KR0121768B1 - 담배식물을 통해 사람 b형 간염 바이러스 재조합 항체를 제조하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 사람 B형 간염 바이러스의 재조합 항체를 담배 식물체에서 생산하기 위한 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세히는 사람의 B형 간염 바이러스 항원과 친화력을 유지하면서 인체내에서 자가면역 반응을 유발시키지 않기 위하여 B형 간염 항원과의 결합부위인 베리어블 영역은 쥐의 것을 그대로 사용하고 컨스턴트 영역은 사람의것으로 재조합된 B형 바이러스 항체 생성 유전자를 삽입하여 재조합된 벡터를 아그로박테리움 튜미훼시언스(Agrobacterium tumefaciens)에 도입시키고, 상기 형질전환된 아그로박테리움 튜미훼시언스를 선별배양 담배식물에 감염시킨 후, 상기 감염된 담배식물을 배양 유전자를 발현시킴을 특징으로 하는 B형 간염 바이러스 항체의 제조방법에 관한 것이다. 또한 이들 B형 간염 바이러스 항체의 생성은 노던분석과 웨스턴 분석을 통하여 식물체에서 안정적으로 발현됨이 확인되었다.

Description

담배식물을 통해 사람 B형 간염 바이러스 재조합 항체를 제조하는 방법

제1도는 헤비체인과 카파체인 유전자의 고등식물 형질전환용 유전자 운반체에의 삽입과정도이다.

제2도는 헤비체인과 카파체인 유전자가 유전자 운반체에 삽입되어 있음을 보여주는 자외선 조사로 촬영한 사진이다.

제3도는 동물의 면역 유전자인 헤비체인이 식물체에서 발현되는 노던분석 결과의 사진이다.

제4도는 형질전환된 식물체내에서 헤비체인과 카파체인 유전자로부터 면역 단백질의 생성을 확인하기 위한 웨스턴 특이성 결합의 결과사진이다.

본 발명은 사람 B형 간염 바이러스의 재조합 항체를 담배 식물체에서 생산하기 위한 제조방법에 관한 것이다.

헤파타이티스-비 바이러스(Hepatitis-B Virus:이하 HBV라 칭한다)는 간염과 간암의 주된 병원체이다. HBV는 지질막을 가지고 있는 정이십면체(Icosahedral)구조의 바이러스이다. HBV는 혈청학적인 분류에 따라 그 지리적 분포도 다르게 나타나는데, 한국을 포함하고 있는 극동아시아 지역에는 여러가지 간염 바이러스(adr,adw,ayr,ayw)중 adr형이 우세하다. B형 간염 바이러스의 표면에는 S, pre-S1, pre-S2의 표면 항원들이 존재한다. 이들 중 pre-S2항원은 바이러스의 표면 지질막에 존재하며 우세한 결정인자를 가지고 있다. 이러한 특징을 가진 pre-S2항원은 HBV에 대한 중화항체(neutralizing antibody)가 생기도록 유도함이 보고되었다. HBV 감염의 예방 및 치료를 위하여는 건강한 보균자나 S항원을 예방접종 받았던 사람의 혈청으로부터 HBV 면역 글로블린을 분리하여 사용하였으나, 많은 양의 항체를 구하기 쉽지 않고 바이러스나 세균에 의한 오염문제가 발생하기 쉽기 때문에 HBV의 표면항원에 대한 생쥐의 단일 클론(clone)항체의 생산이 시도되었다. 그러나 생쥐의 단일클론 항체를 인체에 임상적으로 사용하는 경우 특수한 경우를 제외하고는 대부분이 인체내에서 쥐의 항체에 대한 면역반응이 일어나 그 치료효과가 떨어지고 부작용이 생기는 단점을 갖고 있다. 사람의 단일클론 항체를 사용하면 이런 문제점들은 생기지 않겠지만 생산이 쉽지 않고 또한 일반적으로 항원에 대한 친화도가 낮은 문제가 있었다.

