CN111606979B - 一种水稻条纹病毒核衣壳蛋白的多克隆抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种水稻条纹病毒核衣壳蛋白的多克隆抗体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种水稻条纹病毒核衣壳蛋白的多克隆抗体制备方法及其应用，属于水稻条纹病毒检测技术领域，所述水稻条纹病毒核衣壳蛋白CP的多克隆抗体，以水稻条纹病毒核衣壳蛋白CP为免疫原免疫动物获得；所述水稻条纹病毒核衣壳蛋白CP的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明所述水稻条纹病毒核衣壳蛋白的多克隆抗体具有成本低、适用广、受众多元、灵敏度高等特点，能够用于免疫斑点测定法、酶联免疫吸附测定法、蛋白质免疫印迹法、免疫荧光法和免疫电镜法等多项生物学检测实验。利用本发明所述的多克隆抗体，在水稻水稻条纹叶枯病爆发之初通过灰飞虱进行病害预警，利于多手段的病害监测。

Description

一种水稻条纹病毒核衣壳蛋白的多克隆抗体及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于水稻条纹病毒检测技术领域，尤其涉及一种水稻条纹病毒核衣壳蛋白的多克隆抗体及其制备方法和应用。
背景技术
水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)隶属于纤细病毒属。水稻条纹病毒引发的水稻条纹叶枯病在东亚温带、亚热带的水稻上病害严重。该病害最早被发现于1987年日本枥木、群马县，后传入朝鲜、俄罗斯、乌克兰和中国。我国自1963年在江浙地区始发后，波及上海、福建、山东、江西、安徽、湖北、广西、广东、河北、河南、辽宁、云南、台湾等16个省、市和自治区。2000年以来在江苏苏北、浙江北部、云南宝山楚雄、北京双桥、河南原阳、山东济宁等地区发病普遍，严重时，田间产量损失70％～80％，甚至颗粒无收。近年，水稻条纹叶枯病的危害由于田间飞虱数量的下降而发生减弱，但是水稻条纹叶枯病随时可能再次爆发，所以监测、检测、预防工作刻不容缓。
植物病毒引起的植物病害，每年在全世界范围造成约11％的农作物损失。近85％的植物病毒依赖于昆虫传播。媒介昆虫通过取食过程将病毒传至寄主植物造成植物发病。因此，植物-病毒-介体昆虫互作研究一直备受关注。在该互作关系中，相比于固着的寄主植物，介体昆虫对植物病毒传播起至关重要作用。水稻条纹病毒主要在灰飞虱(Laodelphaxstriatellus)体内以持久、循回增殖型方式传播。水稻条纹叶枯病是由灰飞虱传播的病毒病，该病毒一旦侵染水稻便无药可医，也被称为“植物癌症”。所以对该病的防治方法在于“治虫防病”，亟需建立高效、灵敏、多用途的灰飞虱带毒率和体内带毒情况检测方法，这对于水稻条纹叶枯病的预测预报和防治有着重要意义。
现今，国内外常用的灰飞虱体内水稻条纹叶枯病毒检测方法有RT-PCR、Northern、DIBA和ELISA等，RT-PCR和Northern的成本和仪器要求较高，且不适合批量操作。而周益军团队研发病毒单抗可以用于DIBA和ELISA检测，其简易、快速特点适用于基层农技人员适用，但是该单抗经在WB、IF和IM检测中表现不稳定，无法达到科研人员的实验要求。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种水稻条纹病毒核衣壳蛋白的多克隆抗体及其制备方法和应用；所述水稻条纹病毒核衣壳蛋白的多克隆抗体具有成本低、适用广、受众多元、灵敏度高等特点，能够用于DIBA、ELISA、WB、IF和IM多项生物学检测实验，同时兼顾基层农技人员和科研人员的工作需要，具备3天在灰飞虱肠道检测病毒的快速、高效、灵敏等特点。利用本发明所述的多克隆抗体，在水稻水稻条纹叶枯病爆发之初通过灰飞虱进行病害预警，利于多手段的病害监测。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种水稻条纹病毒核衣壳蛋白CP，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供了编码所述水稻条纹病毒核衣壳蛋白CP的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明还提供了一种表达所述水稻条纹病毒核衣壳蛋白CP的重组载体，包括所述的基因和初始载体。
