CN101533024B - 耶尔森氏鼠疫杆菌Caf1M蛋白的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了耶尔森氏鼠疫杆菌Caf1M蛋白的应用，具体是耶尔森氏鼠疫杆菌Caf1M蛋白在制备鼠疫检测和/或诊断制剂中的应用。本发明同时还提供了一种鼠疫检测和/或诊断制剂，其包括耶尔森氏鼠疫杆菌Caf1M蛋白。本发明还涉及一种重组Caf1M蛋白及其制备方法，以及所述制备过程中所设计的引物、及重组载体与转化体。本发明为鼠疫的检测和/或诊断提供了一种新的辅助手段。

Description

耶尔森氏鼠疫杆菌Caf1M蛋白的应用

本发明基于以下受资助的课题：

国家高技术研究计划项目：《鼠疫特异性诊断新技术的建立及应用评价》，项目编号：2006AA2Z4A7。

技术领域

本发明涉及耶尔森氏鼠疫杆菌Caf1M蛋白的应用，具体是涉及Caf1M蛋白在制备鼠疫检测和/或诊断制剂中的应用。

背景技术

鼠疫(Plague)是由耶尔森氏鼠疫杆菌(Yersinia pestis)引起的自然疫源性烈性传染病，是一个古老却迄今仍严重威胁人类的传染病，其席卷全球的三次大流行，夺走了数亿人们的生命。近年来，世界鼠疫疫情呈上升趋势，世界卫生组织已将鼠疫列为重新抬头的传染病，因此鼠疫的威胁依然存在，一旦暴发，那将是人类的灾难。

鼠疫免疫检测是鼠疫防治工作中的一个重要环节，其在鼠疫的发现、疫区处理及临床诊断中发挥至关重要的作用。回顾鼠疫免疫检测的历史，主线是围绕F1抗原的历史。F1抗原是由耶尔森氏鼠疫杆菌pMT1质粒上caf1基因编码的一种荚膜蛋白。

长期以来，F1抗原被认为是鼠疫杆菌的特异性抗原，基于F1的检测抗体的方法被认为是较可信的鼠疫检测和诊断方法。然而，2003年，在正常的自然人群中发现了F1抗体阳性者，其中最高滴度的F1抗体为1∶2560，对以F1抗原为基础的检测鼠疫抗体的方法提出了挑战。自然人群F1抗体阳性血清的发现，是F1抗原的一种交叉反应(或位点交叉反应)，还是真正鼠疫感染而引起的，都迫切需要一种鼠疫其它组分进行检测和诊断。

另一方面，自然界已发现存在天然缺失F1抗原的鼠疫菌株，现行方法针对于单一F1检测的方法就有漏诊的可能性。加之，F1抗原是一种温度调控表达抗原，在37℃时大量表达，而在28℃时不予表达或微量表达，这也限制了它的应用研究范围。蚤作为鼠疫的一种主要传播媒介，其体温度是28℃，在此温度下F1抗原几乎不表达，因此现有的基于F1的检测和诊断方法不能用于蚤体的检测；在鼠疫的检测中，自然界的标本中，尤其在尸体标本上，其温度不可能在37℃，这也解释了在一些检测中，从鼠体上分离到了鼠疫菌，而IHA等免疫学方法呈阴性的现象。因此，发展除F1抗原外的检测和诊断技术称为必要，将是鼠疫防治工作中的一个重要课题。

Caf1M蛋白是鼠疫F1抗原的伴侣蛋白，也为鼠疫pMT1质粒编码。编码Caf1M蛋白的基因(NCBI：NC_003134(82567..83343)(Yersinia pestisCO92))序列及所编码的Caf1M蛋白(Swiss-Prot：P26926)序列请参见SEQID No：1与SEQ ID No：2所示。Caf1M蛋白属于非ATP依赖的周质伴侣家族，该家族蛋白在革兰氏病原体中与外膜一起装配并分泌纤维样粘附物。它帮助折叠和转运鼠疫F1荚膜的Caf1亚单位。在周质中，Caf1M依靠给活化的Caf1加上大量的疏水表面阻止亚单位聚集(Anton V.Zavialov andStefan D.Knight A novel self-capping mechanism controls aggregation ofperiplasmic chaperone Caf1M.Molecular Microbiology(2007)64(1)，153-164)。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种除F1抗原外的检测和/或诊断鼠疫的方法，以辅助检测和/或诊断鼠疫。

本发明的另一目的在于提供一种除F1抗原外的检测和/或诊断鼠疫的候选抗原。

本发明的另一目的在于提供所述的除F1抗原外的检测和/或诊断鼠疫的候选抗原的应用，及所述候选抗原的制备方法。

本发明的另一目的在于提供一种以所述候选抗原为基础的检测和/或诊断制剂。

本发明通过免疫蛋白组学，首先寻找并确定了20多种候选诊断蛋白进行克隆表达，然后通过对这20余种重组蛋白进一步分析鉴定(参见实施例1)，发现Ca1M蛋白对正常兔血清及鼠疫全菌免疫兔血清的反应存在明显差别，从而提出Ca1M蛋白是一种具有潜在诊断价值的蛋白，可以作为除F1抗原外的检测和/或诊断鼠疫的候选抗原。

