CN109312325B - 新型杉树花粉蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种新型的杉树花粉蛋白以及使用其的以杉树花粉为原因的过敏性疾病的诊断药、预防药和治疗药等。该杉树花粉蛋白选自以下的(a)～(c)：(a)包含序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质；(b)包含在序列号2所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被取代、缺失或添加而成的氨基酸序列且具有杉树花粉过敏原活性的蛋白质；(c)包含与序列号2所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列且具有杉树花粉过敏原活性的蛋白质。

Description

新型杉树花粉蛋白
技术领域
本发明涉及一种来自杉树花粉的新型的蛋白质和该蛋白质的应用。
背景技术
花粉症因吸入空气中飞散的花粉而发病，是表现出眼睛发痒或疼痛等的过敏性结膜炎、鼻炎、皮肤的炎症或哮喘等症状的过敏性疾病。作为花粉症的原因的植物已知有很多，但在日本最多的花粉症是杉树(スギ、柳杉)花粉症(以杉树花粉为原因的过敏性疾病)。在2003年的报告中，推定杉树花粉症的发病率在2001年时为19.4％(非专利文献1)，推定至少2000万人以上受杉树花粉症折磨，称之为国民病也不为过。
有关杉树花粉症的更严重的问题之一，可以列举杉树花粉飞散量的逐年增加。已知杉树花粉的飞散量与花粉飞散期前一年的夏季的平均气温正相关，已有报告称，随着日本的平均气温的上升，杉树花粉飞散量逐年增加(非专利文献2)。随之，也容易想到今后杉树花粉症患者的增加，有损害日本国民的健康的危险。实际上已经有报告，根据使用了38份报告的元分析(meta-analysis)的结果，从1980年至2000年期间杉树花粉症发病率已上升到2.6倍(非专利文献3)。
在这些杉树花粉症的治疗中，已使用了以抗组胺药等的使用为代表的一系列的对症疗法，作为能够期待杉树花粉症的根治的唯一的治疗方法，过敏原免疫疗法(减敏疗法)受到了期待。这是通过将作为过敏性疾病的原因的过敏原经皮下或舌下等投予而期待缓解过敏症状的治疗方法。在这些过敏原免疫疗法的开发或其治疗效果的提高过程中，确定原因过敏原及对其的理解不可或缺。
作为与杉树花粉症的发病相关联的主要的杉树花粉过敏原，迄今为止已报告了Cry j 1、Cry j 2、Cry j 3(非专利文献4、5和6)，特别是Cry j 1和Cry j 2，已开发了以它们为主要成分的标准化杉树花粉提取物(非专利文献7)，在日本已经能够实施对杉树花粉症的过敏原免疫疗法。然而，也存在过敏原免疫疗法无法奏效的患者群。已暗示了杉树花粉中还存在未被鉴定的新型过敏原(非专利文献8)，要求有效性更高的以杉树花粉症的免疫疗法为目的的特征性新型过敏原蛋白。
现有技术文献
专利文献
非专利文献1：Okuda M，Ann Allergy Asthma Immunol.，91:288-296，2003
非专利文献2：Yamada T,et al.,J Allergy Clin Immunol.,133:632-639,2014
非专利文献3：Kaneko Y,et al.,Int Arch Allergy Immunol.,136:365-371,2005
非专利文献4：Yasueda H,et al.,J.Allergy Clin.Immunol.,71:77-86,1983
非专利文献5：Sakaguchi M,et al.,Allergy,45:309-312,1990
非专利文献6：Fujimura T,et al.,Allergy,62:547-553,2007
非专利文献7：Yasueda H,et al.,Allergol.Int.,46:135-140,1997
非专利文献8：Fujimura T,et al.,Int Arch Allergy Immunol.,133:125-135,2004
发明内容
发明所要解决的课题
本发明提供一种新型的杉树花粉蛋白以及使用其的以杉树花粉为原因的过敏性疾病的诊断药、预防药和治疗药等。
用于解决课题的技术方案
本发明的发明人为了解决上述的课题，进行了研究，从杉树花粉粗抗原中发现了与来自杉树花粉症患者的淋巴球和血清中IgE显示高的反应性的新的蛋白质，并且发现其作为以杉树花粉为原因的过敏性疾病的诊断药、预防药或治疗药是有效的。
即，本发明涉及以下的1)～13)。
1)一种选自以下的(a)～(c)的杉树花粉蛋白。
(a)包含序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质；
(b)包含在序列号2所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被取代、缺失或添加而成的氨基酸序列且具有杉树花粉过敏原活性的蛋白质；
(c)包含与序列号2所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列且具有杉树花粉过敏原活性的蛋白质。
2)一种编码选自以下的(a)～(c)的杉树花粉蛋白的多核苷酸。
(a)包含序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质；
(b)包含在序列号2所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被取代、缺失或添加而成的氨基酸序列且具有杉树花粉过敏原活性的蛋白质；
(c)包含与序列号2所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列且具有杉树花粉过敏原活性的蛋白质。
3)一种选自以下的(d)～(f)的多核苷酸。
(d)包含序列号1所示的碱基序列的多核苷酸；
(e)与包含与序列号1所示的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸在严格的条件下杂交且编码具有杉树花粉过敏原活性的蛋白质的多核苷酸；
(f)包含与序列号1所示的碱基序列具有90％以上的同一性的碱基序列且编码具有杉树花粉过敏原活性的蛋白质的多核苷酸。
4)一种以上述1)的杉树花粉蛋白为有效成分的以杉树花粉为原因的过敏性疾病的预防或治疗剂。
5)一种以上述1)的杉树花粉蛋白为有效成分的以杉树花粉为原因的过敏性疾病的诊断药。
6)一种上述1)的杉树花粉蛋白的抗体。
7)如上述6)的杉树花粉蛋白的抗体，其为单克隆抗体。
8)上述1)的杉树花粉蛋白在制造以杉树花粉为原因的过敏性疾病的预防或治疗剂中的用途。
