KR100255474B1

KR100255474B1 - 형질전환된 벼 고엽고 바이러스 저항성 벼 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR100255474B1
Application number: KR1019920022980A
Authority: KR
Inventors: 야펭 주; 다까히꼬 하야가와; 시게미쓰 도리야마
Original assignee: 아사가 고오이찌; 노오린스이산쇼오 노오교오강꾜오기쥬쓰 겡규우쇼
Priority date: 1991-12-02
Filing date: 1992-12-01
Publication date: 2000-05-01
Also published as: KR930013120A; JPH07313173A; TW290426B; CN1075335A; CN1044385C

Abstract

벼과 식물에서 기능하는 프로모우터의 하류에 벼 고엽고 바이러스 감염 특이 단백질을 코우드하는 유전자 및 터미네이트를 도입한 벡터로 벼를 형질 전환시키고 이 유전자를 발현시킴으로써 벼 고엽고 바이러스에 저항성을 가진 벼를 만든다. 이 방법을 사용하면 종래 공지되어 있는 벼 고엽고 바이러스 외피 단백질 이외의 비구조 단백질을 이용하여 이러한 바이러스 저항성의 벼를 만들 수가 있다.

Description

형질전환된 벼 고엽고 바이러스 저항성 벼 및 그 제조방법

제1도는 실시예에서 얻는 형질전환용 플라스미드 pLAN160의 모식도.

본 발명은 벼 고엽고(葉枯) 바이러스의 감염 특이(特異) 단백질을 코우드(code)하는 유전자 및 이 유전자를 도입한 벼 고엽고 바이러스 감염에 대한 저항성을 가진 벼 및 그 제조방법에 관한 것이다.

종래 식물 바이러스로서는 담배(煙草) 모자이크 바이러스와 오이 모자이크 바이러스를 비롯한 수많은 바이러스가 알려져 있다.

이들 식물 바이러스는 농작물에 병해를 주어 수확을 크게 감소시키는 원인으로 되어 있다. 이러한 바이러스 중에서 벼 고엽고 바이러스는 일본, 중국, 러시아, 한국 등에 분포하여 이들 나라의 도작(稻作)에 큰 피해를 주고 있다. 일본에서는 매년 평균 약 10%의 벼가 벼 고엽고 바이러스의 피해를 입고 있다.

그러나 실용적인 항 바이러스제가 극히 적으므로 그 방제의 대부분은 감염원 식물의 제거나 매개충의 구제에 의지하고 있는 것이 현재의 실정이다. 이와 같은 물리적인 또는 화학적인 방제 수단이외에 생물적인 경종적(耕種的) 수단으로서 약독(弱毒) 바이러스나 저항성 품종의 이용을 들 수 있다.

약독 바이러스에 의한 방제법은 병징(病徵)이 약한 바이러스를 미리 식물에 접종하여 두면 후에 강한 병징을 가진 강독주(强毒株)에 감염되더라도 그 증식이 억제되어 발병하지 않게 되는 것을 이용한 것인데, 담배 모자이크 바이러스(TMV) 등 일부의 바이러스에 대하여 실용화 되어 있다[Ann. Rev. Phytopathol. 14, (1976); Phytopathol. 57, 1347(1976); Plant Disease Report 64, 538(1980)]. 이러한 현상은 오래전 부터 알려져 있어 간섭효과(cross protection)라 불리어지고 있다.

한편, 교잡육종에 의한 바이러스 저항성 품종도 벼, 콩, 오이, 무우, 담배, 토마토 등에서 만들어져서, 예컨대 벼 고엽고 바이러스 저항성 유전자를 벼의 재배종에 도입하는 방법(中國農試報:A16, 39) 등이 알려져 있다.

근년, 바이러스의 외피 단백질을 코우드하는 유전자를 식물에 도입하여 이것을 식물체내에서 발현시켜 바이러스 저항성 식물을 만들 수 있다는 것이 보고되어 있다[Ann. Rev. Phytopathol. 28, 451(1990)]. 또한 오이 모자이크 바이러스의 부수체(satelite) RNA를 식물에 도입함으로써 바이러스 저항성 식물을 얻었다는 보고 [Nature 328, 799(1985)] 및 안티센스 RNA를 이용한 바이러스 방제법[Proc. Nat1. Acad. Sci. USA 86, 6949(1989)]이 보고 되어 있다.

벼에 있어서는 본 발명자등이 벼 고엽고 바이러스의 게놈(genome) RNA3에 코우드되는 벼 고엽고 바이러스의 외피 단백질의 유전자를 벼에 도입하여 벼 고엽고 바이러스 내성벼를 만드는데 성공하였다[일본국 平成 3月日本植物病理學會大會講演要旨集 p. 193; Proc. Nat1. Acad. Sci. USA 89, (1992)].

최근 담배 모자이크 바이러스의 비구조 단백질(54kD 단백질)을 코우드하는 유전자를 담배에 도입하여 강력한 담배 모자이크 바이러스 저항성 식물을 만들었다. 그 저항성 기구에 대해서는 불명한 점이 많고, 또한 기타 바이러스에 대해서는 이와 같은 비구조 단백질을 이용한 바이러스 저항성 식물의 제조는 보고되어 있지 않다. 이제까지 그 효과가 알려져 있지 않는 비구조 단백질을 벼에서 발현시켜 벼에 바이러스 저항성을 부여하는 것이 본 발명이 해결해야 할 문제이다.

