CN107759677A - 一种美洲大蠊过敏原蛋白ba2及其表达方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种美洲大蠊过敏原蛋白BA2及其表达方法：(1)通过提取美洲大蠊RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，获得美洲大蠊过敏原蛋白编码基因片段；(2)将过敏原基因克隆入原核表达载体中，构建重组表达质粒pET28a(+)‑BA2，再转入宿主菌大肠杆菌BL21，用IPTG诱导其表达，采用亲和层析方法纯化，从而获得重组美洲大蠊过敏原蛋白BA2。通过药理实验显示：BA2蛋白能明显增加小鼠血清中的IgE含量(P<0.05)，能显著增加小鼠肺泡灌洗液和小鼠脾细胞上清液中IL‑4、IL‑5和IL‑13炎症因子的含量以及致使小鼠肺组织发生明显病理变化。本发明所述方法能够获得纯度较高的过敏原蛋白，为美洲大蠊过敏原后续研究以及其他动物体内潜在过敏原物质的研究提供参考依据。

Description

一种美洲大蠊过敏原蛋白BA2及其表达方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种美洲大蠊过敏原蛋白BA2及其表达方法。

背景技术

变态反应疾病被世界卫生组织列为21世纪重点防治的三大疾病之一。变态反应疾病的发生极为广泛，全世界有1/3的人口患有变态反应疾病。在变态反应疾病中，支气管哮喘(简称哮喘)约占全部病例的1/4。哮喘可以由多种因素引发，其中过敏原，尤其是室内过敏原，具有十分重要的作用。室内过敏原主要包括动物皮屑、尘螨和蟑螂等。

蟑螂可以引起哮喘的报道最早出现在上世纪60年代。美洲大蠊是蟑螂过敏诱发哮喘的重要过敏源。蟑螂，即美洲大蠊(Periplaneta americana)，是我国南方室内蟑螂的优势种群。国内外学者通过皮试和支气管激发试验测定，发现约40％的哮喘患者对蟑螂过敏原过敏，证实蟑螂是仅次于屋尘和尘螨的主要室内过敏原携带者，且蟑螂过敏原是一种强吸入性过敏原。蟑螂诱发哮喘的病原学研究是近年来过敏与哮喘研究领域的热点。筛选新过敏原并对其过敏原性的研究对过敏性疾病的诊断和脱敏治疗都具有重要意义。在诊断和治疗蟑螂过敏性疾病时，广泛使用的是过敏原的粗浸液，但由于其成分复杂，很难进行标准化且在治疗中易导致免疫球蛋白(IgE)介导的其它过敏反应，因此限制了过敏原浸液在临床上的使用。随着基因工程技术的发展，重组蛋白逐渐被重视。与天然过敏原浸提液相比，重组过敏原的产量高，生产条件稳定，方便进行过敏原的标准化，利于临床诊断和治疗。近年来的研究证实重组蟑螂过敏原蛋白具有纯度高、易于标准化的特点，能安全和有效地为患者提供免疫治疗。与此同时，根据重组过敏原设计的疫苗被大量的运用到治疗过敏性疾病中。开发能有效治疗不同类型过敏症的免疫治疗疫苗已经成为新的研究热点。

本发明拟通过PCR获得过敏原基因，构建pET-28a(+)-BA2原核表达载体，并对其原核表达产物进行纯化，获得BA2蛋白质，同时对BA2蛋白诱发小鼠哮喘进行研究，为美洲大蠊的过敏原的研究以及其他动物体内潜在过敏原物质的研究提供参考依据。

发明内容

本发明的目的在于提供一种美洲大蠊过敏原蛋白BA2及其表达方法，将PCR扩增得到的过敏原基因克隆入原核表达载体，构建重组表达质粒，再转入宿主菌并诱导其表达，从而获得过敏原蛋白BA2，本发明所获得的过敏原蛋白作用于小鼠可诱发其过敏性哮喘。

本发明所述的一种美洲大蠊过敏原蛋白BA2，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNo.1所示。

