CN108314735A

CN108314735A - 一种抗田鼠巴贝斯虫的单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN108314735A
Application number: CN201810045325.XA
Authority: CN
Inventors: 贺兰; 赵俊龙; 喻龙; 战雪燕; 刘琴; 赵阳楠; 周艳琴; 方瑞; 申邦; 胡敏
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2018-01-17
Filing date: 2018-01-17
Publication date: 2018-07-24
Anticipated expiration: 2038-01-17
Also published as: CN108314735B

Abstract

本发明公开了一种抗田鼠巴贝斯虫的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCC NO：C201835的杂交瘤细胞株HA5‑E4所分泌的。本发明针对田鼠巴贝斯虫糖代谢途径的乳酸脱氢酶LDH，该蛋白具有免疫原性，制备了针对rBmLDH的单克隆抗体；利用Western blot检测证实，该单抗能特异性地识田鼠巴贝斯虫，但不识宿主的LDH，故可应用于免疫荧光法检测感染细胞中的田鼠巴贝斯虫。

Description

一种抗田鼠巴贝斯虫的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明属于寄生虫病的血液原虫防治技术领域，具体涉及一株抗田鼠巴贝斯虫的单克隆抗体及其应用。

背景技术

田鼠巴贝斯虫(Babesia microti)是顶器门、孢子虫纲、梨形虫目、巴贝斯科、巴贝斯属的一种红细胞内专性寄生的血液原虫，是引发人与啮齿动物的巴贝斯虫病最主要的病原体之一，主要经硬蜱叮咬传播，也可经输血或者血液制品等途径感染及传播，呈机会性致病的特点，一般宿主则多为隐性感染，免疫力低的人或动物感染后表现出严重的临床症状，严重时可导致死亡。目前该病在全球范围内广泛流行，人感染的病例主要集中在美洲，近年来发病病例激增，在欧洲、亚洲等地方不断发现感染病例。在我国，亦有人感染田鼠巴贝斯虫的报道，这一新发人兽共患病给畜牧业和人类健康带来了威胁。人感染后可导致黄疸、稽留高热、血红蛋白尿等，对免疫缺陷的病人危害尤为严重，可导致死亡。

人和动物感染田鼠巴贝斯虫后，初期无典型的临床症状，但人和动物一旦感染，呈终生带虫免疫。迄今为止，尚无有效疫苗预防该病，也无有效药物可根治。因此早期诊断并及时治疗是控制该病的重要方法。

目前对田鼠巴贝斯虫病的检测无可用的商品化试剂盒，主要依耐于实验室检测。现阶段常用的实验室诊断方法主要有血涂片染色镜检法、实时荧光定量PCR、常规PCR和克隆测序。

血涂片染色镜检法操作简便、对仪器设备要求不高，但需要检测人员有很丰富的经验，熟悉巴贝斯虫的形态特征，检出率低，容易错检和漏检；实时荧光定量PCR、常规PCR和克隆测序方法，灵敏度和准确性均高，但需要昂贵的仪器设备，对检测人员的技术和实验技能要求高、需要良好的分子生物学基础和生物信息学基础，故难以实现临床的批量检测。因此，临床上急需一种能检测田鼠巴贝斯虫抗原的检测方法，获得特异性高亲合力的单克隆抗体是建立田鼠巴贝斯虫抗原检测方法的前提和基础。此外，单克隆抗体还可以在致病机理研究、疫苗开发等方面具有广泛的用途。

目前国外和国内均无田鼠巴贝斯虫单克隆抗体的报道，本申请人所在的农业微生物学国家重点实验室的课题组选取田鼠巴贝斯虫(Babesia microti PRA-99)的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，简称LDH)基因，生物信息学分析表明该基因相对保守、具有良好抗原性，将具有更为广阔的应用前景。本发明从该指导思想出发，克隆表达了田鼠巴贝斯虫乳酸脱氢酶(BmLDH)，以重组rBmLDH免疫小鼠，获得杂交瘤细胞，筛选获得一株高亲合力的单克隆抗体，经过免疫印迹和免疫荧光实验验证该抗体特异性良好，灵敏度高，并具有田鼠巴贝斯虫检测能力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型单克隆抗体，该单克隆抗体针对的是一种田鼠巴贝斯虫糖代谢途径的酶即乳酸脱氢酶，该单克隆抗体由杂交瘤细胞株HA5-E4分泌，可以特异、灵敏和稳定地识别田鼠巴贝斯虫。