벼 고엽고 바이러스는 분절(分節) 입자 구조를 가지며 식물의 테누이바이러스 그룹에 속해 있다. 바이러스의 입자내에는 4종류의 2중 가닥 RNA(double-stranded RNA)와 4종류의 단일 가닥 RNA(각각 2중 가닥 또는 단일 가닥 RNA1, RNA2, RNA3, RNA4라 칭한다)가 포함된다. 2중 가닥 RNA1~4는 각각의 단일 가닥 RNA1~4가 복제한 것에 대응한다[J. Gen. Virol. 70, 505(1989)]. 바이러스 입자에는 단일의 외피 단백질과 RNA 폴리머라아제가 관찰된다. 한편, 벼 고엽고 바이러스 감염벼에는 외피 단백질이나 RNA 폴리머라아제 이외에 바이러스 게놈 유래의 감염 특이 단백질이 검출된다. [Microbiological Sciences 3, 347(1986)]. 감염 특이 단백질의 분자량은 바이러스의 분리주(分離株)에 따라 다르고 [Proc. Assoc. P1. Pro. Kyushu 56, 423(1990)], 이 단백질이 생리적 역할등에 대해서는 아직 밝혀져 있지 않다.

벼 고엽고 바이러스 감염 특이 단백질을 RNA4에, 외피 단백질은 RNA3에 코우드 되어 있다는 것이 보고되었다. [Virology. 177, 371(1990)].

본 발명자등은 벼 고엽고 바이러스 감염 특이 단백질 유전자를 가진 cDNA가 결합된 벡터 DNA로 벼를 형질전환시켜 이 유전자를 발현시킴으로써 벼 고엽고 바이러스에 저항성을 가진 벼를 만들 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명의 요지는 벼과(科) 식물에서 기능하는 프로모우터(promoter)의 하류쪽에 벼 고엽고 바이러스 감염 특이 단백질을 코우드하는 유전자 및 터미네이터(terminator)를 도입하여 됨을 특징으로 하는 벡터, 이 벡터로 형질전환시킨 벼과 식물 및 그 제조 방법에 있다.

본 발명은 아래에 나오는 바와 같이 하여 달성할 수가 있으나 그 요지는 벗어나지 않는 한 이하의 내용에 한정되지 않는다.

그리고 이하에 나온 것은 본 발명의 한가지 예로서 벼에 대하여 설명한 것이고, 본 발명의 벼과 식물로서는 벼이외에 호밀, 보리, 밀, 메귀리, 오우트밀, 강아지풀, 조피, 잔디, 바랭이, 참억새, 카리야스, 사탕수수, 옥수수, 율무 등을 들 수 있다.

[바이러스 및 바이러스 RNA의 추출, 정제]

예를 들자면 벼 고엽고 바이러스 분리주[J. Gen. Virol., 70, 505-511(1989)]에 감염된 벼잎을 인산 완충액(10mM 디에틸디티오카르바메이트, 0.1M 인산 수소 2 나트륨, pH 7.2) 중에서 분쇄한 후, 1/5량의 트리플루오로 트리클로로에탄을 가하여 청징화(淸澄化)한 다음 20% 수크로오스 쿠션에 중층(重層)하여 123,000×g에서 1.5시간 원심분리한다.

수득한 침전을 10mM 인산 완충액(pH 7.5)에 용해하고 4,000×g에서 10분간 원심 분리한다. 이어서 상청액에 35% 포화되도록 황산 암모늄을 가하고 5분간 교반한 후 4,000×g에서 5분간 원심 분리한다.

상청액을 약 4배로 희석한 후 최종 농도가 8% 되도록 폴리에틸렌 글리콜을 가하고 1시간 이상 교반한다. 이것을 30,000×g에서 30분간 원심 분리한 후 침전을 수크로오스 밀도 기울기 원심 분리(10~40%, 100,000×g, 2.5시간)함으로써 바이러스 입자를 정제할 수 있다. 이 방법에 의하여 바이러스 입자는 B, M, nB(상층으로부터 하층으로)의 3성분으로 분리하여 얻게 된다. 본 발명에서 사용한 RNA4는 전(全)성분에 함유된다.

정제한 바이러스로부터 전(全) 바이러스 RNA의 추출은, 예컨대 SDS-페놀법을 사용하여 추출한다. 즉 정제 바이러스의 현탁액에 SDS(2%)와 벤토나이트(12.5mg/ml), EDTA(2.5mM)을 가하고, 다시 페놀을 등량 가하여 단백질을 제거하고, 그 후 통상의 방법에 따라 에탄올 침전을 반복하여 RNA를 분리 정제할 수가 있다.

RNA1-4의 혼합액은 수크로오스 밀도 기울기 원심분리에서 얻은 nB 획분으로부터 추출할 수가 있다. B획분과 M획분으로 부터는 RNA2-4의 혼합액을 추출할 수 있다.

[정제된 RNA로부터 cDNA의 합성]

cDNA는 B획분 또는 M획분으로 부터 얻은 RNA2-4의 혼합액을 사용하여 합성한다. 우선 RNA4의 3’ 말단의 염기 배열 [J. gen. virol. 71, 2817(1990)]으로 부터 RNA4에 특이적인 배열을 가진 프라이머(primer)(5’GGGCATATCTTTTGAGATTA 3’; 배열포, 배열번호 3)를 합서한다.

이 프라이머를 사용하여 전(全) RNA를 주형(鑄型)으로 하여 Gubler-Hoffman의 방법 [Gene 25, 234(1983)]에 따라 cDNA를 합성한다. 수득한 cDNA는 단일 가닥이기 때문에 이것을 주형으로 하여 다시 2중 가닥 cDNA를 합성한다.

