CN110590930A - 美洲大蠊生长因子pdgf在制备损伤修复药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种美洲大蠊生长因子PDGF在制备损伤修复药物中的应用,本发明所述的美洲大蠊生长因子PDGF是通过导入大肠杆菌进行原核表达,再对表达后的产物进行鉴定、纯化得到,再进一步将纯化后的PDGF用于机械损伤模型小鼠进行修复活性测定,结果显示美洲大蠊PDGF对小鼠机械损伤具有较强的修复活性。本发明通过对美洲大蠊生长因子PDGF修复活性进行研究,为新型损伤修复药物的开发提供了新的思路。

Description

美洲大蠊生长因子PDGF在制备损伤修复药物中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域,特别涉及一种美洲大蠊生长因子PDGF在制备损伤修复药物中的应用。
背景技术
随着现代分子生物学及细胞生物学技术的不断发展,人们对创伤修复的认识逐步加深。组织创伤修复的过程,既是各种细胞增殖、分化、迁移、凋亡和消失的过程,同时也是一系列不同类型细胞、结构蛋白、生长因子和蛋白激酶等形成网络式交互作用的结果。现已证实,生长因子在烧伤创面修复中具有相当显著的作用,调控着创面修复的各个阶段。生长因子不仅促进成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化,同时随着创面的愈合也启动细胞凋亡信号促使肉芽中的肌成纤维细胞减少,消失,最终完成组织修复过程。PDGF即血小板衍生生长因子,是重要的促细胞有丝分裂剂,能够使细胞进入增值状态,诱导成纤维细胞分裂增殖,刺激创面成纤维细胞、炎性细胞浸润及肉芽组织的形成。
美洲大蠊(Periplaneta americana)属昆虫纲,蜚蠊目,蜚蠊科,俗称蟑螂。广泛分布于热带、亚热带地区,全世界发现并记录的种类约3000余种,中国蟑螂种类记载已超过500余种,但其中被开发利用的仅有几种,美洲大蠊就是代表性的一种。但美洲大蠊生长因子PDGF目前还未有相关信息的报道,故通过转录组获取PDGF基因相关信息并通过原核表达,经纯化后得到美洲大蠊PDGF。对美洲大蠊PDGF修复活性进行验证,探究是否具有促进组织损伤修复作用。这会对美洲大蠊生长因子类的开发利用提供基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种美洲大蠊生长因子PDGF,该生长因子通过原核表达再进行纯化得到蛋白,该蛋白可用于制备促进机械损伤修复的药物,为新型治疗机体损伤药物的开发提供依据。
本发明提供给了一种美洲大蠊生长因子PDGF,所述的美洲大蠊生长因子PDGF其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示,其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
还提供了一种美洲大蠊生长因子PDGF的表达方法,所述的表达方法,包括以下步骤:
a.从转录组数据中筛选出美洲大蠊PDGF基因,用ORF Finder在线软件找出美洲大蠊PDGF基因中最大ORF;并将ORF用SignalP 4.1Serverj进行信号肽分析,将信号肽去除,进行密码子优化,并合成;
b.将载体pET32a(+)用限制性内切酶BamH I、Not I进行双酶切,双酶切体系为:ddH2O为16微升,BamHI为2微升,NotI为2微升,10×buffer为4微升,质粒为16微升;于37℃孵育15min;将美洲大蠊PDGF基因连接进pET32a(+)载体,构建载体所用引物为:
F1-PDGF:ATCGTCGCTTTCAGGGTCGTG
R1-PDGF:GCGGCCGCTTAACGATTATTTTTC
PCR反应条件:98℃预变性2min;98℃变性10s,62℃退火15s,72℃延伸15s,25个循环;72℃延伸5min;
c.将连接后的重组载体转化入大肠杆菌,诱导其表达并纯化蛋白。
进一步,所述的美洲大蠊生长因子PDGF在制备损伤修复药物中的应用。
进一步,所述的美洲大蠊生长因子PDGF在制备机械损伤修复药物中的应用。
与现有技术相比,本发明具有以下三个方面的有益效果:
1.本发明所述的美洲大蠊生长因子PDGF为美洲大蠊新型表达蛋白,目前还未有关于美洲大蠊生长因子PDGF基因及蛋白相关报道;
2.本发明首次证明美洲大蠊生长因子PDGF具有促进小鼠机械损伤愈合的作用,为新型治疗机体机械损伤药物开发提供了新的思路。
3.美洲大蠊生长因子PDGF的促进小鼠机械损伤愈合率较高,比已市售药物康复新液及重组牛碱性成纤维生长因子外用溶液愈合率高,故具有药物开发意义。
附图说明
图1是美洲大蠊生长因子PDGF菌体表达SDS-PAGE电泳鉴定,其中泳道M为Marker、泳道1为未诱导菌体沉淀、泳道2为诱导后菌体沉淀
图2是美洲大蠊PDGF复性后Naive-PAGE电泳图,其中泳道1为复性后PDGF、泳道2为未复性的PDGF
