JP4686710B2 - スギ花粉由来の新規アレルゲンおよびその利用 - Google Patents

Description

本発明は、スギ花粉に由来する新規アレルゲンおよび当該新規アレルゲンを用いたスギ花粉アレルギーの診断・治療に関するものである。

スギ花粉症は、スギ林から早春に飛散するスギ花粉を吸収することによって起こるアレルギー疾患であり、鼻炎や皮膚炎、喘息発作などの即時型のアレルギー反応を誘発するものである。近年、スギ花粉症にかかる患者の数は急増し、スギ花粉症は深刻な社会問題となっている。

そこで、これまでにスギ花粉症に対する各種の治療方法が考案されている。当該治療方法のうちのひとつとして、スギ花粉に含まれるアレルゲンを用いた減感作療法が挙げられる。

この減感作療法は、アレルギー疾患の抜本的な治療方法のひとつであり、アレルギー反応を誘発しない程度の少量のアレルゲンを血液中に注射し、当該アレルゲンに対する感受性を低下させることにより、当該アレルギー疾患を治療する方法である（非特許文献１、２）。

スギ花粉症の場合には、スギ花粉症のアレルギー反応を誘発するアレルゲン（以下では、「スギ花粉アレルゲン」と称す）をヒトの免疫系が認識することが引き金となって発症する。従って、スギ花粉症の減感作療法においては、スギ花粉アレルゲンが少量ずつ血液中に注射される。

スギ花粉アレルゲンとして、これまでにＣｒｙ ｊ１（非特許文献３）およびＣｒｙ ｊ２（非特許文献４）が同定されている。Ｃｒｙ ｊ１は、ペクテートリアーゼ活性を有するタンパク質であり、Ｃｒｙ ｊ２は、ペクチン分解活性を有するタンパク質である。これらのスギ花粉アレルゲンは、スギ花粉症の主要なアレルゲンであると考えられており、これらのスギ花粉アレルゲンを用いてスギ花粉症の診断や減感作療法が行われている。

一方、Ｃｒｙ ｊ１およびＣｒｙ ｊ２以外のスギ花粉アレルゲンも同定されている。例えば、特許文献１において、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動によって測定される分子量が５７０００〜６７０００ダルトンであり、等電点がｐＨ７．０〜９．０の範囲にあるスギ花粉由来のアレルゲンが開示されている。また、非特許文献５に記載の研究では、Ｃｒｙ ｊ２の同族タンパク質が同定されている。
Sigeta, S. et al., Arerugi, 39(3), 313-21 (1990) Bousquet, J. et al., J. Allergy Clin. Immunol. 102, 558-62 (1998) Yasueda, H. et al., J. Allergy Clin. Immunol., 71, 77-86 (1983). Sakagucji, H. et al., Allergy, 45, 309-312 (1990) Fujimura, T. et al., Int. Arch. Allergy Immunol., 133, 125-135 (2004) 特開２００１-１５１７９７公報（公開日；２００１年６月５日）

しかしながら、これまで同定されたスギ花粉アレルゲン以外のアレルゲンによってアレルギー反応が誘発されるスギ花粉症も多く、スギ花粉症患者一人ひとりに対して、当該スギ花粉症患者に適した診断や減感作療法を行うためには、より多くのスギ花粉アレルゲンを同定する必要がある。

本発明は、上記の問題点を解決するためになされたもので、その目的は、スギ花粉症の診断や治療に役立つ新規のスギ花粉アレルゲンを提供することにある。

本発明者らは、上記の課題を解決するために、スギ花粉に含まれる新規のスギ花粉アレルゲンを同定した。この新規のスギ花粉アレルゲンは、発明者らによりＣＪＰ３８と命名された。ＣＪＰ３８は、スギ花粉症患者の血清に含まれる抗体により認識されるが、健常者の血清に含まれる抗体によっては認識されない。上記の結果から、本発明者らは、ＣＪＰ３８が新規のスギ花粉アレルゲンであると結論付け、本発明を完成させるに至った。

即ち、本発明は、学術上または産業上有用な方法・物質として、下記Ａ）〜Ｏ）の発明を含むものである。

Ａ）スギ花粉に含まれるアレルゲンであって、１，３-beta-グルカナーゼ活性を有することを特徴とするタンパク質。

Ｂ）以下の（ａ）または（ｂ）に記載のスギ花粉に含まれるタンパク質。

（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。

（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１個または複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アレルゲン活性を有するタンパク質。

Ｃ）Ａ）またはＢ）のタンパク質をコードする遺伝子。

Ｄ）配列番号３に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有するＢ）の遺伝子。

Ｅ）配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アレルゲン活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。

Ｆ）Ａ）またはＢ）のタンパク質を認識する抗体。

Ｇ）Ｃ）〜Ｅ）の何れかの遺伝子を含むベクター。

Ｈ）Ｃ）〜Ｅ）の何れかの遺伝子を導入してなる形質転換体。

Ｉ）Ｇ）のベクターを用いることを特徴とするタンパク質の製造方法。

Ｊ）Ｈ）の形質転換体を用いることを特徴とするタンパク質の製造方法。

Ｋ）Ａ）またはＢ）のタンパク質に含まれるペプチドであって、スギ花粉症患者由来のＴ細胞を増殖させる活性を有することを特徴とするペプチド。

Ｌ）Ｃ）〜Ｅ）の何れかの遺伝子における少なくとも一部の塩基配列またはその相補配列をプローブとして用いた遺伝子検出装置。

Ｍ）Ａ）またはＢ）のタンパク質を含むことを特徴とするアレルギー診断用薬剤。

Ｎ）下記（１）または（２）の物質を含む減感作治療用薬剤。

（１）Ａ）またはＢ）のタンパク質。

（２）Ｆ）の抗体。

本発明にかかるタンパク質は、以上のように、スギ花粉に含まれるアレルゲンであって、１，３-beta-グルカナーゼ活性を有することを特徴とするタンパク質である。

また、上記タンパク質の一例として、スギ花粉に含まれるタンパク質であって、（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１個または複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アレルゲン活性を有するタンパク質、を挙げることができる。

それゆえ、本発明のタンパク質（アレルゲン）を当該アレルゲンに対してアレルギー反応を起こすスギ花粉症患者に投与することにより、当該スギ花粉症を治療することができるという効果を奏する。さらに、本発明のタンパク質をスギ花粉症の診断用薬剤として用いることにより、従来よりも信頼性の高いスギ花粉症の診断を行うことができるという効果を奏する。

本発明の実施の形態について以下に説明するが、本発明は以下の記載に限定されるものではない。

（１）本発明に係るタンパク質およびその遺伝子の特徴
本発明に係るタンパク質は、スギ花粉に含まれるスギ花粉症のアレルゲンであって、植物由来の１，３-beta-グルカナーゼと高い相同性を有し、１，３-beta-グルカナーゼ活性を有するものである。本実施の形態では、本発明に係るタンパク質の一例として、スギ花粉アレルゲンＣＪＰ３８（以下では、単に「ＣＪＰ３８」と称する）を挙げて説明する。

（１−１）本発明に係るタンパク質の特徴
本発明のＣＪＰ３８は、配列番号１に示すアミノ酸配列（３４８アミノ酸残基）からなるタンパク質であり、スギ花粉に含まれているものである。また、ＣＪＰ３８のアミノ酸配列は、ＣＪＰ３８をコードする遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列とともに図３にも示されている。

このＣＪＰ３８は、図４に示すように、植物由来の１，３-beta-グルカナーゼと高い相同性を有している。図４には、ＣＪＰ３８のアミノ酸配列と植物由来の１，３-beta-グルカナーゼとを比較した結果が示されており、ＣＪＰ３８のアミノ酸残基と同一のアミノ酸残基を他の植物由来の１，３-beta-グルカナーゼが有している場合には、当該アミノ酸残基を太字で表している。具体的には、ＣＪＰ３８は、パラゴムノキの１，３-beta-グルカナーゼであるＨｅｖ ｂ２（配列番号９）と約４３％、オリーブの１，３-beta-グルカナーゼであるＯｌｅ ｅ９（配列番号１０）と約４０％、トマト（L. esculentum）の１，３-beta-グルカナーゼ（配列番号１１）と４７％の相同性を有している。

