CN104845981A - 田鼠巴贝虫Bm1524抗原及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种分离的基因，其序列如SEQ ID NO：3所示。本发明还提供了一种田鼠巴贝虫Bm1524抗原蛋白，由上述的分离的基因编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。本发明还提供了一种抗体，它特异性的结合上述的一种田鼠巴贝虫Bm1524抗原蛋白。本发明通过田鼠巴贝虫Bm1524抗原的表达纯化，已进一步建立了高特异性和敏感性的田鼠巴贝虫病诊断方法，可应用于田鼠巴贝虫的科研和防治等不同方面；本发明的疫苗具有预防田鼠巴贝虫感染的效果。本发明的试剂盒和胶体金免疫层析试条还可以用来检测田鼠巴贝虫。

Description

田鼠巴贝虫Bm1524抗原及其应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种寄生虫田鼠巴贝虫，具体来说是一种田鼠巴贝虫Bm1524抗原及其应用。

背景技术

1957年，南斯拉夫报道了首例人体巴贝虫病的确诊病例。随后，欧洲多个国家和美国相继报道了多例人体巴贝虫病，亚洲的日本、中国大陆和台湾地区、非洲的南非和埃及也出现了少量的病例。巴贝虫病是由寄生于脊椎动物红细胞的巴贝虫感染引起，是一种由蜱传播的人兽共患病。目前，已被鉴定可导致人体巴贝虫病的巴贝虫，包括田鼠巴贝虫(Babesia microti)和分歧巴贝虫(Babesiadivergens)为主的等少数几种巴贝虫科(Babesiidae)原虫。

人一般通过带虫蜱的叮咬或临床输入无症状感染者所献血液导致感染。该病的临床症状表现不一，多为无症状的隐性感染，少数病例以发热、溶血、贫血、脾肿大为主要临床表现，脾切除、年老和免疫功能低下者易罹患严重感染，甚至发生死亡。

统计表明：美国近20年，以田鼠巴贝虫为主的人体巴贝虫病呈暴发流行趋势。在我国巴贝虫病属于新发寄生虫病，近年来，时有人体感染病例报道。临床医生由于缺乏相关认知，该病易被忽视而导致严重后果。因此，建立快速、准确的诊断方法是预防和控制巴贝虫病的重要手段。

目前，田鼠巴贝虫病的诊断技术主要包括病原、分子生物学和免疫学诊断技术。病原诊断包括血液涂片显微镜检查和动物接种分离技术。镜检仍是诊断田鼠巴贝虫病的金标准，但在低密度原虫血症的情况下易漏诊。动物接种的方法敏感性高，但耗时(数周以上)且昂贵，无法满足快速检测的需求。分子生物学技术是通过PCR方法扩增田鼠巴贝虫特异性DNA片段，具有较高的敏感性和特异性，但对实验室设备技术要求较高，另外，对无症状感染者有时也无法得出阳性结果。免疫学诊断技术中，间接免疫荧光试验作为目前唯一标准化的田鼠巴贝虫检测方法，其应用受特殊设备和专业人员操作的限制。ELISA方法近年来也被用于田鼠巴贝虫病的检测，其中，BmSA1是目前文献报道中诊断效果最好的抗原之一，然而，其与恶性疟原虫存在一定的交叉反应。因此，寻找诊断效果更好的田鼠巴贝虫抗原是提高ELISA检测效果的关键。

对已报道的田鼠巴贝虫的诊断抗原进行生物信息学分析，发现大部分抗原具有完整或不完整的串联重复多肽，并且为分泌性蛋白，即同时含有信号肽序列。如，BmP94、BmIRA、BMN1-8、BmSA1、BMN1-17和BMN1-2等抗原。

发明内容

本发明的目的在于提供一种田鼠巴贝虫Bm1524抗原及其应用，所述的这种田鼠巴贝虫Bm1524抗原及其应用解决了现有技术中诊断田鼠巴贝虫疾病的抗原及方法灵敏度不高的技术问题。

本发明提供了一种分离的基因，其序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明还提供了一种田鼠巴贝虫Bm1524抗原蛋白，由上述的分离的基因编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明还提供了一种抗体，它特异性的结合上述的一种田鼠巴贝虫Bm1524抗原蛋白。

