KR100822742B1 - 애멸구 유래 재조합 그로이엘단백질 유전자 클론 및 이를이용한 벼줄무늬 잎마름병 바이러스의 면역포획역전사효소연쇄중합반응 검정방법 - Google Patents

애멸구 유래 재조합 그로이엘단백질 유전자 클론 및 이를이용한 벼줄무늬 잎마름병 바이러스의 면역포획역전사효소연쇄중합반응 검정방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 곤충 유래 특이단백질을 이용한 바이러스 검정법 개발에 관한 것으로, 한국, 중국 및 일본 등에서 벼의 주요 바이러스병인 벼줄무늬잎마름병바이러스(RSV)의 정밀한 검정기술 및 RSV 저항성 형질전환벼 개발 등에 적용하기 위한 기반 기술로서 RSV가 특이적으로 결합반응하는 애멸구 매개충 유래의 그로이엘(GroEL) 재조합단백질 및 이를 이용한 RSV의 면역포획 역전사효소연쇄중합반응(RT-PCR) 검정방법을 발명하고자 하였다.
본 발명의 애멸구 유래 그로이엘 재조합단백질의 유전자 클론으로부터 순수 분리된 62.81kDa의 재조합단백질이 RSV와 결합반응함을 확인할 수 있었고, 상기 결합반응은 담배가루이 등과 달리 애멸구 유래 그로이엘 재조합단백질이 실(絲)형의 RSV와 특이적으로 반응하는 것으로, 본 그로이엘 재조합단백질을 반응용기 표면에 코팅하고 이병벼 및 애멸구의 시료용액 내의 RSV를 면역포획시켜 역전사효소연쇄중합반응에 의해 RSV를 검정하였다.
본 발명에 따르면 정밀 RSV 발병예찰이 가능하고 그로이엘 단백질 발현 RSV저항성 형질전환식물 개발 및 RSV검출의 각종 도구로 활용 가능함을 알 수 있다.
벼줄무늬잎마름병바이러스, RSV, 애멸구, 매개충, 그로이엘 재조합단백질, 면역포획 역전사효소중합반응

Description

애멸구 유래 재조합 그로이엘단백질 유전자 클론 및 이를 이용한 벼줄무늬 잎마름병 바이러스의 면역포획 역전사효소연쇄중합반응 검정방법{Gene clone of recombinant GroEL originated from small brown planthopper and detection method of immunocapture RT-PCR for rice stripe virus using the GroEL protein}
도1은 본 발명에 따른 애멸구 유래 그로이엘 재조합 단백질 생산을 위한 발현벡터지도와 애멸구 유래 그로이엘 유전자 염기서열을 나타낸 그림이다.
도2는 본 발명에 따른 애멸구 유래 그로이엘 재조합단백질의 발현 및 순수분리결과를 나타낸 사진이다(M: 단백질 마커, NI: 발현 비유도, I: 발현유도, P: 순수분리(500㎍/㎖ in PES)).
도 3은 본 발명에 따른 애멸구 유래 그로이엘 재조합단백질 이용 면역포획 역전사효소연쇄중합반응에 의한 벼줄무늬잎마름병바이러스(RSV) 검정 결과를 나타낸 것이다(좌: RSV 이병벼 농도별(0~5mg/mL) 검출, 우: 애멸구 보독충 수별(0~2마리) 검출).
도 4는 애멸구 유래 그로이엘과 진딧물 및 담배가루이 유래 그로이엘 유전자간의 DNA 염기서열 유사성을 분석한 그림이다.
한국, 중국, 일본 등에서 벼의 주요 바이러스병인 벼줄무늬잎마름병바이러스(RSV)의 정밀한 검정기술 및 RSV 저항성 형질전환벼 개발 등에 적용하기 위한 기반 기술로서 RSV가 특이적으로 결합반응하는 애멸구 매개충 유래의 그로이엘(GroEL) 재조합단백질 및 이를 이용한 RSV의 면역포획 역전사효소연쇄중합반응(RT-PCR) 검정방법을 발명하고자 하였다.
벼의 주요 바이러스병인 벼줄무늬잎마름병바이러스(RSV)에 대하여 이병벼 및 애멸구에서 RSV의 항체를 이용한 효소면역측정법(ELISA) 검정 키트가 일본에서 상품화되어 있으나 정확도 및 효율이 낮다. 현재 기술로 RSV 검정을 위한 역전사효소연쇄중합반응(RT-PCR) 검정이 가능하므로 본 발명에서도 면역포획 후 역전사효소연쇄중합반응을 위하여 RSV의 피복단백질 유전자를 이용한 DNA 표지인자(primer) 및 반응 조건 등을 확립하였다.
