CN102227214B - 二聚体形成减少的组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及非还原性糖或糖衍生物和抑制冻干组合物中二聚体形成的至少一种剂为冻干组合物提供改进的长期储存稳定性的用途,所述冻干组合物包含包括游离半胱氨酸残基的至少一种肽。
Description
发明领域
本发明涉及非还原性糖或糖衍生物和抑制冻干组合物中二聚体形成的至少一种剂为冻干组合物提供改进的长期储存稳定性的用途,所述冻干组合物包含包括游离半胱氨酸残基的至少一种肽。
发明背景
本领域已知有许多方法用来保存易腐材料或使得材料更便于运输。对于药物、生物技术材料或食品材料,典型方法是冻干(也称为冷冻干燥或冻干(cryodesiccation))。这是一种脱水过程,通过冷冻材料,然后减少周围压力,并加入仅足够的热以允许材料中的冰水直接从固态升华为气体来作用。然后所获得的冻干产物可易于在溶液中重构,以供未来使用。
冻干产物的优势在于其通常比在溶液中的同样材料在储存和运输期间更稳定,具有更长的存放时间。然而,冻干存在一些问题,因为在冷冻和干燥过程期间可能发生对待保存的材料的损害。这些问题在一定程度上通过向待冻干的材料加入冷冻保护剂和冻干保护剂来解决。然而,认识不足的是,一些易腐材料,尤其是包括至少一个游离半胱氨酸残基的肽,即使在冻干过程完成后,仍然容易发生降解和损害。即,虽然冻干具有防腐作用,包含包括至少一个游离半胱氨酸残基的肽的冻干产物通常具有比期望的短的存放时间。对改进包含这种肽的冻干组合物的稳定性的手段有明显的需求。
发明概述
本发明涉及(i)至少一种非还原性糖和(ii)抑制二聚体形成的至少一种剂在包含包括至少一个游离半胱氨酸残基的至少一种肽的冻干组合物中的用途,其中所述用途是用于阻止或减少所述组合物中所述至少一种肽的二聚化。
本发明还涉及产生包含至少一种肽的稳定冻干组合物的方法,所述方法包括:
a)制备在溶液中包含以下的组合物:(i)至少一种非还原性糖、(ii)抑制二聚体形成的至少一种剂和(iii)包括至少一个游离半胱氨酸残基的至少一种肽;并且
b)冻干从步骤(a)获得的组合物。
在一个实施方案中,所获得的冻干组合物在2-8℃的温度储存时,稳定至少2年。在一个进一步的实施方案中,该方法还包括在溶液中重构步骤(b)的冻干组合物。
本发明还涉及一种包含用于免疫或耐受作用(tolerisation)的至少一种肽的稳定冻干组合物,其中所述组合物另外包含至少一种非还原性糖和抑制二聚体形成的至少一种剂。
在以上用途、方法和组合物的一个实施方案中,至少一种非还原性糖选自海藻糖、蔗糖、棉子糖、水苏糖或松三糖,且所述剂是硫代甘油。
在以上用途、方法和组合物的一个实施方案中,所述至少一种肽是用于免疫或耐受作用,长度为8至30个氨基酸,并包括:
a)至少一个半胱氨酸残基;和
b)包含至少一个T细胞表位的区域。
附图说明
图1至83显示当包含在如实施例所述的不同冻干组合物中时,在如所示的不同条件下储存的肽的稳定性(T=海藻糖、S=蔗糖、M=甘露醇、TG=硫代甘油、G=甘氨酸、Met=甲硫氨酸)。时间(周)显示在X-轴。从指定组合物重构的溶液中存在的未降解肽的量显示在Y轴。该量显示为相对于未被冻干的肽MLA07标准品量的百分比。
每张图显示对应以下每种不同肽的七个不同结果组:MLA05(黑线,小圆点);MLA12(黑线,方形点)、MLA03(浅灰线,三角形点);MLA14(浅灰线,x-形点);MLA01(黑线,x-形点)、MLA04(黑线,大圆点);MLA07(黑线;垂直线-形点)。在每种组合物中,在冻干七种肽的混合物后产生数据。
图84显示包含在实施例4所述具体组合物中的七种肽MLA05;MLA12、MLA03;MLA14;MLA01;MLA04和MLA07的混合物在30℃/65%RH经12个月后的稳定性,即硫代甘油“低”(菱形)和硫代甘油“高”(方形)。
序列描述
SEQ ID NO:1至83代表尤其优选地包含在本发明的组合物中的肽序列。SEQ ID NO:84至86代表本发明的组合物中可包含的其它肽序列。
发明详述
冻干
冻干是一种复杂操作,其中通过升华从产物除去溶剂(通常是水)。如公知的,当冷冻的液体不经液相直接进入气相时发生升华。升华是压力与温度的函数,压力与温度的平衡对于成功冻干很关键。
冻干过程由三个阶段组成:冷冻、初级干燥和二级干燥。在冷冻步骤期间,溶液转化为固体。必须小心控制冷冻过程,因为冷冻速率影响产物中形成的冰晶的大小,这可影响产物稳定性,并可影响初级干燥阶段和二级干燥阶段期间的干燥速率。
在临界温度以下进行冷冻步骤非常重要。临界温度是结晶物质的低共熔温度(Teut),或无定形产物的最大冷冻浓缩溶质的玻璃化转变温度(Tg’)。
在初级干燥期间,经由升华从产物去除冰,形成干燥、结构完整的产物。这要求小心控制干燥装置中的搁板温度和室压力(chamber pressure)。冰从冷冻产物升华的速率取决于多种因素,这些因素是本领域技术人员理解的。重要的是在初级干燥期间,在升华界面的产物温度(producttemperature,Tp)不超过制剂的“临界温度”,即,其必须未能获得达到流动的足够流动性,因此不破坏饼状物的结构。这也称为坍塌温度(Tc),通常比Tg’高几度。
如上所述,临界温度对于主要为结晶的物质是Teut,对于无定形物质是Tg’或Tc。结晶物质容易冻干,因为Teut通常高(如,非常常见的填充剂甘露醇的Teut是-3℃)。而且,当从结晶物质获得时,所得的冻干“饼状物”通常具有美观的外形。然而,结晶物质通常不能充分适于在冷冻过程和干燥过程期间稳定肽。在本文,通常使用无定形糖、多元醇和其它赋形剂。缺点是这些物质的Tg’通常比低共熔温度低得多(如,蔗糖:-32℃)。
完成初级干燥,并使所有冰升华后,产物中仍存在结合的水分。产物表现干燥,但残余的水分含量可能高达7-8%。需要以更高搁板温度(shelftemperature)继续干燥以减少残余的水分含量到最优值(对于许多制剂<1%)。这一过程或二级干燥,也称为等温解吸,因为从产物解吸结合的水。二级干燥通常在高于室温但仍低于制剂玻璃化转变(Tg)或熔解温度的产物温度继续。
应理解的是,本领域技术人员理解小心考虑以上参数、适当考虑不同组合物之间性质的差异的需要,和反复试验以确立最佳冷冻和干燥条件的可能需要。
冻干方法稳定脆弱产物(如,蛋白、肽等等)有多种优势:例如,适当冻干的产物通常不需要冷藏,它们可在室温储存,能够快速地用水或另一种适当的注射用溶剂重构。通常预期冻干组合物具有超过2年的稳定存放时间。在这一范畴中,通常用稳定表示冻干组合物可毫无困难地重构,且重构溶液适合于药物用途。稳定也认为是在重构前,除了冻干饼状物破碎以外,产物的物理或表面外观不存在任何变化。对药物用途的适合性取决于所讨论的生物材料和具体用途,但通常可由本领域技术人员容易地评价。大体上,预期重构溶液中的生物材料将具有与冻干前溶液中等价材料相当的活性。在重构溶液包含肽或蛋白的情形,如果重构溶液无菌并不含可见的颗粒,通常将认为重构溶液适合于药物用途,尤其是用于注射。
冻干存在许多困难,这可能缩短产物的稳定存放时间,有时是剧烈地,尤其是对于包含具有至少一个游离半胱氨酸残基的蛋白或肽的组合物。这种材料不但可能在冻干过程期间,也可能在冻干过程后,即,在冻干产物储存期间,经历不可逆的改变或降解。
冻干过程期间的降解可能发生在冷冻期间、干燥期间、或冷冻和干燥二者期间。如果产物降解发生在冷冻期间,通常加入“冷冻保护剂”。冷冻保护剂在冷冻期间稳定,但在冷冻干燥期间(即,冷冻和干燥二者期间)未必稳定。常见的冷冻保护剂包括高浓度的二糖和一些氨基酸(达0.5M)、和低水平的聚乙二醇(<1%,w/w)或其它聚合物。术语“冻干保护”是指在所有冻干过程期间(即,冷冻和干燥二者期间稳定化)稳定化。这样的稳定化通常是冻干生物材料诸如蛋白和肽所需的。这是因为复杂的生物分子诸如蛋白通常需要中度水平的残余水来维持结构和功能。因此通常可加入“冻干保护剂”。本领域已知的冻干保护剂通常是多羟基化合物,诸如糖(单糖、二糖和多糖)、多元醇和其衍生物。
不同于上述,在冻干过程后,即,在冻干产物的储存或运输期间发生的损害和降解更难以解决。这样的损害可能采取例如,脱酰胺、水解、外消旋化或氧化的形式,所有这些通常可能导致储存的蛋白或肽的聚集和/或变性。半胱氨酸残基侧链氧化,导致分子间二硫键的形成,且分子随后的二聚化是个具体问题。这样的损害可能经长时间段缓慢发生,或可能在储存条件短期改变期间快速发生,储存条件短期改变诸如因为气候控制系统失灵而温度突然升高或甚至仅仅是室温的季节性变化。
本发明通过抑制或减少至少一种肽二聚化,解决了包含所述至少一种肽,尤其是包括至少一个游离半胱氨酸残基的肽的冻干组合物在冻干过程后发生的损害和降解问题。
本发明的冻干组合物
本发明尤其与包含包括至少一个游离半胱氨酸残基的至少一种肽的冻干组合物有关。尤其感兴趣的肽是可用于调整免疫系统的肽,尤其是通过调整T-细胞应答来调整免疫系统的肽。
抗原的T细胞识别需要抗原呈递细胞(APC)呈递与主要组织相容性复合物(MHC)的分子缔合的在其细胞表面上的抗原蛋白的片段(肽)。T细胞使用其抗原特异性T细胞受体(TCR)以高特异性识别由APC呈递的片段。这样的识别作为免疫系统的触发器起作用来产生一系列应答以根除已被识别的抗原。
