KR0155453B1 - 담배식물을 통해 사람 비이형 간염 바이러스 조립된 형태의 재조합 항체를 제조하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 사람의 B형 간염 바이러스 항원과 친화력을 유지하면서 인체내에서 자가면역반응을 유발시키지 않기 위하여 B형간염 항원과의 결합부위인 영역은 쥐의 것을 그대로 사용하고 컨스턴트 영역은 사람의 것으로 재조합된 헤비체인 또는 카파체인의 B형 바이러스 항체 생성 유전자를 삽입하여 재조합된 벡터를 아그로박테리움 튜머페시언스에 각각 도입시키고, 상기 형질전환된 아그로박테리움 튜머페시언스를 선별배양 각각 담배식물에 감염시킨후, 상기 헤비체인 유전자를 포함하는 감염된 담배식물과 카파체인 유전자를 포함하는 감염된 담배식물을 상호 교배하여, 조립된 B형 간염 바이러스 항체 유전자를 발현시키는 개체를 선별한 후, 형질전환된 담배식물로부터 B형 바이러스 항체 유전자를 발현시킴을 특징으로 하는 사람 B형 간염 바이러스 재조합 항체의 제조방법에 관한 것이다.

Description

담배식물을 통해 사람 B형 간염 바이러스 조립된 형태의 재조합 항체를 제조하는 방법

제1도는 B형 간염 바이러스의 Pre-S2 항원에 대한 항체를 구성하는 헤비체인 또는 카파체인 유전자를 각각 플라스미드 pBKS-1 에 삽입함으로써 재조합 플라스미드 pBKS-1 및 pBKC-1 를 제조하는 과정을 도시한 것이다.

제2도는 B형 간염 바이러스 Pre-S2 항원에 대한 항체를 구성하는 헤비체인 또는 카파체인 유전자가 플라스미드 pBKS-1 에 삽입되었음을 확인하기위한 자외선 촬영도이다.

제3도는 형질전환된 담배의 노던(Northerm)분석 결과를 나타낸 것이다.

제4도는 형질전환된 담배내에서 Pre-S2 항원에 대한 항체를 구성하는 헤비체인 또는 카파체인이 생성된 것을 확인하기 위한 웨스턴 분석결과를 나타낸 것이다.

제5도는 B형 간염 바이러스의 Pre-S2 항원에 대한 항체를 구성하는 헤비체인 또는 카파체인 유전자에 의해 각각 형질전환된 담배를 교배하여 가나마이신이 첨가된 배지에서 담배를 선별하는 과정을 나타낸 것이다.

제6도는 B형 간염 바이러스의 Pre-S2 항원에 대한 항체를 구성하는 헤비체인 또는 카파체인 유전자가 담배 식물의 교배에 의해 한 개체의 담배내로 모두 이전되어 이 담배내에서 동물의 면역체계에 존재하는 조립된 형태의 항체가 생산됨을 확인하기 위한 웨스턴 분석의 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 담배식물(Nicotiana tabacum)로 부터 B형 간염 바이러스 항체의 헤비체인 또는 카파체인 유전자를 각각 함유하는 조립된 형태의 재조합 항체를 제조하기 위한 것으로, 더욱 상세히는 재조합 벡터로 형질전환시킨 균주를 제조하고, 상기 균주를 매개로 하여 항체의 헤비체인 또는 카파체인 유전자로 각각 형질전환된 담배식물을 제조한 후, 헤비체인 또는 카파체인 단백질을 발현시키는 상기 담배식물을 상호 교배(Cross Pollenation)하여 헤비체인 유전자 및 카파체인 유전자가 한 개체내의 담배식물에 도입시켜 상호교배에 의해 동물의 면역체계에서 존재하는 조립된 키메릭(chimeric)항체를 생산함을 특징으로 하는 형진전환된 담배식물로 부터 B형 간염 바이러스의 조립된 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다.

B형 간염 바이러스(Hepatitis-B Virus : 이하 HBV라 칭한다)는 지질막을 함유하는 정이십면체(Icosahedral)구조의 바이러스로서 B형 간염 및 간암의 주된 병원체로 알려져 있으며, 그 혈청학적인 분류에 따라 그 지리적 분포도 다르게 나타나는데, 한국을 포함하고 있는 극동아시아 지역에는 여러 가지 간염 바이러스(adr,adw,ayr,ayw)중 adr형이 특히 우세하다. 또한, B형 간염 바이러스의 표면에는 S, pre-S1, pre-S2의 표면 항원들이 존재하는데, 이중에서도 pre-S2 항원은 바이러스의 표면지질막에 존재하며 우세한 졀정인자를 가지고 있으므로 HBV에 대한 중화항체(neutralizing antibody)가 잘 형성되도록 유도한다.

