MX2011005530A - Composiciones con formacion reducida de dimeros. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con el uso de un carbohidrato o derivado de carbohidrato no reductor y por lo menos un agente el cual inhibe la formación de dímeros en una composición liofilizada que comprende por lo menos un péptido que contiene un residuo cisteína libre, para proporcionar una composición liofilizada con estabilidad mejorada al almacenamiento a largo plazo.

Description

COMPOSICIONES CON FORMACION REDUCIDA DE DIMEROS CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con el uso de un carbohidrato no reductor o un derivado de carbohidrato y por lo menos un agente el cual inhibe la formación de dímeros en una composición liofilizada que comprende por lo menos un péptido que contiene un residuo cisteína libre para proporcionar una composición liofilizada con estabilidad mejorada al almacenamiento a largo plazo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Existen varios métodos conocidos en el ámbito que se utilizan para preservar un material perecedero o para volver al material más conveniente para transporte . Para materiales farmacéuticos, biotecnológicos o de alimentos, un método típico es liofilizado (también conocido como congelamiento- secado o criodesecación) . Este es un procedimiento de deshidratación el cual funciona al congelar el material y después reducir la presión circundante y agregar solo calor suficiente para permitir que el agua congelada en el material sublime directamente de la fase sólida a la gaseosa. El producto liofilizado resultante después se puede reconstituir fácilmente en solución para uso posterior .

La ventaja de un producto liofilizado es que Ref.: 220341 generalmente es más estable durante el almacenamiento y transporte y tiene una vida de anaquel más prolongada que el material equivalente en solución.- No obstante, existen algunos problemas con el liofilizado en que el daño al material que se va a conservar se puede producir durante los procedimientos de congelamiento y secado. Estos problemas son en alguna medida resueltos por la adición de crioprotectores y lioprotectores al material que se va a liofilizar. No obstante, lo que es bien reconocido es que algunos materiales perecederos, especialmente péptidos que contienen por lo menos un residuo cisteína libre se someten a degradación y daño incluso después de completar el proceso de liofilizado. Es decir, aunque la liofilización tiene un efecto preservador, los productos liofilizados que comprenden péptidos que constituyen por lo menos un residuo cisteína libre con frecuencia tienen una vida de anaquel más corta que la deseada. Existe una necesidad clara por medios par mejorar la estabilidad de composiciones liofilizadas que comprenden a tales péptidos.

SUMARIO DE LA INVENCION La invención se relaciona con el uso de (i) por lo menos un carbohidrato no reductor, y (ii) por lo menos un agente que inhibe la formación de dímeros, en una composición liofilizada que comprende por lo menos un péptido que comprende por lo menos un residuo cisteína libre, en donde el uso es para evitar o reducir la dimerización de por lo menos un péptido en la composición.

La invención se relaciona adicionalmente con un método para producir una composición liofilizada estable que comprende por lo menos un péptido, el método comprende: a) preparar una composición que comprende en solución (i) por lo menos un carbohidrato no reductor, (ii) por lo menos un agente que inhibe la formación de dímero y (iii) por lo menos un péptido que comprende por lo menos un residuo cisteína libre; y b) liofilizar la composición resultante de la etapa (a) .

En una modalidad, la composición liofilizada resultante es estable por al menos 2 años cuando se almacena a una temperatura de 2-8°C. En una modalidad adicional, el método comprende además reconstituir la composición liofilizada de la etapa (b) en solución.

La invención se relaciona adicionalmente con una composición liofilizada estable que comprende por lo menos un péptido para inmunización o formación de tolerancia, en donde la composición comprende adicionalmente por lo menos un carbohidrato no reductor y por lo menos un agente el cual inhibe la formación de dímeros .

En una modalidad de los usos, métodos y composiciones anteriores, por lo menos un carbohidrato no reductor se selecciona de trehalosa, sacarosa, rafinosa, estaquiosa o raelezitosa y el agente es tioglicerol.

En una modalidad de los usos, métodos y composiciones anteriores, por lo menos un péptido es para uso en inmunización o generación de tolerancia, y es de 8 a 30 aminoácidos de longitud y comprende: a) por lo menos un residuo cisteína; y b) una región que comprende por lo menos un epítopo de linfocito T.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Las figuras 1 a 83 muestran la estabilidad de péptidos, almacenados bajo diferentes condiciones según se indica, cuando están comprendidos dentro diferentes composiciones liofilizadas como se describe en los ejemplos (T = trealosa, S = sacarosa, = manitol, TG = tioglicerol, G = glicina, Met = metionina) . El tiempo (semanas) se muestra en el eje de las abcisas. La cantidad de péptido no degradado presente en una solución reconstituida a partir de una composición dada se muestra en el eje de las ordenadas. La cantidad se muestra como un porcentaje en relación a la cantidad de un estándar de péptido MLA07, el cual no ha sido liofilizado .

Cada figura muestra siete conjuntos de resultados diferentes, que corresponden a cada uno de los siguientes diferentes péptidos: MLA05 (línea oscura, puntos de círculos pequeños) ; MLA12 (línea oscura, puntos cuadrados) , MLA03 (línea gris claro, puntos triangulares) ; MLA14 (línea gris claro, puntos en forma de X) ; MLA01 (línea oscura, puntos en forma de X) , MLA04 (línea oscura, puntos de círculos grandes) ; MLA07 (línea oscura; puntos de forma de línea vertical) . Los datos se generan siguiendo el liofilizado de una mezcla de los siete péptidos en cada composición.

La figura 84 muestra la estabilidad a 30°C y 65% de HR en 112 meses de una mezcla de siete péptidos: MLA05; MLA12, MLA03 , MLA13 ; MLA01; MLA04 y MLA07 comprendida en las composiciones específicas descritas en el ejemplo 4, es decir, "baja" en tioglicerol (rombos) y "alta" en tioglicerol (cuadros) .

BREVE DESCRIPCION DE LAS SECUENCIAS Las SEC ID NOS: 1 a 83 representan las secuencias de péptidos los cuales son preferidos particularmente para inclusión en las composiciones de la invención. Las SEC ID NOS: 84 a 86 representan las secuencias de péptidos adicionales los cuales se pueden incluir en las composiciones de la invención.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION LIOFILIZADO El liofilizado es una operación compleja en donde se extrae un solvente (habitualmente agua) de un producto por medio de sublimación. Como es bien sabido, la sublimación se produce cuando un líquido congelado pasa directamente a la fase gaseosa sin pasar por la fase líquida. La sublimación es una función de la presión y temperatura, cuyo equilibrio es básico para una liofilización exitosa.

El procedimiento de liofilización consiste de tres etapas: congelamiento, secado primario y secado secundario. Durante la etapa de congelamiento la solución se convierte en un sólido. El procedimiento de congelación debe controlarse cuidadosamente dado que la velocidad de congelamiento afecta el tamaño de los cristales de hielo que se forman en el producto lo cual puede alterar la estabilidad del producto y también puede alterar la velocidad de secado durante las fases de secado primaria y secundaria.

Es muy importante realizar la etapa de congelamiento por debajo de una temperatura crítica. Esta temperatura es la temperatura eutéctica (Teut) para materiales cristalinos o la temperatura de transición vitrea para un soluto concentrado congelado de manera máxima (Tg1) para productos amorfos .

Durante el secado primario, se separa el hielo del producto congelado por sublimación, lo que resulta en un producto estructuralmente intacto, seco. Esto requiere un control cuidadoso de la temperatura de gabinete y la presión de la cámara en el dispositivo de secado. La velocidad de sublimación del hielo a partir del producto congelado depende de una diversidad de factores los cuales se apreciarán por una persona experta en el ámbito. Es importante que durante el secado primario, la temperatura del producto en el límite de sublimación (Tp) no exceda la "temperatura crítica" de la formulación, es decir, no debe alcanzar fluidez suficiente para que fluya y por lo tanto destruya la estructura de la torta. Esto también se conoce como la temperatura de colapso (Te) y típicamente es varios grados mayor que la Tg' .

Como se menciona en lo anterior, la temperatura crítica es Teut para materiales principalmente cristalinas y Tg' o Te para materiales amorfos. Los materiales cristalinos son fáciles de congelar puesto que la Teut generalmente es alta (por ejemplo, la Teut para el manitol, un agente que proporciona volumen muy popular es de -3°C) . Además, la "torta" liofilizada resultante típicamente tiene una apariencia atractiva cuando se deriva de materiales cristalinos. No obstante, los materiales cristalinos con frecuencia no son adecuados para estabilizar péptidos durante los procedimientos de congelamiento y secado. Aquí, generalmente se utilizan azúcares amorfos, polioles y otros excipientes. El inconveniente es que la Tg' de esta sustancia generalmente es mucho más baja que las temperaturas eutécticas (por ejemplo, sacarosa: -32°C) .

Después de que el secado primario ha sido completado, y la totalidad del hielo se ha sublimado, la humedad unida aún está presente en el producto. El producto presenta una apariencia seca pero el contenido de humedad residual puede ser tan alto como 7-8%. Es necesario continuar el secado a una temperatura de anaquel mayor para reducir el contenido de humedad residual a valores óptimos (para muchas formulaciones, <1%) . Este procedimiento, el secado secundario se conoce también como desorción isotérmica dado que el agua unida se desorbe del producto. El secado secundario normalmente continúa a una temperatura de producto mayor que el ambiente pero aún por debajo de la temperatura de transición vitrea (Tg) o de fusión de la formulación.

Se apreciará que las personas expertas en el ámbito entienden la necesidad de una consideración cuidadosa de los parámetros anteriores, con consideración adecuada dada a las diferencias en las propiedades entre las diferentes composiciones y la necesidad potencial de ensayo y error para establecer condiciones óptimas de congelamiento y secado.

Existen varias ventajas del procedimiento de liofilizado para estabilizar productos delicados (por ejemplo proteínas, péptidos, etc.): por ejemplo, los productos liofilizados adecuadamente con frecuencia no necesitan refrigeración, se pueden almacenar a temperatura ambiente y pueden ser reconstituidos rápidamente de modo completo con agua u otro solvente adecuado para inyección. Una composición liofilizada típicamente se espera que tenga una vida de anaquel estable mayor a 2 años. En este contexto, estable típicamente significa que la composición liofilizada puede ser reconstituida sin dificultad y que la solución reconstituida es adecuada para uso farmacéutico. Estable también se considera que indica ausencia de cualquier cambio en la apariencia física o cosmética del producto con la excepción de ruptura de la torta liofilizada, antes de la reconstitución. Lo adecuado para uso farmacéutico depende del material biológico y el uso específico en cuestión pero típicamente se puede determinar con facilidad por una persona experta en el ámbito. En términos generales, el material biológico en la solución reconstituida se esperará que tenga una actividad comparable al material equivalente en solución antes del liofilizado. En el caso de una solución reconstituida que comprende un péptido o proteína, la solución reconstituida típicamente se considerará adecuada para uso farmacéutico, particularmente para inyección si es estéril y está libre de materiales particulados visibles.

Existen varias dificultades con el liofilizado que pueden acortar la vida de anaquel estable de un producto, algunas veces de manera notoria, particularmente para composiciones que comprenden proteínas o péptidos que tienen por lo menos un residuo cisteína libre. Estos materiales pueden presentar cambios irreversibles o degradación durante el procedimiento de liofilizado, pero también después de este procedimiento, es decir, durante el almacenamiento del producto liofilizado.

La degradación durante el procedimiento de liofilizado se puede producir durante el congelamiento, durante el secado o durante ambos, el congelamiento y el secado. Si la degradación del producto se produce durante el congelamiento, es típica la adición de un " crioprotector" . Los crioprotectores estabilizan durante el congelamiento pero no necesariamente estabilizan durante la liofilización (es decir, durante ambos, congelamiento y secado) . Los crioprotectores comunes incluyen concentraciones altas de disacáridos y algunos aminoácidos (hasta 0.5M) y concentraciones bajas de polietilenglicol (<1%, p/p) u otros polímeros. El término " lioprotección" se refiere a estabilización durante la totalidad del procedimiento de liofilizado (por ejemplo, durante el congelamiento y el secado) . La estabilización con frecuencia es necesaria para el liofilizado de materiales biológicos tales como proteínas y péptidos. Esto es debido a que las complejas moléculas biológicas tales como las proteínas con frecuencia requieren una concentración moderada de agua para mantener la estructura y función. En consecuencia, un " lioproptector" se puede agregar típicamente. Los lioproptectores conocidos en el ámbito típicamente son compuestos de polihidroxi tales como azúcares (mono-, di- y polisacáridos) , polialcoholes y sus derivados.

En contraste con lo anterior, el daño y la degradación que se producen después del procedimiento de liofilizado, es decir, durante el almacenamiento o transporte del producto liofilizado es más difícil de corregir. Este daño puede tomar la forma, por ejemplo, de desamidación, hidrolización, racemización u oxidación, la totalidad de los cuales típicamente resultan en agregación y/o desnaturalización de una proteína o péptido almacenados. La oxidación de las cadenas laterales de residuos cisteína, que llevan a la formación de enlace disulfuro entre las moléculas y su dimerización subsecuente, es un problema particular. Este daño se puede presentar lentamente durante un período prolongado de tiempo o puede suceder rápidamente durante un cambio a corto plazo en las condiciones de almacenamiento, tal como un incremento súbito en la temperatura debido a una falla de un sistema de control de clima o incluso a una simple variación estacional en la temperatura ambiente.

La presente invención resuelve los problemas de daño y degradación que se producen después de un procedimiento de liofilizado, en composiciones liofilizadas que comprenden por lo menos un péptido, específicamente un péptido que comprende por lo menos un residuo cisteína libre, al inhibir o reducir la dimerización de por lo menos un péptido.

COMPOSICIONES LIOFILIZADAS DE LA INVENCION La presente invención está relacionada particularmente con composiciones liofilizadas que comprenden por lo menos un péptido que comprende por lo menos un residuo cisteína libre. Los péptidos los cuales son particularmente de interés son aquellos los cuales son útiles para modular el sistema inmunitario, específicamente al modular las respuestas de los linfocitos T.

El reconocimiento de antígenos por los linfocitos T requiere que las células presentadoras de antígeno (APC, por sus siglas en inglés) presenten fragmentos (péptidos) de la proteína antigénica a su superficie celular en asociación con moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC, por sus siglas en inglés) . Los linfocitos T utilizan sus receptores específicos de antígeno para linfocitos T (TCR, por sus siglas en inglés) para reconocer con alta especificidad los fragmentos presentados por las APC. Este reconocimiento actúa como un activador para el sistema inmunitario con el fin de generar una gama de respuestas para erradicar el antígeno el cual ha sido reconocido.

