CN104602698A - 用于预防或治疗变态反应的日本柳杉肽 - Google Patents

Abstract

可用于预防或治疗对日本柳杉和/或日本扁柏花粉的变态反应的多肽，为多达30个氨基酸长且包括(I)氨基酸序列：DLKIKLRRTIEAEGIP(SEQ ID NO:1；Cry26)；或(II)包含T细胞表位的变体序列，所述包含T细胞表位的变体序列为具有多达7个氨基酸修饰的所述氨基酸序列(I)，所述氨基酸修饰的每一个独立地为缺失、置换或插入。

Description

用于预防或治疗变态反应的日本柳杉肽

发明领域

本发明涉及可用于预防或治疗对日本柳杉(Japanese Cedar)和/或日本扁柏(Japanese Cypress)花粉的变态反应的多肽和其药物制剂。

发明背景

树的花粉变应原被认为是人类中变应性疾病的主要诱因。尤其是，对日本柳杉树(日本柳杉(Cryptomeria Japonica)；日文称为‘sugi’)花粉的变态反应(也被称作花粉症)在日本是最常见的变应性呼吸道疾病之一。在日本，日本扁柏树(日本扁柏(Chamaecyparis obtusa)，日文称为‘hinoki’)也会导致花粉症。日本柳杉花粉季从二月持续到三月，而日本扁柏花粉季从三月持续到四月；过了花粉季症状也可持续。大比例的日本人群罹患花粉症和变态反应的症状。花粉症和变态反应也在日本柳杉或日本扁柏树为本土物种或种植该树的其他国家，包括韩国和中国发生。

发明概述

本发明提供了适合用于预防或治疗对日本柳杉花粉和/或日本扁柏花粉的变态反应的多肽或其药学上可接受的盐，所述多肽为多达30个氨基酸长且包括：

(I)氨基酸序列：DLKIKLRRTIEAEGIP(SEQ ID NO:1；Cry26)；或

(II)包含T细胞表位的变体序列(T cell epitope-containing variantsequence)，所述包含T细胞表位的变体序列为具有多达7个氨基酸修饰的所述氨基酸序列(I)，所述氨基酸修饰的每一个独立地为缺失、置换或插入。

本发明还提供了包含药学上可接受的载体或稀释剂和本发明的多肽或其药学上可接受的盐的药物制剂。

本发明另外提供了本发明的多肽、盐或药物制剂用于在治疗或预防对日本柳杉花粉和/或日本扁柏花粉的变态反应的方法中使用。

本发明还提供了治疗个体对日本柳杉花粉和/或日本扁柏花粉的变态反应或在个体中预防对日本柳杉花粉和/或日本扁柏花粉的变态反应的方法，该方法包括对所述个体施用治疗上或预防上有效量的本发明的多肽、盐或药物制剂。

本发明还提供了本发明的多肽或盐用于制备用于预防或治疗对日本柳杉花粉和/或日本扁柏花粉的变态反应的药物的用途。

本发明另外提供了确定T细胞是否识别本发明的多肽或盐的体外(invitro)方法，该方法包括将所述T细胞与所述多肽或盐接触及检测所述T细胞是否被所述多肽或盐刺激。

本发明还提供了制备本发明的药物制剂的方法，包括将本文描述的多肽或盐与药学上可接受的载体或稀释剂组合。

序列描述

SEQ ID NO:1至9提供了如在详述和实施例1至3中列出的氨基酸序列。SEQ ID NO:1至6对应源自蛋白Cry IFR的氨基酸序列。

Cry IFR蛋白的Uniprot登录号在实施例1中提供。

发明详述

本发明涉及预防或治疗对日本柳杉花粉和/或日本扁柏花粉的变态反应，并提供了适合用于该用途的多肽和其药学上可接受的盐。所述多肽或盐可在药物制剂中提供。

氨基酸序列及变体氨基酸序列

本发明的多肽可包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成。

可选地，本发明的多肽可包括包含T细胞表位的变体序列、由其组成或基本上由其组成，所述包含T细胞表位的变体序列为具有多达7个氨基酸修饰的如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述氨基酸修饰的每一个独立地为缺失、置换或插入。

优选的是，变体序列中的修饰不改变存在于相应原始氨基酸序列中的T细胞表位的功能特性。T细胞表位的功能特性在以下进一步讨论。

在优选的变体序列中，保留相应原始氨基酸序列的足够的连续氨基酸以包含T细胞表位。通常，此变体序列保留原始氨基酸序列的至少8个、优选至少9个连续氨基酸。变体序列可保留原始氨基酸序列的从8至12个氨基酸或从9至12个氨基酸。

变体序列可具有少于7个氨基酸修饰。例如，所述变体序列可具有多达6个氨基酸修饰，诸如多达5个氨基酸修饰、优选多达4个所述氨基修饰、更优选多达3个氨基酸修饰、且最优选仅1或2个氨基酸修饰。所有所述修饰独立地为缺失、置换或插入。

在特别优选的实施方案中，变体序列具有1或2个氨基酸修饰，所述修饰或每个修饰独立地为缺失或置换。

缺失

在包含T细胞表位的变体序列具有为缺失的氨基酸修饰的情况下，缺失的氨基酸优选地从相应原始氨基酸序列的N-或C-末端移除。即，变体序列为通过从原始序列的N-和/或C-末端移除1个或更多个连续氨基酸形成的原始氨基酸序列的截短。此变体序列可任选地不具有其他缺失或不具有其他修饰。

缺失的氨基酸可较不优选地从相应原始氨基酸序列中的内部位置移除。从内部位置移除意指缺失的氨基酸自身不在原始氨基酸序列的N-或C-末端，且也不是作为包含原始氨基酸序列的N-或C-末端的连续氨基酸序列的部分被移除。即，要称得上是从内部位置缺失，所述缺失必须独立于从原始氨基酸序列的N-或C-末端的缺失而发生。

例如，假定原始序列ABCDEFGH，具有2个氨基酸的内部缺失的变体序列的实例可以是ADEFGH。因此，B和C从内部位置移除且原始末端残基A和H被保留。相反，从同一原始序列的N-末端缺失2个连续氨基酸会产生变体序列CDEFGH，其中A和B被移除且C现在在N-末端。在这种情况下，B的缺失不是从内部位置的移除，因为它是作为包含原始序列的N-末端的2个连续氨基酸之一被移除。

在变体序列中发生多于1个缺失的情况下，缺失的氨基酸可从N-末端和/或C-末端和/或内部位置的任意组合处移除。优选的变体序列具有不多于1个从内部位置的缺失。在特别优选的变体序列中，不存在从内部位置的缺失，且缺失的氨基酸从原始序列的N-末端和/或C-末端的任意组合移除。即，缺失的氨基酸可全部从原始序列的N-末端移除，或其可全部从原始序列的C-末端移除，或一些氨基酸可从原始序列的每一个末端移除。

因此，在一个实施方案中，变体序列为具有1、2、3、4、5、6或7个氨基酸从所述SEQ ID NO:1的序列的N-末端移除的SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，变体序列为具有1、2、3、4、5、6或7个氨基酸从所述SEQ ID NO:1的序列的C-末端移除的SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，变体序列为具有若干氨基酸从所述序列的N-末端和C-末端两端移除的SEQ ID NO:1的氨基酸序列，只要所述序列具有总计不多于7个修饰。此变体序列的优选实施方案为具有1、2或3个氨基酸从所述SEQ ID NO:1的序列的N-末端和/或C-末端移除且任选地无其他修饰的SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

具有至少1个缺失的变体氨基酸序列的具体实例包括：

-变体序列LKIKLRRTI(SEQ ID NO:5)，其为具有1个氨基酸从N-末端移除以及6个氨基酸从C-末端移除的DLKIKLRRTIEAEGIP(SEQ IDNO:1)的氨基酸序列；

-变体序列IKLRRTIEA(SEQ ID NO:6)，其为具有3个氨基酸从N-末端移除以及4个氨基酸从C-末端移除的DLKIKLRRTIEAEGIP(SEQ IDNO:1)的氨基酸序列。

置换

在包含T细胞表位的变体序列具有为置换的氨基酸修饰的情况下，置换可在原始氨基酸序列中的任何位置发生。优选的是所述置换不会引入脯氨酸或半胱氨酸。还优选的是所述置换为保守置换。

保守置换是指氨基酸可用具有相似特性的任何可替代的氨基酸置换。以下是实例的非详尽列举：

具有碱性侧链的氨基酸诸如赖氨酸、精氨酸或组氨酸，每一个可独立地置换为彼此。

具有酸性侧链的氨基酸诸如天冬氨酸(aspartate)和谷氨酸(glutamate)，每一个可独立地置换为彼此或其酰胺衍生物天冬酰胺和谷氨酰胺。谷氨酸或谷氨酰胺还可优选地用焦谷氨酸(pyroglutamate)替换。具有脂肪族侧链的氨基酸诸如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，每一个可独立地置换为彼此。在这类中，特别优选的置换限于具有较小脂肪族侧链的氨基酸，即甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸，优选地，其每一个可独立地置换为彼此。