进一步的，所述的抗体为单克隆抗体。

本发明还提供了一种载体，所述载体含有编码上述的一种田鼠巴贝虫Bm1524抗原的基因。

本发明还提供了一种宿主细胞，所述的细胞含有上述的载体，或者所述的细胞用编码上述的一种田鼠巴贝虫Bm1524抗原的基因转化或转染。

本发明还提供了一种疫苗，包括上述的一种分离的基因、或者上述的一种田鼠巴贝虫Bm1524抗原蛋白、或者上述的抗体、或者上述的载体。

本发明还提供了上述的一种分离的基因在制备治疗、诊断或者预防田鼠巴贝虫病的药物中的应用。

本发明还提供了上述的田鼠巴贝虫Bm1524抗原蛋白在制备治疗、诊断或者预防田鼠巴贝虫病的药物中的应用。

本发明还提供了上述的抗体在制备治疗、诊断或者预防田鼠巴贝虫病的药物中的应用。

本发明还提供了上述的疫苗在制备治疗、或者预防田鼠巴贝虫病的药物中的应用。

本发明还提供了一种试剂盒，含上述的一种分离的基因、上述的田鼠巴贝虫Bm1524抗原蛋白、或者上述的抗体。

本发明还提供了一种重组蛋白，含有SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列。

进一步的，上述的一种重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：6或者SEQID NO：8所示。

本发明还提供了一种胶体金免疫层析试条，含有上述的重组蛋白。

本发明还提供了一种抗体，它特异性的结合上述的重组蛋白。

本发明还提供了一种试剂盒，含有上述的重组蛋白、或者上述的抗体。

本文中的术语“载体”，是指本领域中常用的细菌质粒、酵母质粒及其它各种病毒载体。本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达用的载体(原核表达载体)、在酵母中表达用的载体(如毕赤酵母载体)、在哺乳动物细胞中表达用的载体(逆转录病毒载体、腺病毒载体等)。在一优选实施方式中，所述表达载体为大肠杆菌表达载体。本领域技术人员可利用DNA重组技术等一系列技术，构建含本发明所述编码融合蛋白的DNA序列、合适的转录和翻译调控序列、启动子及选择性标记基因等特定元件的表达载体。上述载体可用来转化、转染合适的宿主细胞，以便获得所需要的融合蛋白。

本发明的宿主细胞可以是原核细胞，也可以是真核细胞，如，细菌细胞、哺乳动物细胞等。宿主细胞在转化或转染含本发明所述编码融合蛋白的基因序列后，即构成工程化细胞或细胞株，可用于生产所需融合蛋白。本领域技术人员能够恰当地选择适当的载体、宿主细胞，并熟知如何将载体高效地转化或转染入宿主细胞中，所用方法包括但不限于：氯化钙法、电穿孔法用于细菌细胞，脂质体包裹、电融合法用于哺乳动物细胞等真核细胞。

本发明的宿主细胞可以通过常规方法培养、诱导来表达所需要的融合蛋白，包括发酵过程和纯化工艺。上述表达的蛋白可在细胞内、细胞膜上或分泌到细胞周质、细胞外。根据需要，可利用融合蛋白的物理的、化学的以及其它生物学特性，进行分离纯化。方法包括但不限于：裂菌，离心，盐析，分子筛色谱，离子交换色谱，吸附色谱，反向色谱，以及常规的变性、复性处理等，这些方法均是本领域技术人员所熟知的。

本发明以串联重复多肽和信号肽的双重特征，搜索红内期的田鼠巴贝虫转录组数据；同时通过免疫学方法鉴定，发现了一个新的田鼠巴贝虫抗原—Bm1524。本发明为田鼠巴贝虫病的诊断提供了新技术和手段。通过田鼠巴贝虫Bm1524抗原的表达纯化，已进一步建立了高特异性和敏感性的田鼠巴贝虫病诊断方法；并易制备多/单克隆抗体，可应用于田鼠巴贝虫的科研和防治等不同方面；本发明的疫苗具有预防田鼠巴贝虫感染的效果。本发明的试剂盒和胶体金免疫层析试条还可以用来检测田鼠巴贝虫。

附图说明：

图1为田鼠巴贝虫总RNA与mRNA的琼脂糖凝胶电泳图，M为DNA标志物，1为总RNA，2为mRNA。

图2为串联重复序列示意图，GEG为完全重复的序列。

图3为信号肽预测结果。

图4为Isotig01524的blastp序列比对分析图。

图5为Bm1524基因的RTPCR结果图，M：DNA Marker；1-2：RTPCR产物。

图6为pET28a-Bm1524C Rosetta(DE3)重组蛋白的表达鉴定图。

图7为pET28a-Bm1524C Rosetta(DE3)重组蛋白变性方式纯化12％聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

