JP2008048622A - アミロイドβペプチドをコードする遺伝子を含有したイネ。 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】Aβをコードする遺伝子が発現可能に導入されていることを特徴とするイネであり、前記AβはAβ40、又はAβ42、又は前記Aβ40又はAβ42のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり体内において抗アミロイドβペプチド抗体を産生するタンパク質であることが好ましい。更に前記Aβをコードする遺伝子がアジュバント効果を持つタンパク質をコードする遺伝子との融合遺伝子であることが好ましく、前記アジュバント効果を持つタンパク質が蛍光タンパク質であることが好ましい。更に本発明は前記イネから生産されるAβ、及び該Aβを含有する食品、医薬品、または栄養補助剤である。
【選択図】図4
Description
<1> 本発明は、Aβをコードする遺伝子が発現可能に導入されていることを特徴とするイネであり、前記Aβをコードする遺伝子は、Aβ40、又はAβ42をコードする遺伝子、並びに前記Aβ40又はAβ42のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ抗Aβ抗体を産生する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である。
<2> 更に本発明は、前記Aβをコードする遺伝子がアジュバント効果を持つタンパク質をコードする遺伝子との融合遺伝子であることが好ましく、前記アジュバント効果を持つタンパク質が蛍光タンパク質であることが好ましく、更に前記蛍光タンパク質は緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、又はこれらの誘導体であることが好ましい。
<3> 更に前記イネは極早生稲品種であることが好ましい。
<4> 更に本発明は、前記イネから生産されるアミロイドβペプチド、及び該アミロイドβペプチドを含有する食品、医薬品、または栄養補助剤である。
本発明が対象とする「アミロイドβペプチド」は、人体においては細胞膜に存在するアミロイド前駆体タンパク質(以下APPということがある。)が、分解酵素βセクレターゼ及びγセクレターゼにより切断されて生成される。AβはC-末端の切断部位の違いによってAβ40(40アミノ酸)と、それより2アミノ酸C-末側で切断されるAβ42が存在する。Aβ42のアミノ酸配列は、下記の通りであり、Aβ40のアミノ酸配列は、Aβ42のアミノ酸配列からC-末側の「IA」が欠落した配列である。
Aβ42:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA
イネ品種は「はやゆき」を用いた。成熟種子のもみを取り除き、玄米を取り出し、該玄米を70%エタノールで10秒間、20%アンチホルミン(和光純薬工業(株)製、品名コード197-02206)で15分間、表面を除菌した。該除菌処理は、直径90mm高さ20mmのシャーレ(テルモ(株)製、品名コードSH-20S)を用いて行い、除菌処理後に、滅菌水で玄米を4回以上洗い、前記除菌液を完全に取り除いた。
参考文献1(Toki S., Hara N. , Ono K., Onodera H., TagiriA., Oka S., Tanaka H.:
Early infection of scutellum tissue withAgrobacterium allows high
speed transformation of rice.Plant J. in press (2006) )
なお前記培地組成、培養条件等は、あくまでも本実施例において使用したものであり、形質転換に通常使用される他の方法で、本発明の形質転換イネを作出してもよい。なお後記の、接種用培地、共存培養用培地、除菌用培地、選抜用培地等の各培地についても同様である。
ヒト由来のアミロイド前駆体(APP) cDNAから、PCR法により、Aβ40遺伝子を作製した 。具体的には、Aβ40遺伝子の5’末端の塩基配列に制限酵素XhoIサイトとチミンを付加したプライマー(Aβ−5’ XhoI(+):5’-GAAGTCTCGAGTGATGCAGAAT-3’)と、Aβ40遺伝子の3’末端の塩基配列に終止コドンと制限酵素HindIIIサイトを付加したプライマー(Aβ40−3’HindIII(−):5’-GATGCAAGCTTTTAGACAACACCG-3’)を用い、PCR法によりAβ40遺伝子を増幅した。さらに、増幅された遺伝子をXhoIとHindIIIで切断し、実施例1の目的遺伝子であるAβ40遺伝子を得た。実施例2の目的遺伝子であるAβ42遺伝子も、前記のプライマー(Aβ−5’ XhoI(+))とプライマー(Aβ42−3’HindIII(−):5’-GAACGAAGCTTTTACGCTATGACA-3’) を用い、Aβ40遺伝子と同様に得た。