优选的，所述初始载体为pET-28a载体，所述基因重组于所述pET-28a载体的BamHI酶切位点和NcoI酶切位点之间。
本发明还提供了一种表达所述水稻条纹病毒核衣壳蛋白CP的重组菌株，为转入所述的重组载体的菌株。
优选的，所述菌株为大肠杆菌。
本发明还提供了一种水稻条纹病毒核衣壳蛋白CP的多克隆抗体，以所述水稻条纹病毒核衣壳蛋白CP为免疫原免疫动物获得。
优选的，所述动物包括小鼠；所述免疫原与佐剂混合乳化后进行免疫。
本发明还提供了所述的多克隆抗体在检测灰飞虱体内水稻条纹病毒中的应用。
优选的，所述检测的方法包括免疫斑点测定法、酶联免疫吸附测定法、蛋白质免疫印迹法、免疫荧光法和免疫电镜法。
本发明的有益效果：本发明提供的水稻条纹病毒核衣壳蛋白CP的多克隆抗体能够快速、高效、灵敏的检测灰飞虱中水稻条纹病毒，应用的检测方法包括DIBA、ELISA、WB、IF和IM方法；使用IF法在灰飞虱获毒3天后，即可快速、高效、灵敏的对其体内的水稻条纹病毒进行检测。利用本发明所述的多克隆抗体，在水稻水稻条纹叶枯病爆发之初，通过灰飞虱进行病害预警，利于多手段的病害监测。
附图说明
图1为CP多克隆抗体的WB验证结果；
图2为DIBA法检测CP多克隆抗体在灰飞虱中特异性；
图3为WB法检测CP多克隆抗体在灰飞虱中特异性；
图4为IF法检测CP多克隆抗体在灰飞虱中特异性；
图5为IM法检测CP多克隆抗体在灰飞虱中特异性。
具体实施方式
本发明提供了一种水稻条纹病毒核衣壳蛋白CP的部分肽链，其氨基酸序列如SEQID No.1所示，具体如下所示：
WDYVPQYIKLESETAPYCTTHSLSHILFVVHIIHSFQITKKTMPEGKKKERGLTKDIDMMKYTTGLLVITCKSKNLADKKKEDGRKKVLDEFITNGKVKTTIFDALAGMSVNTISTYGNQTRLYLAQQSKLMKILAENTSKTASEVSGLVKEFFEDEAEGADD。
本发明还提供了编码所述水稻条纹病毒核衣壳蛋白CP的部分基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下：
TGGGACTATGTTCCACAATATATTAAACTGGAGAGTGAAACAGCTCCTTACTGCACAACTCACTCCCTAAGTCATATTTTGTTTGTTGTGCACATCATTCACTCCTTCCAAATAACCAAAAAGACCATGCCAGAGGGTAAGAAGAAGGAGCGTGGTCTGACAAAAGACATAGACATGATGAAGTACACAACTGGTCTCCTGGTCATCACATGCAAGTCAAAGAACCTGGCTGACAAGAAGAAGGAAGATGGCAGAAAGAAGGTCTTAGATGAATTCATCACCAATGGGAAAGTGAAGACCACAATCTTCGATGCGCTGGCTGGTATGTCTGTCAATACGATCAGCACTTATGGGAATCAGACAAGGCTGTACTTGGCTCAACAGAGCAAGCTGATGAAGATCCTTGCTGAGAACACTTCAAAGACAGCATCTGAAGTCAGCGGGTTGGTGAAGGAGTTCTTCGAGGATGAGGCAGAAGGTGCAGATGACTAG。
本发明还提供了一种表达所述水稻条纹病毒核衣壳蛋白CP的重组载体，包括所述的基因和初始载体。在本发明中，所述初始载体优选为pET-28a载体；在本发明中，所述基因优选的重组于所述pET-28a载体的BamHI酶切位点和NcoI酶切位点之间。
在本发明中，所述重组载体的制备方法优选的包括以下步骤：1)提取带水稻条纹病毒的灰飞虱的总RNA，反转录获得cDNA；2)以所述cDNA为模板进行PCR扩增获得编码CP的基因片段；3)将所述基因片段与pMD-19T载体连接后转化大肠杆菌获得CP/pMD-19T质粒；4)将所述CP/pMD-19T质粒双酶切后，回收编码CP的基因片段与pET-28a载体连接获得所述重组载体。