따라서 본 발명에서는 이러한 문제점을 해결하기 위하여 항원과 결합부위인 베리어블 영역(Variable region : 이하 V영역이라 한다)은 쥐의 것을 그대로 사용하고 컨스턴트 영역(Constant region : 이하 C영역이라 한다)은 사람의 것으로 재조합된 유전자의 사용을 시도하였다. 유전자 도입에 의한 단백질의 미생물체로부터의 생산은 현재까지 유전공학분야의 주류를 이루고 있으나 미생물체의 배양은 잘 조절된 환경과 배지의 공급이 지속적으로 이뤄져야 하는 문제점이 있다. 아울러 대상 단백질이 고등생물체에 존재하는 단백질인 경우는 미생물체와 고등생물체의 단백질 완성과정의 차이점 때문에 유전공학 기법을 이용하여 미생물체로부터 생산된 단백질은 고등생물체에 존재하는 원래의 단백질과 차이점을 보이며 이러한 차이점은 단백질의 활성 저하 내지는 동물체에서의 면역 반응을 유발하기도 하는 단점이 있다.

또한 지금까지 단일클론항체의 생산은 동물세포인 하이브리도마를 이용하여 왔다. 그러나 이러한 단일클론항체의 생산은 생산량이 극히 소량이며, 생산단가가 높을 뿐 아니라 생산과정이 복잡하여 경제성 및 대량 생산의 관점에서 단점으로 지적되고 있다. 따라서 대량생산 및 낮은 생산단가와 보다 간편하게 하기 위하여 1989년 미국 스크립스(Scripps) 연구소의 엔드류 하이얏트(Andrew Hiatt) 연구진(1989. Nature 342:76-78:1993, FEBS Lett 307:71-75)의 단일 클론항체를 담배에서 발현시키고자 시도한 것을 비롯하여 막스프랑크(Max Planck) 연구소의 듀링(During) 연구진(1990, Mol.Biol. 15:281-293)은 단일클론항체의 합성과 자가조립(self assembly)에 관해 보고하였다. 한편, 식물체내에서 항체의 글라이코실레이션(glycosylation)에 관해서도 연구가 이루어지고 있다(Hein et al,1991, Biotechnol.Prog. 7:455-461:Kijimoto-Ochiai et al,1989,Biochem.J. 257:43-49).

로스만(Rothmann)(1989,Cell:59:591-601)은 동물세포의 경우 이뮤노글로블린(immunoglobulin)의 사슬들이 정확하게 조립되기 위해서는 결합단백질(binding protein:이하 BiP라 한다)이 있어야 한다는 사실을 밝혀냈는데, 폰테스(Fontes)등(1991,Plant Cell 3:483-496)과 보스턴(Boston)등(1991,Plant Cell 3:497-505)에 의해 BiP가 식물에서도 존재한다는 것이 확인되었다.

본 발명에서는 사람의 B형 간염 바이러스 항원과 친화력을 유지하면서 인체내에서 자가면역 반응을 유발 시키지 않기 위하여 B형 간염 항원과의 결합부위인 베리어블 영역은 쥐의 것을 그대로 사용하고 컨스턴트 영역은 사람의 것으로 재조합된 B형 바이러스 항체 생성 유전자를 담배(Nicotiana tabacum)에 도입하므로서 사람 B형 간염 바이러스 재조합 항체를 담배에서 생산하게 하였다.

따라서 본 발명의 목적은 사람의 B형 간염 바이러스 항원과 친화력을 유지하면서 인체내에서 자가면역반응을 유발시키지 않기 위하여 B형 간염 항원과의 결합부위인 베리어블 영역은 쥐의 것을 그대로 사용하고 컨스턴트 영역은 사람의 것으로 재조합된 B형 바이러스 항체 생성 유전자를 삽입하여 재조합된 벡터를 아그로박테리움 튜미훼시언스(Agrobacterium tumefaciens)에 도입시키고, 상기 형질전환된 아그로박테리움 튜미훼시언스를 선별배양 담배식물에 감염시킨 후, 상기 감염된 담배식물을 배양 유전자를 발현시킴을 특징으로 하는 B형 간염 바이러스 항체의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명에 사용한 방법으로는 토양미생물인 아그로박테리움 튜미훼시언스(Agrobacterium tumefaciens)를 사용하였다. 아그로박테리움 튜미훼시언스는 고등식물의 상처를 통하여 식물체에 감염되었을 때 식물체의 크라운 골(crown gall) 부분에서 형성되는 근두암종병을 일으키는 미생물이다. 이 미생물은 플라스미드(Plasmid)를 가지고 있고, 이 플라스미드의 일부가 식물체의 주염색체내에 삽입되어 이러한 병을 유발시키는 것으로 알려졌다. 이것을 Ti-플라스미드(Ti-plasmid)라고 명명하고, Ti-플라스미드내에서 식물체의 주염색체상에 도입되는 부분을 T-DNA라고 명한다. 미생물의 이러한 특징을 이용하여 플라스미드내의 병원성 유전자는 제거하고, 유전자가 식물체에 삽입되는 필요한 부분만 남겨두었다. 이렇게 조작된 플라스미드를 가지고 있는 미생물은 다른 외부 유전자를 식물체에 도입시키는데 중요한 운반체로서의 역할을 하고 있다. 이 플라스미드를 가지고 있는 아그로박테리움 튜미훼시언스는 자신의 플라스미드만 식물체의 주 염색체에 삽입시키는 것이 아니라, T-DNA의 일부를 가지고 있는 다른 플라스미드도 식물체의 주염색체내로 도입시키는 능력을 가지고 있다.