进一步，所述过敏原蛋白BA2的氨基酸序列由质粒所表达的氨基酸序列和过敏原基因所表达的氨基酸序列组成，其中过敏原基因所表达的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明所述的一种美洲大蠊过敏原蛋白BA2的表达方法为：

a.从美洲大蠊组织中提取总RNA，反转录成cDNA；

b.以cDNA为模板进行PCR扩增反应，获得美洲大蠊过敏原的编码基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

c.设计并合成酶切位点引物:

BA2-F 5’-CGGCTAGCATGACGATTGACTTCTACTACTT-3’

BA2-R 5’-CCGCTCGAGTCATTTTTTTGTTTTGGACTCG-3’

d.将步骤b所获得的编码基因克隆入原核表达载体中，构建重组表达质粒；

e.将步骤d获得的重组质粒转入宿主菌，诱导其表达并纯化蛋白。

进一步，所述的美洲大蠊过敏原蛋白BA2的表达方法中选用的表达载体为pET-28a(+)。

进一步，所述的美洲大蠊过敏原蛋白BA2的表达方法中选用的双酶切位点为Nhe I和Xho I酶切位点。

进一步，所述的美洲大蠊过敏原蛋白BA2的表达方法中选用的的宿主菌为大肠杆菌BL21。

进一步，所述的美洲大蠊过敏原蛋白BA2的表达方法中采用IPTG诱导其表达，其中IPTG的终浓度为0.2mmol/L，诱导温度为37℃，诱导时间5～6h。

进一步，所述的美洲大蠊过敏原蛋白BA2的表达方法中选用亲和层析方法纯化重组蛋白BA2，其中缓冲液含磷酸钠和咪唑。

本发明所述的蛋白BA2为一种可诱发哮喘的过敏原蛋白。

与现有技术相比，本发明通过提取美洲大蠊RNA，扩增出过敏原蛋白基因，经双酶切后连接到原核表达载体上，再转入宿主菌并诱导其表达，经His标签的亲和柱分离、纯化，从而获得美洲大蠊过敏原蛋白BA2；通过实验结果显示BA2蛋白为一种可诱发哮喘的过敏原蛋白，BA2蛋白刺激小鼠可致小鼠血清中IgE含量增高，肺泡灌洗液及脾细胞上清液中的炎症因子含量增高，肺组织发生明显病理变化。

附图说明

图1 pET-28a(+)-BA2质粒双酶切鉴定电泳图，其中A为pET-28a(+)-BA2质粒经NheI/XhoI酶切，B为pET-28a(+)-BA2质粒酶切

图2 BA2蛋白小剂量表达SDS-PAGE分析，其中A是未添加IPTG菌液，B是加入0.2mmol/L的IPTG菌液

图3纯化后蛋白胶图，其中A为SDS-PAGE胶结果，B为Western结果

图4 BCA法标准曲线

图5不同处理组小鼠血清抗原特异性IgE水平

图6不同样品对肺泡灌洗液中细胞因子IL-4的影响

图7不同样品对肺泡灌洗液中细胞因子IL-5的影响

图8不同样品对肺泡灌洗液中细胞因子IL-13的影响

图9不同样品对脾细胞培养上清中的细胞因子IL-4影响

图10不同样品对脾细胞培养上清中的细胞因子IL-5影响

图11不同样品对脾细胞培养上清中的细胞因子IL-13影响

图12不同样品对肺组织的影响

具体实施方式

以下结合实施例的具体实施方式对本发明的内容作进一步的详细说明。

实施例1

1实验材料

1.1实验样本

美洲大蠊由四川好医生药业集团有限公司提供。

30只SPF级BALB/c小鼠，雌性，6～8周龄，体重18～22g，由四川大学实验动物中心提供。随机分为3组：PBS对照组5只、美洲大蠊粗提液处理组10只和BA2蛋白处理组10只，各组分笼饲养。

1.2实验菌株及质粒

所用菌株为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，所用载体为pET28-a(+)质粒，购于Novagen公司。

