KR100520983B1

KR100520983B1 - Ｂ형 간염 바이러스의 항원 유전자를 발현하는 형질전환 감자 세포, 감자 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR100520983B1
Application number: KR10-2003-0015880A
Authority: KR
Inventors: 김현순; 정영희; 전재흥; 이병찬; 홍효정; 정혁
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2003-03-13
Filing date: 2003-03-13
Publication date: 2005-10-12
Anticipated expiration: 2023-03-13
Also published as: KR20040081544A

Abstract

본 발명은 B형 간염 바이러스의 항원 유전자를 발현하는 형질전환 감자 세포, 감자 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인체에 간염을 유발하는 간염 바이러스의 항원 유전자인 preS2 및 S 유전자를 동시에 발현하는 형질전환 감자 세포, 상기 세포를 조직배양시켜 제조되는 감자 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 간염 바이러스의 항원 유전자를 발현하는 형질전환 감자는 간염 바이러스 유전자의 발현효율이 매우 뛰어나므로, 경구용 간염 예방 백신 조성물 등으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

Ｂ형 간염 바이러스의 항원 유전자를 발현하는 형질전환 감자 세포, 감자 및 이의 제조방법{Transformed potato cell and plant, expressing antigens of hepatitis B virus and method for preparing the same}

본 발명은 B형 간염 바이러스의 항원 유전자를 발현하는 형질전환 감자 세포, 감자 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인체에 간염을 유발하는 간염 바이러스의 항원 유전자를 동시에 발현하는 형질전환 감자 세포, 상기 세포를 조직배양시켜 제조되는 감자 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

1990년 WHO는 안전하고, 열에 안정하며, 경구 투여가 가능할 뿐만 아니라 보다 광범위하게 보급될 수 있는 백신 개발을 목표로 설정한 바 있다. 또한, 연간 60억 달러 규모의 백신 시장은 2003년경에는 130억 달러 규모에 이를 정도로 계속적인 증가 추세에 있다. 현재의 백신 개발 시스템이 가지고 있는 몇 가지 문제점은 고가의 생산설비, 수송과 저장 시에 요하는 냉장설비의 경제적 부담 및 백신 투여의 어려움, 주사를 맞는 것에 대한 사람들의 보편적인 거부감 등이 있다. 따라서, 상기와 같은 문제점을 해결하고, 예방 접종의 혜택을 거의 누리지 못하고 있는 저개발국의 어린이를 위해서라도 대체백신의 개발이 요구되고 있는 것이 세계적인 추세이다. 이러한 대체백신 개발연구 중에서 형질전환 작물을 통한 경구용 식물백신이 그 가능성을 인정받아 백신개발의 새로운 방향으로 자리 매김을 하고 있다. 경구용 식물백신은 재조합 백신의 안전성과 경구백신의 접종에 있어서의 수월성과 효율성을 접목시킨 방법으로서 항원유전자를 식물체 발현벡터를 이용, 식물체에 형질전환시켜 식품을 섭취하듯이 경구투여를 시행함으로써 면역반응을 유도하게 된다.

B형 간염 바이러스(이하, 'HBV'라 약칭함)는 인체에 침입하여 만성 및 급성 간염을 일으키며 악화될 경우 간경화와 간암의 원인이 되는 병원체로, 간염(hepatitis)은 우리나라에서 대략 전체인구의 5 내지 8%가, 전 세계적으로는 약 3억 5천만 명의 간염환자가 존재하는 것으로 추산되고 있다(Tiollais and Buendia, Sci. Am., 264: 48, 1991). 현재 개발되어 유통되고 있는 B형 간염(hepatitis) 백신은 효율적이고 안전하여 백신 자체로서의 문제는 별로 없지만, 생산 단가가 매우 높은데다 3번에 걸쳐 주사해야 하는 등 여러 가지 불편과 예방 비용의 상승 요인을 가지고 있어서 저개발국가들에 대한 보급 확대의 어려움이 따르고 있다.

HBV의 피막은 표면항원 단백질들은 HBV를 중화시키고 무력화하는 항체를 유도하는데, 그 중 S항원은 전체 피막 단백질의 80%를 차지하며, 모든 아형 HBV에 공통으로 존재하는 "Common a"라는 중화 에피토프(Neutralizing epitope)를 가지고 있으며, 특히 pre-S 부위에 의해 유도되는 항체는 바이러스의 제거 및 급성 HBV 감염에서의 회복과 관련이 있고 S항원에 대한 무면역반응(Non-responsiveness)을 극복할 수 있다(Iwarson, et al., J. Med. Virol., 16: 89-96, 1985; Itoh, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 9174-9178, 1986; Neurath, et al., Vaccine, 7: 234-236, 1989; Budkowska, et al., J. Med. Virol., 20: 111-125, 1986; Milich, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 8168-8172, 1985; Milich, et al., J. Immunol., 137: 315-322, 1986).

이에, 메이슨 등은 B형 간염 바이러스 항원(Hepatitis B surface antigen; 이하, 'HBsAg'이라 약칭함)의 표면 항원 유전자를 담배에 형질전환시켜 그 항원의 발현을 보고한 바 있으며(Mason, H.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 11745-11749, 1992; Thanavala, Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 3358-3361, 1995), 중국의 농업 과학원 생물기술센터 또한 B형 간염을 예방 할 수 있는 토마토를 개발하였다고 밝힌 바 있다(http://www.losn.com.cn). 또한, 독일 기센 대학(Giessen University) 연구진이 당근에 유전자 조작을 가하는 방법으로 B형 간염 백신을 함유하는 당근 개발에 성공하였으며, 동 연구진은 향후 3년 후면 이 당근으로 만든 B형 간염 백신의 출시가 가능할 것이라고 예측하고 있다(http://www.yakup.com/cgi~bim/media.cgi). 그러나, 우리나라의 경우에는 아직까지 간염 바이러스 항원 유전자를 식물에 도입시키고자 시도한 예가 없으며, 앞서 언급한 세계의 보고들 역시 식물에 도입한 유전자는 바이러스의 표면 항원 유전자 중 S 항원만을 포함하고 있어서 preS2 항원과 S 항원을 함께 발현시킨 보고는 아직까지 없다.