9)上述1)的杉树花粉蛋白在制造以杉树花粉为原因的过敏性疾病的诊断药中的用途。
10)如上述1)的杉树花粉蛋白，其用于预防或治疗以杉树花粉为原因的过敏性疾病。
11)如上述1)的杉树花粉蛋白，其用于诊断以杉树花粉为原因的过敏性疾病。
12)一种以杉树花粉为原因的过敏性疾病的预防或治疗方法，其特征在于，向患者投予上述1)的杉树花粉蛋白。
13)一种以杉树花粉为原因的过敏性疾病的诊断方法，其特征在于，向患者投予上述1)的杉树花粉蛋白。
发明效果
本发明的杉树花粉蛋白能够应用于以杉树花粉为原因的过敏性疾病的诊断药、预防药和治疗药等。该杉树花粉蛋白包含与Cry j 1、Cry j 2、其他已知杉树花粉蛋白没有相同性的氨基酸一次序列，因此，通过与它们组合，能够进行更有效的减敏治疗。
附图说明
图1是利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对精制后的重组杉树花粉蛋白进行分析而得到的图。
图2是表示使用4名杉树花粉症患者(ImmunoCAP Score≥2)的末梢血单核细胞对因添加精制重组蛋白而发生的增殖反应进行测定而得到的结果的图。
图3是表示流式细胞仪的结果的图，该结果显示了13名杉树花粉症患者(ImmunoCAP Score≥2)的末梢血中的嗜碱性粒细胞被精制重组蛋白活化而增强了CD203c的表达，另一方面显示了在2名健康者(ImmunoCAP Score＜2)的末梢血中的嗜碱性粒细胞中CD203c的表达没有发生变化。
具体实施方式
杉树花粉蛋白
本发明的杉树花粉蛋白是选自以下的(a)～(c)的蛋白质。
(a)包含序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质；
(b)包含在序列号2所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被取代、缺失或添加而成的氨基酸序列且具有杉树花粉过敏原活性的蛋白质；
(c)包含与序列号2所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列且具有杉树花粉过敏原活性的蛋白质。
本发明的杉树花粉蛋白只要具有杉树花粉过敏原活性，则包括包含在该序列号2所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被取代、缺失或添加而成的氨基酸序列的蛋白质(上述(b))。作为包含这样的氨基酸序列的杉树花粉蛋白，例如可以列举具有序列号2所示的氨基酸序列的杉树花粉蛋白的异形体等。
其中，被缺失、置换或添加的多个氨基酸是指例如1～10个、更优选1～5个氨基酸。另外，上述的添加或缺失包括向两末端的1～数个氨基酸的添加或缺失。
作为异形体的具体例，例如可以列举C末端的4个残基的缺失。
其中，“杉树花粉过敏原活性”不仅包含与肥大细胞上的IgE结合而对特应性的人引起即时型过敏反应的活性(De Weck,AL.et al.,Int.Arch.Allergy Immunol.,146:177-189,2008)，也包含只与血清中的IgE结合的活性。与IgE结合的活性可以利用国际公开第2012/105541小册子等所记载的方法测定。
另外，本发明的杉树花粉蛋白只要具有杉树花粉过敏原活性，则包括在序列号2所示的氨基酸序列中对相应的序列进行适当比对时包含与序列号2所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性的蛋白质的蛋白质((上述(c))。
其中，与序列号2所示的氨基酸序列的同一性优选为95％以上，更优选为98％以上。关于该氨基酸序列的同一性，可以应用例如使用BLAST(Basic Local AlignmentSearch Tool at the National Center for Biological Information)、可选参数为利用初期设定值进行计算的方法。
另外，本发明的杉树花粉蛋白也可以形成与多重组氨酸残基那样的有益于精制的序列、用于确保重组生产时的稳定性的与蛋白质等的融合体。
编码杉树花粉蛋白的多核苷酸
本发明的多核苷酸为编码上述杉树花粉蛋白的多核苷酸，优选可以列举(d)包含序列号1所示的碱基序列的多核苷酸；(e)与包含与序列号1所示的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸在严格的条件下杂交且编码具有杉树花粉过敏原活性的蛋白质的多核苷酸；(f)包含与序列号1所示的碱基序列具有90％以上的同一性的碱基序列且编码具有杉树花粉过敏原活性的蛋白质的多核苷酸。
(e)和(f)的多核苷酸包含(d)的多核苷酸的变异体。该变异体包含天然的对立基因变异体或使用该领域中公知的诱变技术能够生成的天然不存在的变异体。
本发明的多核苷酸不仅包含双链DNA，也包含构成其的正义链和反义链这样的各种单链DNA或RNA。反义链能够用作探针等。DNA包括例如利用克隆或化学合成技术或它们的组合得到的cDNA或基因组DNA等。另外，对于本发明所涉及的多核苷酸，除了编码本发明所涉及的多肽的碱基序列以外，还可以添加非翻译区域(UTR)的序列或载体序列(包括表达载体序列)等的碱基序列。
其中，所谓严格的条件，例如可以列举Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Second Edition,J.Sambrook et.al,1989)所记载的条件等。即，可以列举在含有6×SSC(1×SSC的组成：0.15M氯化钠、0.015M柠檬酸钠、pH7.0)、0.5％SDS、5×Denhardt和100mg/mL鲱鱼精子DNA的溶液中与探针一起以65℃恒温8～16小时而使其杂交的条件等。
另外，与序列号1所示的碱基序列的同一性优选为95％以上，更优选为98％以上。关于该碱基序列的同一性，可以应用例如使用BLAST、可选参数为初期设定值进行计算的方法。
作为上述多核苷酸的变异体，例如可以分别列举序列号1所示的碱基序列的第4位的a变异为g、第898位的t变异为c、第1029位的g变异为a、第1643位的t变异为a。
编码杉树花粉蛋白的多核苷酸的获得
本发明的编码杉树花粉蛋白的多核苷酸能够由杉树花粉克隆化，作为克隆方法，可以列举使用已知的方法、例如鸟枪法、PCR法进行的方法。
例如，可以制备与本发明的多核苷酸的碱基序列的一部分特异杂交的探针，使用该探针对基因组DNA库或cDNA库进行筛选。作为这样的探针，只要是与本发明所涉及的多核苷酸或其互补链的至少一部分特异杂交的探针，就可以使用任意的序列和长度。还可以列举人工合成多核苷酸的方法。(Kosuri S et.al.,Nature Methods 11,499-507,2014)