実際に、本発明のＣＪＰ３８は１，３-beta-グルカナーゼ活性を有していることが、本発明の発明者らによって確認された。上記活性は、下記の方法で測定することができる。すなわち、1,3-beta-グルカン含量の高いカードラン、ラミナランを基質溶液として用いて酵素反応を行った後、生成した還元糖をソモジーネルソン（Somogyi-Nelson）法によって測定することにより測定できる。上記ソモジーネルソン法は、弱アルカリ性銅溶液中で還元糖の存在により生じた酸化銅（Ｉ）を硫酸酸性においてモリブデン酸塩と反応させ、モリブデンブルーに還元して、その吸光度（500 nm）を測定するものである。

また、本発明のＣＪＰ３８は、スギ花粉症のアレルゲンである。すなわち、後述する実施例に示すようにスギ花粉症患者の血清に含まれるＩｇＥ抗体によって認識され、当該スギ花粉症患者のアレルギー反応を誘発する。換言すれば、ＣＪＰ３８は、当該ＣＪＰ３８を認識するＩｇＥ抗体を血清中に有しているヒトに対して、アレルギー反応を誘発する。

なお、本発明に係るタンパク質は、アミノ酸がペプチド結合してなるポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含む複合タンパク質であってもよい。したがって、ＣＪＰ３８は、配列番号１に示されるアミノ酸配列以外に、他の構造を含む複合タンパク質であっても良い。ここでいうポリペプチド以外の構造としては、糖鎖やイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。

あるいは、本発明に係るタンパク質は、Ｃｒｙ ｊ１やＣｒｙ ｊ２など、他のアレルゲンタンパク質と融合させて使用してもよい。また、本発明に係るタンパク質は、その一部分、特にＴ細胞によって特異的に認識されるエピトープを含む部分（Ｔ細胞エピトープペプチド）、のみを利用するようにしてもよい。上記Ｔ細胞エピトープペプチドとは、スギ花粉症患者由来Ｔ細胞を増殖させる活性を有することと特徴とするペプチドのことを意味する。また「スギ花粉症患者由来のＴ細胞を増殖させる活性」とは、スギ花粉症患者由来の末梢血単核細胞群（Ｔ細胞が多く含まれる）を、Ｔ細胞エピトープペプチドの存在下で培養したときに、該末梢血単核細胞群のＤＮＡ合成速度を、該ペプチドの非存在下で培養した末梢血単核細胞群の２倍を越える速度、より好ましくは５倍以上の速度にする活性のことを意味する。

なお、上記Ｔ細胞は、体内に取り込まれたアレルゲンを認識し、ＩｇＥ抗体の産生を促す細胞である。したがって、Ｔ細胞がアレルゲンを認識する能力が低下すれば、当該アレルゲンに対するＩｇＥ抗体の産生量は低下し、それに伴い当該アレルゲンによって誘発されるアレルギー反応は沈静化する。そこで減感作療法では、微量のアレルゲンを当該アレルゲンに対してアレルギー反応を誘発する患者に投与することにより、当該アレルゲンに対するＴ細胞の感受性を低下させる。したがって、本発明に係るタンパク質のＴ細胞エピトープペプチドは、スギ花粉症患者に対する減感作療法において利用することができる。

Ｔ細胞エピトープペプチドの同定は、適宜公知の方法を用いることが可能であるが、例えば以下のようにして同定することができる。

まず本発明に係るオーバーラップペプチドを合成する。ここで「オーバーラップペプチド」とは、本発明にかかるタンパク質（例えば、ＣＪＰ３８；配列番号１）のアミノ酸配列に基づき、Ｎ末端からＣ末端に至る全アミノ酸残基をカバーするペプチドのことである。かかるオーバーラップペプチドは、市販されているペプチド自動合成装置により容易に合成することができる。これらのオーバーラップペプチドの中から、少なくとも一つのＴ細胞エピトープを含むペプチドを同定すればよい。

またＴ細胞エピトープを同定するためには、スギ花粉症患者の末梢血リンパ球から、本発明にかかるタンパク質（例えば、ＣＪＰ３８）を特異的に認識し増殖応答するＴ細胞ラインを樹立する必要がある。一般に、患者毎に反応するＴ細胞エピトープが異なるため、患者毎にＴ細胞ラインを樹立することが望ましい。

Ｔ細胞ラインの樹立するためには、通常患者の末梢血リンパ球を本発明にかかるタンパク質（例えば、ＣＪＰ３８）の存在下、７日間程度培養して抗原刺激によりＴ細胞を活性化し、さらに、活性化Ｔ細胞を、抗原と抗原提示細胞と共に７日間培養することを数回繰り返して抗原刺激することにより、抗原特異的Ｔ細胞ラインを作製することができる。しかしながら、Ｔ細胞が増殖因子のIL-2の存在下でよく増殖している場合は、抗原刺激は最初だけにすることが好ましい。Ｔ細胞ラインを数度抗原刺激すると、増殖率の高いＴ細胞が選択的に取れ、Ｔ細胞エピトープを含むペプチドを同定する場合において、エピトープによっては十分な増殖応答を示さない場合が生じるからである。なお抗原刺激に使用する本発明に係るタンパク質（ＣＪＰ３８）としては、スギ花粉から取得した天然型のものが最も望ましいが、組換えタンパク質、あるいはオーバーラップペプチドの混合物も好適に使用できる。上記本発明に係るタンパク質は、大腸菌で発現させ精製したものが利用できる。

また上記で使用する抗原提示細胞としては、Ｔ細胞ラインと同一人の末梢血リンパ球を、マイトマイシンＣ処理あるいは放射線照射して増殖能力を失わせたものが望ましい。しかし、採血回数が多くなるため、Epstein-Barr virus（EBV ）を自己のＢリンパ球に感染させトランスフォーメーションを起こさせたものは、in vitroで増殖し続けリンパ芽球様細胞株（Ｂ細胞株）となるため、このＢ細胞株を抗原提示細胞として用いてもよい。Ｂ細胞株の樹立方法は既に確立されている［組織培養の技術第二版、187-191 頁、日本組織学会編(1988.8.10) ］。

それぞれの患者固有のＴ細胞ラインが認識する、Ｔ細胞エピトープを含むペプチドは以下のようにして同定される。ここで「認識する」という意味は、Ｔ細胞レセプターが抗原エピトープ（MHC 分子を含めて）と特異的に結合し、その結果、Ｔ細胞が活性化されることを意味し、活性化の状態は、リンホカインの産生や、ＤＮＡの合成を [ ³Ｈ] チミジンの取込み量を指標として測定することにより観察される。すなわち、Ｔ細胞ラインとマイトマイシンＣ処理した同一人のＢ細胞株とを、９６穴平底プレートに播種し、オーバーラップペプチドと共に混合培養し、 [ ³Ｈ] チミジンの取込み量（cpm ）を液体シンチレーションカウンターで測定する。その際、 [ ³Ｈ] チミジンの取込みは、個々の培養系で異なるため、例えば、個々のペプチドに対するＴ細胞ラインの [ ³Ｈ] チミジン取込み量（cpm）を、抗原を添加していないコントロールの [ ³Ｈ] チミジン取込み量（cpm ）で除した数（stimulation index: SI ）が２以上のものをＴ細胞エピトープペプチドと同定する。

また、本発明に係るタンパク質は、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。このようなポリペプチドが付加される場合としては、例えば、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等によって本発明に係るタンパク質がエピトープ標識されるような場合が挙げられる。

さらに、本発明に係るタンパク質は、後述する本発明に係る遺伝子（本発明に係るタンパク質をコードする遺伝子）を宿主細胞に導入して、そのタンパク質を細胞内発現させた状態のものであってもよいし、細胞、組織などから単離精製された状態のものであってもよい。また、上記宿主細胞での発現条件によっては、本発明に係るタンパク質は、他のタンパク質とつながった融合タンパク質であってもよい。さらに本発明に係るタンパク質は、無細胞系によって合成されたものであってもよいし、化学合成されたものであってもよい。