抗原片段的T细胞识别的特异性大部分由片段中氨基酸更小的子序列提供。这种子序列称为T细胞表位。因此,包含这种表位的肽是用作调节受治疗者免疫系统的治疗剂所关注的。在胞外变应原和自身抗原或同种抗原的情形中,肽通常呈递在II类MHC分子上,其被CD4T细胞识别。因此,对变应性病症和自身免疫病症或同种免疫病症的关注集中在结合II类MHC的T细胞表位上。然而,被CD8T细胞识别的结合I类MHC的T细胞表位也令人关注。例如,当需要调节对内源和/或胞内抗原的免疫应答时。这在某些癌症标记的情况可能是期望的,来自癌症标记的肽可用于诱导肿瘤免疫性,或用于治疗传染病,诸如肝炎和人乳头瘤病毒导致的传染病。
已经证实,向受治疗者施用来源于胞外变应原和自身抗原或同种抗原的肽表位导致诱导对表位来自的抗原的耐受性。基于这种效应的治疗剂在预防和治疗变态反应,以及其中期望下调特异性免疫应答的自身免疫疾病或同种免疫疾病方面具有巨大潜力。
已经证实,向受治疗者施用来源于与癌症或传染病相关的某些蛋白的肽表位导致诱导对表位来自的抗原的特异性免疫。基于这种效应的治疗剂在预防和治疗其中期望上调特异性免疫应答的疾病方面具有巨大潜力。
使用肽表位来产生对特异性抗原的耐受性或免疫性的进一步发展被许多问题所阻碍。一个这种问题是表位序列,尤其是来自变应原和自身抗原和同种抗原的表位序列可溶性差,因此在制造、储存和向受治疗者施用时都存在问题。尤其是,包含包括半胱氨酸残基的表位序列的肽可能受二聚化或更高级的聚集损伤,导致不适当的免疫应答,通常是IgE或IgG结合造成的发炎。
因此,当包含这种表位的肽被包括在冻干组合物中时,其尤其受对运输和储存期间,即,冻干过程后发生的如上列出的损害和降解类型损伤。这继而导致重构溶液不适于其预期药物用途,因为当要求耐受作用时,高度不期望激发不适当的免疫应答诸如发炎。类似地,当要求诱导特异性免疫时,形成二聚体或更高级的聚集体将抑制对I类MHC分子的结合或随后对适当T-细胞的结合,从而阻止刺激T-细胞介导的免疫应答。
结合H类MHC的T细胞表位
如上所述,对用于治疗或预防变应性病症和自身免疫病症或同种免疫病症的肽的关注集中在结合II类MHC的T细胞表位上。当需要激发特异性免疫应答时,这种表位也可以是令人关注的。本发明的肽中包含的结合II类MHC的T细胞表位通常是能够结合于II类分子并当与II类缔合在细胞表面上呈递于T细胞时能够刺激CD4T细胞的最小氨基酸序列。表位通常是结合于人类II类MHC分子,诸如本文提到的任何这种分子的表位。
II类MHC分子由两种蛋白α和β组成,其每一个由不同基因编码。人类中存在编码不同α蛋白和β蛋白的三个基因簇。它们是人类白细胞抗原(HLA)簇DR、DQ和DP。每个簇包括编码α蛋白不同变体的多个不同A基因和编码β蛋白不同变体的多个不同B基因。因此所得的II类MHC异二聚体极大地不同,相应地其结合的T细胞表位也极大地不同。
II类MHC分子的结合位点包括两个分离的蛋白,它们形成裂缝(cleft)。裂缝是末端开口的,这在理论上允许结合任何长度的肽。然而,只有9个氨基酸能占据裂缝本身。占据裂缝的最多9个氨基酸的特性限定了指定肽是否结合指定II类MHC分子和是否可用于呈递到T细胞。因此,这最多9个氨基酸代表II类MHC-结合所需的最小序列。通常假设这样的序列当与II类缔合在细胞表面上呈递于T细胞时能够刺激T细胞。然而,这可由本领域标准方法实验证实。
这种方法通常可包括在允许表位与T细胞相互作用的条件下将表位与从受治疗者获取的样品中的T细胞接触;然后确定是否刺激了任何T细胞。确定是否刺激了T细胞可由任何适当方法实现,例如通过检测T细胞的细胞因子的产生,其中细胞因子的产生指示T细胞已被刺激。适当的细胞因子包括干扰素γ、白介素4和白介素13。细胞因子产生可由任何适当方法检测,例如ELISA、ELISPOT测定或流式细胞术测定。受治疗者样品中的T细胞通常以由从受治疗者获取的血液或血清样品分离的外周血单核细胞(PBMC)群体存在。
本发明结合II类MHC的T细胞表位通常由8或9个氨基酸组成,但可由7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸组成。表位的氨基酸序列可通过进一步参照II类MHC分子的结合位点来宽泛地定义。这种结合位点具有特异性结合袋,其对应于结合肽表位序列中的主要和次要锚定位置。结合袋由II类MHC分子序列中的氨基酸位置限定,对于表位中具体氨基酸通常不是绝对有差别的。因此任何指定MHC分子的肽结合特异性是相对宽的。所以,结合相同MHC同种异型的肽表现一些程度的相似性,但不需要相同性。
对于最常见的人类II类MHC类型即HLA-DR,结合于结合袋的关键锚定位置是肽表位的位置1、4、6、7和9(从占据裂缝的最N末端残基向最C末端计数)。因此,结合袋中具有相似氨基酸的不同HLA-DR等位基因通常结合在位置1、4、6、7和9具有相似氨基酸的肽。因此,包含结合II类MHC的T细胞表位的区域优选地在对应于位置1、4、6、7和9的位置具有允许结合最宽范围HLA-DR等位基因的氨基酸。不同HLA-DR等位基因的典型结合特性的实例列在以下:
在β链位置86具有甘氨酸的DR等位基因显示在肽位置1强烈优选大的疏水侧链(Trp、Tyr、Phe),而在位置86的缬氨酸限制结合袋的大小并改变在该位置对小的疏水侧链(Val和Ala)的偏好。中等大小的疏水氨基酸Leu和Ile在所有DR等位基因中是充分接受的。
在β链的位置70具有Gln、在位置71具有赖氨酸、在位置74具有精氨酸或Gln的DR等位基因在结合袋4中具有总的正电荷,这要求结合肽在位置4具有带负电荷的氨基酸Asp和Glu(如例如,在DRB1*0301中)。具有这种基序的DR等位基因与两种自身免疫疾病相关:系统性红斑狼疮和桥本甲状腺炎。
在β链的位置70具有Gln或Arg、在位置71具有Arg或Lys且在位置74具有Glu或Ala的DR等位基因结合与上述类似的肽,因为仅有的显著差异是在位置74。然而,当在位置74存在Ala时,结合袋4的大小增加,可容纳更大的氨基酸,诸如Phe、Trp和Ile(如例如,在DRB1*0401、04、05中)。预计在位置74带有Glu的等位基因允许在结合肽位置4的小的极性残基如Ser和Thr。具有这种基序的DR等位基因与对类风湿性关节炎的易感性相关。
在β链的位置70具有Asp、在位置71具有Glu或Arg、在位置74具有Leu或Ala的DR等位基因排除在肽位置4具有带负电荷的氨基酸的肽(例如DRB1*0402)。这是因为在位置70存在Asp。具有这种基序的DR等位基因与自身免疫疾病儿童类风湿性关节炎(JRA)、寻常天疱疮和变应性支气管肺病/综合征相关。
在β链位置9的多态性限定所有DR等位基因中结合袋9的大小。在此位置具有Trp的等位基因仅接受结合肽位置9中小的氨基酸,如,Ala、Val、Gly、Ser、Thr、Pro(如例如,DRB1*0101和*1501中)。在位置9的Glu连同在位置57的Asp,使得结合袋9带负电荷,便于容纳带正电荷的氨基酸诸如Lys(如例如,DRB1*0401和*0404中)和组氨酸(如例如,DRB1*0402中)。在大多数II类MHC等位基因中,在位置57的Asp与在位置76的Arg形成盐-桥的氢键,使得结合袋也容纳脂肪族和极性氨基酸。在位置57的Asp被Ser(例如DRB1*0405)或Ala(DQ8)代替的情形,氢键网络被破坏,在位置76的Arg可强烈地吸引在结合肽位置9带负电荷的氨基酸诸如Asp或Glu(如例如,DRB1*0405中)。
因此,表位优选序列的实例在位置1具有Trp、Tyr、Phe、Val或Ala;在位置4具有Asp、Glu、Ser或Thr;在位置9具有Ala、Val、Gly、Ser、Thr、Pro。表位优选序列的进一步实例在位置1具有大的芳香族或疏水氨基酸,例如Tyr、Phe、Trp、Leu、Ile或Val,在位置6具有小的、无电荷的氨基酸,例如Ser、Thr、Ala、Pro、Val、Ile或Met。结合于由DRB1*0101、*0401和*0701等位基因编码的II类MHC分子的全部或组合的肽的大约87.5%包含这种基序。而且,因为来源于变应原和自身免疫抗原的T细胞表位通常不包含大量指定的一种或多种氨基酸重复,本发明的优选表位通常包含至少5、6、7或8个不同氨基酸。
表位的准确氨基序列可由基于计算机的算法预测,由体外生化测定证实。适合的可购买获得的算法包括EpiMatrix算法(EpiVax Inc.)。其它算法可在例如http://www.imtech.res.in/raghava/propred/和http://www.imtech.res.in/raghava/mhc2pred/获得。用这些算法分析通常包括将较大的多肽序列分析为多个重叠的小肽。然后利用算法分析这些小肽的序列以鉴定预测为结合II类MHC分子的小肽。重叠的小肽通常是9-mer。
然后在体外利用标准结合测定,评价在这一分析中得分最高的候选肽结合由不同II类等位基因编码的一组II类MHC分子的能力。例如可使用竞争性II类MHC结合测定,其中分析每种肽从所研究的每种人类II类MHC同种异型中置换已知的对照结合子(binder)的能力。在这样的测定中,每种肽被给定一个IC50值(实现对照肽结合50%抑制的浓度)。IC50越低,肽对指定II类MHC同种异型的亲和力越高。
取多肽中的一个或多个表位为显示出与II类MHC分子的最高结合亲和力的肽。尤其优选的表位显示出与由多于一种、优选地两种、更优选地三种、四种或五种II类MHC等位基因编码的不同II类分子结合的高亲和力。
尤其优选的表位是易于形成二聚体的区域中包含的表位。这些区域在以下另一部分定义。