另外，通过使用适当的原理，获得与包含本发明的多核苷酸的一部分或全部的多核苷酸杂交的序列，也能够得到本发明的多核苷酸。例如，可以列举将上述的包含本发明的多核苷酸的一部分的多核苷酸用作引物而进行的PCR法、将上述的包含本发明的多核苷酸的一部分的多核苷酸用作探针的方法。
例如，关于使用PCR等扩增方法的方法，从本发明的多核苷酸的5'侧和3'侧的序列(或其互补序列)中分别制备引物，使用这些引物，将基因组DNA(或cDNA)等作为模板，进行PCR等扩增反应，对夹在两引物间的DNA区域进行扩增，从而能够大量获得包含该多核苷酸的DNA片段。
另外，例如通过利用有计划的或随机的变异导入法等方法，改变包含序列号1所示的碱基序列的多核苷酸，也能够制作本发明所提供的多核苷酸。
其中，有计划地导入变异时的变异的计划例如可以参考多核苷酸序列上的特征序列而进行。另外，作为随机导入变异的方法，例如可以列举PCR法、利用变异原处理的方法。作为有计划地导入变异的方法，可以列举定点突变法，更具体而言，例如可以使用Site-Directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Km试剂盒(Takara Bio)等进行。另外，也可以使用重组PCR法(PCR protocols,Academic Press,New York,1990)。
杉树花粉蛋白的制造
本发明的杉树花粉蛋白可以由杉树花粉通过分离精制而得到。分离精制方法没有特别限定，例如可以使用凝胶过滤、离子交换色谱法、亲和色谱法等目前公知的方法，对杉树花粉提取液进行分离精制。
还可以将向适当的载体插入本发明的多核苷酸而制作的重组载体导入宿主细胞内，使杉树花粉蛋白在细胞内或细胞外表达而收集。
作为宿主，只要是能够转化的活细胞，就没有特别限定，例如可以列举大肠杆菌、枯草杆菌等的细菌、酵母或丝状菌等的真菌类、Sf9细胞等的昆虫培养细胞、蚕等的昆虫、动物细胞、植物或来自植物的细胞等。
用于插入本发明的多核苷酸的载体只要能够在上述的宿主中复制，就没有特别限定，可以根据所导入的宿主的种类、导入方法等适当决定。
例如，可以列举质粒DNA、噬菌体DNA、病毒载体等。用于表达载体的构建的载体DNA可以使用已广泛普及的容易获得的载体。例如，可以列举pUC19(Takara Bio)、pTV118N(Takara Bio)、pMAMneo(Clontech)、pGEX(GE Healthscare)、pET160(Invitrogen)、pDEST(Invitrogen)、pIEx(Merckmillipore)、pBacPAK(Clontech)等。另外，作为病毒载体，例如可以列举杆状病毒载体、逆转录酶病毒载体、人类免疫缺陷病毒(HIV)等的慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体(AAV载体)、疱疹病毒、痘苗病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒、辛德毕斯(Sindbis)病毒、仙台病毒、猴病毒－40(SV－40)等的DNA病毒或RNA病毒等。
使用该重组载体转化宿主时，可以使用原生质体法、感受态细胞法、电穿孔法等进行。所得到的转化体可以使用含有能够利用的碳源、氮源、金属盐、维生素等的培养基在适当的条件下进行培养。从如此操作而得到的培养液中，利用一般的方法收集、精制蛋白质，能够得到本发明的杉树花粉蛋白。例如，使用大肠杆菌作为宿主时，可以列举pET SystemManual,10th edition(Novagen)所记载的方法等。
以杉树花粉为原因的过敏性疾病的预防或治疗剂
本发明的杉树花粉蛋白可以形成以杉树花粉为原因的过敏性疾病的预防或治疗剂，用于向需要其的人(患者)投予而预防或治疗以杉树花粉为原因的过敏性疾病。
其中，作为以杉树花粉为原因的过敏性疾病，可以列举杉树花粉的特异抗原为原因的所有的过敏性疾病，具体而言，例如可以列举特应性支气管哮喘、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、特应性皮肤炎等。
这样的以杉树花粉为原因的过敏性疾病的预防或治疗剂例如能够用作以杉树花粉为原因的过敏性疾病的减敏治疗剂。
关于本发明的杉树花粉蛋白，根据使用GENETYX Ver.12的氨基酸同一性分析的结果，没有发现与作为与杉树花粉症的发症相关联的主要的杉树花粉过敏原而被报告的Cryj 1、Cry j 2、Cry j 3的同一性，考虑是由于其为与目前公知的Cry j 1、Cry j 2、Cry j 3是不同的蛋白质，通过与它们组合，能够进行更有效的减敏治疗。
将本发明的以杉树花粉为原因的过敏性疾病的预防或治疗剂用作减敏治疗剂时，优选将本发明的杉树花粉蛋白直接使用、或者干燥而成粉末状，或者根据需要利用通常方法添加常用的佐剂和各种添加剂、例如稳定剂、赋形剂、溶解辅助剂、乳浊剂、缓冲剂、无痛剂、保存剂、着色剂等而调制成配合剂。
例如，可以将粉末状的精制后的杉树花粉蛋白溶解在添加有苯酚的生理食盐水中，作为减敏治疗用抗原的原液使用。
本发明的以杉树花粉为原因的过敏性疾病的预防或治疗剂可以利用通常的投予途径例如经皮、经口、皮内、皮下、肌肉内、腹腔内等投予方法进行。另外，例如也可以作为含剂、舌下片、滴眼剂、鼻腔内喷雾剂、糊剂、乳剂、洗剂等的经皮、经粘膜药使用。
本发明的以杉树花粉为原因的过敏性疾病的预防或治疗剂的投予量和投予次数因投予途径、症状等而不同，例如适当选择，使其处于成人每1次约0.1～1000μg的范围内，每周投予1至数次左右。
以杉树花粉为原因的过敏性疾病的诊断
本发明的杉树花粉蛋白可以形成以杉树花粉为原因的过敏性疾病诊断药，用于诊断以杉树花粉为原因的过敏性疾病。
这样的以杉树花粉为原因的过敏性疾病诊断药例如可以用作对以杉树花粉为原因的过敏性疾病的皮肤反应诊断、即皮内试验或点刺试验药剂等。并且，通过制备特异的IgE抗体检查用药剂，能够进行使用患者血清或血浆的诊断。(鼻过敏诊疗指南－常年性鼻炎和花粉症－2013年版，株式会社Life Sciences)
用作皮肤反应诊断药剂时，可以将利用上述的方法获得的本发明的杉树花粉蛋白例如干燥而成粉末状，将其溶解在含有苯酚或甘油的生理食盐水中，稀释后使用。作为特异的IgE抗体检查用药剂，可以列举在水相中或固相上使患者被检测体中的IgE抗体与本发明的杉树花粉蛋白结合、基于荧光酶免疫分析法(Fluoro enzyme immunoassay)、化学发光酶免疫分析法(Chemiluminescence enzyme immunoassay)、酶免疫分析法(enzymeimmunoassay)等原理进行检测的方法，但检测方法并不限定于此。
杉树花粉蛋白的抗体