其他优选的置换包括用正亮氨酸(Nle)置换甲硫氨酸。

此外，更概括地说，中性氨基酸可被另一种中性氨基酸置换，带电荷的氨基酸可被另一种带电荷的氨基酸置换，亲水性氨基酸可被另一种亲水性氨基酸置换，疏水性氨基酸可被另一种疏水性氨基酸置换，极性氨基酸可被另一种极性氨基酸置换，以及芳香族氨基酸可被另一种芳香族氨基酸置换。可被用来选择合适置换物(substituent)的20种主要氨基酸的一些性质如下：

Ala	脂肪族、疏水性、中性	Met	疏水性、中性
				Cys	极性、疏水性、中性	Asn	极性、亲水性、中性
Asp	极性、亲水性、带电荷(-)	Pro	疏水性、中性
				Glu	极性、亲水性、带电荷(-)	Gln	极性、亲水性、中性
Phe	芳香族、疏水性、中性	Arg	极性、亲水性、带电荷(+)
				Gly	脂肪族、中性	Ser	极性、亲水性、中性
His	芳香族、极性、亲水性、带电荷(+)	Thr	极性、亲水性、中性
				Ile	脂肪族、疏水性、中性	Val	脂肪族、疏水性、中性
Lys	极性、亲水性、带电荷(+)	Trp	芳香族、疏水性、中性
				Leu	脂肪族、疏水性、中性	Tyr	芳香族、极性、疏水性

在一些变体序列中，可存在置换和缺失。例如，在一个实施方案中，变体序列为具有若干氨基酸在所述SEQ ID NO:1的序列的N-末端和C-末端两端插入以及若干缺失的SEQ ID NO:1的氨基酸序列，只要所述序列具有总计不多于7个修饰。此变体序列的优选实施方案为具有1或2个氨基酸从所述SEQ ID NO:1的序列的N-末端和/或C-末端缺失以及在SEQ IDNO:1的序列内进行1或2个置换的SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

插入

在变体序列具有为插入的氨基酸修饰的情况下，添加的氨基酸可在原始氨基酸序列的任何位置插入。优选插入不引入脯氨酸或半胱氨酸。

优选地，氨基酸可在原始序列的N-末端和/或C-末端插入。即，变体序列为通过将氨基酸添加到原始序列的N-末端和/或C-末端形成的原始氨基酸序列的延伸。此变体序列可任选地不具有其他插入或其他修饰。

较不优选地，氨基酸可在内部位置插入。在内部位置插入意指氨基酸在原始序列N-末端的氨基酸的C-末端的任何位置插入，或氨基酸在原始序列C-末端的氨基酸的N-末端的任何位置插入。

在变体序列中发生多于1个插入的情况下，添加的氨基酸可在N-末端和/或C-末端和/或内部位置的任意组合处插入。优选的变体序列在内部位置具有不多于1个插入。特别优选的变体序列在内部位置没有插入，且添加的氨基酸在原始序列的N-末端和/或C-末端的任意组合处插入。即，添加的氨基酸可全部在原始序列的N-末端插入，或其可全部在原始序列的C-末端插入，或一些氨基酸可在原始序列的每个末端插入。即，添加的氨基酸可被认为在N-末端和/或C-末端延伸原始序列。

因此，在一个实施方案中，变体序列为具有1、2、3、4、5、6或7个氨基酸在所述SEQ ID NO:1的序列的N-末端插入的SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，变体序列为具有1、2、3、4、5、6或7个氨基酸在所述SEQ ID NO:1的序列的C-末端插入的SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，变体序列为具有若干氨基酸在所述SEQ IDNO:1的序列的N-末端和C-末端两端插入的SEQ ID NO:1的氨基酸序列，只要所述序列具有总计不多于7个修饰。此变体序列的优选实施方案为具有1、2或3个氨基酸在所述SEQ ID NO：1的序列的N-末端和/或C-末端插入且任选地无其他修饰的SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

具有带电荷的氨基酸在N-末端和/或C-末端插入的变体序列是特别优选的，其中所述带电荷的氨基酸将对应于本发明的多肽的N-末端和/或C-末端，所述本发明的多肽包含变体序列、由其组成或基本由其组成。在多肽的N-末端和/或C-末端的带电荷的残基可改善多肽的溶解性。优选的带电荷的氨基酸包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸。赖氨酸是特别优选的。因此，特别优选的变体序列为具有1个或更多个带电荷的氨基酸、优选1个或更多个赖氨酸残基在所述SEQ ID NO:1的序列的N-末端和/或C-末端插入的SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

在一些变体序列中可存在置换和插入。例如，在一个实施方案中，变体序列为具有若干氨基酸在所述SEQ ID NO:1的序列的N-末端和C-末端两端插入以及若干置换的SEQ ID NO:1的氨基酸序列，只要所述序列具有总计不多于7个修饰。此变体序列的优选实施方案为具有1个或2个氨基酸在所述SEQ ID NO:1的序列的N-末端和/或C-末端插入以及在SEQ IDNO:1的序列内进行1个或2个置换的SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

多肽

本发明的多肽为多达30个氨基酸长，并包含如以上限定的氨基酸序列或变体序列、由其组成或基本上由其组成。

所述多肽的长度优选地可以为多达25个氨基酸、更优选地长度为多达20个氨基酸或长度为多达17个氨基酸、且最优选地长度为多达15个氨基酸。换言之，多肽可具有30、25、20、17或15个氨基酸的最大长度。

本发明的多肽的长度优选地为至少8个氨基酸、更优选地长度为至少9个氨基酸、最优选地长度为至少12个氨基酸。换言之，多肽可具有8、9或12个氨基酸的最小长度。

本发明的多肽可以为由所述最小和所述最大长度的任意组合所限定的长度。例如，多肽的长度可以为8至30、8至25、8至20、8至17或8至15个氨基酸。多肽的长度可以为9至30、9至25、9至20、9至17或9至15个氨基酸。多肽的长度可以为12至30、12至25、12至20、12至17或12至15个氨基酸。优选的多肽的长度为9至30个氨基酸、更优选地长度为9至20个氨基酸。特别优选的多肽的长度为12至17个氨基酸。

本发明的多肽可包含如以上限定的氨基酸序列或变体序列。因此，所述多肽可包含未被所述氨基酸序列或变体序列限定的另外的氨基酸。另外的氨基酸可描述为在所述氨基酸序列或变体序列的侧翼。即，另外的氨基酸被包含在所述氨基酸序列或变体序列的N-末端和/或C-末端。

换言之，本发明的多肽可具有由具有N-末端和/或C-末端的若干氨基酸延伸的所述氨基酸序列或变体序列组成的序列。在N-末端和/或C-末端延伸中的氨基酸的最大数目由如以上限定的多肽的最大长度确定。

在所述氨基酸序列或变体序列的N-末端延伸中的氨基酸优选地对应于其所源自的蛋白的天然序列中紧邻所述氨基酸序列的N-末端的氨基酸。

在所述氨基酸序列或变体序列的C-末端延伸中的氨基酸优选地对应于其所源自的蛋白的天然序列中紧邻所述氨基酸序列的C-末端的氨基酸。

N-末端和/或C-末端延伸可以是分别对应于其所源自的蛋白的序列中紧邻所述氨基酸序列的N-末端或C-末端的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。

即，N-末端和/或C-末端延伸为分别对应于其所源自的蛋白的天然序列中紧邻所述氨基酸序列的N-末端或C-末端的1至10个连续氨基酸的从1至10个氨基酸。

优选地，N-末端和/或C-末端延伸为分别对应于紧邻所述氨基酸序列的N-末端或C-末端的1至6个连续氨基酸的从1至6个氨基酸。

更优选地，N-末端和/或C-末端延伸为分别对应于紧邻所述氨基酸序列的N-末端或C-末端的1至4个连续氨基酸的从1至4个氨基酸。

最优选地，N-末端和/或C-末端延伸为分别对应于紧邻所述氨基酸序列的N-末端或C-末端的1至2个连续氨基酸的从1至2个氨基酸。

包含氨基酸序列或变体序列的N-末端和/或C-末端延伸的本发明的多肽的具体实例包括以下：

-DLKIKLRRTIEAEGIP(SEQ ID NO:1)可具有对应于在Cry IFR的天然序列中紧邻DLKIKLRRTIEAEGIP的N-末端的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸，即氨基酸H、A、V、E、P、M、K、S、M和F的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的N-末端延伸。例如，在所有10个所述连续氨基酸存在的情况下，本发明的多肽具有HAVEPMKSMFDLKIKLRRTIEAEGIP(SEQ ID NO:2；N-末端延伸加下划线)的氨基酸序列。

-DLKIKLRRTIEAEGIP(SEQ ID NO:1)可具有对应于在Cry IFR的天然序列中紧邻DLKIKLRRTIEAEGIP的C-末端的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸，即氨基酸H、T、Y、V、V、P、H、C、F和A的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的C-末端延伸。例如，在所有10个所述连续氨基酸存在的情况下，本发明的多肽具有DLKIKLRRTIEAEGIPHTYVVPHCFA(SEQ ID NO:3；C-末端延伸加下划线)的氨基酸序列。