从而，一方面，本发明提供了耶尔森氏鼠疫杆菌Caf1M蛋白的新应用，更具体地说，本发明提供了耶尔森氏鼠疫杆菌Caf1M蛋白在制备鼠疫检测和/或诊断制剂中的应用。所述的检测和/或诊断鼠疫包括辅助检测和/或诊断鼠疫。

在本发明的具体实施方案中，所述Caf1M蛋白为带有或未带有标签的下述蛋白：

(a)如SEQ ID No：2至少第21～258位所示的氨基酸序列组成的蛋白；或

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与(a)具有相同功能的由(a)衍生的蛋白。

本发明所述的Caf1M蛋白优选为去除全部或部分信号肽的Caf1M蛋白，例如，其氨基酸序列为如SEQ ID No：2所示氨基酸序列去除N端10～20位氨基酸后的序列；在本发明的一最优选的具体实施方案中，所述Caf1M蛋白为去除了全部信号肽的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No：2第21～258位所示，共具有238个氨基酸。

本发明中，所述Caf1M蛋白编码基因为编码所述Caf1M蛋白的多核苷酸序列，优选具有如SEQ ID No：1至少第61～774位所示的多核苷酸序列。在本发明的一最优选的实施方案中，所述caf1M基因为去信号肽编码序列的caf1M基因，其编码序列如SEQ ID No：1第61～774位所示，该编码序列全长714个核苷酸。

根据本发明的一具体实施方案，本发明的Caf1M蛋白编码基因的多核苷酸序列可以依据标准的PCR扩增技术，以基因组DNA作为模板，并选取合适的寡核苷酸引物扩增得到。这样得到的核苷酸可以克隆进合适的载体中，并用DNA分析技术进行序列描述。本发明的Caf1M蛋白可以通过常规方法获得，例如通过转化宿主细胞并在被转化的宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用适当的方法(如温度变动或化学物质诱导)诱导启动子，然后继续培养。培养完成后，可用离心法收集细胞，并用任何已知的方法，如冻融法、超声处理法、溶菌酶溶解法或机械破碎法破碎细胞。可以用各种已知的方法从宿主细胞培养物中回收和纯化本发明的Caf1M蛋白，这些方法包括硫酸铵或乙醇沉淀法、酸萃取法、超滤法、离子交换层析法、磷酸纤维层析法、疏水相互作用层析法、凝胶过滤法、亲和层析法及高压液柱层析法。

根据本发明的一具体实施方案，所述Caf1M蛋白为重组Caf1M蛋白(rCaf1M)。在本发明的一更具体的实施方案中，所述rCaf1M是按照以下方法制备得到的未去除或去除纯化标签后的蛋白：

设计引物，PCR扩增caf1M基因，然后克隆进载体中，转化宿主细胞，诱导培养阳性克隆，对诱导表达产物进行收集并纯化。

根据本发明的一更具体的实施方案，本发明在制备重组Caf1M蛋白时，设计了专用于扩增caf1M基因的引物，该引物是针对去信号肽编码序列的caf1M基因的全长(即如SEQ ID No：1所示多核苷酸序列的第61～774位)进行扩增，本发明的引物具体为：

caf1M-S 5’CATGCCATGGGCGAACTCTGCTCAACCAGATA-3’

(参见SEQ ID No：3所示，下划线部分序列为Nco I酶切位点)，

caf1M-A 5’-CCGCTCGAGTAAAGTCACATTTTTGGA ATACA-3’

(参见SEQ ID No：4所示，下划线部分序列为Xho I酶切位点)。

根据本发明的具体实施方案，在利用所述引物PCR扩增caf1M基因时，优选的扩增条件为：

95℃预变性5min；95℃变性60s，58℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸5min。

在本发明的一具体实施例(参见实施例2)中，对所述扩增产物进行了鉴定，证实确实得到了目的caf1M基因全长序列。

根据本发明的一优选实施方案，本发明接下来采用一步法克隆，直接将扩增产物(目的caf1M基因序列)与表达载体连接。所述表达载体优选为质粒pGEX4t-1。一步法克隆可省去传统的TC克隆步骤，更节约时间和成本。

经上述克隆步骤，本发明得到了一种重组载体，根据本发明的一具体实施方案，该重组载体是含有所述caf1M基因的重组质粒，命名为caf1M-pGEX4t-1。

然后，本发明将所述重组载体转化宿主细胞而得到一种转化体。在本发明的一具体实施方案中，该转化体是将所述重组载体转入大肠杆菌E.coliBL21(DE3)而得到的。实验证明，该转化体能高效表达Caf1M蛋白(参见实施例4)。

本发明还对转化大肠杆菌得到的阳性克隆进行诱导培养，以表达目的产物。根据本发明的优选具体实施方案，所述的诱导培养条件为：终浓度0.1～1.0mmol/L的IPTG，24℃～38℃诱导1～10h。在该诱导条件下，目的蛋白的表达量最高。

本发明在制备rCaf1M时，还进一步包括对诱导表达产物进行收集并纯化的步骤。

在本发明的一具体实施例(参见实施例4)中，还对所制备得到的表达产物进行Western Blot分析，证明利用本发明的方法得到的rCaf1M具有较好的免疫学活性，能与鼠疫天然免疫血清有较强反应。