本发明的杉树花粉蛋白的抗体是能够与本发明的杉树花粉蛋白特异性结合的抗体。上述抗体是指免疫球蛋白(IgA、IgD、IgE、IgG、IgM和它们的Fab片段、F(ab')2片段、Fc片段)，例如可以列举多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体、抗独特型抗体(anti-idiotypeantibody)和人源化抗体，但并不限定于此。
上述抗体可以使用各种公知的方法制作，制作方法没有特别限定。
上述抗体可以用于表达本发明的杉树花粉蛋白的生物体或其组织或细胞的鉴定等。例如，可以用于测定大气中或屋内的空间或人的粘膜有无杉树花粉蛋白等。该测定可以利用公知的免疫学方法进行，例如可以利用ELISA法进行。
以下，利用实施例对本发明进行具体说明，但本发明并不限定于这些实施例。
实施例
实施例1新型杉树花粉蛋白的粗精制
＜杉树花粉蛋白的粗精制＞
向2g的杉树花粉中加入提取缓冲液(20mM Tris-HCl、pH9.0)50mL，进行10分钟超声波破碎。接着，室温下混合10分钟后，离心(10,000g、10分钟)，得到上清液。对该上清液再次进行超离心分离(50,000g、60分钟)，回收上清液。对于该上清液17mL，加入等量的利用提取缓冲液(20mM Tris-HCl、pH9.0)平衡化后的Q sepharose high performance树脂(GEHealthscare)悬浮液，室温下振荡30分钟。利用离心分离(1,000g、10分钟)除去上清液后，用提取缓冲液(20mM Tris-HCl、pH9.0)定容至50mL，反转混合后，通过再次离心分离，清洗树脂。接着，向清洗后的树脂中加入含有0.0125M NaCl的提取缓冲液(20mM Tris-HCl、pH9.0)10mL，室温下振荡5分钟。利用离心分离(1,000g、10分钟)除去上清液，洗脱吸附于树脂的蛋白质。利用含有0.025M NaCl的提取缓冲液(20mM Tris-HCl、pH9.0)、含有0.05MNaCl的提取缓冲液(20mM Tris-HCl、pH9.0)、含有0.1M NaCl的抽缓冲液(20mM Tris-HCl、pH9.0)、含有0.2M NaCl的提取缓冲液(20mM Tris-HCl、pH9.0)、含有0.4M NaCl的提取缓冲液(20mM Tris-HCl、pH9.0)、含有0.6M NaCl的提取缓冲液(20mM Tris-HCl、pH9.0)重复相同的操作。最后，使用含有0.6M NaCl的提取缓冲液(20mM Tris-HCl、pH9.0)，回收所洗脱的蛋白质溶液作为粗精制液。
＜部分内部氨基酸序列的鉴定＞
利用100,000MWCO离心柱对所回收的粗精制液进行浓缩操作。使用Novex(注册商标)NuPAGE(注册商标)SDS-PAGE system(invitrogen)的一般的规程，对浓缩后的样品进行还原和SDS-PAGE。使用SilverQuest(注册商标)Silver Staining Kit(ThermoFisher)的标准规程，对电泳后的SDS-PAGE凝胶进行银染色。接着，为了明确本发明蛋白质内部的部分氨基酸序列，对利用蛋白酶限制分解而得到的片段进行分析。即，将分子量70kDa带附近的凝胶切碎后，收集碎片，用水和乙腈清洗，供于利用DTT和碘乙酰胺的烷基化处理。接着，向样品中加入胰蛋白酶，在37℃保温16小时，进行水解反应。反应后，使用25mM碳酸氢铵、5％甲酸和乙腈，从凝胶片提取肽。最后，将提取溶液在减压下干燥。将干燥后的样品溶解在含有水、乙腈和三氟乙酸的溶剂(体积比98:2:0.1)中，利用LC-MS/MS系统(Paradigm MS4(Michrom Bioresources公司)、MS/MS：LTQ OrbiTrap XL质量分析仪(ThermoFisher)进行分析。柱选择分析用C18柱L-Column Micro(化学物质评价研究机构)，流动相A([水]:[乙腈]:[甲酸]＝98:2:0.1(体积比))和流动相B([水]:[乙腈]:[甲酸]＝5:95:0.1(体积比))。添加样品后，以乙腈送液梯度(分钟，％B)：(0，5)→(20，35)→(25，90)→(30，90)→(30.01，5)→(40，5)的条件进行洗脱、分级，利用MS/MS测定肽分子量。关于所得到的分子量，使用Mascot(Matrix Science)软件确定肽序列。作为其结果，得到部分序列WIVDEATGLR。
实施例2精制重组蛋白的制备
＜杉树total RNA的提取＞
将在液氮中冻结粉碎后的杉树雄花(花药)2g添加至加入了植物RNA提取试剂(Plant RNA Isolation Reagent)(Invitrogen)25mL的50mL管中，混合后，室温下静置5分钟。
以4℃离心(2600x g、5分钟)之后，利用倾析，用网眼尺寸100μm的网过滤上层。接着，向所回收的滤液中加入1/5倍量的5M NaCl和3/5倍量的氯仿。以4℃离心(2600x g、30分钟)之后，回收上层20mL，加入9/10倍量的异丙醇并搅拌。室温下静置10分钟后，以4℃离心(2600x g、30分钟)，使RNA沉淀。除去上清液后，向RNA粒料中加入75％乙醇10mL进行清洗。然后，以4℃离心(2600x g、5分钟)之后，除去上清液后，将Total RNA在室温下干燥后，溶解在200μL的RNase free water中。室温下离心(12000x g、3分钟)后，使用RNase-Free DNaseSet(QIAGEN)进行DNase处理。即，向Total RNA溶液上清液180μL中加入15μL Buffer RDD、5μL DNase I stock solution，室温下静置10分钟的方式实施。接着，使用RNeasy mini kit(QIAGEN)实施total RNA的净化。即，向DNase处理后样品200μL中添加700μL的Buffer RLT、500μL的乙醇后，添加至RNeasy mini kit附带的柱中进行离心(8000x g、15秒)。
接着，向柱中加入500μL的Buffer RPE，室温下离心(8000x g、15秒)，将本操作重复2次。接着，将30μL的RNase free water加入柱中，室温下离心(8000x g、1分钟)，回收所得到的溶液作为净化后total RNA。
＜杉树cDNA的制作＞