-DLKIKLRRTIEAEGIP(SEQ ID NO:1)可具有对应于在Cry IFR的天然序列中紧邻DLKIKLRRTIEAEGIP的N-末端的1、2、3、4、5、6、7或8个连续氨基酸，即氨基酸V、E、P、M、K、S、M和F的1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸的N-末端延伸。其还可具有对应于Cry IFR的天然序列中紧邻DLKIKLRRTIEAEGIP的C-末端的1个连续氨基酸，即氨基酸H的1个氨基酸的C-末端延伸。例如，在所有8个连续氨基酸存在于N-末端延伸中且1个连续氨基酸存在于C-末端延伸中的情况下，本发明的多肽具有VEPMKSMFDLKIKLRRTIEAEGIPH(SEQ ID NO:4；N-末端和C-末端延伸加下划线)的氨基酸序列。

在N-末端和/或C-末端延伸中的氨基酸可以不精确地对应于氨基酸序列或变体序列所源自的蛋白的天然序列中的氨基酸。N-末端和/或C-末端延伸可包含源自所述天然序列的序列，所述序列已被修饰，以例如改善多肽的稳定性、溶解性或可制造性。例如，天然序列中的甲硫氨酸可用正亮氨酸置换，和/或可在N-末端延伸的N-末端和/或C-末端延伸的C-末端添加1个或更多个带电荷的残基。优选地，添加带正电荷的残基诸如精氨酸和赖氨酸。可添加选自组氨酸、谷氨酸和天冬氨酸的氨基酸。

可选地，N-末端和/或C-末端延伸的氨基酸可不对应于氨基酸序列或变体序列所源自的蛋白的天然序列中的氨基酸。相反，其可以为任何合适的氨基酸，优选地被选择以改善多肽的稳定性、溶解性或可制造性的任何合适的氨基酸。例如，可在SEQ ID NO:1的N和/或C末端添加1个或更多个带电荷的残基。优选地，添加带正电荷的残基诸如精氨酸和赖氨酸。可添加选自组氨酸、谷氨酸和天冬氨酸的氨基酸。

在一些实施方案中，合适的多肽可具有还包含1个或更多个缺失的由所述SEQ ID NO:1的氨基酸序列的N-末端或C-末端延伸组成的序列。特别地，多肽可包含天然序列内所述氨基酸序列在一个末端诸如N-末端的延伸，以及在另一个末端诸如C-末端的氨基酸缺失。

多肽可具有由具有分别对应于其所源自的蛋白的序列中紧邻所述氨基酸序列的N-末端的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个连续氨基酸的1、2、3、4、5、6或7、8、9、10个或更多个氨基酸的所述氨基酸序列的N-末端延伸，和1、2、3、4、5、6或7个氨基酸从所述氨基酸序列的C-末端的缺失组成的序列。

多肽可具有由具有分别对应于其所源自的蛋白的序列中紧邻所述氨基酸序列的C-末端的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个连续氨基酸的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸的所述氨基酸序列的C-末端延伸，和1、2、3、4、5、6或7个氨基酸从所述氨基酸序列的N-末端的缺失组成的序列。

T细胞表位

本发明的多肽为多达30个氨基酸长并包含如以上限定的氨基酸序列或变体序列、由其组成或基本上由其组成。氨基酸序列和各所述变体序列包含T细胞表位。T细胞表位优选地为MHC II类结合T细胞表位(MHCClass II-binding T cell epitope)。优选变体序列中的修饰不改变存在于相应原始氨基酸序列中的T细胞表位的功能特性。

在优选的变体序列中，保留相应原始氨基酸序列的足够的连续氨基酸以包含T细胞表位。通常，此变体序列保留原始氨基酸序列的至少8个、优选地至少9个连续氨基酸。

T细胞表位的存在优选地可通过经计算机模拟(in silico)例如使用如实施例1中所述的生物信息学软件进行的分析来确认。可选地，T细胞表位的存在可通过其功能特性的直接评价来确认。T细胞表位的特定功能特性包括包含表位的多肽与MHC分子、优选地MHC II类分子结合的能力，和/或包含表位的多肽激活T细胞的能力、优选地当与MHC II类分子结合时激活T细胞的能力。

多肽与MHC分子结合的能力可使用任何合适的方法诸如竞争性测定评价。优选的体外测定在实施例3中描述。

多肽激活T细胞的能力也可使用任何合适的方法评价。优选的方法包括与T细胞激活有关的1个或更多个参数，诸如增殖或细胞因子释放的测量。对于这些参数的优选的测定在实施例4中描述。相关细胞因子包括IFN-γ、IL-13和IL-10。在本发明的背景下，如果多肽引起IFN-γ、IL-13和IL-10的1种、2种或全部的释放，诸如IFN-γ和IL-13两者的释放，其通常被认为激活了T细胞。多肽优选地引起大于50pg/ml的给定细胞因子的释放。更优选地，多肽引起大于100pg/ml的给定细胞因子的释放。

如以上提及的，优选变体序列中的修饰不改变存在于相应原始氨基酸序列中的T细胞表位的功能特性。因此，包含变体氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的多肽应当与包含相应原始氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的多肽具有基本上相同的MHC II类结合特性和基本上相同的T细胞激活特性。

通常，如果一种多肽与另一种多肽都能与属于相同MHC II类等位基因超类型家族(MHC Class II allele supertype family)的1种或更多种MHC II类分子特异性结合，则两种多肽具有基本上相同的MHC II类结合特性。MHC II类等位基因超类型家族的实例包括HLA-DR1、HLA-DR3、HLA-DR4、HLA-DR7、HLA-DR8、HLA-DR11、HLA-DR13、HLA-DR15和HLA-DR51。最优选地，两种多肽都将与相同的MHC II类分子，即由相同等位基因编码的MHC II类分子特异性结合。

通常，如果一种多肽与另一种多肽都特异性激活表达相同T细胞受体的T细胞，则两种多肽具有基本上相同的T细胞激活特性。优选地，在由每一种多肽引起的激活水平方面应当没有显著差异。激活水平可如以上描述的通过监测增殖和/或细胞因子释放评价。

包含变体序列、由其组成或基本上由其组成的合适的多肽可凭经验得到或根据已知标准选择。在单一多肽中，存在有助于在MHC抗原结合沟(binding groove)内结合的特定残基和与T细胞受体的高变区相互作用的其他残基(Allen等人(1987)Nature 327:713-5)。有利地，肽可被设计为有助于T-细胞增殖和脱敏的诱导。Metzler和Wraith已证明了其中进行增强多肽-MHC亲和力的置换的多肽的改善的耐受原能力(tolerogenic capacity)(Metzler&Wraith(1993)Int Immunol:1159-65)。改造的多肽配体可在克隆的T细胞中导致长期而深远的无变应性被Sloan-Lancaster等人(1993)Nature 363:156-9证明。

序列同一性

根据本发明的合适的包含T细胞表位的变体序列可选地可按照其与相应的原始氨基酸序列的序列同一性描述。例如，变体序列与SEQ ID NO:1的氨基酸序列可具有至少65％的同一性。更优选地，变体序列与SEQ IDNO:1的氨基酸序列可具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸同一性。

序列同一性通常跨越原始氨基酸序列中的若干连续氨基酸评价。例如，序列同一性可根据比较的肽的大小，跨越原始氨基酸序列中至少9、10、11、12、13、14或15个连续氨基酸测定。优选序列同一性跨越原始氨基酸序列中至少9个连续氨基酸测定。特别优选地，序列同一性跨越相应原始氨基酸序列的整个长度测定。

对于氨基酸序列，“序列同一性”指在使用ClustalW(Thompson等人,1994,同上)以以下参数评价时具有设定值的序列：

两两比对参数-方法：精确的；矩阵：PAM；空位开放罚分(Gap openpenalty)：10.00；空位扩展罚分(Gap extension penalty)：0.10；多重比对参数-矩阵：PAM；空位开放罚分：10.00；％延迟同一性(％identity for delay)：30；末端空位罚分(Penalize end gaps)：开；空位间隔距离(Gap separationdistance)：0；负矩阵：否；空位扩展罚分：0.20；残基特异性空位罚分(Residue-specific gap penalties)：开；亲水性空位罚分(Hydrophilic gappenalties)：开；亲水性残基：G、P、S、N、D、Q、E、K和R。特定残基的序列同一性预期包括已简单衍化的相同残基。

盐

本发明包括本发明多肽的任何药学上可接受的盐。所述药学上可接受的盐包括例如无机酸盐诸如氯化物、盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；以及有机酸盐诸如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。盐酸盐或乙酸盐是优选的。

合成

本发明的多肽可通过任何合适的技术制备。固相肽合成(SPPS)为优选的技术。其包括肽在小的固体珠上的形成。

利用SPPS，肽在合成期间保持共价附着至珠。肽利用重复的偶联-洗涤-脱保护-洗涤循环来合成。特别地，固相附着的肽的游离N-末端胺与单个N-保护的氨基酸单位偶联。然后该单位脱保护，露出新的N-末端胺，另外的保护的氨基酸附着于所述新的N-末端胺。重复这些步骤直到肽是完全的。然后使用合适的试剂使肽从珠上裂解。