さらに、本発明に係るタンパク質は、その一部が改変された変異タンパク質であってもよい。即ち、本発明に係るタンパク質には、（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるＣＪＰ３８のみならず、（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アレルゲン活性を有するタンパク質、すなわちＣＪＰ３８変異タンパク質も含まれる。

上記「アレルゲン活性を有するタンパク質」とは、アレルギーの原因となる抗原物質、換言すれば、スギ花粉症患者の血清に含まれるＩｇＥ抗体によって認識され、アレルギー反応を誘発するタンパク質を意味する。

上記「１個又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、及び／又は付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されることを意味する。このように、上記（ｂ）のタンパク質は、上記（ａ）のタンパク質の変異タンパク質である。なお、ここでいう「変異」は、主として公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する同様の変異タンパク質を単離精製したものであってもよい。

（１−２）本発明に係る遺伝子
本発明に係る遺伝子は、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子、およびその塩基配列の一部を改変した改変遺伝子が含まれる。本発明に係る遺伝子を適当な宿主（例えば細菌、酵母）に導入すれば、本発明に係るタンパク質をその宿主内で発現させることができる。また、例えば、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を適当なベクターに導入し、組み換えバキュロウイルスを作成し、このバキュロウイルスに昆虫の組織を感染させると、昆虫の組織において、本発明のタンパク質を発現させることができる。

本発明に係る遺伝子は、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡも包含する。アンチセンス鎖は、プローブとして又はアンチセンス薬剤として利用できる。ＤＮＡには、例えばクローニングや化学合成技術又はそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。さらに、本発明に係る遺伝子は、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。

本発明に係る遺伝子の一例として、上記ＣＪＰ３８をコードする遺伝子（説明の便宜上、ＣＪＰ３８遺伝子と称する）を挙げることができる。このＣＪＰ３８遺伝子のｃＤＮＡは、配列番号２に示されるように、全長１３１３bpであり、配列番号３に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域として有している。なお、ＣＪＰ３８遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列は、ＣＪＰ３８遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列とともに図３にも示されている。

さらに、本発明に係る遺伝子は、上記配列番号２に示される塩基配列を有する遺伝子に限定されるものではなく、配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子が含まれる。なお、上記「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７％の同一性が配列間に存在するときにのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。

上記ハイブリダイゼーションは、J.Sambrook et al. Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2d Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory（1989）に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる（ハイブリダイズし難くなる）。

（２）本発明に係るタンパク質および遺伝子の取得方法
本発明に係るタンパク質および遺伝子の取得方法（生産方法）は特に限定されるものではないが、代表的な方法として次に示す各方法を挙げることができる。

（２−１）タンパク質の取得方法
本発明に係るタンパク質を取得する方法（生産方法）は、上述したように特に限定されるものではないが、まず、本発明に係るタンパク質を発現する細胞、組織などから単純精製する方法を挙げることができる。すなわち、スギ花粉から本発明に係るタンパク質を抽出・精製してもよい。精製方法も特に限定されるものではなく、公知の方法でスギ花粉から細胞抽出液を調製し、この細胞抽出液を公知の方法、例えばカラム等を用いて精製すればよい。

また、本発明に係るタンパク質を取得する方法として、遺伝子組み換え技術等を用いる方法も挙げられる。この場合、例えば、本発明に係る遺伝子をベクターなどに組み込んだ後、公知の方法により、発現可能に宿主細胞に導入し、細胞内で翻訳されて得られる上記タンパク質を精製するという方法などを採用することができる。遺伝子の導入（形質転換）や遺伝子の発現等の具体的な方法については後述する。

なお、このように宿主に外来遺伝子を導入する場合、外来遺伝子の発現のために宿主内で機能するプロモーターを組み入れた発現ベクター及び宿主には様々なものが存在するので、目的に応じたものを選択すればよい。産生されたタンパク質を精製する方法は、用いた宿主、タンパク質の性質によって異なるが、タグの利用等によって比較的容易に目的のタンパク質を精製することが可能である。

変異タンパク質を作製する方法についても、特に限定されるものではない。例えば、部位特異的突然変異誘発法（Hashimoto-Gotoh,Gene 152,271-275(1995)他）、ＰＣＲ法を利用して塩基配列に点変異を導入し変異タンパク質を作製する方法、あるいはトランスポゾンの挿入による突然変異株作製法などの周知の変異タンパク質作製法を用いることができる。これら方法を用いることによって、上記（ａ）のタンパク質をコードするｃＤＮＡの塩基配列において、１またはそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されるように改変を加えることによって作製することができる。また、変異タンパク質の作製には、市販のキットを利用してもよい。

本発明に係るタンパク質の取得方法は、上述に限定されることなく、例えば、化学合成してもよい。例えば、無細胞系のタンパク質合成液を利用して、本発明に係る遺伝子から本発明に係るタンパク質を合成してもよい（無細胞タンパク質合成系による本発明にかかるタンパク質の合成）。上記「無細胞タンパク質合成系」とは、生細胞を用いずに、遺伝子にコードされた目的タンパク質を生産する技術のことである。例えば、「無細胞タンパク質合成系」としては、小麦胚芽抽出液を用いる方法（BIO INDUSTRY, 17, 20-27, 2000）、カイコ抽出液を用いる方法（特開２００４-３４４０１４）が知られている。この時、市販されているキットを適宜選択の上、利用することができる。上記キットとしては、例えばPROTEIOS ^TM Wheat germ cell-free protein synthesis kit （東洋紡株式会社製）が挙げられる。

また本発明にかかる遺伝子を含むことにより、アレルゲンタンパク質の無細胞合成系を構成することができる。当該アレルゲンタンパク質の無細胞合成系には、ＲＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ、アミノ酸、小麦胚芽抽出液、大腸菌抽出液等が含まれていてもよい。

（２−２）遺伝子の取得方法
本発明に係る遺伝子を取得する方法は、特に限定されるものではなく、前述の開示された配列情報等に基づいて種々の方法により、上記各遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングすることができる。

例えば、上記各ｃＤＮＡ配列の一部配列と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、スギのゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、上記各ｃＤＮＡ配列またはその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列・長さのものを用いてもよい。また、上記スクリーニングにおける各ステップについては、通常用いられる条件の下で行えばよい。

上記スクリーニングによって得られたクローンは、制限酵素地図の作成およびその塩基配列決定（シークエンシング）によって、さらに詳しく解析することができる。これらの解析によって、本発明に係る遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を取得したか容易に確認することができる。

また、上記プローブの配列を、植物の１，３-beta-グルカナーゼの間で良好に保存されている領域の中から選択し、他の植物のゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）ライブラリーをスクリーニングすれば、上記ＣＪＰ３８と同様の特性を有する、相同分子や類縁分子をコードする遺伝子を単離しクローニングできる可能性が高い。

本発明に係る遺伝子を取得する方法は、上記スクリーニング法以外にも、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法がある。例えば、上記各ｃＤＮＡ配列のうち、５’側および３’側の配列（またはその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてスギのゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明に係る遺伝子を含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。

（３）本発明に係るタンパク質およびその遺伝子の利用方法（有用性）
本発明のタンパク質は、これまでにスギ花粉症の主要アレルゲンとして知られているＣｒｙ ｊ１やＣｒｙ ｊ２とは異なる構造を有する新規のスギ花粉アレルゲンである。アレルゲンを認識するＩｇＥ抗体は、アレルゲンであるタンパク質の特定の領域（エピトープ）を認識することから、本発明のタンパク質は、Ｃｒｙ ｊ１やＣｒｙ ｊ２とは異なるエピトープを有していると考えられる。換言すれば、本発明のタンパク質を認識する抗体と、Ｃｒｙ ｊ１またはＣｒｙ ｊ２を認識する抗体とは異なると考えられる。

スギ花粉症患者に対して減感作療法を行う場合には、当該スギ花粉症患者が保有している抗体により認識されるアレルゲンを当該患者に投与する必要がある。例えば、Ｃｒｙ ｊ１に対する抗体を保有している患者には、Ｃｒｙ ｊ１を投与する必要がある。

これまで、スギ花粉症患者に対して減感作療法を行う場合には、主にＣｒｙ ｊ１やＣｒｙ ｊ２が当該患者に投与されていた。しかし、上述の理由から、本発明のタンパク質に対する抗体を保有するスギ花粉症患者に対しては、上記Ｃｒｙ ｊ１やＣｒｙ ｊ２を用いた治療方法は効果を奏さないと考えられる。

