CN101531710B - rF1抗原及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种重组鼠疫F1(rF1)抗原及其制备方法与应用，所述的rF1抗原为带有或不带有标签的以下蛋白：(a)如SEQ ID No：2所示氨基酸序列去除N端10～21位氨基酸后的氨基酸序列组成的蛋白；或(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与(a)具有相同功能的由(a)衍生的蛋白以及专用于制备该rF1的引物、重组载体与转化体。本发明同时还涉及在制备rF1的方法中的专用引物、重组载体与转化体，以及以该rF1制成的鼠疫抗体诊断胶体金试纸条。本发明的rF1具有较好的免疫学活性，制备成的鼠疫诊断金标试纸条的敏感性高于目前使用的以天然F1为基础的试纸条。

Description

rF1抗原及其制备方法与应用

本发明基于以下受资助的课题：

国家高技术研究计划项目：《鼠疫特异性诊断新技术的建立及应用评价》，项目编号：2006AA2Z4A7。

技术领域

本发明是关于一种重组F1(rF1)抗原及其制备方法与应用，同时还涉及在制备rF1的方法中的专用引物、重组载体与转化体，以及以该rF1制成的鼠疫抗体诊断胶体金试纸条。

背景技术

鼠疫(Plague)是由耶尔森氏鼠疫杆菌(Yersinia pestis)引起的自然疫源性烈性传染病。近年来，世界鼠疫疫情呈上升趋势，世界卫生组织已将鼠疫列为重新抬头的传染病。

鼠疫免疫学检测与诊断主要是以鼠疫菌的特异性抗原——F1抗原及其抗体为基础的。F1抗原是由耶尔森氏鼠疫杆菌pMT1质粒上caf1基因编码的一种荚膜蛋白，自然状态下以单体及聚合体形式存在，其单体分子量约为15.5kD。

长期以来，制备鼠疫检测和诊断用的F1抗原都是由鼠疫菌培养获得。由于生物安全的限制，鼠疫菌的培养只能在P3实验室进行，这对F1抗原的生产带来极大的不便；而且，从鼠疫菌上提取天然的F1抗原，其纯度很难达到太高，其中含有其它菌体成份往往会造成诊断的假阳性；另一方面，鼠疫菌生产周期长，充分表达F1抗原需三天左右，对培养基营养要求也较高，菌体上F1抗原的含量也只有1％～2％；再者，从菌体上提取F1抗原也是一个比较繁琐的操作，一般需要一个星期左右。利用传统的方法，要得到1克左右的F1抗原，至少需1万元试剂费，另外需要一个工作组(5～10人)至少2个月的时间，这样由于操作过程长，多人参加，每批次的产品其免疫学活性及纯度都不可能做到一致，以致生产的鼠疫检测试剂也随之差别较大，以不同检测试剂所得的数据很难进行比较，对鼠疫检测及诊断带来不便。

现有技术中也有文献记载了F1抗原的相关克隆表达，例如刘斌等人的“鼠疫耶尔森氏菌F1抗原在酿酒酵母中的表达及鉴定”(细胞与分子免疫学杂志，2005，21(4))，王革等人的“重组鼠疫菌F1抗原在大肠杆菌中的表达及免疫原性分析”(微生物学免疫学进展，2005年第33卷第3期)，其中，是针对包含了信号肽编码序列的caf1基因(GenBank接受序列号：AL117211(85950..86462))设计引物进行扩增(刘斌等人研究中的扩增产物还包含了约100bp的非caf1基因编码序列)，制备rF1。虽然以上文献都报道制备出有生物学活性的rF1抗原，但其与天然F1抗原活性比较并未提及，也未见用其制备出鼠疫诊断试剂的有关报道。由于天然F1抗原并不包含信号肽，只有15.5kD，上述研究中克隆表达的包括信号肽或更多氨基酸的重组产物是否会影响其活性，以及其与天然F1抗原活性的差异有多大，不得而知。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种重组F1(rF1)抗原。