用于SPPS的合适的保护基团、试剂、溶剂和反应条件为本领域技术人员所熟知并如此，可由本领域技术人员通过常规优化程序确定条件。

多肽的药学上可接受的盐可通过任何合适的技术制备。通常，成盐作用包括多肽或其盐与合适的试剂通常酸的反应以获得选择的药学上可接受的盐。

例如，多肽的盐酸盐可通过最初使用三氟乙酸使多肽从固相裂解制备。因此，多肽最初将呈三氟乙酸盐。然后，可通过任何已知技术诸如使用盐酸作为洗脱液的在合适柱上的离子交换将三氟乙酸盐转化为盐酸盐。

在需要的情况下，多肽或多肽盐产物可通过任何合适的技术纯化。可使用例如高压液相色谱法(HPLC)。

术语“多肽”不仅包括其中氨基酸残基通过肽键(-CO-NH-)连接的分子，还包括其中肽键被反转的分子。此类逆反肽模拟物(retro-inversopeptidomimetics)可使用本领域已知方法例如诸如在Meziere等人(1997)J.Immunol.159,3230-3237中所描述的方法制备。该方法包括制备包含涉及骨架而不是侧链方向的变化的假多肽(pseudopolypeptide)。Meziere等人(1997)表明，至少对于MHC II类和T辅助细胞响应，这些假多肽是有用的。包含NH-CO键而不是CO-NH肽键的逆反多肽更加耐受蛋白水解。

类似地，肽键可完全省掉，只要使用保持氨基酸残基的碳原子之间的间距的合适的接头部分；如果接头部分与肽键具有基本相同的电荷分布和基本相同的平面性则是特别优选的。还将领会的是，肽可在N-末端或C-末端被方便地封闭以有助于降低对外切蛋白水解(exoproteolytic)消化的敏感性。例如，多肽的N-末端氨基基团可通过与羧酸反应被保护，且肽的C-末端羧基基团可通过与胺反应被保护。修饰的其他实例包括糖基化和磷酸化。另一个潜在的修饰是R或K的侧链胺上的氢可用亚甲基基团替换(-NH₂→-NH(Me)或-N(Me)₂)。

根据本发明的多肽的类似物还可包括增加或减小多肽的体内(in vivo)半衰期的肽变体。根据本发明使用的能够增加多肽半衰期的类似物的实例包括肽的类肽类似物、肽的D-氨基酸衍生物和肽-类肽杂合体(peptide-peptoid hybrid)。根据本发明使用的变体多肽的另一个实施方案包括多肽的D-氨基酸形式。使用D-氨基酸而不是L-氨基酸制备多肽，大大降低了此剂通过正常代谢过程的不想要的分解，降低需要被施用的剂的量以及其施用的频率。

由本发明提供的多肽可源自由通过编码亲本蛋白链的初级转录本的可变剪接产生的mRNA编码的亲本蛋白的剪接变体。多肽也可源自亲本变应原蛋白的氨基酸突变、糖基化变体和其他共价衍生物。示例性衍生物包括其中本发明的多肽通过置换、化学、酶促或其他适当的方式用不是天然存在的氨基酸的部分共价修饰的分子。还包括亲本蛋白的天然存在的变体氨基酸序列。此变体氨基酸序列可由等位基因变体编码或代表可变剪接变体。

如以上所述的修饰可在肽合成期间或通过制备后修饰制备，或当多肽呈重组形式时，利用核酸的定点诱变、随机诱变或酶促裂解和/或连接的已知技术制备。

本文描述的多肽也可被修饰来改良理化性质。因此，例如可改变原始氨基酸序列以改善其溶解性，并因此在同等条件下本发明的具有变体序列的多肽将优选地比具有相应原始氨基酸序列的多肽更可溶。用于评价多肽溶解性的方法是本领域中熟知的。

由于对受试者施用难溶性剂会引起不期望的、非引起耐受的(non-tolerising)炎性反应，改善的溶解性有利于引起受试者对本发明的多肽源自其的变应原的耐受(tolerisation)。多肽的溶解性可通过改变在包含T细胞表位的区域侧翼的残基改善。例如，在T细胞表位侧翼的多肽残基的N和C末端，可添加选自精氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸和天冬氨酸的至少1种氨基酸。在其他实例中：

i)未包含在T细胞表位中的多肽的天然序列的N或C末端的多达3个氨基酸中的任意疏水性残基(any hydrophobic residues in the up to threeamino acids at the N or C terminus)被缺失；和/或

ii)未包含在T细胞表位中的在多肽的天然序列的N或C末端的多达4个氨基酸中的包括序列Asp-Gly的任意两个连续氨基酸被缺失；和/或

iii)在多肽的天然序列的N和/或C末端添加1个或更多个带正电荷的残基。

任选地，包含半胱氨酸残基的任意多肽可被工程化，使得任何半胱氨酸残基被替换为丝氨酸或2-氨基丁酸，以防止二聚体形成。

多肽组合

本发明的多肽或其盐可与1种或更多种另外的多肽或其盐组合提供。

此多肽组合适合用于通过引起耐受预防或治疗对日本柳杉花粉和/或日本扁柏花粉的变态反应。此多肽组合通常包括至少1种另外的多肽，所述另外的多肽为多达30个氨基酸长且包含(I)来自日本柳杉花粉变应原或日本扁柏花粉变应原的包含T细胞表位的氨基酸序列；或(II)具有多达7个氨基酸修饰的所述氨基酸序列(I)的包含T细胞表位的变体序列，每个修饰独立地为缺失、置换或插入。

(I)的天然的包含T细胞表位的序列通常是长度为9至20、9至17、12至17或12至20个氨基酸的氨基酸序列，其在完整变应原的序列中作为连续序列存在并包含1个或更多个T细胞表位。

包含T细胞表位的变体序列可以是如以上通过参考SEQ ID NO:1描述的相应的天然的包含T细胞表位的氨基端序列的任何变体。包含T细胞表位的变体序列可以是通过日本柳杉花粉变应原或日本扁柏花粉变应原的截短衍生的保留形成变应原的T细胞表位的核心8或9个氨基酸的片段。

多肽组合可包含2、3、4、5、6、7或更多种如以上所述的另外的多肽。多肽组合优选地包含总计12种多肽或更少、更通常地10种多肽或更少、优选地7种或6种多肽或更少。

另外的多肽通常源自日本柳杉和日本扁柏花粉变应原Cry IFR、Cry j1、Cry j2、Cha 01或Cha 02或其变体。优选地，多肽组合将包含源自多于1种变应原的多肽。因此，除本发明的源自Cry IFR的多肽之外，组合可包含源自Cry j1和/或Cry 2的1种或更多种多肽。组合可包含源自Cha o1和/或Cha 02的1种或更多种多肽。

以上所述的任何多肽组合可掺入本发明的药物制剂中，如以下更详细描述的。

医疗用途及方法

本发明的多肽盐(polypeptide salt)或药物制剂被用于治疗或预防对日本柳杉花粉和/或日本扁柏花粉的变态反应。其可通过引起耐受预防或治疗变态反应。可引起针对柳杉(Cryptomeria)属和/或扁柏(Chamaecyparis)属的1种或更多种蛋白变应原的耐受。通常引起针对日本柳杉的花粉变应原CryIFR(异黄酮还原酶)的耐受。

因此，提供了治疗个体对日本柳杉花粉和/或日本扁柏花粉的变态反应或在个体中预防对日本柳杉花粉和/或日本扁柏花粉的变态反应的方法。该方法包括对所述个体施用治疗上或预防上有效量的本发明的多肽或盐或本发明的药物制剂。因此，该方法可减少或减轻罹患变态反应的个体中的变态反应症状。该方法可改善罹患变态反应的个体的状况。该方法可预防或延迟个体中变态反应的症状的出现。以下讨论对日本柳杉花粉和/或日本扁柏花粉的变态反应的症状。

多肽或盐的组合可用于治疗或预防对日本柳杉花粉和/或日本扁柏花粉的变态反应。组合中的多肽和/或盐不需要一起施用，和/或不需要不是同一药物制剂的部分。

因此，本发明提供了本发明的多肽或盐用于在如以上所述的预防或治疗对日本柳杉花粉和/或日本扁柏花粉的变态反应的方法中使用，其中所述方法还包括施用至少1种、优选2种或更多种如以上所述的源自日本柳杉花粉或日本扁柏花粉的另外的多肽。该方法的多种肽的每种可同时、顺序或并发(concurrently)施用。因此，它们可被分别施用。

本发明的多肽、盐或药物制剂可通过对日本柳杉花粉和/或日本扁柏花粉脱敏或引起对其的耐受来治疗或预防变态反应。本发明的多肽可用于引起个体对所述多肽所源自的变应原耐受或使个体对所述多肽所源自的变应原脱敏。使个体对变应原脱敏意指在适当致敏的个体中抑制或削弱由变应原引起的变应性组织反应。术语“引起耐受(tolerisation)”指压制或消除对抗原的反应、诸如对蛋白变应原的变应性反应(allergic response)的能力。引起耐受也是减少或消除不想要的免疫反应或使受试者对蛋白变应原脱敏的能力。引起耐受可通过T细胞反应的体外分析或通过个体中症状减少的观察来确定。