图3是蛋白测定标准曲线
图4是美洲大蠊生长因子PDGF对小鼠机械损伤的愈合率,其中A:PDGF高剂量、B:PDGF中剂量、C:PDGF低剂量、D:康复新液、E:重组牛碱性成纤维细胞生长因子组、F:阴性对照组Control
具体实施方式
以下结合实施例的具体实施方式对本发明的内容作进一步的详细说明,但不应理解为本发明所要求保护的范围仅限定于以下所述的实施例中,本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1美洲大蠊生长因子PDGF原核表达
1实验材料
菌株:大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21
载体:pET32a(+)
限制性内切酶:BamH I、Not I
培养基:LB培养基
2实验方法
(1)将美洲大蠊PDGF从转录组数据中筛选出来;
(2)对美洲大蠊PDGF基因进行ORF、信号肽、密码子分析;
(3)用ORF Finder在线软件找出美洲大蠊PDGF基因中最大ORF;并将ORF用SignalP4.1Serverj进行信号肽分析,将信号肽去除;将去除信号肽的基因送去公司进行密码子优化,并合成;
(4)将载体pET32a(+)用限制性内切酶BamH I、Not I进行双酶切,双酶切体系如表1,于37℃孵育15min。构建载体所用引物如表2,将美洲大蠊PDGF基因连接进pET32a(+)载体;PCR反应条件:98℃,2min;【98℃,10s;62℃,15s;72℃,15s;25个循环】;72℃,5min;
表1双酶切体系
表2构建载体所用引物
(5)将连接后的重组载体转化入大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21,涂平板后于37℃培养箱培养16h,挑取单克隆进行鉴定,鉴定后送去公司测序;
(6)将测序正确的菌株取100微升接种于10mL LB培养基,进行37℃摇床培养4h,然后加入IPTG至终浓度0.5mM,于25℃恒温摇床培养6h,进行诱导表达。
(7)将诱导后的10mL菌液取1mL进行离心8000rpm,10min,得到上清液与沉淀,分别取20微升上清液,并用20微升蒸馏水重悬沉淀,然后在上清液及重悬后的沉淀分别加入5微升5×SDS loading buffer,再进行沸水浴10min,取出后进行离心,12000rpm,2min,最后进行SDS-PAGE电泳进行鉴定;
3实验结果
通过诱导及未诱导菌体沉淀SDS-PAGE电泳对比,发现诱导后的菌体沉淀在49.87kDa处有PDGF蛋白目的条带(如图1所示),即诱导表达成功。
实施例2美洲大蠊生长因子PDGF表达形式鉴定并纯化
1实验材料与方法
1.1实验材料
菌株:重组载体pET32a(+)-PDGF转化后的大肠杆菌BL21
培养基:LB培养基
1.2实验方法
(1)取500微升重组载体pET32a(+)-PDGF转化后的大肠杆菌BL21接种于50mL LB培养基,于进行37℃摇床培养4h,然后加入IPTG至终浓度0.5mM,于25℃培养6h,进行诱导表达。
(2)将诱导后的50mL菌液进行离心8000rpm,10min,去掉上清液,收集沉淀,用5mL50mM pH7.4PB缓冲液重悬沉淀,于细胞粉碎机进行细胞破碎,3s plus/7s stop,45%P,30min。将破碎后的细胞进行8000rpm,10min离心,得到上清液与沉淀,分别进行SDS-PAGE电泳检测,发现目的蛋白在沉淀中,为包涵体表达。
(3)将包涵体先用含2M尿素、1m M EDTA、pH8.0 50mM Tris-Hcl缓冲液进行洗涤,离心12000rpm,10min去上清液,再用去掉EDTA的含2M尿素的pH8.050mM Tris-Hcl进行洗涤,离心12000rpm,10min去上清液,收集沉淀。
(4)用含8M尿素的pH8.0 50mM Tris-Hcl缓冲液进行包涵体变性。
将变性后的包涵体进行12000rpm,10min离心,将上清液用0.25微摩孔径的滤膜进行过滤。
(5)将过滤后的上清液进行上柱,用His柱进行纯化。
(6)纯化后的样品进行SDS-PAGE电泳检测,将较为纯的样品进行梯度浓度尿素(6M-0M)透析复性。
(7)将复性后的样品进行-PAGE电泳检测。
(8)对复性后的样品进行浓度测定,根据碧云天BCA浓度测定试剂盒进行测定。
2实验结果
对纯化后的PDGF进行透析复性,经复性后进行Naive-PAGE电泳验证,通过透析复性前及透析复性后对比,发现复性后有49.87kDa条带(如图2所示),表明复性成功。并经过BCA试剂盒浓度测定,浓度为0.4mg/ml。
按BCA浓度测定试剂盒进行浓度测定,先进行标准蛋白的测定,绘制标准曲线,按照标准曲线计算各蛋白液的浓度。如表3所示为标准蛋白液BSA的浓度测定,并绘制标曲(图3)。
表3标准蛋白液BSA浓度测定结果