[cDNA의 클로닝과 시퀀스]

이어서 다음에 나오는 실시예에 나와 있는 방법으로 선택한 RNA4 유래의 클론(clone)을 예컨대 키로시퀀스용 딜리션 키트(일본국 寶酒造製)를 사용하여 클론의 결손 변이주를 제조한다. 100~200 염기 정도의 비율로 결손을 가진 변이주를 선발하여 Sanger 등의 디데옥시법 [Proc. Nat1. Acad. Sci. USA 74, 5463(1977)]으로 각 변이주의 염기 배열을 결정한다. 이어서 수득한 염기 배열로 부터 예컨대 프라이머(5’ CAACTTTCAACATACTTGTT 3’; 배열표, 배열 번호:4)를 합성하고, RNA4 체인(chain) 전체 길이를 커버하는 cDNA를 제조하여 위에 나온 것과 동일한 방법으로 클로닝 하여 염기 배열을 결정한다. 이렇게 함으로써 RNA4의 전(全) 염기배열을 결정할 수 있다.

[형질전환 식물 제조]

벼 고엽고 바이러스 감염 특이 단백질은 RNA4(2157 염기)의 55 염기째부터 591 염기째까지에 코우드 되어 있다(배열표의 배열번호 2). 수득한 RNA4의 cDNA를 기초로 하여 예컨대 리버어스 프라이머(일본국 寶酒造製)와 합성 프라이머(5’TAATGCTAGCACTCGTGG 3’; 배열표, 배열번호:5)를 사용하여 Saiki 등의 PCR법 [Nature 324, 126(1986)]으로 벡터 pUC19 [Gene 33, 103(1985)]의 클로닝 사이트도 포함해서 1-663염기를 증폭시켜 예컨대 pUC19의 SmaI 부위에 삽입하였다. 이 유전자를 예컨대 제한 효소 SalI와 EcoRI으로 잘라내어 벼과 식물중에서 발현하는 프로모우터와 터미네이터, 혹은 필요에 따라서는 인트론을 가진 플라스미드 벡터에 짜넣는다.

이용되는 프로모우터로서는 예컨대 CaMV35S(pBI221:EMBO. J., 6, 3901~3907, (1987) 등의 꽃양배추 모자이크 바이러스유래의 프로모우터, rbcS(ribulose 1.5-bisphosphate carboxylase), Cab(chlorophyll a/b binding protein) 등(Science, 244, 174, 1989) 식물 중에서 발현하는 것이 확인된 프로모우터를 들 수 있다.

터미네이터로서는 예컨대 꽃양배추 모자이크 바이러스 유래의 터미네이터, NOS(노팔린 합성 효소) 유전자 유래의 터미네이터 등을 들 수 있다.

또한 프로모우터와 구조 유전자의 사이에 인트론을 분배하는 벡터도 고발현 벡터로서 이용할 수 있고, 인트론으로서는 예컨대 옥수수 Adhl(알코올 디히드로게나아제)의 제1인트론(Genes & Development, 1, 1183-1200, 1987), 피마자 Cat(카달라아제)의 제1인트론(Tanaka 등, Nucleic Acids Research, 18, 6767-6770, 1990) 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서는 더욱이 하이그로마이신 포스포트란스퍼라아제 유전자, 네오마이신 포스포트란스퍼라아제 유전자, 클로람페니콜 아세틸 트란스퍼라아제 유전자, β-글루쿠로니다아제 유전자 등으로 부터 선택되는 두가지 이상의 외래 유전자를 사용하고, 또한 그 중 한가지는 목적으로 하는 콜로니를 선택할때 유효한 소위 선택 마아커(selective marker) 유전자를 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 선택 마아커 유전자로서는 하이그로마이신 포스포트란스퍼라아제 유전자가 바람직하다.

본 발명에서는 선택 마아커 유전자와 기타 외래 유전자를 동일한 플라스미드 중에 가진 것을 사용하여도 좋고, 선택 마아커 유전자를 가진 플라스미드와 기타 외래 유전자를 가진 플라스미드를 병용하여도 좋다.

벡터는 벼과 식물을 형질 전환하는데 사용된다. 즉, 벼과 식물 유래의 프로토플라스트(Protoplast)를 액체매체에 현탁시키고 전기 펄스를 인가하여 이 벡터를 도입한 후 벼 배양세포를 함유하는 배지에서 배양하여 콜로니를 형성시키고, 이콜로니로 부터 식물체를 재생시키는 방법이다 [Shimamoto et al., Nature, 337, 274-276, 1989). 프로토플라스트는 다음과 같이 제조할 수 있다.

예컨대 닛뽕바레, 코시히카리, 사시니시키등의 재배벼의 완숙 및 미숙 종자, 어린 잎, 뿌리의 조직에서 유래하는 서스펜션 세포 또는 캘러스(callus)를 R2 배지등의 통상 사용되는 액체 배지에서 배양한 후 통상의 방법에 따라 예컨대 셀룰라아제나 마세로자임등의 세포벽 분해 효소를 포함하는 효소액중에서 25~30℃, 0~50spm의 조건하에 3~16시간 정도 효소처리한다.