本发明的技术方案如下：

本发明所用的田鼠巴贝斯虫购自美国ATCC(Babesia microti PRA-99),申请人首先克隆了田鼠巴贝斯虫的LDH基因，进而在大肠杆菌中表达，提取纯化重组蛋白rBmLDH；用rBmLDH蛋白免疫小鼠，抗体上升后，用获得的免疫鼠脾淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，获得一株杂交瘤细胞；进一步用rBmLDH筛选，获得能稳定分泌高亲合力的田鼠巴贝斯虫单克隆抗体的杂交瘤细胞。申请人将该细胞株命名为杂交瘤细胞株HA5-E4，并于2018年1月10日送交位于中国湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCCNO：C201835。

序列表SEQ ID NO:1是田鼠巴贝斯虫LDH基因的核苷酸序列，全长999bp。

序列表SEQ ID NO:2是田鼠巴贝斯虫LDH基因编码的氨基酸序列，共编码332个氨基酸。

将杂交瘤细胞HA5-E4在小鼠腹腔接种，制备小鼠腹水，从腹水中提纯单克隆抗体；进一步建立检测田鼠巴贝斯虫抗原的免疫荧光检测法等生物学功能验证。

本发明制备的杂交瘤细胞株HA5-E4和单克隆抗体HA5-E4可以用于制备检测田鼠巴贝斯虫的抗原制剂或试剂盒。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

本发明是针对田鼠巴贝斯虫糖代谢途径的乳酸脱氢酶LDH，该蛋白具有免疫原性，制备了针对rBmLDH单克隆抗体；利用Western blot检测证实，本发明制备的单抗能特异性地识田鼠巴贝斯虫，但不识宿主的LDH。利用本发明制备的单抗可应用在一种免疫荧光法上，该方法可检测感染细胞中的田鼠巴贝斯虫。

附图说明

图1：重组rBmLDH蛋白的酶活性检测。分别为NADH标准曲线、rBmLDH实验组、空白对照组。

图2：利用Western blot方法鉴定重组rBmLDH。1：rBmLDH与鼠阳性血清反应；2：rBmLDH与鼠阴性血清反应。

图3：本发明制备的单克隆抗体纯化前后的SDS-PAGE照片。泳道：1：纯化前的腹水；2：纯化后的单克隆抗体。

图4：利用Western blot方法鉴定单克隆抗体的特异性结果。泳道：M.参考蛋白；1：田鼠巴贝斯虫全虫抗原与HA5-E4单抗反应；2：人血液全蛋白与HA5-E4单抗反应；3：鼠血液全蛋白与HA5-E4单抗反应。

图5：利用间接免疫荧光检测田鼠巴贝斯虫。Hochest：田鼠巴贝斯虫的核显蓝色；HA5-E4：BmLDH单克隆抗体HA5-E4染田鼠巴贝斯虫的LDH显红色；Merge：二者叠加可见红细胞内的蓝色的田鼠巴贝斯虫核和存在于田鼠巴贝斯虫胞质中的LDH蛋白。

图6：是本发明构建的pET-28a-BmLDH重组质粒图谱。

具体实施方式

实施例1：田鼠巴贝斯虫rBmLDH单克隆抗体的制备

1.1田鼠巴贝斯虫LDH基因克隆表达

利用PCR引物对相应基因进行克隆，以田鼠巴贝斯虫PRA-99株DNA为模板，利用克隆引物(BmLDH-F1/BmLDH-R1)，测序鉴定序列正确后，利用含有酶切位点的表达引物(BmLDH-F2/BmLDH-R2)扩增，并将扩增片段双酶切后插入表达载体pET-28a，进行原核表达。

所述的具体引物序列如下(所述引物由上海生工生物技术有限公司合成)：

BmLDH-F1/BmLDH-R1

上游引物(或称正向引物，下同)：BmLDH-F1：ATGCATTCGTTAAAAGAAGAATTTCTG

下游引物(或称反向引物，下同)：BmLDH-R1：TTATAGTTGGATATCTTTCTGTGTGTTC

BmLDH-F2/BmLDH-R2

上游引物：BmLDH-F2：ATGCATTCGTTAAAAGAAGAATTTCTG(斜体下划线部分为BamH1酶切位点，波浪线部分为保护性碱基)

