JP3259178B2 - プロモーター活性を有するｄｎａ断片 - Google Patents
プロモーター活性を有するｄｎａ断片Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、植物細胞内等で異種蛋白遺伝子を発現させ
る時、好適に使用されるプロモーター活性を保持するDN
A断片、該DNA断片が導入されたベクター及び該ベクター
により形質転換された宿主に関する。
る時、好適に使用されるプロモーター活性を保持するDN
A断片、該DNA断片が導入されたベクター及び該ベクター
により形質転換された宿主に関する。
遺伝子組換え技術の分野では、遺伝子の発現量を増大
させるために強力なプロモーターにより、産生mRNA量を
増大させることが行われている。植物においては、その
様な例としてカルフラワーモザイクウィルス35s（CaMV3
5s）プロモーターが多用されている。しかしながら、こ
のプロモーターを使用して異種蛋白遺伝子を発現させた
場合、必ずしも期待通りの発現量が得られないことが多
い。そこで、更に強力なプロモーターの開発が望まれて
いた。
させるために強力なプロモーターにより、産生mRNA量を
増大させることが行われている。植物においては、その
様な例としてカルフラワーモザイクウィルス35s（CaMV3
5s）プロモーターが多用されている。しかしながら、こ
のプロモーターを使用して異種蛋白遺伝子を発現させた
場合、必ずしも期待通りの発現量が得られないことが多
い。そこで、更に強力なプロモーターの開発が望まれて
いた。
ところで、ペルオキシダーゼには、多くのアイソザイ
ムが存在すると言われ、ペルオキシダーゼを高生産する
西洋ワサビの培養細胞が既に獲得されている［Yamada,
Y.,et al.,J.Chem.Tech.Bioch.,38,31（1987）］。ま
た、この西洋ワサビ培養細胞から得たペルオキシダーゼ
アイソザイムのゲノム遺伝子の構造が決定され、その5'
上流にプロモーター配列が存在することが確認されてい
る（昭和62年度日本醗酵工学会講演要旨集,p21）。
ムが存在すると言われ、ペルオキシダーゼを高生産する
西洋ワサビの培養細胞が既に獲得されている［Yamada,
Y.,et al.,J.Chem.Tech.Bioch.,38,31（1987）］。ま
た、この西洋ワサビ培養細胞から得たペルオキシダーゼ
アイソザイムのゲノム遺伝子の構造が決定され、その5'
上流にプロモーター配列が存在することが確認されてい
る（昭和62年度日本醗酵工学会講演要旨集,p21）。
本発明者らは、これらの事情に鑑み、各種研究を重ね
た結果、この西洋ワサビの培養細胞から、多種のペルオ
キシダーゼアイソザイム遺伝子のクローンを取得し、各
クローンのプロモーターを検索したところ、高いプロモ
ーター活性を有するDNA断片を見い出し、本発明の完成
に至った。
た結果、この西洋ワサビの培養細胞から、多種のペルオ
キシダーゼアイソザイム遺伝子のクローンを取得し、各
クローンのプロモーターを検索したところ、高いプロモ
ーター活性を有するDNA断片を見い出し、本発明の完成
に至った。
即ち、本発明の特徴は、第１図に示す全部もしくは一
部の塩基配列、またはそれらと均等な塩基配列を有し、
プロモーター活性を有するDNA断片、該DNAが挿入された
ベクター及び該ベクターにより形質転換された宿主に存
する。
部の塩基配列、またはそれらと均等な塩基配列を有し、
プロモーター活性を有するDNA断片、該DNAが挿入された
ベクター及び該ベクターにより形質転換された宿主に存
する。
以下にこれを詳述する。
本発明のDNA断片は次のようにして調製できる。
まず、本発明の出発遺伝子である各種ペルオキシダー
ゼアイソザイム遺伝子は西洋ワサビの培養細胞から常法
に従い、例えば、Molecular Cloning,（1989）,p.8,3,
（Cold Spring Harbor Labs.）に記載の方法に従い、cD
NAライブラリーを調製し、Welinderの報告したFEBS Let
ters,（1976）,72,19記載の西洋ワサビのペルオキシダ
ーゼのアミノ酸配列に基づき調製したDNAプローブを用
いて、遺伝子を選択することができる。また、例えば、