另一方面，本发明还提供了所述的鼠疫检测和/或诊断制剂，其可以为任何用于检测和/或诊断、或者辅助检测和/或诊断鼠疫的制剂，优选为通过免疫学方法进行抗原抗体测定的制剂。例如，所述鼠疫检测和/或诊断制剂可以为检测试剂、试纸条或试剂盒。根据本发明的一具体实施方案，所述检测和/或诊断制剂包括Ca1M蛋白。在本发明的一更具体实施方案中(参见实施例5)，提供了一种喷涂有rCaf1M蛋白的NC膜，并对自然人群F1抗体阳性与阴性人的血清进行免疫印迹分析，F1抗体阳性人群中对其反应阳性，而阴性人血清反应阴性。

由上述内容可知，本发明同时还提供了一种rCaf1M蛋白及其制备方法，本发明同时还提供了一种针对去信号肽编码序列鼠疫caf1M基因设计的特定引物(参见SEQIDNO：3与SEQIDNO：4所示)，本发明还提供了以该引物进行PCR扩增的方法以及扩增得到的caf1M基因，本发明还提供了以所述扩增产物制备得到的重组质粒caf1M-pGEX4t-1以及将该重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)而构建得到的转化体BL21-rCaf1M。本发明中，由于采用去信号肽编码序列的caf1M基因进行重组Caf1M蛋白的表达，重组Caf1M蛋白具有较好的抗原性，以此纯化的重组Caf1M蛋白喷制NC膜或吸附于其他载体材料，通过免疫学方法进行抗原抗体测定。

综上所述，本发明首次提出了利用Caf1M蛋白进行鼠疫辅助检测和/或诊断，为鼠疫的检测和/或诊断提供了一种新的手段，本发明的技术是对以F1抗原为主的鼠疫检测和/或诊断的有益补充。

附图说明

图1显示本发明实施例1中对鼠疫24个克隆表达蛋白的免疫学评价结果。其中，膜a和膜b所喷涂的蛋白相同，膜c和膜d所喷涂的蛋白相同，NC膜上喷涂的蛋白具体如下：1：PMT054；2：YPO1293；3：rF1；4：蛋白编号4；5：YPO3842；6：Caf1M；7：YOPN；8：YP_pMT054；9：YPO1635；10：YPO2093；11：YPMT1.05C；12：YPO2090；13：天然F1；14：YPO2174；15：YPO2301；16：YPO2877；17：YPO3141；18：YPPCP1.04；19：F1C；20：F1N；21：YPPCP1.06；22：YP3209；23：Caf1A；24：YPO0388；25：YPO3903；26：天然F1。

图2为去信号肽编码序列的caf1M基因PCR电泳图。其中，泳道1：去信号肽编码序列的caf1M基因PCR扩增产物；泳道2：分子量标准。

图3为重组质粒caf1M-pGEX4t-1双酶切电泳图。其中，泳道1：质粒pGEX4t-1以Xho I单酶切；泳道2：重组质粒caf1M-pGEX4t-1以Xho I单酶切；泳道3：重组质粒caf1M-pGEX4t-1以NcoI与Xho I双酶切；泳道4：分子量标准。

图4显示转化体BL21-rCaf1M诱导表达产物的SDS-PAGE分析结果。其中，泳道a：分子量标准；泳道b：转化体BL21-rCaf1M诱导前全菌蛋白；泳道c：转化体BL21-rCaf1M诱导表达后的全菌蛋白；泳道d：转化体BL21-rCaf1M诱导表达后的菌体裂解后沉淀；泳道e：转化体BL21-rCaf1M诱导表达后的菌体裂解后上清；泳道f：转化体BL21-rCaf1M诱导表达后的菌体裂解后上清经GST纯化柱纯化后产物。

图5显示纯化重组Caf1M的免疫印迹分析结果。其中，NC膜上喷涂的蛋白具体为：①表达菌裂解上清；②裂解沉淀(以8M尿素溶解)；③纯化后的重组Caf1M蛋白；④天然F1抗原。a、b、c、d分别代表进行免疫印迹分析时所加的血清标本具体如下的膜：a：免疫印迹时加的抗体为阳性鼠疫免疫兔血清；b：免疫印迹时加的抗体为免疫前兔血清；c：免疫印迹时加的抗体为F1阳性人血清；d：免疫印迹时加的抗体为正常人血清。

图6显示重组Caf1M蛋白对人群血清的应用评价结果。其中，所有NC膜上自上而下喷涂物分别为重组Caf1M蛋白和天然F1抗原。上面6条NC膜进行免疫印迹分析时分别加6份正常人血清，下面6条NC膜进行免疫印迹分析时分别加6份F1抗体阳性人血清。

具体实施方式

为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，例如参见Sambrook等人的《分子克隆实验指南》(第三版)(Cold Spring Harbor Lab(CSHL)Press，2001)中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。

实施例1鼠疫24种重组蛋白的免疫学评价

实验材料：

申请人按照所属领域常规操作克隆并纯化的鼠疫24种重组蛋白，分别是：PMT054，YPO1293，rF1，蛋白编号4，YPO3842，Caf1M，YOPN，YP_pMT054，YPO1635，YPO2093，YPMT1.05C，YPO2090，YPO2174，YPO2301，YPO2877，YPO3141，YPPCP1.04，F1 C端多肽(24aa)，F1 N端多肽(35aa)，YPPCP1.06，YP3209，Caf1A，YPO0388，YPO3903；