본 발명은 이러한 아그로박테리움 튜미훼시언스를 이용하여 담배의 주염색체내로 항체 생산 유전자를 도입시키므로서 항체 생산 기술의 근간을 이룬다.

항체 생산 유전자인 IgG(immunoglobulin G)의 헤비체인 및 카파체인을 고등식물의 형질전환용 유전자 운반체인 pBKS-1(홍주봉 등,1989,핵산조작에 의한 항 바이러스성 식물의 개발과학기술처 국책연구사업보고서 pp 41-43)의 카올리플라워(Cauliflower) 모자익 바이러스의 35s 전사체의 프로모터(35S promoter)와 노팔라인 신테이즈의 터미네이터(Tnos) 사이에 삽입하였다. 즉 pBKS-1의 P35s와 Tnos 사이의 제한 효소 Xba I 위치에 간염 바이러스의 항체생산 유전자인 헤비체인과 카파체인 단백질 암호 부위만을 분리해내어 삽입하였다(도면 1참조). 삽입과정은 간염 바이러스의 항체를 생산하는 유전자인 헤비체인과 카파체인 유전자가 삽입되어 있는 pBluscript SK⁺(한국과학기술원의 홍효정 박사 제공 : HBV Pre-S2 항원에 대한 재조합 항체 생산 기술 개발. 과학기술처 국책연구사업보고서 pp71-84)를 Sal I으로 절단하고 다시 Xba I adaptor를 고등식물 형질전환용 벡터인 pBKS-1에 삽입하였다(도면 1 참조). 이러한 실험과정을 거쳐 만들어진 벡터를 헤비체인을 운반하는 벡터는 pBHC-1으로, 카파체인을 운반하는 벡터는 pBKC-1으로 명명하였다.

재조합된 유전자 운반체 pBHC-1와 pBKC-1는 An et al(1989)의 방법을 변형하여 아그로박테리움 튜미훼시언스, LBA4404에 도입하였다(도면 2 참조). : YEP 배지(리터당 10g의 효모추출물,10g의 펩톤,5g의 소금,pH 7.0)에서 대수기의 증식단계에 있는 아그로박테리움 튜미훼시언스를 3,000g로 5분간 4℃에서 원심분리하여 수확한 다음 0℃의 20mM 칼슘클로라이드 용액에 현탁하였다. 준비된 형질전환용 아그로박테리움에 플라스미드 DNA를 첨가하여 액제 질소에서 급속 냉동시키고 다시 15분간 37℃ 수조에서 녹인 후 YEP 배지를 첨가하여 28℃에서 2-4시간 배양하였다. 헤비체인과 카파체인 유전자가 삽입된 아그로박테리움은 150㎛/ml가 나마이신이 첨가된 한천배지에 위의 용액을 도말하여 배양함으로서 선별하였다.

선별된 아그로박테리움 튜미훼시언스를 이용한 B형 간염 바이러스의 항체 유전자인 헤비체인과 카파체인의 담배내로의 도입 및 발현 과정은 다음과 같이 실행되었다. : 담배의 어린 잎을 살균하고 장방향으로 절단하여 액체 신초 유기용 배지(MS+0.5mg BAP/L)를 분주한 페트리 디쉬(petri dish)에 옮긴 후 YEP 배지에 12시간 진탕 배양한 상기의 선별된 아그로박테리움을 첨가하였다. 위의 페트리 디쉬를 1-2일간 정치하여 암배양한 후, MS배지로 2-3회 세척하였다. 세척한 담배잎 절편은 항생제인 카르베니실린(250mg/L)과 가나마이신(10mg/L)을 함유한 선택배지에서 배양하였다.