本发明的另一目的在于提供一种rF1抗原的制备方法，以方便、快捷、高效地制备rF1抗原。

本发明的另一目的在于提供一种专用于制备rF1的引物、重组载体与转化体。

本发明的另一目的在于提供所述rF1抗原的应用。

本发明的另一目的在于提供一种以所述rF1制成的鼠疫抗体诊断胶体金试纸条。

一方面，发明人在分析研究天然F1抗原结构特性的基础上，提供了一种新的重组F1(rF1)抗原。与GenBank中记载的caf1基因(AL117211(85950...86462))(如SEQ ID No：1所示)所编码的F1蛋白(如SEQ ID No：2所示氨基酸序列)相比，本发明的rF1抗原部分或全部去除了信号肽(如SEQ ID No：2第1～21位氨基酸序列组成的多肽)。

根据本发明的具体实施方案，本发明中的rF1抗原为带有或不带有标签的以下蛋白：

(a)如SEQ ID No：2所示氨基酸序列去除N端10～21位氨基酸后的氨基酸序列组成的蛋白；或

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与(a)具有相同功能的由(a)衍生的蛋白。

与现有技术如前述王革等人、刘斌等人的研究中记载的rF1相比，本发明的rF1部分或全部去除了所述信号肽，其构象与天然成熟的完整F1分子更相似。

根据本发明的具体实施方案，本发明的rF1抗原为按照以下方法制备得到的：

设计引物，扩增caf1基因，然后将扩增产物克隆进表达载体中，转化宿主细胞，诱导培养阳性克隆，对诱导表达产物进行收集并纯化。

即，另一方面，本发明还提供了一种制备所述rF1抗原的方法，该方法包括：

设计引物，扩增caf1基因，然后将扩增产物克隆进表达载体中，转化宿主细胞，诱导培养阳性克隆，对诱导表达产物进行收集并纯化。

本发明的caf1基因的多核苷酸序列可以依据标准的PCR扩增技术，以鼠疫基因组DNA作为模板，并选取合适的寡核苷酸引物扩增得到。这样得到的核苷酸可以克隆进合适的载体中，并用DNA分析技术进行序列描述。之后可以通过转化宿主细胞并在被转化的宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用适当的方法(如温度变动或化学物质诱导)诱导启动子，然后继续培养。培养完成后，可用离心法收集细胞，并用任何已知的方法，如冻融法、超声处理法、溶菌酶溶解法或机械破碎法破碎细胞。可以用各种已知的方法从宿主细胞培养物中回收和纯化本发明的rF1蛋白，这些方法包括硫酸铵或乙醇沉淀法、酸萃取法、超滤法、离子交换层析法、磷酸纤维层析法、疏水相互作用层析法、凝胶过滤法、亲和层析法及高压液柱层析法。本发明的rF1抗原可以是带有纯化标签的融合蛋白，也可以是切除纯化标签后的rF1蛋白。本发明中的纯化标签例如可以为HIS、GST。

本发明的rF1为去除全部或部分信号肽的rF1，在重组该rF1时，是根据部分或全部去除信号肽编码序列的caf1基因设计扩增引物，例如，可根据如SEQ ID No：1至少去除第1～30位、优选1～45位、更优选第1～60位或第1～63位核苷酸后的多核苷酸序列设计扩增引物，以此编码的rF1分别具有如SEQ ID No：2所示氨基酸序列去除N端至少10位、优选15位、更优选20或21位氨基酸后的氨基酸序列。

在本发明的一优选的具体实施方案中，是根据如SEQ ID No：1去除第1～60位以及第511～513位核苷酸后的多核苷酸序列设计扩增引物，相应编码的rF1具有如SEQ ID No：2第21～170位所示的氨基酸序列。同时，本发明所提供的专用于rF1制备方法中的扩增引物为：

F1s 5’-CGCGGATCCGCGGCAGATTTAACTGCAAGCA-3’

(SEQ ID No：3，下划线部分序列为BamH I酶切位点)，

F1a 5’-ATTTGCGGCCGCTTGGTTAGATACGGTTACGGTTACA-3’

(SEQ ID No：4，下划线部分序列为Not I酶切位点)。

本发明的上述引物可以通过Primer5进行设计，设计的原则首先是F1s与F1a的5’端固定，通过加减3’核苷酸的数目使之得到较高的评分，同时注意两条引物的Tm值尽量接近；设计好后，人工加上酶切位点序列及保护碱基。

在利用本发明的引物扩增caf1基因时，优选的扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性60s，58℃退火30s，72℃延伸20s，30个循环；72℃延伸10s。

