CN109839508B

CN109839508B - Rbm24-S181位点磷酸化作为精神压力类疾病及相关心脏疾病用药的标记物的应用

Info

Publication number: CN109839508B
Application number: CN201910089104.7A
Authority: CN
Inventors: 张敏; 杨鹤; 孙雷
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2019-01-30
Filing date: 2019-01-30
Publication date: 2021-06-29
Anticipated expiration: 2039-01-30
Also published as: CN109839508A

Abstract

本发明涉及生物医学领域，为了解决现有精神压力导致心脏疾病发生的诊断标志物少之又少的问题，提供了一种Rbm24‑S181位点磷酸化作为精神压力类疾病及相关心脏疾病用药的标记物的应用，本发明通过Rbm24‑S181位点磷酸化为评估精神压力与心脏疾病的分子诊断，提供了新的靶点和干预策略。

Description

Rbm24-S181位点磷酸化作为精神压力类疾病及相关心脏疾病用药的标记物的应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种Rbm24-S181位点磷酸化作为精神压力类疾病及相关心脏疾病用药的标记物的应用。

背景技术

随着生活节奏的加快，社会竞争日益激烈，人们的生活压力越来越大，大部分人都在超负荷运转，很容易产生不同程度的精神压力疾病，如抑郁，焦虑，失眠，狂躁等疾病。对于精神疾病的诊断是十分复杂的，目前对精神疾病的特异性诊断未能得到理想的标志物。在临床上，对于精神类疾病进行诊断主要是依靠患者的临床症状。但是，随着医学水平的不断发展，当前在临床诊断中，要根据精神症状，结合生化检查的结果可以更加准确的对精神疾病进行确诊，而且依据生化检查结果，对症下药，从而减轻药物对患者脏器的损害也有积极的意义。目前在临床上主要使用神经递质、酶以及环核苷酸等生化检测指标，可以应用于精神疾病的辅助诊断，但是这些生化检测仍然具有一些局限性。

根据文献报道，抑郁或者焦虑等精神障碍疾病与随后的心脏疾病的发生有密切关系。在抑郁症患者中，其心脏疾病的发生率高于正常人心脏疾病发生率。但是关于精神压力导致心脏疾病发生的诊断标志物少之又少。

因此，发现一种诊断精神压力等亚健康人士患心脏疾病风险是否提高的标志物是非常有必要的，可以使得精神疾病患者在早期发现是否患有心脏疾病，并得到及时治疗。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种Rbm24-S181位点磷酸化在由精神压力以及由精神压力导致的心脏疾病中作为生物标记物的用途，本发明通过Rbm24-S181位点磷酸化(Rbm24-S181的其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，即Rbm24蛋白第181位丝氨酸)为评估精神压力与心脏疾病的分子诊断，提供了新的靶点和干预策略。

本发明的目的是通过以下技术方案实现：

Rbm24-S181位点磷酸化在精神压力类疾病中作为生物标记物的用途。

Rbm24-S181位点磷酸化在诊断精神压力导致的心脏疾病中作为分子标记物的用途。

Rbm24-S181位点磷酸化在预防和治疗相关精神压力引起的心脏疾病中作为药物靶点的用途

检测Rbm24-S181位点磷酸化水平的物质在制备预防、诊断治疗诊断精神压力类疾病以及由精神压力引起的心脏疾病中的产品中应用。

作为优选方案，所述物质为识别Rbm24-S181磷酸化的多克隆抗体或单克隆抗体，所述单克隆抗体的氨基酸序列为YAApSPAAAGYVTA。

本发明的原理：

Rbm24属于RNA结合蛋白的RBM家族（氨基酸序列见），在心脏中特异高表达。Rbm24在调节心脏发育中发挥重要的作用，由于Rbm24在不同物种间具有很高的序列相似性，从而体现出很强的功能保守性。在小鼠中，Rbm24参与心脏的早期发育，Rbm24基因缺失在小鼠中导致心内膜垫损伤，进而引起胚胎期死亡。在一项对人类冠心病的分子流行病学研究中，Rbm24被识别为冠心病发生的潜在生物标志物和主要危险因素之一，其转录水平在冠心病人中明显上调。因此，Rbm24在心脏疾病的发生中有着重要的作用。