图8为pET28a-Bm1524S BL21(DE3)重组蛋白的表达鉴定图。

图9是pET28a-Bm1524S BL21(DE3)重组蛋白非变性方式纯化12％聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

图10为Bm1524C重组蛋白ELISA法检测鼠血清特异性抗体散点图。

图11为Bm1524S重组蛋白ELISA法检测鼠血清特异性抗体散点图。

图12为Bm1524S-胶体金免疫层析试条检测鼠血清结果，上排为正常鼠血清的检测结果，下排为田鼠巴贝虫感染鼠血清的检测结果。

具体实施方式：

实施例1 田鼠巴贝虫的收集

田鼠巴贝虫选用中国医学科学院实验动物学研究所提供的Babesia microtiPRA-99^TM虫株。经腹腔注射田鼠巴贝虫，接种BALB/c小鼠，约4天后，原虫血症感染率达20％，抗凝取全血。使用Percoll密度梯度离心将白细胞和红细胞分层，除去白细胞。加入红细胞裂解液裂解红细胞，离心后收集沉淀，通过镜检确定为巴贝虫虫体。

实施例2 mRNA的分离纯化：

用Invitrogen公司TRIzol试剂提取田鼠巴贝虫总RNA，按Oligitex mRNASpin-Column Kit试剂盒说明书方法，从总RNA中分离纯化mRNA。并通过琼脂糖凝胶电泳和紫外分析测定，检测mRNA的质量(如图1所示)。

实施例3 田鼠巴贝虫的转录组测序及分析：

该转录组的测序和分析由上海欧易生物医学科技有限公司完成。使用Clontech公司SMART cDNA Library construction Kit试剂盒，构建测序的SMARTcDNA文库。使用罗氏454测序仪完成大规模转录组测序。

对取得的转录组的原始数据进行预处理，去除接头序列和引物序列，去除低质量和短长度序列。获得处理后的序列共708175个。

使用Newbler软件(2.6版本)对上述处理后序列的进行拼接，设置“Useduplicate reads”，“Extend low depth overlaps”，“Minimus read length”为45bp，“Reads limited to one contig”，“Single ACE file”，最终组装为9377个Isotig和23088个Singlets。

实施例4 候选抗原基因的寻找：

对转录组的9377个Isotig和23088个Singlets，首先使用Tandem RepeatsFinder软件(3.3.0.0版本)寻找串联重复序列，参数设定：“Alignment Parameters[match，mismatch，indel]”为2,7,7；“Minimum Alignment Score To Report Repeat”为50；“Maximum Period Size”为2000。随后将Minimum Alignment Score To ReportRepeat值大于50的cDNA序列，使用NCBI的Open Reading Frame Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)寻找开放阅读框序列；最后将氨基酸序列使用SignalP 4.1软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测是否含有信号肽序列。

使用上述策略，在田鼠巴贝虫转录组中共发现8个组装序列含有串联重复序列和信号肽序列结构，其中，Isotig01524序列经blast比对，为一新颖的基因。该序列全长1720bp，63-1376bp为开放阅读框，Isotig01524的核苷酸序列如SEQID NO：1所示。Isotig01524推导的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

通过Tandem Repeats Finder软件分析(结果见表1)，Isotig01524序列共有2组串联重复序列，第一组位于1121-1341bp，重复单元为15bp(即5个aa，推导的氨基酸序列为GEGPS)，14.7次重复。第二组位于1339-1379bp，重复单元为17bp，因不是3的倍数，推导的氨基酸序列不再是重复序列，故第二组串联重复序列没有意义。串联重复序列如图2所示。由Isotig01524所含的开放阅读框序列推导的氨基酸序列，使用SignalP 4.1软件在线分析，D值(1-31)为0.652，表明该氨基酸序列中1-31aa为信号肽结构(见图3)。

表1.TRF分析结果表

实施例5 Isotig01524的blastp序列比对分析：

将Isotig01524推导的氨基酸序列，在NCBI进行在线的blastp序列比对分析(图4)。经blastp序列比对分析，由Isotig01524推导的氨基酸序列的N端和C端分别与2个假定蛋白具有较高的同源性，而且，这2个假定蛋白是由CornillotE等学者对田鼠巴贝虫RI株进行基因组测序所推导的，也未作进一步的鉴定和功能研究。blastp序列比对结果表明Isotig01524序列代表一个新颖的基因。