1.3实验仪器

离心机、摇床、电热恒温水槽、PCR仪、电泳槽、凝胶成像系统、半干转印系统转印槽(Bio-Rad)、迷你垂直电泳仪、蛋白层析系统、超声波破碎仪、酶标仪、连结仪(Eppendof)；

1.4实验试剂及耗材

限制性内切酶Nhe I和Xho I(Takara公司)、Taq酶(南京诺唯赞生物科技有限公司)、T4DNA连接酶(Takara公司)、割胶纯化试剂盒(OMEGA公司)、DL2000DNAMarker(成都擎科梓熙生物技术有限公司)；

氢氧化铝凝胶、RPMI-1640、胎牛血清、青、链霉素双抗(上海生工生物工程技术服务有限公司)、离心管、红细胞裂解液、细胞筛、0.22μm过滤器(北京全式金生物科技有限公司)、His亲和层析柱(GE生物公司)；

1.5主要试剂的配制

(1)磷酸盐缓冲溶液(PBS)：

NaCl：8g；Na₂HPO₄：1.44g；KCl：0.2g；KH₂PO₄：0.24g

用HCl调节溶液的pH值至7.4加ddH₂O定容至1000ml，在120psi高压下蒸气灭菌20min。保存于室温；

(2)考马斯亮蓝染色液：

考马斯亮蓝G250或R250(Fisher)：0.5％；甲醇：40％；乙酸：10％

将考马斯亮蓝G250或R250溶于甲醇中搅拌15min。各溶液加好后ddH₂O定容至1000ml；

(3)脱色液：

甲醇：30％；乙酸：10％

各溶液加好后ddH₂O定容至1000ml

(4)Tris Buffered Saline(TBS Buffer，pH＝7.5)：

Tris-HCl：20mM；NaCl：500mM

TBST Buffer(含0.05％Tween20的TBS缓冲液)

(5)封闭液(含5％脱脂奶粉的TBS缓冲液)：

脱脂奶粉5g溶于100ml的TBS buffer，溶解后4℃保存。使用时，恢复室温，用量以盖过膜面即可，一次性使用。

2实验方法

2.1目的基因的获得

用北京全式金生物科技有限公司试剂盒提取美洲大蠊的RNA，然后将其反转录成cDNA，-20℃保存。通过PCR仪扩增得到目的基因全长，如序列SEQ IDNo.3。PCR扩增反应体系如表1。

表1 PCR扩增反应体系

反应条件：95℃，5min；94℃，45s；60℃，30s；72℃，1min；循环35次；72℃，10min。

2.2构建表达载体

PCR扩增得到的目的基因序列和表达载体pET-28a-c(+)图谱，合成带Nhe I和XhoI酶切位点的引物，引物序列如表2。

表2引物序列表

注：序列中下划线部分为酶切位点

利用限制性内切酶Nhe I和Xho I分别切割pET28-a(+)原核表达载体及BA2产生粘性末端，酶切体积分别为50μl及30μl，体系如表3、表4所示。

表3原核表达载体的酶切体系

表4 BA2的酶切体系

将PCR产物与原核表达载体pET-28a-c(+)分别用Nhe I和Xho I酶切。加入与酶切体系等体积(50μl)的酚仿异戊醇(25:24:1)下层液，震荡30s；12000rpm离心10min；取上清50μl，加入5μl 3M乙酸钠，再加入2.5倍体系(137.5μl)的无水乙醇，混匀后-20℃沉淀45min以上；12000rpm，4℃，离心10min；弃上清；70％乙醇1ml洗涤并12000rpm，4℃离心10min；弃上清，100％无水乙醇1ml洗涤并12000rpm，4℃离心10min；弃上清；倒置风干(5-10min)；加入15μlddH₂O；检测后保存。