在本发明中，提取带水稻条纹病毒的灰飞虱的总RNA，反转录获得cDNA。在本发明中，所述总RNA的提取优选的采用TRIzol法，在本发明具体实施过程中，优选的采用试剂盒进行，所述试剂盒优选为TRIzolTM LS Reagent,10296010,ThermoFisher,USA；具体操作步骤参见试剂盒说明书。在本发明中，所述反转录优选的采用TAKARA反转录试剂盒，具体的操作参见试剂盒说明书。
本发明在获得所述cDNA后，以所述cDNA为模板进行PCR扩增获得编码CP的基因片段。在本发明中，所述PCR扩增的引物包括CP-BamHI-R和CP-NocI-F；具体序列如下：
CP-BamHI-R：TAGGATCCCTAGTCATCTGC(SEQ ID No.3)；
CP-NocI-F：TACCATGGATGTGGGACTATGT(SEQ ID No.4)。
在本发明中，所述PCR扩增的体系，以25μl计，优选的包括以下组分：10×BufferMg2+plus 2.5μl、2.5mM dNTP 2.0μl、10μM上下游引物各1μl、cDNA模板0.5μl、Taq酶0.5μl、RNase-free ddH2O 17.5μl；所述PCR扩增的程序优选的如下：(1)94℃预变性3min；(2)94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，循环45次；(3)72℃延伸10min。本发明在所述PCR扩增结束后，优选的对获得的PCR扩增产物进行胶回收，本发明对所述胶回收的操作没有特殊限定，采用本领域常规的操作即可。
本发明将所述基因片段与pMD-19T载体连接后转化大肠杆菌获得CP/pMD-19T质粒。在本发明中，所述基因片段与pMD-19T载体的摩尔比例优选为(2.5～3.5):1，更优选为3:1；在本发明中，所述连接用酶优选为Solution I连接酶，所述Solution I连接酶的体积与反应体系总体积的比例优选为1:2。在本发明中，所述连接的温度优选为16℃，所述连接的时间优选为25～35min，更优选为30min。本发明对所述连接产物转化大肠杆菌的的具体步骤没有特殊限定，采用本领域常规的转化步骤即可。本发明在所述转化后，优选的进行阳性菌落的筛选，所述阳性菌落的筛选优选的采用蓝白斑筛选方法。本发明在所述筛选后进行测序鉴定，鉴定正确的质粒优选的置于-20℃进行保存。
本发明在获得所述CP/pMD-19T质粒后，将所述CP/pMD-19T质粒双酶切，回收编码CP的基因片段与pET-28a载体连接获得所述重组载体。在本发明中，所述双酶切用酶优选的包括BamHI和NcoI；所述双酶切的体系优选的包括以下组分：BamHI酶、NcoI酶和缓冲buffer，所述双酶切的温度优选为37℃，所述双酶切的时间优选为8h。本发明在所述双酶切后，回收编码CP的基因片段。本发明在获得所述编码CP的基因片段后，将所述编码CP的基因片段与pET-28a载体连接获得所述重组载体。在本发明中，所述基因片段与pET-28a载体的摩尔比例优选为(2.5～3.5):1，更优选为3:1；所述连接的温度优选为16℃，所述连接的时间优选为25～35min，更优选为30min。本发明在所述连接后，将连接产物转化大肠杆菌，本发明对所述连接产物转化大肠杆菌的的具体步骤没有特殊限定，采用本领域常规的转化步骤即可。本发明在所述转化后，优选的进行阳性菌落的筛选，所述阳性菌落的筛选优选的采用蓝白斑筛选方法。本发明在所述筛选后进行测序鉴定，鉴定正确即为重组载体。
本发明还提供了一种表达所述水稻条纹病毒核衣壳蛋白CP的重组菌株，为转入所述的重组载体的菌株。在本发明中，所述菌株优选为大肠杆菌，更优选为大肠杆菌Rosetta。本发明对所述转入的方法没有特殊限定，采用本领域常规的转入方法即可，在本发明具体实施过程中，优选的采用热激的方法。
本发明还提供了一种水稻条纹病毒核衣壳蛋白CP的多克隆抗体，以所述水稻条纹病毒核衣壳蛋白CP为免疫原免疫动物获得。
在本发明中，所述水稻条纹病毒核衣壳蛋白CP优选的通过以下步骤制备获得：S1)培养上述重组菌株至菌液的OD为0.6～0.8；S2)向所述菌液中添加IPTG诱导表达；S3)收集所述菌液中的菌体、超声破碎、固液分离，上清液经Ni柱纯化获得水稻条纹病毒核衣壳蛋白CP。