진딧물과 담배가루이에서 그로이엘 단백질이 해당 매개충이 매개하는 바이러스 등과 결합함이 보고되었으나 애멸구의 그로이엘이 RSV와 결합반응하는지 여부는 현재까지 보고된 바 없었다.
현재까지 벼줄무늬잎마름병바이러스(RSV)와 결합하는 단백질을 구명하지 못하였으므로 본 발명은 우리나라에 서식하는 애멸구의 공생세균인 Wolbachia에서 그로이엘 단백질 유전자를 분리하고 이의 유전자클론을 구축, 재조합단백질을 대량으로 순수분리하여 이를 반응 용기에 코팅처리하고 RSV 이병벼 및 애멸구 마쇄액을 주입하면 그로이엘 단백질이 RSV 입자와 결합하는 것을 최초로 확인하였다.
이와 더불어 본 발명은 애멸구 유래의 그로이엘 재조합단백질을 직접 중합 반응용기에 코팅하여 바이러스 입자가 포함된 시료를 처리함으로 최적화된 면역 포획(Immunocapture) 및 역전사효소연쇄중합반응(RT-PCR)에 의해 RSV 이병벼 및 애멸구에서 RSV를 특이적으로 검정할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 방법을 통해 야외에서 병해 발생의 역학적인 측면에서 매우 적은 양의 시료만으로도 병 발생 정도를 예측할 수 있는 정밀한 검정이 가능할 수 있고 단순한 역전사효소연쇄중합반응(RT-PCR)이 제공할 수 없는 RSV와 애멸구 매개충간의 다양한 분자생리적 연구의 재료 및 도구로 활용가능성을 제공하고자 한다.
본 발명은 우리나라에 서식하는 애멸구의 공생세균인 Wolbachia에서 그로이엘(GroEL) 단백질 유전자를 분리하고 이의 유전자클론을 구축, 재조합단백질을 대량으로 순수분리하여 이를 반응 용기에 코팅처리하고 RSV 이병벼 및 애멸구 마쇄액을 주입하면 그로이엘 단백질이 RSV 입자와 결합하는 것을 특징으로 한다. 애멸구 유래 그로이엘 유전자는 진딧물 등에서 보고된 유전자와 낮은 상동성을 보이고 담배가루이 유래의 그로이엘 단백질이 구형 바이러스와 결합하는 반면, 본 애멸구 유래 그로이엘 유전자는 실[絲]형인 RSV 입자와 결합하는 특이성을 갖는 애멸구 유래의 그로이엘 재조합단백질을 제공할 수 있다.
본 발명에 의하면 애멸구 유래의 그로이엘 재조합단백질을 직접 중합 반응용 기에 코팅하여 바이러스 입자가 포함된 시료를 처리함으로 최적화된 면역 포획(Immunocapture) 및 역전사효소연쇄중합반응(RT-PCR)에 의해 RSV 이병벼 및 애멸구에서 RSV를 특이적으로 검정할 수 있고, 이 재조합단백질을 이용하여 면역 포획 역전사효소연쇄중합반응을 수행하면 벼추출물 1.25~5mg/ml 또는 애멸구 최소 0.5마리로부터 정확하게 RSV의 감염 여부를 판별할 수 있다.
따라서, 본 발명에 의하면 야외에서 병해 발생의 역학적인 측면에서 매우 적은 양의 시료만으로도 병 발생 정도를 예측할 수 있는 정밀한 검정이 가능할 수 있고 단순한 역전사효소연쇄중합반응(RT-PCR)이 제공할 수 없는 RSV와 애멸구 매개충간의 다양한 분자생리적 연구의 재료 및 도구로 활용될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명하지만, 본 발명의 보호범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 애멸구 유래 그로이엘 재조합단백질의 유전자 클론의 제작
우선 담배가루이에서 이미 알려진 그로이엘 유전자의 DNA표지인자를 이용하여 애멸구에서도 공생세균인 Wolbachia에 의한 그로이엘 유전자가 발현됨을 확인한 후 애멸구 체내에서 그로이엘 단백질에 대한 전체 유전자(1.659kb)를 획득하였다(GenBank Accession no. : DQ356890). 이를 단백질발현벡터(pQE30UA)에 삽입하고 발현 유도하여 대량으로 발현된 62.81kDa의 그로이엘 재조합단백질이 순수분리됨을 확인하고, 신규한 서열목록을 기탁하였다(기탁번호 KACC-95060P).