使用Superscript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR(Invitrogen)，由所得到的净化后total RNA合成cDNA。将Total RNA2μg溶解在8μL的精制水中，加入1μL的50μM oligo(dT)20、1μL的10mM dNTP，在65℃培养5分钟。将样品在冰上冷却后，加入2μL的10X RT buffer、4μL的25mM MgCl2、2μL的0.1M DTT、1μL的RNaseOUT(40U/μL)、1μL的SuperScript III Reverse Transcriptase并混合。在50℃培养50分钟后，在85℃处理5分钟，停止反应。接着，向样品中加入1μL的RNase H，在37℃培养20分钟，由此形成杉树cDNA。
＜克隆＞
对于所得到的部分序列WIVDEATGLR，使用GENETYX Ver.12.0.4软件，进行cDNA序列的推定，利用ForestGEN(http://forestgen.ffpri.affrc.go.jp/ja/index.html)数据库进行同一性检索。作为其结果，检索到了cluster ID:Cj5792。还发现了，作为检索到的Cj5796的同源基因的来自葡萄(Vitis vinifera)的未鉴定蛋白基因序列gi|157358255|emb|CAO65892.1|包含ForestGEN cluster ID:Cj822。并且，Cj5792和Cj822与杉树cDNA库BY882225.1、BY900252.1分别具有高的同一性。基于这些信息，设计用于克隆的引物组(primer set)，供于下述研究。即，为了得到序列号1所示的多核苷酸，将杉树的cDNA作为模板，使用Primer 1(GATTTCATGRCAGCGACAG：序列号3)及其下游的Primer 2(CATGRCAGCGACAGSGAT：序列号4)作为正义引物，使用Primer 3(TCAAAGTTGATGCAACAATTG：序列号5)作为反义引物，利用KOD Fx Neo(TOYOBO)进行巢式PCR(nested PCR)。利用WizardSV Gel and PCR Clean-Up System(Promega)对PCR产物进行精制。使用TOPO TA CloningKit for Sequencing(Thermo Fischer)试剂盒，将精制后的PCR产物插入pCR 2.1-TOPO TAVector，制作包含序列号1所示的多核苷酸的载体。
＜重组蛋白的精制＞
对于序列号2所示的氨基酸一次序列(推测为信号序列部分的第1－26位的氨基酸除外)的C末端添加有Flag标签的重组蛋白，利用Sysmex株式会社的ProCube(注册商标)服务，按照日本特开2014-195411公报的方法实施。即，利用上述制作的载体，将序列号1所示的多核苷酸(编码推测为信号序列部分的1－26的氨基酸的第1－78位的多核苷酸除外)重组于具有蚕表达用信号序列且将Flag标签融合表达于C末端的转移质粒，制作杆状病毒后，接种于蚕蛹后，利用磨碎缓冲液(20mM Trs-HCl，100mM NaCl，Complete EDTA free 1片/50mL，苯硫脲)磨碎第7日得到的蛹。将磨碎物超离心后，回收上清液，使用DDDDK-taggedProtein PURIFICATION GEL(MBL)，按照附加文件进行亲和精制，由此制备精制重组蛋白。将利用SDS-PAGE对精制后的重组蛋白进行分析而得到的结果示于图1。
实施例3精制重组蛋白的过敏原活性确认
(i)杉树花粉症患者淋巴球增殖应答
从由杉树花粉症患者(ImmunoCAP score≥2)得到的末梢血30mL中分离末梢血单核细胞，以成为1.11×106cells/mL的方式悬浮于含有10％非活化自身血浆的RPMI-1640培养基中。将所制备的细胞悬浮液180μL和20μL的本发明的重组蛋白溶液(浓度100μg/mL)接种于96孔板(2×105cells/孔)。在37℃、5％CO2条件下培养3日后，添加3H-胸苷，测定16小时后的摄入量作为放射活性，由此评价细胞增殖。算出添加精制重组蛋白时的3H-胸苷摄入量除以非添加时的摄入量而得到的值作为刺激指数(Stimulation index)，将该结果示于图2。一般而言，在临床检查的淋巴球刺激试验中，将Stimulation index 1.8以上作为阳性基准(内田重行等、肝脏30卷4号439-443,1989)。根据该基准，4例中3例(75％)被判定为阳性。以上的结果显示了，在杉树花粉症患者中，在T细胞水平上高频率地对本发明的重组蛋白致敏。
(ii)杉树花粉症患者嗜碱性粒细胞的活化
已知在被过敏原刺激而活化后的嗜碱性粒细胞中，CD203c的表达增强(De Weck,AL.et al.,Int.Arch.Allergy Immunol.,146:177-189,2008)。基于该原理，使用过敏原(Allergenicity)试剂盒(Beckman Coulter)，对杉树花粉症患者(ImmunoCAP score≥2)或健康者(ImmunoCAP score<2)血液中的嗜碱性粒细胞活化进行分析。即，以最终浓度成为3μg/mL的方式，向肝素采血而得到的全血100μL中加入本发明的重组蛋白溶液20μL，向阴性对照样品中加入PBS(-)20μL。接着，向全部样品中加入含有CD3-PC7、CRTH2-FITC和CD203c-PE的抗体混合物20μL，在37℃培养15分钟。加入反应停止液100μL和溶血固定液2mL，室温下反应10分钟。离心(200x g、5分钟)后，除去上清液，加入磷酸缓冲液(PBS)3mL，再次离心。除去上清液后，将细胞悬浮于添加了0.1％甲醛的PBS中，利用流式细胞仪(FACScanto、BDBiosciences)进行测定。对于所得到的数据，将CD3-PC7为阴性且CRTH2-FITC为阳性作为指标，选择血细胞中的嗜碱性粒细胞，对CD203c的表达强度进行分析。数据表示本发明蛋白质溶液刺激样品中的CD203c阳性嗜碱性粒细胞比例(％)至各阴性对照样品中的CD203c阳性嗜碱性粒细胞比例(％)，将健康者的最高值0.8％的2倍的1.6以上的值判定为阳性。其结果如图3所示，在2例健康者中，添加重组蛋白时，2例均未确认到CD203c的表达增强，另一方面，在杉树花粉症患者中，13例中7例(54％)确认了CD203c的表达增强，其差异显著(p<0.05,Welch's t test)。因此，显示了杉树花粉症患者高频率地具有与本发明的重组蛋白结合的IgE，还显示了本发明的重组蛋白具有过敏原活性。
序列表
<110> 大鹏药品工业株式会社
<120> 新型杉树花粉蛋白
<130> TH0107
<150> JP 2016-122318
<151> 2016-06-21
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1659
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组杉树花粉蛋白