将BA2片段与pET28a(+)的酶切产物混合(按浓度3:1)混合，加入T4连接酶的Buffer，放置到65℃水浴锅水浴5min，放入冰盒快速冷却，短暂离心后，加入T4连接酶，连接体系如表5，放入连结仪中，构建重组表达质粒pET28a(+)-BA2。

表5连接体系

2.3以重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)

将感受态BL21(DE3)从超低温冰箱取出，冰浴解冻融化5min；取出连接产物短暂离心，加入100μl感受态细胞，冰浴30min；放入42℃预热水浴锅热击90s后将EP管快速冰浴，冷却2min；向EP管中加入提前预热到37℃的500μl LB培养基里，置于37℃摇床培养。2小时后，将菌液涂含抗生素的LBA平板。

2.4诱导表达，纯化蛋白及检测

2.4.1诱导表达

用灭菌牙签从含有E.coli BL21(DE3)过敏原菌落的LBA固体培养基上挑取分离良好的单个新鲜阳性克隆菌落于1ml含1％的Kana+LB液体培养基中，200r/min、37℃恒温摇床震荡中过夜培养；按1：100的比例将过夜培养的菌液接种于2.5L的液体培养基中，200r/min、37℃恒温摇床震荡培养OD600至0.6(约2～3h)；加入诱导剂IPTG至终浓度约为0.2mmol/L，200r/min、37℃继续通气诱导5h～6h；

2.4.2蛋白的分离与纯化

4℃条件下，将菌液8000r/min离心10min，收集细菌沉淀，用超声波破碎仪破壁，离心后将上清液用0.45um孔径的滤膜过滤，保留滤液备用。

按照HisTrapTMFF crude柱(GE healthcare Bio-Science corp，USA)分别配置PH＝7.4结合缓冲液：20mM磷酸钠，0.5M NaCl，30mM咪唑，及不同梯度的PH＝7.4的洗脱缓冲液：20mM磷酸钠，0.5M NaCl，咪唑(咪唑梯度分别为80、100、200、300mM)。将HisTrapTMFFcrude柱连接NGCTM中高压层析系统，流速为1ml/min，仪器操作步骤如下：用8ml的去离子水冲洗层析柱至洗脱峰平直；用30mM的洗脱液平衡层析柱；将菌液破碎后的样品上样到层析柱；分别用80mM、100mM及200mM的洗脱液洗脱，当出现明显单峰的时候，收集样品；最终以300mM的洗脱液清洗层析柱，以20％的乙醇溶液清洗层析柱，4℃保存层析柱。

2.4.3目的蛋白的检测及Western blot鉴定

取30μl纯化后的样品和6μl 5×SDS-PAGE上样缓冲液，轻轻吹打使沉淀充分悬浮，95℃～100℃煮沸10min～15min，使蛋白质变性，然后置于0℃冰水中水浴3min～5min，以防蛋白质复性，取10μl上述样品进行SDS-PAGE检测。

纯化后的蛋白经SDS-PAGE电泳后，将凝胶上的蛋白质电转移至PVDF膜上，用含50g/L脱脂奶粉TBS封闭后，加入鼠抗His(一抗)，4℃封闭过夜；用PBST在室温下脱色摇床上洗3次，每次5min；再加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体(二抗)，室温孵育3h，用PBST在室温下脱色摇床上洗2次，每次5min，再用PBS洗2次，每次5min；用二氨基联苯胺(DAB)底物显色，再次确认该蛋白为目的蛋白。

2.5 BCA法测蛋白的浓度

测定方法参考试剂盒说明书。使用时将Solution A摇晃混匀，根据样品数量，按50体积Solution A加1体积Solution B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。

A.完全溶解蛋白标准品(5mg/ml BSA)，取10μl用PBS缓冲液稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml。蛋白样品与标准品使用相同的溶液进行稀释。