下游引物：BmLDH-R2：TTATAGTTGGATATCTTTCTGTGTGTTC(下划线部分为XholI酶切位点，波浪线部分为保护性碱基)

克隆BmLDH基因的PCR反应体系如下：

PCR反应条件：反应条件为95℃5min；94℃30sec，57℃60sec，72℃45sec；72℃10min；35个循环周期。

回收以上PCR扩增产物，以此为模板，测序鉴定正确后，使用引物BmLDH-F2/BmLDH-R2扩增BmLDH全基因，其PCR反应体系同上。

回收用BmLDH-F2/BmLDH-R2引物对扩增的PCR产物，用BamH1和XholI酶切，同时，将pET-28a质粒(默克雪兰诺有限公司。即Merck)也用BamH1和XholI双酶切。将酶切BmLDH全基因和pET-28a质粒用DNA连接酶(T4DNA ligase)连接，得到重组质粒(pET-28a-BmLDH)，见图6。用重组质粒转化DH 5α大肠杆菌后，放于37℃摇床(180r/min)培养12小时，提取质粒经过T7鉴定和测序正确后转化BL21大肠杆菌，将该大肠杆菌在LB液体培养基中培养到OD＝_0.6时取1mL菌液作为诱导前对照，同时加入IPTG至终浓度为0.8mM，37℃摇床诱导表达3小时。取1mL菌液进行处理。样品处理方法为12000r/min离心1min后弃掉上清加入1mL磷酸盐缓冲液(PBS，配方：KCl 0.2g，NaCl 8g，Na₂HPO₄ 1.44g，KH₂PO₄ 0.24g，1000mL蒸馏水，pH＝7.6)溶液重悬后再以12000r/min离心1min弃掉上清，然后加入30μL的PBS和30μL上样缓冲液(1MTris-HCl(pH＝6.8)1mL，200mM DDT 0.31g，4％SDS 0.4g，0.2％溴酚蓝0.02g，20％甘油2mL，7mL超纯水)重悬。100℃沸水中煮沸10min。用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定是否表达。

1.2 rBmLDH蛋白的纯化

将重组的BL21大肠杆菌按上述方法诱导表达后，取菌液8000r/min离心10min后弃掉上清，用500mL PBS洗一次后在8000r/min离心10min，再重复用500mL PBS洗一次。弃掉上清后加入30mL的PBS重悬，使用液压破碎仪破碎。破碎后12000r/min离心30min，取40μL上清加入50μL 2x上样缓冲液和10μL DTT，涡旋混匀，在沸水中煮沸10min作为上清组。取一点沉淀加入30μL的PBS和40μL上样缓冲液煮沸10min作沉淀组。经过SDS-PAGE凝胶电泳后，确定rBmLDH大部分表达于上清中。

具体地，纯化步骤如下：

(1)向亲和层析柱中加入4mL Ni-NTA金属螯合His蛋白纯化介质填料；

(2)向亲和层析柱中加入12mLddH₂O洗涤；

(3)加入12mL的banding buffer(20mM Na₃PO₄，0.5M NaCl，10mM咪唑，pH＝7.4)平衡柱子；

(4)加入经过0.45μm孔径滤器过滤的蛋白表达上清，收集前几滴滤出的液体，编号为1；

(5)加入50mL banding buffer(300mM NaCl,10mM Tris base,50mM NaH₂PO₄·2H₂O，10mM咪唑，pH＝7.4)平衡柱子，收集前几滴液体，编号2；

(6)加入10mL Elution buffer(5％-100％咪唑梯度洗脱)(终浓度为20mM Na₃PO₄，0.5M NaCl,400mM咪唑，pH＝7.4)洗脱目的蛋白，收集前几滴，编号3；

(7)将编号为1到3的管中各加入50μL上样缓冲液(SDS)煮沸10min；

(8)配置SDS-PAGE聚丙酰胺凝胶，将处理好的样品加入孔中10μL/每孔，电泳(浓缩胶直流电压为80伏特，分离胶直流电压为120伏特)，电泳完成后，取下凝胶用考马斯亮蓝染色过夜。然后脱色，确定得到纯化的目的蛋白。