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1659)
<400> 1
atg aca gcg aca gcg atg aca acg gcg gcg cta cga tta ctc ata gcg 48
Met Thr Ala Thr Ala Met Thr Thr Ala Ala Leu Arg Leu Leu Ile Ala
1 5 10 15
ttg ctt ctt gtg gcg gcg ccg gca gag tgc ctg ccg cta cgg gca cgt 96
Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Ala Glu Cys Leu Pro Leu Arg Ala Arg
20 25 30
ggc aga tgg atc gtg gac gag gca acg ggg ctg aga gta aag cta gca 144
Gly Arg Trp Ile Val Asp Glu Ala Thr Gly Leu Arg Val Lys Leu Ala
35 40 45
tgc gtc aat tgg ccg ggc cac ctg gag ccc ggg tta ccg gaa ggt ctc 192
Cys Val Asn Trp Pro Gly His Leu Glu Pro Gly Leu Pro Glu Gly Leu
50 55 60
aac cgg ttg ccg gtt acc aca ata gcg cac acc atc agc tct ctg ggc 240
Asn Arg Leu Pro Val Thr Thr Ile Ala His Thr Ile Ser Ser Leu Gly
65 70 75 80
ttc aat tgt gtc cgc ctc acc tac tcc att cag atg gtc acg gag aag 288
Phe Asn Cys Val Arg Leu Thr Tyr Ser Ile Gln Met Val Thr Glu Lys
85 90 95
agc tac aca gag gcc acg gtt ggg cag act ttt gcg cag cta aat ctg 336
Ser Tyr Thr Glu Ala Thr Val Gly Gln Thr Phe Ala Gln Leu Asn Leu
100 105 110
aca gaa ccc gcc tcg gga atc gag ggc aac aat ccg ggg ttc ctc caa 384
Thr Glu Pro Ala Ser Gly Ile Glu Gly Asn Asn Pro Gly Phe Leu Gln
115 120 125
ttg ggc cac gtg gct gca tac gat agc atc gtg gcg gca ctt gcg gag 432
Leu Gly His Val Ala Ala Tyr Asp Ser Ile Val Ala Ala Leu Ala Glu
130 135 140
gcg ggt gtc atg gtc atc ctg gac aac cat gtc agt aag ccc aag tgg 480
Ala Gly Val Met Val Ile Leu Asp Asn His Val Ser Lys Pro Lys Trp
145 150 155 160
tgc tgt gct gtg gat gat ggc aat ggg ttt ttc ggt gac agt tac ttc 528
Cys Cys Ala Val Asp Asp Gly Asn Gly Phe Phe Gly Asp Ser Tyr Phe
165 170 175
gac cct aga ttg tgg caa cga ggg cta ggt cta atg gct aca cat ttc 576
Asp Pro Arg Leu Trp Gln Arg Gly Leu Gly Leu Met Ala Thr His Phe
180 185 190
aat aac acg ccc aac gtc gtc gcc atg tcg ctt cgc aac gag cta cgt 624
Asn Asn Thr Pro Asn Val Val Ala Met Ser Leu Arg Asn Glu Leu Arg
195 200 205
ggc aac cga tcg acc tcg gca cgg tgg tca aag tac atg cag cgg ggt 672
Gly Asn Arg Ser Thr Ser Ala Arg Trp Ser Lys Tyr Met Gln Arg Gly
210 215 220
gcg gct acc gtc cac gag gcc aac cca aat gtc ctc gtt gtc ctc tcg 720
Ala Ala Thr Val His Glu Ala Asn Pro Asn Val Leu Val Val Leu Ser
225 230 235 240
ggg cta cac ttc gac acc atc ctc agc ttc tta ccg gtc cta cca gtt 768
Gly Leu His Phe Asp Thr Ile Leu Ser Phe Leu Pro Val Leu Pro Val
245 250 255
act tta cct ttt aaa gag aaa att gtg tat gaa ggg cac tgg tac tcc 816
Thr Leu Pro Phe Lys Glu Lys Ile Val Tyr Glu Gly His Trp Tyr Ser
260 265 270
ttc ggt gtg ccc tgg cat gat ggc ttg cct aat gac att tgt ttg aat 864
Phe Gly Val Pro Trp His Asp Gly Leu Pro Asn Asp Ile Cys Leu Asn
275 280 285
gag acg tcg cgg ttt aag gat aat att ggg ttt ttg acc tcg tcg att 912
Glu Thr Ser Arg Phe Lys Asp Asn Ile Gly Phe Leu Thr Ser Ser Ile
290 295 300
aat ggt act gcg gca cca ctt ttt gtt agc gag ttc gga att gat cag 960