上記の理由から、本発明のタンパク質は、当該本発明のタンパク質を認識する抗体を保有するスギ花粉症患者に対して効果的な減感作療法を行うことを可能とする。また、本発明のタンパク質は、当該本発明のタンパク質に対する抗体を保有するか否かを診断するための診断薬に利用することもできる。さらに、本発明のタンパク質は、スギ花粉症の治療薬の開発において、スギ花粉症のメカニズムの解明や当該治療薬の効果を検証するための薬剤として利用することができる。

そこで、本発明の利用方法（および有用性）として、薬剤、抗体、組換え発現ベクター、形質転換体、遺伝子検出器具を例に挙げてより具体的に説明する。

（３−１）薬剤
本発明には、本発明に係るタンパク質や抗体を含む治療用薬剤も含まれる。例えば、本発明に係る治療用薬剤の一例として、スギ花粉症患者に対して行われる減感作療法に用いる減感作治療用薬剤が挙げられる。当該治療用薬剤（例えば、減感作治療用薬剤）は、本発明のタンパク質を主成分とするものであってもよいし、本発明のタンパク質と本発明のタンパク質以外のタンパク質との混合物であってもよく、本発明に係るタンパク質の一部を含むものであってもよい。

本発明に係る治療用薬剤は通常、本発明にかかるタンパク質または抗体を０．０１〜１００％（ｗ／ｗ）、好ましくは０．０５〜５０％（ｗ／ｗ）、さらに好ましくは０．５〜５．０％（ｗ／ｗ）含んでなる。本発明にかかる治療用薬剤は、当該タンパク質または抗体単独の形態はもとより、それ以外に生理的に許容される、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ソルビトール、マルチトール、ラクチトール、マンニトール、プルランなどの担体、賦形剤、免疫助成剤、安定剤、さらには必要に応じてステロイドホルモンやクロモグリク酸ナトリウムなどの抗炎症剤や抗ヒスタミン剤、抗ロイコトリエン剤、抗タキキニン剤を含む１種または２種以上の他の薬剤と組み合わせた組成物としての形態を包含する。さらに、本発明の薬学的組成物は、投薬単位形態の薬剤をも包含し、その投薬単位形態の薬剤とは、本発明にかかるタンパク質または抗体を、例えば、１日当たりの用量またはその整数倍（４倍まで）またはその約数（１／４０まで）に相当する量を含有し、投与に適する物理的に分離した一体の剤形にある薬剤を意味する。このような投薬単位形態の薬剤としては、散剤、細粒剤、顆粒剤、丸剤、錠剤、カプセル剤、トローチ剤、口腔剤、シロップ剤、乳剤、軟膏剤、硬膏剤、パップ剤、坐剤、点眼剤、点鼻剤、噴霧剤、注射剤などが挙げられる。

また、本発明に係るタンパク質や遺伝子を含む薬剤は、スギ花粉症患者が本発明のタンパク質に対する抗体を保有するか否かを診断するためのアレルギー診断用薬剤（または、アレルギー診断用キット）であってもよい。例えば、上記アレルギー診断用キットは、マイクロタイタープレートなどの基板（担体）上に本発明のタンパク質が固定された抗原基板と、当該抗原基板にスギ花粉症患者の血清が滴下された後に、上記抗原基板上に固定された本発明のタンパク質と結合したＩｇＥ抗体を検出する２次抗体と、当該２次抗体を検出するための薬剤とを備える構成にしてもよい。

（３−２）抗体
本発明に係る抗体は、前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質（本発明に係るタンパク質）、またはその部分タンパク質・部分ペプチドを抗原として、公知の方法によりポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得られる抗体である。公知の方法としては、例えば、文献（Harlowらの「Antibodies : A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory, New York(1988))、岩崎らの「単クローン抗体 ハイブリドーマとELISA,講談社(1991)」」に記載の方法が挙げられる。

このようにして得られる抗体は、本発明に係るタンパク質の検出・測定などに利用できる。例えば、本発明のタンパク質を含む花粉が大気中や屋内の空間またはヒトの粘膜にどの程度存在しているのかを調べるために利用できる。

（３−３）ベクター
本発明に係るベクターは、前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする本発明の遺伝子を含むものである。例えば、ｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクターが挙げられる。ベクターの作製には、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどを用いることができるが特に限定されるものではない。また、当該組換え発現ベクターの作製方法も公知の方法の中から選択すればよい。

ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、宿主細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に遺伝子を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係る遺伝子を各種プラスミド等に組み込んだものをベクターとして用いればよい。

本発明に係る遺伝子が宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認するために、各種マーカーを用いてもよい。例えば、宿主細胞中で欠失している遺伝子をマーカーとして用い、このマーカー遺伝子と本発明に係る遺伝子とを含むプラスミド等を発現ベクターとして宿主細胞に導入する。これによって当該マーカー遺伝子の発現から本発明に係る遺伝子の導入を確認することができる。あるいは、本発明に係るタンパク質を融合タンパク質として発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）をマーカーとして用い、本発明に係るタンパク質をＧＦＰ融合タンパク質として発現させてもよい。

上記宿主細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、カイコガ由来の細胞をはじめとして、キイロショウジョウバエ等の昆虫、大腸菌（Escherichia coli）等の細菌、酵母（出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeや分裂酵母Schizosaccharomyces pombe）、線虫Caenorhabditis elegans、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）の卵母細胞等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。

上記ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換方法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、例えば、本発明に係るタンパク質を昆虫で転移発現させる場合には、バキュロウイルスを用いた発現系を好適に採用することができる。

（３−４）形質転換体
本発明に係る形質転換体は、本発明に係る遺伝子、すなわち、前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子が導入された形質転換体である。ここで、「遺伝子が導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されることを意味する。また、上記「形質転換体」とは、細胞・組織・器官のみならず、生物個体を含む意味である。

本発明に係る形質転換体の作製方法（生産方法）は、上述したベクターを用いて、宿主を形質転換する方法を挙げることができる。また、形質転換の対象となる宿主も特に限定されるものではなく、上記宿主細胞で例示した各種微生物や動物を挙げることができる。また、プロモーターやベクターを適切に選択すれば、植物も形質転換の対象とすることが可能である。

（３−５）本発明に係るタンパク質の生産方法
上記本発明にかかるベクターおよび形質転換体を用いることによって本発明にかかるタンパク質の生産を行うことができる。

一実施形態において、本発明に係るタンパク質の生産方法は、本発明に係るタンパク質をコードする遺伝子を含むベクター（上記本発明にかかるベクター）を用いることを特徴とする。

本実施形態の１つの局面において、本実施形態に係るタンパク質の生産方法は、上記ベクターを無細胞タンパク質合成系に用いることが好ましい。無細胞タンパク質合成系を用いる場合、種々の市販のキットを用いればよい。好ましくは、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上記ベクターと無細胞タンパク質合成液とをインキュベートする工程を包含する。

本実施形態の他の局面において、本実施形態に係るタンパク質の生産方法は、組換え発現系を用いることが好ましい。組換え発現系を用いる場合、本発明に係る遺伝子を組換え発現ベクターに組み込んだ後、公知の方法により発現可能に宿主に導入し、宿主内で翻訳されて得られる上記タンパク質（ポリペプチド）を精製するという方法などを採用することができる。組換え発現ベクターは、プラスミドであってもなくてもよく、宿主に目的遺伝子（ポリヌクレオチド）を導入することができればよい。好ましくは、本実施形態に係るタンパク質（ポリペプチド）の生産方法は、上記ベクターを宿主に導入する工程を包含する。

このように宿主に外来遺伝子（ポリヌクレオチド）を導入する場合、発現ベクターは、外来遺伝子（ポリヌクレオチド）を発現するように宿主内で機能するプロモーターを組み込んであることが好ましい。組換え的に産生されたタンパク質（ポリペプチド）を精製する方法は、用いた宿主、タンパク質（ポリペプチド）の性質によって異なるが、タグの利用等によって比較的容易に目的のタンパク質（ポリペプチド）を精製することが可能である。