蛋白磷酸化是蛋白翻译后修饰的重要机制之一，在细胞对外界信号反应中处于首要位置。我们前期工作表明，心脏Rbm24-S181位点磷酸化响应精神压力信号，探究精神压力与Rbm24-S181位点磷酸化的调控关系可以作为由精神压力导致的心脏疾病的分子标记物。

本发明的有益效果：

本发明运用Rbm24-S181位点磷酸化，并通过血液即可实现对疾病的诊断，有着方便快捷的优点，一方面可以减轻病人的痛苦，另一方面还可以减轻医护人员的工作量，提高工作效率。本发明还属于基因诊断类型的诊断方法，特异性较高，使病人早发现，早治疗，及时控制病情。

附图说明

图1a 为本发明所用抗体制作的免疫肽段图；

图1b为western-blot检测在成心肌细胞C2C12中过表达3Flag-Rbm24的图。

图1c 为western-blot检测在结直肠癌细胞HCT116中敲低Rbm24蛋白水平图。

图1d为western-blot检测在结直肠癌细胞HCT116中利用crispr-cas9技术敲除Rbm24蛋白水平图

图2a 为western-blot检测在成心肌细胞C2C12中用肾上腺素处理后Rbm24-S181位点磷酸化的显著变化图，其中lithium为Rbm24-S181位点磷酸化上游激酶抑制剂。

图2b 为western-blot检测在C57小鼠腹腔注射肾上腺素处理后，小鼠心脏Rbm24-S181位点磷酸化的显著变化图，其中lithium为Rbm24-S181位点磷酸化上游激酶抑制剂。

图2c 为western-blot检测C57小鼠经过慢性压力处理后，小鼠心脏Rbm24-S181位点磷酸化的显著变化图，其中lithium为Rbm24-S181位点磷酸化上游激酶抑制剂。

图3 为western-blot C57小鼠经过不同时间慢性压力处理后，取血液纯化后得到血清检测Rbm24-S181位点磷酸化的显著变化图；

图4为Rbm24 氨基酸序列（灰度部分是RNA结合区）。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。

实施例1：制备Rbm24-S181位点磷酸化抗体并验证该抗体可用

图1a-图1d 鉴定Rbm24-S181位点磷酸化后，根据图1a所示肽段免疫兔子，制备了特异识别Rbm24-S181磷酸化的单克隆抗体，其氨基酸序列为YAApSPAAAGYVTA，此肽段在人、小鼠（YAApSPAAAGYVTT）和斑马鱼（YAApS PAAT GYVA A，如SEQ ID No.1所示）等动物中高度保守，这一抗体可识别细胞内过表达的Rbm24， S181D突变体（天冬氨酸D可以模拟磷酸化），但不识别S181A（丙氨酸A可以模拟非磷酸化）突变体。

该结果说明S181D可模拟S181磷酸化，并被磷酸化抗体特异识别。同时，Rbm24-S181磷酸化抗体可特异识别体内表达磷酸化Rbm24，应用siRNA技术，将细胞中Rbm24的表达水平降低，发现Rbm24-S181磷酸化的水平也降低。应用crispr-cas9技术，将细胞中Rbm24的基因敲除，发现Rbm24-S181磷酸化不能发生。

实施例2：Rbm24-S181位点磷酸化响应精神压力

图2a的实验条件是，在小鼠的成心肌细胞C2C12中，加入终浓度为40uM的肾上腺素处理30min后，收蛋白样品。经western-blot检测，其结果如图2a所示，Rbm24-S181磷酸化被明显激活（泳道3）。泳道2和4是加Lithium组，其中泳道2是只加Lithium可以看到Rbm24-S181磷酸化本底水平明显下调，泳道4是在加了Lithium 30min后加入肾上腺素处理30min，可以明显看出Rbm24-S181磷酸化水平不能被激活。