Molecular Cloning,（1989）,p.9,4,（Cold Spring Har
bor Labs.）に記載の方法に従い、西洋ワサビの培養細
胞からゲノムライブラリーを調製し、既に得られている
アイソザイム遺伝子をプローブにして、更に多くのペル
オキシダーゼアイソザイム遺伝子を選択することができ
る。なお、これらのペルオキシダーゼアイソザイム遺伝
子の選択方法は、既に本発明者等により発表されてい
る。すなわち、Fujiyama et al.,Eur.J.Biochem.173,
（1988）,681−687において、prxC1a及びprxC1bと命名
されたペルオキシダーゼアイソザイム遺伝子が単離され
たことが記載されており、またFujiyama et al.,Gene,8
9,（1990）,163−169において、prxC2及びprxC3と命名
されたペルオキシダーゼアイソザイム遺伝子が単離され
たことが記載されている。
ゼアイソザイム遺伝子は西洋ワサビの培養細胞から常法
に従い、例えば、Molecular Cloning,（1989）,p.8,3,
（Cold Spring Harbor Labs.）に記載の方法に従い、cD
NAライブラリーを調製し、Welinderの報告したFEBS Let
ters,（1976）,72,19記載の西洋ワサビのペルオキシダ
ーゼのアミノ酸配列に基づき調製したDNAプローブを用
いて、遺伝子を選択することができる。また、例えば、
Molecular Cloning,（1989）,p.9,4,（Cold Spring Har
bor Labs.）に記載の方法に従い、西洋ワサビの培養細
胞からゲノムライブラリーを調製し、既に得られている
アイソザイム遺伝子をプローブにして、更に多くのペル
オキシダーゼアイソザイム遺伝子を選択することができ
る。なお、これらのペルオキシダーゼアイソザイム遺伝
子の選択方法は、既に本発明者等により発表されてい
る。すなわち、Fujiyama et al.,Eur.J.Biochem.173,
（1988）,681−687において、prxC1a及びprxC1bと命名
されたペルオキシダーゼアイソザイム遺伝子が単離され
たことが記載されており、またFujiyama et al.,Gene,8
9,（1990）,163−169において、prxC2及びprxC3と命名
されたペルオキシダーゼアイソザイム遺伝子が単離され
たことが記載されている。
本発明のDNA断片は、この様にして単離したたprxC1a,
prxC1b,prxC2及びprxC3等のクローンを種々の制限酵素
によって切断し、異種蛋白を発現させ、その量を測定す
ることによって、最も高いプロモーター活性を示した5'
非翻訳領域の一部である。
prxC1b,prxC2及びprxC3等のクローンを種々の制限酵素
によって切断し、異種蛋白を発現させ、その量を測定す
ることによって、最も高いプロモーター活性を示した5'
非翻訳領域の一部である。
prxC1aの5'非翻訳領域については、制限酵素Xba I
（塩基配列−525）と制限酵素EcoR I（塩基配列−５）
で切断した断片を調製した。
（塩基配列−525）と制限酵素EcoR I（塩基配列−５）
で切断した断片を調製した。
prxC1bについては、制限酵素EcoR I（塩基配列−53
3）と制限酵素NSi I（塩基配列＋１）で切断した断片を
調製した。
3）と制限酵素NSi I（塩基配列＋１）で切断した断片を
調製した。
prxC2については、制限酵素Xba I（塩基配列−527）
と制限酵素NSi I（塩基配列＋５）で切断した断片を調
製した。
と制限酵素NSi I（塩基配列＋５）で切断した断片を調
製した。
prxC3については、制限酵素EcoR I（塩基配列−484）
と制限酵素Hind III（塩基配列＋63）で切断し、更に修
飾酵素Exonuculease IIIでHind IIIサイトから−５の位
置まで分解した断片を調製した。
と制限酵素Hind III（塩基配列＋63）で切断し、更に修
飾酵素Exonuculease IIIでHind IIIサイトから−５の位
置まで分解した断片を調製した。
これらの各遺伝子の5'非翻訳領域のプロモーター活性
の検索は、レポータ遺伝子としてベーターグルクロニナ