Asn Gly Thr Ala Ala Pro Leu Phe Val Ser Glu Phe Gly Ile Asp Gln
305 310 315 320
aga tac gtg aat gat aat gat aac agg tat ttg aac tgt atc ttg gct 1008
Arg Tyr Val Asn Asp Asn Asp Asn Arg Tyr Leu Asn Cys Ile Leu Ala
325 330 335
ttt ctg gcg gag gaa gac gtg gac tgg gcg ctg tgg act atg ggg ggg 1056
Phe Leu Ala Glu Glu Asp Val Asp Trp Ala Leu Trp Thr Met Gly Gly
340 345 350
agc tat aat tac cgg tcg gac aag gag ccc gtt cag gac ttt gag gag 1104
Ser Tyr Asn Tyr Arg Ser Asp Lys Glu Pro Val Gln Asp Phe Glu Glu
355 360 365
acc tac ggc ttt ttc aat cgt gac tgg agt cgc atc agg aat cct gac 1152
Thr Tyr Gly Phe Phe Asn Arg Asp Trp Ser Arg Ile Arg Asn Pro Asp
370 375 380
ttt att tct cgc ctt aag gaa att caa cag ccc att caa gac cct tac 1200
Phe Ile Ser Arg Leu Lys Glu Ile Gln Gln Pro Ile Gln Asp Pro Tyr
385 390 395 400
tta tct cca ggg cca tat tat caa ata atc tac cac cct gca tca ggc 1248
Leu Ser Pro Gly Pro Tyr Tyr Gln Ile Ile Tyr His Pro Ala Ser Gly
405 410 415
ctc tgt gtt gaa tcc agc att gga aac acc att cat cta gga tca tgc 1296
Leu Cys Val Glu Ser Ser Ile Gly Asn Thr Ile His Leu Gly Ser Cys
420 425 430
cag agt gtg aga agc aga tgg aac tat gat gcc agt gtg gaa ggc cca 1344
Gln Ser Val Arg Ser Arg Trp Asn Tyr Asp Ala Ser Val Glu Gly Pro
435 440 445
att gga cta atg gga agt tca tcc tgc att tcc act caa gga aat ggg 1392
Ile Gly Leu Met Gly Ser Ser Ser Cys Ile Ser Thr Gln Gly Asn Gly
450 455 460
ttg cct gca att atg aca gaa aaa tgt tct gcc ccc aac aac act ctg 1440
Leu Pro Ala Ile Met Thr Glu Lys Cys Ser Ala Pro Asn Asn Thr Leu
465 470 475 480
tgg agc aca gtc tcc tct gga cag ctg cag ttg ggc act aga gtt ttt 1488
Trp Ser Thr Val Ser Ser Gly Gln Leu Gln Leu Gly Thr Arg Val Phe
485 490 495
gat gag gat ggg aaa gag aag tgg atg tgt tta gat ggg agt aga agt 1536
Asp Glu Asp Gly Lys Glu Lys Trp Met Cys Leu Asp Gly Ser Arg Ser
500 505 510
cca ttg att aca aca act gaa tgc atc tgc atc act gac tct cac tgc 1584
Pro Leu Ile Thr Thr Thr Glu Cys Ile Cys Ile Thr Asp Ser His Cys
515 520 525
tat cca aat cag aat cca gaa aag cag tgg ttt aaa gtc ata aca acc 1632
Tyr Pro Asn Gln Asn Pro Glu Lys Gln Trp Phe Lys Val Ile Thr Thr
530 535 540
aac aaa caa ttg ttg cat caa ctt tga 1659
Asn Lys Gln Leu Leu His Gln Leu
545 550
<210> 2
<211> 552
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 2
Met Thr Ala Thr Ala Met Thr Thr Ala Ala Leu Arg Leu Leu Ile Ala
1 5 10 15
Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Ala Glu Cys Leu Pro Leu Arg Ala Arg
20 25 30
Gly Arg Trp Ile Val Asp Glu Ala Thr Gly Leu Arg Val Lys Leu Ala
35 40 45
Cys Val Asn Trp Pro Gly His Leu Glu Pro Gly Leu Pro Glu Gly Leu
50 55 60
Asn Arg Leu Pro Val Thr Thr Ile Ala His Thr Ile Ser Ser Leu Gly
65 70 75 80
Phe Asn Cys Val Arg Leu Thr Tyr Ser Ile Gln Met Val Thr Glu Lys
85 90 95
Ser Tyr Thr Glu Ala Thr Val Gly Gln Thr Phe Ala Gln Leu Asn Leu
100 105 110
Thr Glu Pro Ala Ser Gly Ile Glu Gly Asn Asn Pro Gly Phe Leu Gln