La mayor parte de la especificidad del reconocimiento de los linfocitos T de los fragmentos de antígeno se proporciona por una subsecuencia más pequeña de aminoácidos dentro de los fragmentos. Esta subsecuencia se conoce como el epítopo de linfocitos T. De esta manera, los péptidos que comprenden estos epítopos son de interés para uso como agentes terapéuticos para modular los sistemas inmunitarios de los sujetos. En el caso de alérgenos extracelulares y auto- o alo-antígenos, los péptidos típicamente se presentan en las moléculas MHC clase II, las cuales son reconocidas por células T CD4. En consecuencia, el interés en trastornos alérgicos y/o auto- o alo-inmunes se ha enfocado en epítopos de linfocitos T que unen MHC clase II, epítopos de células de linfocitos T que unen MHC clase I, los cuales son reconocidos por las células T CD8 también pueden ser de interés, por ejemplo, cuando se requiere modular las respuestas inmunitarias a antígenos endógenos y/o intracelulares . Esto puede ser deseable en el caso de ciertos marcadores de cáncer, péptidos a partir de los cuales se pueden utilizar para inducir inmunidad tumoral o para el tratamiento de enfermedades infecciosas tales como las causadas por hepatitis y virus de papiloma humano.

La administración a sujetos de los epítopos peptídicos derivados de alérgenos extracelulares y auto- o alo-antígenos ha sido demostrado que resulta en la inducción de tolerancia al antígeno del cual se deriva el epítopo. Los agentes terapéuticos basados en este efecto tienen un gran potencial en la prevención y tratamiento de alergias, y de enfermedades auto-y alo-inmunes en donde es deseable la regulación por disminución de una respuesta inmunitaria específica .

La administración a los sujetos de los epítopos peptídicos derivados, por ejemplo de algunas proteínas asociadas con cáncer o enfermedades infecciosas, se ha demostrado que resulta en la inducción de inmunidad específica al antígeno para el cual se deriva el epítopo. Los agentes terapéuticos basados en este efecto tienen un gran potencial en la prevención y tratamiento de enfermedades en donde es deseable la regulación por aumento de una respuesta inmunitaria específica.

El progreso adicional en el uso de los epítopos peptídicos para producir tolerancia o inmunidad a un antígeno específico está impedido por numerosos problemas. Uno de estos problemas es que las secuencias de epítopo, particularmente secuencias de epítopo de alérgenos y auto- y alo-antígenos con frecuencia son poco solubles y por lo tanto son problemáticas para la manufactura, para almacenamiento y para administrar a los sujetos. En particular, los péptidos que comprenden secuencias de epítopo que contienen residuos cisteína pueden ser vulnerables a la dimerización o agregación de orden superior, lo que genera una respuesta inmunitaria apropiada, típicamente inflamación que resulta de la unión de IgE o IgG.

En consecuencia, cuando los péptidos comprenden estos epítopos están comprendidos dentro de una composición liofilizada, son particularmente vulnerables a los tipos de daño y degradación que se produce durante el transporte y almacenamiento, es decir, después del procedimiento de liofilizado como se indica en lo anterior. Esto a su vez genera una solución reconstituida la cual no es adecuada para el uso farmacéutico destinado, dado que, cuando se requiere generación de tolerancia, la provocación de respuestas inmunitarias inapropiadas tales como inflamación es altamente indeseable. Similarmente, cuando se requiere la inducción de inmunidad específica, la formación de dímeros o agregado de orden superior inhibirá la unión de las moléculas MHC clase I o la unión subsecuente a los linfocitos T apropiados y de esta manera evitarán la estimulación de respuestas inmunitarias mediadas por linfocitos T.

EPITOPOS DE LINFOCITO T QUE UNEN MHC CLASE II Como se describe en lo anterior, el interés en los péptidos para el tratamiento o prevención de trastornos alérgicos y auto- o halo-inmunes se ha enfocado en los epítopos de linfocitos T que se unen a MHC clase II. Estos epítopos también pueden ser de interés cuando se requiere inducir una respuesta inmunitaria específica. El epítopo de linfocito T que se une a un MHC clase II comprendido en los péptidos de la invención típicamente es la secuencia aminoácida mínima que es capaz de unirse a moléculas clase II y que es capaz de estimular linfocitos T CD4 cuando se presentan a linfocitos T en asociación con clase II sobre la superficie celular. El epítopo típicamente es aquel que se une a la molécula MHC clase II humana tal como cualquiera de las moléculas mencionadas en la presente.

Una molécula MHC clase II consiste de dos proteínas, a y ß, cada una de las cuales es codificada por un gen diferente. En los humanos existen tres conjuntos de genes que codifican para diferentes proteínas y ß. Estas son los grupos de antígeno de leucocito humano (HLA) DR, DQ y DP. Cada conjunto comprende diferentes genes A múltiples que codifican para una variante diferente de la proteína a y diferentes genes B múltiples que codifican para diferentes variantes de la proteína ß. Los heterodímeros MHC clase II resultantes por lo tanto son extremadamente diversos y de manera correspondiente lo mismo sucede con los epítopos de linfocitos T con los que se unen.

El sitio de unión de moléculas MHC clase II está constituido de dos proteínas separadas las cuales forman una hendidura. La hendidura es de extremo abierto la cual en teoría permite que el péptido de cualquier longitud se una. No obstante, solo 9 aminoácidos pueden ocupar la hendidura misma. Las identidades de hasta 9 aminoácidos los cuales ocupan la hendidura define si un péptido dado se unirá o no a una molécula MHC clase II dada y estará disponible para presentación a linfocitos T. Estos hasta 9 aminoácidos por lo tanto representan la secuencia mínima que se requiere para unión de MHC clase II. Se supone de manera general que la secuencia será capaz de estimular linfocitos T cuando se presenten a linfocitos T asociado con clase II en la superficie de la célula. No obstante, esto se puede confirmar experimentalmente por métodos estándar en el ámbito.

Los métodos los cuales típicamente comprenden poner en contacto el epítopo con linfocitos T en una muestra tomada de un sujeto, bajo condiciones las cuales permiten que el epítopo y los linfocitos T interactúen; y después determinar si cualquiera de los linfocitos T ha sido estimulado o no. La determinación de si los linfocitos T han sido estimulados o no se puede obtener por cualquier método adecuado, por ejemplo mediante detección de la producción de citocinas por los linfocitos T, en donde la producción de citocinas indica que los linfocitos T han sido estimulados. Las citocinas adecuadas incluyen interferón y, interleucina 4 e interleucina 13. Se puede detectar la producción de citocina por cualquier método adecuado por ejemplo, un análisis de ELISA, ELISPOT o un análisis de citometría de flujo. Los linfocitos T en una muestra de un sujeto típicamente están presentes en una población de células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) aislados de sangre o suero de muestra tomada del sujeto.

El epítopo de linfocito T que une MHC clase II de la invención típicamente consiste de 8 ó 9 aminoácidos pero puede consistir de 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos del epítopo puede ser definida ampliamente con referencia adicional al sitio de unión de las moléculas MHC clase II. Este sitio de unión tiene receptáculos de unión específicos los cuales corresponden a posiciones de ancla primaria y secundaria en la secuencia de la unión del epítopo peptídico. Los receptáculos de unión se definen por posiciones de aminoácidos en la secuencia de la molécula MHC clase II y generalmente no son absolutamente discriminatorios para un aminoácido específico del epítopo. Por lo tanto, la especificidad de unión de péptido de cualquier molécula MHC dada es relativamente amplia. De esta manera, los péptidos que se unen al mismo halotipo MHC muestran cierto grado de similitud, pero no hay un requerimiento para identidad.

Para la mayor parte del tipo MHC clase II humano, HLA-DR, las posiciones de ancla clave para unión a los receptáculos de unión son las posiciones 1, 4, 6, 7 y 9 del epítopo peptídico (realizando la cuenta desde el recibo que se encuentra más hacia la parte N terminal ocupando la hendidura hacia la parte más C terminal) . Los diferentes alelos HLA-DR los cuales tienen aminoácidos similares en sus receptáculos de unión por lo tanto típicamente unen péptidos con aminoácidos similares en las posiciones 1, 4, 6, 7 y 9. En consecuencia, la región que contiene un epítopo de linfocito T que une MHC clase II preferiblemente tiene aminoácidos en las posiciones que corresponden a las posiciones 1, 4, 6, 7 y 9 que permiten la unión de un intervalo más amplio de alelos HLA-DR. Los ejemplos de propiedades de unión características de diferentes alelos HLA-DR se establecen en lo siguiente: Alelos DR con glicina en la posición 86 de la cadena ß muestran fuertes preferencias por cadenas laterales hidrofóbicas grandes (Trp, Tyr, Phe) en la posición peptídica 1 mientras que la valina en la posición 86 limita el tamaño de receptáculo y altera las preferencias a cadenas laterales hidrofóbicas pequeñas (Val y Ala) en esta posición. Los aminoácidos hidrofóbicos de tamaño medio Leu e lie son bien aceptados en todos los alelos DR.

Los alelos DR con Gln en la posición 70, lisina en la posición 71 de arginia o Gln en la posición 74 de la cadena ß tienen una carga positiva general dentro del receptáculo 4, lo cual requiere aminoácidos cargados negativamente Asp y Glu en la posición 4 del péptido de unión (como en por ejemplo, DRB1*0301) . Los alelos DR con este motivo están asociados con dos enfermedades autoinmunes: lupus eritematoso sistémico y tiroiditis de Hashimoto.

Alelos DR con Gln o Arg en la posición 70, Arg o Lys en la posición 71 y Glu o Ala en la posición 74 de la cadena ß unen péptidos similares a los directamente anteriores dado que la única diferencia significativa es en la posición 74. No obstante, cuando está presente Ala en la posición 74, el receptáculo 4 aumenta en tamaño y puede albergar aminoácidos más grandes tales como Phe, Trp e lie (como en, por ejemplo, DRB1*0401, 04, 05) . Los alelos que presentan Glu en la posición 74 se espera que permiten residuos polares pequeños, como Ser y Thr en la posición 4 del péptido de unión. Los alelos DR con este motivo están asociados con una susceptibilidad a artritis reumatoide.

Los alelos DR con Asp en la posición 70, Glu o Arg en la posición 71 y Leu o Ala en la posición 74 de la cadena ß excluyen péptidos con aminoácidos cargados negativamente en la posición de péptido 4 (por ejemplo DRB1*0402) . Esto es debido a la presencia de Asp en la posición 70. Los alelos DR con este motivo están asociados con las enfermedades autoinmunes artritis reumatoide juvenil (JRA, por sus siglas en inglés), pénfigo vulgar . y enfermedad/síndrome broncopulmonar alérgico.

Los polimorfismos en la posición 9 de la cadena ß definen el tamaño del receptáculo 9 de unión en todos los alelos DR. Los alelos con Trp en esta posición aceptan sólo aminoácidos pequeños en la posición 9 del péptido de unión, por ejemplo, Ala, Val, Gly, Ser, Thr, Pro (como en, por ejemplo, DRB1*0101 y *1501) . Glu en la posición 9, en combinación con Asp en la posición 57, vuelve al receptáculo 9 cargado negativamente, lo que facilita el albergado de aminoácidos cargados positivamente tales como Lys (como en, por ejemplo, DRB1*0401 y *0404) e histidina (como en, por ejemplo, DRB1*0402) . En la mayor parte de los alelos MHC clase II, Asp en la posición 57 hace un enlace de hidrógeno con un puente salino con Arg en la posición 76, lo que permite que el receptáculo también albergue aminoácidos alifáticos y polares. En casos en donde Asp en la posición 57 está sustituido por Ser (por ejemplo DRB1*0405) o Ala (DQ8) , se destruye la red de unión de hidrógeno y Arg en la posición 76 puede atraer fuertemente aminoácidos cargados negativamente tales como Asp o Glu en la posición 9 del péptido de unión (como en, por ejemplo DRB1*0405) .

Un ejemplo de una secuencia preferida para un epítopo por lo tanto tiene Trp, Tyr, Phe, Val o Ala en la posición 1; Asp, Glu, Ser o Thr en la posición 4; y Ala, Val, Gly, Ser, Thr, Pro en la posición 9. Un ejemplo adicional de una secuencia preferida para un epítopo tiene un aminoácido aromático grande o hidrofóbico en la posición 1, por ejemplo Tyr, Phe, Trp, Leu, lie o Val y un aminoácido no cargado pequeño en la posición 6, por ejemplo Ser, Thr, Ala, Pro, Val, lie o Met. Aproximadamente 87.5% de los péptidos se unen a la totalidad o a una combinación de las moléculas MHC clase II codificadas por los alelos DRB1*0101, *0401 y *0701 que contienen este motivo. Además, puesto que los epítopos de linfocitos T derivados de alérgenos y antígenos autoinmunes típicamente no contienen una gran cantidad de secuencias repetidas de un aminoácido o aminoácidos dados, los epítopos preferidos de la invención típicamente comprenden por lo menos 5, 6, 7 ú 8 aminoácidos diferentes.

La secuencia precisa de amino de un epítopo se puede predecir por algoritmos basados en computadora y confirmados por análisis bioquímico in vitro. Los algoritmos disponibles comercialmente adecuados incluyen el algoritmo EpiMatrix (EpiVax Inc.). Otros algoritmos están disponibles, por ejemplo, en http://www.imtech.res.in/raghava/propred/ y http://www.imtech.res.in/raghava/mhc2pred/. El análisis con estos algoritmos típicamente comprende análisis sintáctico de una secuencia polipeptídica más grande en péptidos pequeños que se superponen múltiples. Las secuencias de estos péptidos pequeños después se analizan utilizando el algoritmo para identificar aquellos las cuales se predice que se unen a moléculas MHC clase II. Los péptidos pequeños que se superponen típicamente son de 9 unidades.

Los péptidos candidatos los cuales califican más alto en este análisis después se determinan para su capacidad para unirse a un grupo de moléculas MHC clase II codificadas por diferentes alelos de clase II in vitro utilizando análisis de unión estándar. Por ejemplo, se puede utilizar un análisis de unión MHC clase II competitivo, en donde cada péptido es analizado por su capacidad para desplazar un aglutinante de control conocido a partir de cada uno de los alotipos MHC clase II humanos investigados. En este análisis, cada péptido se le asigna un valor CI50 (la concentración a la cual se obtiene 50% de inhibición de la unión del péptido control) . Cuanto menos sea la CI50 mayor será la afinidad de un péptido para un alotipo MHC clase II dado.

El epítopo o epítopos en un polipéptido son tomados por aquellos péptidos los cuales muestran la afinidad de unión más grande a moléculas MHC clase II. Los epítopos particularmente preferidos muestran alta afinidad de unión por diferentes moléculas clase II codificadas por más de uno, preferiblemente dos, y de manera más preferible tres, cuatro o cinco alelos MHC clase II.

