JP2006238861A - スギ花粉由来の新規アレルゲンおよびその利用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 本発明に係るタンパク質(CPJ38)は、348アミノ酸残基からなるタンパク質であり、スギ花粉に含まれるアレルゲンであって、植物由来の1,3-beta-グルカナーゼと高い相同性を有し、1,3-beta-グルカナーゼ活性を有するものである。
【選択図】 図3
Description
Sigeta, S. et al., Arerugi, 39(3), 313-21 (1990) Bousquet, J. et al., J. Allergy Clin. Immunol. 102, 558-62 (1998) Yasueda, H. et al., J. Allergy Clin. Immunol., 71, 77-86 (1983). Sakagucji, H. et al., Allergy, 45, 309-312 (1990) Fujimura, T. et al., Int. Arch. Allergy Immunol., 133, 125-135 (2004)
本発明に係るタンパク質は、スギ花粉に含まれるスギ花粉症のアレルゲンであって、植物由来の1,3-beta-グルカナーゼと高い相同性を有し、1,3-beta-グルカナーゼ活性を有するものである。本実施の形態では、本発明に係るタンパク質の一例として、スギ花粉アレルゲンCJP38(以下では、単に「CJP38」と称する)を挙げて説明する。
本発明のCJP38は、配列番号1に示すアミノ酸配列(348アミノ酸残基)からなるタンパク質であり、スギ花粉に含まれているものである。また、CJP38のアミノ酸配列は、CJP38をコードする遺伝子のcDNAの塩基配列とともに図3にも示されている。
本発明に係る遺伝子は、上記(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子、およびその塩基配列の一部を改変した改変遺伝子が含まれる。本発明に係る遺伝子を適当な宿主(例えば細菌、酵母)に導入すれば、本発明に係るタンパク質をその宿主内で発現させることができる。また、例えば、上記(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子を適当なベクターに導入し、組み換えバキュロウイルスを作成し、このバキュロウイルスに昆虫の組織を感染させると、昆虫の組織において、本発明のタンパク質を発現させることができる。
本発明に係るタンパク質および遺伝子の取得方法(生産方法)は特に限定されるものではないが、代表的な方法として次に示す各方法を挙げることができる。
本発明に係るタンパク質を取得する方法(生産方法)は、上述したように特に限定されるものではないが、まず、本発明に係るタンパク質を発現する細胞、組織などから単純精製する方法を挙げることができる。すなわち、スギ花粉から本発明に係るタンパク質を抽出・精製してもよい。精製方法も特に限定されるものではなく、公知の方法でスギ花粉から細胞抽出液を調製し、この細胞抽出液を公知の方法、例えばカラム等を用いて精製すればよい。
本発明に係る遺伝子を取得する方法は、特に限定されるものではなく、前述の開示された配列情報等に基づいて種々の方法により、上記各遺伝子配列を含むDNA断片を単離し、クローニングすることができる。
本発明のタンパク質は、これまでにスギ花粉症の主要アレルゲンとして知られているCry j1やCry j2とは異なる構造を有する新規のスギ花粉アレルゲンである。アレルゲンを認識するIgE抗体は、アレルゲンであるタンパク質の特定の領域(エピトープ)を認識することから、本発明のタンパク質は、Cry j1やCry j2とは異なるエピトープを有していると考えられる。換言すれば、本発明のタンパク質を認識する抗体と、Cry j1またはCry j2を認識する抗体とは異なると考えられる。
本発明には、本発明に係るタンパク質や抗体を含む治療用薬剤も含まれる。例えば、本発明に係る治療用薬剤の一例として、スギ花粉症患者に対して行われる減感作療法に用いる減感作治療用薬剤が挙げられる。当該治療用薬剤(例えば、減感作治療用薬剤)は、本発明のタンパク質を主成分とするものであってもよいし、本発明のタンパク質と本発明のタンパク質以外のタンパク質との混合物であってもよく、本発明に係るタンパク質の一部を含むものであってもよい。
本発明に係る抗体は、前記(a)又は(b)のタンパク質(本発明に係るタンパク質)、またはその部分タンパク質・部分ペプチドを抗原として、公知の方法によりポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得られる抗体である。公知の方法としては、例えば、文献(Harlowらの「Antibodies : A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory, New York(1988))、岩崎らの「単クローン抗体 ハイブリドーマとELISA,講談社(1991)」」に記載の方法が挙げられる。