在本发明中，培养所述重组菌株的温度优选为36～38℃，更优选为37℃；所述培养过程中优选的伴随搅拌，所述搅拌的转速优选为200～250rpm，更优选为220rpm，本发明在培养所述重组菌株10～14h后，优选的进行传到培养，所述传代培养的接种比例优选为1:100；所述传代培养的培养基优选为Kanamycin培养基中；所述传代培养的温度优选为36～38℃，更优选为37℃；所述传代培养过程中优选的伴随搅拌，所述搅拌的转速优选为200～250rpm，更优选为220rpm。
本发明在所述传代培养的菌液的OD为0.6～0.8后，向所述菌液中添加IPTG诱导表达。在本发明中，添加的IPTG与菌液的体积比优选为1:800～1200，更优选为1:1000。在本发明中，所述菌液中IPTG的终浓度优选为0.3～0.5mmol/L，更优选为0.4mmol/L。在本发明中，所述又到表达的温度优选为36～38℃，更优选为37℃；所述诱导表达的时间优选为2.5～3.5h，更优选为3h；所述诱导表达过程中优选的伴随搅拌，所述搅拌的转速优选为200～250rpm，更优选为220rpm。
本发明在所述诱导表达结束后，收集所述菌液中的菌体。本发明对所述收集的方法没有特殊限定，采用离心或膜过滤的方法均可。本发明优选的用PBS缓冲液对收集到的菌体重悬后进行超声破碎。在本发明中，所述PBS缓冲液的pH值优选为7.4，所述PBS缓冲液的浓度优选为40～60mmol/L，更优选为50mmol/L。在本发明中，所述PBS缓冲液和菌体的体积比例优选为1:10。在本发明中，所述超声破碎的功率优选为280～320W，更优选为300W；本发明所述超声破碎优选为间歇性超声破碎，更优选为超声破碎3s，停止3s，所述超声破碎的总时间优选为2～3min。本发明在所述超声破碎后，进行固液分离；所述固液分离的方法优选为离心，所述离心的转速优选为10000～140000rpm，更优选为12000rpm；所述离心的时间优选为4～6min，更优选为5min。本发明在所述固液分离后，收集上清液，将上清液经Ni柱纯化获得水稻条纹病毒核衣壳蛋白CP。在本发明中，所述Ni柱优选为His标签过的Ni柱。
本发明在获得所述水稻条纹病毒核衣壳蛋白CP后，以所述水稻条纹病毒核衣壳蛋白CP为免疫原免疫动物获得多克隆抗体。在本发明中，所述动物优选的包括小鼠。在本发明中，所述免疫原优选与佐剂混合乳化后进行免疫。在本发明中，所述佐剂优选为弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂。在本发明中，所述乳化优选的采用两个注射器用橡皮管对接后进行完全乳化；所述完全乳化的标准为将乳化后的免疫原滴入37℃水中不分散。在本发明中，所述免疫的次数优选为4次；在本发明中，所述免疫原和佐剂的体积比优选为1:1。在本发明中，每次免疫所述免疫原的浓度优选为0.5mg/ml，免疫的剂量优选为0.1ml/只。在本发明中，首次免疫优选的采用弗氏完全佐剂，二次免疫、三次免疫和四次免疫优选的采用弗氏不完全佐剂。在本发明中，首免后第21天进行二免，二免到三免，三免到四免间隔时间为14天。本发明对所述具体的免疫方法没有特殊限定，采用皮下、腹腔多点注射。本发明在所述第四次免疫后，采血，收集血清即获得水稻条纹病毒核衣壳蛋白CP的多克隆抗体。在本发明中，所述采血优选为眼眶采血，收集血清优选的采用离心的方法；所述离心的转速也有选为10000rpm，所述离心的时间优选为5～10min；本发明在所述离心后收集上清获得所述多克隆抗体。
本发明还提供了所述的多克隆抗体在检测灰飞虱体内水稻条纹病毒中的应用。在本发明中，所述检测的方法包括免疫斑点测定法、酶联免疫吸附测定法、蛋白质免疫印迹法、免疫荧光法和免疫电镜法。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
CP/pET-28a原核表达载体的构建：
水稻条纹病毒CP的序列扩增：TRIzol法(TRIzolTM LS Reagent,10296010,ThermoFisher,USA)提取带毒灰飞虱的总RNA；以提取获得的总RNA为模板进行反转录获得cDNA；反转录采用TAKARA反转录试剂盒，操作参见试剂盒说明书。
以cDNA为模板进行PCR扩增获得CP基因。
PCR扩增的特异引物：
CP-BamHI-R：TAGGATCCCTAGTCATCTGC(SEQ ID No.3)；
CP-NocI-F：TACCATGGatGTGGGACTATGT(SEQ ID No.4)。
PCR扩增体系如表1。
表1 PCR扩增体系
Figure BDA0002527392750000081