更详细地说，T细胞可被选择性激活，且然后使得是无反应性的。此外，这些T-细胞的无反应性(anergising)或消除致使患者对特定变应原脱敏。脱敏自身显示为在变应原或源自变应原的肽的第二次和再施用时，对变应原或源自变应原的肽的反应的减弱或优选地此反应的消除。可在经过合适的时间段之后进行该第二次施用以允许脱敏发生；这优选地是在1天和若干周之间的任何时间段。优选约4周的间隔。

对其施用多肽、盐或药物制剂的个体可以是无症状的。对此个体施用预防上有效量的多肽或药物制剂。预防上有效量是预防变态反应的1种或更多种症状发作的量。

可选地，对其施用多肽、盐或药物制剂的个体可以是有相应需要的。即，个体可表现出变态反应的1种或更多种症状。对此个体施用治疗上有效量的多肽或药物制剂。治疗上有效量为有效改善变态反应的1种或更多种症状的量。

对其施用多肽、盐或药物制剂的个体优选为人类。个体可以是已知对日本柳杉花粉和/或日本扁柏花粉变应原致敏的、处于致敏风险中或被怀疑是致敏的。个体可利用本领域熟知的技术且如本文所述的测试致敏。可选地，个体可具有对日本柳杉花粉和/或日本扁柏花粉的家族过敏史。

测试个体对日本柳杉花粉和/或日本扁柏花粉的致敏可以不是必需的，因为当暴露于日本柳杉花粉和/或日本扁柏花粉时个体可表现出变态反应的症状。暴露意指靠近例如树或花粉或源自树或花粉的物质或产品。靠近意指距离以上所述项10米或更小、5米或更小、2米或更小、1米或更小或0米。变态反应的症状可包括鼻痒、打喷嚏、流眼泪、喉咙痒、上颚痒、眼痒、流鼻涕、呼吸困难、支气管痉挛、哮喘、皮肤发红发痒或皮疹。

个体可以为任何年龄。但是，优选地，个体可在1至90、5至60、10至40或更优选地18至35的年龄组中。

个体可患有对日本柳杉花粉和/或日本扁柏花粉的变态反应至少2周、1个月、6个月、1年、5年或多于5年。个体可罹患由变态反应引起的皮疹、鼻塞、流鼻涕和/或咳嗽。个体可罹患由变态反应引起的鼻痒、打喷嚏、眼痒、流眼泪、喉咙痒、上颚痒、支气管痉挛和/或哮喘。

个体可以或可以没有施用治疗日本柳杉花粉和/或日本扁柏花粉变态反应的其他组合物/化合物。个体可居住在具有温带、亚热带或热带气候的地理区域。个体通常在特定季节罹患对日本柳杉花粉和/或日本扁柏花粉的变态反应但变态反应却可以是常年的。对日本柳杉花粉和/或日本扁柏花粉的季节性变态反应可通常发生在远东地区的晚冬或春天。

变应性个体对来自日本柳杉和/或日本扁柏树的树花粉具有变应性，并因此对来自柳杉属中的树、特别地日本柳杉和/或扁柏属中的树、特别地日本扁柏的花粉具有变应性。变应性个体可对日本柳杉和日本扁柏二者的树花粉具有变应性。

本发明的多肽、盐或药物制剂可在日本柳杉花粉和/或日本扁柏花粉变应性个体的组中筛选以确认其用于使用的适用性。日本柳杉花粉和/或日本扁柏花粉变应性个体的组可包括已知或非已知对日本柳杉花粉和/或日本扁柏花粉具有变应性的个体。特别地，在多种多肽在药物制剂中组合提供的情况下，它们可被筛选以确认其在至少20％的T细胞样品中引起T细胞增殖的能力，其中每个样品从群体中不同的日本柳杉花粉和/或日本扁柏花粉变应性个体获得。优选地，药物制剂将在至少30％的从日本柳杉花粉和/或日本扁柏花粉变应性个体的组获得的T细胞样品中引起T细胞增殖。更优选地，药物制剂将在35％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多或90％或更多的组中的样品中引起T细胞增殖。在日本柳杉花粉和/或日本扁柏花粉变应性个体的组中个体的数目可以为大于1的任何数目，例如至少2、3、5、10、15、20、30、50、80或至少100个个体。

还优选的是，本发明的多肽、盐和药物制剂引起T细胞增殖，但不导致组胺从来自致敏的个体的白细胞样品中释放。多肽、盐或药物制剂的组胺释放谱可因此被确认。合适的白细胞样品包括富集的嗜碱性粒细胞或肥大细胞制品。可存在一些组胺释放，但优选地释放的量不显著。

显著的组胺释放可认为是当来自个体的白细胞样品用药物制剂体外刺激时20％或更多的总的可得的白细胞组胺的释放。本发明的多肽、盐或药物制剂优选地当来自个体的白细胞样品用组合物体外刺激时引起少于5％、少于4％、少于3％、少于2％或少于1％的总的可得的白细胞组胺的释放。正常个体通常具有约150ng/10⁷细胞的白细胞组胺含量。

药物制剂

本发明的各多肽或盐可以以分离的、基本上分离的、纯化的或基本上纯化的形式提供给个体。例如，本发明的多肽或盐可基本上不含其他多肽或其盐地提供给个体。尽管多肽或盐也许可能以原始形式提供，但优选将它们作为药物制剂提供。

因此，根据本发明的另一方面，本发明还提供了包含药学上可接受的载体或稀释剂和本发明的多肽或其药学上可接受的盐的药物制剂。药物制剂可包含如以上描述的本发明的多肽或盐的任何组合。

存在于药物制剂中的载体或稀释剂在与制剂的其他组分兼容和对其接受者无害的意义上而言必须是“可接受的”。通常，用于注射的载体和最终制剂是无菌的和无热原的。优选地，载体或稀释剂为水。载体或稀释剂可包括硫代甘油、苯甲硫醚或甲硫氨酸。

包含1种或更多种本发明的多肽或盐的组合物可与1种或更多种药学上可接受的赋形剂或媒介物(vehicle)组合以制备药物制剂。辅助物质诸如润湿或乳化剂、pH缓冲物质等，可存在于赋形剂或媒介物中。这些赋形剂、媒介物和辅助物质通常为在接受组合物的个体内不会引起免疫反应且可被施用而没有异常毒性的制药用剂(pharmaceutical agent)。药学上可接受的赋形剂包括但不限于液体诸如水、盐水、聚乙二醇、透明质酸、甘油、硫代甘油和乙醇。药学上可接受的盐还可包括例如无机酸盐诸如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；和有机酸盐诸如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯酸盐等在其中。药学上可接受的赋形剂、媒介物和辅助物质的详尽讨论在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.,N.J.1991)中可得。

多肽或盐通常以按重量计0.1％至50％、更优选地以按重量计0.1％至5％存在于药物制剂中。多肽或盐可以以按重量计少于0.1％存在于药物制剂中。

药学上可接受的载体或稀释剂通常以按重量计50％至99.9％、更优选地以按重量计95％至99.9％存在于药物制剂中。药学上可接受的载体或稀释剂可以以按重量计多于99.9％存在于药物制剂中。

药物制剂包括但不限于药学上可接受的溶液、冻干物(lyophilisate)、混悬剂、在油性或水性媒介物中的乳剂、糊剂和可植入的缓释制剂或生物可降解的制剂。此类药物制剂还可包括1种或更多种另外的组分，包括但不限于助悬剂、稳定剂或分散剂。冻干物可包括海藻糖、硫代甘油和苯甲硫醚的1种或更多种。在用于肠胃外施用的药物制剂的一个实施方案中，活性组分以用于在重构的药物制剂的肠胃外施用之前用合适的媒介物(例如，无菌无热原的水)重构的干燥形式(例如，冻干物、散剂或颗粒剂)提供。

本发明还提供了制备本发明的药物制剂的方法，包括将如以上描述的多肽或盐与药学上可接受的载体或稀释剂组合。优选地，所述方法制备用于肠胃外施用的药物制剂，且包括提供呈干燥形式的所述多肽或盐及用所述药学上可接受的载体或稀释剂重构所述多肽或盐。

药物制剂可以以无菌可注射的水性或油性混悬剂或溶液的形式制备、包装或出售。该混悬剂或溶液可根据已知技术配制，且除了活性组分之外可包括另外的组分诸如本文描述的分散剂、润湿剂或助悬剂。此类无菌可注射制剂可使用无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂诸如例如水或1,3-丁二醇制备。其他可接受的稀释剂和溶剂包括但不限于林格氏溶液、等渗氯化钠溶液和固定油诸如合成的单或双甘油酯。