종래, HBV 감염의 예방 및 치료를 위하여는 통상 건강한 보균자나 S항원을 예방 접종 받았던 사람의 혈청으로 부터 HBV 면역 글로블린을 분리해서 사용하여 왔으나, 이는 다량으로 구하기가 용이하지 않고 바이러스나 세균에 의한 오염문제도 발생시킬 수 있다는 단점이 있었다. 따라서, 생쥐내에서 HBV의 표면항원에 대한 단일클론항체를 대량으로 생산하여 이 물질을 인체에 대해 예방 및 치료제로 이용하고자 하는 시도가 있었으나, 생쥐의 단일클론항체를 인체에 임상적으로 적용하는 경우에는 대부분 쥐 유래의 항체에 대한 면역반응이 일어나 치료효과가 떨어지고 부작용이 생긴다는 문제가 발생했다. 이 경우에, 사람의 단일클론 항체를 사용한다면 이런 문제점들이 발생하지 않겠지만 이는 생산이 용이하지 않고, 일반적으로 항원에 대한 친화도가 낮다. 따라서, 이러한 문제점을 해결하기 위하여 항체중에서 항원과 직접 결합하는 부위인 베리어블 영역(Variable region : V영역)은 쥐의 것을 그대로 사용함으로써 항원에 대한 친화도를 높이는 동시에 컨스탄트 영역(Constant region : C영역)은 사람의 것을 사용함으로써 인체에 임상적으로 적용할 경우에도 항체에 대한 면역반응이 일어나지 않도록 재조합된 유전자를 사용하는 방법이 개발되었다.

한편, 현재까지 유전공학 분야에서는 외래 유전자를 미생물에 도입시킴으로써 미생물체에서 목적 단백질을 생산하는 방법이 주류를 이루어 왔으나, 이러한 과정에서 필수적으로 수반되게 마련인 미생물체의 배양은 잘 조절된 환경과 지속적인 배지의 공급을 필요로 할 뿐만 아니라, 목적 단백질이 원래 고등생물체에 존재하는 것일 경우에는 미생물체와 고등생물체 내에서의 단백질 완성 과정의 차이로 인하여 유전공학 기법을 이용하여 미생물체로 부터 생산된 단백질이 고등생물체에 존재하는 원래의 단백질과 구조 및 기능면에서 차이점을 보임에 따라 단백질 활성의 저하내지는 동물체에서의 면역 반응을 유발시킬 수도 있다.

이에 따라, 지금까지 단일클론항체의 생산은 주로 동물세포인 융합(hybridoma) 세포주를 통해서 이루어져 왔으나, 이러한 방법을 통할 경우에는 또한, 단일클론항체의 생산이 극히 소량이며, 생산단가가 높을 뿐아니라 생산과정이 복잡하여 비경제적이라는 사실이 지적되었다. 따라서 대량생산, 저렴한 생산 단가, 생산공정의 간편성 견지에서 1989년에 미국 스크립스(Scripps) 연구소의 엔드류 하이앗트(Andrew Hiatt) 연구진에 의하여 마우스의 하이브리도마 항원에 대한 단일클론항체를 미생물체가 아닌 담배식물에서 발현시키는 것이 시도되었고(참조1989, Nature 342 : 76-78), 막스 프랑크(Max Planck) 연구소의 듀링(During) 연구진에 의하여는 동일한 담배식물에서 생리적 활성을 가지는 B1-8 항원에 대한 단일클론항체의 합성과 자가조립(self assembly)에 관한 보고가 있었다(참조:1990, Mol.Biol. 15 : 281-293). 또한, 현재 식물체내에서 이루어지는 항체의 글라이코실레이션(glycosylation)에 관해서도 연구가 이루어지고 있으며, 동물세포의 경우 면역글로불린(immunoglobulin)의 사슬들이 정확하게 조립되기 위해서는 결합단백질(binding protein, 이하 BiP 라 칭한다)이 있어야 하는데 이러한 BiP가 식물체내에도 존재한다는 사실이 밝혀졌다.

한편, 토양 미생물인 아그로박테리움 튜머페시언스(Agrobacterium tumefacie

ns)는 고등식물의 상처를 통하여 식물체에 감염되었을 때 식물체의 크라운골(crown gall)부분에서 형성되는 근두암종병을 유발시키는 것으로서, Ti-플라스미드로 명명된 플라스미드를 가지고 있고, 바로 이 플라스미드의 일부인 T-DNA 가 식물체의 주 염색체상에 삽입되어 이러한 병을 유발시키는 것으로 알려졌다. 더구나 상기 미생물은 자신의 플라스미드만 식물체의 주염색체내로 삽입시키는 것이 아니라, T-DNA 의 일부를 함유하고 있는 다른 플라스미드도 식물체의 주염색체내로 도입시키는 능력을 가지고 있으므로, 이와 같은 특징을 이용하여 플라스미드 내의 병원성 유전자는 제거하고, 목적하는 유전자가 식물체에 삽입되는 데 필요한 부분만 남도록 조작된 플라스미드를 함유하는 상기 미생물은 다른 외부 유전자를 식물에 도입시키는 운반체로서 중요한 역할을 하고 있으며, 이러한 원리를 이용해 미생물체 단백질의 유전자와 식물 단백질의 유전자 그리고 소수의 동물 단백질의 유전자가 담배, 토마토, 페듀니아 등에 도입되어 이를 식물 염색체의 일부가 되어 단백질로 발현된 바 있다.

