KR101669693B1

KR101669693B1 - 환원 이량체 제형을 가지는 조성물

Info

Publication number: KR101669693B1
Application number: KR1020117014702A
Authority: KR
Inventors: 로드릭 피터 하프너; 폴 라이들러
Original assignee: 서카시아 리미티드
Priority date: 2008-11-28
Filing date: 2009-11-27
Publication date: 2016-11-09
Also published as: GB201114575D0; ES2427855T5; GB2479515A; WO2010061193A2; CA2744587C; US9180098B2; GB2479515B; CN102227214A; GB0821806D0; BRPI0921541A2; JP2012510457A; WO2010061193A3; NZ593145A; DK2373293T3; EP2373293B2; US9375470B2; IL213088A0; AU2009321358A1; JP5905942B2; US20160367660A1

Abstract

본 발명은 비-환원 탄수화물 또는 탄수화물 유도체 및 적어도 하나의 작용제의 용도에 관한 것이다. 상기 작용제는 자유 시스테인 잔기를 포함하는 적어도 하나의 펩타이드로 이루어지는 냉동-건조된 조성물에서 이량체 형성을 억제하여 개선된 장기 저장 능력을 제공한다.

Description

환원 이량체 제형을 가지는 조성물{Composition with reduced dimer formation}

본 발명은 자유 시스테인 잔기를 함유하는 적어도 하나의 펩타이드를 포함하고, 비-환원 탄수화물 또는 탄수화물 유도체 및 이량체 형성을 억제하는 적어도 하나의 작용제를 포함하며 개선된 장기 저장 안정성을 제공하는 냉동-건조 조성물의 용도에 관한 것이다.

부패하기 쉬운 물질을 보존하거나 수송하기 위해 더욱 편리한 물질을 만들도록 사용된 이 분야에서 알려진 다양한 방법들이 있다. 약학 또는 생명공학 또는 식품재료에 대하여, 전형적인 방법은 동결-건조이다(얼림건조(lyophilizaton) 또는 한냉건조(cryodesiccation)로서 또한 알려짐). 이것은 재료를 냉동하고 주위 압력을 낮추고 재료내에서 냉동된 물이 고체상태로부터 기체상태로 직접 승화하기에 충분한 열만을 가하는 작업을 수행하는 탈수 과정이다. 그리고 생성되는 냉동-건조 제품은 이후 사용을 위해 용액으로 쉽게 재구성될 수 있다.

냉동-건조 제품의 장점은 보통 저장 및 수송 중에 더욱 안정적이라는 것과 같은 양의 용액보다 저장-수명이 더 길다는 것이다. 그러나, 냉동 및 건조 과정 중에 보존된 재료에 손상이 발생할 수 있다는 점에서 냉동-건조가 가진 몇 가지 문제점이 있다. 이들 문제점은 냉동될 재료에 동결방지제(cryoprotectants) 및 냉동방지제(lyoprotectants)를 추가함으로써 얼마간은 다루어진 바가 있다(addressed). 그러나, 몇 가지 부패하기 쉬운 재료, 특히 적어도 하나의 자유 시스테인 잔기를 함유하는 펩타이드는 동결-건조 과정의 완료 후에 분해 및 손상이 쉽다는 점은 덜 인식되었다. 즉, 비록 냉동-건조가 보존 효과를 가지지만, 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 펩타이드로 구성되는 냉동-건조 제품은 종종 원하는 저장-수명보다 더 짧은 저장 수명을 가진다. 그런 펩타이드를 포함하는 냉동-건조 조성물의 안정성을 개선하기 위한 수단들에 대한 분명한 필요성이 있는 것이다.

본 발명은 적어도 하나의 자유 시스테인 잔기를 포함하는 적어도 하나의 펩타이드로 이루어지는 냉동-건조 조성물에 있어서, (i) 적어도 하나의 비-환원(non-reducing) 탄수화물(carbohydrate) 및 (ii)이량체 형성을 억제하는 적어도 하나의 작용제(agent)를 포함하는 조성물의 용도에 관한 것으로, 상기 용도는 상기 조성물에 있어서 상기 적어도 하나의 펩타이드의 이합체화(dimerisation)를 방지하거나 환원시키는 것이다.