实施例3美洲大蠊生长因子PDGF对小鼠机械损伤修复
1材料与方法
1.1实验材料
药品:复性后的PDGF纯品、康复新液(四川好医生攀西药业有限责任公司)、重组牛碱性成纤维细胞生长因子外用溶液(重组牛FGF)(贝复济,珠海亿胜生物制药有限公司);
实验动物:SPF级云南小鼠,雄性,体重30-35g,8周龄,购买于成都达硕实验动物有限公司,合格证号SCXK(川)2015-030。
1.2实验方法
(1)小鼠机械损伤模型建立:先在小鼠背部用8%硫化钠进行脱毛处理,脱毛后进行伤口模型的建立,在背部用剪刀剪出1cm2左右伤口,机械损伤模型建立。
(2)实验分组:将小鼠分为6组,每组5只小鼠。分为PDGF高剂量(A)、中剂量(B)、低剂量(C)三个试验组,见表1,及康复新液(D)、重组牛碱性成纤维细胞生长因子外用溶液(E)两个阳性对照组及一个阴性对照组Control(F),其中高浓度PDGF与康复新液组浓度相同,中浓度PDGF与重组牛碱性成纤维细胞生长因子外用溶液浓度相同,如表4。
表4各蛋白药剂浓度
(3)实验方法
每天对各组小鼠分别进行涂药一次,并对伤口进行拍照观察,通过用ImaginJ软件计算小鼠伤口面积,并进行愈合率计算,公式如下:
2实验结果
通过计算各组小鼠伤口愈合率,结果如表5和图4。
表5各蛋白溶液愈合率统计
实验结果显示,PDGF生长因子对小鼠机械损伤修复愈合率与浓度和时间呈正相关性;高浓度的PDGF对小鼠的愈合率相对于同浓度的阳性对照康复新液及重组牛碱性成纤维细胞生长因子外用溶液组的愈合率高,说明本发明所述的美洲大蠊生长因子具有较强的修复作用。
序列表
<110> 四川好医生攀西药业有限责任公司
<120> 美洲大蠊生长因子PDGF在制备损伤修复药物中的应用
<130> 20180608
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 297
<212> PRT
<213> 美洲大蠊(Periplaneta americana)
<400> 1
Met Ala Leu Ser Cys Val Ser Phe Leu Tyr Val His Leu Leu Val Val
1 5 10 15
Ile Val Thr Ala Asp Arg Arg Phe Gln Gly Arg Gly Gly Arg Ala Gln
20 25 30
Arg Thr Ile Leu Gln Asp Ser Thr Leu Tyr Gln Pro Asp Glu Arg Lys
35 40 45
Pro Gln Thr Asn Pro Arg Phe Ala Arg Lys Leu Asn Glu Ile Gly Ser
50 55 60
Val Phe Glu Leu Ala Ser Leu Leu Ala Ser Arg Asp Arg Arg Phe Cys
65 70 75 80
Thr Asn Lys Thr Ile Thr Asn Leu Gln Glu Val Ile Glu Arg Asn Asn
85 90 95
Tyr Thr Thr Ile Gln Lys Glu Glu Phe Leu Thr Asn Leu Asn Lys Gln
100 105 110
Cys Thr Glu Asn Met Asp Thr Arg Arg Arg Tyr Lys Ile Glu Arg Ile
115 120 125
Ile Thr Gln His Asp Leu Thr Lys Met Gly Ile Val Ser Leu Glu Ala
130 135 140
Lys Lys Met Lys Cys Arg Pro Lys Lys Thr Ala Val Glu Leu Pro Glu
145 150 155 160
Ala Arg Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Pro Gln Cys Val Ser Leu Gln Arg
165 170 175
Cys Ser Gly Cys Cys Asn Ser Asp Leu Leu Glu Cys Lys Pro Thr Lys
180 185 190
Val Thr Thr Val Lys Lys Trp Ile Leu Glu Met Asn Ser Leu Leu Asp
195 200 205
Tyr Ser Lys Pro Val Leu Leu Ser Leu Lys Gln His Lys Lys Cys Glu
210 215 220
Cys Gly Cys Lys Ile Leu Ala Ser His Cys Asn Lys Ala Gln Ile Tyr
225 230 235 240
Asp Glu Asp Ser Cys Gln Cys Arg Cys Arg Leu Asp Ser Glu Glu Asp
245 250 255