结合I类MHC的T细胞表位
如上所述,1类MHC结合表位通常更被关注于激发特异性免疫应答(诸如肿瘤免疫或诱导针对传染病致病因子的免疫应答)。本发明的肽中包含的结合I类MHC的T细胞表位通常是当与I类缔合在细胞表面上呈递于T细胞时能够结合于I类分子并能够刺激CD8T细胞的最小氨基酸序列。表位通常是结合于人类I类MHC分子,诸如本文提到的任何这种分子的表位。
I类MHC分子由非共价连接于称为β2-微球蛋白的较小的肽的重肽链组成。重肽链的构成为三个大的球形结构域α1、α2和α3,和较小的跨膜区域和胞内区域。重肽链由单基因编码。人类中存在编码不同I类重链的三个主要基因簇和三个次要基因簇。它们是人类白细胞抗原(HLA)簇HLA-A、HLA-B、HLA-C(主要)与HLA-E、HLA-F和HLA-G(次要)。每个簇包括编码重链不同变体的多个不同基因。因此所得的I类MHC蛋白非常不同,相应地其结合的T细胞表位也非常不同。
I类MHC分子的结合位点由α1和α2结构域(离细胞膜最远的那些)之间的裂缝形成。裂缝是闭合的袋,通常在裂缝中结合的肽具有最多12个氨基酸的最大长度。占据裂缝的最多12个氨基酸的特性限定了指定肽是否结合指定I类MHC分子,和是否可用于呈递到T细胞。因此,这些氨基酸代表I类MHC-结合所需的最小序列。通常假设这样的序列当与I类缔合在细胞表面上呈递于T细胞时能够刺激T细胞。然而,这可由本领域标准方法实验证实,所述方法通常是以上对II类表位列出的方法的等价方法。
本发明结合I类MHC的T细胞表位通常由6至12个氨基酸组成,更通常由8至12个氨基酸或8至10个氨基酸组成。表位可由8、9、10、11或12个氨基酸组成。最通常地,表位长度是9个氨基酸。表位的氨基酸序列可通过进一步参照I类MHC分子的结合位点来宽泛地定义。I类MHC结合裂缝的闭合性质表示,在I类表位每个末端的残基对于识别尤其重要。肽的氨基-末端胺基接触肽沟一端的不变位点,羧基末端的羧基结合沟另一端的不变位点。然而,这些不变位点对于表位中具体氨基酸通常不是绝对有差别的。因此任何指定MHC分子的肽结合特异性是相对宽的。所以,结合相同MHC同种异型的肽表现一些程度的相似性,但不需要相同。虽然如此,通常,I类表位具有疏水或碱性羧基末端,在氨基最末端不存在脯氨酸。表位存在于沿着沟的延长构象中,主链原子与沿着沟的保守氨基酸侧链之间进一步接触。长度变化由肽骨架中的扭转调节,所述扭转通常在脯氨酸或甘氨酸残基。
尤其优选的表位是易于形成二聚体的区域中包含的表位。这些区域在以下另一部分定义。
包含至少一个T细胞表位的区域
用于鉴定T细胞表位的生化测定通常不能够比在大约10至12个氨基酸中更准确地限定在更大序列中,更通常15、20或更多个氨基酸中最小表位序列的位置。其原因是,大序列必须物理地片段化为较小的重叠肽,或较小的重叠肽必须在体外评价这些肽结合MHC分子的能力之前从头制造。本领域技术人员将认识到,使用的重叠肽片段越小,制造过程就更耗时和劳动密集。因此,表位通常鉴定为包含在更大的多肽区域中。预期本发明的肽可包括这样的更大区域。
因此,在本发明的肽中,包含T细胞表位的区域通常长度是8或9个氨基酸,但长度可以是6、7、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。在结合I类MHC的T细胞表位的情形,应理解的是,在表位可呈递到MHC分子之前,可能需要加工该区域。呈递到I类MHC分子之前的抗原加工是本领域公知的。
本发明的区域通常是易于形成二聚体的序列。这将理解为包括同二聚体形成(即,肽单体与其它相同肽单体缔合)和异二聚体形成(即,肽单体与不同肽单体缔合)二者。还应理解,易于形成二聚体的序列还意为指易于形成更高级的寡聚体诸如三聚体、四聚体等等的序列。本发明的区域可包括易于形成二聚体的任何序列或由易于形成二聚体的任何序列组成。指定区域中促进二聚体形成的具体氨基酸序列可包含在T细胞表位的最小II类MHC-结合序列中,或可包含在该序列侧翼的残基中。如此,易于形成二聚体的序列可完全由T细胞表位的最小MHC结合序列组成。
本发明尤其涉及在含半胱氨酸的肽之间形成共价二聚体。因此,优选序列包括至少一个半胱氨酸残基。本领域技术人员将认识到,含有单个半胱氨酸残基的任何肽可与其自身或与可能接触的其它含半胱氨酸的肽形成二聚体。含有两个或更多个半胱氨酸的肽具有形成长链的可能,然后可能聚集。这样的二聚体/聚集体形成造成IgE或IgG结合的风险,因此具有局部的炎性应答。因此,本发明的优选区域通常来源于具有高比例半胱氨酸残基的蛋白。例如,本发明的区域可以来源于具有按占蛋白中氨基酸残基总数的比例计,大于20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35%半胱氨酸残基的蛋白。本发明的区域优选地选自具有较低比例半胱氨酸残基的蛋白中的序列。因此,该区域可包括按占区域中氨基酸残基总数的比例计最多达5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20%的半胱氨酸残基。半胱氨酸残基可包括在表位的最小MHC结合序列中,或可包括在这一序列侧翼的残基中。
其它易于形成二聚体的序列的鉴定可通过计算机模拟分析利用适当的计算方法鉴定,或如下列出的,通过体外分析利用定量以单体或二聚形式存在的序列比例的适当实验方法。对于易于二聚化的序列,以二聚体存在的序列比例可以最小,即,在固态中少于约0.5%或1%,但通常随着时间增加到在适当的条件下在溶液中储存适当时间段的材料的至少约0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。适当的时间段和条件包括本领域技术人员可能合理地预料在使用前在溶液中保存序列的时间和条件的范围。例如,约24小时、约48小时或约72小时的时间段是典型的,尽管一些溶液可保存更长时间,例如,至少1周、1个月、6个月、1年、2年、3年或更久。储存条件通常可为室温和相对湿度,或通常为25℃和60%相对湿度,但可包括本领域技术人员遇到的任何标准储存条件,例如大约5±3℃、-20℃或-80℃。
免疫系统的敏感性使得仅小比例的二聚体即被认为可能触发不期望的免疫应答。
对于评价以指定形式存在的序列的比例,适当的方法是例如在非变性条件下的分析性凝胶电泳。在这样的方法中,在聚丙烯酰胺凝胶中运行序列的溶液,同时运行一组标准分子量标准品。如果序列形成二聚体,将在凝胶中观察到对应分子量为计算的序列氨基酸总数的分子量的大约两倍的物质的蛋白条带。(类似地,存在的任何三聚体或四聚体将观察为对应分子量为计算的序列氨基酸残基的重量总数的分子量的大约三倍或四倍的物质的条带)。因为很少有100%的序列以寡聚形式存在,还可观察到对应具有大约计算的序列氨基酸总数的分子量的物质的第二条带-这代表存单体形式的序列。条带的相对强度可用于定量以每种形式存在的序列的比例。类似的方法可以替代方式评价分子量,例如分析性离心、质谱或尺寸排阻色谱。可选地,寡聚体的定量可利用反相高效液相色谱(RP-HPLC),其中二聚体和更高的寡聚物质与单体依据其疏水性的差异而分离。利用质谱检测实现对各物质的鉴定。相同方法可适于评价指定肽是否显示出与任何其它肽或分子异二聚化的趋势。
另外,本发明的区域可具有在pH 2.0至12.0、或pH 2.0至11.0、pH 2.0至10.0、pH 2.0至9.0、pH 2.0至8.0或pH 2.0至7.0的水溶液中的溶解度少于3.5mg/ml;和/或包括1、2、3或4个半胱氨酸残基;和/或具有低于4.5的等电点;和/或具有高于+0.25的GRAVY评分。这些参数可由任何适当的方法评价。例如,溶解度可由标准体外方法评价,GRAVY和等电点的评价可由计算机模拟利用适当的计算机方法,诸如ProtParam工具(Gasteiger E.等,第571-607页,The Proteomics Protocols Handbook(蛋白质组学实验方案手册),Humana Press(2005);John M.Walker(编著)),可在http://www.expasy.ch/tools/protparam.html获得。
肽
本发明的肽可包括如上定义的区域的天然序列,或可由如上定义的区域的天然序列组成,或可包括被改造以减少二聚体形成或改进溶解度的区域的天然序列,或可由被改造以减少二聚体形成或改进溶解度的区域的天然序列组成。然而,在已被改造区域的上下文中,应理解的是,本发明尤其适用于仍可能经历不可接受的水平的二聚体形成的那些肽。这样的肽通常仍将包括至少一个半胱氨酸残基。
当改造区域以减少二聚体形成时,通常是通过修饰其天然序列。尤其优选的修饰如下,其中:
-区域天然序列中的至少一个半胱氨酸残基被丝氨酸、2-氨基丁酸、丙氨酸或甘氨酸代替;和/或
-区域天然序列中的至少一个半胱氨酸残基被半胱氨酰化(cysteinylated)以产生胱氨酸残基。
应理解的是,本发明的肽意为涵盖所述肽的某些变体。除了减少二聚体形成的上述改造以外,可对肽的天然氨基酸序列进行其它修饰。例如对肽序列中的一个、两个、三个、四个或五个氨基酸进行。任何这样的修饰通常是保守的,即如果天然序列中的氨基酸被不同氨基酸代替,所述不同氨基酸通常具有与天然氨基酸相似的特性。下表显示了氨基酸的特性。分子量在每种氨基酸3-字母编码的一旁显示。提供的分子量是中性、游离氨基酸的分子量;残基重量可通过减去一当量的水(18g/mol)来获得。本发明还包括包含N-末端和C-末端修饰或封闭以减少或抑制外肽酶降解的肽。