オワンクラゲから単離された緑色蛍光タンパク質(以下GFPという。)をコーディングする遺伝子(以下GFP遺伝子という。)を既に含むプラスミドpGFP-C2(ClontechLaboratories, Inc.製)のマルチクローニングサイトを、制限酵素のXhoI及びHindIIIで切断し、前記実施例1の目的遺伝子及び実施例2の目的遺伝子をそれぞれ切断部位に挿入し、GFP遺伝子とAβ40遺伝子との融合遺伝子を含むプラスミド(融合遺伝子含有プラスミド:pGFP-C2(Aβ40)、(実施例1))、及びGFP遺伝子とAβ42遺伝子の融合遺伝子を含むプラスミド(融合遺伝子含有プラスミド、pGFP-C2(Aβ42)、(実施例2))をそれぞれ得た。
前記実施例1及び実施例2の融合遺伝子含有プラスミドを鋳型として、プラスミドの蛍光遺伝子の5’末端の塩基配列にXbaIサイトを付加したプライマー
(GFP-5’Xba(+):5’-TTTCTAGAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’)と、プラスミドのマルチクローニング部位の一部を含む配列に、SacIサイトを付加したプライマー(Aβ-Sac(-):5’-TTGAGCTCGACTGCAGAATTCGAAGCTT-3’)を用いて、PCR法により増幅した後、制限酵素(XbaIとSacI)処理して、実施例1のGFP遺伝子とAβ40遺伝子との融合遺伝子及び実施例2のGFP遺伝子とAβ42遺伝子との融合遺伝子を作製した。
アグロバクテリウム用ベクターとして、下記参考文献2に記載されているpIG121・Hmを用いた。
参考文献2(Hiei Y., Ohta S., Komari T. Et al.: Efficienttransformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of theT-DNA. Plant J. 6: 271-282 (1994) )
参考文献3(Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T.: Molecular Cloning(alaboratory menual)2nd ed. vol.1, 出版社Cold Spring Harbor Laboratory Press)
前記実施例1及び実施例2の融合遺伝子を導入後のベクター(それぞれpIG121・Hm(GFP+Aβ40)及びpIG121・Hm(GFP+Aβ42)を、前記参考文献2に記載のアグロバクテリウム・ツメファシエンスEHA101株に、遺伝子導入装置(Bio-Rad Laboratories, Inc.製、E.coli パルサー)を使用して、エレクトロポレーション法(Bio-RadLaboratories, Inc.製、0.1cmキュベット使用、パルス条件:1.6KV/cm)により導入した。以後前記実施例1及び実施例2のベクターがそれぞれ導入された菌株を、実施例1及び実施例2の菌株という。
前記ベクターの導入が確認された実施例1及び実施例2の耐性菌を、更に50mg/Lのカナマイシンと50mg/LのハイグロマイシンBとを、1.2%バクトアガーを加えたLB培地上で25℃、暗黒下で一昼夜培養した。
前記培養後の実施例1及び実施例2のカルスを、上記培地から取り出し、除菌用培地(N6無機塩、N6ビタミン、2mg/L 2,4-D 、30g/Lショ糖、400mg/L カルベニシリン、pH5.8)を用いて、除菌用培地が透明になるまで洗浄した。この洗浄処理は、前記除菌用培地を7.5mL入れた直径60mmのシャーレを用い、前記カルスを該シャーレに3回以上移し変えることにより行った。
前記除菌後の実施例1及び実施例2のカルスを、選抜用培地において培養した。該選抜用培地は、前記カルス誘導培地に、カルベニシリンを400mg/LとハイグロマイシンBを50mg/L加えたもので、前記カルベニシリンおよびハイグロマイシンBは、オートクレーブ後の培地温度が固化直前になるまで低下したときに、規定濃度になる様に培地に加えた。前記培地20mLを、直径90mm、高さ20mmのシャーレに入れ、該培地上に除菌後の実施例1及び実施例2のカルスを、それぞれ20個置いて培養した。培養条件は、温度が25−27℃で、照度が3000luxの白色灯を1日当たり16時間の照射とした。培養は、10日ごとに、白色または黄色のカルスを同様の培地に移植し、褐色に変色したカルスは廃棄することにより、遺伝子導入カルスを選抜した。
前記により選抜された実施例1及び実施例2の遺伝子導入カルスを、それぞれ植物体誘導培地に移植した。該植物体誘導培地は、下記参考文献4に記載のMS無機塩、MSビタミン、1mg/Lナフタレン酢酸、2mg/Lベンジルアミノプリン、2g/lカザミノ酸、30g/Lソルビトール、30g/Lショ糖、50mg/lハイグロマイシンB、4g/lゲルライト、pH5.8の培地に、100mg/Lカルベニシリンを加えたものである。
参考文献4(Rashid H., Yokoi S., Toriyama K., Hinata K.: Transgenic plantproduction mediated by Agrobacterium in Indica rice. Plant Cell Rep. 15:727-730 (1996) )
前記により1cm以上に生育した実施例1及び実施例2の小植物体を、発根生育培地に移植し、発根と生育を促した。前記発根生育培地の組成は、前記参考文献4に記載のMS無機塩、MSビタミン、30g/Lショ糖、4g/Lゲルライト、50mg/LハイグロマイシンB、pH5.8である。前記培地の20mLを、直径90mm、高さ20mmのシャーレに入れ、単離した10個の小植物体を、やや埋めるようにして移植した。培養条件は、温度が25−27℃で、照度が3000luxの白色灯を1日当たり16時間の照射とした。発根後の遺伝子導入個体の確認は、GFP蛍光法により行い、根が緑色に蛍光を発するものを遺伝子導入個体とし、蛍光を発しないものは廃棄した。