Los epítopos particularmente preferidos son aquellos los cuales están comprendidos en las regiones las cuales son susceptibles a formación de dímeros . Estas regiones se definen en una sección por separado más adelante.

Epítopos de linfocitos T que unen MHC clase I Como se describe en lo anterior, los epítopos de unión MHC clase I habitualmente son de más interés para la inducción de una respuesta inmunitaria específica (tal como inmunidad a tumores o la inducción de respuestas inmunitarias contra agentes que causan enfermedades infecciosas) . El epítopo de linfocitos T que une MHC clase I comprendido en los péptidos de la invención típicamente es una secuencia de aminoácidos mínima que es capaz de unirse a moléculas clase I y capaz de estimular linfocitos T CD8 cuando se presentan a linfocitos T en asociación con clase I en la superficie celular. El epí opo típicamente es uno que se une a una molécula MHC clase I humana, tal como cualquiera de las moléculas mencionadas en la presente.

Una molécula MHC clase I consiste de una cadena peptídica pesada unida de manera no covalente a un péptido más pequeño denominado microglobulina ß2. La cadena peptídica pesada se organiza en tres dominios globulares grandes, al, a2 y a3 y una región transmembranal e intracelular más pequeña. La cadena peptídica pesada es codificada por un solo gen. En los humanos existen tres grupos principales de genes que codifican para diferentes cadenas pesadas clase I y tres grupos menores. Estos son los grupos de antígeno leucocito humano (HLA) , HLA-A, HLA-B y HLA-C (principales) y HLA-E, HLA-F y HLA-G (menores) . Cada grupo comprende genes diferentes múltiples que codifican para variantes diferentes de la cadena pesada. Las proteínas MHC clase I resultantes por lo tanto son muy diversas y de manera correspondiente sucede lo mismo con los epítopos de linfocitos T a los que se unen .

El sitio de unión de las moléculas MHC clase I está conformado por la hendidura entre los dominios al y a2 (aquellos más alejados de la membrana celular) . La hendidura es un receptáculo cerrado y típicamente un péptido que se une en la hendidura tiene una longitud máxima de hasta 12 aminoácidos. Las identidades de hasta 12 aminoácidos los cuales ocupan la hendidura definen si un péptido dado se unirá o no a una molécula MHC clase I dada y si estará disponible para presentación a linfocitos T. Por lo tanto, estos aminoácidos representan la secuencia mínima que se requiere para unión a MHC clase I. Se supone de manera general que tal secuencia será capaz de estimular linfocitos T cuando se presenta a linfocitos T en asociación con clase I sobre la superficie celular. No obstante, esto se puede confirmar experimentalmente por métodos estándar en el ámbito habitualmente métodos equivalentes a los que se establecen en lo anterior para epítopos de clase II.

El epítopo de linfocito T que une MHC clase I de la invención típicamente consiste de entre 6 y 12, de manera más habitual entre 8 y 12 aminoácidos o 8 y 10 aminoácidos. Los epítopos pueden consistir de 8, 9 10, 11 ó 12 aminoácidos. De manera más típica, los epítopos tienen una longitud de 9 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos del epítopo se puede definir ampliamente con referencia adicional al sitio de unión de las moléculas MHC clase I. La naturaleza cerrada de la hendidura de unión MHC clase I significa que los residuos en cada parte terminal de un epítopo clase I son particularmente importantes para reconocimiento. El grupo amina en la parte amino terminal del péptido hace contacto con un sitio invariable en un extremo del surco peptídico y el grupo carboxilato en la parte carboxi terminal se une a un sitio invariable en el otro extremo del surco. No obstante, esta invariabilidad generalmente no es absolutamente discriminatoria para un aminoácido específico en el epítopo. Por lo tanto, la especificidad de unión de péptido a una molécula dada de HC es relativamente amplia. De esta manera, los péptidos que se unen al mismo alotipo MHC muestran cierto grado de similitud pero no a un requerimiento de identidad. Aún así, de manera típica, los epítopos clase I tienen una parte carboxi terminal hidrofóbica o básica y una ausencia de prolina en la parte amino terminal del extremo. El epítopo se encuentra en una conformación extendida a lo largo del surco con contactos adicionales entre los átomos de la cadena principal y las cadenas laterales de aminoácidos conservadas que alienan el surco. Las variaciones en la longitud son adoptadas por dobleces en la estructura principal peptídica, con frecuencia los residuos prolina o glicina.

Los epítopos particularmente preferidos son aquellos los cuales están comprendidos en las regiones las cuales son susceptibles a formación de dímeros. Estas regiones se definen en una sección separada más adelante.

Regiones que contienen por lo menos un epítopo de linfocito T Los análisis bioquímicos para la identificación de un epítopo de linfocito T típicamente no están disponibles para definir la posición de la secuencia de epítopo mínima dentro de una secuencia más grande con mayor precisión que solo con aproximadamente 10 a 12 aminoácidos, y de manera más habitual 15, 20 ó más aminoácidos. El motivo para esto es que una secuencia grande debe ser fragmentada físicamente en péptidos más pequeños que se superponen, o los péptidos más pequeños que se superponen deben fabricarse de novo antes de la determinación in vitro de la capacidad de estos péptidos para unirse a moléculas MHC. Una persona experta en el ámbito reconocerá que cuanto más pequeños sean los fragmentos de péptidos que se superponen se requiere más tiempo y más trabajo en el proceso de fabricación. Por lo tanto, los epítopos con frecuencia se identifican por estar contenidos dentro de una región polipeptídica más grande. Se considera qu los péptidos de la invención puedan comprender tal región m s grande .

En consecuencia, en los péptidos de la invención, la región que contiene un epítopo de linfocito T típicamente tiene una longitud de 8 ó 9 aminoácidos, pero puede tener una longitud de 6, 7,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ó 25 aminoácidos. En el caso de epítopos de linfocitos T que se unen a MHC clase I, se entenderá que el procesamiento de la región se puede requerir antes de que el epítopo se pueda presentar en la molécula MHC. El procesamiento de antígeno antes de la presentación a moléculas MHC clase I es una presentación bien conocida en el ámbito.

La región de la invención típicamente es una secuencia la cual es susceptible a la formación de dímeros . Esto se comprenderá que incluye tanto formación de homodímeros (es decir, asociación de monómeros peptídicos con otros monómeros peptídicos idénticos) así como la formación de heterodímeros (es decir, asociación de monómeros peptídicos con monómeros peptídicos diferentes) . También se entenderá que mediante una secuencia susceptible a formación de dímeros, también se pretende referirse a secuencias las cuales son susceptibles a formar oligómeros de orden superior tales como trímeros, tetrámeros y similares. La región de la invención puede comprender o consistir de cualquier secuencia la cual sea susceptible a la formación de dímeros . La secuencia de aminoácidos particular dentro de una región dada la cual promueve la formación de dímeros puede estar comprendida dentro de una secuencia de unión de MHC clase II mínima del epítopo de linfocito T o puede estar comprendida dentro de los residuos los cuales flanquean esta secuencia. La secuencia susceptible de formación de dímero de esta manera puede consistir completamente de la secuencia de unión de MHC mínima del epítopo de linfocito T.

La presente invención se relaciona particularmente con la formación de dimeros covalentes entre péptidos que contienen cisteína. En consecuencia, las secuencias preferidas comprenden por lo menos un residuo cisteína. Una persona experta en el ámbito apreciará que cualquier péptido que contenga un residuo cisteína único puede formar dimeros, ya sea consigo mismo o con otros péptidos que contengan cisteína con los cuales se pueda poner en contacto. Los péptidos que contienen dos o más cisteínas presentan el potencial de formar cadenas largas las cuales pueden agregarse después. Tal formación de dímeros/agregados genera el riesgo de unión de IgE o IgG y por lo tanto presentan una respuesta inflamatoria local. En consecuencia, una región preferida de la invención típicamente se deriva de una proteína con una proporción alta de residuos cisteína. Por ejemplo, la región de la invención puede derivarse de una proteína que tenga más de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 ó 35% de residuos cisteína como una proporción del número total de residuos aminoácidos en la proteína. La región de la invención preferiblemente se selecciona de una secuencia dentro de la proteína que tenga una proporción menor de residuos cisteína. En consecuencia, la región puede comprender hasta un máximo de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20% de residuos cisteína como una proporción del número total de residuos aminoácidos en la región. Los residuos cisteína pueden estar comprendidos en la secuencia de unión MHC mínima del epítopo o pueden estar comprendidos en los residuos los cuales flanquean a esta secuencia.

Otras secuencias susceptibles de formación de dímeros que se pueden identificar por análisis in silico utilizando métodos computacionales adecuados o mediante análisis in vitro utilizando métodos de laboratorio adecuados ios cuales cuantifican la proporción de una secuencia la cual está presente en forma monomérica o dimérica, como se establece más adelante. Para una secuencia que es susceptible de dimerización la proporción de la secuencia presente como un dímero puede ser mínima, es decir, menor de aproximadamente 0.5% ó 1% en el estado sólido, pero esto típicamente incrementará con el tiempo a por lo menos aproximadamente 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% para material almacenado en solución durante un período de tiempo adecuado bajo condiciones adecuadas. Los períodos de tiempo y las condiciones adecuados incluyen intervalos de tiempo y condiciones bajo las cuales una persona experta en el ámbito puede esperar razonablemente mantener una secuencia en solución antes de su uso. Por ejemplo, son típicos períodos de tiempo de aproximadamente 24 horas, aproximadamente 48 horas o aproximadamente 72 horas, aunque algunas soluciones se pueden mantener por períodos más prolongados, por ejemplo por lo menos una semana, un mes, 6 meses, 1 año, 2 años, 3 años o más . Las condiciones de almacenamiento típicamente pueden ser temperatura ambiente y humedad relativa o de manera típica 25°C y 60% de humedad relativa, pero pueden incluir cualquier condición de almacenamiento estándar encontrada por una persona experta en el ámbito, por ejemplo aproximadamente 5 ± 3°C, -20°C o -80°C.

La sensibilidad del sistema inmunitario es tal que únicamente una proporción pequeña de dímeros se considera probable que active una respuesta inmunitaria indeseable.

Para la determinación de la proporción de una secuencia presente en una forma dada un método adecuado es, por ejemplo, electroforesis analítico en gel bajo condiciones no desnaturalizantes. En ese método, una solución de la secuencia se corre en un gel e poliacrilamida, a lo largo de un conjunto de marcadores de peso molecular estándar. Si la secuencia forma dímeros, se observará una banda de proteína en el gel que corresponda a una especie con un peso molecular aproximadamente dos veces el calculado para la suma de los aminoácidos de la secuencia (de modo similar, los trímeros o tetrámeros que pudieran estar presentes se observará como bandas que corresponden a especies con peso moleculares aproximadamente tres o cuatro veces el calculado para la suma de los pesos residuales de un aminoácido de la secuencia) . Dado que es raro que 100% de una secuencia está presente en forma oligomérica, también se puede observar una segunda banda que corresponde a una especie con aproximadamente el peso molecular calculado para la suma de los aminoácidos de la secuencia - esto representa a la secuencia en forma monomérica. Las intensidades relativas de las bandas se pueden utilizar para cuantificar la proporción de la secuencia la cual está presente' en cada forma. Métodos similares pueden determinar el peso molecular por medios alternativos, por ejemplo, centrifugación en analítica, espectrometría de masas o cromatografía de exclusión de tamaño. De manera alternativa, los oligómeros se pueden cuantificar utilizando cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa (RP-HPLC) , en donde los dímeros y especies oligoméricas superiores están separadas de los monómeros basados en diferencias en sus hidrofobicidades . La identificación de las especies se obtiene utilizando detención espectrométrica de masas. Los mismos métodos se pueden adaptar para determinar si un péptido dado muestra una tendencia a heterodimerizar con cualquier otro péptido o molécula .

Adicionalmente, la región de la invención puede presentar una solubilidad de menos de 3.5 mg/ml en solución acuosa a H 2.0 hasta 12.0, o pH 2.0 a 11.0, pH 2.0 a 10.0, pH 2.0 a 9.0, pH 2.0 a 8.0 o pH 2.0 a 7.0; y/o comprende 1, 2, 3 ó 4 residuos cisteína y/o tener un punto isoeléctrico menor de 4.5; y/o tener una calificación GRAVY superior a +0.25. Estos parámetros se pueden determinar por cualquier método adecuado. Por ejemplo, se puede determinar la solubilidad por métodos estándar in vitro, la calificación GRAVY y el punto isoeléctrico se pueden determinar in silico utilizando métodos computacionales adecuados tales como la herramienta ProtParam (Gasteiger E. et al pp. 571-607 The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005) ; John M. alker (ed) ) la cual está disponible en http : //www. expasy. ch/tools/protparam. html .

Pép idos El péptido de la invención puede comprender o consistir de la secuencia nativa de la región como se define en lo anterior o puede comprender o consistir de la secuencia nativa de la región manipulada para reducir la formación de dímeros o mejorar la solubilidad. No obstante, en el contexto de una región la cual ha sido manipulada, deberá entenderse que la presente invención es particularmente aplicable a aquellos péptidos los cuales aún pueden experimentar un nivel inaceptable de formación de dímeros . Estos péptidos típicamente comprenderán aún por lo menos un residuo cisteína.

Cuando una región es manipulada para reducir la formación de dímeros, esto típicamente será por modificación de su secuencia nativa. Las modificaciones particularmente preferidas son aquellas en las que: - por lo menos un residuo cisteína en la secuencia nativa de la región es sustituido con serina, ácido 2 -aminobutírico, alanina o glicina; y/o por lo menos un residuo cisteína en la secuencia nativa de la región es cisteinilado para crear un residuo cisteína.

Se comprenderá que los péptidos de la invención están diseñados para abarcar ciertas variantes de los péptidos. Además de la manipulación para reducir la formación de dímeros que se ha descrito en lo anterior, se pueden realizar otras modificaciones a las secuencias nativas de aminoácidos del péptido. Por ejemplo, a uno, dos, tres, cuatro o cinco aminoácidos en la secuencia de un péptido, cualquiera de tales modificaciones será conservadora, en la medida en que si un aminoácido en la secuencia nativa es sustituido con un aminoácido diferente, el aminoácido diferente típicamente tendrá propiedades similares a la del aminoácido nativo. La tabla siguiente muestra las propiedades de aminoácidos. Los pesos moleculares se muestran junto con el código de tres letras para cada aminoácido. Los pesos moleculares dados son aquellos para los aminoácidos neutros y libres; los pesos residuales se pueden obtener por resta de un equivalente de agua (18 g/mol) . La invención también incluye péptidos que contienen partes terminales N y C modificadas o bloqueadas para reducir o inhibir la degradación por enzima exopeptidasa.