발명의 요약

본 발명은 또한 적어도 하나의 펩타이드를 포함하는 안정적인 냉동-건조 조성물을 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:

(a) (i)적어도 하나의 비-환원 탄수화물, (ii) 이량체 형성을 억제하는 적어도 하나의 작용제(agent) 및 (iii)적어도 하나의 자유 시스테인 잔기를 포함하는 적어도 하나의 펩타이드 용액으로 이루어지는 조성물을 제조하고;

(b) 상기 단계(a)로부터 얻어지는 조성물을 냉동-건조하는 단계를 포함한다.

*일 실시예에 있어서, 상기 얻어지는 냉동-건조 조성물은 온도 2~8℃에서 저장될 때 적어도 2년 동안은 안정적이다. 또 다른 실시예에서, 상기 방법은 상기 단계 (b)의 냉동-건조 조성물을 용액으로 재구성하는(reconstituting) 단계를 포함한다.

본 발명은 또한 적어도 하나의 면역화(immunsation) 또는 자기내성(tolerisation)용 펩타이드를 포함하는 안정적인 냉동-건조 조성물에 관한 것으로서, 상기 조성물은 추가적으로 적어도 하나의 비-환원 탄수화물 및 이량체 형성을 억제하는 적어도 하나의 작용제를 포함한다.

상기 설명한 용도, 제조 방법 및 조성물에 관한 일실시예에서, 상기 적어도 하나의 비-환원 탄수화물은 트레할로오스(trehalose), 슈크로스(sucrose),라피노오스(raffinose), 스타키오즈(stachyose) 또는 멜레치토스(melezitose)로부터 선택되며 상기 작용제는 티오글리세롤(thioglycerol)이다.

상기 설명한 사용, 방법 및 조성물에 관한 일실시예에서, 상기 적어도 하나의 펩타이드는 면역화 또는 자기내성에 사용하기 위한 것이고, 길이가 8 내지 30개의 아미노산이며 다음을 포함한다:

a) 적어도 하나의 시스테인 잔기; 및

b) 적어도 하나의 티(T) 세포 에피토프(epitope)를 포함하는 지역.

본 발명자들은 이 실시예가 특히 동결 건조 케이크에 있어서 티오글리세롤을 잘 보유하기 때문에 장점이 있다는 것을 고려한다. 티오글리세롤은 동결 건조 조성물에서 결합하기에는 덜 적당한 것으로 이미 고려되었었는데, 왜냐하면 전형적인 동결 건조 조건하에서 유리를 형성하기 위해 스스로 얼지않기 때문인데, 즉 -80℃정도의 낮은 온도에서 액체로 남아있다. 그러나, 본 발명에 있어서, 동결 건조 케이크의 물리적 특성에 있어서 이탈 또는 부정적 충격을 주는 어떠한 신호없이 티오글리세롤은 특히 트레할로스와 결합하여 유지(retained)될 수 있다는 것이 판명되었다. 티오글리세롤의 존재는 효과적으로 조성물내에서 펩타이드 이량체의 형성을 방지한다.

도 1 내지 83은 다른 조건하에서 저장된 펩타이드의 안정성을 나타낸다.
도 84는 실시예 4에 도시된 특별한 조성물로 구성된 7가지 펩타이드의 혼합물의 12개월 경과후의 안정성을 나타낸다.

도 1 내지 도 83은 실시예들에서 설명된 것처럼 다른 냉동-건조 조성물내에서 구성될 때, 지적된 것처럼 다른 조건하에서 저장된 펩타이드의 안정성을 나타낸다(T=트레할로오스(trehalose), S=슈크로스(sucrose),M=만니톨(mannitol),TG=티오글리세롤(thioglycerol), G=글리신(Glycine),Met=메티오닌(methionine)). 시간(주)은 X-축상에 도시되었다. 주어진 조성물로부터 재구성된(reconstituted) 용액으로 존재하는 비-분해(non-degraded) 펩타이드는 Y-축상에 도시되었다. 그 양은 동결-건조되지 않은 표준 펩타이드 MLA07의 양과 상대적인 비율로서 도시되었다.