외부 유전자가 삽입된 식물체에서는 캘루스와 신초의 형성이 2주후에 이루어졌다. 이것을 발근용 배지에 계대 배양하여 발근을 유도하였으며 대부분의 신초가 2-3주 후에는 가나마이신이 첨가된 발근용 배지에서 발근되었다. 뿌리가 형성된 하나의 형질전환체는 온실 내 토양으로의 이식이 가능하게 되었다.

B형 간염 바이러스의 항체를 합성하는 헤비체인과 카파체인 단백질을 생산하는 유전자가 삽입된 형질전환 담배의 도입과 이에 따른 B형 간염 바이러스의 항체를 합성하는 헤비체인과 카파체인을 생산하는 유전자의 생성확인은 mRNA의 분석(노던분석)과 단백질의 항원/항체 반응(웨스턴 분석)을 하므로서 이루어졌다.

헤비체인 유전자가 도입된 담배식물로부터는 약 18kb 염기의 크기의 위치에서 노던 특이적 밴드가 확인된 반면 형질전환 과정이 이루어지지 않은 담배식물로부터는 노던 특이적 밴드가 확인되지 않음을 미루어 식물체가 B형 간염 바이러스의 항체를 합성하는 헤비체인을 안정적으로 발형하는 것을 볼 수 있었다(제3도 참조).

웨스턴 특이성 결합 반응결과 B형 간염 바이러스의 항체를 합성하는 헤비체인은 약 62kd(제4도의 a)와 카파체인을 생산하는 유전자가 도입된 담배식물로부터는 약 34kd(제4도의 b) 위치에서 특이성 웨스턴 밴드가 표출된 반면 형질전환이 시도되지 않았던 담배식물로부터는 특이성 웨스턴 밴드가 표출되지 않았다(제4도 참조). 이러한 결과는 형질전환된 담배를 통하여 인간의 B형 간염 바이러스 재조합 항체를 낮은 생산단가로 생산해 낼 수 있는 길이 열리게 되었음을 보여준다.

더욱이 본 발명으로 인하여 B형 간염 바이러스 항체의 생산이 담배뿐 아니라 기타 고등식물체에서도 동일하게 적용되어 B형 간염 바이러스 항체 생산이 가능하므로 본 발명의 권리는 형질전환된 담배를 포함한 적용 가능한 모든 식물에까지 포함한다.

[실시예1]

B형 간염 바이러스의 항체를 구성하는 헤비체인과 카파체인 단백질을 생산하는 유전자를 고등식물 형질전환용 유전자 운반체(pBKS-1)에 삽입

사람의 B형 간염 바이러스 항원과 친화력을 유지하면서 인체내에서 자가면역반응을 유발시키지 않기 위하여 B형 간염 항원과의 결합부위인 베리어블 영역은 쥐의 것을 그대로 사용하고 컨스턴트 영역은 사람의 것으로 재조합된 B형 바이러스 항체 생성 유전자인 헤비체인과 카파체인 단백질을 생산하는 유전자를 삽입 할 수 있는 클론 pBluscript SK⁺는 홍효정(한국과학기술연구원 유전공학센터)에 의해 제공되었다.

pBluscript SK⁺는 B형 간염 바이러스의 헤비체인과 카파체인이 각각 EcoR I 과 Sal I 의 위치에 삽입되어져 있다. 이 유전자를 pBKS-1에 삽입하기 위하여 제한효소 Sal I 으로 절단한 후, Xba I adaptor를 부착하였다. 이러한 처리를 마친 플라스미드를 다시 부착시킨 후, 제한효소 Xba I으로 절단하여 헤비체인인 1592bp 조각과 카파체인 850bp 조각을 아가로스 젤과 DEAE-셀룰로오스 종이를 이용하여 회수하였다. 분리된 두개의 유전자 조각을 T4 DNA ligase를 이용하여 pBKS-1의 Xba I 위치에 접합시키고(제1도) E. coil 내로의 도입 및 증폭과정을 거쳐 플라스미드 DNA를 수거하였다. 전체의 실험조건은 Maniatis et al.(1982)에 준하였다. 이러한 실험과정을 거쳐 만들어진 헤비체인을 운반하는 벡터는 pBHC-1으로 카파체인을 운반하는 벡터는 pBKC-1으로 명명하였다.