115 120 125
Leu Gly His Val Ala Ala Tyr Asp Ser Ile Val Ala Ala Leu Ala Glu
130 135 140
Ala Gly Val Met Val Ile Leu Asp Asn His Val Ser Lys Pro Lys Trp
145 150 155 160
Cys Cys Ala Val Asp Asp Gly Asn Gly Phe Phe Gly Asp Ser Tyr Phe
165 170 175
Asp Pro Arg Leu Trp Gln Arg Gly Leu Gly Leu Met Ala Thr His Phe
180 185 190
Asn Asn Thr Pro Asn Val Val Ala Met Ser Leu Arg Asn Glu Leu Arg
195 200 205
Gly Asn Arg Ser Thr Ser Ala Arg Trp Ser Lys Tyr Met Gln Arg Gly
210 215 220
Ala Ala Thr Val His Glu Ala Asn Pro Asn Val Leu Val Val Leu Ser
225 230 235 240
Gly Leu His Phe Asp Thr Ile Leu Ser Phe Leu Pro Val Leu Pro Val
245 250 255
Thr Leu Pro Phe Lys Glu Lys Ile Val Tyr Glu Gly His Trp Tyr Ser
260 265 270
Phe Gly Val Pro Trp His Asp Gly Leu Pro Asn Asp Ile Cys Leu Asn
275 280 285
Glu Thr Ser Arg Phe Lys Asp Asn Ile Gly Phe Leu Thr Ser Ser Ile
290 295 300
Asn Gly Thr Ala Ala Pro Leu Phe Val Ser Glu Phe Gly Ile Asp Gln
305 310 315 320
Arg Tyr Val Asn Asp Asn Asp Asn Arg Tyr Leu Asn Cys Ile Leu Ala
325 330 335
Phe Leu Ala Glu Glu Asp Val Asp Trp Ala Leu Trp Thr Met Gly Gly
340 345 350
Ser Tyr Asn Tyr Arg Ser Asp Lys Glu Pro Val Gln Asp Phe Glu Glu
355 360 365
Thr Tyr Gly Phe Phe Asn Arg Asp Trp Ser Arg Ile Arg Asn Pro Asp
370 375 380
Phe Ile Ser Arg Leu Lys Glu Ile Gln Gln Pro Ile Gln Asp Pro Tyr
385 390 395 400
Leu Ser Pro Gly Pro Tyr Tyr Gln Ile Ile Tyr His Pro Ala Ser Gly
405 410 415
Leu Cys Val Glu Ser Ser Ile Gly Asn Thr Ile His Leu Gly Ser Cys
420 425 430
Gln Ser Val Arg Ser Arg Trp Asn Tyr Asp Ala Ser Val Glu Gly Pro
435 440 445
Ile Gly Leu Met Gly Ser Ser Ser Cys Ile Ser Thr Gln Gly Asn Gly
450 455 460
Leu Pro Ala Ile Met Thr Glu Lys Cys Ser Ala Pro Asn Asn Thr Leu
465 470 475 480
Trp Ser Thr Val Ser Ser Gly Gln Leu Gln Leu Gly Thr Arg Val Phe
485 490 495
Asp Glu Asp Gly Lys Glu Lys Trp Met Cys Leu Asp Gly Ser Arg Ser
500 505 510
Pro Leu Ile Thr Thr Thr Glu Cys Ile Cys Ile Thr Asp Ser His Cys
515 520 525
Tyr Pro Asn Gln Asn Pro Glu Lys Gln Trp Phe Lys Val Ile Thr Thr
530 535 540
Asn Lys Gln Leu Leu His Gln Leu
545 550
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的寡核苷酸 DNA
<400> 3
gatttcatgr cagcgacag 19
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的寡核苷酸 DNA
<400> 4
catgrcagcg acagsgat 18
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的寡核苷酸 DNA
<400> 5
tcaaagttga tgcaacaatt g 21

Claims (9)

1.一种杉树花粉蛋白，其特征在于：
其为由序列号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质。
2.一种多核苷酸，其特征在于：
其编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质。
3.一种多核苷酸，其特征在于：
其为由序列号1所示的碱基序列构成的多核苷酸。
4.一种以权利要求1所述的杉树花粉蛋白作为有效成分的、以杉树花粉为原因的过敏性疾病的预防或治疗剂。
5.一种以权利要求1所述的杉树花粉蛋白作为有效成分的、以杉树花粉为原因的过敏性疾病的诊断药。
6.权利要求1所述的杉树花粉蛋白在制造以杉树花粉为原因的过敏性疾病的预防或治疗剂中的用途。
7.权利要求1所述的杉树花粉蛋白在制造以杉树花粉为原因的过敏性疾病的诊断药中的用途。
8.如权利要求1所述的杉树花粉蛋白，其特征在于：
其用于预防或治疗以杉树花粉为原因的过敏性疾病。
9.如权利要求1所述的杉树花粉蛋白，其特征在于：
其用于诊断以杉树花粉为原因的过敏性疾病。
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