El residuo o los residuos los cuales son modificados pueden estar comprendidos en cualquier parte de la secuencia de la' región. En una modalidad, el residuo o los residuos los cuales son modificados no están comprendidos en la secuencia MHC mínima de la región. En una modalidad preferida, la modificación no crea un epítopo nuevo o afecta las propiedades de unión a MHC de la región.

El péptido de la invención típicamente contiene de 8 a 30 aminoácidos y puede contener 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 ó 29 aminoácidos. Se apreciará que el péptido de la invención puede consistir completamente de la región como se define en lo anterior o puede comprender aminoácidos adicionales que influencian la región hasta un máximo de 30 aminoácidos.

Péptidos más grandes de 30 aminoácidos es probable que posea estructura terciaria suficiente para reticulado de IgG o IgE sobre superficies celulares que resultan en respuestas inmunitarias indeseables tales como activación de linfocitos B o desgranulación de mastocitos.

Síntesis de péptidos Los péptidos de la invención se derivan en un sentido intelectual del polipéptido el cual comprende la región como se define en lo anterior. Esto se realiza al hacer uso de la secuencia de aminoácidos de la región y sintetizar péptidos en base en la secuencia. Los péptidos se pueden sintetizar utilizando métodos bien conocidos en el ámbito. Los métodos preferidos incluyen técnicas de síntesis peptídica en fase sólida y de manera más preferible un sintetizador de péptidos automatizado o semiautomatizado .

Típicamente, utilizando estas técnicas, un aminoácido protegido como -?-carbamoilo y un aminoácido unido a la cadena peptídica en crecimiento en una resina se acoplan, a temperatura ambiente en un solvente inerte tal como dimetilformamida, N-metilpirrolidinona o cloruro de metileno en presencia de agentes acoplantes tales como diciclohexilcarbodiimida y 1-hidroxibenzotriazol en presencia de una base tal como diisopropil-etilamina . El grupo protector a-?-carbamoilo se separa del péptido-resina resultante utilizando un reactivo tal como ácido trifluoroacético o piperidina y la reacción de acoplamiento se repite con el siguiente aminoácido N-protegido deseado que se agrega a la cadena peptídica. Los grupos N-protectores adecuados son bien conocidos en el ámbito e incluyen t-butiloxicarbonilo (tBoc) y fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) .

El término "péptido" incluye no sólo moléculas en las cuales los residuos aminoácidos se unen por enlaces peptídicos (-C0-NH-) sino también moléculas en las cuales se invierte el enlace peptídico. Tales peptidomiméticos retro-inverso pueden elaborarse utilizando métodos conocidos en el ámbito, por ejemplo tales como aquellos descritos en Meziere et al (1997) J. Immunol . 159, 3230-3237. Este enfoque involucra la elaboración de pseudopéptidos que contienen cambios que involucran a la estructura principal y no a la orientación de las cadenas laterales. Meziere et al (1997) demostraron que, por lo menos para las respuestas de linfocitos cooperadores (helper) MHC clase II estos pseudopéptidos son útiles. Los péptidos retro- inverso, los cuales contienen enlaces NH-CO en vez de los enlaces peptídicos CO-NH son mucho más resistentes a proteólisis.

Similarmente, el enlace peptídico se puede suministrar con lo ya proporcionado de que una porción enlazante apropiada la cual retiene la separación entre los átomos de carbono de los residuos aminoácidos se utiliza; se prefiere particularmente si la porción enlazante tiene sustancialmente la misma distribución de carga y sustancialmente la misma planaridad que un enlace peptídico. También se apreciará que el péptido puede ser bloqueado convenientemente en su parte N o C terminal de manera que ayuda a reducir la susceptibilidad a digestión exoproteolítica. Por ejemplo, el grupo amino N terminal y los péptidos puede ser protegido al hacer reaccionar con un ácido carboxílico y el grupo carboxilo en la parte C terminal del péptido se puede proteger al hacerlo reaccionar con una amina. Otros ejemplos de modificaciones incluyen glucosilación y fosforilación. Otra modificación potencial es que los hidrógenos en las aminas de cadena lateral de R o K se pueden sustituir con grupos metileno (-NH2 sustituido con -NH (Me) o -N (Me) 2)¦ Los análogos de péptidos de acuerdo con la invención también pueden incluir variantes peptídicas que incrementen o disminuyan la semivida del péptido in vivo. Los ejemplos de análogos capaces de incrementar la semivida de los péptidos utilizados de acuerdo con la invención incluyen análogos peptoides de los péptidos, derivados de D-aminoácidos de los péptidos e híbridos péptido-peptoide . Una modalidad adicional de los polipéptidos variantes utilizados de acuerdo con la invención comprenden forma de D-aminoácido de polipéptido. La preparación de los polipéptidos utilizando D-aminoácidos en vez de L-aminoácidos disminuye en gran medida cualquier descomposición no deseada de tal agente por procedimientos metabólicos normales, disminución en las cantidades de agente que se necesita administrar junto con la frecuencia de su administración.

Péptidos de interés Los péptidos de interés típicamente comprenden por lo menos un residuo cisteína libre. El término "libre" típicamente significa que el residuo cisteína está disponible para modificación química y/o dimerización con otros péptidos que contienen cisteína en ausencia de un agente el cual inhibe la formación del dímero . En otras palabras, una cisteína libre es aquella que contiene un grupo tiol en su forma reducida (-SH) y el cual es capaz de experimentar una reacción de oxidación con otra cisteína con otro grupo tiol también en forma reducida (-SH) para formar un enlace disulfuro (-S-S-), en ausencia de un agente el cual inhiba la formación de dímero.

Los péptidos de interés también comprenden típicamente una región que comprende por lo menos un epítopo de linfocito T que une MHC derivado de un alérgeno o aloantígeno. Así, una solución acuosa que comprende los péptidos de interés típicamente es capaz de inducir una respuesta en fase tardía en un individuo que es sensibilizado al alérgeno. El término "respuesta en fase tardía" incluye el significado como se establece en Allergy and Allergic Diseases (1997) A. B. Kay (Ed.), Blackwell Science, pp 1113-1130. La respuesta en fase tardía puede ser cualquier respuesta en fase tardía (LPR, por sus siglas en inglés) . Preferiblemente, las composiciones que comprenden un epítopo derivado de un alérgeno proteínico son capaces de inducir una respuesta asmática tardía (LAR, por sus siglas en inglés) o una respuesta rinítica tardía, o una respuesta cutánea de fase tardía o una respuesta ocular de fase tardía. Que una composición particular pueda o no dar lugar a una LPR se puede determinar utilizando métodos bien conocidos en el ámbito; un método particularmente preferido es el que se describe en Cromwell O, Durham SR, Shaw RJ, Mackay J y Kay AB. Provocation tests and measurements of mediators from mast cells and basophils in asthma and allergic rhinitis. In: Handbook of Experimental Immunology (4) Capítulo 127, Editor: Weir DM, Blackwell Scientific Publications , 1986. De esta manera, preferiblemente, las composiciones individuales de la invención son capaces de inducir una LPR en un individuo quien ha sido sensibilizado a un alérgeno proteínico del cual se deriva el epítopo.

Si un individuo ha sido sensibilizado o no en la proteína de la cual se deriva el epítopo se puede determinar por procedimientos bien conocidos tales como la detección de anticuerpos en la sangre o suero del individuo los cuales son específicos para la proteína. Si el epítopo se deriva de un alérgeno, las pruebas adecuadas para sensibilización al alérgeno incluyen la prueba de marcas en la piel con soluciones de extractos de proteína, inducción de LPR cutánea, antecedentes clínicos, exposición de alérgeno y prueba de radioalergoabsorbente (RAST, por sus siglas en inglés) para medición de IgE específica para proteína. Si un individuo particular se espera o no que se beneficie del tratamiento se puede determinar por el médico en base, por ejemplo, en estas pruebas o determinaciones.

La pérdida de sensibilidad o la generación de tolerancia de un individuo a la proteína de la cual se deriva el epítopo significa inhibición o amortiguamiento de las reacciones de tejido inmunológico inducidas por la proteína en individuos sensibilizados apropiadamente. Se ha demostrado que los linfocitos T pueden ser activados de manera selectiva y después se pueden volver inertes. Además, la generación de alergia o eliminación de estos linfocitos T genera la pérdida de sensibilidad del paciente por una proteína particular. La pérdida de sensibilidad se manifiesta a sí misma como una reducción en la respuesta a una proteína o un péptido derivado de proteína, o preferiblemente la eliminación de la respuesta, sobre una segunda administración o administraciones adicionales de la proteína o del péptido derivado de proteína. La segunda administración se puede realizar después de que ha transcurrido un período de tiempo adecuado para permitir que se produzca la pérdida de sensibilidad, esto es preferiblemente cualquier período entre un día y varias semanas. Se prefiere un intervalo de aproximadamente dos semanas .

Aunque las composiciones de la invención son capaces de inducir una LPR en un individuo quien ha sido sensibilizado a la proteína, debe apreciarse que cuando se utiliza una composición para tratar un paciente es preferible que se utilice una concentración suficientemente baja de la composición de manera que no se produzca LPR observable pero que la respuesta sea suficiente para desensibilizar parcialmente a los linfocitos T de manera que la siguiente dosis (preferiblemente más grande) se pueda administrar y así sucesivamente. De esta manera, la dosis se acumula para proporcionar una pérdida de sensibilización completa pero con frecuencia incluso sin haber inducido una LPR en el paciente. No obstante, la composición o péptido es capaz de hacer esto a una concentración embriónica que a la que se le administra.

La composición de la invención típicamente tiene una capacidad reducida para inducir una respuesta en fase temprana en un individuo. Mediante la frase "reducir la capacidad para inducir una respuesta en fase temprana" se quiere entender que la composición de la invención resultará en una gravedad menor de los síntomas en fase temprana (tal como desgranulación de basófilos o mastocitos) en relación a una composición que comprende un péptido que comprende la misma región que la que se encuentre en la composición de la invención, pero sin modificación de su secuencia para reducir la formación de dímero, y que carece de un agente el cual reduzca la formación de dímeros . En consecuencia, la composición de la invención producirá una respuesta en fase temprana menor que un péptido equivalente presente de manera predominante en forma dimérica. El péptido es equivalente debido a que comprende el mismo epítopo de linfocito T que se une a MHC clase II.

De manera alternativa o adicional, la composición de la invención típicamente tiene una capacidad mejorada para inducir tolerancia en un individuo. Mediante la frase "capacidad mejorada para inducir tolerancia" se entenderá que la composición de la invención producirá un nivel mayor de pérdida de sensibilidad en un individuo en comparación con una composición que comprende un péptido que comprende la misma región que la que se encuentra en la composición de la invención, pero sin modificación de su secuencia para reducir la formación de dímero y que carece de un agente el cual reduce la formación de dímero. En consecuencia, una composición de la invención producirá un nivel mayor de pérdida de sensibilidad en comparación con un péptido equivalente presente de manera predominante en forma dimérica. El péptido es equivalente debido a que comprende el mismo epítopo de linfocito T que une MHC clase II.

La pérdida de sensibilidad es como se define en lo anterior y su nivel se puede caracterizar por cualquier medio adecuado. Por ejemplo, en asma alérgico, una LAR menor producida en respuesta a la inhalación de la proteína de la cual se deriva el epítopo (o un péptido derivado de la proteína) puede indicar un nivel mayor de pérdida de sensibilidad posterior al tratamiento con la composición de la invención. El tamaño de una LAR se puede determinar por cualquier medio adecuado en el ámbito, por ejemplo, detección de la reducción en el volumen expirado forzado (FEV) de un individuo después de la administración de la proteína. Una reducción mayor en FEV indica una LAR más grande. La composición de la invención preferiblemente resulta en una LAR de por lo menos 10%, 20%, 30%, 40% ó 50% menor que una composición que comprende un péptido equivalente presente de manera predominante en forma dimérica.

De manera alternativa, un nivel mayor de pérdida de sensibilidad se puede indicar por una mayor reducción en la producción específica de proteína por linfocitos T de citocinas inflamatorias tales como interferón ?, interleucina 4 e interleucina 13. La producción de citocina por linfocitos T se puede detectar por cualquier método adecuado, por ejemplo los análisis de ELISA, ELISPOT o análisis citométrico de flujo. Los métodos particularmente preferidos incluyen ensayos de arreglo de esferas ultiplex como se describe, por ejemplo en Jager et al; Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, 2003, Vol 10(1) p. 133-139. Mediante la frase "una reducción mayor" se prefiere que el tratamiento con la composición de la invención resulta en una producción de preferiblemente por lo menos 10%, 20%, 30%, 40% ó 50% menos citocinas inflamatorias que una composición que comprende un péptido equivalente presente de modo predominante en forma dimérica .

Las composiciones preferidas de la invención comprenden por lo menos un péptido que comprende o que consiste de un epítopo el cual se deriva de: un alérgeno que se selecciona de: un alérgeno vegetal (particularmente un alérgeno de pasto) , alérgenos de piel de animales, un alérgeno de moho o micótico, un alérgeno de polvo, un antibiótico u otro medicamento, o el veneno de un insecto que pique, un alérgeno ambiental o un alérgeno de alimento; o un antígeno que se selecciona de los antígenos principales asociados con encefalomielitis diseminada aguda (ADEM) ; enfermedad de Addison; espondilitis anquilosante; síndrome de anticuerpo antifosfolipídico (APS) ; anemia aplásica; hepatitis autoinmune; Ooforitis autoinmune; enfermedad cilíaca; enfermedad de Crohn; diabetes mellitus tipo 1; penfigoide gestacional; síndrome de Goodpasture; enfermedad de Graves; síndrome de Guillain-Barré (GBS) ; enfermedad de Hashimoto; púrpura trombocitopénica idiopática; enfermedad de Kawasaki; lupus eritematoso, esclerosis múltiple; miastenia grave; narcopsia; síndrome de mioclono opsoclono (OMS) ; neuritis óptica; tiroiditis de Ord; pénfigo; anemia perniciosa; poliartritis en perros; cirrosis biliar primaria; artritis reumatoide; síndrome de Reiter; síndrome de Sjógren; arteritis de Takayasu; arteritis temporal (también conocida como "arteritis de células gigantes11); anemia hemolítica autoinmune de Warm o granulomatosis de Wegener .