在本发明的一具体实施例(参见实施例1)中，对所述扩增产物进行了鉴定，证实确实得到了目标caf1基因。

接下来，本发明采用一步法克隆，直接将目的序列caf1基因与表达载体连接。所述表达载体优选为质粒pET32a(+)。一步法克隆可省去传统的TC克隆步骤，更节约时间和成本。并且，本发明中，由于在所设计引物酶切位点前加了3个以上保护碱基，使PCR产物可以进行直接酶切，并进一步通过控制目的基因与表达载体的合适比例(例如摩尔比2∶1～10∶1)，可使一步法克隆有90％以上成功率。

经上述克隆步骤，本发明得到了一种重组载体，根据本发明的一具体实施方案(参见实施例2)，该重组载体是含有所述扩增得到的caf1基因的重组质粒，命名为caf1-pET32a。

然后，本发明将所述重组载体转化大肠杆菌而得到一种转化体。在本发明的一具体实施方案中，该转化体是将所述重组载体转入大肠杆菌E.coliBL21(DE3)而得到的。实验证明，该转化体能高效表达rF1抗原(参见实施例3)。

本发明还对转化大肠杆菌得到的阳性克隆进行诱导培养，以表达目的产物。根据本发明的优选具体实施方案，所述的诱导培养条件为：终浓度0.5～1.0mmol/L的IPTG，20～38℃诱导5～10h。在该诱导条件下，目的蛋白的表达量最高。

本发明的制备rF1抗原的方法，还进一步包括对诱导表达产物进行收集并纯化的步骤。在本发明的方法中，由于表达产物携带易于纯化的标签，纯化十分方便，纯度也十分高。本发明纯化后的rF1经SDS-PAGE分析，出现单一条带，纯度在99％左右。在本发明的一具体实施例(参见实施例3)中，还以此纯化的rF1制备成鼠疫诊断金标试纸条，进行了实验室及现场测试，证明利用本发明的方法得到的rF1抗原具有较好的免疫学活性，能与鼠疫天然免疫血清有较强反应，并且，本发明的rF1抗原的敏感性高于目前使用的以天然F1为基础的试纸条。

另一方面，本发明提供了所述rF1在制备鼠疫检测和/或诊断制剂中的应用，所述鼠疫检测和/或诊断制剂优选为通过免疫学方法进行抗原抗体测定的制剂。例如，所述鼠疫检测和/或诊断制剂可以为检测试剂、试纸条或试剂盒。根据本发明的一具体实施方案，所述检测和/或诊断制剂包括rF1抗原。在本发明的一更具体实施方案中(参见实施例4)，提供了一种鼠疫抗体诊断胶体金试纸条，其包含本发明所述的rF1抗原，本发明利用该试纸条对自然人群F1抗体阳性与阴性人的血清进行免疫印迹分析，具有较高的免疫学活性和灵敏性。

综上所述，本发明的技术具有以下有益效果：本发明针对去信号肽编码序列的鼠疫caf1基因设计了特定的引物进行PCR扩增，并利用原核表达技术，克隆表达去信号肽的完整鼠疫F1，所表达的rF1携带易于纯化的标签，纯化十分方便，纯度也十分高；本发明的rF1是以单体存在，每个分子都能充分暴露自己的表位，因此敏感性高于天然F1抗原；本发明的表达完整F1的克隆子具有高效表达、可溶性好(参见图3显示的表达菌体诱导后全菌蛋白电泳分析结果)、免疫反应性强的特点，经Quantity one灰度扫描，表达蛋白占全菌蛋白的50％左右，按此计算，生产1克rF1抗原只需要2克左右的菌体(1L培养液)，同样生产1克F1抗原，只需1人2～3天左右，且质控很容易，由于使用同一菌株、单人短时间操作，避免了不同批次的产品差异，以此开发的诊断试剂将会为我国鼠疫诊断提供可靠的基础。

附图说明

图1为本发明实施例1中PCR扩增去信号肽编码序列的caf1基因的扩增产物的电泳图。其中，泳道1：去信号肽编码序列的caf1基因PCR扩增产物；泳道2：分子量标准。

图2为实施例2中重组质粒caf1-pET32a(+)双酶切电泳图。其中，泳道1：质粒pET32a(+)以BamH I单酶切；泳道2：质粒caf1-pET32a(+)以BamHI单酶切；泳道3：质粒caf1-pET32a(+)以BamH I与NotI双酶切；泳道4：分子量标准。