B.将稀释后的标准品(0.5mg/ml BSA)按0，1，2，4，8，12，16，20μl分别加到96孔板中，加标准品稀释液将所有标准品补足到20μl。

C.加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液到20μl。

D.各孔加入200μl BCA工作液，轻轻用加样枪吹打混匀(注意不要弄出气泡影响读数)37℃放置30-60min。

E.冷却到室温后，用酶标仪测定A562，或540-590nm之间的其他波长的吸光度。

2.6构建过敏性小鼠哮喘模型

用Al(OH)₃佐剂乳化的美洲大蠊粗提液、BA2和PBS腹腔注射小鼠，剂量为50μg/(次·只)，共2次，间隔时间为一周。从第23天开始持续对小鼠进行5天的滴鼻试验，剂量为50μg/(次·只)。

2.7收集血清，ELISA检测IgE

在第28天收集小鼠的血液，静置后，低速离心分离血清后用于酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测IgE。具体参考试剂盒说明书操作。

(1)试剂盒取出，室温平衡35min后使用；

(2)在酶标包被板上设标准孔10孔，在第一孔、第二孔中依次加入标准品100μl、标准品稀释液50μl，混匀；

(3)从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔、第四孔，再在第三孔、第四孔中分别加入标准品稀释液50μl，混匀，混匀后再分别取50μl混合液弃去；

(4)从第三孔、第四孔中分别各取50μl分别加入第五孔、第六孔中，再在第五孔、第六孔中分别加入标准品稀释液50μl，混匀；

(5)从第五孔、第六孔中分别各取50μl加到第七孔、第八孔中，再在第七孔、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀；

(6)从第七孔、第八孔中分别各取50μl加到第九、十孔中，再在第九孔、第十孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀，混匀后再分别弃去50μl混合液。(稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为9μg/ml、6μg/ml、3μg/ml、1.5μg/ml、0.75μg/ml)

(7)加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

(8)温育：用封板膜封板后置于37℃温育30min。

(9)加入50μl显色液A和50μl显色液B，37℃避光条件下显色15min，加入50μl终止液终止显色反应，酶标板读取A450值。

2.8肺泡灌洗及小鼠肺组织切片

麻醉小鼠后，使用PBS通过静脉留置针反复灌洗小鼠肺部，收集液体，离心后，收集上清液保存于-80℃，用于IL-4、IL-5和IL-13细胞因子检测。留取肺泡灌洗液后，打开胸腔把左肺中下叶靠近肺门部取出3mm³肺组织，置于中性福尔马林溶液中，采用HE染色后光学显微镜下观察有无炎症反应。

2.8.1 IL-4检测

(1)标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一孔、第二孔中各加入标准品100μl、标准品稀释液50μl，混匀；从第一孔、第二孔中各取100μl分别加入第三孔和第四孔，再在第三孔、第四孔分别加入标准品稀释液50μl，混匀，混匀后再分别取50μl混合液弃去；从第三孔、第四孔中各取50μl分别加入第五孔、第六孔中，再在第五孔、第六孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀；从第五孔、第六孔中各取50μl分别加入第七孔、第八孔中，再在第七孔、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀；从第七孔、第八孔中分别取50μl加入第九孔、第十孔中，再在第九孔、第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；混匀后再分别取50μl混合液弃去。

(2)加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

(3)温育：用封板膜封板后置37℃温育30min。

(4)配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。

(5)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次，拍干。

(6)加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

(7)温育：用封板膜封板后置37℃温育30min。

(8)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次，拍干。

(9)显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15min。

(10)终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。

(11)测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15min以内进行。

2.8.2 IL-5检测与IL-13检测

具体参考试剂盒说明书和2.8.1操作。

2.9脾细胞上清液细胞因子测定

无菌条件下剖开小鼠的腹腔取脾，研磨过200目筛网，将冲洗脾脏的培养液转入离心管中，1500r/min，离心5min，倒掉上清，加入6ml红细胞裂解液EDTA-NH4Cl混匀，静置5min，1500rpm，5min后将上清弃掉，然后D-Hanks重悬和离心，洗涤两次(1500r/min，5min)，弃上清；用2.5ml RPMI-1640完全培养基重悬细胞，制成单个脾细胞悬液；将配好的脾细胞培养基(完全培养基)重悬脾细胞并计数，将脾细胞浓度调整为5×106Cell/ml。每孔加入调整好浓度的脾细胞悬液100μl。实验组用BA2和粗蛋白提取液(25μg/ml)刺激，阴性对照组用PBS刺激，恒温培养箱培养72h，进行脾细胞上清液细胞因子检测，方法参考2.8。

