう
ち、１クローンがｐｒｘＣ１ａ、ｐｒｘＣ１ｂ遺伝子を
ランダムに含んでいることがわかった。ハイブリダイゼ
ーションの強度が余り強くないクローン（クラス２）の
４個の組換えクローンはｃＤＮＡプローブとハイブリダ
イズする EcoRI制限断片（４kb）を含んでいた。また、
ハイブリダイゼーション強度が最も弱いクラス（クラス
３）は、プローブとハイブリダイズする EcoRI（1.5 k
b、0.8 kb) を含んでいた。これらの EcoRI断片及びク
ラス２、クラス３のクローンから得られる他の制限酵素
切断断片とオーバーラップする断片をｐＵＣ１９にサブ
クローンし、塩基配列を決定した。これらの塩基配列を
ｐｒｘＣ１ａ及びｐｒｘＣ１ｂの塩基配列とそれから予
測されるアミノ酸配列比較した結果、ペルオキシダーゼ
アイソザイム遺伝子ｐｒｘＣ２及びｐｒｘＣ３と命名し
た
【００１７】[2] ＤＮＡ断片の調製 前記[1] で得たｐｒｘＣ２を制限酵素 XbaＩ（塩基配列
−527)と NsiＩ（塩基配列＋５）で切断し、配列表配列
番号１に示されるＤＮＡ断片を得た。
−527)と NsiＩ（塩基配列＋５）で切断し、配列表配列
番号１に示されるＤＮＡ断片を得た。
【００１８】[3] タバコプロトプラストでのｐｒｘＣ２
の５’非翻訳領域のプロモーター活性の確認 ＤＮＡ組換えの為の一連の遺伝子操作は、基本的には、
Molecular Cloning, (1989),(Cold Spring Harbor Lab
s.)に従って行った。前記[2] で得たｐｒｘＣ２の５’
非翻訳領域５３２ｂｐ（第１図）とＧＵＳ遺伝子とのキ
メラ遺伝子を作製し、更にそれらをｐＵＣ１８につな
ぎ、発現プラスミドを構築した。比較のために、ｐｒｘ
Ｃ２の５’非翻訳領域 XbaＩ／ NsiＩ断片の代わりに、
ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを用いた発現プラスミドも
構築した。これらの発現プラスミドをエレクトロポレー
ション法によりタバコプロトプラストに導入し、２４時
間後のＧＵＳ活性を測定した。ＧＵＳ活性は以下のよう
にして測定した。酵素抽出液３００μｌに、2mM メチル
ウンベリフェリルグルクロナイドを含む抽出液(50mM リ
ン酸緩衝液, pH7.0 、10mM EDTA 、0.1%トリトンX-100
、0.1%ラウリルザルコシン、10mM β−メルカプトエ
タノール) を300 μｌ加え、37℃、1 時間酵素反応を行
った。0.2 M Na2CO3 2.4mlを加えて反応を停止させ、生
成物4-メチルウンベリフェロンの蛍光量を蛍光光度計を
用いて測定(Ex. 365nm, Em. 455nm)した。4-メチルウン
ベリフェロン量は4-メチルウンベリフェロンを用いて作
製した標準曲線より求め、それを基にＧＵＳ活性を算出
した。蛋白質濃度はBio-Rad 社のプロテインアッセイキ
ットを用いて測定した。その結果を表１に示す。この結
果より、ｐｒｘＣ２の５’非翻訳領域にはプロモーター
活性があり、しかも汎用されているＣａＭＶ３５Ｓプロ
モーターよりも約４倍以上の強い活性を有することがわ
かる。
の５’非翻訳領域のプロモーター活性の確認 ＤＮＡ組換えの為の一連の遺伝子操作は、基本的には、
Molecular Cloning, (1989),(Cold Spring Harbor Lab
s.)に従って行った。前記[2] で得たｐｒｘＣ２の５’
非翻訳領域５３２ｂｐ（第１図）とＧＵＳ遺伝子とのキ
メラ遺伝子を作製し、更にそれらをｐＵＣ１８につな
ぎ、発現プラスミドを構築した。比較のために、ｐｒｘ
Ｃ２の５’非翻訳領域 XbaＩ／ NsiＩ断片の代わりに、
ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを用いた発現プラスミドも
構築した。これらの発現プラスミドをエレクトロポレー
ション法によりタバコプロトプラストに導入し、２４時
間後のＧＵＳ活性を測定した。ＧＵＳ活性は以下のよう
にして測定した。酵素抽出液３００μｌに、2mM メチル
ウンベリフェリルグルクロナイドを含む抽出液(50mM リ
ン酸緩衝液, pH7.0 、10mM EDTA 、0.1%トリトンX-100
、0.1%ラウリルザルコシン、10mM β−メルカプトエ
タノール) を300 μｌ加え、37℃、1 時間酵素反応を行
った。0.2 M Na2CO3 2.4mlを加えて反応を停止させ、生
成物4-メチルウンベリフェロンの蛍光量を蛍光光度計を
用いて測定(Ex. 365nm, Em. 455nm)した。4-メチルウン