图3显示实施例3中转化体BL21-rF1诱导表达产物的SDS-PAGE分析结果。其中，泳道a1，b1：分子量标准；泳道a2：转化体BL21-rF1诱导表达后的全菌蛋白；泳道a3：转化体BL21-rF1诱导表达后的菌体裂解后上清；泳道b2：转化体BL21-rF1诱导表达后的菌体裂解后上清经Ni柱纯化后产物。

图4显示实施例3中纯化rF1抗原的免疫印迹分析结果。其中，标注1+：免疫印迹时加的抗体为阳性鼠疫免疫兔血清；标注1-：免疫印迹时加的抗体为免疫前兔血清；标注24：免疫印迹时加的抗体为浙江F1抗体阳性人血清；标注B1：免疫印迹时加的抗体为浙江正常人血清。

图5显示以rF1抗原构建的金标试纸条测定鼠疫免疫兔血清结果。其中，兔1～兔4是指用来检测的兔血清做不同倍数稀释，依次为1∶1000，1∶2000，1∶4000，1∶8000稀释，兔5为阴性血清。试纸条自上而下为：质控线，天然F1抗原线，rF1抗原线。

具体实施方式

为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，例如参见Sambrook等人的《分子克隆实验指南》(第三版)(Cold Spring Harbor Lab(CSHL)Press，2001)中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。

实施例1、鼠疫caf1基因的获取

1材料和方法

鼠疫菌DNA模板：28℃培养鼠疫EV76过夜，取少许(接种环一环)研磨于装有1ml去离子水的1.5ml离心管；轻轻振荡混悬，12000rpm离心1min(Eppendorf，5415D)，弃上清，以1ml去离子水重新悬浮，重复1-2次该步骤；将重悬好的菌液置于沸水中煮沸5min，12000rpm离心取上清，即为鼠疫DNA模板。

PCR相关试剂(其中Taq酶使用高保真的Ex Taq酶(TaKaRa))及超薄DNA产物纯化试剂盒(TIANGEN，离心柱型，目录号：DP203)。

2方法

2.1引物设计

根据耶尔森氏鼠疫杆菌(Yersinia pestis)caf1基因序列(NCBI：AL117211 85950..86462)，并去除其部分信号编码序列(SEQ ID No：1的第1～60位核苷酸)及终止密码子(SEQ ID No：1的第511～513位核苷酸TAA)，设计5’端正义引物F1s和3’端反义引物F1a，设计的原则首先是F1s与F1a的5’端确定，通过加减3’核苷酸的数目使之得到较高的评分，同时注意两条引物的Tm值尽量接近；设计好后，人工加上酶切位点序列及保护碱基，其中在正义引物引入BamH I酶切位点，在反义引物引入Not I酶切位点：

F1s 5’-CGCGGATCCGCGGCAGATTTAACTGCAAGCA-3’

(SEQ ID NO：3，下划线部分序列为BamH I酶切位点)，

F1a 5’-ATTTGCGGCCGCTTGGTTAGATACGGTTACGGTTACA-3’

(SEQ ID NO：4，下划线部分序列为Not I酶切位点)。

引物委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

2.2PCR扩增caf1基因

应用鼠疫菌DNA模版及上述引物进行聚合酶链式反应(PCR)，扩增caf1基因。其中，PCR扩增体系为25μl：10×PCR缓冲液2.5μl，dNTP 0.5μl，DNA模板1μl，F1s、F1a引物各0.5μl(20μmol/L)，Ex Taq酶(5U/μl)0.5μl，ddH₂O 18.5μl。PCR条件：95℃预变性5min；95℃变性60s，58℃退火30s，72℃延伸20s，30个循环；72℃延伸10s。

2.3PCR产物回收与纯化

PCR扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为110V桓压30min，全自动凝胶成像仪拍照。合并4管上述PCR扩增产物以DNA纯化试剂盒进行纯化，操作按说明书进行。

3结果

扩增产物的电泳图请参见图1所示，结果显示扩增产物片段长度近500bp，与理论片段(471bp)相符。

实施例2、含caf1基因重组质粒的构建及鉴定

1材料和方法

1.1材料

菌株及质粒：

表达质粒：pET32a(+)(购自Merk公司)；感受态菌株E.coli BL21(DE3)(购自天根生化科技(北京)有限公司)。

分子生物学主要试剂：Ex Taq酶(TaKaRa BIOTECH)，限制性内切酶BamHI、NotI(promega公司)，T4DNA连接酶(promega公司)；超薄DNA产物纯化试剂盒(TIANGEN，离心柱型，目录号：DP203)；高纯度质粒小提试剂盒(TIANGEN，离心柱型，目录号：DP104)。液体LB培养基及含氨苄青霉素的LB固体培养基(含Amp 100μg/ml)。