각각의 도면은 다음의 다른 펩타이드 각각에 대응하는 7가지 결과 집합을 나타낸다: MLA05(흑선, 작은 원형 점들); MLA12(흑선, 사각형 점들), MLA03(밝은회색선, 삼각형 점들); MLA14(밝은 회색선, x-형상 점들); MLA01(흑선, x-형상 점들), MLA04(흑선, 큰 원형 점들); MLA07(흑선; 수직선-형태 점들). 데이터는 각각의 조성물에서 7가지 펩타이드들의 혼합물의 냉동-건조이후에 생성되었다.

도 84는 "로우(low)" 티오글리세롤(다이아몬드) 및 "하이(high)"티오글리세롤(사각형)로 실시예 4에 도시된 특별한 조성물로 구성된, MLA05; MLA12, MLA03; MLA14;MLA01;MLA04 및 MLA07의 7가지 펩타이드의 혼합물의 12개월 경과후의 30℃/65%RH에서의 안정성을 나타낸다.

서열목록의 설명

서열목록 번호(SEQ ID NOS) 1 내지 83은 본 발명의 조성물에 특히 바람직한 함유물에 대한 펩타이드의 서열을 나타낸다. 서열목록 번호(SEQ ID NOS) 84 내지 86은 본 발명의 조성물내에 포함될 수 있는 추가 펩타이드의 서열을 나타낸다.

냉동-건조

냉동-건조는 용액(solvent)(보통 물)이 승화에 의해 제품으로부터 제거되는 복잡한 동작이다. 잘 알려진 것처럼, 승화는 냉동된 액체가 액체 상태를 거치지 않고 직접 기체 상태로 될 때 일어난다. 승화는 압력과 온도의 함수이고, 그들의 균형은 성공적인 냉동-건조에 중요하다.

상기 냉동 건조 공정은 세 단계로 구성되는데, 냉동, 1차 건조 및 2차 건조이다. 상기 냉동 단계 동안에, 용액은 고체로 변한다. 상기 냉동 과정은 냉동 비율이 제품내에 형성된 얼음 결정의 크기에 영향을 주기 때문에 신중하게 조절되어야만 하며, 제품 안정성에 악영향을 줄 수도 있고 상기 1차 및 2차 건조 단계동안 건조 비율에 또한 악영향을 줄 수도 있다.

임계 온도(critical temperature) 이하에서 상기 냉동 단계를 수행하는 것이 매우 중요하다. 이 온도는 결정 물질용 공융 온도(eutectic temperature)(Teut)이거나 무정형 제품용 최대로 냉동 농축된 용질(Tg')의 유리 전이 온도(glass transistion temperature)이다.

1차 건조 단계 동안, 얼음은 승화를 경유하여 냉동 제품으로부터 제거되고, 건조 결과로 구조적으로 온전한 제품이 된다. 이것은 건조 장치내에서 저장 온도(shelf temperature) 및 챔버 압력의 신중한 조절을 요구한다. 냉동 제품으로부터 얼음의 승화 비율은 그 분야에서 익숙한 기술자에 의해 인정될 여러가지 요인에 의해 좌우된다. 1차 건조 단계 동안에, 승화 계면(interface)에서의 제품 온도(Tp)는 제형(forumation)의 "임계 온도"를 넘지 않아야 한다는 것이 중요한데, 즉 흘러내리기에 충분한 유동성(fluidity)에 이르지 않아야만 하며 따라서 케이크(cake)의 구조를 파괴하지 않아야 한다. 이것은 또한 파괴 온도(collapse temperature)(Tc)로 알려져 있고 보통 상기 Tg'보다 몇도 더 높은 온도이다.

상기 언급된 것처럼, 임계 온도는 주로 결정질(crystalline)용 공융 온도(Teut) 및 무정형 물질용 Tg' 또는 Tc이다. 결정질 물질은 Teut가 보통 높기 때문에 냉동 건조가 쉽다(예를 들면, 매우 일반적인 증량제(bulking agent) 만니톨(monnitol)의 공융온도(Teut)는 -3℃이다. 또한, 생성되는 건조-냉각된 "케이크"는 보통 결정질 물질로부터 얻어질 때 매력적인 외양을 가진다. 그러나, 결정질 물질은 냉동 및 건조 과정동안 펩타이드를 안정화하기에는 종종 적합하지 않다. 여기서, 무정형 당분, 폴리올 및 다른 부형제가 보통 사용된다. 문제점은 이들 물질의 Tg'가 보통 공융 온도(예를 들면 슈크로스(sucrose):-32℃)보다 훨씬 낮다는 점이다.