图2b的实验条件是，C57雄性小鼠腹腔注射 5mg/kg 肾上腺素，1h后二氧化碳处死，收心脏样品经western-blot检测，其结果如图2b所示，Rbm24-S181磷酸化被明显激活（泳道3）。泳道2和4是腹腔注射Lithium组，其中泳道2是只注射Lithium可以看到Rbm24-S181磷酸化本底水平明显下调，泳道4是同时注射Lithium 和肾上腺素，可以明显看出Rbm24-S181磷酸化水平不能被激活。

图2c的实验条件是，将C57雄性小鼠孤立养殖，即一只鼠笼养一只老鼠，持续30天，30天后将小鼠用co2的方式处死，取心脏经western-blot检测，其结果如图2c所示，Rbm24-S181磷酸化被明显激活（泳道3）。泳道2和4是腹腔注射Lithium组，其中泳道2是每天只注射Lithium小鼠群居可以看到Rbm24-S181磷酸化本底水平明显下调，泳道4是每天注射Lithium 和每天隔离持续30天，可以明显看出Rbm24-S181磷酸化水平不能被激活。

实施例3：小鼠血清检测Rbm24-S181磷酸化

图3的实验条件是，将雄性C57小鼠进行隔离实验，分别在隔离10天，20天，30天，40天后取小鼠血液，将血液静置一段时间后离心得到血清，将血清进行western-blot检测。Western-blot结果如图3所示，经过不同时间慢性压力的小鼠，其血清中的Rbm24-S181磷酸化水平呈明显梯度上调。

综合上述实施例1-3，本发明可以根据Rbm24-S181位点磷酸化水平在诊断、预防和治疗精神压力，如抑郁症，焦虑症，失眠症等，以及精神压力引起的心脏疾病，如心脏增生、心肌肥厚、心肌细胞纤维化，心脏瓣膜损伤等中使用，Rbm24-S181位点磷酸化在诊断精神压力以及由精神压力引起的心脏疾病中作为分子标记使用。

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> Rbm24-S181位点磷酸化作为精神压力类疾病及相关心脏疾病用药的标记物的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)

<400> 2

Tyr Ala Ala Ser Pro Ala Ala Thr Gly Tyr Val Ala Ala

1 5 10

<210> 2

<211> 236

<212> PRT

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)

<400> 2

Met His Thr Thr Gln Lys Asp Thr Thr Tyr Thr Lys Ile Phe Val Gly

1 5 10 15

Gly Leu Pro Tyr His Thr Thr Asp Ala Ser Leu Arg Lys Tyr Phe Glu

20 25 30

Val Phe Gly Glu Ile Glu Glu Ala Val Val Ile Thr Asp Arg Gln Thr

35 40 45

Gly Lys Ser Arg Gly Tyr Gly Phe Val Thr Met Ala Asp Arg Ala Ala

50 55 60

Ala Glu Arg Ala Cys Lys Asp Pro Asn Pro Ile Ile Asp Gly Arg Lys

65 70 75 80

Ala Asn Val Asn Leu Ala Tyr Leu Gly Ala Lys Pro Arg Ile Met Gln

85 90 95

Pro Gly Phe Ala Phe Gly Val Gln Gln Leu His Pro Ala Leu Ile Gln

100 105 110

Arg Pro Phe Gly Ile Pro Ala His Tyr Val Tyr Pro Gln Ala Phe Val

115 120 125

Gln Pro Gly Val Val Ile Pro His Val Gln Pro Thr Ala Ala Ala Ala

130 135 140

Ser Thr Thr Pro Tyr Ile Asp Tyr Thr Gly Ala Ala Tyr Ala Gln Tyr

145 150 155 160

Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Tyr Asp Gln Tyr

165 170 175

Pro Tyr Ala Ala Ser Pro Ala Ala Ala Gly Tyr Val Thr Ala Gly Gly

180 185 190

Tyr Gly Tyr Ala Val Gln Gln Pro Ile Thr Ala Ala Ala Pro Gly Thr

195 200 205

Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Phe Gly Gln

210 215 220

Tyr Gln Pro Gln Gln Leu Gln Thr Asp Arg Met Gln

225 230 235

Claims

1.一种识别Rbm24-S181磷酸化的单克隆抗体的抗原表位肽，其特征在于：所述单克隆抗体的抗原表位肽的氨基酸序列为YAApSPAAAGYVTA。