효소처리 종료후 여과하여 소화되지 아니한 물질을 제거하고 여액에 2-5배량의 KMC액(0.118M 염화 칼륨, 0.081M 염화 마그네슘, 0.085M 염화 칼슘, pH 6.0)(Theor. Appl. Genet., 53, 57~63, 1978) 등을 가하여 원심 분리해서 정제된 프로토플라스트를 얻을 수 있다.

위와 같이 하여 조정한 유전자를 함유한 발현 벡터, 예를 들자면 1~100㎍/ml와, 상기 식물 유래의 프로토플라스트, 예를 들자면 (2~10)×10⁶개/ml를 30~200mM 염화 칼륨, 0~50mM 염화 마그네슘, 0.2~0.6M 만니톨을 함유한 완충액 등의 액체 매체중에 현탁시키고 여기에 전기 펄스를 인가하여 플라스미드를 프로토플라스트 중에 도입한다. 전기 펄스 처리는 100~1000㎌의 콘덴서를 사용하여 얻어지는 200~1000V/cm의 초기 전압의 직류 펄스로 펄스폭 1~50msec 정도의 조건으로 인가하는 것이 바람직하다(일본국 특허 공개 평 1-18179호 공보 참조).

위와 같이 전기 펄스 처리한 프로토플라스트를, 예컨대 R2 배지(Plant. Cell. Physiol., 14, 1113, 1973)의 무기 성분과 MS 배지(Murashige and Skook, 15, 473~497, 1962)의 비타민 혼합액을 함유한 액체 배지(R2/MS) 혹은 MS 배지에서, 바람직하게는 질소원으로서 질산 칼륨을 0.2~0.5% 함유하는 배지에 현탁하고, 이것을 1.0~3.0% 정도의 아가로오스를 함유하는 R2/MS 또는 MS 배지등과 등량씩 혼합하여 신속히 접시중에 넓게, 그리고 얇게 고화시킨다. 이때의 프로토플라스트의 농도는 약(5~50)×10⁵개/ml가 되도록 하는 것이 바람직하다.

고화한 아가로오스를 5~20mm 크기로 절단하여 상기 액체배지에서 배양한다. 이때 벼과 식물 유래의 프로토플라스트를 사용했을 경우에는 바람직하게는 배지중에 벼 배양 세포를 접시 하나당 100~300mg FW 정도 공존시켜 20~50rpm의 회전으로 서서히 진탕하면서 어두운 조건하에서 23~27℃에서 배양한다. 벼 배양 세포와 공존시키는 방법은 상기의 방법외에 프로토플라스트를 함유하는 액체 배지를 밑바닥에 멤브레인 필터를 설치한 용기내에 넣고 이 용기를 벼 배양 세포와 함께 액체 배지를 넣은 접시에 침지하여 공존시키는 방법이 있다.

여기에 나와 있는 벼 배양 세포는 왕성하게 분열하고 있는 미세한 세포괴(塊)로 된 것이 바람직하다. 이와 같은 배양 세포는 예컨대 벼 식물의 종자, 뿌리, 줄기 또는 꽃밥으로 부터 얻은 캘러스를 액체 배지중에서 계대(繼代)하여 분열 속도가 빠른 세포를 선발하여 가는 등의 공지방법에 따라 용이하게 얻을 수 있다.

배양후 2~4주간내에 0.5~1mm 정도의 콜로니가 형성된다. 이때, 예를 들자면 외래 유전자로서 선택 표지 유전자에도 있는 하이그로마이신 포스포트란스퍼라아제 유전자(hph)를 도입하여 두었을 경우에는 배양 개시후 7~20일에 하이그로마이신을 10~100㎍/ml 정도 배양액중에 첨가하여 다시 배양을 계속하면 목적으로 하는 형질 전환세포의 선택을 좋은 효율로 할 수 있다. 이어서 이 콜로니를 증식배지, 예컨대 R2 배지에 식물 호르몬, 예를들자면, 2, 4-디클로로페녹시 아세트산(2, 4-D)를 2mg/ℓ정도, 아가로오스를 0.1~1.0% 가한 한천 배지상에서 2~4주간, 조명하(1000~4000 lux), 23~27℃에서 배양하여 3~6mmø의 캘러스를 얻는다. 개개의 캘러스를 단독으로 분리하여, 다시 예컨대 외래 유전자로서 hph 유전자를 도입했을 경우에는 하이그로마이신 20~50㎍/ml을 함유한 이 증식배지에 가하고 하이그로마이신 내성(耐性)을 확인한다.

이 캘러스를 예컨대 0.5~1.5% 아가로오스를 함유한 R2/MS 배지(0.1~1% 인돌 아세트산, 0.5~2% 제아틴)에서 23~27℃, 2000~4000 lux의 조건하에서 배양하면 2~10주간 사이에 부정배(不定胚) 또는 부정아(不定芽)의 형성이 관찰된다. 다시 2~3주간 호르몬을 함유하지 않은 R2/MS 배지 등에서 배양함으로써 이식 가능한 어린 식물체를 얻게 된다. 이와 같이 하여 얻은 어린 식물체는 버어미큘라이트등에 이식하여 성장시키면 목적으로 하는 형질전환된 벼 식물체를 얻을 수가 있다.

[고엽고 바이러스 감염 저항성의 확인]

재생한 벼잎으로 부터 단백질을 추출하고 웨스턴 해석에 의하여 벼 고엽고 바이러스 감염 특이 단백질을 발현한 형질전환 벼를 확인한다. 이 형질전환 벼와 대조로서 사용한 벼 고엽고 바이러스 감염 특이 단백질을 발현하지 않은 벼, 정상의 벼와 더불어 일정수의 바이러스 보독충(保毒)(갈색 메뚜기)을 넣은 사육상자에 넣고 감염시킨다.