1차 건조(primary drying)가 완료된 후에, 모든 얼음은 승화되고, 결합된 수분은 여전히 제품내에 존재한다. 제품은 건조된 것 같지만, 잔여 습기 함유량(moisture content)은 7-8%만큼 높을 수 있다. 더 높은 저장 온도에서 계속된 건조는 최적값(많은 제형에서 < 1%)으로 상기 잔여 습기 함유량을 줄이는데 필요하다. 이런 과정, 또는 2차 건조(secondary drying)는 결합된 물이 제품으로부터 제거되는(desorbed) 것과 같은 등온 탈착(isothermal desorption)으로 알려져 있다. 2차 건조는 대기(ambient)보다 더 높은 제품 온도에서 정상적으로 계속되지만 여전히 제형(formulation)의 유리 전이(glass transition)(Tg) 또는 용융(melting) 온도 이하이다.

이 분야 기술자는 다른 조성물간에 특성 차이로 주어진 적당한 고려사항(consideration) 및 최적의 냉동 및 건조 조건을 확립하기 위한 시행착오의 잠재적 필요성과 함께 상기 변수의 신중한 고려의 필요성을 알고 있다는 것을 인식할 것이다.

정교한(delicate) 제품(예, 단백질, 펩타이드 등)을 안정화시키는 냉동 건조 과정의 몇 가지 장점이 있다: 예를 들면, 적당하게 냉동 건조된 제품은 종종 냉장(refrigeration)이 필요없고, 대기 온도에서 저장될 수 있으며, 주사용 증류수 또는 다른 적당한 용액으로 빠르게 완전하게 재구성될 수 있다. 냉동-건조된 조성물은 보통 2년 이상 안정한 유통 기한을 가지는 것으로 기대된다. 이런 맥락에서, 안정하다는 것은 보통 냉동-건조된 조성물이 어려움 없이 재구성될 수 있고 상기 재구성된 용액은 약학적 용도에 적합하다는 것을 의미하게 된다. 안정하다는 것은 또한 재구성 이전에, 냉동-건조된 케이크의 파괴는 제외하고, 제품이 물리적으로 또한 겉모습의 어떤 변화가 없는 것으로 여겨진다. 약학적 용도의 적합성은 생물학적 재료 및 문제의 특별한 용도에 의존하지만, 그 분야의 전문가에 의해 보통 쉽게 평가될 수 있다. 일반적 용어에 있어서, 재구성된 용액에서 생물학적 재료는 냉동-건조전의 동등한 용액 재료와 비교할만한 활성을 가지는 것으로 기대된다. 펩타이드 또는 단백질을 포함하는 재구성 용액의 경우, 만약 그것이 살균한 것이고 눈에 보이는 미립자가 없다면, 상기 재구성 용액은 보통 약학적 용도, 특히 주사용(for injection)에 적합한 것으로 고려된다.

제품의 안정한 유통 기한을 줄일 수도 있고, 때로는 극적으로, 특히 적어도 하나의 자유 시스테인 잔기를 가진 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 조성물용 제품의 안정한 유통 기한을 줄일 수도 있는 냉동-건조에는 많은 어려움이 있다. 그러한 물질은 냉동-건조 과정 동안, 그러나 또한 이런 과정 이후에, 즉, 상기 냉동-건조된 제품의 저장 과정 동안에 되돌릴 수 없는 변화, 또는 악화로 고통받을 수 있다.