2方法

2.1纯化的PCR产物与质粒pET32a(+)的双酶切

将实施例1中得到的纯化的caf1基因PCR扩增产物与质粒pET32a(+)分别用BamHI与NotI双酶切，酶切体系为30μl，其中10×D缓冲液3μl，PCR产物或质粒pET32a(+)18μl，BamHI、NotI各1μl，加ddH₂O至终体积30μl，37℃金属浴3h。

2.2连接

将上PCR酶切产物及pET32a(+)酶切产物分别用DNA纯化试剂盒及质粒小提试剂盒纯化，将纯化后的酶切caf1基因PCR产物与酶切后的pET32a(+)经核酸定量后，按4∶1的摩尔比例混合，加入T4 DNA连接酶(按T4连接酶使用说明进行)，22℃进行连接反应3h。

2.3转化

①从深低温冰箱(-80℃)取出感受态细胞，迅速置入碎冰中(0～-5℃)，静置2～5min，使细胞解冻；

②取10μl上述连接反应产物加到100μl宿主菌感受态细胞中，轻轻用吸头吹打，以混匀内容物，然后冰中静置30min；

③从冰中取出后，迅速置入42℃水浴中热激90s，注意不要操作要轻；

④热激完成后，快速将管重新放回冰浴中，静置3～5min；

⑤从冰浴中取出，然后向其中加500μl液体LB培养基(最好水浴预热至37℃)，混匀后，转移到37℃摇床上，75rpm，温育45min至1h。

⑥取150～200μl培养液均匀涂于LB固体培养基(含Amp 100μg/ml)表面，将平板置于室温直至液体被吸收后，倒置平皿于37℃温箱培养过夜。

2.4 caf1-pET32a重组质粒的鉴定

将长出的克隆，进行菌落PCR鉴定，具体步骤如下：从LB固体培养基(含Amp 100μg/ml)上选取若干(一般为8至10个)单菌落，用接种环挑选单菌落，提取DNA模板并进行针对目标基因的PCR检测(PCR反应液参考实施例1)；做菌落PCR鉴定时，应设置一个阳性和阴性对照。

将阳性克隆者接种于5ml含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB液体培养基中，37℃，220r/min培养过夜，用质粒小提试剂盒提取质粒，操作按说明书进行。

2.5 caf1-pET32a重组质粒的酶切鉴定

以质粒提取试剂盒提取阳性质粒，对重组质粒进行酶切鉴定，即以BamHI单酶切pET32a及caf1-pET32a进行比对，以BamHI、NotI对重组质粒caf1-pET32a进行双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳观察结果。

2.6 caf1-pET32a重组质粒中caf1基因序列测定

将3～5个酶切正确的caf1-pET32a重组质粒送上海生工进行caf1基因序列测定，对序列与参考序列完全一致者进行下一步诱导表达。

3实验结果

caf1-pET32a重组质粒的酶切鉴定结果见图2，其中，以BamHI单酶切pET32a及caf1-pET32a进行比对，后者要比前者片段大500bp左右，说明后者在质粒pET32a中确有序列插入；以BamHI、NotI双酶切重组质粒caf1-pET32a进行比对，切出了两个片段，其中较大片段约5000bp，与质粒pET32a相近，较小片段约500bp与目的的caf1基因片段大小一致。说明去信号肽编码序列的caf1基因已成功地通过BamH I与NotI酶切位点连接于表达质粒pET32a(+)中了，caf1-pET32a重组质粒构建成功。

实施例3、rF1的表达和检测

1材料与设备

含有重组质粒caf1-pET32a(caf1基因序列测定正确)E.coli BL21，IPTG(1M/L)，含氨苄青霉素的LB固体及液体培养基(含Amp 100μg/ml)，用于SDS-PAGE的全套试剂及设备，用于免疫印迹分析的全套试剂及设备，温控摇床等。