이에 본 발명자들은 상기 기술한 바와 같은 연구 결과들을 토대로 하여 HBV 에 대한 조립된 항체를 대량으로 제조하여 B형 간염 및 간암의 치료제로 이용할 수 있는 방법을 모색하고 지속적인 연구를 수행한 결과, B형 간염바이러스의 항체를 생산하는 유전자를 담배의 주 염색체내로 도입시켜 담배내에서 합성되었으며, 이를 이미 대한민국 특허출원 제93-16254호로 출원한 바 있다.

그러나, 이러한 목적을 달성함에 있어서는 택일적으로 항체를 구성하는 헤비체인 또는 카파체인 유전자를 각각 다른 개체의 담배식물에 도입시 단백질을 발현시킨 다음 후처리 과정에서 결합시키거나 담배식물의 상호교배에 의해 양 유전자를 한 개체내로 도입시키면 한 개체의 담배에서 동물의 면역체계에 존재하는 조립된 형태로 항체가 합성되어 보다 간편하게 원하는 항체를 생산하는 방법을 이용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

특히, 전자의 방법에 의할 경우에는 헤비체인 또는 카파체인을 각각 다른 개체의 담배식물에서 발현시키게 되므로 발현 및 분리 작업을 수행한 후에도 이들 단백질을 적당한 조건하에 활성을 나타내는 형태로 다시 조립하여야 하는 반면, 후자의 방법에 의할 경우에는 본 발명에서는 담배식물내에서 이러한 조립단계까지 완료되도록 한 것이므로 복잡한 후처리 과정을 생략할 수 있다는 장점이 있다.

따라서 본발명의 목적은 사람의 B형 간염 바이러스 항원과 친화력을 유지하면서 인체내에서 자가면역반응을 유발시키지 않기 위하여 B형 간염 항원과의 결합부위인 영역은 쥐의 것을 그대로 사용하고 컨스턴트 영역은 사람의 것으로 재조합된 헤비체인 또는 카파체인의 B형 바이러스 항체 생성 유전자를 삽입하여 재조합된 벡터를 아그로박테리움 튜머페시언스에 각각 도입시키고, 상기 형질전환된 아그로박테리움 튜머페시언스를 선별배양 각각 담배식물에 감염시킨 후, 상기 헤비체인 유전자를 포함하는 감염된 담배식물과 카파체인 유전자를 포함하는 감염된 담배식물을 상호 교배하여, 조립된 B형 간염 바이러스 항체 유전자를 발현시킴을 특징으로 하는 사람 B형 간염 바이러스 조립된 형태의 재조합 항체의 제조방법을 제공하는 것이다.

또한 이때, 상기 재조합 벡터는 카울리플라워 모자익 바이러스 35S 전사체의 프로모우터(35S Promoter)와 노팔라인 신테이즈 터미네이터(Tnos)사이에 B형 간염 바이러스 항체 생성 유전자를 삽입하여 제조함을 특징으로 하고, 상기 형질전환된 아그로박테리움 튜머페시언스는 가나마이신 또는 카르베니실린이 첨가된 배지에서 선별배양시킴을 특징으로 한다.

이하, 본 발명의 구성을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 B형 간염 바이러스의 항체를 구성하는 헤비체인 또는 카파체인 유전자가 각각 도입되고 운반체로는 고등식물의 형질전환용 벡터인 pBKS-1(홍주봉 등, 1989, 핵산조작에 의한 항바이러스성 식물의 개발 과학기술처 국책연구사업보고서 pp 41-43)를 사용하여 제조된 재조합 벡터 및 이 재조합 벡터에 의해 형질전환된 균주를 이용한다.

먼저, 재조합 벡터를 제조함에 있어서, B형 간염 바이러스에 대한 항체를 생산하는 헤비체인 또는 카파체인 유전자로는 사람의 B형 간염 바이러스 항원과 친화력을 유지하면서 인체내에서 자가면역 반응을 유발시키지 않기 위하여 B형 간염 항원과의 결합부위인 베리어블 영역은 쥐의 것을 그대로 사용하고 컨스턴트 영역은 사람의 것으로 재조합된 B형 바이러스 항체 생성 유전자인 헤비체인과 카파체인 단백질을 생산하는 유전자를 삽입할 수 있는 클론 pBluscript SK⁺이 이용된다. 이 클론 pBluscript SK⁺은 EcoRI 및 Sall 위치에 헤비체인 또는 카파체인이 각각 삽입되어 있는 것을 사용하며, 이를 각각 pBKS-1 의 카울리플라워(Cauliflower) 모자의 바이러스의 35S 전사체의 프로모터(35S promoter)와 노팔라인 신테이즈의 터미네이터(nopaline synthase terminator, 이하 Tnos라 칭한다) 사이에 있는 X6aI 제한효소위치에 삽입시켜 헤비체인 또는 카파체인을 함유하고 있는 2가지의 재조합 벡터 pBHC-1 및 pBKC-1을 제조한다(제1도 참조).

상기에서 사용한 클론 pBluscript SK⁺및 운반체 벡터 pBKS-1 는 한국과학기술연구원 산하 유전공학센터로 부터 제공받은 것으로서, 여기서 벡터 pBKS-1은 제한 효소 Xba I 절단부위를 가지고 있는 특징이 있는데, 본 발명에서는 이 Xba I 절단부위를 클로닝 작업 수행시에 유용하게 이용하였다.