ーゼ（GUS）遺伝子を用い、それと5'非翻訳領域とのキ
メラ遺伝子を作製し、それらとpUC系プラスミドまたはp
BI系プラスミドとから発現プラスミドを構築し、これら
を植物プロトプラストに導入することにより、または、
植物形質転換体を作製し、GUS遺伝子の発現量を測定す
ることにより行うことができる。その結果、第１図に示
すprxC2の5'非翻訳領域がCaMV35sプロモーターよりも高
い活性を示し、更にprxC1a,prxC1b,prxC3の5'非翻訳領
域よりも高い活性を示すことが見出された。
の検索は、レポータ遺伝子としてベーターグルクロニナ
ーゼ（GUS）遺伝子を用い、それと5'非翻訳領域とのキ
メラ遺伝子を作製し、それらとpUC系プラスミドまたはp
BI系プラスミドとから発現プラスミドを構築し、これら
を植物プロトプラストに導入することにより、または、
植物形質転換体を作製し、GUS遺伝子の発現量を測定す
ることにより行うことができる。その結果、第１図に示
すprxC2の5'非翻訳領域がCaMV35sプロモーターよりも高
い活性を示し、更にprxC1a,prxC1b,prxC3の5'非翻訳領
域よりも高い活性を示すことが見出された。
本発明では、第１図に示すDNA塩基配列は、プロモー
ター活性を損なわない範囲内で一部を削除あるいは改変
してもよい。
ター活性を損なわない範囲内で一部を削除あるいは改変
してもよい。
本発明のプロモーター活性を有するDNA断片はpUC系プ
ラスミド、pBI系プラスミド等のプラスミドベクター中
に挿入され、異種蛋白遺伝子を発現させるためのベクタ
ーとして使用される。
ラスミド、pBI系プラスミド等のプラスミドベクター中
に挿入され、異種蛋白遺伝子を発現させるためのベクタ
ーとして使用される。
プロモーター活性を有するDNA断片の各種プラスミド
への挿入は、DNA組換えの一般的方法、例えば、Molecul
ar Cloning,（1989），（Cold Spring Harbor Labs.）
に記載の方法に従って行うことができる。例えばprxC2
の5'非翻訳領域を含むXba I/Nsi I断片はpUC18のXba I
とPst Iで切断したマルチクローニングサイトとライゲ
ーションすれば、プラスミドpUC18に挿入することがで
きる。
への挿入は、DNA組換えの一般的方法、例えば、Molecul
ar Cloning,（1989），（Cold Spring Harbor Labs.）
に記載の方法に従って行うことができる。例えばprxC2
の5'非翻訳領域を含むXba I/Nsi I断片はpUC18のXba I
とPst Iで切断したマルチクローニングサイトとライゲ
ーションすれば、プラスミドpUC18に挿入することがで
きる。
本発明のDNA断片を含有するベクターは、ベーターグ
ルクロニダーゼ（GUS）、ペルオキシダーゼ、アスコル
ビン酸オキシダーゼ、ルシフェラーゼ等各種動植物、酵
母等真核生物由来の遺伝子を発現させるのに好適であ
る。
ルクロニダーゼ（GUS）、ペルオキシダーゼ、アスコル
ビン酸オキシダーゼ、ルシフェラーゼ等各種動植物、酵
母等真核生物由来の遺伝子を発現させるのに好適であ
る。
また、本発明のベクターは、植物細胞または、酵母細
胞等の宿主を形質転換するのに好適に用いられる。
胞等の宿主を形質転換するのに好適に用いられる。
以下に実施例を示し、本発明を更に詳しく説明する
が、本発明はその要旨を越えない限り以下の実施例に於
いて限定されるものではない。
が、本発明はその要旨を越えない限り以下の実施例に於
いて限定されるものではない。
実施例１ ［１］ペルオキシダーゼアイソザイム遺伝子の調製 西洋ワサビゲノムDNAライブラリーの調製 西洋ワサビの茎から誘導された細胞培養〔Fujiyama e
t al.,Structure of the horseradish peroxidase isoz
yme c genes,Eur.,J.Biochem,173,（1988）,681−687〕
から〔Blin and Stafford Nucleic Acids Res.3,（197
6）,2303−2308］の方法で全DNAを調製した。次にこれ
らをManiatisの方法で制限酵素Sau3A Iで部分分解し