实施例2：重组rBmLDH蛋白的酶活性检测

(1)样品准备：BCA法测定rBmLDH蛋白浓度并调整蛋白浓度至1mg/mL，使用0.1μg的蛋白浓度测定重组蛋白酶活。

(2)LDH标准曲线制备：加入0,2,4,6,8和10uL的1.25mM NADH标准品(一式两份)装入96孔板，生成0(空白)，2.5，5，7.5，10和12.5nmole/孔标准。添加LDH分析缓冲液至最终体积为50μL。

(3)酶活测定实验步骤：分别取48μL分析缓冲液和2μL底物混合液，混匀。

(4)每孔添加50μL酶活反应混合物，使用水平振动或移液枪混匀。在实验过程中避免光照。

(5)2-3分钟后，进行初始测量。在初始时间初始测量450nm处的吸光度(注意：最重要的是初始值在标准曲线的线性范围内)。在37℃，孵育板每5分钟进行一次测量。继续测量，直到最活跃的样品值大于最高标准值(12.5nmole/孔)。此时最活跃的样品接近或超过标准曲线线性范围的末端。

检测结果见图1。rBmLDH活性以nmole/min/mL＝milliunit/mL报道。一个单位的LDH活性被定义为催化乳酸转化为丙酮酸在37℃下，每分钟产生1.0摩尔的NADH。

实施例3：重组蛋白rBmLDH反应原性的鉴定

将纯化后的重组蛋白rBmLDH先进行SDS-PAGE电泳，然后在50V电压下转移到NC膜上，3h后将NC膜用TBST-5％脱脂奶粉封闭1h，TBST洗3次，每次5min；分别将NC膜放入1:100稀释的田鼠巴贝斯虫阳性血清和阴性血清中，室温孵育1h，TBST洗3次，每次5min；加入二抗(1:5000稀释的兔抗鼠IgG)，室温孵育1h，TBST洗3次，每次5min后，加入BCL显色。Westernblot结果表明，纯化后的rBmLDH在30kDa与阳性血清有特异性反应，但与阴性血清无反应(见图2)。

实施例4：单克隆抗体制备

4.1免疫小鼠

利用上述制备的田鼠巴贝斯虫rBmLDH抗原免疫BALB/C小鼠，免疫程序如下：

(1)0天，采血收血清作为阴性血清，初次免疫,田鼠巴贝斯虫rBmLDH抗原100μg/只鼠,加弗氏完全佐剂颈背部皮下多点注射，0.2mL/只鼠。

(2)14天，第一次加强免疫,田鼠巴贝斯虫rBmLDH抗原剂量100μg/只鼠，加弗氏不完全佐剂颈背部皮下多点注射，0.2mL/只鼠。

(3)28天，第二次加强免疫,田鼠巴贝斯虫rBmLDH抗原剂量100μg/只鼠，加弗氏不完全佐剂颈背部皮下多点注射，0.2mL/只鼠。

(4)40天，第三次加强免疫,田鼠巴贝斯虫rBmLDH抗原剂量80μg/只鼠，加弗氏不完全佐剂颈背部皮下多点注射，0.2mL/只鼠。

(5)50天，收集血清测效价，用间接法ELISA测其效价，即用田鼠巴贝斯虫rBmLDH抗原包板，加入小鼠血清稀释品于37℃孵育，洗板后加入HRP标记的羊抗鼠二抗(购自Southern Biotech公司)于37℃孵育，洗板后加入TMB底物显色，取效价高者继续加强免疫做融合用。

(6)54天，融合前冲击免疫,田鼠巴贝斯虫rBmLDH抗原剂量100μg/只鼠，直接腹腔注射，0.2mL/只鼠。

(7)61天，收获脾细胞准备融合。

4.2制备杂交瘤细胞：采用PEG介导融合方法

SP2/0瘤细胞的准备：

(1)将冻存的SP2/0瘤细胞于200g离心去除冻存液后用DMEM完全培养基(含20％胎牛血清，1％双抗贮存液，终浓度：链霉素100μg/mL，青霉素100U/mL)的DMEM基础培养基(Heyclon))复苏，加入24孔细胞培养板中，于5％CO₂、饱和湿度的37℃条件下进行培养。