실시예 2: 애멸구 유래 그로이엘 단백질의 유전자 클론으로부터 재조합 단백질의 발현, 분리 및 이 단백질에 대하여 쥐 등으로부터 제작된 항체
실시예1에서 제작된 62.81kDa의 그로이엘 재조합단백질은 His-tag Ni-NTA 아가로스(Agarose) 컬럼으로 정제하여 수용성 단백질로 순수분리되었다. 순수분리된 그로이엘 재조합단백질을 쥐의 혈관에 주사함으로써 이로부터 제작된 그로이엘 재조합단백질에 대한 항체로 이후 그로이엘의 정확한 동정에 이를 이용 할 수 있었다. 즉, 본 발명에 따른 그로이엘 재조합단백질의 항체를 이용하여 RSV의 검정을 위한 효소면역측정법(ELISA) 검정을 수행하면 RSV 검출에 따른 발색 반응이 확인되었다. 그러므로 본 발명은 그로이엘 재조합단백질에 의한 바이러스의 면역포획 후 그로이엘 항체를 이용한 ELISA 검정도 가능하였다.
실시예 3: 애멸구 유래 그로이엘 재조합단백질과 벼줄무늬잎마름병바이러스( RSV)간의 결합반응
담배가루이에서 발견된 그로이엘 단백질은 구형의 바이러스만 특이적으로 결합하였으나, 이와 달리 본 발명에 따른 애멸구 유래 그로이엘 재조합단백질은 실[絲]형의 바이러스인 RSV와 결합하였다(도 3). 이는 담배가루이, 목화진딧물 및 애멸구 유래의 그로이엘 유전자간의 염기서열 유사성에 큰 차이로 인해 나타나는 특이성인 것으로 예상되었다(도 4). 즉, 담배가루이와는 53%, 진딧물과는 54%의 상동성만을 보였다.
실시예4 : 애멸구 유래 그로이엘 재조합단백질이 벼줄무늬잎마름병바이러스(RSV) 와 결합하는 특성을 이용한 면역포획( Immunocapture ) 역전사효소중합반응 RSV 검정 방법
(1) 그로이엘 재조합단백질을 이용한 RSV의 면역포획법
상기 순수분리된 그로이엘 재조합단백질을 PolySorp처리된 중합반응 튜브나 96 well plate 등 반응용기에 코팅용액(0.16% Na2CO3, 0.29% NaHCO3, pH9.6)과 함께 37℃에서 3시간 반응시켜 용기 표면에 그로이엘 재조합단백질이 부착되도록 하였다.
그 후 200㎕ 세척용액(0.5% Tween20 포함된 PBS 버퍼, pH7.4) 3회 세척하였다. RSV 검정을 위한 RSV추출용 PBS 버퍼용액 (0.05% Tween20, 2% Polyvinylpyrrolidone, 0.5% Bovine serum albumin 포함, pH7.4)을 이용하여 이병벼(추출물 농도 1.25~5mg/mL) 및 애멸구 매개충(0.5마리 이상)의 마쇄 상등액 100㎕를 반응 용기에 넣고 37℃에서 3시간 방치하여 그로이엘 단백질과 결합반응이 일어나도록 하였다.
애멸구 유래 그로이엘 재조합단백질에 결합반응 하는 RSV 입자는 중합반응 용기에 코팅된 그로이엘 재조합단백질에 의해 용액 세척 후에도 그대로 용기에 부착됨에 따라 효소면역측정법(ELISA) 또는 역전사효소연쇄중합반응(RT-PCR)에 의해 바이러스 검출이 가능하였다.