本発明に係るベクターは、前記(a)又は(b)のタンパク質をコードする本発明の遺伝子を含むものである。例えば、cDNAが挿入された組換え発現ベクターが挙げられる。ベクターの作製には、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどを用いることができるが特に限定されるものではない。また、当該組換え発現ベクターの作製方法も公知の方法の中から選択すればよい。
本発明に係る形質転換体は、本発明に係る遺伝子、すなわち、前記(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子が導入された形質転換体である。ここで、「遺伝子が導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法(遺伝子操作技術)により、対象細胞(宿主細胞)内に発現可能に導入されることを意味する。また、上記「形質転換体」とは、細胞・組織・器官のみならず、生物個体を含む意味である。
上記本発明にかかるベクターおよび形質転換体を用いることによって本発明にかかるタンパク質の生産を行うことができる。
本発明に係る遺伝子検出器具は、本発明に係る遺伝子における少なくとも一部の塩基配列またはその相補配列をプローブとして用いたものである。遺伝子検出器具は、種々の条件下において、本発明に係る遺伝子の発現パターンの検出・測定などに利用することができる。
本発明者らは、本発明のタンパク質を同定することを目的として、スギ花粉から全タンパク質を粗抽出し、当該スギ花粉租抽出タンパク質をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)により分離した。そして、分離されたスギ花粉粗抽出タンパク質に対して、複数のスギ花粉症患者から得られた血清を用いて免疫染色を行った。すなわち、本発明者らは、スギ花粉症患者の血清に含まれるIgE抗体と高頻度に反応するスギ花粉タンパク質を探索した。
日本スギ(C. japonica)の葯(2g)(広島県豊田郡豊町にて採取)を液体窒素中で粉砕し、使用したスギ葯の10倍量(W/V)の2×CTAB(centyltrimethylammomium bromide)溶液中に、粉砕されたスギ葯を懸濁した後、65℃で10分間インキュベートした。そして、上記懸濁液と等量のクロロホルム/イソアミルアルコール(24:1)を上記懸濁液に加えて攪拌し、室温で遠心分離(9,300 g,10分間)した。分離された液層のうち、水層(上層)を回収し、当該水層と等量のクロロホルム/イソアミルアルコール(24:1)を当該水層に加えて攪拌し、再度室温で遠心分離(9,300 g,10分間)した。分離された液層のうち、水層を回収し、当該水層の3/4倍量のイソプロピルアルコールを当該水層に加えた後に、室温で10分間静置した。その後、4℃で遠心分離(9,300 g,10分間)し、形成された沈殿をTE(Tris-EDTA)バッファーに溶解することにより全RNA粗抽出液を得た。
上記実施例1において得られた全RNAを鋳型として、CJP38をコードするcDNAを合成した。具体的には、3’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends(Invitrogen社製)を用いて、逆転写反応とPCR反応とを行い、CJP38遺伝子のcDNAを特異的に増幅した。以下において、この手法の詳細な説明を行う。
全RNA(5μg)を含む溶液 5μlに、アダプタープライマー 1μlと、DEPC(diethylpyrocarbonate)処理液 6μlとを加え、インキュベート(70℃、10分間)した後に、氷上に1分間静置した。この反応液に10×PCRバッファー 2μl、25mM MgCl2 2μl,dNTP MI×(2.5 mM each) 1μl、DTT(dithiothreitol)(0.1 M) 2μlを加え、42℃で5分間プレインキュベートした。この反応液にSUPERSCRIPT II(Life Technonogies, Inc.社製)を1μl加えて、42℃で50分間インキュベートした。その後、70℃で15分間インキュベートすることにより反応を停止させた。この反応液を氷上で静置した後に、RNase Hを1μl加えてインキュベート(37℃、20分間)することによりRNAを消化した。
次に、上記の処理によって合成されたcDNAを鋳型として、PCR反応を行った。この反応において次に示す2種類のプライマーを用いた。
プライマー1:GCHATHTCHGTDGGNAAYGARGT(配列番号12)
プライマー2:CCRTCNGGYTTRAANAGNCCRTA(配列番号13)
上記の塩基配列中、RはAまたはGを表し、YはCまたはTを表し、HはAまたはT、またはCを表し、DはGまたはAまたはTを表し、NはAまたはCまたはGまたはTを表す。