た。この部分分解断片を10〜40％シュクロース密度勾配
遠心分離（33,000rpm,16時間）で分画し、10〜20kbの長
さのDNA断片を回収した。これを更にアルカリフォスフ
ァターゼで処理し、脱リン化した後、あらかじめBamH I
とSal Iで処理したλEMBL4（プロメガ製）とライゲーシ
ョンし、Horn（1979）の方法によりパッケージングし
た。組換えファージで感染のためE.coli NM539を使用し
た。
t al.,Structure of the horseradish peroxidase isoz
yme c genes,Eur.,J.Biochem,173,（1988）,681−687〕
から〔Blin and Stafford Nucleic Acids Res.3,（197
6）,2303−2308］の方法で全DNAを調製した。次にこれ
らをManiatisの方法で制限酵素Sau3A Iで部分分解し
た。この部分分解断片を10〜40％シュクロース密度勾配
遠心分離（33,000rpm,16時間）で分画し、10〜20kbの長
さのDNA断片を回収した。これを更にアルカリフォスフ
ァターゼで処理し、脱リン化した後、あらかじめBamH I
とSal Iで処理したλEMBL4（プロメガ製）とライゲーシ
ョンし、Horn（1979）の方法によりパッケージングし
た。組換えファージで感染のためE.coli NM539を使用し
た。
西洋ワサビペルオキシダーゼゲノムの選択 西洋ワサビペルオキシダーゼのcDNAクローンをpSK1
（上記の文献の、Pst Iで切り出した1.3kbのDNA）をマ
ルチプライムDNAラベリング系（Amersham）を使用して
32Pでラベルした。E.coli NM539に感染させて生じたプ
ラークをナイロン膜に移した後、上記のラベルしたcDNA
プローブでプラークハイブリダイゼーションを行った。
ポジティブクローンを精製後、ファージDNAの制限酵素
切断断片をサザーンブロッティングを行い、cDNAとハイ
ブリダイズするDNA断片をpUC19にサブクローンした。
（上記の文献の、Pst Iで切り出した1.3kbのDNA）をマ
ルチプライムDNAラベリング系（Amersham）を使用して
32Pでラベルした。E.coli NM539に感染させて生じたプ
ラークをナイロン膜に移した後、上記のラベルしたcDNA
プローブでプラークハイブリダイゼーションを行った。
ポジティブクローンを精製後、ファージDNAの制限酵素
切断断片をサザーンブロッティングを行い、cDNAとハイ
ブリダイズするDNA断片をpUC19にサブクローンした。
pSK1に挿入されている32P−ラベルcDNAとハイブリダ
イズする９個の組換えλEMBL4ファージを６×104の組換
えファージの中から分離した。これらのファージのハイ
ブリダイゼーションの強度は、３クラスに分離された。
イズする９個の組換えλEMBL4ファージを６×104の組換
えファージの中から分離した。これらのファージのハイ
ブリダイゼーションの強度は、３クラスに分離された。
ハイブリダイゼーションの強度が最も強いクローン
（クラス１）のうち、１クローンがprxC1a、prxC1b遺伝
子をランダムに含んでいることがわかった。ハイブリダ
イゼーションの強度が余り強くないクローン（クラス
２）の４個の組換えクローンはcDNAプローブとハイブリ
ダイズするEcoR I制限断片（4kb）を含んでいた。ま
た、ハイブリダイゼーション強度が最も弱いクラス（ク
ラス３）は、プローブとハイブリダイズするEcoR I（1.
5kb、0.8kb）を含んでいた。これらのEcoR I断片及びク
ラス２、クラス３のクローンから得られる他の制限酵素
切断断片とオーバーラップする断片をpUC19にサブクロ
ーンし、塩基配列を決定した。
（クラス１）のうち、１クローンがprxC1a、prxC1b遺伝
子をランダムに含んでいることがわかった。ハイブリダ
イゼーションの強度が余り強くないクローン（クラス
２）の４個の組換えクローンはcDNAプローブとハイブリ
ダイズするEcoR I制限断片（4kb）を含んでいた。ま
た、ハイブリダイゼーション強度が最も弱いクラス（ク
ラス３）は、プローブとハイブリダイズするEcoR I（1.