实施例6 Bm1524基因的克隆：

根据Isotig01524ORF的核苷酸序列，设计反转录引物(Bm1524GSP：CATTATTTTTATTGGGTC)、正向引物(Bm1524F：ATGAGGGGAATGTTCTCTAAC)和反向引物(Bm1524R：TTAAGCCGTTCCATTCATTAAG)。使用invitrogen公司的SuperScript^TM II RT逆转录酶对提取的田鼠巴贝虫总RNA进行反转录，所得的cDNA作为模板，进一步PCR扩增，反应条件：95℃5min；94℃l min；55℃1min；72℃3min，共35个循环；72℃7min。RTPCT结果见图5。得到的PCR片段与pGEM T-easy载体连接，构建T_Bm1524质粒，转化至E.coli DH5α中，挑选单克隆菌落测序(由华大基因测序)，得到目的基因的完整序列。根据转录组测序分析的Isotig序号，将其命名为Bm1524。

Bm1524基因的核苷酸序列与转录组测序分析组装的Isotig01524的序列仅相差一个碱基(第43位碱基，由T变为C)。推导的氨基酸序列(Bm1524蛋白)由438个氨基酸组成，与Isotig01524推导的氨基酸序列相差一个氨基酸(第15位氨基酸，由苯丙氨酸变为亮氨酸)。该蛋白N端具有一31aa的信号肽结构。354-428aa区域存在一组串联重复多肽序列。Bm1524基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。Bm1524蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

实施例7 Bm1524重组蛋白的表达

1.pET28a-Bm1524C重组蛋白的表达：

根据Bm1524基因序列，设计正向引物(PBm24CF：CATGCCATGGTGCGCAAGAGATTATATAAATTT)和反向引物(PBm24R：CCGCTCGAGAGCCGTTCCATTCATTAAGCCG)。以T_Bm1524质粒为模板，进行PCR扩增(反应条件：95℃5min；94℃l min；58℃1min；72℃3min，共30个循环；72℃7min)。PCR产物以NcoI/XhoI双酶切，与经NcoI/XhoI双酶切的pET28a质粒连接，成功构建pET28a-Bm1524C表达载体。进一步转化至E.coli DH5a，扩增，提取质粒，测序验证后，转化E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞。将转化的细菌转入LB培养基(含卡那霉素50ug/ml和氯霉素34ug/ml)于37℃培养至吸光度(A595值)为0.6时，加入IPTG(终浓度为1mmol/L)继续培养4h，收集菌体。按照组氨酸标签蛋白表达和纯化试剂盒(Qiagen公司)蛋白变性纯化操作方法进行不可溶性重组蛋白的纯化。图6是pET28a-Bm1524CRosetta(DE3)重组蛋白的表达鉴定,图7是pET28a-Bm1524C Rosetta(DE3)重组蛋白变性方式纯化12％聚丙烯酰胺凝胶电泳图，M：Protein marker；F：流出液(pH8.0)；C2、C4：Buffer C液(pH6.3)；D1-D4：Buffer D液(pH5.9)；E1-E5：Buffer E液(pH4.5)。不可溶性的pET28a-Bm1524C重组蛋白集中在Buffer E(E1管)的洗脱液中。pET28a-Bm1524C的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。pET28a-Bm1524C重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

2.pET28a-Bm1524S重组蛋白的表达：

为提高重组蛋白的可溶性表达量，根据Bm1524基因序列，设计正向引物(PBm24SF：CATGCCATGGACAATATATTTAAATACTTTGGAAA)和反向引物(PBm24R：CCGCTCGAGAGCCGTTCCATTCATTAAGCCG)。以T_Bm1524质粒为模板，进行PCR扩增(反应条件：95℃5min；94℃l min；58℃1min；72℃3min，共30个循环；72℃7min)。PCR产物以NcoI/XhoI双酶切，与经NcoI/XhoI双酶切的pET28a质粒连接，成功构建pET28a-Bm1524S表达载体。进一步转化至E.coli DH5a，扩增，提取质粒，测序验证后，转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞。将转化的细菌转入LB培养基(含卡那霉素50ug/ml)于37℃培养至吸光度(A595值)为0.6时，加入IPTG(终浓度为1mmol/L)继续培养4h，收集菌体。可溶性重组蛋白按照组氨酸标签蛋白表达和纯化试剂盒(Qiagen公司)蛋白非变性纯化操作方法进行。图8是pET28a-Bm1524S BL21(DE3)重组蛋白的表达鉴定；图9是pET28a-Bm1524S BL21(DE3)重组蛋白非变性方式纯化12％聚丙烯酰胺凝胶电泳图，M：Protein marker；1：Ni-NTA纯化流出液；2-3：含20mM咪唑洗涤液第2、4管；4-6：含50mM咪唑洗脱液第1-3管；7-9：含100mM咪唑洗脱液第1-3管；10-14：含250mM咪唑洗脱液第1-5管。pET28a-Bm1524S可溶性重组蛋白集中在含50-100mM咪唑的洗脱液中。pET28a-Bm1524S的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。pET28a-Bm1524S重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