有用的其他肠胃外可施用的药物制剂包括包含呈微晶形式的、在脂质体制品中的或作为生物可降解聚合物系统的成分的活性组分的那些。用于缓释或植入的药物制剂可包含药学上可接受的聚合的或疏水的材料诸如乳剂、离子交换树脂、微溶的聚合物或微溶的盐。

可选地，本发明的多肽可以被胶囊化、吸附到颗粒载体或与颗粒载体缔合。合适的颗粒载体包括源自聚甲基丙烯酸甲酯聚合物的那些，及源自聚丙交酯和聚丙交酯乙交酯共聚物的PLG微粒。参见例如，Jeffery等人(1993)Pharm.Res.10:362-368。还可使用其他颗粒体系和聚合物，例如聚合物诸如聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸、精胺、亚精胺、及这些分子的缀合物。

本文提到的任何多肽的制剂将取决于诸如多肽性质和递送方法的因素。药物制剂可以以多种剂型施用。其可口服(例如，作为片剂、糖锭、锭剂、水或油混悬剂、可分散的散剂或颗粒剂)、局部、肠胃外、皮下、通过吸入、静脉内、肌内、淋巴管内(诸如施用至腹股沟中的淋巴结)、胸骨内、经皮、皮内、表皮、舌下、鼻内、含服或通过输注技术施用。施用可以是扁桃体内的。施用可以是作为栓剂的。施用可以通过离子电泳作用进行。优选地，施用是皮内的、表皮的或经皮的。施用可通过贴剂、诸如微齿贴剂(microtine patch)进行。

医师将能够决定每个特定个体所需的施用途径和方法。

本发明的药物制剂优选地密封在容器中提供。药物制剂通常以单位剂型例如单次剂型提供。其可选地可以以多剂型提供。在药物制剂为药学上可接受的溶液的情况下，溶液可在安瓿、密封的小瓶、注射器、弹药型制剂(cartridge)、柔性袋或玻璃瓶中提供。在药物制剂为冻干物的情况下，优选地在封闭的小瓶中提供。

本发明的药物制剂将包含有效的而不会引起不良反应的合适浓度的每种多肽。在药物制剂为例如冻干物的情况下，相关浓度将为重构后各多肽的浓度。通常，当在溶液中时药物制剂中各多肽的浓度将在0.03至200nmol/ml的范围内。各多肽的浓度更优选地可在0.3至200nmol/ml、3至180nmol/ml、5至160nmol/ml、10至150nmol/ml、50至200nmol/ml或30至120nmol/ml的范围内，例如约100nmol.ml。药物制剂应当具有大于95％或98％的纯度或至少99％的纯度。

佐剂或其他治疗剂可与本发明的1种或更多种多肽组合使用。佐剂优选地以足以增强本发明多肽的效果的量施用，反之亦然。佐剂或其他治疗剂可以是增强本发明多肽的效果的剂。例如，其他治疗剂可以是增强对本发明多肽的反应的免疫调节分子。佐剂的非限制性实例包括维生素D、雷帕霉素和糖皮质激素类固醇诸如地塞米松、氟替卡松、布地奈德、莫米松、倍氯米松、氢化可的松、醋酸可的松、强的松、强的松龙、甲基强的松龙、倍他米松和曲安奈德。优选的糖皮质激素为地塞米松。

在其中1种或更多种本发明的多肽与1种或更多种其他治疗剂或佐剂组合用于治疗的实施方案中，其他治疗剂或佐剂可单独、同时或顺序施用。它们可在相同或不同的药物制剂中施用。因此，可制备包含本发明的多肽且还包含1种或更多种其他治疗剂或佐剂的药物制剂。本发明的药物制剂可选地可与作为组合治疗的部分的1种或更多种其他治疗组合物同时、顺序或单独使用。因此，在如以下描述的根据本发明的预防或治疗变态反应的方法中，受试者也可用其他治疗剂治疗。

施用途径

在将本发明的多肽或盐在药物制剂中对个体施用的情况下，优选将制剂施用至个体身体中的部位，其中多肽或盐将具有接触合适的抗原呈递细胞的能力以及它或它们将具有接触个体T细胞的机会。

制备之后，本发明的药物制剂可利用多种已知途径和技术递送至受试者体内。例如，药物制剂可被提供作为可注射的溶液、混悬剂或乳剂，并使用常规针头和注射器、微针头和注射器或使用液体射流注射系统经由肠胃外、皮下、表皮、皮内、肌内、淋巴管内、动脉内、腹腔内或静脉内注射。施用可使用贴剂诸如微齿贴剂进行。组合物还可局部地诸如鼻内、扁桃体内、气管内、肠道、直肠或阴道施用至皮肤或粘膜组织，或提供作为适合用于呼吸道或肺部施用的细微喷雾(finely divided spray)。其他施用方式包括口服施用、栓剂、舌下施用和主动或被动经皮递送技术。

剂量

本发明的多肽、盐或药物制剂的施用可通过如以上描述的任何合适的方法。待施用的多肽或盐的合适的量可凭经验确定，但通常在以下给出的范围内。各多肽或盐的单次施用可足以对患者具有有益效果，但应领会的是，如果多肽或盐被施用多于一次可以是有益的，在这种情况中，通常的施用方案可以是例如每周一次或两次，每6个月持续2-4周，或每天一次，每4至6个月持续1周。如将领会的，在多肽或盐的组合中的各多肽或盐可单独地或组合施用至患者。

用于施用的剂量将取决于若干因素，包括肽、盐或药物制剂的性质、施用途径和施用方案的时间表和时间选择。本发明多肽或盐的合适剂量可以是每次施用约多达10μg、多达15μg、多达20μg、多达25μg、多达30μg、多达50μg、多达100μg、多达500μg或更多。合适的剂量可少于15μg，但至少1ng或至少2ng或至少5ng或至少50ng或至少100ng或至少500ng或至少1μg或至少10μg。可选地，使用的剂量可更高，例如多达1mg、多达2mg、多达3mg、多达4mg、多达5mg或更高。剂量可以以适于允许用于通过选择的途径施用的合适的体积的浓度在液体制剂中提供。将理解的是，在肽或盐的组合的情况下，以上剂量指的是总剂量。例如，“多达35μg”指的是在包含组合或多于1种多肽或盐的组合物中总的肽或盐浓度多达35μg。

核酸和载体

本发明的多肽可直接施用，或可通过从编码序列表达间接施用。例如，可提供编码本发明多肽的多核苷酸。本发明的多肽因此可从编码并能够表达该多肽的多核苷酸产生或以所述多核苷酸的形式递送。本文任何关于本发明肽的使用、递送或施用预期包括此肽经由从编码其的多核苷酸表达的间接使用、递送或施用。

在这一方面，本发明提供了编码包含SEQ ID NO:1或源自其的变体的氨基酸序列、由其组成或基本由其组成的多肽的多核苷酸。

术语“核酸分子”和“多核苷酸”在本文可互换使用，且指任何长度的核苷酸的聚合形式，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸的非限制性实例包括基因、基因片段、信使RNA(mRNA)、cDNA、重组多核苷酸、质粒、载体、分离的任何序列的DNA、分离的任何序列的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以以分离的或纯化的形式提供。

可根据本领域熟知的方法合成多核苷酸，如在例如Sambrook等人(1989,Molecular Cloning-a laboratory manual；Cold Spring Harbor Press)中描述的。

以上多核苷酸可体外、离体(ex vivo)或体内用于产生本发明的多肽。此类多核苷酸可在预防或治疗对日本柳杉花粉和/或日本扁柏花粉的变态反应中施用或使用。

用于基因递送的方法是本领域已知的。参见，例如，美国专利号5,399,346、5,580,859和5,589,466。可通过诸如标准的肌内或皮内注射，经皮颗粒递送，吸入，局部地或通过口服、鼻内或粘膜的施用方式将核酸分子直接引入接受的受试者。可选地，可将分子离体引入已从受试者移出的细胞。例如，可将本发明的多核苷酸、表达盒或载体离体引入个体的APC。将含有感兴趣的核酸分子的细胞重新引入受试者，以使得增强针对通过核酸分子编码的肽的免疫反应。用于此免疫的核酸分子在本文通常被称作“核酸疫苗”。

抗原呈递细胞(APC)

本发明包括制备将本发明的多肽呈递在其表面的APC的群体的方法的体外用途。所述APC群体可以随后用于治疗。所述制备方法可在从患者获取的细胞样品上离体进行。以这种方式制备的APC因此形成可在治疗或预防对日本柳杉花粉和/或日本扁柏花粉的变态反应中使用的制药用剂。细胞应被个体的免疫系统接受，因为其源自该个体。将以这种方式制备的细胞递送至所述细胞最初从其获取的个体，因此形成本发明的治疗实施方案。

在APC待被施用的情况下，优选将APC施用至身体中的部位，其中其将具有接触并激活个体的合适的T细胞的能力。

体外方法

本发明还提供了确定T细胞是否识别本发明的多肽或盐的体外方法，该方法包括将所述T细胞与所述多肽或盐接触及检测所述T细胞是否被所述多肽或盐刺激。优选地，该方法包括使用包含SEQ ID NO:1或源自其的变体的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的多肽或其盐。