天然F1，购自青海省疾病预防控制中心地方病预防控制所；

鼠疫全菌免疫兔血清：刮取37℃培养48h的鼠疫EV76，研磨于生理盐水中，定菌浓度至7×10⁸cfu/ml，56℃水浴1h灭活备用。初免：1ml/只，皮下多点；20天后加强免疫，0.5ml/只，皮下多点，共加强3次；末次免疫15天后，采血测定效价(金标法)，效价达1∶1000以上的备用。

实验方法：

1.将上述重组蛋白经紫外分光光度计定量后，分别以1.5mg/ml的浓度、1μl/cm的量喷涂于NC膜(Millipore 135)，37℃干燥过夜。

2.将上述喷涂有蛋白的NC膜以5％脱脂牛奶封闭过夜。

3.以PBST(pH7.4，0.01M，含0.1％Tween-20)洗膜三次。

4.分别加正常兔血清及鼠疫全菌免疫兔血清(1∶100)，37℃反应1h。

5.以PBST(pH7.4，0.01M，含0.1％Tween-20)洗膜三次。

6.加辣根过氧化物酶标记SPA(1∶1000)，37℃反应1h。

7.以PBST(pH7.4，0.01M，含0.1％Tween-20)洗膜三次。

8.将膜放入二氨基联苯胺(6mg DAB、10μl H₂O₂、PBS(0.01M，pH7.4)10ml)显色液中显色5min左右。

9.将膜取出，以d₂H₂O冲洗，晾干后以扫描仪扫描结果。

实验结果：

本实施例中鼠疫24种重组蛋白的免疫印迹分析结果请参见图1，其中，在免疫印迹实验时，膜a与膜c加的血清为兔正常血清(免疫前血清)，膜b和膜d加的是鼠疫全菌免疫兔血清(免疫后血清)。从图中可以看出，其中rF1(重组F1抗原)，编号为4的蛋白及Ca1M蛋白对正常兔血清及鼠疫全菌免疫兔血清的反应存在明显差别，是具有潜在诊断价值的蛋白。

实施例2、鼠疫caf1M基因的获取

1材料和试剂

鼠疫菌DNA模板：28℃培养鼠疫EV76过夜，取少许(接种环一环)研磨于装有1ml去离子水的1.5ml离心管；轻轻振荡混悬，12000rpm离心1min(Eppendorf，5415D)，弃上清，以1ml去离子水重新悬浮，重复1～2次该步骤；将重悬好的菌液置于沸水中煮沸5min，12000rpm离心取上清，即为鼠疫DNA模板；

PCR相关试剂(其中Taq酶使用高保真的Ex Taq酶(TaKaRa))；

超薄DNA产物纯化试剂盒(TIANGEN，离心柱型，目录号：DP203)。

2制备方法

2.1引物设计

根据耶尔森氏鼠疫杆菌(Yersinia pestis)caf1M基因序列(NCBI：NC_003134(Yersinia pestis CO92))，并去除其信号序列(如SEQ ID No：1第1～60位所示核苷酸序列)以及终止密码子(TGA)，(目标扩增基因核苷酸序列如SEQ ID No：1第61～774位所示，共714bp)设计5’端正义引物caf1M-S和3’端反义引物caf1M-A，设计的原则首先是caf1M-S与caf1M-A的5’端确定，通过加减3’核苷酸的数目使之得到较高的评分，同时注意两条引物的Tm值尽量接近；设计好后，人工加上酶切位点序列及保护碱基，本发明中，在正义引物引入NcoI酶切位点，在反义引物引入XhoI酶切位点，本发明所设计的引物如下：

caf1M-S 5’-CATGCCATGGGCGAACTCTGCTCAACCAGATA-3’

(SEQ ID No：3，下划线部分序列为Nco I酶切位点)，

caf1M-A 5’-CCGCTCGAGTAAAGTCACATTTTTGGA ATACA-3’

(SEQ ID No：4，下划线部分序列为Xho I酶切位点)。

引物委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

2.2PCR扩增caf1M基因

应用鼠疫菌DNA模版及上述引物进行聚合酶链式反应(PCR)，扩增caf1M基因。其中，PCR扩增体系为25μl：10×PCR缓冲液2.5μl，dNTP 0.5μl，DNA模板1μl，caf1M-S、caf1M-A引物各0.5μl(20μmol/L)，Ex Taq酶(5U/μl)0.5μl，d₂H₂O 18.5μl。PCR条件：95℃预变性5min；95℃变性60s，58℃退火30s，72℃延伸40s，共30个循环；最后72℃延伸5min。

2.3PCR产物回收与纯化

PCR扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为110V恒压30min，全自动凝胶成像仪拍照。合并上述4管PCR扩增产物以DNA纯化试剂盒进行纯化，操作按说明书进行。