鼠疫免疫兔血清：刮取37℃培养48h的鼠疫EV76，研磨于生理盐水中，定菌浓度至7亿/ml，56℃水浴1h灭活备用。

初免：1ml/只，皮下多点；20天后加强免疫，0.5ml/只，皮下多点，共加强3次；末次免疫15天后，采血测定效价(金标法)，效价达1∶1000以上的备用。

鼠疫病人血清：采自青海，血凝效价1∶160。

正常人血清及正常兔血清。

2实验方法

2.1目的基因的诱导表达

挑一个含重组质粒caf1-pET32a(caf1基因序列测定正确)E.coli BL21单克隆，接种于5ml液体LB培基，37℃振动培育3h左右(菌液OD600值达到0.8～1.0时)，向菌液中加入2.5μl左右的IPTG(1M/L)(IPTG终浓度为0.5mmol/L左右)，继续37℃振动培育4h左右，取菌液进行如下鉴定。

2.2用于分析rF1抗原表达状态样品的制备

分别吸取1ml菌液于2个离心管，12000rpm离心2min收集的菌体，以0.01M，pH7.4 PBS洗菌体两次，以50μlPBS(0.01M，pH7.4)分别悬浮菌体并以震荡器混匀。其中一管中加入50μl2×SDS凝胶上样缓冲液，用吸管混匀，100℃水浴煮沸5min，用于全菌蛋白分析样品。另一管中加入5μl10×BugBuster^TM裂解液(Merk公司)，室温下缓慢摇动30min，将裂解后的菌液12000rpm离心5min，分离上清和沉淀部分，上清中加入等体积2×SDS-PAGE上样缓冲液，沉淀先以50μl PBS(0.01M，pH7.4)分别悬浮混匀，然后50μl 2×SDS凝胶上样缓冲液，此两样品作为分析重组蛋白存在状态样品。

2.3样品SDS-PAGE分析

分别取5μl左右上述制备样品进行SDS-PAGE分析(12％的分离胶，5％的浓缩胶)，恒压电泳，先在80V下电泳30～40min，待溴酚蓝指示条带进入分离胶，将电压调高至120V，继续电泳约120min，直至溴酚蓝前端到达凝胶底部。取出凝胶，将之浸没在盛有1％考马斯亮蓝R250染色液(乙醇50％，ddH₂O 40％，冰醋酸10％，1％考马斯亮蓝R250)的托盘中，染色30min以上或过夜。然后将凝胶置于脱色液中(乙醇50％，d₂H₂O 40％，冰醋酸10％)脱色约90min，直至背景无色，拿到凝胶成像仪下作成像分析。

2.4表达产物的纯化

采用Ni柱(His SpinTrap，GE)进行纯化，操作按其说明进行。将纯化产物上SDS-PAGE电泳鉴定。

2.5表达产物进行Western Blot分析

将纯化后的rF1以1.5mg/ml喷涂于硝酸纤维素膜(NC膜)，将膜放入封闭液(TBST+5％脱脂奶粉)，缓摇4℃封闭过夜；用含0.1％Tween的TBST冲洗3次，每次5min，加入1∶100被试血清(鼠疫免疫兔血清，正常兔血清，鼠疫病人血清及正常人血清)，室温温和摇动孵育60min；取出NC膜用0.1％Tween的TBST冲洗30次，每次5min，中间换液一次，至1∶2000二抗反应液(HRP-SPA)(购自中彬生化)室温缓摇90min，洗膜后二氨基联苯胺(6mgDAB、10μlH₂O₂、PBS(0.01M，pH7.4)10ml)显色5min。

3实验结果

转化体BL21-rF1诱导表达产物的SDS-PAGE分析结果见图3，从图中可以看出，转化体BL21-rF1经IPTG诱导可以高效表达rF1抗原，且该抗原大部分以可溶形式存在，表达产物经Ni柱纯化后得到了高纯度的rF1抗原，该rF1抗原是与纯化标签HIS结合的融合蛋白，分子量在35KD左右。

纯化rF1抗原的免疫印迹分析见图4，该免疫印迹图说明，纯化rF1抗原与鼠疫F1抗体阳性血清有良好的反应，而与鼠疫F1抗体阴性血清无反应。

实施例4：利用rF1制备检测鼠疫胶体金试纸条

1实验材料

528份人血清标本：采自浙江，浙江省疾病预防控制中心提供

粗制天然F1抗原(购自青海省疾病预防控制中心)，纯化rF1抗原(制备方法见实施例1、2、3，其为带有纯化标签的融合蛋白)