被修饰的一个或多个残基可包含在区域序列的任何部分中。在一个实施方案中,被修饰的一个或多个残基不包含在区域的最小MHC结合序列中。在一个优选实施方案中,修饰不产生新的表位或影响区域的MHC结合特性。
本发明的肽通常包含8至30个氨基酸,可包含9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个氨基酸。应理解的是,本发明的肽可完全由如上定义的区域组成,或可包括在区域侧翼的另外的氨基酸,最多达30个氨基酸。
比30个氨基酸长的肽可能具备足以交联细胞表面上的IgG或IgE,导致不期望的免疫应答,诸如B细胞活化或肥大细胞脱粒的三级结构。
肽合成
在理性意义上,本发明的肽来源于包含如上定义的区域的多肽。这通过利用区域的氨基酸序列并基于该序列合成肽来进行。肽可利用本领域公知的方法合成。优选方法包括固相肽合成技术,最优选地自动或半自动肽合成仪。通常,利用这样的技术,在偶联剂诸如二环己基碳二亚胺和1-羟基苯并三唑存在下,在碱诸如二异丙基-乙胺存在下,α-N-氨基甲酰基保护的氨基酸与连接于树脂上成长肽链的氨基酸在室温在惰性溶剂诸如二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮或二氯甲烷中偶联。利用诸如三氟乙酸或哌啶的试剂从所得的肽-树脂移去α-N-氨基甲酰基保护基,并重复偶联反应,向肽链加入下一个期望的N-保护的氨基酸。适当的N-保护基是本领域公知的,包括叔丁氧羰基(tBoc)和芴甲氧羰基(Fmoc)。
术语“肽”不仅包括其中氨基酸残基被肽(-CO-NH-)键连接的分子,还包括在其中肽键被倒转的分子。这样的逆反(retro-inverso)模拟肽可使用本领域已知的方法制备,例如诸如Meziere等人(1997)J.Immunol.159,3230-3237中描述的那些。该方法包括制备包含涉及骨架的变化而非侧链取向变化的拟肽。Meziere等人(1997)显示,至少对于II类MHC和T辅助细胞应答,这些拟肽是有用的。包含NH-CO键而非CO-NH肽键的逆反肽对蛋白水解更加耐受。
类似地,可完全不需要肽键,条件是使用保持氨基酸残基的碳原子之间间距的合适的连接体部分;如果所述连接体部分具有与肽键大致上相同的电荷分布和大致上相同的平面性,它是特别优选的。还应理解的是,可方便地在其N-或C-末端封闭所述肽,以帮助减少对外切蛋白水解消化的敏感性。例如,可通过与羧酸反应保护肽的N-末端氨基,而且可通过与胺反应保护肽的C-末端羧基。修饰的其它实例包括糖基化和磷酸化。另外的潜在修饰是R或K侧链胺上的氢可被亚甲基代替(-NH2被-NH(Me)或-N(Me)2代替)。
根据本发明的肽的类似物还可包括增加或减少肽的体内半衰期的肽变体。能够增加按照本发明使用的肽的半衰期的类似物的实例包括肽的类肽类似物、肽的D-氨基酸衍生物和肽-类肽杂合体。按照本发明使用的变体多肽的另外的实施方案包括多肽的D-氨基酸形式。使用D-氨基酸而非L-氨基酸制备多肽大大减少正常代谢过程对这种药剂的任何不期望的破坏,减少待施用的药剂的量以及施用频率。
关注的肽
关注的肽通常包括至少一个游离半胱氨酸残基。“游离”(free)通常表示在抑制二聚体形成的剂不存在时,半胱氨酸残基可用于与其它含半胱氨酸的肽的化学修饰和/或二聚化。换言之,游离半胱氨酸是包含还原形式(-SH)硫醇基的半胱氨酸,在抑制二聚体形成的剂不存在时,能够与带有也为还原形式(-SH)的硫醇基的另一半胱氨酸进行氧化反应以形成二硫键(-S-S-)。
关注的肽还通常包含包括来源于变应原或同种-抗原的至少一个结合MHC的T细胞表位的区域。因此,包含关注的肽的水溶液通常能够在对变应原敏化的个体诱导晚期应答。术语“晚期应答”包括列在Allergy andAllergic Disease(变态反应和变应性疾病)(1997)A.B.Kay(编辑),Blackwell Science,第1113-1130页中的含义。晚期应答可以是任何晚期应答(LPR)。优选地,包含来源于蛋白变应原的表位的组合物能够引起晚期哮喘性应答(LAR),或晚期鼻炎性应答,或晚期皮肤应答,或晚期眼部应答。可使用本领域公知方法,确定特定的组合物是否能够产生LPR;特别优选的方法描述于Cromwell O,Durham SR,Shaw RJ,Mackay J和KayAB.Provocation tests and measurements of mediators from mast cells andbasophils in asthma and allergic rhinitis(哮喘和变应性鼻炎中来自肥大细胞和嗜碱性细胞的介质的激发测试和测量).于Handbook of ExperimentalImmunology(实验免疫学手册)(4)第127章,编辑:Weir DM,BlackwellScientific Publications,1986。因此,优选地,本发明的单独组合物能够在已经对表位源自的蛋白变应原敏感的个体中诱发LPR。
可通过公知程序确定个体是否已经对表位源自的蛋白敏化,诸如检测个体血液或血清中对该蛋白特异性的抗体。当表位来源于变应原时,对变应原敏化的适当检测包括使用蛋白提取物溶液的皮肤点刺测试、皮肤LPR的诱发、临床史、变应原攻击和用于测量蛋白特异性IgE的放射变应原吸附试验(RAST)。可由医师基于例如这样的试验或测定来确定特定个体是否被预期得益于治疗。
使得个体对表位源自的蛋白脱敏或耐受表示在适当地敏化的个体中抑制或减弱由所述蛋白诱发的免疫组织反应。已显示,可选择性地活化T细胞,并随后使之无应答性。此外,使这些T细胞无反应或将其消除导致患者对特定的蛋白脱敏。脱敏本身表现为在第二次或进一步施用该蛋白或蛋白衍生的肽时,减少或优选地消除对蛋白或蛋白衍生的肽的应答。第二次施用可在经过允许脱敏发生的合适时间段后进行;这优选地为一天到数周之间的任何期间。大约两周的间隔是优选的。
尽管本发明的组合物能够在已对该蛋白敏化的个体中诱发LPR,应理解的是,当组合物被用于治疗患者时,优选地使用足够低浓度的组合物,以致不发生可观察到的LPR,但应答将足以部分地将T细胞脱敏,以致可给予下一(优选地更高的)剂量,如此继续。以这种方式,建立起提供完全的脱敏,但通常从来不在患者中诱发LPR的剂量。然而,该组合物或肽能够在比施用的更高的浓度下做到这样。
本发明的组合物通常在个体中具有减少的激发早期应答的能力。“减少的激发早期应答的能力”应理解为,相对于包含具有与本发明的组合物相同的区域的肽,但其序列没有被修饰以减少二聚体形成、并缺少减少二聚体形成的剂的组合物,本发明的组合物将导致更低严重度的早期症状(诸如嗜碱性细胞或肥大细胞脱粒)。因此,本发明的组合物将产生比主要以二聚形式存在的相当肽少的早期应答。肽是相当的,因为其包含相同的结合II类MHC的T细胞表位。
可选地或另外,本发明的组合物通常具有改进的在个体中诱导耐受的能力。“改进的诱导耐受的能力”应理解为,相对于包含具有与本发明的组合物相同的区域的肽,但其序列没有被修饰以减少二聚体形成、并缺少减少二聚体形成的剂的组合物,本发明的组合物将导致更大程度的脱敏。因此,本发明的组合物将产生比主要以二聚形式存在的相当肽更大程度的脱敏。肽是相当的,因为其包含相同的结合II类MHC的T细胞表位。
脱敏如上定义,其水平可由任何适当的手段表征。例如,在变应性哮喘中,响应于吸入表位源自的蛋白(或蛋白衍生肽)而产生的较小LAR将指示在用本发明的组合物治疗后较大程度的脱敏。LAR的大小可由本领域任何适当的手段来评价,所述手段例如,检测个体施用蛋白后用力呼气量(Forced Expired Volume,FEV)的减少。FEV更大的减少指示更大的LAR。本发明的组合物导致的LAR优选地比包含主要以二聚形式存在的相当肽的组合物小至少10%、20%、30%、40%或50%。
可选地,更大程度的脱敏可由T细胞引起的炎性细胞因子的蛋白-特异性产生的更大的减少来指示,所述炎性细胞因子诸如干扰素γ、白介素4和白介素13。T细胞引起的细胞因子产生可由任何适当方法检测,例如ELISA、ELISPOT测定或流式细胞术测定。尤其优选的方法包括多路微珠阵列测定,如描述在例如de Jager等;Clinical and Diagnostic LaboratoryImmunology(临床和诊断实验免疫学),2003,第10(1)卷,第133-139页。“更大的减少”优选地是以本发明的组合物治疗与包含主要以二聚形式存在的相当肽的组合物相比,导致炎性细胞因子的产生减少优选至少10%、20%、30%、40%或50%。
本发明的优选组合物包括包含来源于以下的表位的至少一种肽或由来源于以下的表位组成的至少一种肽:
选自以下的变应原:植物变应原(尤其是草变应原(grass allergen))、动物皮屑变应原、霉菌或真菌变应原、粉尘变应原、抗生素或其它药物、叮刺昆虫毒液、环境变应原或食物变应原;或
选自与以下有关的主要抗原的抗原:急性播散性脑脊髓炎(ADEM);阿狄森氏病;强直性脊柱炎;抗磷脂抗体综合征(APS);再生障碍性贫血;自身免疫性肝炎;自身免疫性卵巢炎;腹部疾病;克罗恩病;1型糖尿病;妊娠性类天疱疮;古德帕斯丘综合征;格雷夫斯氏病;吉兰-巴雷综合征(GBS);桥本氏病;特发性血小板减少性紫癜;川崎氏病;红斑狼疮;多发性硬化;重症肌无力;发作性睡病(narcolepsy)、眼阵挛-肌阵挛综合征(OMS);视神经炎;Ord甲状腺炎;天疱疮;恶性贫血;犬的多关节炎;原发性胆汁性肝硬变;类风湿性关节炎;莱特尔氏综合征;斯耶格伦氏综合征;高安氏动脉炎;颞动脉炎(也称为“巨细胞动脉炎”);温抗体型自身免疫性溶血性贫血(Warm autoimmune hemolytic anemia);或韦格纳氏肉芽肿病。