한편, 담배식물내로 항체 유전자를 도입하기 위한 운반 균주로는 아그로박테리움 튜머페시언스를 선택하여 사용하며, 특히 아그로박테리움 튜머페시언스, LBA4404를 선택하여 안 등(An et al) 방법의 변형법에 따라 재조합 벡터 pBHC-1 및 pBKC-1를 도입시킴으로써(제2도 참조) 항체를 구성하는 헤비체인 또는 카파체인 유전자에 의해 형질전환된 균주를 제조한다.

형질전환된 균주를 제조하기 위해서는 YEP 배지(1리터당 10g의 효모추출물, 10g의 팹톤, 5g의 소금, pH 7.0) 상에서 대수기의 증식단계에 있는 아그로박테리움 튜머페시언스 LBA4404를 회수하여 20mM 칼슘클로라이드 용액에 현탁시킨 다음 여기에 이미 제조된 재조합 벡터 pBHC-1 및 pBKC-1를 가하여 배양하고 계속하여 가나마이신이 첨가된 한천배지에서 배양하여 선별함으로써 수득한다.

형질전환된 담배식물을 제조하기 위해서는 상기 기술한 과정을 통해 형질 전환되고 선별된 아그로박테리움 튜머페시언스 LBA4404 를 이용하여 다음에 설명하는 방법으로 목적하는 유전자를 담배식물내로 도입시키고 유전자를 발현시킨다.

먼저 담배의 어린 잎을 장방형으로 절단하여 액체 신초 유기용 배지(MS + 0.5mg BAP/L)로 옮긴 후 여기에 미리 YEP 배지상에서 12시간 진탕 배양한 상기의 헤비체인 또는 카파체인 유전자에 의해 형질전환된 아그로박테리움 균주를 첨가한다. 혼합액을 1-2일간 암배양한 후, MS배지(참조:Schuler, M.A et al., Methods in Plant Molecular Biology, Academic Press, San Diego, U.S.A. 1989)로 2-3회 세척하고 세척한 담배잎 절편은 항생제인 카르베니실린(250mg/L)과 가나마이신(10mg/L)을 함유한 선택배지에서 배양한다. 외부 유전자가 도입된 식물에서는 캘루스와 신초의 형성이 2주 후에 이루어지므로 이것을 발근용배지에 계대배양하여 발근을 유도하면 2-3주 후에는 가나마이신이 첨가된 발근용 배지에서 대부분의 산초가 발근한다. 일단 뿌리가 형성된 형질전환체는 온실 내 토양으로의 이식이 가능하게 된다.

이러한 방법으로 유전자가 도입되어 형질전환된 담배에서 B형 간염바이러스의 항체를 구성하는 헤비체인과 카파체인 유전자가 발현되는지를 확인하기 위해 하기 실시예에 상세히 기재한 방법에 따라 노던분석 및 단백질의 항원/항체 반응을 이용한 웨스턴분석을 시행하였다. 노던분석 결과, 헤비체인 유전자가 도입된 담배식물로 부터는 약 18kb 염기의 크기의 위치에서 노던 특이적 밴드가 확인된 반면 형질전환 과정이 이루어 지지 않은 담배식물로 부터는 노던 특이적 밴드가 확인되지 않았으며(제3도 참조), 또한 웨스턴분석 결과, 헤비체인 유전자가 도입된 담배식물로 부터는 약 62kd의 분자량 위치에서(제4도의 a참조), 카파체인 유전자가 도입된 담배식물로 부터는 약 34kd의 분자량 위치에서(제4도의 b참조) 웨스턴 특이적밴드가 표출된 반면 형질전환이 시도되지 않았던 담배식물로 부터는 특이성 웨스턴 밴드가 표출되지 않았다. 따라서, 이와 같은 분석 결과를 통해서 담배식물이 B형 간염 바이러스의 항체를 구성하는 헤비체인 또는 카파체인 유전자을 각각 안정적으로 발현하는 것을 확인할 수 있었다.

B형 간염 바이러스에 대한 항체를 구성하는 헤비체인 또는 카파체인 유전자에 의해 형질전환됨으로써 각각의 단백질을 발현할 수 있는 담배식물을 얻게된 본 발명자들은 다음 단계로서 담배식물의 한 개체내에서 상기 항체를 동물의 면역 체계에 존재하는 조립된 형태로 수득하기 위한 연구에 돌입하였으며, 하기의 과정을 통해 그러한 목적을 달성할 수 있었다. 즉, 헤비체인 단백질을 발현하는 개체인 GC,1-1 과 카파체인 단백질을 발현하는 개체인 KC. H2-24를 임의 선택하여 양자를 화분교배(Cross Pollenation)시키고 그 종자를 채취하여 가나마이신이 200 ㎍/㎖ 첨가된 배지에서 배양함으로써 그중 살아남은 개체(Progeny)를 선별한다(제5도 참조). 선별된 식물체들은 다시 순환단계를 거쳐 온실로 이동시키고 약 한 달동안 재배한 후 각 개체에 대해 웨스턴 분석을 실시하여 B형 간염 바이러스 항체의 헤비체인 또는 카파체인 유전자가 한 개체의 식물로 모두 이전되어 조립된 항체가 생산 되는지의 여부를 확인한다.