2.10统计学分析

用SPSS10.0进行单因素方差分析，各组数据均用x^-±s表示。P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为有显著性差异。

3实验结果

3.1质粒pET-28a(+)-BA2的酶切鉴定

质粒pET-28a(+)-BA2双酶切后，经1％琼脂糖凝胶电泳，可见约720bp左右的电泳条带，大小与理论预计值相符如图1。经测序验证后证实为目的序列。

3.2 BA2蛋白的SDS-PAGE胶检测及Western blot分析

重组pET-28a(+)-BA2质粒转化BL21(DE3)大肠杆菌后，取含有pET-28a(+)-BA2的阳性克隆表达菌株经IPTG 37℃诱导5h后，取1ml诱导产物离心收集菌体。样品常规处理后取20μl进行SDS-PAGE分析，经考马斯亮蓝R250染色，结果显示在26kDa左右处出现了1条蛋白质表达条带，蛋白质量与预计值相符如图2。

纯化后重组蛋白进行SDS-PAGE，电转移至NC膜上，用鼠抗His标签多克隆Ig G抗体作一抗，用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠Ig G抗体(二抗)作二抗进行Western blot分析，采用DAB显色，如图3。

3.3重组蛋白浓度测定

根据说明书测定并绘制标准曲线(如图4)，得到线性方程为：y＝0.0235x+0.1007，R²＝0.9996，由此计算出重组蛋白的浓度为0.64-0.91μg/μl。

3.4血清总IgE水平的变化

采用试剂盒检测致敏第28天血清中IgE总水平，如图5。与对照组相比，BA2和蟑螂粗提液致敏组小鼠血清中总IgE浓度有明显性升高(P<0.05)。

3.5不同样品对肺泡灌洗液细胞因子的影响

为了检测BA2组、蛋白粗提液组合PBS组中四种代表性细胞因子分泌水平的变化，即Th2细胞分泌的代表性细胞因子IL-4、IL-5和IL-13，是由Th2细胞分泌的，主要用于调节T细胞、B细胞、肥大细胞、巨噬细胞等参与免疫反应。从图6、图7、图8中可以看出，BA2和蛋白粗提液刺激组肺泡灌洗液中IL-4、IL-5和IL-13含量显著高于PBS组。

3.6不同样品对细胞培养上清中的细胞因子的影响

脾细胞培养72h后，3000r/min，离心10min，收集上清，然后利用ELISA试剂盒检测血上清中IL-4、IL-5和IL-13含量。如图9、图10、图11所示，BA2和蛋白粗提液刺激组脾细胞上清液中IL-4、IL-5和IL-13含量显著高于PBS组。

4.7不同样品对肺组织的影响

显微镜下观察BA2、蛋白粗提液和PBS刺激组中小鼠肺脏的病理学变化。实验结果表明：和PBS组相比，BA2和蛋白粗提液组表现出肺泡壁增厚，伴有毛细血管，动脉和静脉充血，间质性肺炎、肺泡塌陷。PBS组基本正常，偶见少量淤血如图12。

综上所述，通过提取美洲大蠊RNA，反转录为cDNA，进行PCR扩增得到的过敏原基因，将其克隆入原核表达载体中，构建重组表达质粒pET28a(+)-BA2，转入宿主菌诱导其表达，经过纯化并鉴定，得到重组美洲大蠊过敏原蛋白BA2；分别用BA2蛋白、美洲大蠊粗提液和PBS刺激小鼠，结果显示与对照组PBS相比，BA2蛋白能明显增加小鼠血清中的IgE含量(P<0.05)，能显著增加小鼠肺泡灌洗液和小鼠脾细胞上清液中IL-4、IL-5和IL-13炎症因子的含量；通过肺组织病理切片，显示BA2和美洲大蠊粗提液组小鼠肺组织发生明显病理变化。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川好医生攀西药业有限责任公司