PCR扩增程序：
(1)94℃预变性3min；
(2)94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，再进行45个循环；
(3)72℃延伸10min。
对PCR产物进行胶回收，获得编码CP蛋白的基因序列，具体如下：
GTGGGACTATGTTCCACAATATATTAAACTGGAGAGTGAAACAGCTCCTTACTGCACAACTCACTCCCTAAGTCATATTTTGTTTGTTGTGCACATCATTCACTCCTTCCAAATAACCAAAAAGACCATGCCAGAGGGTAAGAAGAAGGAGCGTGGTCTGACAAAAGACATAGACATGATGAAGTACACAACTGGTCTCCTGGTCATCACATGCAAGTCAAAGAACCTGGCTGACAAGAAGAAGGAAGATGGCAGAAAGAAGGTCTTAGATGAATTCATCACCAATGGGAAAGTGAAGACCACAATCTTCGATGCGCTGGCTGGTATGTCTGTCAATACGATCAGCACTTATGGGAATCAGACAAGGCTGTACTTGGCTCAACAGAGCAAGCTGATGAAGATCCTTGCTGAGAACACTTCAAAGACAGCATCTGAAGTCAGCGGGTTGGTGAAGGAGTTCTTCGAGGATGAGGCAGAAGGTGCAGATGACTAG(SEQ ID No.2)
编码水稻条纹病毒CP蛋白氨基酸序列如下：
WDYVPQYIKLESETAPYCTTHSLSHILFVVHIIHSFQITKKTMPEGKKKERGLTKDIDMMKYTTGLLVITCKSKNLADKKKEDGRKKVLDEFITNGKVKTTIFDALAGMSVNTISTYGNQTRLYLAQQSKLMKILAENTSKTASEVSGLVKEFFEDEAEGADD(SEQ ID No.1)
实施例2
CP/pET-28a重组质粒构建：用Solution I连接酶将实施例1回收的CP片段与pMD-19T载体按照摩尔比3:1、16℃、30min连接。用热激法连接产物转化大肠杆菌，利用抗性和蓝白斑筛选法筛阳性菌落。测序鉴定后-20℃保存CP/pMD-19T质粒。
按照50μl体系各加1μl的BamHI(15U/μl)和NcoI(15U/μl)酶双酶切法对CP/pMD-19T进行酶切，切胶回收后的目的片段与pET-28a载体按照3:1、16℃、30min连接。转化大肠杆菌筛选阳性克隆，测序鉴定，获得CP/pET-28a原核表达载体。
CP融合蛋白的原核表达：
(1)CP/pET-28a转化大肠杆菌的培养：将重组质粒CP/pET-28a转入大肠杆菌Rosetta感受态细胞中，37℃、220rpm过夜培养。1：100稀释转入Kanamycin培养基中，37℃、220rpm培养至OD值达到0.6-0.8。
(2)CP/pET-28a诱导表达：按照IPTG体积：菌液体积1:1000加入IPTG至终浓度为0.4mmol/L，同样37℃、220rpm培养3h。诱导表达后，收集目的蛋白表达的菌液，利用pH7.450mmol/L Tris-HCl缓冲液重悬获得重悬菌液。
(3)CP/pET-28a融合蛋白的获得：超声破碎(300W，超3s停3s，超声3min)步骤(2)获得的重悬菌液，4℃、12000rpm离心5min，利用His标签过Ni柱纯化上清，得到CP蛋白。利用His单抗对CP融合蛋白进行WB鉴定。
实施例3
CP多克隆抗体的制备：
免疫原准备：将抗原CP蛋白从-20℃冰箱拿出，常温融解，避免反复冻融。注射器标记，标记项目号和动物号。抗原充分混匀，首免抗原浓度为0.5mg/ml，小鼠免疫剂量为0.1ml/只；二免、三免和四免抗原浓度为0.5mg/ml，小鼠免疫剂量为0.1ml/只。准备佐剂，佐剂和抗原体积比为1:1。首免采用弗氏完全佐剂，二免、三免和四免采用弗氏不完全佐剂。佐剂要混合均匀后再抽入注射器。乳化：两个注射器用橡皮管对接后进行完全乳化，乳化标准为：乳化好的免疫原滴入37℃水中不分散为合格。
免疫小鼠：小鼠免疫方式为皮下、腹腔多点注射。免疫周期：首免后第21天进行二免，二免到三免，三免到四免间隔时间分别为14天。小鼠四免后第7天眼眶采血检测。
血清离心：小鼠四免后第7天眼眶采血，10000rpm，5min，取上清。获得CP多克隆抗体。