한편, 감자는 그 자체가 완벽한 영양 조성을 지닌 세계 4대 주식 작물로서 극한, 극서 지방을 제외한 세계 도처에서 재배되는 수많은 인류의 주식 또는 대체 곡물이다. 따라서, 본 발명자들이 의도하는 바대로 성공적인 감자백신이 개발된다면 이는 자연스럽게 세계 전역의 감자 지역으로 전파되어 전 세계적으로 막대한 수요가 창출될 수 있다. 또한, 현재 인공씨감자 대량생산기술이라는 세계 최고 수준의 실용화 산업 기술을 이미 개발되어 있기 때문에, 인공씨감자가 가지는 여러 장점과 식용경구백신이 가지는 장점을 접목한다면 상기의 감자백신은 인류의 복지뿐만 아니라 훌륭한 고부가가치 상품으로 산업경제에 크게 이바지할 것이라 판단된다.

이에, 본 발명자들은 경구용 간염 백신으로의 사용을 궁극적인 목적으로 하는 HBsAg 발현 감자를 개발하기 위하여, HBsAg 유전자의 preS2와 S를 포함하는 식물체 형질전환용 발현벡터 플라스미드를 이용하여 아그로박테리움에 HBsAg 유전자를 도입하고, 이를 감자의 잎 조직과 공동 배양하여 HBsAg 유전자를 대량 발현하는 형질전환 감자를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 B형 간염 바이러스의 항원 유전자를 발현하는 형질전환 감자 세포, 상기 감자 세포로부터 제조되는 감자 및 상기 감자를 유효성분으로 함유하는 경구용 간염 예방 백신 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 B형 간염 바이러스의 항원 유전자인 preS2 및 S 유전자를 발현하는 형질전환 감자 세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 감자 세포를 조직배양 방법으로 재분화시켜 제조되는 형질전환 감자를 제공한다.

또한, 본 발명은 ⅰ) B형 간염 바이러스의 preS2 및 S 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계; ⅱ) 상기 발현벡터를 아그로박테리움에 도입하는 단계; 및 ⅲ) 상기 아그로박테리움과 감자 세포를 공동배양하여 상기 감자 세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는 상기 형질전환 감자 세포의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환 감자 세포를 재분화시키는 단계를 포함하는 상기의 형질전환 감자의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 형질전환된 감자를 유효성분으로 함유하는 경구용 간염 예방 백신 조성물을 제공한다.

본 발명에서 "기내배양"이란 무균상태의 배양조건이 갖추어진 배양용기 내에서 식물을 배양하는 것을 의미하고, "소괴경"은 앞의 기내배양을 이용하여 감자의 괴경을 콩알크기만큼 축소된 감자의 기내괴경을 일컫는 말이고, "치상"은 식물을 기내배양으로 옮겨놓거나 두는 것을 나타낸다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 B형 간염 바이러스의 항원 유전자인 preS2 및 S 유전자를 발현하는 형질전환 감자 세포를 제공한다.

이때, 상기 preS2 및 S 부분의 유전자는 각각 서열번호 1 및 서열번호 2로 기재되는 염기서열로 이루어지는 것이 바람직하다. 또한, 상기 형질전환은 상기 세포내로 아그로박테리움의 도입을 통하여 이루어지는 것이 바람직하다. 상기에서 아그로박테리움의 종류는 특별히 제한되는 것은 아니나, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404(Gibco BRL, Cat. No. 18313-015)인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 상기 아그로박테리움에 preS2 및 S 유전자를 도입하기 위한 발현벡터로 pMBPHBV 또는 pATHBV을 이용하는 것이 바람직하나, 반드시 여기에 제한되지는 않는다.

본 발명은 preS2 및 S 유전자를 포함하는 식물 형질전환용 발현 플라스미드를 이용하여 아그로박테리움에 상기 유전자를 도입하고, 상기 아그로박테리움을 감자 세포와 공동배양하여 B형 간염 바이러스 항원을 생산하는 형질전환 감자 세포를 제조한다. 상기 형질전환 감자 세포를 제조하기 위한 B형 간염 바이러스 항원 유전자를 포함하는 식물 형질전환용 발현벡터 및 상기 발현벡터가 도입된 아그로박테리움 균주는 모두 본 발명의 범위에 포함되며, 상기 발현벡터와 아그로박테리움 균주는 실시예에서 제시된 감자 이외 다양한 작물에도 응용이 가능하다. 즉, 상기 preS2 및 S 항원을 발현하는 식물 세포에 특별히 제한이 있는 것은 아니며, 사람이 직접 식용가능한 작물인 것이 바람직하고, 특히 우리나라 전역에서 재배 가능한 감자는 본 발명자들이 종전에 개발하였던 인공씨 감자의 장점을 십분 활용할 수 있어서 더욱 바람직하다.

상기 preS2 및 S 유전자는 HBsAg을 구성하는 단백질을 발현시킨다. B형 간염 바이러스의 피막은 3개의 단백질로 구성되는데, 구체적으로 S항원을 포함하는 주(major) 단백질, S항원과 preS2 항원을 포함하는 중(middle) 단백질 및 S항원, preS2 항원과 preS1 항원을 포함하는 대(large) 단백질로 구성된다(Neurath, A.R. and Kent, S.B.H., Adv. Virus Res., 34: 65-142, 1988). 상기 preS2 유전자는 165 bp, S 유전자는 681 bp의 염기서열을 가지며, preS2 부분은 S 부분의 항원성을 증가시키는데 중요한 역할을 하므로, 본 발명자들은 S 부분뿐만 아니라 상기 preS2를 포함하는 감자 식물체가 간염 백신으로 보다 효과적이라고 판단하였다.