(2)用8-氮鸟嘌呤培养基(2mL 8-氮杂鸟嘌呤(50×)(购自Sigma公司)入到99mLDMEM完全培养基(含20％胎牛血清，1％双抗贮存液，终浓度：链霉素100μg/mL，青霉素100U/mL)的DMEM基础培养基)中筛选培养SP2/0瘤细胞7d，调整细胞浓度至10⁶个/mL，取0.5mL于Balb/C小鼠背部皮下注射，可以注射多点。

(3)一般在10d后小鼠背部即会形成实体瘤，摘除眼球放血后处死小鼠，放于75％的酒精溶液中浸泡5min。

(4)用眼科剪和眼科镊剪开小鼠背部皮肤，剪下合适大小的肿瘤块置于匀浆器中，用眼科剪剪成小块，加入5mL DMEM基础培养基(Heyclon)轻柔的研磨，加入7mL DMEM基础培养基，静置3-4min后吸取上层的细胞液7mL，加于50mL尖底离心管中，再向匀浆器中加入7mLDMEM基础培养基(Heyclon)静置，重复上述步骤两次。

(5)将研磨的液体自通过细胞筛网过滤掉块状物，取3—5ml左右培养基冲洗匀浆器，再次过筛网。

(6)将经过细胞筛网过滤的液体吸入干净的50ml无菌离心管中，加培养基至40ml左右，1500rpm，离心5min，弃上清，用DMEM基础培养基重悬备用。

饲养细胞的制备：

(1)取一只6-8周龄的未免疫Balb/c小鼠，摘除眼球放血后处死小鼠，75％的酒精溶液浸泡5min，收集的血清即为阴性血清。

(2)固定小鼠四肢，用眼科剪和眼科镊剪开皮肤；换一套眼科剪和眼科镊将腹膜剪开一个小口，加入3mL基础培养基吹打几下，吸出放入一灭菌的50mL尖底离心管中，即为腹腔巨噬细胞。

(3)将小鼠四肢固定，用眼科剪和眼科镊剪开腹膜，取出脾脏，去除结缔组织，将脾脏剪开，放入无菌的匀浆器中。

(4)将研磨的液体自通过细胞筛网过滤掉块状物，取3—5ml左右培养基冲洗匀浆器，再次过筛网。

(5)将经过细胞筛网过滤的液体吸入干净的50ml无菌离心管中，加培养基至40ml左右，1500rpm，离心5min，弃上清。

(6)用之前配置好的HAT完全培养基(20％胎牛血清+1％双抗(链霉素和青霉素)+1/50体积的HAT(50×)+DMEM基础培养基)重悬沉淀物即可(即饲养细胞培养液)，可按10⁵/孔使用。

免疫小鼠脾细胞的制备：

取加强免疫的小鼠，断颈处死，取脾脏，制备脾细胞，操作同饲养细胞中脾细胞的制备。最后用DMEM基础培养基(Heyclon)重悬备用。

细胞融合：

(1)用不完全培养基DMEM将SP2/0细胞和免疫鼠脾细胞重悬，分别用血球计数板计数，按脾细胞：SP2/0细胞＝5:1-10：1比例于50ml无菌离心管中混合，充分混合后加DMEM至40ml左右，1500rpm，离心5min，此时准备37℃左右的温水。

(2)离心后弃上清以及管壁液体(可用灭菌纸吸干)轻轻敲打SP2/0和免疫鼠混合离心的沉淀使其松动，将离心管底部浸入37℃温水中。

(3)培养箱中拿出已温育的1ml融合剂PEG 1450，60s内均匀滴入细胞混合沉淀中(边滴加边转动离心管)。

(4)37℃温水中静置温育45s，然后取出37℃温箱中预温的DMEM基础培养基，取1mlDMEM基础培养基60s均匀滴入沉淀中(边滴加边转动离心管)，再取1ml，30s内均匀滴入，之后将剩余的DMEM基础培养基缓慢的全部加入。注意：不要冲击！(此步骤为稀释融合剂)