本実施形態に係るタンパク質（ポリペプチド）の生産方法は、本発明に係るタンパク質（ポリペプチド）を含む細胞または組織の抽出液から当該タンパク質（ポリペプチド）を精製する工程をさらに包含することが好ましい。タンパク質（ポリペプチド）を精製する工程は、周知の方法（例えば、細胞または組織を破壊した後に遠心分離して可溶性画分を回収する方法）で細胞や組織から細胞抽出液を調製した後、この細胞抽出液から周知の方法（例えば、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー）によって精製する工程が好ましいが、これらに限定されない。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために用いられる。

別の実施形態において、本発明に係るタンパク質（ポリペプチド）の生産方法は、本発明に係るタンパク質（ポリペプチド）を天然に発現する細胞または組織から当該タンパク質（ポリペプチド）を精製することを特徴とする。本実施形態に係るタンパク質（ポリペプチド）の生産方法は、上述した抗体を用いて本発明に係るタンパク質（ポリペプチド）を天然に発現する細胞または組織を同定する工程を包含することが好ましい。また、本実施形態に係るタンパク質（ポリペプチド）の生産方法は、上述したタンパク質（ポリペプチド）を精製する工程をさらに包含することが好ましい。

（３−６）遺伝子検出器具
本発明に係る遺伝子検出器具は、本発明に係る遺伝子における少なくとも一部の塩基配列またはその相補配列をプローブとして用いたものである。遺伝子検出器具は、種々の条件下において、本発明に係る遺伝子の発現パターンの検出・測定などに利用することができる。

本発明に係る遺伝子検出器具としては、例えば、本発明の遺伝子と特異的にハイブリダイズする上記プローブを基板（担体）上に固定化したＤＮＡチップが挙げられる。ここで「ＤＮＡチップ」とは、主として、合成したオリゴヌクレオチドをプローブに用いる合成型ＤＮＡチップを意味するが、ＰＣＲ産物などのｃＤＮＡをプローブに用いる貼り付け型ＤＮＡマイクロアレイをも包含するものとする。

プローブとして用いる配列は、ｃＤＮＡ配列の中から特徴的な配列を特定する従来公知の方法によって決定することができる。具体的には、例えば、ＳＡＧＥ：Serial Analysis of Gene Expression法（Science 276:1268, 1997; Cell 88:243, 1997; Science 270:484, 1995; Nature 389:300, 1997; 米国特許第5,695,937 号）等を挙げることができる。

なお、ＤＮＡチップの製造には、公知の方法を採用すればよい。例えば、オリゴヌクレオチドとして合成オリゴヌクレオチドを使用する場合には、フォトリソグラフィー技術と固相法ＤＮＡ合成技術との組み合わせにより、基板上で該オリゴヌクレオチドを合成すればよい。一方、オリゴヌクレオチドとしてｃＤＮＡを用いる場合には、アレイ機を用いて基板上に貼り付ければよい。

また、一般的なＤＮＡチップと同様、パーフェクトマッチプローブ（オリゴヌクレオチド）と、当該パーフェクトマッチプローブにおいて一塩基置換されたミスマッチプローブとを配置して遺伝子の検出精度をより向上させてもよい。さらに、異なる遺伝子を並行して検出するために、複数種のオリゴヌクレオチドを同一の基板上に固定してＤＮＡチップを構成してもよい。

以下添付した図面に沿って実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

以下、本発明のタンパク質について行った機能解析の結果について、図面を参照しながら説明する。

まず、以下の実施例にて用いられたＣＪＰ３８が同定された経緯について、簡潔に説明する。

〔ＣＪＰ３８同定までの経緯〕
本発明者らは、本発明のタンパク質を同定することを目的として、スギ花粉から全タンパク質を粗抽出し、当該スギ花粉租抽出タンパク質をＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）により分離した。そして、分離されたスギ花粉粗抽出タンパク質に対して、複数のスギ花粉症患者から得られた血清を用いて免疫染色を行った。すなわち、本発明者らは、スギ花粉症患者の血清に含まれるＩｇＥ抗体と高頻度に反応するスギ花粉タンパク質を探索した。

図１に、上記免疫染色の結果を示している。レーン１には健常者由来の血清を用いた場合、レーン２〜７にはそれぞれ異なるスギ花粉症患者由来の血清を用いた場合の免疫染色の結果が示されている。なお、レーンＭには分子量マーカーの泳動結果が示されている。

図１に示すように、健常者の血清とは反応しないが、スギ花粉症患者の血清とは反応するタンパク質のバンド（約６０ｋＤａ）が検出された（レーン６，７）。そこで、上記約６０ｋＤａのタンパク質のアミノ酸配列を質量分析（Ｑ ＴＯＦ-ＭＳ解析）により決定したところ、１０残基のアミノ酸配列（配列番号４）が明らかとなった。

上記１０残基のアミノ酸配列について相同性検索を行ったところ、オリーブ花粉の主要アレルゲンであるＯｌｅ ｅ９（配列番号５）と、１０残基中８残基のアミノ酸が一致することが明らかとなった（図１右側の配列参照）。上記Ｏｌｅ ｅ９は、１，３-beta-グルカナーゼであることから、上記約６０ｋＤａのタンパク質も１，３-beta-グルカナーゼであると推測された。

そこで、本発明者らは、１，３-beta-グルカナーゼの保存配列を利用して、上記約６０ｋＤａのタンパク質をコードする遺伝子のｃＤＮＡ（complementary ＤＮＡ）を単離することを試みた。具体的には、スギの葯から抽出した全ＲＮＡを鋳型として、上記１０残基のアミノ酸配列（配列番号４）に基づくプライマーと植物由来の１，３-beta-グルカナーゼに保存されている配列（配列番号６，７，８）（図２参照）に基づくプライマーとを用いて、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ-ＰＣＲ）を行った。

上記ＲＴ-ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列を基に、１３１３塩基からなる全長ｃＤＮＡを取得し、当該全長ｃＤＮＡの塩基配列を決定した。その結果、当該ｃＤＮＡは図３（配列番号２）に示す塩基配列を有することが明らかとなった。本発明者らは、上記ｃＤＮＡによってコードされるタンパク質をＣＪＰ３８と命名した。

ＣＪＰ３８の推定分子量は、約３８ｋＤａであることから、当初単離を目指した上記約６０ｋＤａのタンパク質とは異なるタンパク質であると考えられた。しかし、ＣＪＰ３８は、オリーブ花粉の主要アレルゲンであるＯｌｅ ｅ９や、ラテックッスアレルギーの主要抗原であるＨｅｖ ｂ２と高い相同性を有している（図４参照）ことが明らかとなり、ＣＪＰ３８はスギ花粉のアレルゲンである可能性が高いと考えられたため、本発明者らは、ＣＪＰ３８がスギ花粉のアレルゲンである可能性を検証することにした。

〔実施例１：スギ花粉からの全ＲＮＡの抽出〕
日本スギ（C. japonica）の葯（２ｇ）（広島県豊田郡豊町にて採取）を液体窒素中で粉砕し、使用したスギ葯の１０倍量（Ｗ/Ｖ）の２×ＣＴＡＢ（centyltrimethylammomium bromide）溶液中に、粉砕されたスギ葯を懸濁した後、６５℃で１０分間インキュベートした。そして、上記懸濁液と等量のクロロホルム/イソアミルアルコール（２４：１）を上記懸濁液に加えて攪拌し、室温で遠心分離（９，３００ ｇ，１０分間）した。分離された液層のうち、水層（上層）を回収し、当該水層と等量のクロロホルム/イソアミルアルコール（２４：１）を当該水層に加えて攪拌し、再度室温で遠心分離（９，３００ ｇ，１０分間）した。分離された液層のうち、水層を回収し、当該水層の３/４倍量のイソプロピルアルコールを当該水層に加えた後に、室温で１０分間静置した。その後、４℃で遠心分離（９，３００ ｇ，１０分間）し、形成された沈殿をＴＥ（Tris-EDTA）バッファーに溶解することにより全ＲＮＡ粗抽出液を得た。