본 발명자들은 상기 preS2 및 S 유전자를 포함하는 발현벡터로 동시에 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404 균주를 2003년 3월 3일자로 한국생명공학연구원에 수탁번호 KCTC 10436BP로 기탁하였다.

상기 재분화는 그 방법에 있어서 특별히 제한되는 것은 아니나, 조직배양으로 캘러스를 형성시킨 후 기관을 유도하는 방법을 통하여 이루어지는 것이 바람직하다.

상기 HBsAg 유전자가 도입된 아그로박테리움을 조직배양 중의 감자 세포로 구성된 절단한 감자 잎 조직과 공동배양시킴으로써 상기 감자를 형질전환시킬 수 있으며, 상기 형질전환된 감자는 재분화 과정 중에 HBsAg을 발현한다. 본 발명의 실시예를 통하여 제조된 형질전환된 감자를 분석한 결과, ELISA 및 IRMA 분석으로 HBsAg 유전자의 발현을 확인할 수 있었으며(도 8a 및 도 8b 참조), 궁극적으로 간염에 대한 백신 기능을 할 수 있는 감자를 개발하였다.

본 발명의 실시예에서는 인체의 간염을 유발하는 HBsAg 유전자를 감자 세포에 도입하여 그의 발현을 유도하였다. 즉, HBsAg의 preS2와 S 유전자를 CaMV35S(콜리플라워 모자이크 바이러스 35S) 프로모터 또는 감자의 파타틴(patatin) 프로모터 등으로 구성된 발현벡터(도 2 참조)를 이용하여 아그로박테리움 튜메파시엔스 균주에 HBsAg 유전자를 도입하였으며, 발현벡터가 도입된 상기 균주를 사용하여 감자 세포를 형질전환시켰다.

보다 구체적으로, 발현벡터가 도입된 균주의 제작과정을 살펴보면 다음과 같다. 간염 바이러스 항원(HBsAg) 유전자의 preS2 및 S 유전자를 클로닝하고, 상기 유전자를 각각 카나마이신 저항성 유전자를 포함하고 CaMV35S 프로모터를 이용하는 pMBPHBV 벡터 또는 감자의 괴경에 특이적으로 발현하는 파타틴 단백질의 프로모터를 이용하는 pATHBV 벡터와 같은 식물 형질전환용 발현벡터에 도입한 후에, 상기 벡터를 각각 아그로박테리움 튜메파이신스 LBA4404 균주에 삽입시켰다. 이때, preS2와 S 유전자의 전체 염기가 상기 발현벡터내로 도입되어 보존됨을 염기서열분석으로 확인하였다(도 1 참조).

상기 균주를 감자 세포와 공동배양함으로써 형질전환 감자 세포를 제조하였다.

상기의 형질전환 감자 세포의 제조와 함께, 상기 균주를 감자 세포로 이루어진 잎 절편과 공동배양함으로써 형질전환된 감자를 제조하였다. 구체적으로, 기내배양으로 유지하고 있던 감자의 줄기에서 잎의 연령이 1주일 이하된 어린 잎 절편을 칼로 절단하여 상처를 낸 다음 상기 아그로박테리움의 배양액에 침지시킨 다음 공동 배양한 후에, 캘러스 유도 배지로 옮겨서 배양함으로써 상처 부위로부터 형성된 캘러스에서 기관을 분화시키는 과정을 수행하여 상기 감자를 재분화시켰다(도 3 참조).

또한, 본 발명자들은 상기 형질전환 및 재분화된 각각의 감자(도 3 참조)에서 서던 블럿 분석, 노던 블럿 분석을 실시하여 형질전환 감자의 개체 선별을 실시하였다. 이때, 상기 개체 선별을 통하여 분리된 형질전환 감자에서 총 RNA을 추출하여 HBsAg에 특이적인 단백질의 발현을 웨스턴 블럿 분석, ELISA 분석 및 IRMA(분석고형상 면역방사 계수법)을 실시하여 확인하였다. 또한, 상기 선별된 감자로부터 분리한 DNA를 주형으로 서열번호 3 및 서열번호 4로 기재되는 프라이머를 이용한 중합효소연쇄반응(PCR; polymerase chain reaction) 등으로 상기 감자에 도입된 HBsAg 유전자를 확인하였다(도 4 참조). 그 결과, 파타틴 프로모터에 연결하여 HBsAg 유전자를 도입한 상기 형질전환된 감자는 상기 HBsAg의 발현이 대조군인 정상 감자 식물체에 비해 15 내지 17배 이상 높은 개체를 선발할 수 있었으며, 이는 HBsAg 유전자의 도입에 따른 결과이다.

아울러, 상기 형질전환 및 재분화된 감자를 조직배양 방법에 의하여 증식시키고, 고농도의 당이 첨가된 배양조건에서 그의 소괴경을 대량으로 유도하는 조건으로 배양하였다. 그 결과, 상기 형질전환된 감자 캘러스로부터 소식물체를 얻고, 얻어진 소식물체를 약 4주일 정도 증식시킨 다음, 고농도의 당이 첨가된 배지에서 두 달 가량 배양함으로써 약 1g 정도의 소괴경을 얻어 식용으로 이용가능함을 확인하였다(도 3 참조).

본 발명은 HBsAg 유전자인 preS2 및 S 유전자를 동시에 클로닝하고 감자에 도입할 수 있고, 이러한 두 유전자의 동시 도입으로 간염 바이러스의 유전자의 발현 효율이 크게 증진된다. 따라서, 본 발명에 따라 제조된 HBsAg을 생산하는 형질전환 감자는 간염 예방 또는 치료용 백신으로 유용하게 이용될 수 있다.