(5)轻轻颠倒混匀之后，1500rpm，离心5min弃上清，用饲养细胞溶液重悬沉淀。

(6)用排枪将重悬后的液体均匀铺入96孔细胞培养板，200μl/孔，置于5％CO₂，37℃培养箱培养。

4.3杂交瘤细胞的筛选

采用间接ELISA方法进行抗体检测。包被重组蛋白rBmLDH，每孔100ng 4℃孵育过夜，第二天取出后使用PBST(含0.5％吐温-20的磷酸盐缓冲液即PBS)洗涤3次，拍干后使用5％脱脂乳37℃温箱封闭1h，取出后PBST洗涤3次。加入杂交瘤细胞上清100μL，同时设SP2/0细胞上清做对照组，于37℃孵育60min，PBST洗涤3次，加入1:5000倍稀释的羊抗鼠IgG-HRP，37℃孵育60min，PBST洗涤5次，加入显色液(Biosharp)(底物缓冲液：TMB母液＝19：1，和30％H₂O₂ 0.2μL/ml)100μL/孔，避光显色10min，每孔加50μL终止液(0.25％HF)终止反应，用酶标仪在630nm波长下测定OD值。

杂交瘤细胞的克隆：

(1)制备小鼠的饲养细胞，并铺到96孔板中。

(2)将要克隆的杂交瘤细胞用200μL枪头轻轻吹下后计数。

(3)将细胞用HT完全培养基(20％胎牛血清+1％双抗(链霉素和青霉素)+1/50体积的HT(50×)+DMEM基础培养基)稀释至3个浓度，即每毫升培养基含50个、10个和5个细胞，将这三个浓度的细胞悬液按照100μl/孔分别加入96孔细胞培养板中，使每孔分别含5、1、0.5个细胞。

(4)第4天更换细胞悬液一次，观察并记录各孔的细胞生长情况。

(5)第7-10天，当细胞长到视野1/5-1/3时，检测杂交瘤细胞的抗体效价，选择抗体效价高、集落形态好、呈单集落生长的孔，继续单克隆。

(6)两次亚克隆之后将阳性的杂交瘤细胞移至24孔细胞培养板中培养，原孔加HT培养基。待24孔板中细胞生长良好时，冻存杂交瘤细胞。

杂交瘤细胞的冻存与复苏：

(1)杂交瘤细胞的冻存

及时冻存原始孔的杂交瘤细胞和每次克隆化得到的亚克隆细胞十分重要。杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原则上每支安瓿的细胞量应在1×10⁶个以上，但原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而数量不同。细胞冻存液配方(体积比)：90％小牛血清，10％DMSO(二甲基亚砜)。冻存液最好预冷，操作时务必动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降至0℃后放入-70℃超低温冰箱，次日转入液氮中。也可用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性，在液氮中细胞可保存数年或更长时间。

(2)细胞复苏方法

将玻璃安瓿自液氮中小心取出，放37℃水浴中，在1min内使冻存的细胞解冻，将细胞用DMEM基础培养基洗涤两次，然后移入前一天已制备好的饲养层细胞的培养瓶内，置37℃、5％(v/v)CO₂孵箱中培养。当细胞形成集落时，检测抗体活性。

单克隆抗体的扩大制备

制备腹水：先腹腔注射0.5mL弗氏不完全佐剂于BALB/C鼠，7天后腹腔注射1×10⁶个杂交瘤细胞，接种细胞10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多、而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获5～10mL腹水。也可用注射器抽提腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达到5～10mg/mL，这是目前最常用的方法，还可将腹水中细胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水快、且量多。