Los epítopos particularmente preferidos se derivan de isoformas de: proteína de pelo de gato Fel di; proteínas de ácaros de polvo de casa Der p 1, Der p 2, Der p 7, Der p 3 a 15, Der p 18, 20, 21 y 23, Der f 1, 2, 7, 10, 11 a 18 y 20 a 22; proteína de ambrosía amb a 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9 e isoformas de los mismos que incluyen amb a 1.1, a 1.2, al.3 o al.4; proteínas de ballico lol pl y lol p5 ; proteínas de hierba Timothy phl pl y phl p5; proteínas de pasto de bermuda Cyn d 5; proteínas de Alternaría alternata Alt a 1, Alt a 2, Alt a 3 a Alt a 10, Alt a 12, Alt a 13 y Enolasa (Alt a 6), Cía h 1, 2, 5, a 10, 12, GST, HChl, HSP70 , NTF2 , TCTP; proteína de abedul Bet vi, 2, 3, 4, 6, 7, 8 y P14; proteínas de cucaracha alemana Bla g 1, Bla g 2, Bla g 3, Bla g 4, Bla g 5 y Bla g 6, 7, 8, 9, GSTD1 , Tripsina, proteína de artemisa Art v 1; proteína de cardo ruso Sal k 1, Sal k 2 y Sal k 8; cacahuate Ara hl, Ara h2, Ara h3, Ara h4 , Ara h5 , Ara h6 , profilinas vegetales o proteínas de transferencia de lípidos o un antígeno de leucocito humano.

Los péptidos particularmente preferidos comprenden o consisten de las secuencias de (ordenados con referencia al trastorno alérgico o auto/aloinmune relevante) : Alergia a gatos Secuencia de identificación MLA01 CPAVKRDVDLFLT 1 MLA04 KALPWLENARILK CV 2 MLA05 RILKNCVDAKMTEEDKE 3 MLA12 TAMKKIQDCYVENGLI 4 MLA15 ISSSKDCMGEAVQNTV Alergia a ácaros de polvo de casa HDM02 RTVTPIRMQGGCG 6 HDM03C RNQSLDLAEQELVDCASQH 7 HD 06A RYVAREQSCRRPN 8 HDM19 DQVDVKDCANHEIKK 9 HDM26 GVLACAIATHAKIR 10 HD 20 CIIHRGKPFQLEA 11 HDM 100 RFGISNYCQIYPPNVNK 12 HDM101 NYCQIYPPNVNKIREA 13 HDM102 NAQRFGIS YCQI 14 HDM203A DLRQMRTVTPIRMQGGCGS 15 HDMt el QESYYRVYAREQSCRRPNAQRF 16 HDMtre2 EPIIHRGKPFQLEAVFEANQN 17 Alergia a ambrosía RGW02A GSSQIWIDHCSLSKS 18 RG 02B GGSQIWIDHCSLSKA 19 RGW08X GSSHVTVSNCKF 20 RGW08A GSTHVTISNCKF 21 RGW08B GSTHFTVSNCLF 22 RGW12 DGCWRGKADWAENRKALADCA 83 Rechazo de transplante (HLA clase I) TRA30 HAVSDHEATLRCWAL 23 TRA31 HPISDHEATLRCWAL 24 TRA32 HPVSDHEATLRCWAL 25 TRA39 RCWALSFYPAEITLT 26 TRA40 RCWALGFYPAEITLT 27 (Neonatal) Trombocitopenia aloinmune (glucoproteína Illa) AIT VSPMCAWCSDEALPLGSPRCDLKENLLKD 28 AITa VSPMCAWCSDEALPL 29 NAIT01 AWCSDEALPL 30 NAIT01A AWCSDEALPLGSPR 31 NAIT02 AWCSDEALPLGSPRCDLK 32 NAIT02A AWSSDEALPLGSPRCDLK 33 NAIT02B AWGSDEALPLGSPRCDLK 34 NAIT0 C AWCSDEALPLGSPRSDLK 35 NAIT02D AWCSDEALPLGSPRGDLK 36 AIT02 TTRGVSSCQQCLAVS 37 AIT47 DLPEELSLSFNATCL 38 AIT53 FKDSLIVQTFDCDC 39 AIT70 PGSYEDTCEKCPTCP 40 AIT77 DDCWRFQYYEDSSG 41 Enfermedad hemolitica Rhesus D del recién nacido RHD28 AYFGLSVAQ CLPKPL 42 Alergia a alternaría Al SDDITYVATATLPNYCRAGGNGP 62 A2 RNGFKRCLQFTLYRPRDLLSLLNE 63 A3 AIELKSCNALLLKVNQIGTITEA 64 A4 EFIKKAIELKSCN 65 A5 IELKSCNALLLK 66 A6 CAEYGADLAITYNS AEGAEK A 67 A7 ATELKGAYVYFASDASSYCTG 68 A8 SDDITYVATATLPNYCRAGGNG 69 A9 AIHWVNFGIYFNHGQACCAG 70 AIO CAEMGAAVAITYASRAQGAEENV 71 All YNVAKAGCI 72 A12 AISWVNFGIFFNHGQCCCAG 73 Al3 PDTFNYVKKEPIGVCRS 74 A14 SYNVAKAGCIHLAK 75 Alergia a abedul Bl CNEIKIVATPDGGSI 76 B2 CNEIKLVATPDGGST 77 B3 CNEIKIVATPDGGCV 78 B4 SNEIKIVATPDGGC 79 B5 SNEIKIVTTPDGGCV 80 B6 CNEIKIVAAPGGGSILK 81 B7 AENFRALCTGEKGNG 82 Las secuencias de ácaros del polvo de casa mostradas antes típicamente se derivan de las especies de acaro Dermatophagoides pteronyssinus . Las variantes preferidas de estas secuencias incluyen secuencias homologas derivadas de especies de ácaros relacionados Dermatophagoid.es farinae . Estas se indican en la Tabla siguiente por el identificador Otras variantes preferidas de los péptidos de la invención incluyen cortes o extensiones de l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ó 17 aminoácidos en las partes N y/o C terminal de un péptido dado. Los ejemplos de extensiones preferidas y cortes del péptido de acaro de polvo de casa HDM03C también se muestran en lo siguiente como HD 03M, P y W.

Cuando los polipéptidos comprenden residuos los cuales típicamente son difíciles de conservar durante la manufactura, estos residuos se pueden sustituir. Por ejemplo, un glutamato o un residuo glutamina forman espontáneamente piroglutamato en solución, particularmente cuando están presentes en la parte N terminal de un péptido. De esta manera, los residuos de los péptidos de la invención los cuales corresponden a glutamato o glutamina en la secuencia de una secuencia de proteína nativa se pueden sustituir con poliglutamato en los péptidos de la invención cuando estos residuos están presentes en la parte N terminal de un péptido. Por ejemplo HDM03W_n (SEC ID NO: 54) puede tener un piroglutamato en lugar de E en la parte N terminal .

En una modalidad, la composición de la invención comprende los péptidos de la SEC ID NO: 1 a 4. La composición puede comprender además los péptidos de las SEC ID NOS. 83 a 85 y opcionalmente sin péptidos adicionales.

Otros componentes Como se apreciará de la sección anterior en relación al liofilizado, las composiciones las cuales van a ser liofilizadas típicamente comprenden componentes adicionales así como material biológico de interés. La presente invención se relaciona con el uso de una combinación de componentes adicionales para evitar o reducir la dimerización de por lo menos un péptido en las composiciones de la invención, por lo que se genera una composición liofilizada más estable. La presente invención también se relaciona con métodos para la elaboración de estas composiciones. Los presentes inventores han determinado que la combinación de (i) un carbohidrato no reductor y (ii) por lo menos un agente que inhibe la formación de dímeros proporciona este efecto.

Como se menciona en la presente, los carbohidratos y compuestos relacionados tienen la ventaja de que sean útiles como crio- y lioprotectores durante el procedimiento de liofilizado. No obstante, no evitan la formación de dímeros por un péptido comprendido dentro del producto liofilizado final durante su almacenamiento. Se requieren componentes adicionales para obtener esto. Es decir, por lo menos un agente el cual inhiba la formación de dímeros por péptidos también se debe incluir. Los agentes los cuales inhiben la formación de dímeros en las composiciones peptídicas para propósitos farmacéuticos típicamente deben ser farmacéuticamente aceptables. Estos agentes incluyen agentes adecuados para reducir un enlace disulfuro, agentes antioxidantes o agentes conservadores. Los agentes reductores adecuados incluyen cualquier compuesto de trialquilfosfina que incluyen tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP, por sus siglas en inglés) , 2-mercaptoetanol y ditiotreitol (DTT, por sus siglas en inglés) . Otros agentes adecuados incluyen tioglicerol, tioanisol y cisteína. Se prefiere particularmente tioglicerol.

Con el fin de evitar eficazmente la formación de dímeros, los agentes idealmente deben estar presentes por lo menos en una concentración molar equivalente a la del material el cual es susceptible de formación de dímero, cuando se mide antes del congelamiento. Así, en donde el material susceptible a la formación de dimeros es uno o más péptidos que comprende por lo menos un residuo cisteína libre, el agente está presente por lo menos en una concentración molar equivalente a la concentración de uno o más péptidos que comprenden por lo menos un residuo cisteína libre. La concentración de otros componentes, tales como péptidos los cuales no contienen un residuos cisteína libre, típicamente no se toma en consideración. Es decir, en donde una composición comprende, por ejemplo, cuatro péptidos los cuales contienen un residuo cisteína libre y tres péptidos los cuales no contienen un residuo cisteína libre, la concentración del agente el cual inhibe la formación de dimeros se determina en relación a la concentración general de los cuatro péptidos que contienen cisteína libre., La concentración de los tres péptidos los cuales no contienen cisteína y de cualquier otro componente en la composición no es relevante para el nivel de agente que se requiere.

En una modalidad, por lo menos un agente el cual inhibe la formación de dimeros puede estar presente en mayor o menor grado que el material el cual es susceptible de formación de dimeros, cuando se mide antes de congelamiento, con la condición de que la prevención del dímero se evite eficazmente. En una modalidad particular, el agente está presente en una cantidad mayor que el material el cual es susceptible a la formación del dímero. Por ejemplo, el agente puede estar presente en una concentración molar la cual es por lo menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 ó 1000 veces mayor que la concentración molar del material el cual es susceptible a formación del dímero. Preferiblemente, el agente está presente en una concentración molar la cual es por lo menos entre 60 y 80 veces mayor que la concentración molar del material el cual es susceptible de formación de dímero. Por ejemplo, cuando el material está presente en una concentración molar de 200 µ?, el agente preferiblemente estará presente en una concentración molar de entre 12 mM y 16 mM.

Esta situación se aplica, por ejemplo, en una composición "baja" de tioglicerol en el ejemplo 4, en donde cuatro péptidos contienen por lo menos una cisteína libre están presentes, cada uno, a 50 µ? y tres péptidos que no contienen cisteína también están presentes, cada uno, en 50 µ?. De esta manera, en un litro de esta composición existen 350 micromoles de péptido total (siete péptidos) y 200 micromoles de péptidos con cisteína libre (cuatro péptidos con cisteína libre) . En consecuencia, el material susceptible para formación de dimeros se encuentra a 200 µ? y el tioglicerol está presente en una concentración de 14 mM, la cual es 70 veces mayor.

De manera alternativa, el agente puede estar presente en una concentración molar la cual es por lo menos entre 30 y 40 veces mayor que la concentración molar del material el cual es susceptible de la formación de dímero. Por ejemplo, cuando el material está presente en una concentración molar de 400 µ?, el agente preferiblemente estará presente en una concentración molar de entre 12 mM y 16 mM.

Esta situación se puede aplicar, por ejemplo, en la composición "baja" en tioglicerol en el ejemplo 4, si todos los péptidos están presentes a 100 µ? en vez e 50 µ?. Esto es, en un litro de esta composición existen 700 micromoles de péptido total (siete péptidos) y 400 micromoles de péptidos con cisteína libre (4 péptidos con cisteína libre) . En consecuencia, el material susceptible de formación de dimeros está a 400 ? y el tioglicerol está presente en una concentración de 14 mM, la cual es 35 veces mayor.

El material típicamente es por lo menos un péptido que comprende por lo menos un residuo cisteína libre. El límite inferior de la cantidad de péptido presente en la composición antes del congelamiento es una proporción la cual típicamente será de aproximadamente 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.15, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4 ó 1.5% p/p O p/v . El límite superior de la cantidad de péptido presente en la composición antes del congelamiento como una proporción típicamente será de aproximadamente 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 3, 4 ó 5% p/p o p/v. Se reconocerá que la cantidad de péptido típicamente puede estar entre cualquiera de los límites inferiores combinados independientemente con cualquiera de los límites superiores establecidos en lo anterior. Por lo menos un agente el cual inhibe la formación de dímero por lo tanto estará presente en un intervalo similar como una proporción de la composición, con la condición de que la concentración total del agente sea por lo menos a una concentración molar equivalente respecto a la concentración total de péptidos que comprenden por lo menos un residuo cisteína libre en la composición antes del congelamiento. Por ejemplo, si la concentración total de péptidos que comprenden por lo menos un residuo cisteína libre es 0.03 nmol/ml, la concentración de agente total será de por lo menos 0.03 nmol/ml. Si la concentración total de péptidos que comprenden por lo menos un residuo cisteína libre es 500 nmol/ml, la concentración de agente total será de por lo menos 500 nmol/ml.

También se apreciará que por lo menos un agente típicamente se puede incluir en una proporción mayor en relación al péptido como se explica en lo anterior, por ejemplo para asegurar que se reduce . efectivamente la formación de dímero. Además, el límite superior para la concentración total del agente típicamente puede tomar en consideración los requerimientos clínicos o limitaciones como se aplican a composiciones farmacéuticas. Por ejemplo, una solución reconstituida para inyección típicamente tendrá un máximo de 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5 ó 4.0%, p/p o p/v del agente. Esto corresponde a aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35 ó 40% p/p o p/v, respectivamente, en el producto liofilizado. En consecuencia, la cantidad de péptido en el producto puede necesitar estar limitada para cumplir con estos requerimientos clínicos.

Se comprenderá por los expertos en el ámbito que la proporción de cualquier componente en la composición antes del congelamiento típicamente corresponderá a una proporción de aproximadamente 5 a 10 veces mayor en la composición liofilizada final.

La dificultad al incluir por lo menos un agente que inhiba la formación de dímero en una composición liofilizada es que, como lo han determinado los presentes inventores, los agentes escapan de un producto liofilizado, particularmente cuando el producto se almacena por períodos de tiempo prolongados a temperatura ambiente o cuando el producto se expone a incrementos súbitos de temperatura. Los agentes típicamente son volátiles y por lo tanto no son retenidos en el producto final y el cual experimenta daño y degradación durante almacenamiento y transporte con lo que se reduce su vida de anaquel estable, o es inaceptable para uso farmacéutico. Por ejemplo, debido a los cambios en la apariencia de la composición liofilizada o la solución reconstituida a partir de la misma. con el fin de superar esta dificultad, los presentes inventores han diseñado combinaciones de carbohidratos no reductores y agentes inhibidores de dímeros los cuales no resultan es escape de los agentes del producto liofilizado final. Con el fin de obtener esto, es necesario que la composición liofilizada tenga una estructura amorfa. En consecuencia, un carbohidrato no reductor el cual es particularmente adecuado para uso en la presente invención es un carbohidrato el cual es amorfo cuando se liofiliza, denominado en la presente como un "carbohidrato amorfo" . Con el fin de asegurar que la composición en su totalidad tenga una estructura amorfa cuando se liofiliza, el carbohidrato o los carbohidratos amorfos en las composiciones de la invención típicamente estarán presentes en una cantidad la cual es por lo menos 50%, pero de manera más preferible por lo menos 60%, 70% u 80% y de manera más preferible por lo menos 90% de la proporción de los componentes totales de la composición liofilizada.