상기 조성물은 형질전환 감자를 그대로 사용하거나 건조시킨 후 분말 형태로 사용할 수 있으며, 또한 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있으며 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분으로서 감자의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있으며, 유효성분인 감자는 통상 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 특정한 최대 허용 범위가 없이 사용될 수 있음은 확실하다.

상기 조성물을 포함하는 건강식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 감자를 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 반드시 이에 한정되지 않음은 당업자에게 있어서 자명하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 감자의 조직배양

본 발명에 사용한 감자 식물체를 조직배양으로 유지시켰다. 이를 위하여 먼저, 각종 병원균과 바이러스가 없는 본 실험실에서 품종 유지하고 있는 데지레 씨감자(Solamum tuberosum cv. Desiree)를 싹을 틔운 뒤에 생장점을 포함하여 가능한 작은 크기로 절단한 후 70% 에탄올로 표면살균하였다. 상기 절단된 씨감자를 증류수로 세척하고 10% 소듐하이포클로라이드(sodium hypochloride) 용액에서 10분 동안 살균처리 한 후, 다시 증류수로 3번 세척 후에 물기를 제거하고 MS 염(Duchefa co., Cat. No. M0221)에 자당(sucrose)을 3% 첨가한 기본배지에 치상하여 줄기의 생장을 유도하였다. 배양기 내에서 줄기의 생육이 왕성하게 이루어진 다음 2주일 간격으로 계대배양하는 방식으로 감자 식물체의 조직배양을 유지하였다.

<실시예 2> 감자 식물체에 HBsAg 유전자의 삽입

<2-1> 벡터의 제조

감자의 형질전환을 위한 벡터로 pMBPHBV 및 pATHBV를 사용하였다. 상기 벡터들은 HBsAg 간염 바이러스 유전자의 preS2와 S 유전자 및 카나마이신 저항성 유전자(neomycin phosphotransferase, NPTⅡ)를 CaMV35S(cauliflower mosaic virus 35S; 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S) 프로모터에 연결한 벡터(pMBPHBV) 또는 감자 괴경 특이적 발현 프로모터인 파타틴(patatin) 단백질 프로모터에 각각 연결한 벡터(pATHBV)이다(도 2의 A 및 도 2의 B).

구체적으로, pMBPHBV 벡터는 pBI121 벡터(Clontech co., Cat. No. 6018-1)에서 GUS 유전자가 제거된 pMBP1 플라스미드를 BamHⅠ으로 절단한 뒤, CaMV35S 프로모터와 nos 터미네이터 사이에 서열번호 1로 기재되는 HBsAg cDNA(한국생명공학연구원 면역학연구실에서 분양받음)를 삽입시켜 제조하였다. 상기 벡터는 선발표지로서 카나마이신 저항성 유전자인 nptⅡ를 가지고 있다. 반면에, pATHBV 벡터의 파타틴 프로모터는 블룬디 등이 보고한 염기서열을 바탕으로 하여 프라이머를 제작한 후 PCR을 수행하여 클로닝에 이용하였다(Blundy, et al., Plant Molecular Biology, 16:153-160, 1991). PCR로 증폭시킨 파타틴프로모터를 pBI121벡터(Clontech co., Cat. No. 6018-1)의 CaMV35S 프로모터에 대체하여 만든 pATGUS 플라스미드에서 KpnⅠ과 SacⅠ제한효소로 GUS 유전자를 잘라내고 HBsAg preS2와 S의 전체 유전자를 삽입시켜 pATHBV 벡터를 제조하였다.

<2-2> 형질전환체의 제작 및 캘러스 형성

상기의 두 벡터 DNA를 각각 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404(Gibco BRL co., Cat. no.18313-015)에 도입하여 하기의 감자의 형질전환에 사용하였다. 상기 벡터의 아그로박테리움내 삽입은 동결-해동(freeze-thaw) 방법(Holsters, et al., 1978, Mol. Gen. Genet., 163:181-187)에 의하여 실시하였다. 본 발명자들은 상기 형질전화된 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404 균주를 2003년 3월 3일 자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호: KCTC 10436BP).

다음으로, 본 발명자들은 실시예 1에서 배양된 생생된 지 1주일 정도 된 감자 잎을 절단하여 상기의 아그로박테리움과 공동배양으로 형질전환체를 제조한 후, 형질전환체를 재분화시켰다. 구체적으로, 감자의 잎 절편으로 HBsAg 유전자를 도입시키기 위하여, 감자 줄기를 배양시킨 후 7일이 지나지 않은 잎들 약 100여 개를 선별하여 실시예 <2-1>의 pMBPHBV 및 pATHBV 벡터가 삽입된 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404의 배양액에 10분 동안 침지시킨 다음, 멸균된 페이퍼 위에서 수분을 완전히 제거하고 2.0 ㎎/L 2,4-D(2,4-dichlorophenoxy acetic acid)가 들어있는 공동배양 배지에 치상한 후 이틀동안 배양하여 형질전환체를 제조하였다. 상기 과정은 형질전환체의 제조와 함께 잎 절편의 상처부위로부터 캘러스 유도가 보다 잘 이루어지도록 하기 위한 것이며, 이 때 카나마이신과 같은 항생제는 첨가하지 않아야 아그로박테리움 균이 감자 염색체 내로 삽입될 기회가 높아진다. 캘러스 형성을 위하여 사용한 배지는 3%의 자당, 8% 한천 및 2.0 ㎎/L 2,4-D를 첨가한 MS 배지를 사용하였으며, 배지의 수소이온농도는 5.8로 조정하였다.