上記全ＲＮＡ粗抽出液をさらに精製するために、上記全ＲＮＡ粗抽出液の１/４倍量の１０Ｍ塩化リチウム溶液を上記全ＲＮＡ粗抽出液に加え、２時間氷上でインキュベートした。そして、４℃で遠心分離（９，３００ ｇ，１０分間）し、形成された沈殿をＴＥバッファーに溶解した。この溶解液に当該ＴＥバッファーと等量のＴＥ飽和フェノール（ｐＨ９．０）を加え攪拌した後に、室温で遠心分離（９，３００ ｇ，１０分間）した。分離された液層のうち、水層を回収し、当該水層と等量のクロロホルム/イソアミルアルコール（２４：１）を当該水層に加えて攪拌し、再度室温で遠心分離（９，３００ ｇ，１０分間）した。分離された液層のうち、水層を回収し、当該水層の１/１０倍量の３Ｍ酢酸ナトリウムと２倍量の冷エタノール（-２０℃）とを当該水層に加え、-８０℃で１０分間静置した。その後、４℃で遠心分離（９，３００ ｇ，１０分間）し、ＲＮＡの沈殿を得た。そして、当該沈殿を７０％エタノールで洗浄した後に、真空乾燥し、乾燥した沈殿を適量のＴＥバッファーに溶解した。

〔実施例２：ＣＪＰ３８ｃＤＮＡ断片の取得〕
上記実施例１において得られた全ＲＮＡを鋳型として、ＣＪＰ３８をコードするｃＤＮＡを合成した。具体的には、3’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends（Invitrogen社製）を用いて、逆転写反応とＰＣＲ反応とを行い、ＣＪＰ３８遺伝子のｃＤＮＡを特異的に増幅した。以下において、この手法の詳細な説明を行う。

（１）全ＲＮＡを鋳型とした逆転写反応によるｃＤＮＡの合成
全ＲＮＡ（５μｇ）を含む溶液 ５μｌに、アダプタープライマー １μｌと、ＤＥＰＣ（diethylpyrocarbonate）処理液 ６μｌとを加え、インキュベート（７０℃、１０分間）した後に、氷上に１分間静置した。この反応液に１０×ＰＣＲバッファー ２μｌ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２ ２μｌ，ｄＮＴＰ ＭＩ×（２．５ ｍＭ each） １μｌ、ＤＴＴ（dithiothreitol）（０．１ Ｍ） ２μｌを加え、４２℃で５分間プレインキュベートした。この反応液にSUPERSCRIPT II（Life Technonogies, Inc.社製）を１μｌ加えて、４２℃で５０分間インキュベートした。その後、７０℃で１５分間インキュベートすることにより反応を停止させた。この反応液を氷上で静置した後に、RNase Hを１μｌ加えてインキュベート（３７℃、２０分間）することによりＲＮＡを消化した。

（２）ＰＣＲ反応によるＣＪＰ３８遺伝子のｃＤＮＡの増幅
次に、上記の処理によって合成されたｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ反応を行った。この反応において次に示す２種類のプライマーを用いた。
プライマー１：GCHATHTCHGTDGGNAAYGARGT（配列番号１２）
プライマー２：CCRTCNGGYTTRAANAGNCCRTA（配列番号１３）
上記の塩基配列中、ＲはＡまたはＧを表し、ＹはＣまたはＴを表し、ＨはＡまたはＴ、またはＣを表し、ＤはＧまたはＡまたはＴを表し、ＮはＡまたはＣまたはＧまたはＴを表す。

プライマー１は、上記Ｑ ＴＯＦ−ＭＳ解析により決定されたアミノ酸配列、すなわち上記約６０ ｋＤａのタンパク質が有する部分アミノ酸配列（配列番号４）を基に設計された。一方、プライマー２は、植物由来の1,3-beta-グルカナーゼに保存された共通配列（配列番号６，７，８）（図２参照）を基に設計された。

ＰＣＲ反応は次に示す条件で行った。すなわち、９５℃で２分間の加熱処理の後に、９４℃で1分間、５３℃で１分間、６８℃で１分間を１サイクルとして３０サイクルの反応を行った。

〔実施例３：全長ＣＪＰ３８ｃＤＮＡの取得および塩基配列の決定〕
実施例２において得られたＣＪＰ３８ｃＤＮＡ断片をｐＧＥＭ-Ｔ Ｅａｓｙ ベクターに組み込み、ベクター特異的なプライマーを用いて、ＣＪＰ３８ｃＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。

さらに、５’末端および３‘末端を含めたＣＪＰ３８ｃＤＮＡの全塩基配列を決定するために、上記ＣＪＰ３８ｃＤＮＡ断片の塩基配列を基に、次に示す新たなプライマー３およびプライマー４を作製した。
プライマー３：CTTGATGTTGTTCTGCAGATTGG（配列番号１４）
プライマー４：GCGCTCTTTAATCCTACACC（配列番号１５）
プライマー３を用いた５’ＲＡＣＥ（Rapid Amplification of cDNA Ends）法により、ＣＪＰ３８ｃＤＮＡの５’末端側の断片を取得し、この断片の塩基配列を決定した。一方、プライマー４を用いた３’ＲＡＣＥ法により、ＣＪＰ３８ｃＤＮＡの３’末端側の断片を取得し、この断片の塩基配列を決定した。これにより、ＣＪＰ３８ｃＤＮＡの全塩基配列を決定するに至った。決定された配列は、配列番号２に示す配列であり、１３１３塩基からなる。

〔実施例４：ＣＪＰ３８の相同性検索〕
ＣＪＰ３８と相同性の高い植物由来のタンパク質を、GenBankデータベースを用いたＢＬＡＳＴ検索により探索した。その結果、ＣＪＰ３８は１，３-beta-グルカナーゼと高い相同性を有することが確認された。図４に、ＣＪＰ３８と高い相同性を示す植物の１，３-beta-グルカナーゼのアミノ酸配列を示す。ＣＪＰ３８は、トマト（L. esculentum）の１，３-beta-グルカナーゼと４７％、オリーブ花粉の主要アレルゲンであるＯｌｅ ｅ９と４０％、パラゴムノキの主要アレルゲンであるＨｅｖ ｂ２と４３％の相同性を有している。上記の結果から、ＣＪＰ３８は１，３-beta-グルカナーゼである可能性が高いと考えられる。

〔実施例５：組み換えＣＪＰ３８の発現〕
ＣＪＰ３８を大量に得るために、ＣＪＰ３８とＧＳＴ（glutathione S-transferase）との融合タンパク質（ＧＳＴ-ＣＪＰ３８）を大腸菌の発現系にて発現させた。

まず、本実施例の説明で用いる図面について説明する。

図５（ａ）は、ＧＳＴ-ＣＪＰ３８を発現誘導させた大腸菌から抽出したタンパク質を電気泳動（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）した結果を示している。図５（ａ）中の１〜４４の各レーンには、それぞれ次のタンパク質が泳動されている。すなわち、レーン１には発現誘導前の大腸菌から抽出したタンパク質が、レーン２には発現誘導後の大腸菌から抽出したタンパク質が、レーン３には発現誘導後の大腸菌から抽出したタンパク質のうち、可溶性画分に含まれるタンパク質が、レーン４には発現誘導後の大腸菌から抽出したタンパク質のうち、不溶性画分に含まれるタンパク質が、それぞれ泳動されている。

図５（ｂ）は、発現誘導後の大腸菌から抽出した不溶性タンパク質をリフォールディングした後に電気泳動（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）した結果を示している。図５（ｂ）中のレーン５には、上記不溶性タンパク質をリフォールディングした結果得られた可溶性タンパク質が、レーン６には当該可溶性をスロンビンにより消化した結果得られたタンパク質が、それぞれ泳動されている。

以下において、本実施例について詳細に説明する。

ＣＪＰ３８遺伝子の翻訳領域（ＯＲＦ）（配列番号３）をｐＧＥＸ４Ｔ-１ベクターに組み込み、当該ベクターをタンパク質発現用大腸菌株であるＢＬ２１に導入した。上記ｐＧＥＸ４Ｔ-１ベクターには、ＩＰＴＧ（isopropyl-thio-beta-D-galactopyranoside）によって転写活性が高まるプロモーターが組み込まれており、ＩＰＴＧを大腸菌の培地に添加することによりタンパク質発現を誘導できる。そこで、ＩＰＴＧによりタンパク質発現を誘導した後に、大腸菌を回収し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥを行った。その結果、図５（ａ）（レーン２）に示すように、ＧＳＴ-ＣＪＰ３８と推測される約６０ ｋＤａのタンパク質の蓄積が確認された。