냉동-건조 과정 동안 악화는 냉동중에, 건조중에, 또는 냉동 및 건조 과정 중에 생길 수 있다. 만약 제품 악화가 냉동 중에 일어나면, 보통 "동해방지제(cryoprotectant)"를 추가한다. 동해방지제는 냉동중에 안정화시키며, 얼림건조(lyophilization)중에(즉, 냉동 및 건조 중에)는 필연적으로(necessarily) 안정화시키지 않는다. 보통 동해방지제는 이당류(disaccharides) 및 몇몇 아미노산, 및 저 수준의 폴리에틸렌 글리콜(<1%, w/w) 또는 다른 고분자(polymer)의 고 농축물(0.5M 까지)을 포함한다. 용어, "리오프로텍션(lyoprotection)"은 모든 냉동-건조 과정 중(즉, 냉동 및 건조 과정 중) 안정화에 대해 말하는 것이다. 그러한 안정화는 종종 단백질 및 펩타이드 같은 생물학적 물질의 냉동-건조를 위해 요구된다. 이것은 단백질 같은 복잡한 생물학적 분자들은 종종 구조 및 기능을 유지하기 위하여 보통 수준(moderate level)의 잔류 수분을 요구하기 때문이다. 따라서, "리오프로텍턴트(lyoprotetant)"는 보통 추가될 수 있다. 그 기술분야에서 알려진 리오프로텍턴트는 보통 당분(단당류-,이당류-, 및 다당류), 폴리알콜(polyalcohols), 및 그들의 유도체와 같은 폴리하이드록시 화합물(polyhydroxy compounds)이다.

상기와 대비하여, 냉동-건조 과정후에, 즉 냉동-건조된 제품의 저장 또는 수송중에 일어나는 손상과 악화는 다루기가 더욱 어렵다. 그런 손상은 예를 들면, 탈아미드화(deamidation), 가수분해(hydrolysation), 라세미화(racemisation) 또는 산화의 형태를 가질 수 있고, 그들 모두는 보통 저장된 단백질 또는 펩타이드의 응집(aggregation) 및/또는 변성(denaturation)을 야기할 수 있다. 분자와 그들의 이어지는 이합체화(dimerisation) 간의 이황화물(disulphide) 결합의 제형을 이끄는 시스테인 잔기의 측쇄(side-chains)의 산화는 특별한 문제이다. 그러한 손상은 오랜 기간에 걸쳐 천천히 일어날 수 있거나, 또는 실내온도 조절 시스템의 고장으로 인한 온도의 갑작스런 증가 또는 대기 온도의 단순한 계절적 변화 같은 저장 조건에서의 단기간의 변화중에 급속하게 생길 수도 있다.

본 발명은 적어도 하나의 펩타이드, 특히 적어도 하나의 자유 시스테인 잔기를 포함하는 펩타이드를 포함하는 냉동-건조된 조성물에서 냉동-건조 과정 후에 생기는 손상 및 악화의 문제를 상기 적어도 하나의 펩타이드의 이합체화(dimerisation)를 억제하거나 줄임으로써 다룬다.

본 발명의 냉동-건조된 조성물

본 발명은 특히 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 적어도 하나의 펩타이드로 이루어지는 냉동-건조 조성물과 관련이 있다. 특별히 관심이 있는 펩타이드는 특히 T-세포 반응을 조절함으로써 면역체계를 조절하는데 유용한 펩타이드이다.

항원의 T-세포 인식은 주조직적합성복합체(major histocompatibility complex:MHC) 분자와 관련한 세포 표면상의 항원 단백질의 현존하는 단편들(펩타이드들)에 항원 존재 세포(APCs)를 요구한다. T 세포는 APC에 의해 존재된 단편들을 높은 특이성(specificity)을 가지고 인식하기 위하여 그들의 항원 특성 T 세포 수용기(receptor)(TCR)를 이용한다. 그런 인식은 인식된 항원을 근절하기(eradicate) 위한 반응의 범위를 생성하도록 면역 체계에 트리거(trigger)로서 작용한다.