<120> 一种美洲大蠊过敏原蛋白BA2及其表达方法

<130> 2016

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 239

<212> PRT

<213> 美洲大蠊

<400> 1

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Ile Asp Phe Tyr Tyr Leu Pro

20 25 30

Leu Ser Ala Pro Cys Arg Ser Val Leu Leu Thr Ala Asn Ala Leu Gly

35 40 45

Val Lys Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Leu Phe Lys Gly Glu His Leu

50 55 60

Lys Pro Glu Phe Leu Lys Leu Asn Phe Gln His Cys Ile Pro Thr Leu

65 70 75 80

Asp Asp Asn Gly Phe Val Leu Trp Glu Ser Arg Ala Ile Leu Cys Tyr

85 90 95

Leu Ser Asp Gln Tyr Gly Lys Asn Asp Ser Leu Tyr Pro Lys Asp Pro

100 105 110

Lys Lys Arg Ala Val Val Asp Gln Arg Leu Phe Phe Asp Ser Gly Thr

115 120 125

Leu Tyr Gln Arg Phe Leu Asp Tyr Tyr Ser Pro Ile Met Phe Ser Gly

130 135 140

Ala Glu Pro Asp Thr Ala Lys Phe Ala Lys Leu Glu Glu Gly Phe Gln

145 150 155 160

Phe Phe Asp Lys Tyr Leu Glu Gly Gln Thr Trp Val Ala Gly Thr His

165 170 175

Leu Thr Ile Ala Asp Leu Ala Leu Val Thr Thr Ala Ser Ser Ala Glu

180 185 190

Ala Phe Gly Phe Asp Val Lys Lys Tyr Pro Asn Val Ser Lys Trp Leu

195 200 205

Ala Asn Ala Lys Lys Thr Ile Pro Asn Tyr Glu Glu Leu Asn His Ala

210 215 220

Gly Cys Met Asp Tyr Lys Gln Phe Tyr Glu Ser Lys Thr Lys Lys

225 230 235

<210> 2

<211> 216

<212> PRT

<213> 美洲大蠊

<400> 2

Met Thr Ile Asp Phe Tyr Tyr Leu Pro Leu Ser Ala Pro Cys Arg Ser

1 5 10 15

Val Leu Leu Thr Ala Asn Ala Leu Gly Val Lys Leu Asn Leu Lys Leu

20 25 30

Leu Asp Leu Phe Lys Gly Glu His Leu Lys Pro Glu Phe Leu Lys Leu

35 40 45

Asn Phe Gln His Cys Ile Pro Thr Leu Asp Asp Asn Gly Phe Val Leu

50 55 60

Trp Glu Ser Arg Ala Ile Leu Cys Tyr Leu Ser Asp Gln Tyr Gly Lys

65 70 75 80

Asn Asp Ser Leu Tyr Pro Lys Asp Pro Lys Lys Arg Ala Val Val Asp

85 90 95

Gln Arg Leu Phe Phe Asp Ser Gly Thr Leu Tyr Gln Arg Phe Leu Asp

100 105 110

Tyr Tyr Ser Pro Ile Met Phe Ser Gly Ala Glu Pro Asp Thr Ala Lys

115 120 125

Phe Ala Lys Leu Glu Glu Gly Phe Gln Phe Phe Asp Lys Tyr Leu Glu

130 135 140

Gly Gln Thr Trp Val Ala Gly Thr His Leu Thr Ile Ala Asp Leu Ala