3结果

去信号肽编码序列的caf1M基因PCR电泳结果如图2所示，从图中可以看出，PCR扩增得到接近750bp一个条带，与理论片段(733bp)相符。

实施例3、含caf1M基因重组质粒的构建及鉴定

1材料及试剂

菌株及质粒：

表达质粒：pGEX4t-1(Novagen)；感受态菌株E.coli BL21(DE3)等(天根生化)。

分子生物学主要试剂：

Ex Taq酶、限制性内切酶NcoI与Xho I(均购自Takara)，T4 DNA连接酶(promega公司)；超薄DNA产物纯化试剂盒(TIANGEN，离心柱型，目录号：DP203)；高纯度质粒小提试剂盒(TIANGEN，离心柱型，目录号：DP104)。液体LB培养基及含氨苄青霉素的LB固体培养基(含Amp100μg/ml)。

2方法

2.1纯化PCR产物与质粒pGEX4t-1的双酶切

将实施例1中得到的纯化的caf1M基因PCR扩增产物与质粒pGEX4t-1分别用Nco I与Xho I双酶切，酶切体系为30μl，其中10×K缓冲液3μl，PCR产物或质粒pGEX4t-1 18μl，Nco I与Xho I各1μl，加d₂H₂O至终体积30μl，37℃金属浴3h。

2.2连接

将上述PCR酶切产物及pGEX4t-1酶切产物分别用DNA纯化试剂盒及质粒小提试剂盒纯化，将纯化后的酶切caf1M基因PCR产物与酶切后的质粒pGEX4t-1经核酸浓度定量后，按4∶1的摩尔比例混合，加入T4 DNA连接酶(按T4连接酶使用说明进行)，22℃ 3h进行连接反应。

2.3转化

①从深低温冰箱(-80℃)取出感受态细胞，迅速置入碎冰中(0～-5℃)，静置2～5min，使细胞解冻；

②取10μl上述连接反应产物加到100μl宿主菌感受态细胞中，轻轻用吸头吹打，以混匀内容物，然后冰中静置30min；

③从冰中取出后，迅速置入42℃水浴中热激90s，注意操作要轻；

④热激完成后，快速将管重新放回冰浴中，静置3～5min；

⑤从冰浴中取出，然后向其中加500μl液体LB培养基(最好水浴预热至37℃)，混匀后，转移到37℃摇床上，75rpm，温育45min至1h。

⑥取150～200μl培养液均匀涂于LB固体培养基(含Amp 100μg/ml)表面，将平板置于室温直至液体被吸收后，倒置平皿于37℃温箱培养过夜。

2.4重组质粒caf1M-pGEX4t-1的鉴定

将长出的克隆进行菌落PCR鉴定，具体步骤如下：从LB固体培养基(含Amp 100μg/ml)上选取若干(一般为8至10个)单菌落，用接种环挑取单菌落，提取DNA模板并进行针对目标基因的PCR检测(PCR反应液参考实施例1)；做菌落PCR鉴定时，应设置一个阳性和阴性对照。

将阳性克隆接种于5ml含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB液体培养基中，37℃，220r/min培养过夜，用质粒小提试剂盒提取质粒，操作按说明书进行。

2.5重组质粒caf1M-pGEX4t-1的酶切鉴定

以质粒提取试剂盒提取阳性质粒，对重组质粒进行酶切鉴定，即以XhoI对pGEX4t-1及caf1M-pGEX4t-1行单酶切，以NcoI与Xho I对重组质粒caf1M-pGEX4t-1进行双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳观察结果。

2.6重组质粒caf1M-pGEX4t-1中caf1M基因序列测定

将3～5个酶切正确的caf1M-pGEX4t-1重组质粒送上海生工进行caf1M基因序列测定，将序列与参考序列完全正确者进行下一步诱导表达。

3实验结果

重组质粒caf1M-pGEX4t-1的酶切鉴定结果请参见图3，其中，以Xho I单酶切pGEX4t-1及caf1M-pGEX4t-1进行比对，后者(泳道2)要比前者(泳道1)分子量大700bp左右，说明后者在质粒pGEX4t-1中确有序列插入；以NcoI与Xho I双酶切重组质粒caf1M-pGEX4t-1(泳道3)进行比对，切出了两个片段，其中较大片段约5000bp，与质粒pGEX4t-1相近，较小片段约700bp，与目的caf1M基因片段大小一致。该电泳图说明，去信号肽编码序列的Caf1M基因已成功地通过NcoI与Xho I酶切位点连接于表达质粒pGEX4t-1中了。caf1M-pGEX4t-1重组质粒构建成功。

实施例4、重组鼠疫Caf1M蛋白的表达和检测

1材料与设备

含有重组质粒caf1M-pGEX4t-1(caf1M基因序列测定正确)的E.coliBL21，IPTG(1M/L)，含氨苄青霉素的LB固体及液体培养基(含Amp100μg/ml)，用于SDS-PAGE的全套试剂及设备，用于免疫印迹分析的全套试剂及设备，温控摇床等。

鼠疫免疫兔血清：刮取37℃培养48h的鼠疫EV76，研磨于生理盐水中，定菌浓度至7×10⁸cfu/ml，56℃水浴1h灭活备用。初免：1ml/只，皮下多点；20天后加强免疫，0.5ml/只，皮下多点，共加强3次；末次免疫15天后，采血测定效价(金标法)，效价达1∶1000以上的备用。