5kb、0.8kb）を含んでいた。これらのEcoR I断片及びク
ラス２、クラス３のクローンから得られる他の制限酵素
切断断片とオーバーラップする断片をpUC19にサブクロ
ーンし、塩基配列を決定した。
これらの塩基配列をprxC1a及びprxC1bの塩基配列とそ
れから予測されるアミノ酸配列比較した結果、ペルオキ
シダーゼアイソザイム遺伝子prxC2及びprxC3と命名し
た。
れから予測されるアミノ酸配列比較した結果、ペルオキ
シダーゼアイソザイム遺伝子prxC2及びprxC3と命名し
た。
［２］DNA断片の調製 前記［１］で得たprxC2を制限酵素Xba I（塩基配列−
527）とNsi I（塩基配列＋５）で切断し、第１図に示す
DNA断片を得た。
527）とNsi I（塩基配列＋５）で切断し、第１図に示す
DNA断片を得た。
［３］タバコプロトプラストでのprxC2の5'非翻訳領域
のプロモーター活性の確認 DNA組換えの為の一連の遺伝子操作は、基本的には、M
olecular Cloning,（1989），（Cold Spring Harbor La
bs.）に従って行った。前記［２］で得たprxC2の5'非翻
訳領域532bp（第１図）とGUS遺伝子とのキメラ遺伝子を
作製し、更にそれらをpUC18につなぎ、発現プラスミド
を構築した。比較のために、prxC2の5'非翻訳領域Xba I
/Nsi I断片の代わりに、CaMV35sプロモーターを用いた
発現プラスミドも構築した。これらの発現プラスミドを
エレクトロポレーション法によりタバコプロトプラスト
に導入し、24時間後のGUS活性を測定した。GUS活性は以
下のようにして測定した。酵素抽出液300μに、2mMメ
チルウンベリフェリルグルクロライドを含む抽出液（50
mMリン酸緩衝液,pH7.0、10mM EDTA、0.1％トリトンＸ−
100、0.1％ラウリザルコシン、10mM β−メルカプトエ
タノール）を300μ加え、37℃、１時間酵素反応を行
った。0.2M Na2CO32.4mを加えて反応を停止させ、生
成物４−メチルウンベリフェロンの蛍光量を蛍光光度計
を用いて測定（Ex.365nm,Em.455nm）した。４−メチル
ウンベリフェロン量は４−メチルウンベリフェロンを用
いて作製した標準曲線より求め、それを基にGUS活性を
算出した。蛋白質濃度はBio−Rad社のプロテインアッセ
イキットを用いて測定した。その結果を第１表に示す。
この結果より、prxC2の5'非翻訳領域にはプロモーター
活性があり、しかも汎用されているCaMV35sプロモータ
ーよりも約４倍以上の強い活性を有することがわかる。
のプロモーター活性の確認 DNA組換えの為の一連の遺伝子操作は、基本的には、M
olecular Cloning,（1989），（Cold Spring Harbor La
bs.）に従って行った。前記［２］で得たprxC2の5'非翻
訳領域532bp（第１図）とGUS遺伝子とのキメラ遺伝子を
作製し、更にそれらをpUC18につなぎ、発現プラスミド
を構築した。比較のために、prxC2の5'非翻訳領域Xba I
/Nsi I断片の代わりに、CaMV35sプロモーターを用いた
発現プラスミドも構築した。これらの発現プラスミドを
エレクトロポレーション法によりタバコプロトプラスト
に導入し、24時間後のGUS活性を測定した。GUS活性は以
下のようにして測定した。酵素抽出液300μに、2mMメ
チルウンベリフェリルグルクロライドを含む抽出液（50
mMリン酸緩衝液,pH7.0、10mM EDTA、0.1％トリトンＸ−
100、0.1％ラウリザルコシン、10mM β−メルカプトエ
タノール）を300μ加え、37℃、１時間酵素反応を行
った。0.2M Na2CO32.4mを加えて反応を停止させ、生
成物４−メチルウンベリフェロンの蛍光量を蛍光光度計
を用いて測定（Ex.365nm,Em.455nm）した。４−メチル
ウンベリフェロン量は４−メチルウンベリフェロンを用
いて作製した標準曲線より求め、それを基にGUS活性を
算出した。蛋白質濃度はBio−Rad社のプロテインアッセ
イキットを用いて測定した。その結果を第１表に示す。
この結果より、prxC2の5'非翻訳領域にはプロモーター
活性があり、しかも汎用されているCaMV35sプロモータ
ーよりも約４倍以上の強い活性を有することがわかる。
［４］トランスジェニックタバコ細胞でのprxC2の非翻
訳領域のプロモーター活性の確認 prxC2の5'非翻訳領域とGUS遺伝子とのキメラ遺伝子の
プラスミドpBI101へのつなぎ換えは第２図に示した。即
ち、prxC2の5'非翻訳領域、GUS遺伝子、及びpUC18から
成る組換プラスミドからprxC2の5'非翻訳領域とGUS遺伝
子部分を含むPvu II/EcoR I断片を切り出した。一方、p
BI101はHind III/EcoR Iで切断後、Hind III切断末端を