De manera alternativa, se puede obtener una estructura amorfa general con una proporción de carbohidrato amorfo que sea inferior a 50% como una proporción de los componentes totales de la composición. Esto se puede obtener si el carbohidrato amorfo se utiliza en combinación con un carbohidrato el cual sea cristalino al liofilizar, denominado en la presente como un "carbohidrato cristalino" . No obstante, para que tal combinación retenga parte de la estructura amorfa en la cual se dispersan las moléculas biológicas de interés, típicamente será necesario llevar a cabo un calentamiento y enfriamiento cíclico de composición durante la etapa de congelamiento del procedimiento de liofilizado. Este calentamiento y enfriamiento cíclico habitualmente se denomina como recocido y cuando se lleva a cabo en condiciones apropiadas puede resultar en la formación de una estructura de torta cristalina/amorfa mixta. En este caso, el carbohidrato o los carbohidratos amorfos en la composición de la invención típicamente estarán presentes en una cantidad la cual es por lo menos 20% de la proporción de los componentes totales de la composición.

Los carbohidratos preferidos particularmente para los usos de la invención incluyen maltulosa, iso-maltulosa, lactulosa y sacarosa, maltosa, lactosa, isomaltosa y alcoholes de azúcar de los mismos, maltitol, lactitol, palatinito, una mezcla de a-D-glucopiranosilmanitol y a-D-glucopiranosil sorbitol y sus alcoholes de azúcar individuales, glucósidos no reductores de compuestos polihidroxi que se seleccionan de alcoholes de azúcar, otros polialcoholes de cadena lineal, trehalosa, sacarosa, rafinosa, estaquiosa, melezitosa y dextrano.

Los carbohidratos preferidos son di, tri- y tetrasacáridos no reductores que incluyen trehalosa, sacarosa, rafinosa, estaquiosa y melezitosa. Se prefiere particularmente la trehalosa.

De manera ideal, el carbohidrato debe tener una Tg (temperatura de transición vitrea) por lo menos 5, 10, 15 o de manera más preferible 20°C por encima de la temperatura de almacenamiento anticipada más alta del producto liofilizado final para una mejor estabilidad. Los valores reportados para Tg y los parámetros relacionados para algunos carbohidratos preferidos se muestran a continuación.

Compuesto Tg (°C) Tg' Sacarosa 43-65 aproximadamente -46 Rafinosa 70-106 aproximadamente -36 Trehalosa 63-115 aproximadamente -27 Melezitosa > 100 Estaquiosa 81-123 Tg = temperatura de transición vitrea; Tg' = Tg para el estado concentrado y congelado de manera máxima; Como se demuestra en la presente, la estructura amorfa de los carbohidratos liofilizados atrapa al agente el cual inhibe la formación de dímeros dentro del producto liofilizado final. Esto contrasta con los materiales los cuales tienen una estructura cristalina cuando lo utilizan. Los materiales cristalinos o mixtos/amorfos se han preferido previamente para aplicaciones del liofilizado del tipo descrito en la presente, en parte debido a que la "torta" liofilizada final típicamente tiene una apariencia más atractiva y ciclos de secado más cortos y más agresivos se pueden utilizar.

De esta manera, la presente invención se relaciona con el uso de (i) por lo menos un carbohidrato no reductor, y (ii) por lo menos un agente el cual inhibe la formación de dímeros en una composición liofilizada que comprende por lo menos un péptido que comprende un residuo cisteína libre, en donde el uso es para evitar o reducir la dimerización de por lo menos un péptido en la composición. Por lo menos un agente el cual inhibe la formación de dímeros se retiene en el producto liofilizado por la estructura amorfa de por lo menos un carbohidrato y de esta manera es capaz de reducir o evitar la dimerización del péptido o los péptidos en el mismo a través de la duración de almacenamiento del producto. De esta manera, se obtiene una duración de anaquel estable la cual idealmente es de por lo menos 1 año o por lo menos 2 años a 5 ± 3°C, 25°C/60% de HR, 30°C/65% de HR o 40°C/75% de HR.

De acuerdo con lo anterior, una modalidad preferida de la invención se relaciona con el uso de (i) por lo menos un carbohidrato no reductor que se selecciona de trehalosa, sacarosa, rafinosa, estaquiosa o melezitosa, y (ii) tioglicerol, en una composición liofilizada que comprende por lo menos un péptido que comprende por lo menos un residuo cisteína libre, en donde el uso es para evitar o reducir la dimerización de por lo menos un péptido en la composición.

En una modalidad particularmente preferida, el carbohidrato no reductor es trehalosa o sacarosa, de manera más preferible trehalosa.

Aunque no se desea unir alguna hipótesis específica, los inventores consideran que esta modalidad es particularmente ventajosa debido a la buena retención de tioglicerol en la torta liofilizada. Previamente se ha considerado al tioglicerol menos adecuado para incorporación en composiciones liofilizadas debido a que no se congela a si mismo para formar un vidrio bajo condiciones típicas de liofilizado, es decir, permanece líquido a temperaturas tan bajas como -80°C. No obstante, en la presente invención se demuestra que se puede retener tioglicerol, particularmente en combinación con trehalosa sin ningún signo de escape o impacto negativo en la calidad física de la torta liofilizada. La presencia de tioglicerol evita eficazmente la formación de dimeros peptídicos en la composición.

COMPOSICIONES RECONSTITUIDAS DE LA INVENCION Se apreciará que estas composiciones liofilizadas elaboradas de acuerdo con la invención se puede reconstituir en solución, típicamente en una solución acuosa adecuada para inyección, tal como agua estéril sin pirógenos. Idealmente, la solución será isotónica/iso-osmolar y por lo tanto adecuada para inyección parenteral .

La composición reconstituida típicamente tendrá una proporción mínima de péptido presente como un dímero. Esto es, se puede evitar eficazmente la formación de dimeros. Mediante una proporción mínima del péptido presente como un dímero se quiere indicar que está presente la solución como un dímero un máximo de 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.05% o 0.01%. Se comprenderá que la proporción de péptido presente como un dímero en solución será la proporción presente como dímero después de un período de tiempo adecuado en solución. Los períodos de tiempo adecuado se incluyen a intervalos de tiempo que una persona experta en el ámbito esperará razonablemente mantener una secuencia en solución antes de usarla. Por ejemplo, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 48 horas o aproximadamente 72 horas. La proporción de un péptido presente en una forma dada se puede determinar por cualquier método adecuado .

La composición reconstituida típicamente será una formulación farmacéutica para tolerizar (generar tolerancia) o inmunizar a un individuo contra una proteína de la cual se deriva el péptido comprendido en la composición. De esta manera, la composición reconstituida puede comprender uno o más portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables y opcionalmente uno o más ingredientes terapéuticos adicionales . Uno o varios de los portadores deben ser "aceptables" en el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de la formulación (en particular, no deben promover la formación de dímeros) y no deben ser perjudiciales a quien la reciba. Típicamente, los portadores para inyección y la formulación final son estériles y sin pirógenos . Los componentes adicionales pueden haber estado presentes en la composición liofilizado o se pueden agregar durante o después de la reconstitución. De esta manera, pueden estar presentes sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsificantes , modificadores de pH o sustancias amortiguadoras, antioxidantes, agentes quelantes y similares. Estos excipientes, vehículos y sustancias auxiliares generalmente son agentes farmacéuticos que no introducen una respuesta inmunitaria en el individuo que recibe la composición y los cuales se pueden administrar sin toxicidad indebida. Los excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a líquidos tales como agua, solución salina, polietilenglicol , ácido hialurónico y etanol . Las sales farmacéuticamente aceptables también se pueden incluir en la misma, por ejemplo sales de ácido mineral tal como clorhidratos, bromhidratos , fosfatos, sulfatos y similares; y las sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y similares. Una profunda discusión de los excipientes, vehículos y sustancias auxiliares aceptables farmacéuticamente está disponible en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co. , N. J. 1991) .

Las composiciones de la invención comprenderán una concentración adecuada de cada péptido que sea eficaz sin provocar reacciones adversas. Típicamente, para uso en tolerización, la concentración de cada péptido en la composición estará en un intervalo de 0.03 a 500 nmol/ml, o 0.03 a 200 nmol/ml. De manera más preferible, estará en el intervalo de 0.3 a 200 nmol/ml, 3 a 180 nmol/ml, 10 a 150 nmol/ml o 30 a 120 nmol/ml. Se prefiere particularmente el intervalo de 3 a 12 nmol/ml. La composición debe tener una pureza de más de 90% ó 95%, ó 98% o una pureza de por lo menos 99%. Los volúmenes de inyección típicamente pueden ser de 60 µ? ó 120 µ?.

Por lo tanto, se puede formular una composición la cual comprende una molécula y/o célula de la invención y también una o más moléculas terapéuticas adicionales. De manera alternativa, una composición de la invención se puede utilizar de modo simultáneo, secuencial o separado con una o más composiciones terapéuticas como parte de un tratamiento combinado .

Típicamente, para uso en inmunización, la composición proporcionará una presentación que, una vez reconstituida, permita la administración de entre 1 µg y 10 mg de cada péptido. De modo más preferible, una cantidad de cada péptido está en el intervalo de 3 a 5 mg, 5 µ? a 5 mg, 10 yg a 2 mg o 20 pg a 1 mg. La concentración de cada péptido dependerá de la vía de administración pero típicamente se suministrarán por vía intradérmica, subcutánea, intramuscular, intravenosa, oral, intranasal o por inhalación. La composición debe tener una pureza mayor de 90%, ó 95% o 98% o una pureza de por lo menos 99%.

METODOS TERAPEUTICOS E INDIVIDUOS QUE VAN A SER TRATADOS La presente invención se relaciona con composiciones que comprenden por lo menos un péptido que es capaz de modular el sistema inmunitario de un individuo.

El término "modular" significa sensibilizar o inducir inmunidad en individuos hacia una proteína de la cual por lo menos un péptido de las composiciones de la invención se deriva. En este caso, la proteína típicamente es una proteína de antígeno tumoral o una proteína de antígeno de una enfermedad infecciosa tales como aquellas causadas por hepatitis y virus de papiloma humano. Las composiciones de la invención por lo tanto son útiles para la prevención o tratamiento de cáncer o enfermedades infecciosas.

De manera alternativa, el término "modular" puede indicar desensibilizar o tolerizar a individuos hacia una proteína de la cual se deriva por lo menos un péptido de las composiciones de la invención. En este caso, la proteína típicamente es un alérgeno u otro antígeno al cual es indeseable una respuesta inmunitaria. Los ejemplos de estos antígenos incluyen antígenos asociados con enfermedades autoinmunes, antígenos asociados con enfermedad de rechazo inverso (injerto versus huésped) o rechazo de transplante (denominado en la presente como condiciones aloinmunes) y antígenos asociados con respuestas inmunes materno-fetales, por ejemplo enfermedad hemolítica Rhesus D del recién nacido. Las composiciones de la invención por lo tanto son útiles en la prevención o tratamiento de enfermedades alérgicas, enfermedades autoinmunes, una condición aloinmune o una respuesta inmunitaria materno-fetal .

La invención proporciona composiciones para uso en la prevención o tratamiento de las condiciones anteriores. La invención también proporciona un método para evitar o tratar a un sujeto que tiene las condiciones anteriores, que comprende administrar una composición reconstituida de la invención. El individuo que va a ser tratado o a quien se le va a proporcionar la composición de la invención preferiblemente es un ser humano.

Cuando se desea desensibilización /tolerización, se apreciará que el individuo que va a ser tratado puede ser conocido por ser sensibilizado a un alérgeno o antígeno particular, en riesgo de ser sensibilizado o sospechoso de Ser sensibilizado. El individuo puede ser probado para sensibilización utilizando técnicas bien conocidas en el ámbito como las que se describen en este documento. Alternativamente, el individuo puede tener antecedentes familiares de las condiciones descritas antes. Puede no ser necesario probar a un individuo para sensibilización a alérgenos debido a que el individuo puede mostrar síntomas de alergia cuando se pone en proximidad con una fuente de alérgeno adecuada. Mediante el término proximidad se quiere indicar 10 metros o menos, 5 metros o menos, 2 metros o menos, 1 metro o menos O 0 metros de la fuente. Los síntomas de alergia pueden incluir comezón en los ojos, escurrimiento nasal, dificultades para respirar, piel con comezón y enrojecimiento o exantema. El individuo que va a ser tratado para la enfermedad alérgica puede haber presentado alergia durante las últimas 2 semanas, 1 mes, 6 meses, 1 año o 5 años. El individuo puede sufrir de exantema, congestión nasal, descarga nasal y/o tos causada por la alergia. El individuo puede no habérsele administrado con otras composiciones/compuestos las cuales tratan alergia.

En general, el individuo que va a ser tratado puede ser de cualquier edad. No obstante, de manera preferible, el individuo puede estar en el grupo de edades de 1 a 90 años, 5 a 60, 10 a 40 o de manera más preferible 18 a 35 años. Preferiblemente, el individuo que va a ser tratado es de una población que tiene frecuencias de alelo MHC dentro del intervalo de frecuencias que son representativas de la población caucásica. Las frecuencias de alelo de población de referencia para 11 familias de alelo DRBl comunes se muestran a continuación: Las frecuencias de referencia se obtienen por análisis de estudios múltiples que reportan frecuencias y las cantidades que se muestran son medias de valores. Preferiblemente, por lo tanto, el individuo que va a ser tratado es de una población que tiene frecuencias de alelo MHC equivalentes como la población de referencia para los alelos a los que se hace referencia en la tabla anterior (tal como para por lo menos 1, 2, 3, 4, 5 o todos los alelos), por ejemplo dentro de los intervalos de los valores anteriores más o menos 1, 2, 3, 5, 10, 15 ó 20%.

Preferiblemente, el individuo es de una población en donde las frecuencias de alelo de los siguientes alelos DRB1 es : 4 - por lo menos 9% 7 - por lo menos 10% 11 - por lo menos 8%.