상기 방법대로 실시하고 웨스턴 분석방법을 이용하여 검증한 결과, 최종적으로 수득된 담배식물로부터 추출한 단백질에 베타머캅토에탄올을 처리한 경우는 조립된 항체내에 존재하는 디설파이드 결합이 끊어져서 항체를 구성하는 헤비체인 62 kd 와 카파체인 34 kd 의 크기로 각각 나타나는 반면(제6도의 a 참조), 이 단백질에 베타머캅토에탄올을 처리하지 않은 경우에는 항체의 디설파이드 결합이 여전히 존재하기 때문에 조립된 항체인 220kd 의 크기로 나타나는 것을 확인하였다(제6도의 b 참조). 한편, 두 개의 유전자가 모두 전이되지 않은 개체에서는 조립된 항체의 밴드가 나타나지 않았다. 따라서, 본 발명의 결과 B형 간염 바이러스의 항체를 조립된 형태로 직접 식물체내에서 발현시키는 것이 가능해 졌으므로, 담배식물에서 헤비체인 또는 카파체인 단백질이 각각 발현되는 경우 각 단백질을 활성형 항체로 조립하여야 하는 것과 같은 복잡한 후처리 과정 없이 분리 및 정제방법만을 통해 조립된 항체를 생산할 수 있게 되었다.

B형 간염 바이러스의 항체 단백질을 생성하도록 담배식물을 재배하고 이 담배식물로부터 실제 산업적으로 이용할 수 있을 정도의 순도로 항체를 분리 및 정제하기 위해서는 프로테인 에이-세파로오스 친화성 크로마토그래피(Protein A-Sepharose affinity chromatography) 방법에 따라 실시할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 설명한 벙법에 따른 제조과정은 거쳐 수득된 항체를 유효성분으로 함유하는 B형 간염 및 간암 치료제를 제공함을 목적으로 한다. 이러한 치료제는 당분야에서 사용되는 통상의 방법에 따라 다양한 제형으로 제조될 수 있고 필요에 따라 약제학적으로 허용되는 보조제와 함께 배합되어 사용될 수도 있는데, 여기서 사용가능한 보조제로는 자일로오스(xylose), 푸코오스(fucose), N-아세틸 글루코오스아민(N-acetly glucosamine) 등을 들 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 어떤 형태로든 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

제조합 벡터 pBHC-1 및 pBKC-1 의 제조

사람의 B형 간염 바이러스 항원과 친화력을 유지하면서 인체내에서 자가면역 반응을 유발시키지 않기 위하여 B형 간염 항원과의 결합부위인 베리어블 영역은 쥐의 것을 그대로 사용하고 컨스턴트 영역은 사람의 것으로 재조합된 B형 바이러스 항체 생성 유전자인 헤비체인과 카파체인 단백질을 생산하는 유전자를 삽입할 수 있는 클론 pBluscript SK⁺는 홍효정(한국과학기술연구원 유전공학센터)에 의해 제공되었다. 플라스미드 pBluscript SK⁺는 B형 간염 바이러스의 헤비체인 또는 카파체인 유전자가 각각 EcoR I 과 Sal I의 위치에 삽입 되어있다. 따라서, 이 유전자를 고등식물 형질전환용 벡터인 pBKS-1에 삽입하기 위하여 플라스미드 pBluscript SK⁺를 제한효소 Sal I으로 절단한 후, XbaI 어댑터를 부착하여 다시 연결하였다. 재연결된 플라스미드 및 pBKS-1을 제한효소 튜 으로 각각 절단하여 헤비체인 1592 bp 조각과 카파체인 850 bp 조각을 아가로오즈겔과 DEAE-셀룰로오스 종이를 이용하여 회수하였다. 분리된 두 개의 유전자 조각을 T4-DNA 리가아제를 이용하여 pBKS-1의 XbaI 위치에 접합시키고(제1도 참조) E. coli 내로의 도입 및 증폭과정을 거쳐 플라스미드 DNA를 수거하였다.

전체의 실험조건은 문헌(참조: Maniatis et al., Molecular Cloling:a laboratory manual pp. 25-28, 1982)에 기재된 바에 준하였으며, 이러한 실험과정을 거쳐 제조된 헤비체인을 운반 벡터는 pBHC-1으로, 카파체인 운반 벡터는 pBKC-1으로 각각 명명하였다.