鼠疫病人血清：采自青海，血凝效价1∶160。

正常人血清及正常兔血清：正常人血清为采自健康人的血清，没有鼠疫感染历史，且经常规方法检测鼠疫抗体阴性；正常兔血清采自健康新西兰兔。

2实验方法

2.1目的基因的诱导表达

挑一个含重组质粒caf1M-pGEX4t-1(插入的caf1M基因序列测定正确)E.coli BL21单克隆，接种于5ml液体LB培基，37℃振动培育3h左右(菌液OD600值达到0.8～1.0时)，向菌液中加入2.5μl左右的IPTG(1M/L)(IPTG终浓度为0.5mmol/L左右)，继续37℃振动培育4h左右，取菌液进行如下分析鉴定。

2.2用于分析rCaf1M蛋白表达状态样品的制备

分别吸取1ml菌液于2个离心管，12000rpm离心2min收集菌体，以0.01M、pH7.4PBS洗菌体两次，以50μl PBS(0.01M，pH7.4)分别悬浮菌体并以震荡器混匀。其中一管中加入50μl 2×SDS凝胶上样缓冲液，用吸管混匀，100℃水浴煮沸5min，用于全菌蛋白分析样品。另一管中加入5μl10×BugBuster^TM裂解液(Merk公司)，室温下缓慢摇动30min，将裂解后的菌液12000rpm离心5min，分离上清和沉淀部分，上清中加入等体积的2×SDS-PAGE上样缓冲液，沉淀先以50μl PBS(0.01M，pH7.4)分别悬浮混匀，然后50μl 2×SDS凝胶上样缓冲液，此两样品作为分析重组蛋白存在状态样品。

2.3样品SDS-PAGE分析

分别取5μl左右上述用于分析重组Caf1M蛋白表达状态的制备样品进行SDS-PAGE分析(12％的分离胶，5％的浓缩胶)，恒压电泳，先在80V下电泳30～40min，待溴酚蓝指示条带进入分离胶，将电压调高至120V，继续电泳约120min，直至溴酚蓝前端到达凝胶底部。取出凝胶，将之浸没在盛有1％考马斯亮蓝R250染色液(乙醇50％，d₂H₂O 40％，冰醋酸10％，1％考马斯亮蓝R250)的托盘中，染色30min以上或过夜。然后将凝胶置于脱色液中(乙醇20％，d₂H₂O 70％，冰醋酸10％)脱色约90min，直至背景无色，拿到凝胶成像仪下作成像分析。

2.4表达产物的纯化

采用GST纯化柱(GST SpinTrap，GE)进行纯化，操作按其说明书进行。将纯化产物上SDS-PAGE电泳鉴定。

2.5表达产物进行Western Blot分析

将表达菌裂解上清、裂解沉淀(以8M尿素溶解)及纯化后的重组Caf1M以1.5mg/ml喷涂于硝酸纤维素膜(NC膜)，将膜放入封闭液(TBST+5％脱脂奶粉)，40rpm缓摇，4℃封闭过夜；用含0.1％ Tween的TBST冲洗3次，每次5min，加入1∶100被试血清(鼠疫免疫兔血清，正常兔血清，鼠疫病人血清及正常人血清)，室温温和摇动孵育60min；取出NC膜用0.1％Tween的TBST冲洗30次，每次5min，中间换液一次，至1∶2000二抗反应液(HRP-SPA)(中彬生化)室温缓摇90min，洗膜后以二氨基联苯胺(6mgDAB、10μl H₂O₂、PBS(0.01M，pH7.4)10ml)显色5min。

3实验结果

转化体BL21-rCaf1M诱导表达产物的SDS-PAGE分析结果请参见图4，从图中可以看出，转化体BL21-rCaf1M经IPTG诱导可以高效表达重组rCaf1M抗原(泳道c)，该抗原部分以可溶形式存在，部分以包涵体形成存在，上清部分经GST纯化柱纯化后得到了较高纯度的重组rCaf1M蛋白(泳道f)，该重组rCaf1M蛋白是与纯化标签GST结合的融合蛋白(GST-Caf1M)，分子量在55KD(标签26KD，Caf1M 28.751KD)左右。

表达菌裂解上清、裂解沉淀(以8M尿素溶解)及纯化后的重组Caf1M的免疫印迹分析结果请参见图5。从该免疫印迹图可以看出，三者都与鼠疫免疫兔血清及F1抗体阳性人血清有良好的反应，而与正常兔血清及正常人血清无反应。

实施例5重组Caf1M蛋白(rCaf1M)对正常人群血清的应用评价

实验材料：

重组Caf1M蛋白(纯化的GST-Caf1M)及天然F1；NC膜(Millipore 135)。

正常人群血清12份，其中包括选取的F1抗体阳性血清6份(血凝测定1∶40以上)，正常人血清6份。

实验方法：

1.将重组Caf1M蛋白与天然F1经紫外分光光度计定量后，分别以1.5mg/ml的浓度、1μl/cm的量喷涂于NC膜(Millipore 135)，37℃干燥过夜。