Cys Gly Asp Glu Lys Met Trp Asp Pro Thr Leu Cys Lys Cys Val Cys
260 265 270
Lys Arg Ser Pro Ser Cys Ser Thr Gly Ala Asp Phe Asp Tyr Thr Ser
275 280 285
Cys Arg Cys Lys Leu Lys Asn Asn Arg
290 295
<210> 2
<211> 894
<212> DNA
<213> 美洲大蠊(Periplaneta americana)
<400> 2
atggcattgt cttgtgtttc attcctttac gtacacttgc tcgtcgtcat agttaccgct 60
gatagacgtt tccaaggaag aggcggccga gcacaaagaa ccattctcca ggattcaact 120
ctgtaccagc ctgatgaacg gaagcctcag acgaatccac gctttgccag aaaactcaac 180
gagattgggt cagtgtttga gttggcatcc ctgctggctt ccagagatcg acgcttttgt 240
accaacaaaa caataactaa cctgcaggaa gtaatcgaaa gaaacaatta tactacaata 300
cagaaagagg agtttctaac aaatctgaac aaacagtgca ctgaaaacat ggatacaaga 360
agaagatata aaatagaaag aattatcacc cagcacgacc taactaagat gggaatagtg 420
agtttagagg ccaaaaagat gaagtgcagg cccaagaaga ctgcagtaga gctcccagag 480
gctcgttacg ggtacactta ctaccctcaa tgcgtgtcgc tgcagaggtg tagcggctgc 540
tgcaacagtg accttctcga gtgcaaacct accaaagtca ctacagtaaa aaaatggatt 600
ctggaaatga attcactact cgactactcc aaacctgttt tgctatcatt gaagcaacac 660
aagaaatgtg agtgtggatg caagatattg gctagtcact gcaataaggc ccagatatac 720
gacgaagact cctgccagtg cagatgtcgg ctcgattcgg aagaagactg cggggacgag 780
aagatgtggg accccacgct gtgcaaatgc gtgtgcaagc gctcgccgtc ttgctccaca 840
ggtgccgatt ttgattacac ttcttgcagg tgcaaactaa aaaataacag ataa 894

Claims (5)

1.一种美洲大蠊生长因子PDGF,其特征在于,所述的美洲大蠊生长因子PDGF的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示。
2.一种美洲大蠊生长因子PDGF,其特征在于,所述的美洲大蠊生长因子PDGF其核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。
3.一种美洲大蠊生长因子PDGF的表达方法,其特征在于,所述的表达方法,包括以下步骤:
a.从转录组数据中筛选出美洲大蠊PDGF基因,用ORF Finder在线软件找出美洲大蠊PDGF基因中最大ORF;并将ORF用SignalP 4.1Serverj进行信号肽分析,将信号肽去除,进行密码子优化,并合成;
b.将载体pET32a(+)用限制性内切酶BamH I、Not I进行双酶切,双酶切体系为:ddH2O为16微升,BamHI为2微升,NotI为2微升,10×buffer为4微升,质粒为16微升;于37℃孵育15min;将美洲大蠊PDGF基因连接进pET32a(+)载体,构建载体所用引物为:
F1-PDGF:ATCGTCGCTTTCAGGGTCGTG
R1-PDGF:GCGGCCGCTTAACGATTATTTTTC
PCR反应条件:98℃预变性2min;98℃变性10s,62℃退火15s,72℃延伸15s,25个循环;72℃延伸5min;
c.将连接后的重组载体转化入大肠杆菌,诱导其表达并纯化蛋白。
4.根据权利要求1所述的一种美洲大蠊生长因子PDGF,其特征在于,所述的美洲大蠊生长因子PDGF在制备损伤修复药物中的应用。
5.根据权利要求1所述的一种美洲大蠊生长因子PDGF,其特征在于,所述的美洲大蠊生长因子PDGF在制备机械损伤修复药物中的应用。
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