次に、この発現誘導されたタンパク質が可溶性か不溶性かを確認するために、ＩＰＴＧ添加後の大腸菌をリン酸バッファー中にて超音波破砕した後に遠心分離することにより、当該大腸菌のタンパク質を可溶性タンパク質（３）と不溶性タンパク質（４）とに分離した。当該可溶性および不溶性タンパク質を電気泳動したところ、図５（ａ）（レーン３、４）に示すように、上記発現誘導されたタンパク質は、主に不溶性タンパク質として蓄積していることが明らかになった。

そこで、上記不溶性タンパク質をリフォールディングにより可溶化した。具体的には、大腸菌の不溶性画分を１％TritonX-100を含むＰＢＳ(pH7.6)で洗浄した後、８Ｍ 尿素を含むＰＢＳで変性、可溶化した。この可溶化したサンプルを、当該サンプルの液量の１０倍量の４Ｍ、２Ｍ、１Ｍの尿素を含むＰＢＳに対して各１時間、２回づつ順に透析し、最後に尿素を含まないＰＢＳで一晩透析した。その結果、上記不溶性タンパク質の大半を可溶化することができた。

そして、この可溶化されたタンパク質をスロンビンにより消化したところ、図５（ｂ）（レーン５、６）に示すように、上記可溶化されたタンパク質は、ＧＳＴと推測されるタンパク質と、組み替えＣＪＰ３８（以下では、ｒＣＪＰ３８と称す）と推測されるタンパク質とに分離した。ここで、上記スロンビンは、ＧＳＴと当該ＧＳＴに融合されたタンパク質との境界に存在する特定のアミノ酸配列を認識し、消化する酵素である。

上記ｒＣＪＰ３８と推測されるタンパク質のＮ末端のアミノ酸配列をペプチドシークエンスにより決定したところ、当該Ｎ末端のアミノ酸配列とＣＪＰ３８のアミノ酸配列とが一致した。この結果から、上記ｒＣＪＰ３８と推測されるタンパク質は、実際にｒＣＪＰ３８であることが確認された。

〔実施例６：ｒＣＪＰ３８のアレルゲン活性測定〕
上記実施例５において得られたｒＣＪＰ３８がアレルゲン活性を有しているかどうかを明らかにするために、ｒＣＪＰ３８を含む画分と、スギ花粉症患者の血清とを用いて免疫染色を行った。なお、上記ｒＣＪＰ３８を含む画分とは、上記可溶化されたタンパク質をスロンビン消化することによって得られるタンパク質画分であり、この画分には、ｒＣＪＰ３８の他にＧＳＴや大腸菌由来のタンパク質も含まれている。

まず、本実施例の説明で用いる図面について説明する。

図６は、ｒＣＪＰ３８とスギ花粉症患者の血清とを用いて免疫染色を行った結果を示す図である。Ｐ１〜Ｐ２０は、それぞれ異なるスギ花粉症患者由来の血清を用いた場合の結果を示しており、Ｎ１〜Ｎ３は、それぞれ異なる健常者由来の血清を用いた場合の結果を示している。ｒＣＪＰ３８と各血清との反応性の度合いを＋/−で表しており、顕著に反応した場合には＋、ほとんど反応しなかった場合には−、わずかに反応した場合には＋−が付されている。

以下において、本実施例について詳細に説明する。

上記ｒＣＪＰ３８を含む画分をＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分離した後に、分離されたタンパク質をブロッティングキット（Hoefer DALT社製）を用いてＰＶＤＦ膜（Hybond-P；Amersham社製）に転写した。そして、当該ＰＶＤＦ膜をブロッキング液（５％ 脱脂粉乳、１％ BSA、０．１％ Tween20を含むPBS）中で一晩振とうした後に、１０倍希釈したスギ花粉症患者の血清または健常者の血清と室温で４時間反応させた（１次抗体反応）。

次に、１次抗体反応後のＰＶＤＦ膜をＰＢＳＴ（１％ Tween20を含むPBS）により洗浄した後に、ビオチン標識されたヒトＩｇＥ抗体（１５０倍希釈）（Vector Laboratories, Inc.社製）と２時間反応させた（２次抗体反応）。

その後、２次抗体反応後のＰＶＤＦ膜をＰＢＳＴで洗浄し、ＨＲＰ（horseradish peroxidase）標識されたストレプトアビジン（３０００倍希釈）（Zymed Laboratories Inc.社製）と１時間反応させた。そして、ECL-Plus Western blotting detection reagent（Amersham Bioscience社製）を用いてＸ線フィルム上でＨＲＰの活性を検出した。

その結果、図６に示すように、ｒＣＪＰ３８は、健常者の血清（Ｎ１〜Ｎ３）とはほとんど反応しなかったのに対し、スギ花粉症患者の血清とは、２０人中１５人という高い確率で反応した（Ｐ１〜Ｐ２０）。すなわち、健常者の血清中には、ｒＣＪＰ３８を認識する抗体がほとんど含まれていないのに対して、スギ花粉症患者の血清中には、ｒＣＪＰ３８を認識する抗体が高い確率で含まれていた。なお、図示しないが、ＧＳＴは、すべてのスギ花粉症患者および健常者の血清と反応しなかった。

上記の結果から、ｒＣＪＰ３８は、スギ花粉症のアレルギー反応を誘発するアレルゲンであることが強く示唆された。

〔実施例７：ｒＣＪＰ３８の１，３-beta-グルカナーゼ活性測定〕
上記実施例５において得られたｒＣＪＰ３８が１，３-beta-グルカナーゼ活性を有しているかどうかを明らかにするために、酢酸ナトリウムバッファー(pH5.0)で透析した上記ｒＣＪＰ３８を含む画分を用いて１，３-beta-グルカナーゼ活性測定を行った。

まず、本実施例の説明で用いる図面について説明する。

図７は、ｒＣＪＰ３８の１，３-beta-グルカナーゼ活性を測定した結果を示すグラフである。上記活性は、酵素反応により生成されたグルコースの濃度によって表されている。ネガティブコントロールとして、ｒＣＪＰ３８を含まない、バッファーのみの反応液における活性（Sodium Acetate buf）を測定している。

以下において、本実施例について詳細に説明する。

酢酸ナトリウムバッファー(pH5.0)で調製した１％ラミナラン（SIGMA社製）溶液に終濃度１０μg/mlとなるように上記ｒＣＪＰ３８画分を添加し、３７℃で一晩インキュベートした。その後、終濃度１０U/mlとなるようにアーモンド由来のbeta-グルコシダーゼを添加し、３７℃で４時間インキュベートした後に、生成されたグルコースの濃度をD-Glicose UV-method（R-biopharma AG社製）を用いて測定した。

その結果、図７に示すように、酢酸ナトリウムバッファーのみを用いて上記活性測定を行った場合と比較して、上記ｒＣＪＰ３８を含む画分を添加した場合には、１，３-beta-グルカナーゼ活性が有意に高まった。

したがって、上記の結果から、ｒＣＪＰ３８は１，３-beta-グルカナーゼ活性を有していることが示され、スギ花粉中に存在するＣＪＰ３８も１，３-beta-グルカナーゼ活性を有していることが示唆された。

〔実施例８：ＣＪＰ３８抗体を用いた２次元免疫染色〕
スギ花粉に含まれるＣＪＰ３８の分子量および等電点を確認するために、スギ花粉から抽出したタンパク質を２次元電気泳動により展開した後に、ＣＪＰ３８抗体を用いて免疫染色を行った（２次元免疫染色）。

まず、上記ＣＪＰ３８抗体の作製方法について説明する。

上記ＣＪＰ３８抗体は、上記のリフォールディングにより可溶化したＧＳＴ-ＣＪＰ３８を抗原として用いて作製された。具体的には、抗原溶液（０．５mg/ml in PBS）１００μlとAjuvand, Complete, Freund１００μlとをルアーロック式シリンジで混合し、乳化することにより抗原・アジュバンド溶液（終濃度０．２５mg/ml）を調整し、この抗原・アジュバンド溶液をＢＡＬＢ/ｃマウス（６週齢、メス）の腹腔内へ投与した。当該投与を、２週間ごとに同量の抗原を用いて行い、十分な抗体価が得られるまで繰り返した。