<실시예 3> 기관 분화에 의한 감자 식물체의 재분화 및 소괴경 형성

실시예 <2-2>의 형질전환체의 제조 이후 상처 부위로부터 캘러스의 형성이 유도될 무렵(즉, 2,4-D가 들어있는 캘러스 유도 배지에서 형질전환된 잎 절편을 이틀 동안 배양)에, 소식물체의 재분화를 유도하기 위하여 0.01 ㎎/L NAA(α-NaphthaleneAcetic Acid), 0.1 ㎎/L GA₃(지베렐린; gibberellin)및 2.0 ㎎/L 지아틴(Zeatin)이 함유된 MS 한천 배지인 재분화 배지로 옮겨주었다. 이때, 카나마이신(Duchefa co., K0126) 100 ㎎/L을 첨가하여 형질전환 감자 식물체만이 재분화하도록 선발압력을 가하였고, 잎 절편에 묻어 있거나 식물체내로 도입되지 않고 남아있는 아그로박테리움을 제거하기 위하여 카베니실린(Duchefa co., C0109) 1000 ㎎/L을 배양배지에 첨가하였다. 옮겨 준 지 1주일 만에 잎 절편의 상처 부위에서 캘러스의 형성이 시작되고 4주 경과 후부터 소식물체가 출현하였다. 형질전환 소식물체가 재분화하는 기간동안 약 2주 간격으로 새로운 배지로 옮겨 주었다. 그 결과, 상기 형질전환된 잎 절편을 2주 간격으로 동일한 선발배지로 계대배양하여, 배양 8주가 경과된 후에 약 50 개체의 소식물체를 얻을 수 있었다. 기내배양된 정상적인 감자 식물체와 비교하였을 때, 형질전환된 감자에서 비정상적인 형태는 관찰되지 않았다.

소괴경 형성을 유도하기 위하여, 형질전환 소식물체를 분리가 가능할 정도까지 배양한 다음 MS 기본 배지로 옮겨 주어 정상 식물체와 동일한 과정으로 증식시켜 화분으로 옮겨 생육을 관찰한 결과 정상적인 감자 괴경까지 수확할 수 있었다. 기내소괴경 형성용 배지는 MS 기본배지에 90 g/L의 자당을 첨가한 것을 사용하였으며 배양환경은 8시간의 광주기와 17℃의 배양온도에서 배양하였다. 기내소괴경 형성은 증식용 배양조건에서 2 내지 3주 정도 자란 감자줄기의 아랫부분을 치상하였으며, 치상 후 약 2주일부터 저장줄기가 부풀어오르기 시작하여 8주 정도가 지나면 1 g 이상의 성숙된 소괴경을 얻을 수 있었다(도 3). 이러한 결과는 HBsAg 유전자가 감자 식물체에 안정적으로 도입되어 정상적인 식물체로 생육됨을 입증하는 것이다.

<실시예 4> PCR 및 서던 블럿 분석에 의한 HBsAg 유전자의 도입 확인

본 발명은 HBsAg 유전자가 식물체내로 도입된 것을 확인하기 위하여, 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하였다. 카나마이신을 포함하는 선발배지를 이용함으로써 이 배지에서 생육하는 소식물체를 일차적으로 선발할 수 있었고, 여기서 선발된 개체들의 염색체 DNA(genomic DNA) 내의 NPTⅡ 유전자의 존재여부를 PCR로 분석하였다.

구체적으로, 카나마이신이 함유된 배지에서 선발된 소식물체의 잎 절편으로부터 염색체 DNA를 분리하고, NPTⅡ 유전자의 프라이머(primer)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 이때, 서열번호 3으로 기재되는 정방향 프라이머(sense primer)와 서열번호 4로 기재되는 역방향 프라이머(antisense primer)를 이용하여 전반응(precycling reaction)으로 94℃에서 2분간 변성시키고, 94℃에서 1분, 57℃에서 1분, 72℃에서 2분의 순서로 45회 반응을 반복한 다음 마지막 반응에서 72℃에서 10분간 반응시킴으로서 상기 반응을 종료시켰다. PCR 산물을 확인하기 위하여, 반응액 10 ㎕를 아가로스 젤(agarose gel)에 전기영동하고 자외선을 조사하여 DNA 밴드를 조사하였다. 도 4는 선발된 소식물체 중 6개체만을 대상으로 PCR 분석의 결과를 나타낸 것으로 4 개체에서 0.7 kb의 NPTⅡ DNA 밴드가 관찰되었다. 즉, 약 66%의 선발 효과를 보였다.

또한, NPTⅡ 유전자외에도 HBsAg 유전자의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 서열번호 5로 기재되는 정방향 프라이머(forward primer)와 서열번호 6으로 기재되는 역방향 프라이머(backward primer)를 이용하여 전반응(precycling reaction)으로 94℃에서 2분간 변성시키고, 94℃에서 45초, 60℃에서 1분 및 72℃에서 2분의 순서로 30회 반응을 반복한 다음 마지막 반응에서 72℃에서 10분간 반응시킴으로서 상기 반응을 종료시켰다. 아가로스 젤에서 반응액을 확인해 본 결과 0.85 kb의 HBsAg 유전자 DNA 밴드를 관찰하였다. 상기의 결과로, 형질전환된 감자에서 선발 표식인자인 NPTⅡ 유전자 및 HBsAg 유전자가 감자 염색체내에 존재하고 있음을 확인하였다.