La invención es particularmente adecuada para uso con individuos quienes pueden necesitar recibir administraciones múltiples de las composiciones de la invención como se describe en lo anterior. Los péptidos los cuales son más susceptibles a formación de dímeros en comparación con los péptidos de la invención es más probable que induzcan una respuesta adversa en un individuo quien recibe administraciones múltiples. Dado que los péptidos monoméricos típicamente son menos inflamatorios que los péptidos diméricos, la invención también es adecuada particularmente para administración a un individuo quien tiene o está en riesgo de una condición, en donde la condición está caracterizada por una reacción inflamatoria adversa a un tratamiento que comprende un péptido. Una reacción inflamatoria adversa a un tratamiento que comprende un péptido se puede diagnosticar como un resultado del inicio de cualquiera de los síntomas de alergia como se define en lo anterior seguido por la administración de un tratamiento que comprende un péptido. Se puede considerar a un individuo que está en riesgo de tal reacción por cualquier razón médica adecuada, por ejemplo un antecedente familiar de reacciones similares, antecedentes médicos personales de respuestas alérgicas múltiples o respuestas fuertemente positivas de muestras cutáneas o parches cutáneos a alérgenos comunes.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención: EJEMPLOS Los siguientes ejemplos y ejemplos comparativos muestran el desempeño de las diferentes composiciones bajo condiciones de almacenamiento diferentes. Cada una de las diferentes composiciones comprende los péptidos que consisten de las secuencias de SEC ID NOS : 1 a 4 (péptidos MLA01, 04, 05 y 12) y tres péptidos adicionales: MLA03 (EQVAQYKALPWLENA (SEC ID NO: 84)), MLA07 (KENALSLLDKIYTPSL (SEC ID NO: 85)) y MLA14 (SRVLDGLVMTTISSSK (SEC ID NO : 86)).

En todos los casos, la composición se prepara en solución antes de someterse a liofilización. Las condiciones de liofilización se seleccionan como apropiadas para cada composición y se muestra para cada una un ciclo de liofilizado típico. La degradación de péptidos durante el procedimiento de liofilizado se mide al comparar el nivel de degradación de péptido en una muestra de solución antes y después del procedimiento. Todas las composiciones probadas experimentaron solo degradación menor de péptidos durante el procedimiento de liofilizado (datos no mostrados) .

Después del liofilizado se almacenó una muestra de de cada composición a una diversidad de condiciones diferentes (-80°C, 5°C, 25°C/65% de HR, 40°C/75% de HR) (HR: humedad relativa) hasta por 28 semanas. La degradación durante el almacenamiento del producto liofilizado final se determinó al reconstituir una muestra a intervalos y al comparar el nivel de degradación de péptido con la de una solución estándar recién preparada de MLA07.

En cada composición probada, el único componente volátil es tioglicerol. En consecuencia, se determinó la retención de tioglicerol al observar la presencia o ausencia de condensación en las paredes y en los frascos de almacenamiento .

EJEMPLO 1 - FORMULACION CON TREHALOSA CICLO DE LIOFILIZADO TIPICO Etapa Temperatura Presión de la Duración de anaquel cámara (mbar) (h.min) (°C) 1 20 1000 0 2 -40 1000 00.36 3 -40 1000 1.30 4 -24 0.05 2.00 5 -24 0.05 24.00 6 24 0.05 9.20 7 24 0.05 6.00 Componentes no peptídicos (los valores entre paréntesis indican concentraciones, en mM) trehalosa/tioglicerol/metionina (250:46:5) Características Tg' = -31.9°C Tg = 83 - 87 °C (primera corrida) Humedad residual = nd Difractograma AXS : completamente amorfo La retención de tioglicerol es excelente. No hay condensación visible en las paredes del frasco en todas las condiciones de almacenamiento. Evidentemente el tioglicerol ha sido inmovilizado dentro de la torta amorfa.

La apariencia de la torta es fracturada y no es estéticamente agradable, pero la estabilidad de almacenamiento es excelente, como se muestra desde la figura 17 hasta la figura 19. No se observó degradación de péptido significativa además de las condiciones más extremas probadas (40°C/75 de HR) después de aproximadamente 8 semanas.

EJEMPLO 2 - SERIE DE MEZCLAS BINARIAS "AMORFAS" CICLO DE LIOFILIZADO TIPICO Componentes no peptídicos (los valores entre paréntesis indican concentraciones, en mM) trehalosa/glicina/tioglicerol/metionina (165 : 95 : 46 : 5) Características Tg' = -36.7°C Tg = 62.5°C Humedad residual = 0.061%, p/v Estructura de la torta: completamente amorfa La retención de tioglicerol es excelente. No hay condensación visible en las paredes del frasco en todas las condiciones de almacenamiento. Evidentemente el tioglicerol ha sido inmovilizado dentro de la torta amorfa.

La apariencia de la torta es fracturada y no es estéticamente agradable, pero la estabilidad de almacenamiento es excelente, como se muestra desde la figura 20 hasta la figura 23. No se observó degradación de péptido significativa además de las que se obtuvieron por las condiciones más extremas probadas (40°C/75% de HR) , a las cuales se observó declinación continua del contenido de péptido . 2B Componentes no peptídicos (los valores entre paréntesis indican concentraciones, en mM) sacarosa/glicina/tioglicerol/metionina (182:78:46:5) Características Tg' = -37.8°C Tg = 38.6°C Humedad residual = 0.56%, p/v Difractograma WAXS : completamente amorfo La retención de tioglicerol es menos buena que en el ejemplo 2A, la condensación es visible en las paredes del frasco almacenado a 25°C/65% de HR. Evidentemente el tioglicerol no ha sido inmovilizado completamente dentro de la torta amorfa.

La apariencia de la torta es fracturada y no es estéticamente agradable, pero la estabilidad de almacenamiento es buena, como se muestra desde la figura 24 hasta la figura 27. La degradación significativa del péptido se observa únicamente para las condiciones más extremas probadas: 25°C/65% de HR (la cual mostró una clara declinación, particularmente después de 5 semanas) y 40°C/75% de HR (la cual mostró una estabilidad del péptido muy pobre) . 2C Componentes no peptídicos (los valores entre paréntesis indican concentraciones, en mM) trehalosa/manitol/tioglicerol/metionina (160:100:46:5) Características Tg' = -36.6°C Tg = 51.6°C Humedad residual = 0.42%, p/v Difractograma WAXS : completamente amorfo La retención de tioglicerol es menos buena que en el ejemplo 2A, la condensación es visible en las paredes del frasco almacenado a 25°C/65% de HR. Evidentemente el tioglicerol no ha sido inmovilizado completamente dentro de la torta amorfa.

La apariencia de la torta es fracturada y no es estéticamente agradable, pero la estabilidad de almacenamiento es buena, como se muestra desde la figura 28 hasta la figura 31. No se observa degradación significativa del péptido además de la que se observa en las condiciones más extremas probadas (40°C/75% de HR) en las cuales se observa una declinación continua del contenido del péptido. La estabilidad a 25°C/65% de HR es buena, aunque no tan buena como para el ejemplo 2A. 2D Componentes no peptídicos (los valores entre paréntesis indican concentraciones, en mM) sacarosa/manitol/tioglicerol/metionina (150 : 110 : 46 : 5) Características Tg' = -38.7°C Tg = ND (<25°C) Humedad residual = 0.34%, p/v Difractograma WAXS: completamente amorfo La retención de tioglicerol es menor que en el ejemplo 2A, la condensación es visible en las paredes del frasco almacenado a 25°C/65% de HR. Evidentemente el tioglicerol no ha sido inmovilizado completamente dentro de la torta amorfa.

La apariencia de la torta es fracturada y no es estéticamente agradable, pero la estabilidad al almacenamiento es menos buena que otras formulaciones, como se muestra desde la figura 32 hasta la figura 35. La degradación del péptido se observa únicamente a 25°C/65% de HR (estabilidad pobre) y a 40°C/75% de HR (estabilidad muy pobre) .

EJEMPLO COMPARATIVO 1 - SERIE DE MANITOL CICLO DE LIOFILIZACION TIPICO CIA Componentes no peptídicos (los valores entre paréntesis indican concentraciones, en mM) manitol/ tioglicerol (265:14) Características Tg1 = ninguna Tg = ninguna Humedad residual = 0.75%, p/v Estructura de la torta: cristalina La retención de tioglicerol es pobre. La condensación es visible en las paredes del frasco para todas las condiciones de almacenamiento. Evidentemente el tioglicerol no ha sido inmovilizado dentro de la torta cristalina. apariencia de la torta es buena y de este modo es estéticamente agradable, pero la estabilidad al almacenamiento es pobre, como se muestra desde la figura 1 hasta la figura 4. Se observa degradación significativa del péptido en todas las condiciones además de la más favorable (-80°C) . Es poco probable que esta condición de almacenamiento esté disponible comercialmente para un producto farmacéutico.

C1B Componentes no peptídicos ( los valores entre paréntesis indican concentraciones , en mM) manitol/tioglicerol (265:46) Características Tg' = ninguna Tg = ninguna Humedad residual = 0.33%, p/v Estructura de la torta: cristalina La retención de tioglicerol es pobre. La condensación es visible en las paredes del frasco en un grado similar que en el ejemplo CIA. Evidentemente el tioglicerol no ha sido inmovilizado dentro de la torta cristalina incluso cuando está presente a mayor.

La apariencia de la torta es buena y de este modo es estéticamente agradable, pero la estabilidad al almacenamiento es pobre, como se muestra desde la figura 5 hasta la figura 8. Se observa degradación significativa del péptido en todas las condiciones además de la más favorable (-80°C) .

C1C Componentes no peptídicos (los valores entre paréntesis indican concentraciones, en mM) manitol/tioglicerol/metionina (265 : 14 : 5) Características Tg 1 = ninguna Tg = ninguna Humedad residual = 1.04%, p/v Estructura de la torta: cristalina La retención de tioglicerol es pobre. La condensación es visible en las paredes del frasco en un grado similar a la del ejemplo CIA. Evidentemente el tioglicerol no ha sido inmovilizado dentro de la torta cristalina en presencia de metionina.

La apariencia de la torta es buena y de este modo es estéticamente agradable, pero la estabilidad al almacenamiento es pobre, como se muestra desde la figura 9 hasta la figura 12. Se observa degradación significativa del péptido en todas las condiciones además de la más favorable (-80°C) . La metionina no ha mejorado las propiedades de esta composición.

CID Componentes no peptídicos (los valores entre paréntesis indican concentraciones, en mM) manitol/tioglicerol/metionina (265 :46 : 5) Características Tg ' = ninguna Tg = ninguna Humedad residual = 0.61%, p/v Estructura de la torta: cristalina La retención de tioglicerol es pobre. La condensación es visible en las paredes del frasco en un grado similar a la del ejemplo CIA. Evidentemente el tioglicerol no ha sido inmovilizado dentro de la torta cristalina incluso cuando está presente en una concentración mayor y en presencia de metionina.

La apariencia de la torta es buena y de este manera es estéticamente agradable, pero la estabilidad al almacenamiento es pobre, como se muestra desde la figura 13 hasta la figura 16. Se observa degradación significativa del péptido en todas las condiciones además de la más favorable (-80°C) . La metionina no ha mejorado las propiedades de esta composición.

EJEMPLO COMPARATIVO 2 - SERIE DE TREHALOSA DE UNA MEZCLA BINARIA (CRISTALINA) CICLO DE LIOFILIZACION TIPICO C2A Componentes no peptídicos (los valores entre paréntesis indican concentraciones, en mM) manitol/trehalosa/tioglicerol/metionina (245:10:46:5) Características Tg1 = -58.3°C Tg = 70-73°C Tm = aproximadamente 160 °C Humedad residual = 0.11%, p/v Estructura de la torta: cristalina (no completamente) .

La retención de tioglicerol es pobre. La condensación es visible en las paredes del frasco después de 6 semanas a 25°C y 40°C. Evidentemente el tioglicerol no ha sido inmovilizado dentro de la torta cristalina.

La apariencia de la torta es buena y en esta medida es estéticamente agradable, pero la estabilidad al almacenamiento es pobre, como se muestra desde la figura 36 hasta la figura 39. Se observa degradación significativa del péptido en todas las condiciones además de las dos más favorable (5°C y -80°C) .

C2B Componentes no peptídicos (los valores entre paréntesis indican concentraciones, en mM) manitol/trehalosa/tioglicerol/metionina (235 : 20 : 46 : 5) Características Tg1 = nd Tg = nd Tm = nd Humedad residual = nd Estructura de la torta: cristalina (no completamente) .

La retención de tioglicerol es pobre. La condensación es visible en las paredes del frasco especialmente a 25°C y 40°C. Evidentemente el tioglicerol no ha sido inmovilizado dentro de la torta cristalina incluso a una concentración mayor de trehalosa.

La apariencia de la torta es buena y en esta medida es estéticamente agradable, pero la estabilidad al almacenamiento es pobre, como se muestra desde la figura 40 hasta la figura 43. Se observa degradación significativa del péptido en todas las condiciones además de las dos más favorable (5°C y -80°C) .

C2C Componentes no peptídicos (los valores entre paréntesis indican concentraciones, en mM) manitol/trehalosa/tioglicerol/metionina (225 : 30 :46 : 5) Características Tg' = nd Tg = nd Tm = nd Humedad residual = nd Estructura de la torta: cristalina (no completamente) .

La retención de tioglicerol es pobre. La condensación es visible en las paredes de los frascos, especialmente a 25°C y 40°C. Evidentemente, el tioglicerol no ha sido inmovilizado dentro de la torta cristalina incluso a una concentración aún mayor de trehalosa.

La apariencia de la torta es buena y es estéticamente agradable, pero la estabilidad al almacenamiento es pobre, como se muestra desde la figura 44 hasta la figura 47. Se observa degradación significativa del péptido en todas las condiciones además de las dos más favorables (5°C y -80°C) .

C2D Componentes no peptídicos (los valores entre paréntesis indican concentraciones, en mM) mannitol/trehalosa/tioglicerol/metionina/EDTA (245:10:46:5:0.5) Características Tg' = nd Tg = nd Tm = nd humedad residual = nd estructura de la torta: cristalina (no completamente) La apariencia de la torta es buena y en esta medida es estéticamente agradable, pero la estabilidad al almacenamiento es pobre, como se muestra desde la figura 48 hasta la figura 51. Se observa degradación significativa del péptido en todas las condiciones además de las dos más favorables (5°C y -80°C) . La adición de EDTA no afecta las propiedades de esta composición.

C2E Componentes no peptídicos (los valores entre paréntesis indican concentraciones, en mM) mannitol/trehalosa/tioglicerol/metionina/EDTA (235:20:46:5:0.5) Características Tg' = nd Tg = nd Tm = nd humedad residual = nd estructura de la torta: cristalina (no completamente) La apariencia de la torta es buena y de esta manera es estéticamente agradable, pero la estabilidad al almacenamiento es pobre, como se muestra desde la figura 52 hasta la figura 55. Se observa degradación significativa del péptido en todas las condiciones además de las dos más favorables (5°C y -80°C) . La adición de EDTA no afecta las propiedades de esta composición.