ベリフェロン量は4-メチルウンベリフェロンを用いて作
製した標準曲線より求め、それを基にＧＵＳ活性を算出
した。蛋白質濃度はBio-Rad 社のプロテインアッセイキ
ットを用いて測定した。その結果を表１に示す。この結
果より、ｐｒｘＣ２の５’非翻訳領域にはプロモーター
活性があり、しかも汎用されているＣａＭＶ３５Ｓプロ
モーターよりも約４倍以上の強い活性を有することがわ
かる。
【００１９】
【表１】
【００２０】[4] トランスジェニックタバコ細胞でのｐ
ｒｘＣ２の非翻訳領域のプロモーター活性の確認 ｐｒｘＣ２の５’非翻訳領域とＧＵＳ遺伝子とのキメラ
遺伝子のプラスミドｐＢＩ１０１へのつなぎ換えは図１
に示した。即ち、ｐｒｘＣ２の５’非翻訳領域、ＧＵＳ
遺伝子、及びｐＵＣ１８から成る組換プラスミドからｐ
ｒｘＣ２の５’非翻訳領域とＧＵＳ遺伝子部分を含む P
vuII／ EcoRI断片を切り出した。一方、ｐＢＩ１０１は
HindIII／ EcoRIで切断後、HindIII切断末端をクレノー
酵素で修復し平滑末端とし、 PvuII／ EcoRI断片を挿入
した。トランスジェニックタバコの作製は、目的のキメ
ラ遺伝子をTriparental Maiting 法によりアグロバクテ
リウム(Agrobacterium) に導入し、このキメラ遺伝子の
入ったアグロバクテリウム(Agrobacterium) を用いてLe
af Disc 法によりタバコ細胞を形質転換した。
ｒｘＣ２の非翻訳領域のプロモーター活性の確認 ｐｒｘＣ２の５’非翻訳領域とＧＵＳ遺伝子とのキメラ
遺伝子のプラスミドｐＢＩ１０１へのつなぎ換えは図１
に示した。即ち、ｐｒｘＣ２の５’非翻訳領域、ＧＵＳ
遺伝子、及びｐＵＣ１８から成る組換プラスミドからｐ
ｒｘＣ２の５’非翻訳領域とＧＵＳ遺伝子部分を含む P
vuII／ EcoRI断片を切り出した。一方、ｐＢＩ１０１は
HindIII／ EcoRIで切断後、HindIII切断末端をクレノー
酵素で修復し平滑末端とし、 PvuII／ EcoRI断片を挿入
した。トランスジェニックタバコの作製は、目的のキメ
ラ遺伝子をTriparental Maiting 法によりアグロバクテ
リウム(Agrobacterium) に導入し、このキメラ遺伝子の
入ったアグロバクテリウム(Agrobacterium) を用いてLe
af Disc 法によりタバコ細胞を形質転換した。
【００２１】 キメラ遺伝子のアグロバクテリウム(A
grobacterium) への導入 ｐｒｘＣ２の５’非翻訳領域とＧＵＳ遺伝子及びｐＢＩ
１０１から構築された組換プラスミドで形質転換された
E.coliＣ600 （ドナーと称する) 、ｐＲＫ２０１３を保
持するE.coliＨＢ１０１（ヘルパーと称する）をそれぞ
れ50μｇ/mlカナマイシン含有ＬＢ培地で３７℃、一夜
培養した。アグロバクテリウムツメファシエンス(Agrob
acterium tumefaciens)LBA 4404 株は、ＬＢ培地５Ｌで
２５〜２８℃、約３６時間培養した。各培養液は、1.5
ml容エッペンドルフチューブにとり、遠心により集菌し
た。菌体は0.5 〜1 mlの10mM MgSO4で３回ほど洗浄した
後、約30μｌの10mM MgSO4に懸濁した。各菌体懸濁液
は、ドナー、ヘルパー、アグロバクテリウムツメファシ
エンス（A. tumefaciens) の順でＬＢプレート上にスポ
ットし、２５℃、一夜混合培養した。混合培養菌体は、
白金耳等でかき取り、１mlの10mM MgSO4に懸濁し、102
〜105 倍に希釈し、その５０μｌを400 μｇ/mlカナマ
イシン含有ＭｉｎＡプレート[MinA 培地（表２参照）の
入ったシャーレ〕に蒔き、25〜28℃、２〜３日培養し、
キメラ遺伝子が導入されたアグロバクテリウムツメファ
シエンス（A. tumefaciens) の単一コロニーを取得し
た。
grobacterium) への導入 ｐｒｘＣ２の５’非翻訳領域とＧＵＳ遺伝子及びｐＢＩ
１０１から構築された組換プラスミドで形質転換された
E.coliＣ600 （ドナーと称する) 、ｐＲＫ２０１３を保
持するE.coliＨＢ１０１（ヘルパーと称する）をそれぞ
れ50μｇ/mlカナマイシン含有ＬＢ培地で３７℃、一夜
培養した。アグロバクテリウムツメファシエンス(Agrob
acterium tumefaciens)LBA 4404 株は、ＬＢ培地５Ｌで
２５〜２８℃、約３６時間培養した。各培養液は、1.5
ml容エッペンドルフチューブにとり、遠心により集菌し
た。菌体は0.5 〜1 mlの10mM MgSO4で３回ほど洗浄した