前記により培養後、発根した実施例1及び実施例2の小植物体を、滅菌土の入ったポットに移植した。最初は大きめのビーカー等と寒冷紗で保護し、徐々に温室の条件に馴らし、さらに生育させて実施例1及び実施例2のイネ植物体を得た。
前記により得られた実施例1及び実施例2のイネ植物体のDNAに、遺伝子が導入されていることを確認するために、PCR法による解析を行った。遺伝子導入イネ、及び対照として非遺伝子導入イネの抽出DNAを鋳型として、導入された遺伝子の断片を検出するためのプライマーセットとして、ForwardPrimer : GFP-5’Xba(+)、及びReverse Primer : Aβ-Sac(-)を、Premix Taq(Ex Taq、タカラバイオ(株)製、品名コードRR003A)に加えてPCRを行った。PCRは、95℃で1分間処理した後、94℃での変性1分間、65℃でのアニーリング1分間、72℃での伸長1分間の反応を、30サイクル行い、最終サイクルの伸長反応は、1分間延長した。PCR終了後、PCR反応液の約1/4量について、1xTAE緩衝液(40mM Tris、1mM EDTA、20mM 酢酸) によるアガロースゲル電気泳動により増幅産物の確認を行った。分子量マーカーには100bp DNAladder (NEB製、メーカーコード:N3231L) を用いた。
実施例1及び実施例2の遺伝子導入イネに、目的遺伝子の形質発現に由来するアミロイドβペプチドと蛍光タンパク質との融合タンパク質(以下Aβ+GFP融合タンパク質ということがある)が蓄積していることを、ウエスタンブロット法により確認した。実施例1及び実施例2の遺伝子導入イネ、並びに対照として非遺伝子導入イネについて、各個体の葉、および根を、タンパク抽出緩衝液(50mM Tris-HCl(pH6.5)、10% Glycerol、2% ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、2% 2-メルカプトエタノール)を加えて破砕した後、10分間、20,000gで遠心し、タンパク質を抽出した。その上清の一部を泳動用の試料として準備した。
蛍光実体顕微鏡(ニコン製、P-FLA実体蛍光装置(SMZ800)、フィルターブロック:P-FLGFP-B(励起用フィルタ:460〜500nm、吸収フィルタ:510〜560nm))を用い、観察した。結果を図4に示す。図4において、上が非遺伝子導入イネ玄米を、下が実施例2の遺伝子導入イネ玄米をそれぞれ示す。
遺伝子導入イネの玄米のAβの蓄積量をウエスタンブロット分析により確認した。実施例2の遺伝子導入イネ、並びに対照として非遺伝子導入イネについて、各個体に結実した玄米1粒(約20mg)を破砕した後、400μlの抽出緩衝液(20mM Tris-HCl(pH6.5)、8M Urea、5% 2-メルカプトエタノール、20%Glycerol、4% SDS)中で、1時間室温で振盪し、更に、5分間、20,000gで遠心し、タンパク質を抽出した。3μl(玄米0.15mg)を泳動用の試料として準備した。また、実施例2の遺伝子導入イネの玄米に含まれるAβ42濃度を推定するため、市販のAβ42(PeptideInstitute, Inc.製、Code:4349-v)を、5、10、20、40、60ngの濃度に調製し、それぞれ泳動用試料として同様に準備した。
Claims (10)
- アミロイドβペプチドをコードする遺伝子が、発現可能に導入されていることを特徴とするイネ。
- 前記アミロイドβペプチドが、アミロイドβペプチド40、又はアミロイドβペプチド42、又は前記アミロイドβペプチド40又はアミロイドβペプチド42のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり体内において抗アミロイドβペプチド抗体を産生するタンパク質である請求項1に記載のイネ。
- 前記アミロイドβペプチドをコードする遺伝子がアジュバント効果を持つタンパク質をコードする遺伝子と融合されて導入されている請求項1又は請求項2に記載のイネ。
- 前記アジュバント効果を持つタンパク質が蛍光タンパク質である請求項3に記載のイネ。
- 前記蛍光タンパク質が緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、又はこれらの誘導体である請求項4に記載のイネ。
- 前記イネが極早生稲品種である請求項1乃至請求項5のいずれかに記載のイネ。
- 請求項1乃至請求項6に記載のイネに由来し、アミロイドβペプチドを含有する植物個体、組織、カルス、及び細胞。
- 請求項1乃至請求項6に記載のイネ、及び請求項7に記載の植物個体、組織、カルス、及び細胞を用いたアミロイドβペプチドの生産方法。
- 請求項8に記載のアミロイドβペプチドの生産方法を用いて生産されるアミロイドβペプチド。
- 請求項9に記載のアミロイドβペプチドを含有する食品、医薬品、または栄養補助剤。
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