可进行以上方法来确定个体是否患有对日本柳杉花粉和/或日本扁柏花粉的变态反应，或处于患有对日本柳杉花粉和/或日本扁柏花粉的变态反应的风险中。

通过以下实施例说明本发明：

实施例1

MHC II类结合研究

该研究的目的为鉴定具有对7种最常见的人类MHC II类HLA-DRB1*同种异型具有强亲和力的序列的多肽。

为了在日本柳杉变应原中鉴定所述多肽，使用市售可得的EpiMatrix算法(EpiVax Inc.)执行称为“肽穿线(peptide threading)”的电脑模拟方法。这是分析具有给定序列的多肽适应MHC II类HLA-DR分子的结合沟的潜力的生物信息学方法。

EpiMatrix是基于矩阵的算法，其通过估算与选择的MHC分子的每一个结合的概率对来自任何多肽序列的具有9个氨基酸重叠的10个氨基酸长的区段。(De Groot等人，AIDS Research and Human Retroviruses13:539-41(1997))。用于开发矩阵模体(matrix motif)的程序由Schafer等人，16Vaccine 1998(1998)公开。在该实施例中，评价了对HLA DR1、DR2、DR3、DR4、DR7、DR8、DR11、DR13和DR15的结合潜力。通过对多肽序列中各10-mer框架(frame)评分来选择假定的MHC配体。通过将10-mer的序列与已知与各MHC等位基因结合的10个氨基酸的序列的矩阵比较推导出该评分。回顾性研究已证明EpiMatrix精确预测出已公开的MHC配体(Jesdale等人，在Vaccines'97(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1997)中)。与多个MHC分子结合的多肽的成功预测也已被确认。

与选择的MHC分子结合的估算概率如下通过EpiMatrix计算。通过与给定的MHC等位基因的已知MHC结合子(binder)相比估算各氨基酸结合的相对促进或抑制，来对具有给定序列的多肽评分。汇总多肽的该信息并将汇总的评分(EMX评分)分配至整个多肽。将EMX评分与已知的MHC配体的评分比较之后，EpiMatrix实现了“估算的结合概率(estimated bindingprobability)(简称为EBP，但严格来讲并非概率)。EBP用EpiMatrix评分将多肽的部分描述为将与给定的MHC分子高或更高结合。EBP在从100％(高度可能结合)到小于1％(非常不可能结合)的范围。

对Cry IFR(Uniprot登录号：Q8RYC0)的已知同种型的整个序列进行EpiMatrix分析。这些分析鉴定了源自以上序列的核心多肽(及侧翼序列)，其被预测为具有良好的MHC II类结合。序列显示在以下表2中。

在表2中：“序列中的残基”给出了序列在被分析的多肽序列中的位置。核心序列(加粗的中间的氨基酸)界定了在分析期间鉴定出的实际结合序列。稳定的侧翼(N-末端和C-末端，未加粗)被包含用于与核心序列一起使用且通常被需要以有助于多肽的制备。“击中数(number of hits)”指序列中对所有测试的MHC类型高预测的结合亲和力的数目。“EpiMatrix簇评分(EpiMatrix Cluster Score)”由对簇的长度标准化的击中数推导得到。簇评分因此为预测的综合MHC结合特性相对于随机多肽标准的超出或不足。10以上的评分被认为暗示了广泛的MHC结合特性。

表2

Epimatrix分析还鉴定了肽LKIKLRRTI(SEQ ID NO:5)和IKLRRTIEA(SEQ ID NO:6)为具有对4种或更多种HLA等位基因的结合潜力。

实施例2

基于在实施例1中进行的分析和溶解性及其他理化性质的考虑，发明人选择了表3中列出的序列为具有期望的特性。制备了由表3的序列组成的多肽并特别地优选地用于后续测定中的筛选。

表3

肽	序列	亲本中的残基	SEQ ID NO.
				Cry26	DLKIKLRRTIEAEGIP	130-145Cry IFR	1

实施例3

体外结合分析

预筛选具有在实施例1和2中鉴定出的序列的多肽在水、酸性环境中的溶解性，并在体外MHC II类结合测定中测试肽。

方法

使用的测定为竞争性MHC II类结合测定，其中分析了各多肽以确定其从研究的各人类MHC II类同种异型置换已知对照结合子的能力。在该研究中使用的同种异型和对照多肽为以下显示的那些：

在竞争测定中分析了各多肽并与对照多肽相比筛选了相对结合。由于竞争性测定的性质，各多肽的数据被确定为其自身IC50与对照多肽的IC50的比。因此，具有与对照多肽相等的IC50值的多肽具有相同的结合亲和力，而具有小于1的比的肽具有更高的亲和力且具有大于1的比的那些具有较低的亲和力。

在水溶液中的溶解性是多肽作为有效治疗剂的根本标准。因此，作为溶解性筛选的结果，具有高频率的强疏水性氨基酸残基的非常疏水的多肽在多个结合登记(multiple binding registers)中将被淘汰。这是混杂的HLA-DRB1*结合子的特性。与1种或更多种MHC II类同种异型结合的多肽被鉴定出。预期此类多肽会具有结合还未通过MHC结构同源性测试的相似同种异型的能力。

实施例4

使用以下方法评价具有在实施例1和2中鉴定的序列的多肽的T细胞激活特性。

细胞增殖测定

对PBMC进行细胞增殖测定(需要140×10⁶个细胞用于测试所有参数)。通过掺入放射性标记的化合物3H-胸苷测量增殖。更详细的说，将100μl适当抗原或多肽浓度分配到96孔板的合适的孔中。然后，将板放入设置为37℃的经加湿处理的5％CO2的培养箱，持续最长4小时。在室温下，将如以上描述的分离的PBMC制备成在完全培养基中2×10⁶细胞/ml的浓度。然后将100μl细胞溶液分配到含有抗原/多肽的96孔板的各孔中。然后将板孵育6至8天。通过添加10μl氚化胸苷原液溶液(无血清RPMI培养基中1.85MBq/ml)用氚化胸苷溶液脉冲培养物。然后，将板放回培养箱持续8和16之间的小时。然后，使用Canberra Packard FilterMate 196细胞收集器收集培养物。使用合适的β闪烁计数器对干燥的过滤垫计数。

将来自含有多肽的孔的计数与只含有培养基的孔进行统计比较(每组12孔)。使用非参数曼-惠特尼检验。对所有受试者使用相同的统计检验。在只有培养基的孔和多肽刺激的孔之间的统计学显著差异被认为是PBMC被多肽正向刺激。

细胞因子释放测定

小规模(约10mg批量大小，非-GMP)制备了在该测定中使用的多肽。各多肽的纯度为通过HPLC至少95％。提前准备含有多肽和对照(阴性对照为培养基，且阳性对照为葡萄球菌肠毒素(SEB)25ng/ml和日本柳杉花粉变应原完全提取物100μg/ml)的96孔培养板并在测定当天之前储存于-20℃。将多肽以含有200μg/ml浓度的多肽的100μl体积加入孔中，以使得随后加入100μl细胞将产生100μg/ml的最终测定浓度。

通过Ficoll密度梯度离心法将外周血单核细胞(PBMC)从肝素化的血液中分离。然后将100μl等分的5×106细胞/ml的PBMC悬液加入到各孔并将板放入37℃经加湿处理的5％CO2的培养箱中持续5天。刺激后，收集培养物上清液(100μl)用于通过多重珠测定(multiplex bead assay)的测试。

根据制造商的说明，对解冻的培养物上清液进行多重细胞因子珠测定(IL-10、IL-13、干扰素γ(IFN-g))。对每个培养物上清液样品进行单次测量。多重测定完成后，个体的细胞因子水平通过由测定中生成的标准曲线插值确定。阳性结果被认为是在IL-10、IL-13和IFN-g测定的1种或更多种中大于100pg/ml的细胞因子释放。针对每种多肽针对每种细胞因子计算测试的53名日本柳杉花粉变应性受试者中响应者的数目。

阴性对照(只有培养基)在测试的3名受试者中给出大于100pg/ml的IL-13或IFN-g响应。

细胞因子释放测定仅显示对完全变应原阳性对照的弱的响应，仅有24名受试者具有大于100pg/ml的IL-13或IFN-g响应。弱的响应怀疑是由于PBMC制品可能在运输/储存中丢失一些活性。因此，计划用PBMC的新鲜样品重复细胞因子释放测定。

在相同条件下，肽CRY26在测试的11名受试者中显示大于100pg/ml的IL-13或IFN-g响应。该响应值远高于阴性对照值。CRY26肽或其变体因此优选用于治疗或预防日本柳杉花粉和/或日本扁柏花粉变态反应。