또한, 감자의 게놈내에 도입된 HBsAg 유전자의 삽입 상태를 확인하기 위하여 서던 블럿(Southern Blot)을 실시하였다. CTAB(cethyltrimethyl-ammonium bromide) 버퍼를 이용한 식물의 유전자(genomic) DNA 분리방법(Doyle & Doyle, Phytochemica Bulletin, 19:11-15, 1987)을 변용하여 잎과 신초 부분에서 감자의 염색체(genomic) DNA 1 g을 추출하였다. 약 30 ㎍의 DNA를 EcoRⅠ으로 처리하여 정제한 후 1% 아가로스 젤에 25 V로 20시간 동안 전기영동한 다음 DNA 전이를 위한 아가로스 젤의 처리과정을 거친 후 나일론 막으로 전이하였다. 전이된 DNA 단편들을 나일론 막에 고정시키기 위하여 1200 μJ/㎠의 강도로 자외선 조사를 2회 실시하였다. DNA 단편들이 고정되어 있는 나일론 막에서 DNA 밴드를 육안으로 확인하기 위하여 다음과 같은 처리들을 하였다. 먼저 DIG 표지가 부착되어 있는 탐침을 50℃에서 16시간 동안 나일론 막에 붙이고 DIG을 검출할 수 있는 진단킷트를 이용하여 DNA 밴드를 가시화하였다. 그 결과, pMBPHBV 발현 형질전환체의 경우 감자 게놈 내로 1개에서 3개의 유전자를 삽입하였고, pATHBV 발현 형질전환체 역시 1개에서 3개 정도의 삽입이 이루어졌음을 확인하였다(도 5).

<실시예 5> 형질전환 감자 식물체에서의 HBsAg의 전사체 분석

본 발명은 상기 감자 형질전환체에서 RNA의 발현여부를 먼저 관찰하여 개체의 확실한 선발효과를 가지고자 하였다. 감자의 잎과 신초 부분을 포함하여 1 g 정도를 채취하여 총 RNA를 추출하였다. 정제된 RNA를 정량한 뒤 30 ㎍을 19.8%의 포름알데하이드가 함유된 1% 아가로스 젤에 전기영동하였다. 특별한 전처리 없이 아가로스 젤의 RNA를 나일론 막으로 전이시켰다. 전이된 RNA를 나일론 막에 고정시키고 탐침을 부착시킨 후 검출하는 과정은 상기 실시예 4의 서던 블럿에서 언급한 바와 동일하게 실시하였다. 그 결과, 선발된 형질전환체 모두에서 HBsAg의 RNA 발현이 확인되었고, pMBPHBV 형질전환체의 발현 수준과 pATHBV 형질전환체간의 발현 수준이 크게 차이가 나지 않음을 확인하였다(도 6).

<실시예 6> HBsAg 단백질의 발현 분석

pMBPHBV 10번 식물체와 pATHBV 2번과 8번 식물체에서 감자 소괴경을 수확하여 단백질을 추출하였다. 사용한 추출버퍼는 PBS 버퍼(pH 7.2), 10 mM EDTA, 1 mM 단백질 분해효소 저해제 칵테일(proteinase inhibitor cocktail), 0.1% Triton X-100의 혼합물을 시료 무게의 절반 부피로 계산하여 첨가하였다. 이때, 항산화제는 HBsAg 단백질의 이황화(disulfide) 결합을 끊기 때문에 첨가하지 않았으며, 모든 추출 조건을 4℃ 전후로 조절하여 신속한 추출이 이루어지도록 하였다. 도 7은 감자에서 발현되는 HBsAg 단백질을 웨스턴 블럿(Western blot)을 통해 분석한 결과이다. 선별한 세 형질전환 개체의 단백질의 크기를 확인하기 위하여 사용한 항원 대조군에서 HBsAg의 이중체 형태인 48 KDa의 단백질 밴드를 확인할 수 있었으며, 대조군에서는 특이한 밴드를 발견하지 못하였다.

동일한 방법으로 추출한 HBsAg 단백질의 샌드위치 면역활성 측정(Enzyme-linked Immunogy Sandwich Assay; ELISA)과 고형상 면역방사 계수법(IRMA)으로 항원력 및 정량을 확인하고자 하였다. HBsAg 단백질의 ELISA 측정은 다음과 같은 순서로 진행하였다. 양성(HBsAg 항원), 음성(반응버퍼) 대조군과 감자 시료액을 마이크로플레이트 웰에 분주하여 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 5% 스킴 밀크(skim milk)로 블록킹(blocking) 과정을 거친 후 웰을 세척버퍼로 3회 세척하였다. H67 단일항체를 분주하여 실온에서 2시간 반응 후 웰을 씻어내고 마우스 Ig 홍당무 퍼옥시다제(mouse Ig horseradish peroxidase) 이차항체를 분주하여 실온에서 2시간 반응시킨 다음 3회 세척하였다. 발색을 위한 효소반응을 위하여 o-페닐린디아민 디하이드로클로라이드(o-phenylenediamine dihydrochloride)와 H₂O₂를 첨가햐여 20분 동안 암상태에서 방치한 후 마이크로플레이트리더를 이용하여 흡광도를 측정하였다.

고형상 면역방사 계수법(IRMA)의 측정은 양성대조, 음성대조, 감자 시료액을 각각 시험관에 분주하고, anti-HBV가 코팅된 비드를 한 개씩 넣어 실온에서 하룻밤 방치하였다. 용액을 버리고 증류수로 비드를 세척한 다음 ¹²⁵I-anti-HBV를 분주하고 45℃에서 2시간 동안 중탕하였다. 용액을 버리고 비드를 증류수로 세척한 다음 물기를 완전히 말린 다음 감마카운터로 각 시험관의 방사능을 측정하였다.

HBsAg의 S 항원에 대한 ELISA 실험 결과, pMBPHBV 감자의 경우 4-2번 개체에서 대조군에 비해 약 2배 이상의 발현을 보였다. pATHBV 감자의 2번과 6번 개체에서 약 3배 가까운 발현을 나타내었다. 반면에 preS2 항원에 대한 결과 pMBPHBV 감자의 1-2번과 11번 개체에서 약 2배 이상이, pATHBV 감자의 5-3번과 8번 개체에서 약 3배 이상의 발현량을 나타내었다(도 8a). 상기 ELISA 결과는 유의성이 있을 정도로 대조군과 형질전환 개체간의 차이는 아니었다.