[실시예2]

B형 간염 바이러스의 항체를 합성하는 헤비체인과 카파체인을 생산하는 유전자와 pBKS-1이 접합된 재조합 DNA를 A. tumefaciens에 이전

상기의 재조합된 플라스미드 DNA를 A. tumefaciens에의 도입은 아래와 같이 실시하였다. YEP 배지(리터당 10g의 효모 추출물, 10g의 펩톤, 5g의 소금, pH7.0)에서 28℃, 150r.p.m.으로 배양한 후, 대수기에 도달한 A.tumefaciens, LBA4404를 3,000g으로 5분간 4℃에서 원심분리하여 수확한 다음 0℃의 20mM 칼슘 클로라이드 용액에 현탁하였다. 현탁액의 농도는 ml당 1×10³세포정도를 사용하였다. 준비된 형질전환용 아그로박테리움 0.1ml에 플라스미드 DNA 약 100mg을 첨가한 후 액체질소에서 3분간 급속 냉동시키고, 다시 5분간 37℃ 수조에서 녹인 후 현탁액 부피 10배의 YEP 배지를 첨가하여 28℃에서 150r.p.m.으로 흔들어 주며 2-4시간 동안 현탁 배양하였다.

재조합된 DNA가 도입된 아그로박테리움은 5㎍/ml의 가나마이신이 들어있는 YEP 고체배지에 도말하여 배양하므로서 선별하였다. 28℃에서 이틀간 배양하면 Agrobacterium의 군체가 식별이 되며 이들은 다시 YEP 배지에서 배양되었다.

YEP 배지에서 배양된 박테리아로부터 알카리 용해(alkaline lysis) 방법(Maniatis et al.,1982,Molecular Cloning : a laboratory manual page 1.25-28)에 의하여 플라스미드 DNA가 분리되었으며 분리된 플라스미드 DNA는 제한효소 EcoR I/BamH I, Eco I, BamH I으로 처리하여 목적했던 B형 간염 바이러스의 항체를 합성하는 헤비체인과 카파체인을 생산하는 유전자를 고등식물 형질전환용 유전자 운반체 pBKS-1에 삽입되었음을 확인하였다. 아가로스젤 전기영동후 에테디움 브로마이드 염색을 하여 자외선 조사로 유전자 절편들을 관찰할 시, 대부분의 가나마이신이 첨가된 배지에서 선별된 아그로박테리움(90% 이상)을 제한효소 EcoR I으로 처리시 헤비체인 유전자와 nos 터미네이터가 포함된 약 2kb의 밴드를 카파체인 유전자와 nos 터미네이터가 포함된 약 1.2kb의 밴드를 원하는 위치에서 나타나는 것을 보아 목적한 유전자가 아그로박테리움 내로의 도입과 안정한 유지 및 증폭이 확인되었다(제2도 참조). 제2도에서 1, 6열 : DNA 표준마커, 2열 : 아그로박테리움 튜미훼시언스, LBA4404, 3, 4열 : 카파체인 유전자가 삽입된 pBKC-1을 가지고 있는 아그로박테리움 튜미훼시언스, 5열 : 헤비체인 유전자가 삽입된 pBHC-1을 가지고 있는 아그로박테리움 튜미훼시언스, LBA4404를 나타낸다. 또한 2, 3, 4, 5열은 제한효소 EcoR I을 처리하였다.

[실시예 3]

담배(Nicotiana tabacum cv, Wisconsin 38)에 B형 간염 바이러스의 항체를 합성하는 헤비체인과 카파체인을 생산하는 유전자의 도입 및 도입된 담배식물의 재분화

담배의 어린 잎(발아후 두달 정도 온실에서 자란 담배식물의 위로부터 네번 내지 일곱번째의 잎)을 0.1% 하이포클라이드에 5분 동안 담가두므로서 소독하고 가로 및 세로 약 1cm 정도로 절단하여 액체 신초 유기배지(MS 배지+0.5mg/16-벤질아미노산퓨린)를 잎 절편이 겨우 잠길 정도로 분주한 페트리 디쉬에 옮겼다. 각각의 페트리 디쉬에 헤비체인과 카파체인 유전자로 재조합된 플라즈미드가 삽입된 상기의 아그로박테리움을 YEP 액체 배지(약 3ml)에서 12시간 150r.p.m.으로 진탕 배양하여 그중 10㎕ 정도를 첨가하였다. 이것을 25℃에서 1-2일간 암배양한 후 MS 배지로 세척하고 항생제인 카르베니실린(250㎕/ml)과 가나마이신(200㎍/ml)을 함유한 신호 유기 배지에서 배양하였다.