145 150 155 160

Leu Val Thr Thr Ala Ser Ser Ala Glu Ala Phe Gly Phe Asp Val Lys

165 170 175

Lys Tyr Pro Asn Val Ser Lys Trp Leu Ala Asn Ala Lys Lys Thr Ile

180 185 190

Pro Asn Tyr Glu Glu Leu Asn His Ala Gly Cys Met Asp Tyr Lys Gln

195 200 205

Phe Tyr Glu Ser Lys Thr Lys Lys

210 215

<210> 3

<211> 651

<212> DNA

<213> 美洲大蠊

<400> 3

atgacgattg acttctacta cttgcccctc agtgcaccgt gccgatctgt tctgctcact 60

gcaaacgcgc tgggagtaaa actcaaccta aagctcttgg atctgttcaa aggggaacat 120

cttaaaccgg aattcctcaa gctcaatttc caacactgca taccgactct ggacgacaac 180

ggcttcgttt tgtgggagag ccgggctatt ctgtgctatc tgtctgacca gtacggaaag 240

aatgattctc tgtatcctaa ggatccaaag aaacgcgctg ttgtcgacca gaggctcttt 300

ttcgactccg gaactctgta ccagaggttc ttggattatt attccccaat tatgttttct 360

ggcgccgaac ccgatactgc caagttcgcc aagctggagg aagggtttca gttcttcgac 420

aagtacctgg agggtcagac gtgggtcgcc ggcacgcact tgaccatcgc agacctggca 480

cttgtcacaa cagcgtctag tgcagaggcg tttggatttg atgtgaaaaa gtatcccaac 540

gtttctaagt ggctggcgaa tgcgaagaag accattccaa actacgagga actgaaccat 600

gccggatgca tggattacaa gcagttctac gagtccaaaa caaaaaaatg a 651

Claims (9)

1.一种美洲大蠊过敏原蛋白BA2，其特征在于，所述过敏原蛋白BA2的氨基酸序列如SEQID No.1所示。

2.一种美洲大蠊过敏原蛋白BA2，其特征在于，所述过敏原蛋白BA2的氨基酸序列由质粒所表达的氨基酸序列和过敏原基因所表达的氨基酸序列组成，其中过敏原基因所表达的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.一种美洲大蠊过敏原蛋白BA2的表达方法，其特征在于，所述表达方法包括以下步骤：

a.从美洲大蠊组织中提取总RNA，反转录成cDNA；

b.以cDNA为模板进行PCR扩增反应，获得美洲大蠊过敏原的编码基因片段SEQ IDNo.3；

c.设计并合成酶切位点引物：

BA2-F 5’-CGGCTAGCATGACGATTGACTTCTACTACTT-3’

BA2-R 5’-CCGCTCGAGTCATTTTTTTGTTTTGGACTCG-3’

d.将步骤b所获得的编码基因克隆入原核表达载体中，构建重组表达质粒；

e.将步骤d获得的重组质粒转入宿主菌，诱导其表达并纯化蛋白。

4.根据权利要求2所述的一种美洲大蠊过敏原蛋白BA2的表达方法，其特征在于，所述表达方法中选用的表达载体为pET-28a(+)。

5.根据权利要求2所述的一种美洲大蠊过敏原蛋白BA2的表达方法，其特征在于，所述表达方法中选用的双酶切位点为Nhe I和Xho I酶切位点。

6.根据权利要求2所述的一种美洲大蠊过敏原蛋白BA2的表达方法，其特征在于，所述表达方法中选用的宿主菌为大肠杆菌BL21。

7.根据权利要求2所述的一种美洲大蠊过敏原蛋白BA2的表达方法，其特征在于，所述表达方法中采用IPTG诱导表达，其中IPTG的终浓度为0.2mmol/L，诱导温度为37℃，诱导时间5～6h。

8.根据权利要求2所述的一种美洲大蠊过敏原蛋白BA2的表达方法，其特征在于，所述表达方法中选用亲和层析方法纯化重组蛋白BA2，其中缓冲液包含磷酸钠和咪唑。

9.根据权利要求1所述的一种美洲大蠊过敏原蛋白BA2，其特征在于，所述BA2蛋白为一种可诱发哮喘的过敏原蛋白。