[실시예 2]

아그로박테리움 튜머페시언스내로 재조합 벡터의 도입

실시예 1에 기재된 방법에 따라 제조된 재조합 벡터를 아그로박테리움 튜머페시언스 LBA4404 내로 도입시키기 위해 하기와 같이 실시하였다. 먼저, YEP 배지(1리터당 10g의 효모 추출물, 10g의 펩톤, 5g의 소금, ph 7.0)에서 28℃, 150 r.p.m.으로 배양한 후, 대수기에 도달한 아그로박테리움 튜머페시언스 LBA4404 를 3,000g으로 5분간 4℃에서 원심분리하여 수확한 다음 0℃의 20mM 칼슘클로라이드 용액에 현탁하였다. 현탁액의 농도는 ml당 1 x 10⁹개 정도의 세포수가 되도록 하여 사용하였다. 준비된 형질전환용 미생물 현탁액 0.1ml에 실시예 1에서 제조된 플라스미드 DNA 약 100mg 을 첨가한 후 액체질소에서 3분간 급속 냉동시켰다. 이를 다시 5분간 37℃ 수조에서 현탁액 부피에 대해 10배의 YEP 배지를 첨가하여 28℃에서 150 rpm으로 교반하며 2-4시간 동안 현탁 배양하였다.

재조합된 DNA가 도입된 아그로박테리움은 5ug/ml의 가나마이신이 들어있는 YEP 고체배지에 도말하여 배양함으로써 선별하였다. 28℃에서 이틀간 배양하면 아그로박테리움의 군체가 식별이되므로 이들을 다시 YEP 배지에서 배양하였다.

한편, YEP 배지에서 배양된 미생물로 부터 알카리분해(alkaline lysis) 방법 (참조: Maniatis et al., 1982)으로 플라스미드 DNA 를 분리하고 분리된 플라스미드 DNA를 제한효소 EcoR I/BamH I, Eco I 및 BamH I 으로 처리함으로써 본 발명에서 목적하는 B형 간염 바이러스의 항체를 구성하는 헤비체인 또는 카파체인 유전자가 고등식물 형질전환용 벡터 pBKS-1에 삽입되었음을 확인하고자 시도하였다. 즉, 제한효소에 의해 절단된 단편들에 대해 아가로스젤 전기영동 및 에티듐브로마이드 염색을 실시한 후, 자외선 조사로 유전자 절편들을 관찰하였는데 가나마이신이 첨가된 배지에서 선별된 아그로박테리움(90% 이상)을 제한효소 EcoR I 으로 처리시 헤비체인 유전자와 Tnos 터미네이터가 포함된 약 2kb의 밴드 및 카파체인 유전자와 Tnos 터미네이터가 포함된 약 1.2kb의 밴드가 원하는 위치에서 나타났다(제2도 참조). 따라서, 목적한 유전자가 아그로박테리움 내로 도입되었으며 안정한 유지 및 증폭이 이루어지고 있음이 확인되었다.

[실시예 3]

형질전환된 담배식물의 제조 및 담배식물의 재분화

담배(Nicotina tabacum cv. Wisconsin 38)의 어린 잎, 즉 발아후 두달 정도 온실에서 자란 담배 식물의 위로부터 4번째 내지 7번째의 잎을 0.1% 하이포클로라이드 용액에 5분동안 담가둠으로써 소독하고 가로 및 세로 약 1cm 정도가 되도록 절단한 후, 액체 신초 유기배지(MS 배지 + 0.5mg/16-벤질아미노산퓨린)를 잎 절편이 겨우 잠길 정도로 분주한 페트리-디쉬에 옮겼다. 실시예1에 따라 제조된 재조합 벡터 pBHC-1 또는 pBKC-1 가 삽입되어 있는 실시예2의 아그로박테리움 균주를 약 3 ml 의 YEP 액체 배지에서 12시간동안 150 rpm 으로 진탕 배양하고 그중 100㎕ 씩을 각 페트리-디쉬에 첨가하였다. 이것을 25℃에서 1-2일간 암배양 한 후 MS 배지로 세척하고, 항생제 카르베니실린(250ug/ml) 및 가나마이신(200ug/ml)을 함유한 신초유기배지에서 배양하였다.

배양한지 2주 경과 후에는 이들 잎절편으로 부터 다량의 캘러스와 신초가 유기되는 것을 관찰할 수 있었다. 이것을 발근용 배지에 계대배양하여 발근을 유도하였으며 2-3주 후에는 가나마이신이 첨가된 발근용배지에서 대부분의 신초가 발근되었다. 뿌리가 형성된 형질전환체는 온실내의 토양에 이식하는 것이 가능하게 되었다.

[실시예 4]

형질전환된 담배식물에 대한 분석

형질전환된 담배에 B형 간염 바이러스의 항체를 구성하는 헤비체인 또는 카파체인을 생산하는 유전자가 제대로 도입되었는지, 또한 도입된 유전자가 식물체내에서 발현되는지를 확인하기 위해 하기 방법에 따라 노던 분석 및 웨스턴 분석을 실시하였다.