对所述CP多克隆抗体进行WB检测，结果如图1所示，两只小鼠抗血清在检测样本上均检到35kDa的单条带，此带经block验证具有特异性。
血清效价测定结果如表1所示。
表1免疫小鼠血清效价测定结果
Figure BDA0002527392750000101
Figure BDA0002527392750000111
实施例4
利用水稻条纹病毒核衣壳蛋白CP多克隆抗体检测灰飞虱体内水稻条纹病毒的检测方法：
DIBA检测CP多克隆抗体在灰飞虱中特异性
(1)样品准备：田间捕获或者实验室培养的单头灰飞虱放入0.2ml离心管中，加20μl PBS碾磨均匀；
(2)点样：取一张2.5cm×2.5cm的硝酸纤维素膜，按照10×10比例画成100个正方小格。取(1)中上清10μl点样于硝酸纤维素膜的正方格中，晾干待用；
(3)封闭：将膜浸入10ml 5％脱脂奶粉(溶于PBST)封闭，37℃，水平震荡30min；
(4)一抗孵育：在上述封闭液中加入1:1000稀释的CP多克隆抗体100μl，室温3h；
(5)洗涤：用pH7.2 0.01M PBST洗涤膜5次，每次3min；
(6)二抗孵育：将洗涤后的膜加入带有辣根过氧化酶(HRP)标记的羊抗鼠二抗中(100μl 1:5000 HRP稀释于10ml的封闭液)，室温3h；
(7)洗涤：同(5)操作；
(8)显色：将膜浸入10ml PBS溶解的100μl HRP反应底物中，室温显色30min；
(9)终止反应：显色后自来水冲洗晾干；
(10)数据读取：肉眼判断正方格中颜色，蓝紫色为带毒，无色为无毒。
结果如图2所示，硝化纤维膜显色后，蓝色斑点判定为带毒虫，非蓝色斑点为无毒虫。
ELISA检测CP多克隆抗体在灰飞虱中特异性
(1)包板：用包被缓冲液(coating buffer:Na2CO3和NaHCO3缓冲液，PH7.2)将CP抗原稀释至1μg/ml，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加50μl，4℃过夜，次日，弃去孔内溶液，用1xTBST洗涤缓冲液以每孔180μl洗1次。
(2)封闭：每孔加60μl的1％BSA(TBST配制)进行封闭，置37℃孵育1h。之后弃封闭液。
(3)加样：将单头灰飞虱碾磨后按体积比1:30用PBS稀释，取50μl于上述已封闭的反应孔。同时设置好阳性对照孔(阳性血清)与阴性对照孔(BSA)。置37℃孵育1h，之后弃封闭液，用1xTBST洗涤缓冲液以每孔180μl洗2次。
(4)加酶标抗体：将新鲜稀释的二抗-HRP(1:5K，用1％BSA进行稀释)，以50μl/孔加入酶标板孔中，置37℃孵育45min，之后弃封闭液，用1xTBST洗涤缓冲液以每孔180μl洗3次。
(5)加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液100μl，置37℃反应5min。
(6)终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸90μl。
(7)读板：将酶标板置于预热过的酶标仪中(450nm)进行读数，保存数据，进行分析。
结果OD450测试下读数大于1为带毒虫。
WB检测CP多克隆抗体在灰飞虱中特异性
(1)样品准备：10头灰飞虱放入2ml离心管，加入200μl RIPA裂解液或者Trizl法提取总蛋白，3000rpm离心3min，取上清100℃煮沸10min，冰上待用；
(2)电泳：按照标准蛋白电泳方法配置SDS-PAGE凝胶，每孔上样8ul，60V恒压跑30min，转80V恒压电泳分离；
(3)转膜：用湿转膜仪进行电转膜法，将凝胶中蛋白转入PDVF膜，150mA恒流转膜30min；
(4)封闭：将膜浸入10ml 5％脱脂奶粉(溶于PBST)封闭，室温水平震荡2h；
(5)一抗孵育：在上述封闭液中加入1:500稀释的CP多克隆抗体100μl，4℃水平震荡过夜；
(6)洗涤：用pH7.2 0.01M PBST洗涤膜5次，每次3min；
(7)二抗孵育：将洗涤后的膜加入带有辣根过氧化酶(HRP)标记的羊抗鼠二抗中(100μl 1:5000 HRP稀释于10ml的封闭液)，室温水平震荡2h；
(8)洗涤：同(5)操作；
(9)显色：ECL显色反应；
(10)数据读取：用凝胶图象处理系统分析膜上目标带的分子量和净光密度值。