3~5일 경과후 충()을 제거하고 잔존한 충을 살충제로 죽인 다음 격리 온실에서 발병할때까지 관찰한다. 그 후 형질전환체와 대조군이 바이러스병의 감염율로부터 저항성을 측정하였다.

[실시예]

이하 실시예를 들어 본 발명을 설명하지만 본 발명은 그 요지를 벗어나지 않는 한 아래의 실시예에 제약되는 것은 아니다.

[실시예 1]

[바이러스 입자와 바이러스 RNA의 정제]

벼 고엽고 바이러스 [J. gen. Virol. 70, 505(1989)]를 보유하는 갈색 메뚜기를 밀에 접종하고 1주간 정도 바이러스를 증식시킨 후 동결(凍結)하였다. 동결된 감염잎을 인산 완충액(10mM 디에틸디티오카르바메이트, 0.1 인산 수소 2 나트륨, pH 7.2) 중에서 분쇄한 후 1/5량의 트리플루오로트리클로로에탄을 가하여 청칭화한 다음 20% 수크로오스 큐션에 중층하여 123,000×g에서 1.5시간 원심분리한다.

침전을 10mM 인산 완충액(pH 7.5)에 용해하고 4,000×g에서 10분간 원심분리한다. 이어서 상청액에 35% 포화가 되도록 황산 암모늄을 가하고 5분간 교반한 후 4,000×g에서 5분간 원심 분리한다. 상청액을 약 4배로 희석한 후 최종 농도가 8% 되도록 폴리에틸렌 글리콜을 가하고 1시간 이상 교반한다. 이것을 30,000×g에서 30분간 원심 분리한 후 침전을 수크로오스 밀도 기울기 원심분리(10~40%, 100,000×g, 2.5 시간)하였다. 바이러스 입자는 B, M, nB(상층으로 부터 하층으로)의 3성분으로 분리하여 얻는다. 바이러스를 함유하는 각 층을 123,000×g에서 3시간 원심 분리함으로서 바이러스 입자를 정제하였다. 본 발명에 사용한 RNA4는 전(全) 성분에 함유된다.

정제한 바이러스로부터 전(全) 바이러스 RNA를 SDS-페놀법을 사용하여 추출하였다. 즉 정제 바이러스의 현탁액에 SDS(2%)와 벤토나이트(12.5mg/ml)와 EDTA(2.5mM)를 가하고, 다시 페놀을 등량 가하여 단백질을 제거한 다음, 통상의 방법에 따라 에탄올 침전을 반복하여 RNA를 분리 정제하였다. 이 방법에 의하여 수크로오스 밀도 기울기 원심분리로 수득한 B획분과 M획분으로 부터는 RNA2-4의 혼합액을 추출할 수 있었다.

[실시예 2]

[cDNA의 합성과 클로닝]

cDNA는 RNA2-4의 혼합액을 사용하여 합성하였다. 먼저 RNA4의 3’말단의 염기 배열을 직접 시퀀스에 의하여 결정하고 [J. gen. Virol. 71, 287 (1990)], 이것으로 부터 프라이머(5’GGGCATATCTTTTGAGATTA 3’:배열표, 배열번호:3)을 합성하였다. RNA2-4를 주형(鑄型)으로 하여 역전사 효소를 사용해서 Gubler-Hoffman의 방법(앞서 나왔음)에 따라 cDNA를 합성하였다.

수득한 cDNA는 단일 가닥이기 때문에 이것을 주형으로 하여 다시 2중 가닥 cDNA를 합성하였다. 이것을 플라스미드 pUC19 [Gene 33, 103-119, (1985)]의 SmaI 사이트(site)에 연결된 대장균 DH5α로써 형질전환하여 클로닝하였다.

수득한 클론이 3개이 RNA중 어느 것에 대응하는 것인지를 조사하기 위하여 각 클론의 양말단으로 부터 200 염기 정도를 시퀀스하여 염기배열을 결정하였다. 이들과 이미 나온바 있는 RNA의 3’말단의 염기 배열 [J. gen. Virol. 71, 2817(1990)]을 비교하여 RNA4의 3’말단 약 50염기와의 상동성으로 부터 RNA4 유래의 클론이라 판단하고, 이 클론을 선택하였다.

Sanger 등 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463(1977)]의 방법으로 이 클론의 염기 배열을 결정한 후 5’말단에 가까운 적당한 배열을 가진 영역에 대하여 프라이머(5’CAACTTTCAACATACTTGTT 3’:배열표, 배열 번호:4)를 합성하고 프라이머 신장법으로 RNA4 전역에 걸친 cDNA를 합성하였다.

[실시예 3]

[cDNA의 시퀀스와 벼 고엽고 바이러스 감염 특이 단백질 유전자의 결정]

위에서 선택한 RNA4 유래의 클론을 일본국 寶酒造製 키로시퀀스용 딜리션 키트를 사용하여 클론의 결손(欠損) 변이주를 만들었다. 100~200 염기 정도의 비율로 결손을 가진 변이주를 선발하고 Sanger 등의 방법(디데옥시법:앞서 나왔음)으로 각 변이주의 염기 배열을 결정하였다.