C2F Componentes no peptídicos (los valores entre paréntesis indican concentraciones, en mM) mannitol/trehalosa/tioglicerol/metionina/EDTA (225:30:46:5:0.5) Características Tg' = nd Tg = nd Tm = nd humedad residual = nd estructura de la torta: cristalina (no completamente) La retención de tioglicerol es pobre. Es visible la condensación en las paredes de los frascos, especialmente a 25°C y 40°C. Evidentemente el tioglicerol no ha sido inmovilizado dentro de la torta cristalina incluso a una concentración agregada de trehalosa y en presencia de EDTA.

La apariencia de la torta es buena y en esta medida es estéticamente agradable, pero la estabilidad al almacenamiento es pobre, como se muestra desde la figura 56 hasta la figura 59. Se observa degradación significativa del péptido en todas las condiciones además de la más favorable (-80°C) . La adición de niveles aumentados de EDTA no afecta de manera significativa las propiedades de esta composición.

EJEMPLO COMPARATIVO 3 -SERIE DE SACAROSA DE MEZCLA BINARIA "CRISTALINA" CICLO TIPICO DE LIOFILIZADO C3A Componentes no peptídicos (los valores entre paréntesis indican concentraciones, en m ) mannitol/sacarosa/tioglicerol/metionina (250:10:46:5) Características Tg' = nd Tg = nd Tm = nd humedad residual = nd estructura de la torta: cristalina (no completamente) La retención de tioglicerol es pobre. Es visible la condensación en las paredes del frasco después de 5 semanas a 25°C y 40°C. Evidentemente el tioglicerol no ha sido inmovilizado dentro de la torta cristalina.

La apariencia de la torta es buena y en esta medida es estéticamente agradable, pero la estabilidad al almacenamiento es pobre, como se muestra desde la figura 60 hasta la figura 63. Se observa degradación significativa del péptido en todas las condiciones además de las dos más favorables (5°C y -80°C) .

C3B Componentes no peptídicos (los valores entre paréntesis indican concentraciones, en mM) mannitol/sacarosa/tioglicerol/metionina (235 : 20:46:5) Características Tg' = nd Tg = nd Tm = nd humedad residual = nd estructura de la torta: cristalina (no completamente) La retención de tioglicerol es pobre. Es visible la condensación en las paredes del frasco, especialmente a 25°C y 40 °C. Evidentemente el tioglicerol no ha sido inmovilizado dentro de la torta cristalina incluso a una concentración mayor de sacarosa.

La apariencia de la torta es buena y en esta medida es estéticamente agradable, pero la estabilidad al almacenamiento es pobre, como se muestra desde la figura 64 hasta la figura 67. Se observó degradación significativa del péptido en todas las condiciones además de las dos más favorables (5°C y -80°C) .

C3C Componentes no peptídicos (los valores entre paréntesis indican concentraciones, en mM) mannitol/sacarosa/tioglicerol/metionina (225:30:46:5) Características Tg' = nd Tg = nd Tm = nd humedad residual = nd estructura de la torta: cristalina (no completamente) La retención de tioglicerol es pobre. Es visible la condensación en las paredes del frasco después de 5 semanas, especialmente a 25°C y 40°C. Evidentemente el tioglicerol no ha sido inmovilizado dentro de la torta cristalina incluso a una concentración aún mayor de sacarosa.

La apariencia de la torta es buena y en esta medida es estéticamente agradable, pero la estabilidad al almacenamiento es pobre, como se muestra desde la figura 68 hasta la figura 71. Se observó degradación significativa del péptido en todas las condiciones además de las dos más favorables (5°C y -80°C) .

C3D Componentes no peptídicos (los valores entre paréntesis indican concentraciones, en mM) mannitol/sacarosa/tioglicerol/metionina/EDTA (245:10:46:5:0.5) Características Tg' = nd Tg = nd Tm = nd humedad residual = nd estructura de la torta: cristalina (no completamente) La retención de tioglicerol es pobre. Es visible la condensación en las paredes de los frascos después de 5 semanas, especialmente a 25°C y 40°C. Evidentemente el tioglicerol no ha sido inmovilizado dentro de la torta cristalina incluso a una concentración aún mayor de sacarosa.

La apariencia de la torta es buena de manera que es estéticamente agradable, pero la estabilidad al almacenamiento es pobre, como se muestra desde la figura 72 hasta la figura 75. Se observó una degradación significativa del péptido en todas las condiciones además de las dos más favorables (5°C y -80°C) .

C3E Componentes no peptídicos (los valores entre paréntesis indican concentraciones, en mM) mannitol/sacarosa/tioglicerol/metionina/EDTA (235:20:46:5:0.5) Características Tg' = nd Tg = nd Tm = nd humedad residual = nd estructura de la torta: cristalina (no completamente) La retención de tioglicerol es pobre. Es visible la condensación en las paredes del frasco después de 5 semanas, especialmente a 25°C y 40°C. Evidentemente el tioglicerol no ha sido inmovilizado dentro de la torta cristalina.

La apariencia de la torta es buena y de esta manera es estéticamente agradable, pero la estabilidad al almacenamiento es pobre, como se muestra, desde la figura 76 hasta la figura 79. Se observa degradación significativa del péptido en todas las condiciones además de las dos más favorables (5°C y -80°C) . La adición de EDTA no afecta las propiedades de esta composición.

C3F Componentes no peptídicos (los valores entre paréntesis indican concentraciones, en mM) mannitol/sacarosa/tioglicerol/metionina/EDTA (225:30:46:5:05) Características Tg' = nd Tg = nd Tm = nd humedad residual = nd estructura de la torta: cristalina (no completamente) La retención de tioglicerol es pobre. Es visible la condensación en las paredes del frasco después de 5 semanas, especialmente a 25°C y 40°C. Evidentemente el tioglicerol no ha sido inmovilizado dentro de la torta cristalina incluso a una concentración alta de sacarosa y en presencia de EDTA.

La apariencia de la torta es buena y en esta medida es estéticamente agradable, pero la estabilidad al almacenamiento es pobre, como se muestra desde la figura 80 hasta la figura 83. Se observa degradación significativa del péptido en todas las condiciones además de las dos más favorables (5°C y -80°C). La adición de EDTA no afecta las propiedades de esta composición.

EJEMPLO 4 Una formulación basada en los hallazgos del ejemplo 1 se prueba adicionalmente para estabilidad a largo plazo. La siguiente formulación (denominada "alta" en tioglicerol) se almacena hasta por un año a 30°C/65% de HR: Las concentraciones se proporcionan para la composición cuando se encuentra en estado líquido, es decir, antes de liofilizado y después de reconstitución. Se prueba una formulación alternativa ("baja" en tioglicerol) bajo las mismas condiciones y es idéntica, excepto que el tioglicerol está presente a 14 mM en vez de 46 mM. La degradación del péptido se monitorea a intervalos, como se muestra en la figura 84. Los resultados indican que ambas formulaciones presentan excelente estabilidad del péptido durante el período de prueba.

LEYENDAS DE LAS FIGURAS hace constar que con relación a esta fecha, mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (19)

REIVI DICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. El uso de (i) por lo menos un carbohidrato no reductor que se selecciona de trehalosa, sacarosa, rafinosa, estaquiosa o melezitosa, y (ii) tioglicerol, en una composición liofilizada que comprende por lo menos un péptido que comprende por lo menos un residuo cisteína libre, en donde el uso es para evitar o reducir la dimerización de por lo menos un péptido en la composición.

2. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el carbohidrato no reductor es trehalosa.

3. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el carbohidrato no reductor está presente como por lo menos 50%, como una proporción de los componentes totales de la composición liofilizada final y en donde el tioglicerol está presente antes del congelamiento por lo menos en una concentración molar equivalente a la concentración de los componentes peptídicos de la composición que comprende por lo menos un residuo cisteína libre.

4. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde por lo menos un péptido es para uso en la tolerización o inmunización, tiene una longitud de 8 a 30 aminoácidos y comprende: (a) por lo menos un residuo cisteína; y (b) una región que comprende por lo menos un epítopo de linfocitos T.

5. El uso de conformidad con la reivindicación 4, en donde el epítopo se deriva de : a) un alérgeno que se selecciona de: un alérgeno vegetal (particularmente un alérgeno de pasto) , alérgenos de pelo de animal, un alérgeno de moho o micótico, un alérgeno de polvo, un antibiótico u otro medicamento, un veneno de insecto que pica, un alérgeno ambiental o un alérgeno de alimento; o b) un antígeno que se selecciona de los antígenos principales asociados con encefalomielitis diseminada aguda (ADEM) ; enfermedad de Addison; espondilitis anquilosante; síndrome de anticuerpo antifosfolipídico (APS) ; anemia aplásica; hepatitis autoinmune; Ooforitis autoinmune; enfermedad cilíaca; enfermedad de Crohn; diabetes mellitus tipo 1; penfigoide gestacional; síndrome de Goodpasture; enfermedad de Graves; síndrome de Guillain-Barré (GBS) ; enfermedad de Hashimoto; púrpura trombocitopénica idiopática; enfermedad de Kawasaki; lupus eritematoso, esclerosis múltiple; miastenia grave; narcolepsia; síndrome de mioclono opsoclono (OMS) ; neuritis óptica; tiroiditis de Ord; pénfigo; anemia perniciosa; poliartritis en perros; cirrosis biliar primaria; artritis reumatoide; síndrome de Reiter; síndrome de Sjógren; arteritis de Takayasu; arteritis temporal (también conocida como "arteritis de células gigantes"); anemia hemolítica autoinmune de Warm; o granulomatosis de Wegener .

6. El uso de conformidad con la reivindicación 4 , en donde el epítopo se deriva de : proteína de pelo de gato Fel di; proteínas de ácaros de polvo de casa Der p 1, Der p 2, Der p 7, Der p 3 a 15, Der p 18, 20, 21 y 23, Der f 1, 2, 7, 10, 11 a 18 y 20 a 22; proteína de ambrosía amb a l, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9 e isoformas de las mismas que incluyen amb a 1.1, a 1.2, a 1.3 o a 1.4; proteínas de ballico lol pl y lol p5 ; proteínas de pasto Timothy phl pl y phl p5; proteínas de pasto de bermuda Cyn d 5; proteínas de Alternaría alternata Alt a 1, Alt a 2, Alt a 3 a Alt a 10, Alt a 12, Alt a 13 y Enolasa (Alt a 6), Cía h 1, 2, 5, a 10, 12, GST, HChl, HSP70, NTF2, TCTP; proteína de abedul Bet vi, 2, 3, 4, 6, 7, 8 y P14; proteínas de cucaracha alemana Bla g 1, Bla g 2, Bla g 3, Bla g 4, Bla g 5 y Bla g 6, 7, 8, 9, GSTD1, Tripsina, proteína de artemisa Art v 1; proteína de cardo ruso Sal k 1, Sal k 2 y Sal k 8 ; cacahuate Ara hl , Ara h2 , Ara h3 , Ara h , Ara h5, Ara h6 , profilinas vegetales o proteínas de transferencia de lípidos o un antígeno de leucocito humano.

7. El uso de conformidad con la reivindicación 4, en donde por lo menos un péptido comprende o consiste de la secuencia de cualquiera de las SEC ID NOS: 1 a 58.

8. El uso de conformidad con la reivindicación 4, en donde la composición comprende a los péptidos las SEC ID NOS: 1 a 4.

9. El uso de conformidad con la reivindicación 8, en donde la composición comprende además los péptidos de las SEC ID NOS: 84 a 86 y opcionalmente sin péptidos adicionales.

10. Un método para producir una composición liofilizada estable que comprende por lo menos un péptido, caracterizado porque comprende: a) preparar una composición que comprende, en solución: (i) por lo menos un carbohidrato no reductor que se selecciona de trehalosa, sacarosa, rafinosa, estaquiosa o melezitosa; (ii) tioglicerol; y (iii) por lo menos un péptido; y b) liofilizar la composición resultante de la etapa (a) .

11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque comprende: a) preparar una composición que comprende, en solución: (i) por lo menos un carbohidrato no reductor que se selecciona de trehalosa, sacarosa, rafinosa, estaquiosa o melezitosa; (ii) tioglicerol; y (iii) por lo menos un péptido; de manera que el carbohidrato no reductor está presente como por lo menos 50%, como una proporción de los componentes totales de la composición liofilizada final y en donde antes del liofilizado el tioglicerol está presente por lo menos en una concentración molar equivalente respecto a la concentración de los componentes peptídicos de la composición que comprende por lo menos un residuo cisteína libre; b) liofilizar la composición resultante de la etapa (a) ; en donde la composición liofilizada resultante es estable durante por lo menos 2 años cuando se almacena a una temperatura de 2-8°C.

12. El método de conformidad con la reivindicación 10 ú 11, caracterizado porque comprende además : (c) reconstituir la composición liofilizada de la etapa (b) en solución.

13. Un método para reconstituir una composición liofilizada estable que comprende por lo menos un péptido, caracterizado porque comprende: a) preparar una composición que comprende, en solución: (i) por lo menos un carbohidrato no reductor que se selecciona de trehalosa, sacarosa, rafinosa, estaquiosa o melezitosa; (ii) tioglicerol; y (iii) por lo. menos un péptido; de manera que el carbohidrato no reductor está presente como por lo menos 50%, como una proporción de los componentes totales de la composición liofilizada final y en donde, antes del liofilizado, el tioglicerol está presente por lo menos en una concentración molar equivalente a la concentración de los componentes peptídicos de la composición 5 que comprende por lo menos un residuo cisteína libre; b) liofilizar la composición resultante de la etapa (a) ; y (c) reconstituir la composición liofilizada de la etapa (b) en solución; ° en donde la composición liofilizada de la etapa (b) es estable durante por lo menos 2 años cuando se almacena a una temperatura de 2-8°C.

14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, caracterizado porque el 5 carbohidrato no reductor es trehalosa.

15. Una composición liofilizada estable que comprende por lo menos un péptido para tolerización o inmunización, caracterizada porque comprende adicionalmente tioglicerol y por lo menos un carbohidrato no reductor que se 0 selecciona de trehalosa, sacarosa, rafinosa, estaquiosa o melezitosa .

16. La composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el carbohidrato no reductor es trehalosa. 5

17. La composición de conformidad con la reivindicación 15 ó 16, caracterizada porque por lo menos un péptido comprende o consiste de la secuencia de conformidad con cualquiera de las SEC ID NOS: 1 a 58.

18. La composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque comprende los péptidos de las SEC ID NOS: 1 a 4.

19. La composición de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque la composición comprende además los péptidos de las SEC ID NOS: 84 a 86 y opcionalmente sin péptidos adicionales.