实施例8 Bm1524重组蛋白检测抗体效果的评价：

取BALB/c小鼠30只，经腹腔注射接种田鼠巴贝虫7天后，取血制备田鼠巴贝虫感染鼠血清，并随机混合6份感染鼠血清，作为混合阳性鼠血清。同样，制备30份正常鼠血清，并随机混合6份正常鼠血清，作为混合阴性鼠血清。

用重组蛋白分别包被酶标板(Nunc公司，96孔板)，4℃过夜，pET28a-Bm1524C和pET28a-Bm1524S重组蛋白包被浓度均为0.5μg/ml，每孔100μl，甩干。加入1％BSA 200μl，37℃封闭1小时，PBST洗涤三次。加入1：200稀释的鼠血清100μl，37℃反应1小时，PBST洗涤三次。加入100μl的HRP标记羊抗鼠IgG(Sigma公司，1：5000稀释)，37℃反应1小时，PBST洗涤四次。加入底物TMB(天根公司)显色，酶标仪450nm读取数值。

使用上述间接ELISA方法，以混合鼠血清检测二种Bm1524重组蛋白的抗原反应性。结果如表2，混合阳性血清的OD值数倍于混合阴性血清。表明这二种Bm1524重组蛋白均具有较高的抗原反应性。

表2.二种Bm1524重组蛋白的抗原反应性的ELISA检测结果

使用pET28a-Bm1524C和pET28a-Bm1524S重组蛋白，分别以上述间接ELISA方法(重组蛋白包被浓度均为1.0μg/ml)，检测30份正常鼠血清和30份田鼠巴贝虫感染鼠血清，评价Bm1524重组蛋白的诊断价值。

以pET28a-Bm1524C重组蛋白为检测抗原的ELISA结果为：30份正常鼠血清平均OD值为0.006±0.005；30份感染鼠的平均OD值为0.358±0.039。以平均值加上4倍SD为判断标准，OD值大于0.025为阳性，则30份感染鼠血清全为阳性，30份正常鼠血清均为阴性。该ELISA方法的敏感性和特异性均是100％。pET28a-Bm1524C重组蛋白有极高的诊断价值。结果见图10。

以pET28a-Bm1524S重组蛋白为检测抗原的ELISA结果为：30份正常鼠血清平均OD值为0.004±0.003；30份感染鼠的平均OD值为0.259±0.038。以平均值加上4倍SD为判断标准，OD值大于0.017为阳性，则30份感染鼠血清全为阳性，30份正常鼠血清均为阴性。该ELISA方法的敏感性和特异性均是100％。pET28a-Bm1524S重组蛋白有极高的诊断价值。结果见图11。

实施例9 Bm1524C重组蛋白的免疫原性的检测

用pET28a-Bm1524C重组蛋白，免疫5只BALB/c小鼠。每鼠接种抗原30μg，首次接种使用福氏完全佐剂(Sigma公司)，皮下注射；每隔3周，使用30μg抗原混入福氏不完全佐剂(Sigma公司)加强，腹腔注射，共强化免疫4次。取小鼠尾血制备血清。pET28a-Bm1524C重组蛋白包被酶标板，以间接ELISA方法检测小鼠免疫效果。结果见表3。免疫鼠血清的OD值显著高于正常鼠。实验结果表明，pET28a-Bm1524C重组蛋白，具很强的免疫原性，BALB/c小鼠对重组抗原可产生强烈的免疫应答，易制备多/单克隆抗体。