그 이유로 감자 내에서의 발현량이 ELISA로 검출하기에는 너무 작은 양이라고 판단하고, 본 발명자들은 보다 유의성 있고 확실한 HBsAg 발현 개체를 선발하기 위하여 ELISA에 비해 HBsAg에 대한 반응의 민감도가 약 10배 이상되는 IRMA 검사를 실시하였다. 샌드위치법을 이용한 고형상 면역방사 계수 측정 장치로 HBsAg IRMA 키트(새한산업 (주))를 사용하였다. 시료중의 HBsAg를 측정하기 위해 2가지 단일항체로 코팅된 비드에 시료를 첨가시켜 반응시키면 시료내의 HBsAg는 비드에 고착되고 여기에 동위원소 I¹²⁵를 표지시킨 다가항체를 첨가시켜 고착된 HBsAg와 결합시켰다. 그 결과, pMBPHBV의 경우 1-2번과 11번 개체에서 대조군에 비해 약 2배 가까이 높은 값을 보였고, pATHBV의 경우 5-3번과 8번 개체에서 대조군에 비해 약 15 내지 17배 가까이 높은 값을 보임으로써 HBsAg 유전자가 감자 내에 도입되어 발현됨을 확인하였으며, 상시 발현 프로모터인 CaMV35S에 비해 감자괴경 특이적 프로모터인 파타틴 프로모터에 의한 HBsAg의 발현율이 월등히 높음을 확인 할 수 있었다(도 8b).

따라서, 본 발명에서 개발된 형질전환 감자는 간염바이러스의 항원 유전자인 HBsAg의 S 부분과 preS2 부분을 동시에 발현함으로써 식품의 섭취를 통한 경구용 간염 백신의 제조가 가능하다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 인체에 간염을 유발시키는 표면항원 HBsAg 유전자인 S 유전자 및 preS2 유전자를 감자 내로 도입하여 상기 HBsAg를 과발현하는 본 발명의 형질전환 감자는 쉽게 접할 수 있는 식품인 감자를 단지 섭취함으로써 간염 백신의 효능을 나타낼 수 있으므로, 경구용 간염 예방 백신의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 B형 간염 바이러스 항원(HBsAg) 유전자의 서열번호 1로 기재되는 preS2 및 서열번호 2로 기재되는 S의 염기서열을 함께 나타낸 것이고,

도 2는 pMBP 식물체 플라스미드에 서열번호 1(서열번호 2 포함)로 기재되는 HBsAg 유전자의 삽입 위치를 나타낸 형질전환용 pMBPHBV 벡터의 개략도(A) 및 pPAT522 식물용 플라스미드에 서열번호 1(서열번호 2 포함)로 기재되는 HBsAg 유전자의 삽입 위치를 나타낸 형질전환용 pATHBV벡터의 개략도(B)이고,

도 3은 HBsAg 유전자가 삽입된 아그로박테리움에 의한 접종 후 캘러스로 유도되어 증식용 배지에서 자라고 있는 형질전환된 감자 식물체(좌측) 및 증식된 식물체에서 형성된 감자 소괴경의 대량생산 과정(우측)을 나타낸 사진이고,

도 4는 형질전환된 감자 세포에 도입된 HBsAg 유전자를 중합효소연쇄반응으로 증폭시켜 S(상단) 및 preS2(하단) 유전자가 상기 감자 세포에 도입되었음을 나타낸 전기영동 사진이고,

M: 1kb 크기의 DNA 분자량 마커,

N: 형질전환되지 않은 정상 감자,

T1 내지 T6: 각각 다른 클론인 형질전환 감자,

도 5는 HBsAg 유전자가 감자 게놈내로 도입된 개수를 확인하기 위한 서던 블럿(Southern blot)의 결과를 나타낸 전기영동 사진이고,

M: 1kb 크기의 DNA 분자량 마커,

P1: 플라스미드 pMHBV,

1 내지 5: 플라스미드 pMHBV가 도입된 각각 다른 클론인 형질전환 감자,

P2: 플라스미드 pATHBV,

6 내지 10: 플라스미드 pATHBV가 도입된 각각 다른 클론인 형질전환 감자,

N: 형질전환되지 않은 정상 감자,

도 6은 감자 세포에 도입된 HBsAg 유전자의 전사 여부를 확인하기 위하여, 상기 유전자의 mRNA의 노던 블럿(Northern blot) 결과를 나타낸 전기영동 사진이고,

N1: 형질전환되지 않은 정상 감자,

P1 내지 P4: 플라스미드 pATHBV가 도입된 각각 다른 클론인 형질전환 감자,

N2: 형질전환되지 않은 정상 감자,

M1 내지 M4: 플라스미드 pMHBV가 도입된 각각 다른 클론인 형질전환 감자,

도 7은 형질전환된 감자 소괴경에서의 HBsAg 발현(화살표)을 확인하기 위하여, 단일항체 H67을 이용한 웨스턴 블럿(Western blot)의 결과를 나타낸 SDS-PAGE 전기영동 사진이고,

M: 미리 염색된 단백질 분자량 마커,

P: HBsAg 항원,

N: 형질전환되지 않은 정상 감자,

M10: 플라스미드 pMHBV가 도입된 형질전환 감자 10번,

P8: 플라스미드 pATHBV가 도입된 형질전환 감자 8번,

P2: 플라스미드 pATHBV가 도입된 형질전환 감자 2번,

도 8a는 형질전환된 감자 소괴경에서의 HBsAg에 대한 ELISA 분석 결과를 나타낸 그래프이고,

HBsAg-S, HBsAg-preS2; 각각 양성대조군으로 사용한 HBsAg-S항원, HBsAg-preS2항원,

Con, Potato: 형질전환되지 않은 정상 감자,

pMHBV1-2, pMHBV4-2, pMHBV7, pMHBV10, pMHBV11; 플라스미드 pMHBV가 도입된 각각 다른 클론인 형질전환 감자,

pATHBV1-1, pATHBV1-2, pATHBV2, pATHBV5-3, pATHBV6, pATHBV8; 플라스미드 pATHBV가 도입된 각각 다른 클론인 형질전환 감자,

도 8b는 형질전환된 감자 소괴경에서의 HBsAg에 대한 IRMA 분석 결과를 나타낸 그래프이다.