RNA4는 2157염기로 되어 있고 바이러스 RNA의 5’말단에 178 아미노산(배열표의 배열번호 1), 분자량 20,541의 단백질을 코우드하는 영역을 가지며, 바이러스 RNA에 상보적(相補的)인 RNA의 5’말단에 286 아미노산, 분자량 32,474의 단백질을 코우드하는 영역이 있는 안티센스 RNA인 것임을 알았다. [J. gen. Virol., 73 1309-1312(1992)]. 이어서 컴퓨터 해석(GENETYX, Software Development Co.]에 의하여 RNA4에 코우드 되어 있는 단백질의 추정 아미노산 배열을 구하였다. 한편, 감염 벼로 부터 정제한 벼 고엽고 바이러스 감염 특이 단백질의 아미노산 조성을 PICO·TAG법(Waters)으로 분석하였다.

나타난 결과를 벼 고엽고 바이러스 RNA4에 코우드되어 있는 벼 고엽고 바이러스 감염 특이 단백질의 코우딩 영역이라 생각되는 것으로 부터 추정한 아미노산 조성과 비교한 결과 98%의 상동성이 확인되었다. 따라서 분자량 약 20,000의 단백질은 벼 고엽고 바이러스 감염 특이 단백이고, 이 영역이 벼 고엽고 바이러스 감염 특이 단백을 코우드하는 유전자인 것으로 결정하였다. 그 염기 배열은 배열표의 배열 번호 2에 나와 있다. 그리고 본 발명에서는 벼에 바이러스 저항성을 부여할 수 있는 범위에서 일부 아미노산 또는 염기를 제거, 치환 또는 추가하는 등의 개변(改變)을 하였다 하더라도 본 발명에 포함된다.

[실시예 4]

[형질 전환용 플라스미드 구축]

형질 전환용 벡터로서 pIG221 [Plant Cell Physiol. 31, 805(1990)]의 β-글루쿠로니다아제의 코우딩 영역을 하이그로마이신 포스포트란스퍼라아제와 교환하여 인트론 상류의 ATG를 결실(欠失)시킨 벼 고발현 하이그로마이신 내성 벡터(pIZI)를 이용하였다. 이 pIZI 벡터에는 꽃양배추 모자이크 바이러스의 35S 프로모우터와 피마자의 카탈라아제 유래의 인트론, 아그로박테리움의 노팔린 신타아제 유전자 유래의 터미네이터를 가지고 있다.

실시예 2와 실시예 3에서 선택한 RNA4 유래의 cDNA로 부터 벼 고엽고 바이러스 감염 특이 단백질의 유전자(1-632)를 함유하도록 리버어스 프라이머(일본국 寶酒造製)와 프라이머(5’TAATGCTAGCACTCGTGG 3’; 배열표, 배열번호:5)를 사용하여 PCR법으로 증폭시켜 T4 폴리머라아제(일본국 寶酒造製)로 처리해서 평활 말단으로 한후 pUC19(앞서 나왔음)의 SmaI 사이트에 삽입하였다. 이 클론을 제한 효소 EcoRI으로 절단한 후 T4폴리머라아제 처리로 평활말단으로 하고, 다시 제한 효소 SalI로 절단하여 벼 고엽고 바이러스 감염 특이 단백질을 코우드하는 유전자를 가진 단편을 회수하였다.

pIZI 벡터를 EcoRI과 SalI로 절단하고, 하이그로마이신 내성 유전자(hph)를 제거하였다. 이때 EcoRI 부위는 T4 폴리머라아제에 의하여 평활말단으로 하였다. 이렇게 하여 얻은 꽃양배추 모자이크 바이러스의 35S 프로모우터와 피마자 카탈라아제의 인트론, 노팔린 신타아제의 터미네이트를 가진 벡터와 벼 고엽고 바이러스 감염 특이 단백질을 코우드하고 있는 유전자를 DNA 라이게이션 키트(일본국 寶酒造製)를 사용하여 환상화(環狀化)하였다. 대장균 DH5α를 사용하여 형질전환하여 암피실린으로 선발함으로써 형질전환용 플라스미드 pLAN160을 얻었다.

[실시예 5]

[일렉트로포레이션에 의한 벼 프로토플라스트의 형질 전환]

(1) 벼 프로토플라스트의 분리

본 발명에 사용한 벼과 식물 유래의 프로토플라스트(protoplast)는 재배 벼니뽕바레의 완숙 종자에서 유래하는 것으로서 아래와 같이 하여 얻었다.

완숙 종자의 서스펜젼 세포를 R2 배지에서 배양한 후 4% 셀룰라아제 RS, 1% 마세로자임 R10, 0.4M 만니톨을 함유하는 효소액 (pH 5.6)으로 3-4시간 동안 30℃에서 처리하였다. 효소 처리액을 여과한 후 영액에 4배량의 KMC액(KCl 0.118M, CaCl₂0.085M, MgCl₂0.081 M, pH 6.0:앞서 나왔음)을 가하고 원심 분리하여 침강된 프로토플라스트를 수거하여 다시 KMC액으로 2회 세척하였다.

(2) 전기 펄스 처리

위의 (1)에서 조정한 프로토플라스트를 EP3 완충액 [70 mM KCl, 5mM MgCl₂, 0.4M 만니톨, 0.1% MES를 함유한 완충액(pH 5.8)]에 4×10⁶개/ml가 되도록 현탁하였다.