実施例2において得られたCJP38cDNA断片をpGEM-T Easy ベクターに組み込み、ベクター特異的なプライマーを用いて、CJP38cDNA断片の塩基配列を決定した。
プライマー3:CTTGATGTTGTTCTGCAGATTGG(配列番号14)
プライマー4:GCGCTCTTTAATCCTACACC(配列番号15)
プライマー3を用いた5’RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)法により、CJP38cDNAの5’末端側の断片を取得し、この断片の塩基配列を決定した。一方、プライマー4を用いた3’RACE法により、CJP38cDNAの3’末端側の断片を取得し、この断片の塩基配列を決定した。これにより、CJP38cDNAの全塩基配列を決定するに至った。決定された配列は、配列番号2に示す配列であり、1313塩基からなる。
CJP38と相同性の高い植物由来のタンパク質を、GenBankデータベースを用いたBLAST検索により探索した。その結果、CJP38は1,3-beta-グルカナーゼと高い相同性を有することが確認された。図4に、CJP38と高い相同性を示す植物の1,3-beta-グルカナーゼのアミノ酸配列を示す。CJP38は、トマト(L. esculentum)の1,3-beta-グルカナーゼと47%、オリーブ花粉の主要アレルゲンであるOle e9と40%、パラゴムノキの主要アレルゲンであるHev b2と43%の相同性を有している。上記の結果から、CJP38は1,3-beta-グルカナーゼである可能性が高いと考えられる。
CJP38を大量に得るために、CJP38とGST(glutathione S-transferase)との融合タンパク質(GST-CJP38)を大腸菌の発現系にて発現させた。
上記実施例5において得られたrCJP38がアレルゲン活性を有しているかどうかを明らかにするために、rCJP38を含む画分と、スギ花粉症患者の血清とを用いて免疫染色を行った。なお、上記rCJP38を含む画分とは、上記可溶化されたタンパク質をスロンビン消化することによって得られるタンパク質画分であり、この画分には、rCJP38の他にGSTや大腸菌由来のタンパク質も含まれている。
上記実施例5において得られたrCJP38が1,3-beta-グルカナーゼ活性を有しているかどうかを明らかにするために、酢酸ナトリウムバッファー(pH5.0)で透析した上記rCJP38を含む画分を用いて1,3-beta-グルカナーゼ活性測定を行った。
スギ花粉に含まれるCJP38の分子量および等電点を確認するために、スギ花粉から抽出したタンパク質を2次元電気泳動により展開した後に、CJP38抗体を用いて免疫染色を行った(2次元免疫染色)。
Claims (14)
- スギ花粉に含まれるアレルゲンであって、
1,3-beta-グルカナーゼ活性を有することを特徴とするタンパク質。 - スギ花粉に含まれるタンパク質であって、以下の(a)または(b)に記載のタンパク質。
(a)配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
(b)配列番号1のアミノ酸配列において、1個または複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アレルゲン活性を有するタンパク質。 - 請求項2に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
- 配列番号3に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する請求項3に記載の遺伝子。
- 配列番号3に示される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アレルゲン活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
- 請求項1または2に記載のタンパク質を認識する抗体。
- 請求項3〜5の何れか1項に記載の遺伝子を含むベクター。
- 請求項3〜5の何れか1項に記載の遺伝子を導入してなる形質転換体。
- 請求項7に記載のベクターを用いることを特徴とするタンパク質の製造方法。
- 請求項8に記載の形質転換体を用いることを特徴とするタンパク質の製造方法。
- 請求項1または2に記載のタンパク質に含まれるペプチドであって、
スギ花粉症患者由来のT細胞を増殖させる活性を有することを特徴とするペプチド。 - 請求項3〜5の何れか1項に記載の遺伝子における少なくとも一部の塩基配列またはその相補配列をプローブとして用いた遺伝子検出装置。
- 請求項1または2に記載のタンパク質を含むことを特徴とするアレルギー診断用薬剤。
- 下記(1)または(2)の物質を含む治療用薬剤。
(1)請求項1または2に記載のタンパク質。
(2)請求項6に記載の抗体。
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