NC; 음성대조군으로 사용한 반응버퍼,

PC; 양성대조군으로 사용한 HBsAg-S항원,

P-NC; 형질전환되지 않은 정상 감자,

M1-2, M4-2, M7,M10; 플라스미드 pMHBV가 도입된 각각 다른 클론인 형질전환 감자,

P1-1, P1-2, P2, P5-3, P6, P8; 플라스미드 pATHBV가 도입된 각각 다른 클론인 형질전환 감자

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Transformed potato cell and plant, expressing antignes of hepatits B virus and method for preparing the same <130> 3p-01-32 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 846 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <400> 1 atgcagtgga actccaccac attccaccaa gctctgctag atcccagagt gaggggccta 60 tattttcctg ctggtggctc cagttccgga acagtaaacc ctgttccgac tactgcctca 120 cccatatcgt caatcttctc gaggactggg gaccctgcac cgaacatgga gagcacaaca 180 tcaggattcc taggacccct gctcgtgtta caggcggggt ttttcttgtt gacaagaatc 240 ctcacaatac cacagagtct agactcgtgg tggacttctc tcaattttct agggggagca 300 cccacgtgtc ctggccaaaa ttcgcagtcc ccaacctcca atcactcacc aacctcttgt 360 cctccaattt gtcctggcta tcgctggatg tgtctgcggc gttttatcat attcctcttc 420 atcctgctgc tatgcctcat cttcttgttg gttcttctgg actaccaagg tatgttgccc 480 gtttgtcctc tacttccagg aacatcaact accagcacgg gaccatgcaa gacctgcacg 540 attcctgctc aaggaacctc tatgtttccc tcttgttgct gtacaaaacc ttcggacgga 600 aactgcactt gtattcccat cccatcatcc tgggctttcg caagattcct atgggagtgg 660 gcctcagtcc gtttctcctg gctcagttta ctagtgccat ttgttcagtg gttcgcaggg 720 ctttccccca ctgtttggct ttcagttata tggatgatgt gctattgggg gccaagtctg 780 tacaacatct tgagtccctt tttacctcta ttaccaattt tcttttgtct ttgggtatac 840 atttga 846 <210> 2 <211> 681 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <400> 2 atggagagca caacatcagg attcctagga cccctgctcg tgttacaggc ggggtttttc 60 ttgttgacaa gaatcctcac aataccacag agtctagact cgtggtggac ttctctcaat 120 tttctagggg gagcacccac gtgtcctggc caaaattcgc agtccccaac ctccaatcac 180 tcaccaacct cttgtcctcc aatttgtcct ggctatcgct ggatgtgtct gcggcgtttt 240 atcatattcc tcttcatcct gctgctatgc ctcatcttct tgttggttct tctggactac 300 caaggtatgt tgcccgtttg tcctctactt ccaggaacat caactaccag cacgggacca 360 tgcaagacct gcacgattcc tgctcaagga acctctatgt ttccctcttg ttgctgtaca 420 aaaccttcgg acggaaactg cacttgtatt cccatcccat catcctgggc tttcgcaaga 480 ttcctatggg agtgggcctc agtccgtttc tcctggctca gtttactagt gccatttgtt 540 cagtggttcg cagggctttc ccccactgtt tggctttcag ttatatggat gatgtgctat 600 tgggggccaa gtctgtacaa catcttgagt ccctttttac ctctattacc aattttcttt 660 tgtctttggg tatacatttg a 681 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 3 atgattgaac aagatgga 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 4 tcagaagaac tcgtcaag 18 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 5 ggtaccatgc agtggaactc caccaca 27 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> backward primer <400> 6 gagctcaaat gtatacccaa agacaaaag 29

Claims

B형 간염 바이러스의 항원 유전자중 서열번호 1의 1부터 165번까지의 염기서열로 기재되는 preS2와 서열번호 2로 기재되는 S 유전자 및 파타틴 프로모터가 포함된 발현벡터로 형질전환된 아그로박테리움의 도입을 통해 이루어지는 형질전환 감자 세포.
삭제
삭제
상기 제 1항의 발현벡터가 도입된 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404(수탁번호: KCTC 10436BP).
제 1항의 상기 감자 세포를 조직배양 방법으로 재분화시켜 제조되는 형질전환 감자.
제 5항에 있어서, 상기 재분화는 조직배양으로 캘러스를 형성시킨 후 기관을 유도하는 방법을 통하여 이루어지는 것을 특징으로 감자.
ⅰ) 제 1항의 B형 간염 바이러스의 preS2와 S 유전자 및 파타틴 프로모터를 포함하는 pATHBV 발현벡터를 제조하는 단계;

ⅱ) 상기 발현벡터를 아그로박테리움에 도입하는 단계; 및

ⅲ) 상기 아그로박테리움과 감자 세포를 공동배양하여 상기 감자 세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는 제 1항의 형질전환 감자 세포의 제조방법.
제 1항의 형질전환 감자 세포를 조직배양으로 재분화시키는 단계를 포함하는 제 5항의 감자의 제조방법.
제 5항의 감자를 유효성분으로 함유하는 경구용 간염 예방 백신 조성물.