4.4单克隆抗体的纯化和鉴定

4.4.1单克隆抗体(简称单抗)纯化

(1)取适量Protein G悬液，装入层析柱，用10倍柱体积的PBS(或者TBS，下同)洗涤平衡层析柱。

(2)含抗体的腹水高速离心后，将上清与等体积2×PBS缓冲液混合，调整pH以及离子浓度后，缓慢加入层析柱。

(3)用10倍柱体积以上的PBS洗涤，至流出液无蛋白检出。

(4)加入2倍柱体积0.1M柠檬酸(Citrate Acid,pH 2.7)，夹住流出管，静置5分钟后收集穿出液，重复三次。

(5)洗脱后的抗体加入2/5体积的1M Tris，pH 8.0中和。

(6)抗体用TBS透析(pH7.6)2h/次，换液4次以上，浓缩到所需体积，测定浓度，保存在-20℃。

(7)纯化后的单抗使用BCA蛋白测试试剂盒(购自碧云天公司)测浓度，经过SDS-PAGE鉴定单抗的纯度，结果见图3。

4.4.2单克隆抗体特异性鉴定

田鼠巴贝斯虫(购自美国ATCC：PRA-99)全虫蛋白、小鼠全血蛋白、人全血蛋白重组、纯化后的rBmLDH进行SDS-PAGE电泳，经过半干转印到硝酸纤维素膜上(25V，40min)，5％脱脂奶在4℃封闭过夜，TBST洗膜三次，用纯化的单抗HA5-E4(1μg/mL)做为一抗在室温下作用1小时，用TBST洗膜三次，与1：2000倍稀释的HRP-羊抗鼠IgG孵育1小时，用TBST洗膜三次，再用TBS洗膜三次，用Super Signal West Pico Trial Kit(购自Thermo scientific)显色。结果显示HA5-E4单抗可以识别纯化的rBmLDH(30kDa)和田鼠巴贝斯虫中30kDa大小的蛋白。故该单抗可以识别田鼠巴贝斯虫(图4)。

实施例5：利用免疫荧光法鉴定田鼠巴贝斯虫

将1μL田鼠巴贝斯虫染虫血制备血液涂片，用100％冰甲醇室温固定30分钟，然后使用0.5％的TritonX-100通透5分钟，PBS洗涤3次后，用含1％(m/v)牛血清白蛋白(BSA，购自Sigma公司)的PBS溶液37℃封闭1小时。PBS洗涤三次后，用1％(m/v)BSA的PBS溶液稀释HA5-E4单克隆抗体(终浓度100μg/mL)37℃孵育1小时。用PBS洗涤三次，加入200x稀释的羊抗鼠的二抗(羊抗鼠594)，37℃孵育1小时后，PBS洗涤三次，使用Hochest对细胞核染色，室温染色5min。PBS洗涤三次后，使用抗荧光猝灭剂封片。在激光共聚焦显微镜下观察实验结果(图5)，可见田鼠巴贝斯虫的核显蓝色(Hochest),BmLDH单克隆抗体HA5-E4染田鼠巴贝斯虫的LDH显红色(HA5-E4)，二者叠加可见红细胞内的蓝色的田鼠巴贝斯虫核和存在于田鼠巴贝斯虫胞质中的LDH蛋白(Merge)。

田鼠巴贝斯虫是红细胞内专性寄生虫，既可以感染人，也可以感染鼠等啮齿动物。该虫可以带虫免疫，一旦感染即终生带虫，机体无法清除，且当机体抵抗力降低时容易复发。因此，对田鼠巴贝斯虫的诊断将变得越来越重要。田鼠巴贝斯虫生活史复杂，表面抗原多变，而LDH是糖代谢途径途径中一种必须的酶，且免疫原性强，非常适合于用作田鼠巴贝斯虫检测的靶标分子。因此，以rBmLDH蛋白为抗原制备的特异性单克隆抗体HA5-E4对制备田鼠巴贝斯虫检测试剂盒具有重要意义。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种抗田鼠巴贝斯虫的单克隆抗体及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 999

<212> DNA

<213> 田鼠巴贝斯虫(Babesia microti)