이 현탁액에 위의 실시예 4에서 얻는 플라스미드 pLAN160(60g/ml)와 선발 마아커로서 하이그로마이신 포스포트란스퍼라아제 유전자를 가진 플라스미드 pIZI(60㎍/ml)을 첨가하고, 4℃에서 5분간 냉각한 후 멸균한 플라스틱 셀에 옮겨 평행전극을 사용하여 직류 전기 펄스를 인가하였다. 이때 800㎌의 콘덴서를 사용하여 300V/cm의 초기 전압을 가하고 펄스폭은 10msec로 하였다. 펄스 인가후 4℃에서 10분간 냉각한 후 등량의 R2/MS 프로토플라스트 아가로오스 배지 [Mol. Gen. Genet., 206, 408(1987)]와 혼합하여 0.7mm 두께가 되도록 고화시켰다. 이때의 세포 밀도는 약 3×10⁶개/ml이었다.

(3) 프로토플라스트 배양

위의 (2)의 전기 펄스 처리를 한 프로토플라스트를 함유한 아가로오스를 1cm각 정도의 크기로 잘라 R2/MS 액체 프로토플라스트 배지 5ml가 들어간 6cmø의 플레이트에 넣고 다시 약 100mg(신선중량)의 벼 세포를 영양 세포(nurse cell)로 하여 가하였다.

벼의 배양 세포는 아래와 같이 제조하였다. 즉 완숙배(完熟胚)로부터 유래하는 캘러스를 액체 배지중에서 주1회 계속 배양하여 제조한 현탁 배양액 중에 존재하는 분열이 왕성한 미세한(1mmø 이하) 세포괴(塊)를 사용하여 영양 세포로 하였다.

프로토플라스트 배양은 약 25℃에서 10일간, 어두운 곳에서 진탕(50rpm)하면서 배양하였다. 배양후 영양 세포를 세척하여 제거하였다. 다시 배양한지 3~4일 후에 30㎍/ml가 되도록 하이그로마이신 B를 배지에 가하여 2~3주간 배양하였다. 그후 아가로오스 편(片)을 N6 소프트 아가로오스(2mg/ℓ 2,4-D, 0.5mg/ℓ 벤질아미노푸린, 6% 수크로오스, 0.25% 아가로오스, pH 5.6)에 넣고 커진 콜로니를 취하여 R2 증식배지(2mg/ℓ 2, 4-D, 6% 수크로오스, 0.5% 아가로오스, pH 5.6)에다 옮겨 2~3주간 증식시켰다. 내성 캘러스의 출현 빈도는 생성한 콜로니에 대하여 약 0.5%이었다.

(4) 식물체의 재생

위의 (3)에서 얻는 캘러스를 R2/MS 재생배지(1gm/ℓ 제아틴, 0.5mg/ℓ 인돌 아세트산, 3% 소르비톨 2% 수크로오스, 1% 아가로오스, pH 5.8)에 넣고 어두운 곳에서 3~10주간 배양하면 싹과 뿌리가 나타났다. 싹이 2cm정도를 성장하였을 때 마찬가지의 배지를 함유한 마젠타 박스에 옮겨 어린 식물이 되도록 성장시켰다. 다시 버미큘라이트 포트에 옮기고 생육시켜 형질전환체 벼를 얻었다.

(5) 형질 전환 식물의 해석

먼저 (3)에서 얻은 캘러스로부터 Richards의 방법 [Current Protocol in Molecular Biology 2.3.1(1987)]에 따라 DNA를 추출하여 35S 프로모우터의 상류쪽의 염기 배열로 부터 합성한 프라이머(5’CTCAGAAGACCAAAGGG 3’; 배열표, 배열 번호:6)와 벼 고엽고 바이러스 감염 특이 단백질 유전자의 하류쪽 염기 배열로 부터 합성한 프라이머(5’TAATGCTAGCACTCGTGG 3’; 배열표, 배열 번호:5)를 사용하여 PCR을 하였다. 외래 유전자의 단편이 PCR에 의하여 증폭된 것을 형질전환체 캘러스로 하여 N6 재생 배지(1mg/ℓ 제아틴, 0.5mg/ℓ 인돌 아세트산, 3% 소르비톨, 2% 수크로오스, pH 5.8)에 옮겼다. 이 단계에서는 외래 유전자가 도입된 캘러스의 비율은 하이그로마이신 내성 캘러스의 약 90%이었다.

이어서 PCR 포지티브인 캘러스로 부터 재생시킨 형질전환체로 부터 어린 잎의 일부를 채취하여 1% SDS, 1mM 요오드 아세트산을 함유하는 Tris 완충액중에서 마쇄하고 5분간 100℃에서 열처리하였다. 15,000×g에서 10분간 원심 분리함으로써 청징화하고 상청액을 1% SDS를 함유한 10% 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 전기 영동을 하였다.

전기적을 나일론막(Immonilon, 밀리포아제)에 단백질을 옮긴 후 항벼고엽고 바이러스 감염 특이 단백질 항체와 알칼리 포스파타아제 결합 2차 항체를 사용하여 웨스턴 해석을 하여 벼 고엽고 바이러스 감염 특이 단백질을 발현하는 형질 전환체를 확인하였다. 재생한 7 클론 중에서 4 클론에서 벼 고엽고 바이러스 감염 특이 단백질의 발현을 확인하였다.

그리고 Chomczynski와 Sacchi의 방법 [Annal. Biochem. 162, 156(1987)] 으로 형질 전환체의 잎으로 부터 RNA를 추출하였다.

Amersham사의 프로토콜에 따라 2.2M의 포름알데히드를 함유하는 1% 아가로오스를 사용하여 10㎍의 RNA를 전기 영동하였다.