结果如图3所示，在35-40kDa出现明显条带为带毒虫，否则为无毒虫。
IF检测CP多克隆抗体在灰飞虱个组织中特异性
(1)样品准备：单头灰飞虱在显微镜下PBS中解剖中肠、血淋巴和唾液腺组织，分别放入0.2ml离心管，加入固定液固定；
(2)封闭：将组织浸入1ml 5％脱脂奶粉(溶于PBST)封闭，室温360度旋转震荡2h；
(3)一抗孵育：将组织加入1:500稀释的CP多克隆抗体100μl，4℃360度旋转震荡过夜；
(4)洗涤：用pH7.2 0.01M PBST洗涤5次，每次3min；
(5)二抗孵育：将洗涤后的组织放入荧光标记的羊抗鼠二抗中，室温360度旋转震荡2h；
(6)洗涤：同(5)操作；
(7)数据读取：用荧光共聚焦显微镜镜检组织中RSV荧光亮度。
结果如图4所示，绿色荧光标记为RSV侵染的组织细胞。
IM检测CP多克隆抗体在灰飞虱细胞中特异性
样品准备
(1)解剖单头灰飞虱组织，立即放入4％多聚甲醛和2.5％戊二醛的磷酸缓冲液(0.1M，PH7.2)中，4℃下固定2h。
体系：4％多聚甲醛/0.5g；2.5％戊二醛/100μl；0.2M PBS/6.25ml；双蒸水/5ml(4％多聚甲醛+0.2M PBS+ddH2O先在60℃水浴锅溶解，不溶时可加NaOH，最后戊二醛固定)；
(2)4℃冰箱下操作，1％甘氨酸溶液处理30min，洗脱多余醛基，不能超过30min；
(3)4℃冰箱下操作，0.1MPBS漂洗3次，每次15min；
(4)4℃冰箱下操作，依次用30％，50％乙醇溶液脱水，每步30min；
(5)-20℃冰箱下操作，依次用50％，70％，90％，100％，100％，100％乙醇溶液脱水，每步60min，100％乙醇时注意轻轻摇动样品(建议：70％乙醇脱水完可过夜，100％乙醇时要封口)；
(6)-20℃冰箱下操作，依次用30％，70％，100％的LR-Gold渗透，每步120min，100％的LR-Gold渗透过夜，注意不断轻轻摇动样品；
(7)-20℃冰箱下操作，置换新瓶，用0.05％benzil催化的LR-Gold继续渗透6h；0.1％benzil催化的LR-Gold渗透。
(8)-20℃冰箱下操作，制作标签纸，用镊子贴于200ulpcr管内壁，先加100ulLR-Gold，挑出单只样品放入，加100ulLR-Gold；
(9)-20℃冰箱下操作，长紫外线照射聚合72h，注意每天翻动2次样品使紫外线照射均匀。
(10)聚合后的样品应及时切片，长时间放置会导致样品与包埋剂之间分离而无法切片。
(11)胶体金间接标记后，超薄切片厚90nm，载于200-300网孔的镍网上。
(12)双蒸水漂洗2min；
(13)BL封闭30min；
(14)一抗用BL稀释200倍，孵化1h；
(15)双蒸水漂洗3次，每次5min；
(16)胶体金标记抗体液用BL稀释200倍，淡红色为适宜稀释液，1h；
(17)同(15)操作；
常规染色
(18)醋酸双氧铀(50％酒精配)常温8000rpm离心3min；
(19)充分摇动10min，静置1～2天，形成自然沉淀，取上清使用，锡箔纸常温避光保存；
(20)双蒸水清洗多次，在烘烤灯下烘烤5min；
(21)柠檬酸铅溶液染5min，避免二氧化碳，铅染前用NAOH溶液洗移液管；
(22)双蒸水清洗多次，烘烤5min，存放；
(23)扫描电镜观察。
结果如图5所示，灰飞虱细胞中出现黑色小点为病毒粒子所在位置。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种水稻条纹病毒核衣壳蛋白的多克隆抗体及其制备方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 163
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Trp Asp Tyr Val Pro Gln Tyr Ile Lys Leu Glu Ser Glu Thr Ala Pro
1 5 10 15
Tyr Cys Thr Thr His Ser Leu Ser His Ile Leu Phe Val Val His Ile
20 25 30
Ile His Ser Phe Gln Ile Thr Lys Lys Thr Met Pro Glu Gly Lys Lys
35 40 45