<400> 1

atgcattcgt taaaagaaga atttctgatc cgtctcacca acgaagactt gaatgctagc 60

aataagatca ctgtcattgg cgttggtgct gttggcatgg cttgcgcctt cagcatactc 120

aacaaggaat tggccgatga actagtgctc attgacgtag ttgaggataa gttaaaaggg 180

gagatgatgg acttgcagca aggaagctta ttcctaaaga ctcccaatat aatcgctgga 240

aaggattatg aacttactgc aaattccaag ctggttgtgg taactgctgg cgctagacaa 300

caagaagggg aaagcagact aaatttggtg caacgtaatg tcaatatctt caagtttatc 360

atccccaacg tagttaaata cagtccagat tgcatcctac taattgtgtc aaatcctgtt 420

gatattctaa cctatgtcgc atggaaattg agtgggtttc cactcaatcg tgtgattgga 480

agtggatgta atctggattc cgcaagattc cgctatctgg tctcagaaat gattggaatt 540

cacccttcaa atttccatgg ctgcatccta ggtgaacatg gcgactccag cgtcccgata 600

ctaagcgggt taaatatagc agggatgtct attaaaaact tgcataccga catagataca 660

gtttttatca aagatatgtg caaggatgtt cataagaagg tcactgaaag tgcgtatgaa 720

attattaaac tgaagggata cacttcttgg gccattggtc tatctgtggg cgacttgtct 780

tgtagtttga ttaagaatct cagaaaagta caccccgtgt ccactctagt aaaaggacaa 840

ttcggtattg acaatgaggt gttccttagc gtcccttgcg tccttggtcg taatggaatc 900

tcagaagtct tcaaaccaaa actaactgtg gaagaggaac aacaattgaa gaacagtgca 960

gaaaccatat ggaacacaca gaaagatatc caactataa 999

<210> 2

<211> 332

<212> PRT

<213> 田鼠巴贝斯虫(Babesia microti)

<400> 2

Met His Ser Leu Lys Glu Glu Phe Leu Ile Arg Leu Thr Asn Glu Asp

1 5 10 15

Leu Asn Ala Ser Asn Lys Ile Thr Val Ile Gly Val Gly Ala Val Gly

20 25 30

Met Ala Cys Ala Phe Ser Ile Leu Asn Lys Glu Leu Ala Asp Glu Leu

35 40 45

Val Leu Ile Asp Val Val Glu Asp Lys Leu Lys Gly Glu Met Met Asp

50 55 60

Leu Gln Gln Gly Ser Leu Phe Leu Lys Thr Pro Asn Ile Ile Ala Gly

65 70 75 80

Lys Asp Tyr Glu Leu Thr Ala Asn Ser Lys Leu Val Val Val Thr Ala

85 90 95

Gly Ala Arg Gln Gln Glu Gly Glu Ser Arg Leu Asn Leu Val Gln Arg

100 105 110

Asn Val Asn Ile Phe Lys Phe Ile Ile Pro Asn Val Val Lys Tyr Ser

115 120 125

Pro Asp Cys Ile Leu Leu Ile Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr

130 135 140

Tyr Val Ala Trp Lys Leu Ser Gly Phe Pro Leu Asn Arg Val Ile Gly

145 150 155 160

Ser Gly Cys Asn Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Leu Val Ser Glu

165 170 175

Met Ile Gly Ile His Pro Ser Asn Phe His Gly Cys Ile Leu Gly Glu

180 185 190

His Gly Asp Ser Ser Val Pro Ile Leu Ser Gly Leu Asn Ile Ala Gly

195 200 205

Met Ser Ile Lys Asn Leu His Thr Asp Ile Asp Thr Val Phe Ile Lys

210 215 220

Asp Met Cys Lys Asp Val His Lys Lys Val Thr Glu Ser Ala Tyr Glu

225 230 235 240

Ile Ile Lys Leu Lys Gly Tyr Thr Ser Trp Ala Ile Gly Leu Ser Val

245 250 255

Gly Asp Leu Ser Cys Ser Leu Ile Lys Asn Leu Arg Lys Val His Pro

260 265 270

Val Ser Thr Leu Val Lys Gly Gln Phe Gly Ile Asp Asn Glu Val Phe

275 280 285

Leu Ser Val Pro Cys Val Leu Gly Arg Asn Gly Ile Ser Glu Val Phe

290 295 300

Lys Pro Lys Leu Thr Val Glu Glu Glu Gln Gln Leu Lys Asn Ser Ala

305 310 315 320

Glu Thr Ile Trp Asn Thr Gln Lys Asp Ile Gln Leu

325 330

Claims

1.一种抗田鼠巴贝斯虫的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCC NO：C201835的杂交瘤细胞株HA5-E4所分泌的。

2.权利要求1中所述的杂交瘤细胞株，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C201835。

3.权利要求1所述的单克隆抗体在制备检测田鼠巴贝斯虫的试剂盒中的应用。

4.包含权利要求1所述单克隆抗体的试剂盒，该试剂盒是田鼠巴贝斯虫检测试剂盒。