B형 간염 바이러스의 항체를 구성하는 헤비체인 또는 카파체인 유전자가 도입된 후 재분화를 거친 담배식물과 형질전환 과정을 거치지 않은 담배식물의 잎을 채취하여 RNA를 분리하였다. 채취된 약 2g 정도의 잎을 멸균 증류수로 세척한 후 막자사발에 넣고 여기에 5배의 용해완충액(50% 구아니딘 다이오싸이아네이트, 0.5% N-라우닐싸르코신, 0.1% 베타-머캅토에탄올 및 25mM EDTA, pH 7.5)을 첨가하여 마쇄하였다. 마쇄된 용액을 4℃에서 6,000g로 10분간 원심분리하여 얻어진 상등액을 0.1M EDTA(pH 7.5)에 5.7M 농도가 되도록 용해시킨 CsCl 용액 2.3ml 위에 총 5ml이 되도록 서서히 부은 후, 15℃, 22,000 rpm 에서 SW 50.1 roter로 22시간동안 원심분리 하였다. 원심분리 후, 침전물을 10mM TrisㆍCl(pH 7.5)과 0.1% SDS 용액에 녹이고 클로로포름/1-부탄올(4:1) 혼합액으로 일단 정제한 후 에탄올 침전시켜 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 50% 포름알데히드가 함유된 아가로스겔 전기영동으로 크기에 따라 구분한 후, 삼투압을 이용하여 나이트란막으로 전이시켰다(참조: Maniatis et al., 1982). RNA가 전이된 나이트란 막은 즉시 자외선으로 5분간 조사되어 RNA를 나이트란 막에 부착시키고 이 막을 노던 특이성 결합반응에 이용하였다. 프로브로는 B형 간염 바이러스의 항체를 구성하는 헤비체인 및 카파체인 유전자 두 개를 각각 P32 표지하여 준비하였고, 50% 포름아미드 존재하에 37℃ 의 실험조건에서 특이성 결합반응을 수행하고, 반응후에는 0.2% SSPE로 37℃에서 15분간 2회 세척하였다. 기타의 반응 조건들은 Maniastis et al.(1982)에 기술된 바에 준하였다. 세척이 끝난 나이트란 막을 랩으로 싸고 두장의 인텐시파잉막(intensifying membrane)을 부착시킨 후 -70℃에서 X-ray 필름에 이틀간 노출시켰다.

상기와 같이 실험을 수행한 결과, B형 간염 바이러스의 항체를 합성하는 헤비체인 유전자가 도입된 담배 식물로 부터는 약 18kb 염기의 크기에서 노던 특이적 밴드가 관찰된 반면, 형질전환 과정이 이루어 지지 않은 담배식물로 부터는 노던 특이적 밴드가 관찰되지 않았으므로 상기 실시예에서 설명한 형질전환 방법에의해 B형 간염 바이러스의 항체의 헤비체인 유전자가 담배식물에 도입되었으며 성공적으로 헤비체인 mRNA를 생성시키는 것이 확인되었다(제3도 참조).

한편, B형 간염 바이러스의 항체를 합성하는 헤비체인 또는 카파체인 단백질이 형질전환된 담배식물에서 생성되는지의 여부는 웨스턴 특이성 결합반응을 수행함으로써 확인하였다. 가나마이신이 첨가된 신초 유기배지에서 신초를 유기하고 발근용 배지로 계대 배양한 식물체 중 헤비체인 유전자로 형질전환된 것 4개와 카파체인 유전자로 형질전환된 것 8개로 부터 0.01M 포스페이트 완충 용액을 이용하여 단백질을 추출하였다. 단백질을 변성시키기 위한 완충용액(0.125 M TrisㆍCl, 4% SDS, 20% 글리세롤, 10% 베타-머캅토에탄올, 0.002% 브로모페놀블루, pH 6.8)을 25%(v/v) 되도록 첨가하고 5분간 100℃에서 가열한 후 원심분리하여 상등액을 취하였다. 상등액에 대해 15% SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동(15-20 mA로 2-3시간 실온에서 수행)을 실시함으로써 단백질을 크기에 따라 분리하고 TBST완충액(10mM TrisㆍCl, pH8.0)을 150 amp 에서 1-2시간 전기영동함으로써 전이시켰다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, U.S.A. 1989). 단백질 전이된 나이트로셀룰로오스막을 우선1% 소 혈청 알부민(bovine serum albumin)으로 일차반응을 시키고 IgG-알칼라인포스페이트(항-IgG와 알칼라인포스파타제의 결합물)로 실온에서 24시간동안 배양하여 이차 반응을 시킴으로써 웨스턴 특이성 결합이 끝난 니트로 셀룰로오스막을 TBST로 실온에서 1시간 세척하였다. 세척이 끝난 막을 니트로 블루테트라조리움과 5-브로모-4-클로로-3-인도일 포스페이트를 처리함으로써 발색시켰다.

상기의 웨스턴 특이성 결합 반응결과, B형 간염 바이러스의 항체를 구성하는 헤비체인 유전자가 도입된 담배식물로 부터는 약62kd(제4도의 A 참조)위치에서, 카파체인을 생산하는 유전자가 도입된 담배식물로부터는 약34kd(제4도의 B 참조) 위치에서 웨스턴 특이적 밴드가 표출된 반면 형질전환이 시도되지 않았던 담배식물로 부터는 아무런 웨스턴 특이적 밴드도 표출되지 않았다(제4도 참조).