クレノー酵素で修復し平滑末端とし、Pvu II/EcoR I断
片を挿入した。
訳領域のプロモーター活性の確認 prxC2の5'非翻訳領域とGUS遺伝子とのキメラ遺伝子の
プラスミドpBI101へのつなぎ換えは第２図に示した。即
ち、prxC2の5'非翻訳領域、GUS遺伝子、及びpUC18から
成る組換プラスミドからprxC2の5'非翻訳領域とGUS遺伝
子部分を含むPvu II/EcoR I断片を切り出した。一方、p
BI101はHind III/EcoR Iで切断後、Hind III切断末端を
クレノー酵素で修復し平滑末端とし、Pvu II/EcoR I断
片を挿入した。
トランスジェニックタバコの作製は、目的のキメラ遺
伝子をTriparental Maiting法によりアグロバクテリウ
ム（Agrobacterium）に導入し、このキメラ遺伝子の入
ったアグロバクテリウム（Agrobacterium）を用いてLea
f Disc法によりタバコ細胞を形質転換した。
伝子をTriparental Maiting法によりアグロバクテリウ
ム（Agrobacterium）に導入し、このキメラ遺伝子の入
ったアグロバクテリウム（Agrobacterium）を用いてLea
f Disc法によりタバコ細胞を形質転換した。
キメラ遺伝子のアグロバクテリウム（Agrobacteriu
m）への導入 prxC2の5'非翻訳領域とGUS遺伝子及びpBI101から構築
された組換プラスミドで形質転換されたE.coliC600（ド
ナーと称する）、pRK2013を保持するE.coliHB101（ヘル
パーと称する）をそれぞれ50μg/mカナマイシン含有L
B培地で37℃、一夜培養した。アグロバクテリウムツメ
ファシエンス（Agrobacterium Tumefaciens）LBA 4404
株は、LB培地5mで25〜28℃、約36時間培養した。
m）への導入 prxC2の5'非翻訳領域とGUS遺伝子及びpBI101から構築
された組換プラスミドで形質転換されたE.coliC600（ド
ナーと称する）、pRK2013を保持するE.coliHB101（ヘル
パーと称する）をそれぞれ50μg/mカナマイシン含有L
B培地で37℃、一夜培養した。アグロバクテリウムツメ
ファシエンス（Agrobacterium Tumefaciens）LBA 4404
株は、LB培地5mで25〜28℃、約36時間培養した。
各培養液は、1.5m容エッペンドルフチューブにと
り、遠心により集菌した。菌体は0.5〜1mの10mM MgSO
4で３回ほど洗浄した後、約30μの10mM MgSO4に懸濁
した。各菌体懸濁液は、ドナー、ヘルパー、アグロバク
テリウムツメファシエンス（A.Tumefaciens）の順でLB
プレート上にスポットし、25℃、一夜混合培養した。混
合培養菌体は、白金耳等でかき取り、1mの10mM MgSO4
に懸濁し、102〜105倍に希釈し、その50μを400μg/m
カナマイシン含有MinAプレート［MinA培地（第２表参
照）の入ったシャーレ〕に蒔き、25〜28℃、２〜３日培
養し、キメラ遺伝子が導入されたアグロバクテリウムツ
メファシエンス〔A.Tumefaciens）の単一コロニーを取
得した。
り、遠心により集菌した。菌体は0.5〜1mの10mM MgSO
4で３回ほど洗浄した後、約30μの10mM MgSO4に懸濁
した。各菌体懸濁液は、ドナー、ヘルパー、アグロバク
テリウムツメファシエンス（A.Tumefaciens）の順でLB
プレート上にスポットし、25℃、一夜混合培養した。混
合培養菌体は、白金耳等でかき取り、1mの10mM MgSO4
に懸濁し、102〜105倍に希釈し、その50μを400μg/m
カナマイシン含有MinAプレート［MinA培地（第２表参
照）の入ったシャーレ〕に蒔き、25〜28℃、２〜３日培
養し、キメラ遺伝子が導入されたアグロバクテリウムツ
メファシエンス〔A.Tumefaciens）の単一コロニーを取
得した。
Leaf Disc法によるタバコの形質転換 キメラ遺伝子を保持するアグロバクテリウムツメファ
シエンス（A.Tumefaciens）を50μg/mカナマイシン含
有LB培地5m中、25〜28℃、一夜培養したものを、シャ
ーレに移し、そこに5mm角に切った無菌タバコの葉を表
皮を下に、気孔を上にして３分間浸汐した。余分の菌液
をキムワイプで除き、LS培地プレートに置床し、25℃で
培養した。２日後、除菌用培地プレート（第２表）に移
植、３日後、シュート形成用培地（第２表）へ移植し
た。その後、５〜７日間隔でシュート形成用培地へ移植
し続けた。茎葉部の発達したシュートが出てきたら切取
り、除菌用培地に移植した。成育した幼植物体は、バー
ミキュライトとピートモスを1:1に混合し、これに約1g/
のハイポネックス溶液を充分混合したものを含む植木
鉢へ移し、一日の内14時間は10,000ルックスの光を照射