後、約30μｌの10mM MgSO4に懸濁した。各菌体懸濁液
は、ドナー、ヘルパー、アグロバクテリウムツメファシ
エンス（A. tumefaciens) の順でＬＢプレート上にスポ
ットし、２５℃、一夜混合培養した。混合培養菌体は、
白金耳等でかき取り、１mlの10mM MgSO4に懸濁し、102
〜105 倍に希釈し、その５０μｌを400 μｇ/mlカナマ
イシン含有ＭｉｎＡプレート[MinA 培地（表２参照）の
入ったシャーレ〕に蒔き、25〜28℃、２〜３日培養し、
キメラ遺伝子が導入されたアグロバクテリウムツメファ
シエンス（A. tumefaciens) の単一コロニーを取得し
た。
【００２２】
【表２】
【００２３】 Leaf Disc法によるタバコの形質転換 キメラ遺伝子を保持するアグロバクテリウムツメファシ
エンス（A. tumefaciens) を50μｇ/mlカナマイシン含
有ＬＢ培地５ml中、25〜28℃、一夜培養したものを、シ
ャーレに移し、そこに５mm角に切った無菌タバコの葉を
表皮を下に、気孔を上にして３分間浸汐した。余分の菌
液をキムワイプで除き、ＬＳ培地プレートに置床し、25
℃で培養した。２日後、除菌用培地プレート（第２表）
に移植、３日後、シュート形成用培地（第２表）へ移植
した。その後、５〜７日間隔でシュート形成用培地へ移
植し続けた。茎葉部の発達したシュートが出てきたら切
取り、除菌用培地に移植した。成育した幼植物体は、バ
ーミキュライトとピートモスを１：１に混合し、これに
約１ｇ／Ｌのハイポネックス溶液を充分混合したものを
含む植木鉢へ移し、一日の内14時間は10,000ルックスの
光を照射し、25℃で栽培した。なお、水は毎日与え、ハ
イポネックス等の肥料は週に一回与えた。
エンス（A. tumefaciens) を50μｇ/mlカナマイシン含
有ＬＢ培地５ml中、25〜28℃、一夜培養したものを、シ
ャーレに移し、そこに５mm角に切った無菌タバコの葉を
表皮を下に、気孔を上にして３分間浸汐した。余分の菌
液をキムワイプで除き、ＬＳ培地プレートに置床し、25
℃で培養した。２日後、除菌用培地プレート（第２表）
に移植、３日後、シュート形成用培地（第２表）へ移植
した。その後、５〜７日間隔でシュート形成用培地へ移
植し続けた。茎葉部の発達したシュートが出てきたら切
取り、除菌用培地に移植した。成育した幼植物体は、バ
ーミキュライトとピートモスを１：１に混合し、これに
約１ｇ／Ｌのハイポネックス溶液を充分混合したものを
含む植木鉢へ移し、一日の内14時間は10,000ルックスの
光を照射し、25℃で栽培した。なお、水は毎日与え、ハ
イポネックス等の肥料は週に一回与えた。
【００２４】 トランスジェニックタバコの各器官で
のＧＵＳ活性 丈が約10cmまで成長した形質転換タバコを葉、茎、根に
分けて液体窒素で凍結させ、300 〜1000mgをエッペンド
ルフチューブに分取した。抽出緩衝液(50mM リン酸緩衝
液, pH7.0 、10mM EDTA 、0.1 ％トリトンX-100 、0.1
％ラウリルザルコシン、10mM β−メルカプトエタノー
ル）300 〜 600 μｌと海砂を加え、ガラス棒で粉砕
し、遠心分離により上清を回収した。ＧＵＳ活性及び蛋
白量の測定は前述[3]記載の方法に従った。その結果を
表３に示した。プロモーターが存在しないとＧＵＳ遺伝
子の発現はほとんど認められないが、ｐｒｘＣ２のプロ
モーターが存在すると葉、茎、根、いずれの器官でも高
いＧＵＳ活性が認められ、ｐｒｘＣ２のプロモーターが
いずれの器官でも高く発現しうることが示された。また
ｐｒｘＣ２のプロモーターは、同様に測定したｐｒｘＣ
１ａおよびｐｒｘＣ１ｂのプロモーターよりも高いＧＵ
Ｓ活性を示した。
のＧＵＳ活性 丈が約10cmまで成長した形質転換タバコを葉、茎、根に
分けて液体窒素で凍結させ、300 〜1000mgをエッペンド
ルフチューブに分取した。抽出緩衝液(50mM リン酸緩衝
液, pH7.0 、10mM EDTA 、0.1 ％トリトンX-100 、0.1
％ラウリルザルコシン、10mM β−メルカプトエタノー
ル）300 〜 600 μｌと海砂を加え、ガラス棒で粉砕
し、遠心分離により上清を回収した。ＧＵＳ活性及び蛋
白量の測定は前述[3]記載の方法に従った。その結果を
表３に示した。プロモーターが存在しないとＧＵＳ遺伝
子の発現はほとんど認められないが、ｐｒｘＣ２のプロ
モーターが存在すると葉、茎、根、いずれの器官でも高
いＧＵＳ活性が認められ、ｐｒｘＣ２のプロモーターが