진공 블로팅(blotting) 장치를 사용하여 나일론막(하이본드 N,. Amersham 사제)에다 옮기고 벼 고엽고 바이러스 감염 특이 단백질 유전자의 코우딩 영역을 프로우브(probe)로 하여 노오던 해석을 하여 mRNA가 발현해 있음을 확인하였다. 이 때, 프로우브는 멀티프라임 라벨링 키트(Amersham 사제)를 사용하여³²P-dCTP로 라벨하였다.

[실시예 6]

[형질 전환체의 고엽고 바이러스 감염 저항성의 확인]

위의 실시예 5에 나온 노오던 해석 및 웨스턴 해석에 의하여 벼 고엽고 바이러스 감염 특이 단백질을 발현하고 있는 것이 확인된 형질 전환 벼, 4클론(22개체)에 대하여 벼 고엽고 바이러스의 보독충(갈색 메뚜기)을 사용한 감염 실험을 하였다. 대조군으로서 벼 고엽고 바이러스 감염 특이 단백질을 발현하고 있지 않은 형질전환 벼와 비(非) 형진전환 벼를 사용하였다.

이 공시 개체를 메뚜기의 사육상자에 넣고, 상자속에 벼 1개체에 대하여 10마리가 되도록 벼 고엽고 바이러스를 보독(保毒)하고 있는 갈색 메뚜기를 넣어 감염시켰다. 3~5일 경과후 벼에 붙어 있는 충을 제거하고 다시 벼에 잔존해 있는 충을 살충제로 살충한 다음 격리온실에 옮겨 발병할때까지 관찰하였다. 형질 전환체와 대조군으로 사용한 두 종류의 벼의 벼 고엽고 바이러스병 발병율을 비교하였다.

벼 고엽고 바이러스 감염 특이 단백질을 발현한 벼의 형질 전환체의 벼 고엽고 바이러스병 발병율은 9%이었고 대조군으로 사용한 두 종류의 벼의 벼 고엽고 바이러스병의 발병율은 모두 83%이었다. 이 결과로부터 벼 고엽고 바이러스 감염 특이 단백질을 발현한 형질 전환벼가 벼 고엽고 바이러스에 대하여 저항성이 있음을 확인하였다.

[실시예 7]

[벼 고엽고 바이러스 감염 특이 단백질의 차세대에의 유전의 확인]

실시예 6에 나온바 있는 벼 고엽고 바이러스에 대하여 저항성을 나타낸 벼 고엽고 바이러스 감염 특이 단백질을 발현하고 있는 형질 전환체의 종자를 채종(採種)하여 발아시켰다.

실시예 5에 나온 것과 동일한 방법을 사용하여 웨스턴 해석을 하여 형질 전환에 사용한 유전자가 차세대에 유전되어 발현하고 있는가를 조사하였다. 두 계통의 형질 전환체에 대하여 검토한 결과 벼 고엽고 바이러스 감염 특이 단백질을 발혀하고 있는 비율은 22/25(88%), 23/27(85%)으로서 이 유전자는 차세대에 유전하는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명에 의하면 바이러스 외피 단백질 이외의 비구조 단백질인 벼 고엽고 바이러스의 감염 특이 단백질의 유전자를 벼에 도입하여 벼속에서 벼 고엽고 바이러스 감염 특이 단백질 혹은 이 유전자의 MRNA를 발현시켜 고엽고 바이러스 감염 저항성 벼를 만들 수가 있다.

[배열표]

배열 번호:1

배열의 길이:178

배열의 형:아미노산

토폴로지:직쇄상

배열의 종류:단백질

기원:벼 고엽고 바이러스

배열

배열 번호:2

배열의 길이:537

배열의 형:핵산

쇄의 수:단일 가닥

토폴로지:직쇄상

배열의 종류:기타 핵산

기원:벼 고엽고 바이러스

배열

배열 번호:3

배열의 길이:20

배열의 형:핵산

쇄의 수:단일 가닥

토폴로지:직쇄상

배열의 종류:기타 핵산

배열

배열 번호:4

배열의 길이:20

배열의 형:핵산

쇄의 수:단일 가닥

토폴로지:직쇄상

배열의 종류:기타 핵산

배열

배열 번호:5

배열의 길이:18

배열의 형:핵산

쇄의 수:단일 가닥

토폴로지:직쇄상

배열의 종류:기타 핵산

배열

배열 번호:6

배열의 길이:537

배열의 형:핵산

쇄의 수:단일 가닥

토폴로지:직쇄상

배열의 종류:기타 핵산

배열

Claims

벼과 식물에서 기능하는 프로모우터의 하류에 벼 고엽고 바이러스 감염 특이 단백질을 코우드하는 유전자 및 터미네이트를 도입하여된 벡터와 벼과 식물 유래의 프로플라스트를 액체 매체중에 현탁시켜 전기 펄스를 인가하여 이 벡터를 도입한 후, 벼 배양 세포를 함유하는 배지에서 배양하여 콜로니를 형성시키고, 이 콜로니로부터 식물체를 재생시킴을 특징으로 하는 벼 고엽고 바이러스 저항성의 벼과 식물의 제조방법으로서, 이 유전자가 배열표의 배열 번호 1에 기재된 아미노산 배열로 나타내어지는 단백질을 코우드하는 것인 벼고엽고 바이러스 저항성의 벼가 식물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 유전자가 배열표의 배열 번호 2에 기재된 염기 배열로 나타내어지는 것인 벼 고엽고 바이러스 저항성의 벼과 식물의 제조방법.