し、25℃で栽培した。なお、水は毎日与え、ハイポネッ
クス等の肥料は週に一回与えた。
シエンス（A.Tumefaciens）を50μg/mカナマイシン含
有LB培地5m中、25〜28℃、一夜培養したものを、シャ
ーレに移し、そこに5mm角に切った無菌タバコの葉を表
皮を下に、気孔を上にして３分間浸汐した。余分の菌液
をキムワイプで除き、LS培地プレートに置床し、25℃で
培養した。２日後、除菌用培地プレート（第２表）に移
植、３日後、シュート形成用培地（第２表）へ移植し
た。その後、５〜７日間隔でシュート形成用培地へ移植
し続けた。茎葉部の発達したシュートが出てきたら切取
り、除菌用培地に移植した。成育した幼植物体は、バー
ミキュライトとピートモスを1:1に混合し、これに約1g/
のハイポネックス溶液を充分混合したものを含む植木
鉢へ移し、一日の内14時間は10,000ルックスの光を照射
し、25℃で栽培した。なお、水は毎日与え、ハイポネッ
クス等の肥料は週に一回与えた。
トランスジェニックタバコの各器官でのGU活性 丈が約10cmまで成長した形質転換タバコを葉、茎、根
に分けて液体窒素で凍結させ、300〜1000mgをエッペン
ドルフチューブに分取した。抽出緩衝液（50mMリン酸緩
衝液,pH7.0、10mM EDTA、0.1％トリトンＸ−100、0.1％
ラウリルザルコン、10mM β−メルカプトエタノール）
300〜600μと海砂を加え、ガラス棒で粉砕し、遠心分
離により上清を回収した。GUS活性及び蛋白量の測定は
前述（３）記載の方法に従った。その結果を第３表に示
した。プロモーターが存在しないとGUS遺伝子の発現は
ほとんど認められないが、prxC2のプロモーターが存在
すると葉、茎、根、いずれの器官でも高いGUS活性が認
められ、prxC2のプロモーターがいずれの器官でも高く
発現しうることが示された。またprxC2のプロモーター
は、同様に測定したprxC1aおよびprxC1bのプロモーター
よりも高いGUS活性を示した。
に分けて液体窒素で凍結させ、300〜1000mgをエッペン
ドルフチューブに分取した。抽出緩衝液（50mMリン酸緩
衝液,pH7.0、10mM EDTA、0.1％トリトンＸ−100、0.1％
ラウリルザルコン、10mM β−メルカプトエタノール）
300〜600μと海砂を加え、ガラス棒で粉砕し、遠心分
離により上清を回収した。GUS活性及び蛋白量の測定は
前述（３）記載の方法に従った。その結果を第３表に示
した。プロモーターが存在しないとGUS遺伝子の発現は
ほとんど認められないが、prxC2のプロモーターが存在
すると葉、茎、根、いずれの器官でも高いGUS活性が認
められ、prxC2のプロモーターがいずれの器官でも高く
発現しうることが示された。またprxC2のプロモーター
は、同様に測定したprxC1aおよびprxC1bのプロモーター
よりも高いGUS活性を示した。
［５］トランスジェニックタバコ植物体のカルス化によ
るGUS活性の誘導 各種形質転換タバコ植物体の葉部を5mm〜1cm角に切取
り、これをカルス誘導培地（第２表）に置床し、25℃、
暗所下で２〜３週間培養し形成された各カルスのGUS活
性を前述［３］記載の方法に従い測定した。その結果を
第４表に示した。CaMV35sプロモーターを導入したもの
ではカルス化してもGUS活性は誘導されず、比活性はむ
しろ低下した。他方、prxC2のプロモーターを導入した
ものではカルス化により更に約40倍活性が上昇し、prxC
2のプロモーターがカルス化に伴い、より誘導的に強く
発現することが示された。また、prxC2のプロモーター
は、同様に測定したprxC1aおよびprxC1bのプロモーター
よりもカルス化に伴い、より誘導的に強く発現すること
が示された。
るGUS活性の誘導 各種形質転換タバコ植物体の葉部を5mm〜1cm角に切取
り、これをカルス誘導培地（第２表）に置床し、25℃、
暗所下で２〜３週間培養し形成された各カルスのGUS活
性を前述［３］記載の方法に従い測定した。その結果を
第４表に示した。CaMV35sプロモーターを導入したもの
ではカルス化してもGUS活性は誘導されず、比活性はむ
しろ低下した。他方、prxC2のプロモーターを導入した
ものではカルス化により更に約40倍活性が上昇し、prxC
2のプロモーターがカルス化に伴い、より誘導的に強く
発現することが示された。また、prxC2のプロモーター
は、同様に測定したprxC1aおよびprxC1bのプロモーター
よりもカルス化に伴い、より誘導的に強く発現すること
が示された。
〔発明の効果〕 本発明のDNA断片は、植物細胞内等で良好なプロモー
ター活性を有するので、各種異種遺伝子を発現し得る発
現ベクターに有利に使用し得る。
ター活性を有するので、各種異種遺伝子を発現し得る発
現ベクターに有利に使用し得る。
本発明のベクターは、種々の有用なポリペプチドを宿
主内で効率よく発現させることができる。