Lys Glu Arg Gly Leu Thr Lys Asp Ile Asp Met Met Lys Tyr Thr Thr
50 55 60
Gly Leu Leu Val Ile Thr Cys Lys Ser Lys Asn Leu Ala Asp Lys Lys
65 70 75 80
Lys Glu Asp Gly Arg Lys Lys Val Leu Asp Glu Phe Ile Thr Asn Gly
85 90 95
Lys Val Lys Thr Thr Ile Phe Asp Ala Leu Ala Gly Met Ser Val Asn
100 105 110
Thr Ile Ser Thr Tyr Gly Asn Gln Thr Arg Leu Tyr Leu Ala Gln Gln
115 120 125
Ser Lys Leu Met Lys Ile Leu Ala Glu Asn Thr Ser Lys Thr Ala Ser
130 135 140
Glu Val Ser Gly Leu Val Lys Glu Phe Phe Glu Asp Glu Ala Glu Gly
145 150 155 160
Ala Asp Asp
<210> 2
<211> 492
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
tgggactatg ttccacaata tattaaactg gagagtgaaa cagctcctta ctgcacaact 60
cactccctaa gtcatatttt gtttgttgtg cacatcattc actccttcca aataaccaaa 120
aagaccatgc cagagggtaa gaagaaggag cgtggtctga caaaagacat agacatgatg 180
aagtacacaa ctggtctcct ggtcatcaca tgcaagtcaa agaacctggc tgacaagaag 240
aaggaagatg gcagaaagaa ggtcttagat gaattcatca ccaatgggaa agtgaagacc 300
acaatcttcg atgcgctggc tggtatgtct gtcaatacga tcagcactta tgggaatcag 360
acaaggctgt acttggctca acagagcaag ctgatgaaga tccttgctga gaacacttca 420
aagacagcat ctgaagtcag cgggttggtg aaggagttct tcgaggatga ggcagaaggt 480
gcagatgact ag 492
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
taggatccct agtcatctgc 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
taccatggat gtgggactat gt 22

Claims (6)

1.一种水稻条纹病毒核衣壳蛋白CP，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.编码权利要求1所述水稻条纹病毒核衣壳蛋白CP的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.一种表达权利要求1所述水稻条纹病毒核衣壳蛋白CP的重组载体，其特征在于，包括权利要求2所述的基因和初始载体。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述初始载体为pET-28a载体，所述基因重组于所述pET-28a载体的BamHI酶切位点和NcoI酶切位点之间。
5.一种表达权利要求1所述水稻条纹病毒核衣壳蛋白CP的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为转入权利要求3或4所述的重组载体的菌株。
6.根据权利要求5所述的重组菌株，其特征在于，所述菌株为大肠杆菌。
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