マウスの採血は、眼底採血法により行われた。すなわち、マウスを少量のジエチルエーテルで麻酔し、ＥＭマイスターヘマトクリット毛細管を用いて眼下静脈より採血を行った。その後、採取した血液を４℃にて２０００rpmで、２０分間遠心分離し、上清である血清を回収した。上記血清に含まれるＣＪＰ３８抗体の抗体価をＥＬＩＳＡにより測定した結果、１０週齢のマウスで顕著な抗体価の上昇が確認できた（データ示さず）。

次に、２次元免疫染色の説明で用いる図面について説明する。

図８は、スギ花粉タンパク質を２次元泳動電気泳動により展開した後に、銀染色を行った結果（左上）およびＣＪＰ３８抗体を用いて免疫染色を行った結果（右上）を示しており、それぞれの画像の一部を拡大したものを、それぞれ左下および右下に示している。拡大図においては、主要なタンパク質のスポットに番号を付している。

以下において、２次元免疫染色について詳細に説明する。

２次元電気泳動は、Kristensenらの方法（Electrophoresis 2000;21:430-439）に従って行った。そして、２次元電気泳動に続いて、銀染色によるタンパク質の可視化またはＣＪＰ３８抗体による免疫染色を行った。

上記免疫染色においては、ＰＶＤＦ膜へのタンパク質の転写、ブロッキングの後に、２００００倍希釈した、ＣＪＰ３８抗体を含む上記抗血清を用いて１次抗体反応（室温、４時間）を行い、ＰＢＳＴでの洗浄後に、１００００倍希釈したビオチン標識マウスＩｇＧ抗体を用いて２次抗体反応（室温、２時間）を行った。洗浄後、さらに３０００倍希釈したＨＲＰ標識ストレプトアビジンを用いて３次抗体反応（室温、１時間）を行った。洗浄後、ECL-Plus Western blotting detection reagent （Amersham Biosciences社製）により陽性シグナルをＸ線フィルムを用いて可視化した。

上記免疫染色の結果、図８（右上）に示すように、複数のスポットが検出された。一方、免疫前のマウス血清を用いて同様に免疫染色を行っても顕著なスポットは検出されなかった（データ示さず）。上記複数のスポットと、銀染色されたタンパク質のスポットとを比較した結果、ＣＪＰ３８の推定分子量および推定等電点から、ＣＪＰ３８のスポットは、No.９６、９７、９８、１００、１０１.１、１０１.２、１０９のいずれかであると推測された。

そこで、これらのスポットのうち、ＣＪＰ３８抗体と特に強い反応を示したNo.９８およびNo.１０１.２のスポットのタンパク質に対してＥＳＩ-ＴＯＦ ＭＳによる質量分析を行った。具体的には、No.９８およびNo.１０１.２のスポットのタンパク質をトリプシン消化し、得られたペプチド断片に対してＭＳモードによるPeptide Mass Fingerprint解析を行った。

その結果、No.９８およびNo.１０１.２のスポット由来のＭＳスペクトルパターンは酷似しており、No.９８のスポットのタンパク質とNo.１０１.２のスポットのタンパク質とは、アミノ酸配列や翻訳後修飾がわずかに異なる同位体分子であることが示唆された。

そこで、No.９８のスポット由来のペプチド断片のうち、ｍ/ｚ値からＣＪＰ３８由来のものと推測される、３つのペプチド断片についてＭＳ/ＭＳによるアミノ酸シークエンスを行った。

その結果、上記３つのペプチド断片のアミノ酸配列は、それぞれＣＪＰ３８のアミノ酸配列における１４４〜１５９番目（NIQTALENANLQNNIK（配列番号１６））、１６０〜１７７番目（VSTAHAMTVIGTSSPPSK（配列番号１７））、３２９〜３４４番目の配列（HFGLFNPDEQPVYPVK（配列番号１８））と完全に一致することが明らかとなった。すなわち、No.９８のスポットはＣＪＰ３８のスポットであることが明らかとなった。

No.９８のスポットは、非特許文献５に記載の研究におけるスギ花粉症患者由来の血清ＩｇＥを用いた免疫染色において、４２.５％の反応頻度で反応したスポットである。スギ花粉の主要アレルゲンであるＣｒｙ ｊ２の反応頻度が４０.０％であることから、ＣＪＰ３８は、Ｃｒｙ ｊ２を上回る反応頻度を有するアレルゲンであることが示された。

また、上記Peptide Mass Fingerprint解析の結果から、No.１０１.２のスポットもＣＪＰ３８由来のスポットである可能性が考えられる。非特許文献５に記載の研究におけるNo.１０１.２のスポットの反応頻度は５２.５％であり、この事実からもＣＪＰ３８がＣｒｙ ｊ２を上回る反応頻度を有するアレルゲンである可能性が示された。

また、No.９８およびNo.１０１.２のスポットの位置から、ＣＪＰ３８は分子量約３８ｋＤａ、ｐＩ５〜６のタンパク質であることが示された。ただし、ＣＪＰ３８は、No.９８およびNo.１０１.２のスポットを形成するタンパク質とは異なる翻訳後修飾を受けている可能性も残されており、ＣＪＰ３８がNo.９８およびNo.１０１.２以外のスポットを形成している可能性もある。

以上のように、本発明は、スギ花粉症のアレルギー反応を誘発する新規アレルゲンであるＣＪＰ３８とその利用に関するものであり、スギ花粉症を治療することを目的とした減感作療法および新薬の開発、または、スギ花粉症の診断方法および診断試薬の開発などに利用できるほか、種々の有用性を有するものである。

スギ花粉粗抽出タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、スギ花粉症患者血清ＩｇＥを用いて免疫染色を行った結果を示す図、および上記ＩｇＥと反応したタンパク質のＴＯＦ−ＭＳ解析の結果を示す図である。 植物の1,3-beta-グルカナーゼに保存されているアミノ酸配列を示す図である。 本発明に係るタンパク質の一例であるＣＪＰ３８のアミノ酸配列とＣＪＰ３８遺伝子の塩基配列とを示す図である。 本発明に係るタンパク質の一例であるＣＪＰ３８のアミノ酸配列と他の植物の1,3-beta-グルカナーゼのアミノ酸配列とを比較した結果を示す図である。 （ａ）は、組み換えＣＪＰ３８を発現させた大腸菌のタンパク質を分画した後に電気泳動した結果を示す図であり、（ｂ）は、上記大腸菌の不溶性画分のタンパク質をリフォールディングした後にスロンビン消化し、電気泳動した結果を示す図である。 組み換えＣＪＰ３８とスギ花粉症患者の血清とを用いて免疫染色を行った結果を示す図である。 ｒＣＪＰ３８の１，３-beta-グルカナーゼ活性を測定した結果を示すグラフである。 ２次元展開されたスギ花粉タンパク質に対して、ＣＪＰ３８抗体を用いて免疫染色を行った結果を示す図である。

Claims (11)

1. スギ花粉に含まれるアレルゲンであって、
   １，３-beta-グルカナーゼ活性を有する、以下の（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質。
   （ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
   （ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１個または複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アレルゲン活性を有するタンパク質。
2. 請求項１に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
3. 配列番号３に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する請求項２に記載の遺伝子。
4. 配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アレルゲン活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
5. 請求項１に記載のタンパク質を特異的に認識する抗体。
6. 請求項２〜４の何れか１項に記載の遺伝子を含むベクター。
7. 請求項２〜４の何れか１項に記載の遺伝子を導入してなる形質転換体。
8. 請求項６に記載のベクターを用いることを特徴とするタンパク質の製造方法。
9. 請求項７に記載の形質転換体を用いることを特徴とするタンパク質の製造方法。
10. 請求項２〜４の何れか１項に記載の遺伝子の塩基配列またはその相補配列をプローブとして用いた遺伝子検出装置。
11. 請求項１に記載のタンパク質を含むことを特徴とするアレルギー診断用薬剤。