主内で効率よく発現させることができる。
第１図は、本発明のDNA断片の塩基配列を示す。 第２図は、prxC2の5'非翻訳領域をGUS遺伝子のpBI101へ
の組換えの方法を示す。なお、図中において、C2はprxC
2を、GUSはベーターグルクロニナーゼを、NPT IIはネオ
マイシンリン酸転移酵素の遺伝子を表わしている。
の組換えの方法を示す。なお、図中において、C2はprxC
2を、GUSはベーターグルクロニナーゼを、NPT IIはネオ
マイシンリン酸転移酵素の遺伝子を表わしている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (7)
- 【請求項１】以下の（ａ）または（ｂ）のDNAからな
る、西洋ワサビペルオキシダーゼアイソザイム遺伝子に
由来するDNA断片。 （ａ）下記に示す塩基配列からなるDNA （ｂ）塩基配列（ａ）において、１もしくは数個の塩基
が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、且
つプロモーター活性を有するDNA - 【請求項２】植物においてプロモーター活性を有する請
求項１記載のDNA断片。 - 【請求項３】請求項１記載のDNA断片が挿入されたベク
ター。 - 【請求項４】異種遺伝子がプロモーターの転写制御下に
ある請求項３記載のベクター。 - 【請求項５】異種遺伝子が生理活性を有するポリペプチ
ドをコードする遺伝子である請求項４記載のベクター。 - 【請求項６】異種遺伝子が、ベーターグルクロニダー
ゼ、ペルオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼお
よびルシフェラーゼからなる群より選択されるポリペプ
チドをコードする遺伝子である請求項４記載のベクタ
ー。 - 【請求項７】請求項３記載のベクターにより形質転換さ
れた双子葉植物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24477990A JP3259178B2 (ja) | 1990-09-14 | 1990-09-14 | プロモーター活性を有するｄｎａ断片 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24477990A JP3259178B2 (ja) | 1990-09-14 | 1990-09-14 | プロモーター活性を有するｄｎａ断片 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11196728A Division JP2000041688A (ja) | 1999-07-09 | 1999-07-09 | プロモ―タ―活性を有するｄｎａ断片 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04126088A JPH04126088A (ja) | 1992-04-27 |
| JP3259178B2 true JP3259178B2 (ja) | 2002-02-25 |
Family
ID=17123797
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24477990A Expired - Fee Related JP3259178B2 (ja) | 1990-09-14 | 1990-09-14 | プロモーター活性を有するｄｎａ断片 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3259178B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7354390B1 (en) | 1996-09-30 | 2008-04-08 | Her Majesty The Queen In Right Of Canada As Represented By The Minister Of Agriculture And Agri-Food | Seed coat specific nucleotide sequence encoding peroxidase |
| AU755063B2 (en) * | 1997-06-12 | 2002-12-05 | Dow Agrosciences Llc | Regulatory sequences for transgenic plants |
-
1990
- 1990-09-14 JP JP24477990A patent/JP3259178B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04126088A (ja) | 1992-04-27 |
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