いずれの器官でも高く発現しうることが示された。また
ｐｒｘＣ２のプロモーターは、同様に測定したｐｒｘＣ
１ａおよびｐｒｘＣ１ｂのプロモーターよりも高いＧＵ
Ｓ活性を示した。
【００２５】
【表３】
【００２６】[5] トランスジェニックタバコ植物体のカ
ルス化によるＧＵＳ活性の誘導 各種形質転換タバコ植物体の葉部を5 mm〜1 cm角に切取
り、これをカルス誘導培地（表２参照）に置床し、25
℃、暗所下で２〜３週間培養し形成された各カルスのＧ
ＵＳ活性を前述[3] 記載の方法に従い測定した。その結
果を表４に示した。ＣａＭＶ35Ｓプロモーターを導入し
たものではカルス化してもＧＵＳ活性は誘導されず、比
活性はむしろ低下した。他方、ｐｒｘＣ２のプロモータ
ーを導入したものではカルス化により更に約40倍活性が
上昇し、ｐｒｘＣ２のプロモーターがカルス化に伴い、
より誘導的に強く発現することが示された。また、ｐｒ
ｘＣ２のプロモーターは、同様に測定したｐｒｘＣ１ａ
およびｐｒｘＣ１ｂのプロモーターよりもカルス化に伴
い、より誘導的に強く発現することが示された。
ルス化によるＧＵＳ活性の誘導 各種形質転換タバコ植物体の葉部を5 mm〜1 cm角に切取
り、これをカルス誘導培地（表２参照）に置床し、25
℃、暗所下で２〜３週間培養し形成された各カルスのＧ
ＵＳ活性を前述[3] 記載の方法に従い測定した。その結
果を表４に示した。ＣａＭＶ35Ｓプロモーターを導入し
たものではカルス化してもＧＵＳ活性は誘導されず、比
活性はむしろ低下した。他方、ｐｒｘＣ２のプロモータ
ーを導入したものではカルス化により更に約40倍活性が
上昇し、ｐｒｘＣ２のプロモーターがカルス化に伴い、
より誘導的に強く発現することが示された。また、ｐｒ
ｘＣ２のプロモーターは、同様に測定したｐｒｘＣ１ａ
およびｐｒｘＣ１ｂのプロモーターよりもカルス化に伴
い、より誘導的に強く発現することが示された。
【００２７】
【表４】
【００２８】
【発明の効果】本発明のＤＮＡ断片は、植物細胞内等で
良好なプロモーター活性を有するので、各種異種遺伝子
を発現し得る発現ベクターに有利に使用し得る。本発明
のベクターは、種々の有用なポリペプチドを宿主内で効
率よく発現させることができる。
良好なプロモーター活性を有するので、各種異種遺伝子
を発現し得る発現ベクターに有利に使用し得る。本発明
のベクターは、種々の有用なポリペプチドを宿主内で効
率よく発現させることができる。
【００２９】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Toyo Boseki Kabushiki Kaisha <120> DNA Fragment Having Promoter Activity <130> A-4004 <160> 1 <210> 1 <211> 532 <212> DNA <213> Armoracia rusticana <220> <221> promoter <222> (1)...(527) <400> 1 ctagagtcat tttcattttt ataatcttat agtttatgat agatcataaa tttgaattta 60 taatatatgt gtttgcaaat ttgcataaga aattcattag taccttttat ttatcgtgta 120 aatatttttt ttctaaatat taaatattta agttgaaact acaaatttat aaaaatacaa 180 attgaattta taaatgtatt caaagtacat aaaagaaaag attctatatt ataaacacgt 240 gatattcttt aaattttaat ccaatttgcc gaaagaaaac agaaactttt aaaccacttt 300 gtacagaatt attaaacaca ttgtcgtatt atcttccaca tgtaataagt caggtattgg 360 ataagagtat atttatacac cacttgagta caaatatctc caataattca caaaaagtaa 420 aagccgccga gcttcctttt ttgcttataa aaggatttgt taagacgaaa ctttattcac 480 tcaacttcaa acctaaccaa agaattttat cttagagagc aaagaaa atg ca 532 Met 1
【図１】ｐｒｘＣ２の５’非翻訳領域をｐＢＩ１０１の
ＧＵＳ遺伝子の上流に組込む方法を示す図である。な