兔阴性血清及兔抗F1血清：制备方法见实施例3

胶体金试纸条制备相关全套试剂及设备。

2方法

2.1免疫层析试纸条的制备采用直径为40nm的胶体金，将SPA(金葡萄球菌A蛋白)进行标记；同时将纯化后的rF1抗原及粗制天然F1抗原以1.5mg/ml浓度喷划于NC膜上，作为抗鼠疫抗体捕捉物；按常规组装成检测鼠疫抗体免疫层析试纸条。

2.2免疫层析试纸条的使用方法取被检样本(血清)10μl，以生理盐水行10倍稀释，混匀后，将该稀释液用滴管逐滴加入试纸条检测孔，15min后观察结果。

2.3试纸条实验室质控将本实验室制备的兔抗F1血清分别做1∶1000，1∶2000，1∶4000，1∶8000的稀释，同时将兔阴性血清做1∶10稀释，分别滴加于制成的胶体金试纸条，15min后观测结果。

2.4对现场血清标本的检测采用该试纸条对分别对采自浙江的528份人血清标本进行检测，以评价该试纸条对现场材料的检测效果及评价rF1抗原与粗制天然F1抗原检测现场标本的效果对比。

3结果

3.1试纸条实验室质控结果请参见图5所示，从图中可以看出，天然F1抗原线的显色带较宽，而利用本发明rF1的rF1抗原线较窄，在阳性兔血清1∶8000稀释时，天然F1抗原线已看不清，而rF1抗原线仍可识别，说明本发明的rF1抗原较天然F1抗原用于检测时的敏感度更高。对于阴性兔血清，两条检测线都未显色，说明两者特异性均好，本发明的rF1抗原与天然F1抗原有相近的免疫学活性。

3.2本实施例中胶体金试纸条对采自浙江的血清的检测结果请参见表1。

表1试纸条对采自浙江人群血清测试结果

*：经血凝试验证实为阴性。

对528份血清标本的检测中，共有天然F1检测线阳性8(1.5％)份，rF1检测线阳性13(2.5％)份；其中两者共同阳性为5份(1.0％)，共同检测阴性512份(97.0％)。经一致性检测，两者的符合率为97.9％(κ＝0.466)，有较好的一致性。

序列表

<110>中国疾病预防控制中心传染病预防控制所

<120>rF1抗原及其制备方法与应用

<130>GAI09CN0367C

<160>4

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>513

<212>DNA

<213>耶尔森氏鼠疫杆菌(Yersinia pestis)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(513)