尤其优选的表位来源于以下的同种型:猫皮屑蛋白Fel d1;屋尘螨蛋白Der p 1、Der p 2、Der p 7、Der p 3至15、Der p 18、20、21和23、Derf1、2、7、10、11至18和20至22;豚草蛋白amb a 1、2、3、5、6、7、8、9和其同种型,包括amb a 1.1、a 1.2、a1.3或a1.4;黑麦草蛋白lol p1和lol p5;梯牧草蛋白phl p1和phl p5;百慕大草蛋白Cyn d 5;链格孢(Alternaria alternata)蛋白Alt a 1、Alt a 2、Alt a 3至Alt a 10、Alt a 12、Alt a 13和烯醇酶(Alt a 6)、Cla h 1、2、5至10、12、GST、HCh1、HSP70、NTF2、TCTP;桦树蛋白Bet v1、2、3、4、6、7、8和P14;德国小蠊蛋白Bla g 1、Bla g 2、Bla g 3、Bla g 4、Bla g 5和Bla g 6、7、8、9、GSTD1、胰蛋白酶;艾属植物(Mugwort)蛋白Art v 1;俄国蓟(Russian thistle)蛋白Sal k 1、Sal k 2和Sal k 8;花生Ara h1、Ara h2、Ara h3、Ara h4、Ara h5、Ara h6、植物抑制蛋白(profilin)或脂转移蛋白或人类白细胞抗原。
尤其优选的肽包括以下序列或由以下序列组成(通过参照相关变应性病症或自身免疫病症/同种免疫病症来排序):
以上显示的屋尘螨序列通常来源于螨物种屋尘螨(Dermatophagoidespteronyssinus)。这些序列的优选变体包括来源于相关的螨物种粉尘螨(Dermatophagoides farinae)的同源序列。这些在下表中以标识符“_f”指示。
本发明的肽的其它优选变体包括在指定肽N末端和/或C末端的1、2、3、4、5、6、7、10、11、12、13、14、15、16或17个氨基酸的截短或延伸。屋尘螨肽HDM03C的优选延伸和截短的实例也在以下显示为HDM03M、P和W。
HDM03C_f | RNTSLDLSEQELVDCASQH | 51 |
HDM03M | RNQSLDLAEQELVDCASQHG | 52 |
HDM03P | SAYLAHRNQSLDLAEQELVDCAS | 53 |
HDM03W_n | ELVDCASQHG | 54 |
HDM06_f | PYVAREQRCRRPN | 55 |
HDM19_f | DQVDVKDCANNEIKK | 56 |
HDM20_f | CIIHRGKPFTLEA | 57 |
HDM26A_f | NGVLACAIATHGKIR | 58 |
当多肽包含通常难以在制造期间保存的残基时,这些残基可被代替。例如,谷氨酸或谷氨酰胺残基在溶液中自发形成焦谷氨酸,尤其当在肽N末端存在时。因此,本发明的肽中对应于天然蛋白序列的序列中谷氨酸或谷氨酰胺的残基可被本发明的肽中的焦谷氨酸代替,此时这样的残基存在于肽的N末端。例如,HDM03W_n(SEQ ID NO:54)在N末端可用焦谷氨酸代替E。
在一个实施方案中,本发明的组合物包含SEQ ID NO.1至4的肽。组合物可进一步包含SEQ ID NO.83至85的肽,任选地没有另外的肽。
其它组分
如从以上关于冻干的部分可理解的,待冻干的组合物通常包含其它组分以及关注的生物材料。本发明涉及使用其它组分的组合来阻止或减少本发明的组合物中至少一种肽的二聚化,从而形成更稳定的冻干组合物。本发明还涉及制造这样的组合物的方法。本发明人已经确定,(i)非还原性糖与(ii)抑制二聚体形成的至少一种剂的组合实现这一作用。
如本文所述,糖和相关化合物具有可用作冻干过程中的冷冻保护剂和冻干保护剂的优势。然而,其不能阻止最终冻干产物中包含的肽在其储存期间的二聚体形成。需要其它组分来实现这一作用。即,必须还包含抑制肽形成二聚体的至少一种剂。为了药物目的,肽组合物中抑制二聚体形成的剂通常必须是药学上可接受的。这样的剂包括适于还原二硫键的剂、抗氧化剂或防腐剂。适当的还原剂包括任何三烷基膦化合物,包括三(2-羧乙基)膦(TCEP)、2-巯基乙醇和二硫苏糖醇(DTT)。其它适当的剂包括硫代甘油、苯硫基甲烷和半胱氨酸。尤其优选硫代甘油。
为了有效地阻止二聚体形成,在冷冻前测量时,这样的剂应理想地以与易于形成二聚体的材料至少等摩尔的浓度存在。因此,当易于形成二聚体的材料是包括至少一个游离半胱氨酸残基的一种或多种肽时,剂以与包括至少一个游离半胱氨酸残基的一种或多种肽的浓度至少等摩尔的浓度存在。通常不考虑其它组分,诸如不包括游离半胱氨酸残基的肽的浓度。即,当组合物包含例如四种包括游离半胱氨酸残基的肽和三种不包括游离半胱氨酸残基的肽时,抑制二聚体形成的剂的浓度相对于四种包括游离半胱氨酸的肽的总浓度来确定。三种不包括半胱氨酸的肽的浓度和组合物中任何其它组分的浓度与所需剂的水平不相关。
在一个实施方案中,在冷冻前测量时,抑制二聚体形成的至少一种剂可以比易于形成二聚体的材料多或少的量存在,只要有效地阻止了二聚体形成。在一个具体实施方案中,剂以比易于形成二聚体的材料多的量存在。例如,剂可以比易于形成二聚体的材料的摩尔浓度大至少大约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900或1000倍的摩尔浓度存在。优选地,剂可以比易于形成二聚体的材料的摩尔浓度大至少60至80倍的摩尔浓度存在。例如,当材料以200μM的摩尔浓度存在时,剂优选地以12mM至16mM的摩尔浓度存在。
这样的情况适用于例如,实施例4中的硫代甘油“低”组合物,其中包括至少一个游离半胱氨酸的四种肽各以50μM存在,不包括半胱氨酸的三种肽也各以50μM存在。因此,在一升这种组合物中,有350微摩尔的总肽(七种肽)和200微摩尔带有游离半胱氨酸的肽(带有游离半胱氨酸的4种肽)。因此,易于形成二聚体的材料为200μM,硫代甘油以14mM的浓度存在,大70倍。
可选地剂,剂可以比易于形成二聚体的材料的摩尔浓度大至少30至40倍的摩尔浓度存在。例如,当材料以400μM的摩尔浓度存在时,剂优选地以12mM至16mM的摩尔浓度存在。
如果所有肽以100μM而不是50μM存在,这样的情况将适用于例如,实施例4中的硫代甘油“低”组合物。因此,在一升这种组合物中,存在700微摩尔的总肽(七种肽)和400微摩尔带有游离半胱氨酸的肽(带有游离半胱氨酸的4种肽)。因此,易于形成二聚体的材料为400μM,且硫代甘油以14mM的浓度存在,大35倍。
材料通常是包括至少一个游离半胱氨酸残基的至少一种肽。冷冻前组合物中存在的肽量比例的下限通常是约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4或1.5%wt/wt或w/v。冷冻前组合物中存在的肽量比例的上限通常是约1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、3、4或5%wt/wt或w/v。应认识到,肽的量通常可以是在以上列出的任何下限独立地连同以上列出的任何上限之间。因此,抑制二聚体形成的至少一种剂将以组合物的相似比例范围存在,只要剂的总浓度至少是冷冻前组合物中包括至少一个游离半胱氨酸残基的肽的总浓度的等摩尔浓度。例如,如果包括至少一个游离半胱氨酸残基的肽的总浓度是0.03nmol/ml,剂的总浓度将是至少0.03nmol/ml。如果包括至少一个游离半胱氨酸残基的肽的总浓度是500nmol/ml,剂的总浓度将是至少500nmol/ml。
还应认识到,通常可以包括相对于如上解释的肽的较高比例的至少一种剂,例如以确保有效减少二聚体形成。此外,剂总浓度的上限通常可考虑临床需求或应用于药物组合物时的限制。例如,注射用重构溶液通常具有不超过0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5或4.0%wt/wt或w/v的剂。这在冻干产物中分别对应于大约5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35或40%wt/wt或w/v。因此,可需要限制产物中肽的量以符合这些临床需求。
本领域技术人员应理解的是,冷冻前组合物中任何组分的比例通常将对应于最终冻干组合物中高约5至10倍的比例。
在冻干组合物中包含抑制二聚体形成的至少一种剂的困难在于,如本发明人确定的,这样的剂从冻干产物逸出,尤其当所述产物在室温储存延长的时间段时,或当所述产物暴露于温度的突然升高时。剂通常是易挥发的,因此不保持在最终产物中,这样的最终产物在储存和运输期间经历破坏和降解,从而减少其稳定存放时间,或对于药物用途是不可接受的。例如,由于冻干组合物或从其重构的溶液的外观改变。
为了克服这一困难,本发明人设想了非还原性糖与二聚体抑制剂的组合,其不导致所述剂从最终冻干产物逃逸。为了实现这一目的,冻干组合物必需具有无定形结构。因此,尤其适于用于本发明的非还原性糖是在冻干时为无定形的糖,此后称为“无定形糖”。为了确保组合物作为整体在冻干时具有无定形结构,按冻干组合物总组分的比例计,本发明组合物中的一种或多种无定形糖通常应以至少50%的量存在,但更优选地至少60%、70%或80%,最优选地至少90%。