(2) 면역포획된 RSV의 역전사효소연쇄중합반응(RT-PCR) 검정법
상기 결합반응 후 시료용액을 버리고 200㎕ 세척용액(0.5% Tween20 포함된 PBS 버퍼, pH7.4) 3회 세척 후 200㎕ DEPC용액으로 2회 세척하였다. 그 후 RSV 유전자 분리를 위하여 100㎕ DEPC용액으로 95℃에서 10분간 처리 하고 55℃에서 30분간 역전사효소 반응(RT)을 하였다. 연쇄중합반응(PCR)을 위한 RSV의 피복유전자 염기서열로부터 제작된 특이 프라이머인 5'-GTGTTCTCAGCAAGGATCTTCATCAG-3' 및 5'-GTACACAACTGGTCTCCTGGTCATCAC-3'를 이용하여 94℃ 2분 처리 후, 25~40 회 반복적으로 94℃ 15초, 67℃ 30초, 68℃ 1분간의 처리를 하고 68℃에서 5분 반응시켰다. 그 결과 전기영동상에서 RSV 이병벼 및 애멸구 보독충에서 모두 RSV의 유전자(234bp)가 검출되었다(도 3).
rGroEL을 이용한 이병벼 및 보독충에서 RSV 검정을 위한 IC-RT-PCR 조건
항 목 내용 및 처리법 비 고
이병벼 추출물 농도 1.25～5 mg/ml 10 mg/ml 이하
보독충 마리 수 0.5 마리 이상
rGroEL 코팅 농도 10 ㎍/ml 37℃, 3시간 처리
코팅 버퍼용액 0.16% Na2CO3, 0.29% NaHCO3, pH9.6
결합 반응 37℃, 3시간 100㎕ 이병벼 즙액 또는 애멸구 마쇄 상등액
추출 버퍼용액 0.05% Tween20, 2% PVP (Polyvinylpyrrolidone), 0.5% BSA in PBS buffer (pH7.4)
반응 용기 PCR tube 또는 96 well plate PolySorp 표면처리 제품 사용으로 비특이적 반응 제거 가능함
유전자 분리 95℃, 10분
RT 조건 55℃, 30분
PCR 프라이머 Forward: 5'-GTGTTCTCAGCA AGGATCTTCATCAG-3' Reverse: 5'-GTACACAACTGGT CTCCTGGTCATCAC-3'
PCR 반응 94℃, 2분 (94℃, 15초/67℃, 30초/68℃, 1분) x 25-40cycle 68℃, 5분
현재 벼줄무늬잎마름병바이러스(RSV)의 검정을 위한 제품으로 일본에서 개발된 효소면역측정법(ELISA) 키트가 판매되고 있다. 본 발명은 상기 효소면역측정법에 의한 RSV 검정도 가능하면서 또한 역전사효소연쇄중합반응(RT-PCR)이 가능하여 이병벼 및 애멸구 매개충으로부터 RSV에 대한 효율적이고 정밀한 검정을 기할 수 있다. 뿐만 아니라, 기존 RT-PCR을 위해서는 total RNA를 추출해야 하는 과정을 거쳐야 하지만, 본 발명은 이러한 total RNA의 추출을 요하지 않으므로 간편하게 RSV 유전자를 검출할 수 있다.
또한, 본 발명을 이용하여 병해 발생 조사를 수행함으로써 지역적 또는 국가적으로 해당 병해의 예방과 피해 대책을 조기에 수립할 수 있다. 이와 더불어 애멸구 유래의 그로이엘 재조합단백질을 이용하여 RSV 저항성 그로이엘 단백질 발현 형질전환 식물 개발 및 각종 RSV의 분자생물학적 연구에서 RSV의 검출 및 발병 검정 등의 수행을 위한 도구로 활용할 수 있다.
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Claims (4)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 애멸구의 공생미생물 Wolbachia B계통에서 분리된 그로이엘(GroEL) 유전자를 발현벡터에 삽입하여 제작된 그로이엘 재조합단백질 발현을 위한 서열번호1에 기재된 유전자 클론(KACC-95060P)에서 발현하여 His-taq Ni-NTA 아가로스 컬럼으로 정제된 서열번호2에 기재된 재조합단백질로서, 실[絲]형인 벼줄무늬잎마름병바이러스(RSV)와 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질.
  4. (a) 애멸구 유래 그로이엘 재조합단백질 또는 이의 항체를 PolySorp 처리된 반응 용기에 코팅용액으로 코팅처리하는 단계;
    (b) 상기 코팅 후 RSV와의 결합반응에 의해 검정 시료를 처리하여 반응 용기에 RSV 입자가 면역 포획되는 단계; 및,
    (c) 면역포획된 RSV 입자에서 유전자를 분리하여 역전사효소연쇄중합반응(RT-PCR)하여 RSV의 유전자를 검출하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 벼줄무늬잎마름병바이러스(RSV)의 유전자를 검정하는 방법.
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