2.将上述喷涂有蛋白的NC膜以5％脱脂牛奶封闭过夜。

3.以PBST(pH7.4，0.01M，含0.1％Tween-20)洗膜三次。

4.分别被试血清行1∶100稀释，将膜置入血清稀释液，37℃反应1h。

5.弃血清稀释液，以PBST(pH7.4，0.01M，含0.1％Tween-20)洗膜三次。

6.加辣根过氧化物酶标记SPA(1∶1000)，37℃反应1h。

7.以PBST(pH7.4，0.01M，含0.1％Tween-20)洗膜三次。

8.将膜放入二氨基联苯胺(6mgDAB、10μlH₂O₂、PBS(0.01M，pH7.4)10ml)显色液中显色5min左右。

9.将膜取出，以d₂H₂O冲洗，晾干后以扫描仪扫描结果。

实验结果：

免疫印迹分析请参见图6所示，其中，所有NC膜上自上而下喷涂物分别为重组Caf1M蛋白和天然F1抗原。进行免疫印迹分析时，上面6条NC膜分别加6份正常人血清，下面6条NC膜分别加6份F1抗体阳性人血清。从图中可以看出，重组Caf1M蛋白对其中3份F1抗体阳性人血清有明显反应(自左到右第3、4、6)，另3份F1抗体阳性人血清显色较弱；而对正常人血清都只有略微背景显色。该结果表明，重组Caf1M蛋白可以作为鼠疫的一种检测和/或诊断(如辅助检测和/或诊断)用抗原。

长期以来，鼠疫的血清学诊断是以F1作为唯一靶点的诊断方式，然而一旦该检测受到质疑时(如无临床症状)，急需另一个诊断靶点进行验证。本发明的研究发现与鼠疫F1抗原分泌相关的Caf1M蛋白也是鼠疫特异的一种蛋白，且在鼠疫感染兔血清中也发现其相应抗体存在，本发明同时对浙江F1抗体阳性及阴性正常人血清进行了对比检测，发现F1抗体阳性人血清中或多或少存在着Caf1M蛋白抗体，从而支持了浙江F1抗体阳性系为接触鼠疫相关菌引起的观点。

序列表

<110>中国疾病预防控制中心传染病预防控制所

<120>耶尔森氏鼠疫杆菌Caf1M蛋白的应用

<130>GAI09CN0370C

<160>4

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>777

<212>DNA

<213>耶尔森氏鼠疫杆菌(Yersinia pestis)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(777)