表3.pET28a-Bm1524C重组蛋白免疫原性的间接ELISA检测结果

#1鼠	0.339
		#2鼠	0.321
#3鼠	0.341
		#4鼠	0.328
#5鼠	0.323
		正常鼠	0.058
PBST	0.059

实施例10 田鼠巴贝虫特异性抗体检测的胶体金免疫层析试条的研制

将硝酸纤维素膜(NCM)贴于塑料底板的中间，再将吸水膜和试剂垫分别粘贴于NCM的纵向两头。其间，吸水膜与NCM以及NCM与试剂垫在其交界处有重叠连接。在NCM与试剂垫的连接处贴胶纸作为控流。在NCM的近吸水膜处，横向地以线形包被葡萄球菌蛋白A(SPA)，作为质控(Control，C)线。在NCM的近试剂垫处，横向地以线形包被Bm1524S可溶性重组蛋白(浓度0.2mg/ml)，作为检测(Test，T)线。3.5mm宽切条，待用。

按Frens G所著文献Controlled Nucleation for the Regulation of the Particle Sizein Monodisperse Gold Suspensions(Nat Phys，1973，241：20-22)的方法，用枸橼酸三钠还原氯金酸，制备颗粒直径为15nm的胶体金溶液，按Hayat MA所著文献Colloidal Gold,Volume 1:Principles,Methods and Applications(Colloidal Gold:Principles,Methods and Application)(Academic press.San Diego,U.S.A.1989：1-39)的方法，制备SPA-胶体金结合物。

将胶体金免疫层析试条放置于平面，将2滴(80μl)SPA-胶体金试剂加入试条的试剂垫，前者迅速进入NCM。待胶体金试剂进入NCM后，将3.5μl待测血清加于控流胶纸端的NCM。5-10分钟内观察(或扫描存档)结果，仅有C线者判为阴性；有C和T线者判为阳性；无C线者判为无效。

使用胶体金免疫层析试条，对30份正常鼠血清和30份田鼠巴贝虫感染鼠血清进行检测，结果该试条可准确区分全部阳性和阴性血清，敏感性和特异性均为100％(图12)。使用Bm1524S可溶性重组蛋白研制的胶体金免疫层析试条具有简便、快速、特别适合在基层和现场使用的特点，为田鼠巴贝虫病的诊断提供了新技术。

Claims (17)

1.一种分离的基因，其特征在于：其序列如SEQ ID NO：3所示。

2.一种田鼠巴贝虫Bm1524抗原蛋白，其特征在于：由权利要求1所述的分离的基因编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

3.一种抗体，其特征在于：它特异性的结合权利要求2所述的一种田鼠巴贝虫Bm1524抗原蛋白。

4.如权利要求3所述的一种抗体，其特征在于：所述的抗体为单克隆抗体。

5.一种载体，其特征在于：所述载体含有编码权利要求1所述的一种田鼠巴贝虫Bm1524抗原的基因。

6.一种宿主细胞，其特征在于：所述的细胞含有权利要求5所述的载体，或者所述的细胞用编码权利要求1所述的一种田鼠巴贝虫Bm1524抗原的基因转化或转染。

7.一种疫苗，其特征在于：包括权利要求1所述的一种分离的基因、或者权利要求2所述的一种田鼠巴贝虫Bm1524抗原蛋白、或者权利要求3所述的抗体、或者权利要求5所述的载体。

8.权利要求1所述的一种分离的基因在制备治疗、诊断或者预防田鼠巴贝虫病的药物中的应用。

9.权利要求2所述的田鼠巴贝虫Bm1524抗原蛋白在制备治疗、诊断或者预防田鼠巴贝虫病的药物中的应用。

10.权利要求3所述的抗体在制备治疗、诊断或者预防田鼠巴贝虫病的药物中的应用。

11.权利要求7所述的疫苗在制备治疗、或者预防田鼠巴贝虫病的药物中的应用。

12.一种试剂盒，其特征在于：含有权利要求1所述的一种分离的基因、权利要求2所述的田鼠巴贝虫Bm1524抗原蛋白、或者权利要求3所述的抗体。

13.一种重组蛋白，其特征在于：含有SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列。

14.如权利要求13所述的一种重组蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO：6或者SEQ ID NO：8所示。

15.一种胶体金免疫层析试条，其特征在于：含有权利要求13或者14所述的重组蛋白。

16.一种抗体，其特征在于：它特异性的结合权利要求13或者14所述的重组蛋白。

17.一种试剂盒，其特征在于：含有权利要求13或者14所述的重组蛋白、或者权利要求16所述的抗体。