お、図中において、Ｃ２はｐｒｘＣ２を、ＧＵＳはベー
ターグルクロニダーゼを、ＮＰＴIIはネオマイシンリン
酸転移酵素の遺伝子を表わしている。
ＧＵＳ遺伝子の上流に組込む方法を示す図である。な
お、図中において、Ｃ２はｐｒｘＣ２を、ＧＵＳはベー
ターグルクロニダーゼを、ＮＰＴIIはネオマイシンリン
酸転移酵素の遺伝子を表わしている。
Claims (6)
- 【請求項１】 植物細胞においてプロモーター活性を有
する西洋ワサビペルオキシダーゼアイソザイム遺伝子由
来のＤＮＡ断片であって、タバコ培養細胞においては、
カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの約
４倍またはそれ以上のプロモーター活性を有することを
特徴とするＤＮＡ断片。 - 【請求項２】 請求項１記載のＤＮＡ断片を含むベクタ
ー。 - 【請求項３】 異種遺伝子が該ＤＮＡ断片の転写制御下
にある請求項２記載のベクター。 - 【請求項４】 異種遺伝子が生理活性を有するポリペプ
チドをコードする遺伝子である請求項３記載のベクタ
ー。 - 【請求項５】 該ポリペプチドがベータ−グルクロニダ
ーゼ、ペルオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ
およびルシフェラーゼからなる群より選択される請求項
４記載のベクター。 - 【請求項６】 請求項２〜５のいずれかに記載のベクタ
ーにより形質転換された植物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11196728A JP2000041688A (ja) | 1999-07-09 | 1999-07-09 | プロモ―タ―活性を有するｄｎａ断片 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11196728A JP2000041688A (ja) | 1999-07-09 | 1999-07-09 | プロモ―タ―活性を有するｄｎａ断片 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24477990A Division JP3259178B2 (ja) | 1990-09-14 | 1990-09-14 | プロモーター活性を有するｄｎａ断片 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000041688A true JP2000041688A (ja) | 2000-02-15 |
Family
ID=16362614
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11196728A Pending JP2000041688A (ja) | 1999-07-09 | 1999-07-09 | プロモ―タ―活性を有するｄｎａ断片 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000041688A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8552256B2 (en) | 2008-04-11 | 2013-10-08 | National Institute Of Agrobiological Sciences | Gene capable of being expressed specifically in endosperm of plant, promoter for the gene, and use of the gene and the promoter |
-
1999
- 1999-07-09 JP JP11196728A patent/JP2000041688A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8552256B2 (en) | 2008-04-11 | 2013-10-08 | National Institute Of Agrobiological Sciences | Gene capable of being expressed specifically in endosperm of plant, promoter for the gene, and use of the gene and the promoter |
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