배양 2주 경과후에는 이들 잎 절편으로부터 다량의 캘러스와 신초가 유기되는 것을 관찰할 수 있었다. 이것을 발근용 배지에 계대 배양하여 발근을 유도하였으며 대부분의 신초가 2-3주 후에는 가나마이신이 첨가된 발근용 배지에서 발근되었다. 뿌리가 형성된 하나의 형질전환체는 온실내의 토양에 이식이 가능하게 되었다.

[실시예 4]

B형 간염 바이러스의 항체를 구성하는 헤비체인과 카파체인을 생산하는 형질전환된 담배의 분석

B형 간염 바이러스의 항체를 합성하는 헤비체인과 카파체인을 생산하는 유전자가 삽입된 형질전환 담배의 도입과 이에 따른 B형 간염 바이러스의 항체를 합성하는 헤비체인과 카파체인을 생산하는 유전자의 생성 확인은 mRNA의 분석(노던 분석)과 단백질의 항원/항체 반응(웨스턴 분석)을 하므로서 이루어졌다.

B형 간염 바이러스의 항체를 합성하는 헤비체인과 카파체인을 생산하는 유전자가 도입된 후 재분화된 담배식물과 형질전환 과정을 거치지 않은 담배식물의 잎을 채취하여 RNA를 분리하였다. 약 2g 정도의 잎을 채취하여 증류수로 세척한 후 막자사발내에서 5배의 용해완충액(50% 구아니딘 다이오싸이아네이트, 0.5% N-라우닐 쌀코닌, 0.1% 베타-머캅토에탄올과 25mM EDTA, pH 7.5)을 첨가하고 마쇄하였다. 마쇄된 용액을 4℃에서 6,000g로 10분간 원심분리하고 상등액을 0.1M EDTA(pH 7.5)에 녹인 5.7M CsCl 2.3ml위에 5ml가 되도록 서서히 부은 후, 15℃에서 SW 50.1rotor로 22,000r.p.m.으로 22시간 원심분리하였다. 원심분리후 침전물을 10mM Tris.Cl(pH 7.5)과 0.1% SDS 용액에 녹이고 클로로포름/1-부탄올(4:1) 혼합액으로 일단 정제한 후 에탄올 침전하여 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA는 50% 포름알데히드가 함유된 아가로스젤 전기영동으로 크기에 따라 구분한 후, 삼투압을 이용하여 나이트란막으로 전이시켰다(Maniatis et al.,1982). RNA가 전이된 나이트란 막은 즉시 자외선으로 5분간 조사되어 RNA를 나이트란 막에 부착하였고 이 막은 노던 특이성 결합반응에 이용하였다. 프로브는 실시예 2에서 언급한 DNA절편, B형 간염 바이러스의 항체를 합성하는 헤비체인과 카파체인을 생산하는 유전자 두개를 각각 32P로 표지하여 준비하였다.

실험조건은 50% 포름아마이드 존재하에 37℃에서 이루어졌으며 특이성 결합반응 후의 세척과정은 0.2% SSPE로 37℃ 15분간 2회 실시하였다. 기타의 반응조건들은 Maniastis et al.(1982)에 기술된 바에 준하였다. 세척이 끝난 나이트란 막은 랩으로 쌓아 두장의 intensifying 막을 부착시킨 후 X-ray 필름에 -70℃에서 이틀간 노출시켰다.

B형 간염 바이러스의 항체를 합성하는 헤비체인 유전자가 도입된 담배 식물로부터는 약 18kb 염기의 크기에서 노던 특이적 밴드가 관찰된 반면 형질전환 과정이 이루어지지 않은 담배식물로부터는 노던 특이적 밴드가 관찰되지 않음을 미루어 식물체가 B형 간염 바이러스의 항체를 합성하는 헤비체인을 안정적으로 발현하는 것을 확인하였다(제3도 참조).