可选地,总体无定形结构可在作为组合物总组分的比例的无定形糖比例低于50%时实现。如果联合使用无定形糖与在冻干时结晶的糖,此后称为“结晶糖”,可实现这一目的。然而,为了这样的组合保持其中分散关注的生物分子的某种无定形结构,通常在冻干过程的冷冻阶段期间必需对组合物进行循环加热和冷却。这一循环加热和冷却通常称为退火,当以适当条件进行时,其可导致混合的结晶/无定形饼状物结构的形成。在这一情形,本发明的组合物中的一种或多种无定形糖通常以按组合物总组分的比例计至少20%的量存在。
对于本发明的用途尤其优选的糖包括麦芽酮糖、异-麦芽酮糖、乳果糖和蔗糖、麦芽糖、乳糖、异麦芽糖和其糖醇、麦芽糖醇、拉克替醇、帕拉金糖醇(palatinit)、α-D-吡喃葡糖基-甘露醇和α-D-吡喃葡糖基-山梨醇的混合物,和其个体糖醇、选自糖醇的多羟基化合物的非还原性糖苷、其它直链多元醇、海藻糖、蔗糖、棉子糖、水苏糖、松三糖和葡聚糖。
优选的糖是非还原性二糖、三糖和四糖,包括海藻糖、蔗糖、棉子糖、水苏糖和松三糖。尤其优选海藻糖。
理想地,为了最佳的稳定性,糖应具有比最终冻干产物的最高预期储存温度高至少5℃、10℃、15℃或最优选地20℃的Tg(玻璃化转变温度)。一些优选的糖的Tg和相关参数的报告值显示如下。
化合物 | Tg(℃) | Tg’ |
蔗糖 | 43-65 | 大约-46 |
棉子糖 | 70-106 | 大约-36 |
海藻糖 | 63-115 | 大约-27 |
松三糖 | >100 | |
水苏糖 | 81-123 |
Tg=玻璃化转变温度;Tg’=最大冷冻浓缩状态的Tg;
如本文证明的,冻干糖的无定形结构将抑制二聚体形成的剂捕获在最终冻干产物中。这与在冻干时具有结晶结构的材料不同。先前以优选结晶或混合/无定形物质用于本文所述的这种类型的冻干应用,部分是因为最终冻干“饼状物”通常具有更有吸引力的外观,并可采用缩短的更强烈的干燥循环。
因此,本发明涉及(i)至少一种非还原性糖和(ii)抑制二聚体形成的至少一种剂在包含包括游离半胱氨酸残基的至少一种肽的冻干组合物中的用途,其中该用途是为了阻止或减少所述组合物中所述至少一种肽二聚化。抑制二聚体形成的至少一种剂通过至少一种糖的无定形结构被保持在冻干产物中,从而能够在产物的储存寿命期间减少或阻止其中的一种或多种肽的二聚化。以这种方式实现稳定存放时间,其理想地为在5±3℃、25℃/60%RH、30℃/65%RH或40℃/75%RH至少1年或至少2年。
根据以上,本发明的优选实施方案涉及(i)选自海藻糖、蔗糖、棉子糖、水苏糖或松三糖的至少一种非还原性糖和(ii)硫代甘油在包含包括至少一个游离半胱氨酸残基的至少一种肽的冻干组合物中的用途,其中所述用途是为了阻止或减少所述组合物中所述至少一种肽的二聚化。
在尤其优选的实施方案中,非还原性糖是海藻糖或蔗糖,最优选地是海藻糖。
尽管不希望被任何具体假设限制,发明人认为这一实施方案尤其有利,因为硫代甘油充分保持在冻干饼状物中。此前认为硫代甘油较不适于掺入冻干组合物,因为其在通常冻干条件下本身不冷冻形成玻璃状物,即,其在低至-80℃的温度仍保持液态。然而,在本发明中,证明可保持硫代甘油,尤其连同海藻糖,没有任何逃逸迹象或对冻干饼状物的物理性质的任何负面影响。硫代甘油的存在有效阻止组合物中肽二聚体形成。
本发明的重构组合物
应理解的是,根据本发明制造的冻干组合物可在溶液中重构,通常在适于注射的水溶液中,诸如无菌、无热原水。理想地,溶液将是等张力/等渗的,从而适于肠胃外注射。
重构组合物通常具有最小比例的以二聚体存在的肽。即,二聚体形成被有效阻止。最小比例的以二聚体存在的肽是指,在溶液中以最多5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.05%或0.01%的二聚体存在。应理解的是,在溶液中以二聚体存在的肽的比例将是在溶液中适当的时间段后以二聚体存在的比例。适当的时间段包括本领域技术人员可能合理预计使用前在溶液中保留序列的时间范围。例如,约24小时、约48小时或约72小时。以指定形式存在的肽的比例可由任何适当的方法评价。
重构组合物通常是用于使个体对组合物中包含的肽源自的蛋白耐受或免疫的药物制剂。如此,重构组合物可包含一种或多种药学上可接受的载体或稀释剂和任选地一种或多种其它治疗成分。载体必须在与制剂的其它成分相容(尤其是必须不促进二聚体形成)且不危害其接受者的意义上是“可接受的”。通常,用于注射的载体和最终制剂是无菌和无热原的。其它组分可能已在冻干组合物中存在,或可能在重构期间或重构后加入。因此,可存在辅助物质,诸如润湿剂或乳化剂、pH调整物质或缓冲物质、抗氧化剂、螯合剂等等。这些赋形剂、媒介物和辅助物质通常是在接受组合物的个体中不诱发免疫应答,而且可被施用而没有异常毒性的药剂。药学上可接受的赋形剂包括但不限于液体,诸如水、盐水、聚乙二醇、透明质酸和乙醇。其中还可包括药学上可接受的盐,例如,无机酸盐,诸如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等等;以及有机酸盐,诸如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等等。关于药学上可接受的赋形剂、媒介物和辅助物质的详尽论述可在Remington’s Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学)(Mack Pub.Co.,N.J.1991)中获得。
本发明的组合物将包含有效而不导致不良反应的适当浓度的每种肽。通常,为了用于耐受作用,组合物中每种肽的浓度将在0.03至500nmol/ml或0.03至200nmol/ml的范围中。更优选地在0.3nmol/ml至200nmol/ml、3nmol/ml至180nmol/ml、10nmol/ml至150nmol/ml或30nmol/ml至120nmol/ml的范围中。尤其优选的是3至12nmol/ml的范围。组合物应具有大于90%、或95%或98%的纯度或至少99%的纯度。注射体积通常可以是60μl或120μl。
因此,可配制一种组合物,其包括本发明的分子和/或细胞以及还有一种或多种其它治疗分子。可选地,本发明的组合物可与作为组合治疗的一部分的一种或多种其它治疗组合物同时、顺序或分别地使用。
通常,为了用于免疫,组合物将呈现出在重构后允许施用1μg至10mg的每种肽。更优选地每种肽的量在3μg至5mg、5μg至5mg、10μg至2mg或20μg至1mg的范围中。每种肽的浓度将取决于施用途径,但通常可皮内、皮下、肌内、静脉内、口服、鼻内或通过吸入递送。组合物应具有大于90%、或95%或98%的纯度或至少99%的纯度。
治疗方法和待治疗的个体
本发明涉及包含能够调节个体免疫系统的至少一种肽的组合物。
“调节”可以指敏化或诱导个体对本发明组合物的至少一种肽源自的蛋白的免疫性。在这种情况,蛋白通常是肿瘤抗原蛋白或来自传染病的抗原蛋白,诸如肝炎和人乳头瘤病毒导致的传染病。因此,本发明的组合物可用于预防或治疗癌症或传染病。
可选地,“调节”可以指使个体对本发明组合物的至少一种肽源自的蛋白脱敏或耐受。在这种情况,蛋白通常是变应原或不期望对其免疫应答的其它抗原。这样的抗原的实例包括与自身免疫疾病相关的抗原、与移植物抗宿主病或移植排斥(在本文也指同种免疫病症)相关的抗原、和与母体-胎儿免疫应答,例如恒河猴D新生儿溶血病相关的抗原。因此,本发明的组合物可用于预防或治疗变应性疾病、自身免疫疾病、同种免疫病症或母体-胎儿免疫应答。
本发明提供用于预防或治疗上述病症的组合物。本发明还提供预防或治疗患有上述病症的受治疗者的方法,包括施用本发明的重构组合物。将用本发明的组合物治疗或向其提供本发明的组合物的个体优选地是人类。
当期望脱敏/耐受时,应理解的是,待治疗的个体可以已知是对具体变应原或抗原敏感,处于被敏化的风险或怀疑被敏化。可使用本领域公知和本文所述的技术来测试个体的敏化作用。可选地,个体可具有上述病症的家族病史。可能不必测试个体对变应原的敏化作用,因为当接近于适当的变应原来源时,个体可展现变态反应的症状。接近表示距离来源10米或更少、5米或更少、2米或更少、1米或更少或者0米。变态反应的症状可包括眼痒、流鼻涕、呼吸困难、皮肤红痒或皮疹。待治疗变态反应病的个体可能已具有变态反应达至少2周、1个月、6个月、1年或5年。个体可患有变态反应导致的皮疹、鼻充血、流鼻涕和/或咳嗽。个体可能已被或未被施用治疗变态反应的其它组合物/化合物。
通常,待治疗的个体可以是任何年龄。然而,优选地,该个体可处于1至90、5至60、10至40或更优选地18至35的年龄组。优选地,待治疗的个体来自具有在白种人群体中有代表性的频率范围内的MHC等位基因频率的群体。11个常见DRB1等位基因家族的参考群体等位基因频率显示如下:
通过分析报告频率的多个研究来获得参照频率,而所示数字是平均值。因此优选地,待治疗的个体来自如下群体:其具有与上表所指的等位基因(诸如至少1、2、3、4、5种或所有等位基因)的参照群体相等的MHC等位基因频率,例如在这些数字加或减1%、2%、3%、5%、10%、15%或20%的范围内。
优选地,个体来自这样的群体,其中如下DRB1等位基因的等位基因频率是:
4-至少9%
7-至少10%
11-至少8%。