항원 단편의 T 세포 인식의 대부분의 특이성은 상기 단편들내에 더 작은 아미노산의 부분 서열(subsequence)에 의해 제공된다. 이 부분서열은 T 세포 에피토프(epitope)로서 알려져있다. 이렇게 해서, 그런 에피토프를 포함하는 펩타이드는 피험자(subjects)의 면역 체계를 조절하기 위한 치료상의 작용제로서 사용하기 위해 관심이 되고 있다. 세포외 알레르겐(allergens) 및 자신- 또는 다른-항원의 경우, 펩타이드는 보통 MHC 클래스 II 분자상에 존재하는데, 이는 CD4 T 세포에 의해 인식된다. 따라서, 알레르기 및 자신- 또는 다른-면역 장애의 관심은 MHC 클래스 II-결합 T세포 에피토프에 초점이 맞춰져있다. 그러나, CD8 T 세포에 의해 인식되는 MHC 클래스 I-결합 T 세포 에피토프에 또한 관심을 가질 수 있다. 예를 들면, 내생적인(endogenous) 및/또는 세포내 항원(intracellular antigens)에 대한 면역 반응을 조절할 것이 요구된다. 이것은 확실한 암 표적의 경우, 종양 면역을 유도하는데 사용될 수 있는 펩타이드, 또는 이를 테면 간염(hepatitis) 및 유두종(papilloma) 바이러스에 의해 야기된 전염병의 치료를 위해 바람직할 수 있다.

세포외 알레르겐 및 자신- 또는 다른-항원으로부터 나온 펩타이드 에피토프를 피험자에게 투여하는 것은 에피토프가 파생되는 항원에 내성(tolerance) 유도의 결과를 가져온다는 것이 판명되었다. 그러한 효과에 기초한 치료 작용제는 알레르기의 예방과 치료, 및 특별한 면역 반응의 하향 조절(down-regulation)이 바람직한 자신- 및 다른-면역 질병에 큰 잠재성을 가진다.

예를 들면, 암 또는 전염병과 관련된 어떤 단백질로부터 파생된 펩타이드 에피토프를 피험자에게 투여하는 것은 상기 에피토프가 파생된 항원에 특별한 면역의 유도를 가져온다는 것이 판명되었다. 그러한 효과에 기초한 치료 작용제는 특별한 면역 반응의 상향 조절(up-regulation)이 바람직한 질병의 예방과 치료에 큰 잠재성을 가진다.

특별한 항원에 대한 내성 또는 면역을 생성하는 펩타이드 에피토프의 이용의 또 다른 진전은 많은 문제점에 의해 방해받고 있다. 그런 문제중 하나는 에피토프 서열, 특히 알레르겐 및 자신- 및 다른-항원으로부터의 에피토프 서열이 종종 용해성이 좋지않고(poorly soluble), 따라서 제조하거나 저장 또는 피험자에게 투여하는데 문제가 있는 것이었다. 특히, 시스테인 잔기를 함유하는 에피토프 서열로 이루어지는 펩타이드는 보통 IgE 또는 IgG 결합으로 생기는 염증인 부적합한 면역 반응을 초래하는 이형체화 또는 고차(high order) 응집(aggregation)에 취약할 수 있다.

따라서, 그런 에피토프로 이루어지는 펩타이드가 냉동-건조된 조성물내에 포함될 때, 그들은 수송 및 저장 중, 즉 상기 개략적으로 설명한 것처럼 냉동-건조 과정후에 생기는 손상 및 악화 형태에 특히 취약하다. 이것은 차례로 의도된 약학적 사용에 부적합한 재구성된 용액을 가져오는데, 왜냐하면, 내성(tolerisation)이 요구된 때 염증과 같은 부적합한 면역 반응의 유발(provocation)은 매우 바람직하지 않은 것이기 때문이다. 유사하게, 특별한 면역의 유도가 요구된 때, 이량체(dimer) 또는 고차 집합체(high order aggregates)의 형성(formation)은 MHC 클래스 I 분자를 결합하는 것이나 또한 이어지는 적당한 T-세포에 결합하는 것 이를 통해 T-세포 매개(mediated) 면역 반응의 자극을 방지하는(preventing) 것을 억제(inhibit)할 것이다.

MHC 클래스 II -결합 T 세포 에피토프

상기 설명된 것처럼, 알레르기 및 자신- 또는 다른-면역 장애의 치료 또는 예방을 위한 펩타이드에 있어서의 관심은 MHC 클래스 II-결합 T세포 에피토프에 초점이 맞춰져 있다. 그런 에피토프는 특별한 면역 반응의 유발이 요구되었을 때 또한 관심이 될 수 있다. 본 발명의 펩타이드내에 포함된 MHC 클래스 II 결합 T세포 에피토프는 세포 표면상에 클래스 II와 연관된 T 세포에 존재할 때 클래스 II 분자에 결합가능하고 CD4 T 세포를 자극할 수 있는 보통 최소 아미노산 서열이다. 상기 에피토프는 보통 인간 MHC 클래스 II 분자에 결합하는 것으로서 이를 테면 여기에 언급된 임의의 분자이다.