제3도에서 C는 형질전환시키지 않는 담배, 1과 3은 헤비체인 유전자가 삽입되지 않은 형질전환체, 2는 헤비체인 유전자가 삽입된 형질전환체를 나타낸다.

또한 B형 간염 바이러스의 항체를 합성하는 헤비체인과 카파체인을 생산하는 유전자의 단백질이 담배식물에서의 생성 여부는 웨스턴 특이성 결합반응을 하므로서 확인하였다. 가나마이신이 첨가된 신초 유기배지에서 신초를 유기하고 발근용 배지로 계대 배양한 식물체 중 헤비체인 유전자로 형질전환된 것 4개와 카파체인 8개에서 단백질을 추출하였다. 단백질을 추출하기 위하여 사용된 완충액은 0.01M 포스페이트용액이었다. 단백질을 변성시키기 위하여 완충용액(0.125 M Tris Cl, pH 6.8, 4% SDS, 20% 글리세롤, 10% 베타-머캅토 에탄올, 0.002% 브로모페놀블루)을 첨가후 5분간 100℃에서 끓이고 원심분리하여 상등액을 취하였다. 상등액을 15% SDS-폴리아크릴아마이드젤 전기영동(15-20mA로 2-3시간 실온에서)을 하므로서 단백질을 크기에 따라 분리하고 TBST 완충액(10mM Tris Cl, pH 8.0)을 150amp로 1-2시간 전기영동하므로서 전이시켰다(Sambrook,J.,E.F.Fritsch, and T.Maniatis.1989.Molecular Cloning.2nd ed.Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor,U.S.A.).

단백질 전이된 나이트로셀룰로오스막은 우선 1% 보우바인 시럼 알부민(bovine serum ambumin)으로 일차반응을 시키고 IgG-알칼라인포스페이트(anti-IgG와 alkaline phophatase의 결합물)로 실온에서 24시간 배양한 웨스턴 특이성 결합이 끝난 나이트로 셀룰로오스막을 TBST로 실온에서 1시간 세척하고 발색반응을 하였다. 발색반응은 나이트로 블루테트라조리움과 5-브로모-4-클로로-3-인도일 포스페이트를 처리하였다. 상기의 웨스턴 특이성 결합 반응결과 B형 간염 바이러스의 항체를 합성하는 헤비체인은 약 62kd(제4도 a참조)에서 카파체인을 생산하는 유전자가 도입된 담배식물로부터는 약 34kd(제4도 b참조)위치에서 특이성 웨스턴 밴드가 표출된 반면 전환이 시도되지 않았던 담배식물로부터는 특이성 웨스턴 밴드가 표출되지 않았다(제4도 참조). 제4도에서 a는 헤비체인 단백질이 합성되는 것을 1, 2열에서, b는 카파체인 단백질이 합성되는 것을 1열에서 볼 수 있다. M은 단백질 마커를 나타낸다.

Claims (3)

1. 사람의 B형 간염 바이러스 항원과 친화력을 유지하면서 인체내에서 자기면역반응을 유발시키지 않기 위하여 B형 간염 항원과의 결합부위인 베리어블 영역은 쥐의 것을 그대로 사용하고 컨스턴트 영역은 사람의 것으로 재조합된 헤비체인 또는 카파체인의 B형 바이러스 항체 생산 유전자를 삽입하여 재조합된 벡터를 아그로박테리움 튜미훼시언스(Agrobacterium tumefaciens)에 도입시키고, 상기 형질전환된 아그로박테리움 튜미훼시언스를 선별배양 담배식물에 감염시킨 후, 상기 감염된 담배식물을 배양 유전자를 발형시킴을 특징으로 하는 사람 B형 간염 바이러스 재조합 항체의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 재조합된 벡터는 카올리플라워 모자의 바이러스 35S 전사체의 프로모티(35S Promoter)와 노팔라인 신테이즈 터미네이터(Tnos) 사이에 B형 간염 바이러스 항체 생성 유전자를 삽입하여 제조함을 특징으로 하는 사람 B형 간염 바이러스 재조합 항체의 제조방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 형질전환된 아그로박테리움 튜미훼시언스는 가나마이신이 첨가된 배지에서 선별 배양시킴을 특징으로 하는 사람 B형 간염 바이러스 재조합 항체의 제조방법.