本发明尤其适用于需要接受本发明的组合物的多次施用的个体。比本发明的肽更易于形成二聚体的肽更可能在接受多次施用的个体引起副反应。因为单体肽通常比二聚肽炎性低,本发明也尤其适于向患有病症或处于患病症风险的个体施用,其中病症的特征是对包含肽的疗法的不良炎症反应。对包含肽的疗法的不良炎症反应可诊断为在施用包含肽的疗法后,如上定义的变态反应的任何症状的发作的结果。个体可能因为任何适当的医学原因而被认为处于这样的反应风险中,例如,类似反应的家族病史、多种变应性反应的个人病史、或对常见变应原的强烈阳性皮肤点刺或皮肤贴片反应。
以下实施例阐释本发明:
实施例
以下实施例和比较实施例显示不同组合物在不同储存条件下的表现。每种不同组合物包含由SEQ ID NO:1至4的序列组成的肽(肽MLA01、04、05和12)和三种其它肽:MLA03(EQVAQYKALPVVLENA(SEQ IDNO:84))、MLA07(KENALSLLDKIYTSPL(SEQ ID NO:85))和MLA14(SRVLDGLVMTTISSSK(SEQ ID NO:86))。
在每种情形,在进行冻干之前,在溶液中制备组合物。选择对每种组合物适当的冻干条件,显示每种的典型冻干循环。冻干过程期间肽的降解通过比较在过程之前和之后溶液样品中肽降解水平来测量。检验的所有组合物在冻干过程期间仅经历肽的微量降解(数据未显示)。
冻干后,将每种组合物的样品储存在多种不同条件(-80℃、5℃、25℃/65%RH、40℃/75%RH)(RH:相对湿度)下达28周。最终冻干产物储存期间的降解通过以一定间隔重构样品并比较肽降解水平与新鲜制备的MLA07标准溶液来监测。
在检验的每种组合物中,唯一易挥发组分是硫代甘油。因此,硫代甘油的保持通过观察储存管瓶壁上是否存在冷凝来确定。
实施例1-海藻糖制剂
典型冻干循环
步骤 | 搁板温度(℃) | 室压力(mbar) | 持续时间(h.min) |
1 | 20 | 1000 | 0 |
2 | -40 | 1000 | 00.36 |
3 | -40 | 1000 | 1.30 |
4 | -24 | 0.05 | 2.00 |
5 | -24 | 0.05 | 24.00 |
6 | 24 | 0.05 | 9.20 |
7 | 24 | 0.05 | 6.00 |
非-肽组分(括号中的数值表示以mM计的浓度)
海藻糖/硫代甘油/甲硫氨酸(250∶46∶5)。
特征
Tg′=-31.9℃
Tg=83-87℃(第一次运行)
残余水分=未检测
WAXS衍射图:完全无定形
硫代甘油的保持极佳。对于所有储存条件,在管瓶壁上未观察到冷凝。硫代甘油明显固定在无定形饼状物中。
饼状物外观是破裂的,所以不是美学上令人愉悦的,但储存稳定性极佳,如图17至19所示。大约8周后,除了检验的极端条件(40℃/75%RH)以外未观察到显著的肽降解。
实施例2-‘无定形的’二元混合物系列
典型冻干循环
步骤 | 搁板温度(℃) | 室压力(mbar) | 持续时间(h.min) |
1 | -40 | 1000 | 0 |
2 | -40 | 1000 | 1.00 |
3 | -15 | 0.03 | 0.30 |
4 | -15 | 0.03 | 20.00 |
5 | 30 | 0.03 | 0.25 |
6 | 30 | 0.03 | 8.00 |
2A
非-肽组分(括号中的数值表示以mM计的浓度)
海藻糖/甘氨酸/硫代甘油/甲硫氨酸(165∶95∶46∶5)
特征
Tg′=-36.7℃
Tg=62.5℃
残余水分=0.61%w/v
饼状物结构:完全无定形
硫代甘油的保持极佳。对于所有储存条件,在管瓶壁上未观察到冷凝。硫代甘油明显固定在无定形饼状物中。
饼状物外观是破裂的,所以不是美学上令人愉悦的,但储存稳定性极佳,如图20至23所示。除了检验的极端条件(40℃/75%RH)以外,未观察到显著的肽降解,在此极端条件观察到肽含量持续下降。
2B
非-肽组分(括号中的数值表示以mM计的浓度)
蔗糖/甘氨酸/硫代甘油/甲硫氨酸(182∶78∶46∶5)
特征
Tg′=-37.8℃
Tg=38.6℃
残余水分=0.56%w/v
WAXS衍射图:完全无定形
硫代甘油的保持没有实施例2A好,在25℃/65%RH储存时在管瓶壁上观察到冷凝。硫代甘油明显未完全固定在无定形饼状物中。
饼状物外观是破裂的,所以不是美学上令人愉悦的,但储存稳定性良好,如图24至27所示。仅在检验的最极端条件观察到显著的肽降解:25℃/65%RH(显示明显下降,尤其5周后)和40℃/75%RH(显示非常差的肽稳定性)。
2C
非-肽组分(括号中的数值表示以mM计的浓度)
海藻糖/甘露醇/硫代甘油/甲硫氨酸(160∶100∶46∶5)
特征
Tg′=-36.6℃
Tg=51.6℃
残余水分=0.42%w/v
WAXS衍射图:完全无定形
硫代甘油的保持没有实施例2A好,在25℃/65%RH储存时在管瓶壁上观察到冷凝。硫代甘油明显未完全固定在无定形饼状物中。
饼状物外观是破裂的,所以不是美学上令人愉悦的,但储存稳定性良好,如图28至31所示。除了检验的最极端条件(40℃/75%RH)以外未观察到显著的肽降解,在此条件观察到肽含量持续下降。在25℃/65%RH的稳定性良好,尽管不如例如2A同样好。
2D
非-肽组分(括号中的数值表示以mM计的浓度)
蔗糖/甘露醇/硫代甘油/甲硫氨酸(150∶110∶46∶5)
特征
Tg′=-38.7℃
Tg=未检测(<25℃)
残余水分=0.34%w/v
WAXS衍射图:完全无定形
硫代甘油的保持没有实施例2A好,在25℃/65%RH储存时在管瓶壁上观察到冷凝。硫代甘油明显未完全固定在无定形饼状物中。
饼状物外观是破裂的,所以不是美学上令人愉悦的,但储存稳定性没有其它制剂好,如图32至35所示。仅在25℃/65%RH(差的稳定性)和40℃/75%RH(非常差的稳定性)观察到肽降解。
比较实施例1-甘露醇系列
典型冻干循环
步骤 | 搁板温度(℃) | 室压力(mbar) | 持续时间(h.min) |
1 | 20 | 1000 | 0 |
2 | -5 | 1000 | 00.25 |
3 | -5 | 1000 | 00.30 |
4 | -40 | 1000 | 1.10 |
5 | -40 | 1000 | 1.00 |
6 | -20 | 1000 | 0.20 |
7 | -20 | 1000 | 4.30 |
8 | -40 | 1000 | 0.20 |
9 | -40 | 1000 | 1.00 |
10 | -15 | 0.09 | 0.50 |
11 | -15 | 0.09 | 14.00 |
12 | 25 | 0.05 | 6.00 |
13 | 25 | 0.05 | 12.00 |
C1A
非-肽组分(括号中的数值表示以mM计的浓度)
甘露醇/硫代甘油(265∶14)
特征
Tg′=无
Tg=无
残余水分=0.75%w/v
饼状物结构:结晶
硫代甘油的保持差。对于所有储存条件,在管瓶壁上观察到冷凝。硫代甘油明显未固定在结晶饼状物中。
饼状物外观好,所以是美学上令人愉悦的,但储存稳定性差,如图1至4所示。除了最有利的条件(-80℃)以外,在所有条件观察到显著的肽降解。这种储存条件对于药物产物不可能是市售可行的。
C1B
非-肽组分(括号中的数值表示以mM计的浓度)
甘露醇/硫代甘油(265∶46)
特征
Tg′=无
Tg=无
残余水分=0.33%w/v
饼状物结构:结晶
硫代甘油的保持差。在管瓶壁上观察到类似C1A程度的冷凝。硫代甘油明显未固定在结晶饼状物中,即使以更高浓度存在时。
饼状物外观好,所以是美学上令人愉悦的,但储存稳定性差,如图5至8所示。除了最有利的条件(-80℃)以外,在所有条件观察到显著的肽降解。
C1C
非-肽组分(括号中的数值表示以mM计的浓度)
甘露醇/硫代甘油/甲硫氨酸(265∶14∶5)
特征
Tg′=无
Tg=无
残余水分=1.04%w/v
饼状物结构:结晶
硫代甘油的保持差。在管瓶壁上观察到类似C1A程度的冷凝。在甲硫氨酸存在时,硫代甘油明显未固定在结晶饼状物中。
饼状物外观好,所以是美学上令人愉悦的,但储存稳定性差,如图9至12所示。除了最有利的条件(-80℃)以外,在所有条件观察到显著的肽降解。甲硫氨酸未改进这一组合物的特性。
C1D
非-肽组分(括号中的数值表示以mM计的浓度)
甘露醇/硫代甘油/甲硫氨酸(265∶46∶5)
特征
Tg′=无
Tg=无
残余水分=0.61%w/v
饼状物结构:结晶
硫代甘油的保持差。在管瓶壁上观察到类似C1A程度的冷凝。即使以更高浓度存在和在甲硫氨酸存在时,硫代甘油明显未固定在结晶饼状物中。
饼状物外观好,所以是美学上令人愉悦的,但储存稳定性差,如图13至16所示。除了最有利的条件(-80℃)以外,在所有条件观察到显著的肽降解。甲硫氨酸未改进这一组合物的特性。
比较实施例2-‘结晶’二元混合物海藻糖系列
典型冻干循环
步骤 | 搁板温度(℃) | 室压力(mbar) | 持续时间(h.min) |
1 | 20 | 1000 | 0 |
2 | -40 | 1000 | 00.36 |
3 | -40 | 1000 | 1.30 |
4 | -24 | 0.05 | 2.00 |
5 | -24 | 0.05 | 24.00 |
6 | 24 | 0.05 | 9.20 |
7 | 24 | 0.05 | 6.00 |
C2A
非-肽组分(括号中的数值表示以mM计的浓度)
甘露醇/海藻糖/硫代甘油/甲硫氨酸(245∶10∶46∶5)