MHC 클래스 II 분자는 α 및 β의 두 개의 단백질로 구성되는데, 각각은 다른 유전자에 의해 암호화된다(encoded). 인간에 있어서는, 다른 α 및 β 단백질을 암호화하는 세 개의 유전자(gene) 클러스터가 있다. 이들은 인체 백혈구 항원(HLA) 클러스터들인, DR,DQ 및 DP이다. 각각의 클러스터는 상기 α 단백질의 다른 변종(variant)을 암호화하는 다중 다른 A 유전자 및 상기 β 단백질의 다른 변종(variant)을 암호화하는 다중 다른 B 유전자로 구성된다. 따라서 그렇게 만들어진(resulting) MHC 클래스 II 이형이량체(heterodimer)는 매우 다양하고, 그들이 결합하는 T 세포 에피토프들도 마찬가지이다.

MHC 클래스 II 분자의 결합 사이트는 클레프트(cleft)를 형성하는 두 개의 별도의 단백질로 구성된다. 상기 클레프트는 단부가 개방되었고, 이론적으로는 임의의 길이의 펩타이드 결합을 허용한다. 그러나, 단지 9 아미노산이 클레프트를 스스로 차지할 수 있다(can occupy). 상기 클레프트를 차지하는 9개 까지의 아미노산의 동정(identities)은 주어진 펩타이드가 주어진 MHC 클래스 II 분자에 결합할 것인가 아닌가와 T세포 발표(for presentation)를 위해 이용가능하게 될 것인가 아닌가를 결정한다. 따라서 이들 9개 까지의 아미노산은 MHC 클래스 II-결합을 위하여 요구된 최소의 서열을 나타낸다. 이것은 보통 그러한 서열은 세포 표면상에 클래스 II와 연관된 T세포에 존재할 때 T 세포를 자극할 수 있을 것이라는 것이 짐작된다. 그러나, 이것은 종래기술에서 표준인 방법에 의해 실험적으로 확인될 수 있다.

그런 방법은 보통 상기 에피토프와 T 세포가 상호작용하는 것을 허용하는 조건하에서 피험자로부터 획득한 시료내에 T 세포를 가진 에피토프를 접촉시키고; 임의의 T 세포가 자극을 받는지 아닌지를 결정하는 것을 포함한다. T 세포가 자극을 받는지 아닌지를 결정하는 것은 임의의 적당한 방법에 의해 이루어질 수 있는데, 예를 들면, T 세포에 의해 사이토카인(cytokines)의 생산을 검출하는 것에 의해 달성되며, 여기서 사이토카인 생성은 T 세포가 자극을 받았다는 것을 나타낸다. 적당한 사이토카인은 인터페론 감마(interferon gamma), 인터루킨 4(interleukin 4), 및 인터루킨 13(interleukin 13)을 포함한다. 사이토카인 생산은 임의의 적당한 방법에 의해 검출될 수 있는데, 예를 들면 ELISA, ELISPOT 분석 또는 흐름 사이토메트릭 분석이다. 피험자로부터의 시료내에서의 T 세포는 보통 피험자로부터 획득한 혈액 또는 혈장(serum) 시료로부터 분리된 말초혈액 단핵세포(PBMCs)의 집단(population)내에 존재한다.