实施例5-CRY26肽、其盐和药物制剂的制备

如下制备CRY26肽。在固相肽合成(SPPS)反应器中进行合成，并通过将取代的树脂悬浮于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)开始。用DMF洗涤树脂后，通过在DMF中N-[(1H-苯并三唑-1-基)(二甲氨基)亚甲基]-N-甲基甲胺四氟硼酸根N-氧化物(N-[(1H-Benzotriazol-1-yl)(dimethylamino)methylene]-N-methylmethanaminium tetrafluoroborate N-oxide，TBTU)和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)的存在下或在二氯甲烷(DCM)和DMF的混合物中二异丙基碳二亚胺(DIC)和1-羟基苯并三唑(HOBt)的存在下，将N-α-保护的氨基酸衍生物或N-α-保护的二肽添加到在前的氨基酸进行每一次偶联程序。对于各单个步骤，添加溶剂和/或试剂，并搅拌反应混合物且随后过滤以从树脂去除溶剂和/或试剂。

每一次成功的偶联或加帽程序之后，进行Fmoc-脱保护程序。其由以下组成：用DMF洗涤树脂、用DMF或1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)中的20％(V/V)哌啶裂解Fmoc-基团、以及随后用DMF和异丙醇(IPA)的洗涤。对于各单个步骤，添加溶剂和/或试剂，并搅拌反应混合物且然后过滤以从树脂去除溶剂和/或试剂。

重复Fmoc-脱保护和偶联程序直到树脂携带所需肽的完整肽序列。SPPS通过最后的Fmoc-脱保护和在减压下干燥肽树脂完成。

通过以下方法制备特定肽的乙酸盐或盐酸盐。在1,2-乙二硫醇(EDT)、三异丙基硅烷(TIS)和水的存在下，在室温下用冷的三氟乙酸(TFA)处理肽树脂1.5至3小时。滤出并用TFA洗涤树脂后，将产物在冷的二异丙醚(IPE)中沉淀。然后将其滤出，用IPE洗涤，并在减压下干燥。然后，将产物重构并使用高效液相色谱法(HPLC)纯化。

对于乙酸盐的制备，将三氟乙酸盐在5％(V/V)乙酸水溶液中重构并装载到离子交换树脂上。用5％(V/V)乙酸水溶液进行洗脱。将乙酸盐通过0.2μm膜滤器过滤并冻干以产生作为白色至灰白色粉末的最终产物。

对于盐酸盐的制备，将三氟乙酸盐在纯化水中的0.01M HCl中重构并且必要时过滤。将溶液装载到制备性HPLC柱上，用于离子交换为盐酸盐。通过用0.1M氯化铵溶液随后为0.01M HCl洗涤柱子进行离子交换。随后，可将盐酸盐通过0.2μm膜滤器过滤并冻干以产生作为白色至灰白色粉末的最终产物。

本发明的示例性药物制剂包含CRY26肽。肽盐通常为乙酸盐或盐酸盐。肽盐通常以40至220μM的标称浓度存在。药物制剂任选还包含以下的1种或更多种：作为抗氧化剂的L-甲硫氨酸(任选为1至15mM的标称浓度，通常为5mM)、用于pH调整的磷酸、盐酸或氨水(根据需要)以及作为张度剂的海藻糖二水合物(任选为260mM的标称浓度)。药物制剂在溶液中制备，随后经受冷冻干燥以产生冻干物。

Claims (27)

1.一种多肽或其药学上可接受的盐，所述多肽为多达30个氨基酸长且包括：

(I)氨基酸序列：DLKIKLRRTIEAEGIP(SEQ ID NO:1；Cry26)；或

(II)包含T细胞表位的变体序列，所述包含T细胞表位的变体序列为具有多达7个氨基酸修饰的所述氨基酸序列(I)，所述氨基酸修饰的每一个独立地为缺失、置换或插入。

2.根据权利要求1所述的多肽或盐，其中所述多肽包括所述变体序列(II)，所述变体序列(II)具有1或2个氨基酸修饰，且所述修饰或每个修饰独立地为缺失或置换。

3.根据权利要求1或2所述的多肽或盐，其中所述置换或每个置换为保守置换。

4.根据权利要求4所述的多肽或盐，其中所述置换或每个置换可以是：

-赖氨酸或精氨酸置换为彼此；

-天冬氨酸或谷氨酸置换为彼此，或置换为其酰胺衍生物天冬酰胺和谷氨酰胺；和/或

-甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸和异亮氨酸置换为彼此或置换为缬氨酸。

5.根据前述权利要求任一项所述的多肽或盐，其中所述多肽包含所述变体序列(II)，所述变体序列(II)具有多达2个氨基酸从N-末端缺失和/或多达2个氨基酸从C-末端缺失。

6.根据前述权利要求任一项所述的多肽或盐，其中所述多肽的长度为多达20个氨基酸。

7.根据前述权利要求任一项所述的多肽或盐，其中所述多肽具有由具有从1至6个氨基酸的N-末端和/或C-末端延伸的所述序列(I)或(II)组成的氨基酸序列，所述从1至6个氨基酸分别对应于所述序列(I)所源自的蛋白的天然序列中紧邻所述序列(I)的N-末端或C-末端的1至6个氨基酸。

8.根据权利要求1所述的多肽或盐，其中所述多肽具有氨基酸序列DLKIKLRRTIEAEGIP(SEQ ID NO:1；Cry26)。

9.一种药物制剂，所述药物制剂包含药学上可接受的载体或稀释剂和多肽或其药学上可接受的盐，所述多肽为多达30个氨基酸长且包括：

(I)氨基酸序列：DLKIKLRRTIEAEGIP(SEQ ID NO:1；Cry26)；或

(II)包含T细胞表位的变体序列，所述包含T细胞表位的变体序列为具有多达7个氨基酸修饰的所述氨基酸序列(I)，所述氨基酸修饰的每一个独立地为缺失、置换或插入。

10.根据权利要求9所述的药物制剂，其中所述多肽包含所述变体序列(II)，所述变体序列(II)具有1或2个氨基酸修饰，且所述修饰或每个修饰独立地为缺失或置换。

11.根据权利要求9或10所述的药物制剂，其中所述置换或每个置换为保守置换。

12.根据权利要求11所述的药物制剂，其中所述置换或每个置换可以是：

-赖氨酸或精氨酸置换为彼此；

-天冬氨酸或谷氨酸置换为彼此，或置换为其酰胺衍生物天冬酰胺和谷氨酰胺；和/或

-甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸和异亮氨酸置换为彼此或置换为缬氨酸。

13.根据权利要求9至12任一项所述的药物制剂，其中所述多肽包括所述变体序列(II)，所述变体序列(II)具有多达2个氨基酸从N-末端缺失和/或多达2个氨基酸从C-末端缺失。

14.根据权利要求9至13任一项所述的药物制剂，其中所述多肽的长度为多达20个氨基酸。

15.根据权利要求9至14任一项所述的药物制剂，其中所述多肽具有由具有从1至6个氨基酸的N-末端和/或C-末端延伸的所述序列(I)或(II)组成的氨基酸序列，所述从1至6个氨基酸分别对应于所述序列(I)所源自的蛋白的天然序列中紧邻所述序列(I)的N-末端或C-末端的1至6个氨基酸。

16.根据权利要求9所述的药物制剂，其中所述多肽具有氨基酸序列DLKIKLRRTIEAEGIP(SEQ ID NO:1；Cry26)。

17.根据权利要求9至16任一项所述的药物制剂，所述药物制剂被密封在容器中。

18.根据权利要求9至17任一项所述的药物制剂，所述药物制剂为药学上可接受的溶液或冻干物。

19.根据权利要求18所述的药物制剂，其中所述溶液被配制用于皮内施用、皮下施用、口服施用、鼻内施用、局部施用、舌下施用、含服施用或表皮施用。

20.根据权利要求18或19所述的药物制剂，其中所述溶液在安瓿、密封的小瓶、注射器、弹药型制剂、柔性袋或玻璃瓶中提供。

21.根据权利要求18所述的药物制剂，其中所述冻干物在密封的小瓶中提供。

22.根据权利要求1至8任一项所述的多肽或盐或根据权利要求9至21任一项所述的药物制剂，用于在治疗或预防对日本柳杉花粉和/或日本扁柏花粉的变态反应的方法中使用。

23.如权利要求1至8任一项中定义的多肽或盐用于制备用于预防或治疗对日本柳杉花粉和/或日本扁柏花粉的变态反应的药物的用途。

24.一种确定T细胞是否识别如权利要求1至8任一项中定义的多肽或盐的体外方法，所述方法包括将所述T细胞与所述多肽或盐接触及检测所述T细胞是否被所述多肽或盐刺激。

25.根据权利要求24所述的方法，所述方法被进行以确定个体是否患有对日本柳杉花粉和/或日本扁柏花粉的变态反应，或处于患有对日本柳杉花粉和/或日本扁柏花粉的变态反应的风险中。

26.一种治疗个体对日本柳杉花粉和/或日本扁柏花粉的变态反应或用于在个体中预防对日本柳杉花粉和/或日本扁柏花粉的变态反应的方法，所述方法包括对所述个体施用治疗上或预防上有效量的如权利要求1至8任一项中定义的多肽或盐或如权利要求9至21任一项中定义的药物制剂。

27.一种制备药物制剂的方法，包括将如权利要求1至8任一项中定义的多肽或盐与药学上可接受的载体或稀释剂组合。