特征
Tg′=-58.3℃
Tg=70-73℃
Tm=约160℃
残余水分=0.11%w/v
饼状物结构:结晶(不完全)
硫代甘油的保持差。在25℃和40℃6周后,在管瓶壁上观察到冷凝。硫代甘油明显未固定在结晶饼状物中。
饼状物外观好,所以是美学上令人愉悦的,但储存稳定性差,如图36至39所示。除了两种最有利的条件(5℃和-80℃)以外,在所有条件观察到显著的肽降解。
C2B
非-肽组分(括号中的数值表示以mM计的浓度)
甘露醇/海藻糖/硫代甘油/甲硫氨酸(235∶20∶46∶5)
特征
Tg′=未检测
Tg=未检测
Tm=未检测
残余水分=未检测
饼状物结构:结晶(不完全)
硫代甘油的保持差。尤其在25℃和40℃,在管瓶壁上观察到冷凝。即使以更高浓度的海藻糖,硫代甘油明显未固定在结晶饼状物中。
饼状物外观好,所以是美学上令人愉悦的,但储存稳定性差,如图40至43所示。除了两种最有利的条件(5℃和-80℃)以外,在所有条件观察到显著的肽降解。
C2C
非-肽组分(括号中的数值表示以mM计的浓度)
甘露醇/海藻糖/硫代甘油/甲硫氨酸(225∶30∶46∶5)
特征
Tg′=未检测
Tg=未检测
Tm=未检测
残余水分=未检测
饼状物结构:结晶(不完全)
硫代甘油的保持差。尤其在25℃和40℃,在管瓶壁上观察到冷凝。即使以更高浓度的海藻糖,硫代甘油明显未固定在结晶饼状物中。
饼状物外观好,所以是美学上令人愉悦的,但储存稳定性差,如图44至47所示。除了两种最有利的条件(5℃和-80℃)以外,在所有条件观察到显著的肽降解。
C2D
非-肽组分(括号中的数值表示以mM计的浓度)
甘露醇/海藻糖/硫代甘油/甲硫氨酸/EDTA(245∶10∶46∶5∶0.5)
特征
Tg′=未检测
Tg=未检测
Tm=未检测
残余水分=未检测
饼状物结构:结晶(不完全)
饼状物外观好,所以是美学上令人愉悦的,但储存稳定性差,如图48至51所示。除了两种最有利的条件(5℃和-80℃)以外,在所有条件观察到显著的肽降解。加入EDTA不影响这一组合物的特性。
C2E
非-肽组分(括号中的数值表示以mM计的浓度)
甘露醇/海藻糖/硫代甘油/甲硫氨酸/EDTA(235∶20∶46∶5∶0.5)
特征
Tg′=未检测
Tg=未检测
Tm=未检测
残余水分=未检测
饼状物结构:结晶(不完全)
饼状物外观好,所以是美学上令人愉悦的,但储存稳定性差,如图52至55所示。除了两种最有利的条件(5℃和-80℃)以外,在所有条件观察到显著的肽降解。加入EDTA不影响这一组合物的特性。
C2F
非-肽组分(括号中的数值表示以mM计的浓度)
甘露醇/海藻糖/硫代甘油/甲硫氨酸/EDTA(225∶30∶46∶5∶0.5)
特征
Tg′=未检测
Tg=未检测
Tm=未检测
残余水分=未检测
饼状物结构:结晶(不完全)
硫代甘油的保持差。尤其在25℃和40℃,在管瓶壁上观察到冷凝。即使以高浓度海藻糖和EDTA存在时,硫代甘油明显未固定在结晶饼状物中。
饼状物外观好,所以是美学上令人愉悦的,但储存稳定性差,如图56至59所示。除了最有利的条件(-80℃)以外,在所有条件观察到显著的肽降解。加入增加水平的EDTA不显著影响这一组合物的特性。
比较实施例3-‘结晶’二元混合物蔗糖系列
典型冻干循环
步骤 | 搁板温度(℃) | 室压力(mbar) | 持续时间(h.min) |
1 | 20 | 1000 | 0 |
2 | -40 | 1000 | 00.36 |
3 | -40 | 1000 | 1.30 |
4 | -24 | 0.05 | 2.00 |
5 | -24 | 0.05 | 24.00 |
6 | 24 | 0.05 | 9.20 |
7 | 24 | 0.05 | 6.00 |
C3A
非-肽组分(括号中的数值表示以mM计的浓度)
甘露醇/蔗糖/硫代甘油/甲硫氨酸(250∶10∶46∶5)
特征
Tg′=未检测
Tg=未检测
Tm=未检测
残余水分=未检测
饼状物结构:结晶(不完全)
硫代甘油的保持差。在25℃和40℃5周后,在管瓶壁上观察到冷凝。硫代甘油明显未固定在结晶饼状物中。
饼状物外观好,所以是美学上令人愉悦的,但储存稳定性差,如图60至63所示。除了两种最有利的条件(5℃和-80℃)以外,在所有条件观察到显著的肽降解。
C3B
非-肽组分(括号中的数值表示以mM计的浓度)
甘露醇/蔗糖/硫代甘油/甲硫氨酸(235∶20∶46∶5)
特征
Tg′=未检测
Tg=未检测
Tm=未检测
残余水分=未检测
饼状物结构:结晶(不完全)
硫代甘油的保持差。尤其在25℃和40℃,在管瓶壁上观察到冷凝。即使以更高浓度的蔗糖,硫代甘油明显未固定在结晶饼状物中。
饼状物外观好,所以是美学上令人愉悦的,但储存稳定性差,如图64至67所示。除了两种最有利的条件(5℃和-80℃)以外,在所有条件观察到显著的肽降解。
C3C
非-肽组分(括号中的数值表示以mM计的浓度)
甘露醇/蔗糖/硫代甘油/甲硫氨酸(225∶30∶46∶5)
特征
Tg′=未检测
Tg=未检测
Tm=未检测
残余水分=未检测
饼状物结构:结晶(不完全)
硫代甘油的保持差。尤其在25℃和40℃5周后,在管瓶壁上观察到冷凝。即使以更高浓度的蔗糖,硫代甘油明显未固定在结晶饼状物中。
饼状物外观好,所以是美学上令人愉悦的,但储存稳定性差,如图68至71所示。除了两种最有利的条件(5℃和-80℃)以外,在所有条件观察到显著的肽降解。
C3D
非-肽组分(括号中的数值表示以mM计的浓度)
甘露醇/蔗糖/硫代甘油/甲硫氨酸/EDTA(245∶10∶46∶5∶0.5)
特征
Tg′=未检测
Tg=未检测
Tm=未检测
残余水分=未检测
饼状物结构:结晶(不完全)
硫代甘油的保持差。尤其在25℃和40℃5周后,在管瓶壁上观察到冷凝。即使以更高浓度的蔗糖,硫代甘油明显未固定在结晶饼状物中。
饼状物外观好,所以是美学上令人愉悦的,但储存稳定性差,如图72至75所示。除了两种最有利的条件(5℃和-80℃)以外,在所有条件观察到显著的肽降解。
C3E
非-肽组分(括号中的数值表示以mM计的浓度)
甘露醇/蔗糖/硫代甘油/甲硫氨酸/EDTA(235∶20∶46∶5∶0.5)
特征
Tg′=未检测
Tg=未检测
Tm=未检测
残余水分=未检测
饼状物结构:结晶(不完全)
硫代甘油的保持差。尤其在25℃和40℃5周后,在管瓶壁上观察到冷凝。硫代甘油明显未固定在结晶饼状物中。
饼状物外观好,所以是美学上令人愉悦的,但储存稳定性差,如图76至79所示。除了两种最有利的条件(5℃和-80℃)以外,在所有条件观察到显著的肽降解。加入EDTA不影响这一组合物的特性。
C3F
非-肽组分(括号中的数值表示以mM计的浓度)
甘露醇/蔗糖/硫代甘油/甲硫氨酸/EDTA(225∶30∶46∶5∶0.5)
特征
Tg′=未检测
Tg=未检测
Tm=未检测
残余水分=未检测
饼状物结构:结晶(不完全)
硫代甘油的保持差。尤其在25℃和40℃5周后,在管瓶壁上观察到冷凝。即使以高浓度蔗糖和EDTA存在时,硫代甘油明显未固定在结晶饼状物中。
饼状物外观好,所以是美学上令人愉悦的,但储存稳定性差,如图80至83所示。除了两种最有利的条件(5℃和-80℃)以外,在所有条件观察到显著的肽降解。加入EDTA不影响这一组合物的特性。
实施例4
进一步检验基于实施例1的发现的制剂的长期稳定性。在30℃/65%RH储存以下制剂(称为硫代甘油“高”)达一年:
给出的是组合物处于液态时的浓度,即在冻干之前和重构之后的浓度。在相同条件下检验替代制剂(硫代甘油“低”),该制剂除了硫代甘油以14mM而不是46mM存在以外相同。以一定间隔监测肽的降解,如图84所示。结果表示,两种制剂在整个检验期间实现极佳的肽稳定性。
Claims (13)
1.一种产生包含SEQ ID NO:1-4的肽的稳定冻干组合物的方法,所述方法包括:
(a)制备在溶液中包含以下的组合物:(i)作为唯一的非还原糖的海藻糖;(ii)硫代甘油;和(iii)所述肽;并
(b)冻干从步骤(a)获得的组合物。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述组合物在步骤(a)中被制备,其中硫代甘油以比所述肽的摩尔浓度大60倍和80倍之间的摩尔浓度存在。
3.根据权利要求1所述的方法,其中所述组合物在步骤(a)中被制备,其中硫代甘油以比所述肽的摩尔浓度大30倍和40倍之间的摩尔浓度存在。
4.根据权利要求1所述的方法,其中所述组合物还包含SEQ ID NO.84至86的肽。
5.根据权利要求4所述的方法,其中所述组合物不包含另外的肽。
6.一种通过如前述权利要求中任一项所定义的方法产生的稳定冻干组合物。
7.一种重构如权利要求6中所定义的稳定冻干组合物的方法,所述方法包括在溶液中重构所述冻干组合物。
8.一种通过如权利要求7中所定义的方法重构的溶液。
9.一种稳定冻干组合物,其包含SEQ ID NO:1-4的肽、硫代甘油和作为唯一的非还原糖的海藻糖。
10.根据权利要求9所述的组合物,所述组合物还包含SEQ ID NO.84至86的肽。
11.根据权利要求10所述的组合物,所述组合物不包含另外的肽。
12.一种重构如权利要求9至11中任一项所定义的稳定冻干组合物的方法,所述方法包括在溶液中重构所述冻干组合物。
13.一种通过权利要求12中所定义的方法重构的溶液。
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