<400>1

atg att tta aat aga tta agt acg tta gga att att act ttc ggc atg    48

Met Ile Leu Asn Arg Leu Ser Thr Leu Gly Ile Ile Thr Phe Gly Met

1               5                   10                  15

ctt agt ttt gct gcg aac tct gct caa cca gat atc aaa ttc gca agc    96

Leu Ser Phe Ala Ala Asn Ser Ala Gln Pro Asp Ile Lys Phe Ala Ser

            20                  25                  30

aaa gag tat ggc gtg act ata ggt gag agt agg atc ata tac ccg tta    144

Lys Glu Tyr Gly Val Thr Ile Gly Glu Ser Arg Ile Ile Tyr Pro Leu

        35                  40                  45

gat gct gct ggc gtt atg gtc tcg gtg aaa aac acc caa gat tat ccg    192

Asp Ala Ala Gly Val Met Val Ser Val Lys Asn Thr Gln Asp Tyr Pro

    50                  55                  60

gtt ctc att cag tct agg atc tac gac gag aat aaa gaa aaa gaa tca    240

Val Leu Ile Gln Ser Arg Ile Tyr Asp Glu Asn Lys Glu Lys Glu Ser

65                  70                  75                  80

gag gat cct ttc gtg gtc act ccg cca ttg ttt cga ttg gat gct aag    288

Glu Asp Pro Phe Val Val Thr Pro Pro Leu Phe Arg Leu Asp Ala Lys

                85                  90                  95

caa caa aat tct ttg cgt ata gct cag gct gga ggt gtt ttc ccg cga    336

Gln Gln Asn Ser Leu Arg Ile Ala Gln Ala Gly Gly Val Phe Pro Arg

            100                 105                 110

gat aaa gag agc cta aag tgg tta tgc gta aaa ggg att cca cca aag    384

Asp Lys Glu Ser Leu Lys Trp Leu Cys Val Lys Gly Ile Pro Pro Lys

        115                 120                 125

gat gaa gat ata tgg gtt gat gat gcg aca aat aag caa aaa ttc aat    432

Asp Glu Asp Ile Trp Val Asp Asp Ala Thr Asn Lys Gln Lys Phe Asn

    130                 135                 140

cca gac aaa gat gtg gga gtg ttc gtg caa ttc gca att aat aat tgc    480

Pro Asp Lys Asp Val Gly Val Phe Val Gln Phe Ala Ile Asn Asn Cys

145                 150                 155                 160

att aag ctt ttg gtt cga ccg aat gaa tta aaa gga acc cct ata cag    528

Ile Lys Leu Leu Val Arg Pro Asn Glu Leu Lys Gly Thr Pro Ile Gln

                165                 170                 175

ttt gct gaa aac tta agc tgg aaa gtt gat ggg ggg aag cta att gct    576

Phe Ala Glu Asn Leu Ser Trp Lys Val Asp Gly Gly Lys Leu Ile Ala

            180                 185                 190

gaa aac ccc tca cct ttc tac atg aac ata ggt gaa tta aca ttt gga    624

Glu Asn Pro Ser Pro Phe Tyr Met Asn Ile Gly Glu Leu Thr Phe Gly

        195                 200                 205

ggg aaa agt att cct tct cac tat att cca cct aaa tcg acg tgg gct    672

Gly Lys Ser Ile Pro Ser His Tyr Ile Pro Pro Lys Ser Thr Trp Ala

    210                 215                 220

ttt gat ttg cca aaa gga cta gcg gga gca cgt aat gtt tcg tgg aga    720

Phe Asp Leu Pro Lys Gly Leu Ala Gly Ala Arg Asn Val Ser Trp Arg

225                 230                 235                 240

ata att aat gat cag gga ggg ttg gat cgt ttg tat tcc aaa aat gtg    768

Ile Ile Asn Asp Gln Gly Gly Leu Asp Arg Leu Tyr Ser Lys Asn Val

                245                 250                 255

act tta tga                                                        777

Thr Leu

<210>2

<211>258

<212>PRT

<213>耶尔森氏鼠疫杆菌(Yersinia pestis)

<400>2

Met Ile Leu Asn Arg Leu Ser Thr Leu Gly Ile Ile Thr Phe Gly Met

1               5                   10                  15

Leu Ser Phe Ala Ala Asn Ser Ala Gln Pro Asp Ile Lys Phe Ala Ser

            20                  25                  30

Lys Glu Tyr Gly Val Thr Ile Gly Glu Ser Arg Ile Ile Tyr Pro Leu

        35                  40                  45

Asp Ala Ala Gly Val Met Val Ser Val Lys Asn Thr Gln Asp Tyr Pro

    50                  55                  60

Val Leu Ile Gln Ser Arg Ile Tyr Asp Glu Asn Lys Glu Lys Glu Ser

65                  70                  75                  80

Glu Asp Pro Phe Val Val Thr Pro Pro Leu Phe Arg Leu Asp Ala Lys

                85                  90                  95

Gln Gln Ash Ser Leu Arg Ile Ala Gln Ala Gly Gly Val Phe Pro Arg

            100                 105                 110

Asp Lys Glu Ser Leu Lys Trp Leu Cys Val Lys Gly Ile Pro Pro Lys

        115                 120                 125

Asp Glu Asp Ile Trp Val Asp Asp Ala Thr Asn Lys Gln Lys Phe Asn

    130                 135                 140

Pro Asp Lys Asp Val Gly Val Phe Val Gln Phe Ala Ile Asn Asn Cys

145                 150                 155                 160

Ile Lys Leu Leu Val Arg Pro Asn Glu Leu Lys Gly Thr Pro Ile Gln

                165                 170                 175

Phe Ala Glu Asn Leu Ser Trp Lys Val Asp Gly Gly Lys Leu Ile Ala

            180                 185                 190

Glu Asn Pro Ser Pro Phe Tyr Met Asn Ile Gly Glu Leu Thr Phe Gly

        195                 200                 205

Gly Lys Ser Ile Pro Ser His Tyr Ile Pro Pro Lys Ser Thr Trp Ala

    210                 215                 220

Phe Asp Leu Pro Lys Gly Leu Ala Gly Ala Arg Asn Val Ser Trp Arg

225                 230                 235                 240

Ile Ile Asn Asp Gln Gly Gly Leu Asp Arg Leu Tyr Ser Lys Asn Val

                245                 250                 255

Thr Leu

<210>3

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>3

catgccatgg gcgaactctg ctcaaccaga ta                                     32

<210>4

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4

ccgctcgagt aaagtcacat ttttggaata ca                                     32

Claims (9)

1.鼠疫耶尔森氏菌Caf1M蛋白在制备鼠疫检测和/或诊断制剂中的应用；

其中，所述Caf1M蛋白为带有或未带有标签的下述蛋白：

如SEQ ID No：2第21～258位所示的氨基酸序列组成的蛋白。

2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述Caf1M蛋白为按照以下方法制备得到的未去除或去除纯化标签后的蛋白：

设计引物，PCR扩增caf1M基因，然后克隆进表达载体中，转化宿主细胞，诱导培养阳性克隆，对诱导表达产物进行收集并纯化。

3.根据权利要求2所述的应用，其中，所述用于扩增caf1M基因的引物为：

caf1M-S  5’-CATGCCATGGGCGAACTCTGCTCAACCAGATA-3’

caf1M-A  5’-CCGCTCGAGTAAAGTCACATTTTTGGAATACA-3’。

4.根据权利要求2所述的应用，其中，所述扩增条件为：

95℃预变性5min；95℃变性60s，58℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸5min。

5.根据权利要求2所述的应用，其中，将扩增得到的caf1M基因与pGEX4t-1连接，得到重组质粒caf1M-pGEX4t-1，然后转化宿主细胞。

6.根据权利要求2所述的应用，其中，所述诱导培养条件为：

终浓度0.1～1.0mmol/L的IPTG，24℃～38℃诱导1～10h。

7.根据权利要求1所述的应用，其中，所述鼠疫检测和/或诊断制剂为通过免疫学方法进行抗原抗体测定的制剂。

8.根据权利要求1所述的应用，其中，所述鼠疫检测和/或诊断制剂为喷涂有Caf1M蛋白的NC膜。

9.一种鼠疫检测和/或诊断制剂，其包括鼠疫耶尔森氏菌Caf1M蛋白，所述Caf1M蛋白为带有或未带有标签的下述蛋白：

如SEQ ID No：2第21～258位所示的氨基酸序列组成的蛋白。

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