<400>1

atg aaa aaa atc agt tcc gtt atc gcc att gca tta ttt gga act att    48

Met Lys Lys Ile Ser Ser Val Ile Ala Ile Ala Leu Phe Gly Thr Ile

1               5                   10                  15

gca act gct aat gcg gca gat tta act gca agc acc act gca acg gca    96

Ala Thr Ala Asn Ala Ala Asp Leu Thr Ala Ser Thr Thr Ala Thr Ala

            20                  25                  30

act ctt gtt gaa cca gcc cgc atc act ctt aca tat aag gaa ggc gct    144

Thr Leu Val Glu Pro Ala Arg Ile Thr Leu Thr Tyr Lys Glu Gly Ala

        35                  40                  45

cca att aca att atg gac aat gga aac atc gat aca gaa tta ctt gtt    192

Pro Ile Thr Ile Met Asp Asn Gly Asn Ile Asp Thr Glu Leu Leu Val

    50                  55                  60

ggt acg ctt act ctt ggc ggc tat aaa aca gga acc act agc aca tct    240

Gly Thr Leu Thr Leu Gly Gly Tyr Lys Thr Gly Thr Thr Ser Thr Ser

65                  70                  75                  80

gtt aac ttt aca gat gcc gcg ggt gat ccc atg tac tta aca ttt act    288

Val Asn Phe Thr Asp Ala Ala Gly Asp Pro Met Tyr Leu Thr Phe Thr

                85                  90                  95

tct cag gat gga aat aac cac caa ttc act aca aaa gtg att ggc aag    336

Ser Gln Asp Gly Asn Asn His Gln Phe Thr Thr Lys Val Ile Gly Lys

            100                 105                 110

gat tct aga gat ttt gat atc tct cct aag gta aac ggt gag aac ctt    384

Asp Ser Arg Asp Phe Asp Ile Ser Pro Lys Val Asn Gly Glu Asn Leu

        115                 120                 125

gtg ggg gat gac gtc gtc ttg gct acg ggc agc cag gat ttc ttt gtt    432

Val Gly Asp Asp Val Val Leu Ala Thr Gly Ser Gln Asp Phe Phe Val

    130                 135                 140

cgc tca att ggt tcc aaa ggc ggt aaa ctt gca gca ggt aaa tac act    480

Arg Ser Ile Gly Ser Lys Gly Gly Lys Leu Ala Ala Gly Lys Tyr Thr

145                 150                 155                 160

gat gct gta acc gta acc gta tct aac caa taa                        513

Asp Ala Val Thr Val Thr Val Ser Asn Gln

                165                 170

<210>2

<211>170

<212>PRT

<213>耶尔森氏鼠疫杆菌(Yersinia pestis)

<400>2

Met Lys Lys Ile Ser Ser Val Ile Ala Ile Ala Leu Phe Gly Thr Ile

1               5                   10                  15

Ala Thr Ala Asn Ala Ala Asp Leu Thr Ala Ser Thr Thr Ala Thr Ala

            20                  25                  30

Thr Leu Val Glu Pro Ala Arg Ile Thr Leu Thr Tyr Lys Glu Gly Ala

        35                  40                  45

Pro Ile Thr Ile Met Asp Asn Gly Asn Ile Asp Thr Glu Leu Leu Val

    50                  55                  60

Gly Thr Leu Thr Leu Gly Gly Tyr Lys Thr Gly Thr Thr Ser Thr Ser

65                  70                  75                  80

Val Asn Phe Thr Asp Ala Ala Gly Asp Pro Met Tyr Leu Thr Phe Thr

                85                  90                  95

Ser Gln Asp Gly Asn Asn His Gln Phe Thr Thr Lys Val Ile Gly Lys

            100                 105                 110

Asp Ser Arg Asp Phe Asp Ile Ser Pro Lys Val Asn Gly Glu Asn Leu

        115                 120                 125

Val Gly Asp Asp Val Val Leu Ala Thr Gly Ser Gln Asp Phe Phe Val

    130                 135                 140

Arg Ser Ile Gly Ser Lys Gly Gly Lys Leu Ala Ala Gly Lys Tyr Thr

145                 150                 155                 160

Asp Ala Val Thr Val Thr Val Ser Asn Gln

                165                 170

<210>3

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>3

cgcggatccg cggcagattt aactgcaagc a                                      31

<210>4

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4

atttgcggcc gcttggttag atacggttac ggttaca                                37

Claims (9)

1.一种rF1抗原，该rF1抗原为带有标签的以下蛋白：

如SEQ ID No：2第21～170位所示氨基酸序列组成的蛋白。

2.根据权利要求1所述的rF1抗原，该rF1抗原为按照以下方法制备得到的：

设计引物，扩增caf1基因，然后将扩增产物克隆进表达载体中，转化宿主细胞，诱导培养阳性克隆，对诱导表达产物进行收集并纯化。

3.根据权利要求1所述的rF1抗原，其中，所述标签为HIS标签或GST标签。

4.一种制备权利要求1～3任一项所述rF1抗原的方法，该方法包括：

设计引物，进行扩增，然后将扩增产物克隆进表达载体中，转化宿主细胞，诱导培养阳性克隆，对诱导表达产物进行收集并纯化。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，根据SEQ ID No：1第61～510位所示多核苷酸序列设计引物；所述引物具有如SEQ ID No：3与SEQ IDNo：4所示多核苷酸序列。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其中，将扩增产物与pET32a连接，得到重组质粒caf1-pET32a，然后转化大肠杆菌。

7.根据权利要求4所述的方法，其中，所述诱导培养条件为：

终浓度0.5～1.0mmol/L的IPTG，20～38℃诱导5～10h。

8.权利要求1～3任一项所述rF1抗原在制备鼠疫检测和/或诊断制剂中的应用，所述鼠疫检测和/或诊断制剂为通过免疫学方法进行抗原抗体测定的制剂。

9.一种鼠疫抗体诊断胶体金试纸条，其包含权利要求1～3任一项所述的rF1抗原。

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