[실시예 5]

형질전환된 담배식물의 화아분화 유도 및 상호 교배

B형 간염 바이러스의 항체를 합성하는 헤비체인 또는 카파체인 유전자가 삽입됨으로써 형질전환된 식물은 순화단계를 거쳐 온실에서 재배하였다. 온실에서 재배한 지 약 2개월 경과한 후 화아 분화가 시작되었으므로 이중 헤비체인 단백질을 생산하는 개체인 GC, 1-1 과 카파체인 단백질을 생산하는 개체인 KC. H2-24 를 선택하여 상호 교배하였다. 교배한 지 4주 후에 B형 간염 바이러스에 대한 조립된 항체를 생산할 수 있는 종자를 획득하였다.

[실시예 6]

B형 간염 바이러스 항체를 합성하는 유전자 발현 개체의 선별

실시예 5로부터 얻어진 종자를 0.1% 하이포클로라이드 용액에 5분 동안 담가둠으로써 소독하고 가나마이신이 200ug/ml 첨가된 발아용 배지(MS 배지+0.3% 수크로오스)에 치상하였다. 치상한 지 일주일 후에 ;담배가 발아되는 것을 관찰할 수 있었으며, 총 2500개 종자 중에서 가나마이신 저항성을 갖는 종자의 발아율은 25%로 멘델의 유전법칙에 준하였다. 선별배지 중에서 배양하는 단계에서 B형 간염 바이러스 항체를 구성하는 헤비체인이나 카파체인 유전자를 유전받지 못한 개체는 모두 고사하였고, 두 개의 유전인자 중 적어도 하나를 유전받은 개체는 살아남는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 방법으로 선별된 개체들은 다시 순환과정을 거쳐 온실로 옮겨졌다.

[실시예 7]

형질전환 후 교배된 담배식물로 부터 B형 간염 바이러스에 대한 조립된 항체의 분석

B형 간염바이러스의 항체의 유전자가 동일한 개체의 식물로 모두 이전되어 동물의 면역체계에 속하는 조립된 항체를 생산하는지 알아보기 위하여 웨스턴 특이성 결합반응을 실시예 4에서와 동일한 방법으로 실시하였으며, 그러한 목적으로 먼저 가나마이신이 첨가된 발아용 배지에서 발아된 식물을 온실로 이동시킨 후 약 48개의 선별된 개체의 잎으로부터 수용성 단백질을 추출하였다. 단, 실시예4의 방법에 추가하여 헤비체인 또는 카파체인이 디설파이드 결합으로 연결된 조립된 상태의 항체 크기를 측정하기 위하여 10% 베타머캅토에탄올이 제거된 완충 용액도(실시예 4 참조)를 이용하였다.

웨스턴 특이성 결합 반응 결과, 단백질에 베타머캅토에탄올을 처리하지 않음으로써 항체내의 디설파이드 결합이 절단되지 않은 경우에는 총 48개의 개체중 7개의 개체에서 동물의 면역체계에 존재하는 조립된 항체를 생산하고 있음이 확인되었으며, 그 크기는 약 220 kd로 추정되어진다. 또한, 추출된 단백질에 베타머캅토에탄올을 처리한 경우에는 조립된 항체의 디설파이드 결합이 끊어져 항체를 구성하는 헤비체인(62 kd) 및 카파체인(34 kd)으로 각각 분리되어 나타나는 것을 확인하였다. 한편, 형질전환된 담배식물의 잎으로부터 프로테인 에이-세파로오스 친화성 크로마토그래피 방법을 통해 추출된 B 형 간염바이러스의 조립된 항체 단백질의 생산량은 전체 수용성 단백질량 대비 0.1% 미만이었다.

Claims (3)

1. 사람의 B형 간염 바이러스 항원과 친화력을 유지하면서 인체내에서 자가면역반응을 유발시키지 않기 위하여 B형 간염 항원과의 결합부위인 영역은 쥐의 것을 그대로 사용하고 컨스터트 영역은 사람의 것으로 재조합된 헤비체인 또는 카파체인의 B형 바이러스 항체 생성 유전자를 삽입하여 재조합된 벡터를 아그로박테리움 튜머페시언스에 각각 도입시키고, 상기 형질전환된 아그로박테리움 튜머페시언스를 선별배양 각각 담배식물에 감염시킨 후, 상기 헤비체인 유전자를 포함하는 감염된 담배식물과 카파체인 유전자를 포함하는 감염된 담배식물을 상호 교배하여, 조립된 B형 간염 바이러스 항체 유전자를 발현시키는 개체를 선별한 후, 형질전환된 담배식물로부터 B형 바이러스 항체 유전자를 발현시킴을 특징으로 하는 사람 B형 간염 바이러스 재조합 항체의 제조방법
2. 제1항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 카울리플라워 모자의 바이러스 35S 전사체의 프로모우터(35S Promoter)와 노팔라인 신테이즈 터미네이터(Tnos)사이에 B형 간염 바이러스 항체 생성 유전자를 삽입하여 제조함을 특징으로 하는 사람 B형 간염 바이러스 재조합 항체의 제조방법
3. 제1항에 있어서, 상기 형질전환된 아그로박테리움 튜머페시언스는 가나마이신 또는 카르베니실린이 첨가된 배지에서 선별배양시킴을 특징으로 하는 사람 B형 간염 바이러스 재조합 항체의 제조방법.