본 발명의 MHC 클래스 II -결합 T세포 에피토프는 보통 8 또는 9개의 아미노산으로 구성되지만, 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 또는 20개의 아미노산을 포함할 수 있다. 상기 에피토프의 아미노산 서열은 MHC 클래스 II 분자의 결합 사이트에 대한 추가적인 참고 자료에 의해 넓게 정의될 수 있다. 이러한 결합 사이트는 특별한 결합 포켓을 가지는데, 상기 결합 펩타이드 에피토프 서열에서 1차 및 2차커(primary and secondary anchor) 포지션에 대응한다. 상기 결합 포켓은 MHC 클래스 II 분자의 서열에서 상기 아미노산 위치에 의해 정의되며, 보통 상기 에피토프내에 특별한 아미노산에 대하여 절대적으로 차별적인 것은 아니다. 따라서, 어떤 주어진 MHC 분자의 상기 펩타이드 결합 특수성(specificity)은 상대적으로 넓다. 따라서, 동일한 MHC 알로타이프에 결합하는 펩타이드는 어느 정도의 유사성을 나타내지만, 동정(identity)에 대한 요구사항은 없다.

가장 일반적인 MHC 클래스 II 형태인, HLA-DR은 결합 포켓에 결합하기 위한 주요 앵커(key anchor) 위치들은 상기 펩타이드 에피토프의 1,4,6,7, 및 9의 위치에 있다(상기 클레프트를 차지하는(occupying) 가장 N 말단(terminal)인 잔기(residue)로부터 가장 C 말단인 잔기까지 계수함(counting)). 그러므로 그들의 결합 포켓내에서 유사한 아미노산을 가지는 다른 HLA-DR 대립유전자(alleles)가 보통 위치 1,4,6,7, 및 9에서 유사한 아미노산을 가지는 펩타이들과 결합한다. 따라서, MHC 클래스 II 결합 T 셀 에피토프를 포함하는 지역은 바람직하게는 가장 넓은 범위의 HLA-DR 대립유전자에 결합을 허용하는 위치 1,4,6,7, 및 9에 대응하는 위치에서 아미노산을 가진다. 다른 HLA-DR 대립유전자의 특징적인 결합 특성의 예가 이하에 설명된다:

β 체인의 위치 86에서 글리신(Glycine)을 가진 DR 대립유전자는 펩타이드 위치 1에서 큰 소수성 측쇄(Trp,Tyr,Phe)에 대해 강한 선호도를 나타내며, 반면에 위치 86에서 발린(Valine)은 포켓 크기를 제한하고 이 위치에서 작은 소수성 측쇄(Val 및 Ala)에 대한 선호도를 변경한다. 최소 크기의 소수성 아미노산 Leu 및 Ile는 모든 DR 대립유전자에서 잘 받아들여진다.

위치 70에서 Gln, 위치 71에서 리신(Lysine) 및 상기 β 체인의 위치 74에서 아르기닌(Arginine) 또는 Gln을 가진 DR 대립유전자는 포켓 4내에서 전반적인 양의 전하를 가지며, 결합 펩타이드(예를 들면, DRB1*0301과 같은)의 위치 4에서 음으로 대전된 아미노산 Asp 및 Glu를 요구한다. 이런 모티프(motif)를 가진 DR 대립유전자(alleles)는 두 가지의 자가면역 질환: 전신성 홍반성 낭창(systematic lupus erythematosus) 및 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis)과 관련이 있다.

위치 70에서 Gln 또는 Arg, 위치 71에서 Arg 또는 Lys 및 상기 β 체인의 위치 74에서 Glu 또는 Ala를 가진 DR 대립유전자는 유일한 특별한 차이가 위치 74에서 있기 때문에 직접적으로 유사한 펩타이드를 그들에 결합한다. 그러나, Ala가 위치 74에 존재할 때, 포켓 4는 크기가 증가하고 더 큰 아미노산 이를 테면 Phe, Trp, 및 Ile를 축적할 수 있다(예를 들면, DRB1*0401,04,05와 같은). 위치 74에서 Glu를 가지는 대립유전자는 결합 펩타이드의 위치 4에서 Ser 및 Thr처럼 작은 극성 잔기(residues)를 허용하도록 기대된다. 이런 모티프를 가진 DR 대립유전자는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis)에 대한 민감성(susceptibility)과 관련이 있다.

위치 70에서 Asp, 위치 71에서 Glu 또는 Arg 및 상기 β 체인의 위치 74에서 Leu 또는 Ala를 가진 DR 대립유전자는 펩타이드 위치 4에서 음으로 대전된 아미노산을 가진 펩타이드(예를 들면, DRB1*0402와 같은)를 배제한다. 이것은 위치 70에서 Asp의 존재 때문이다. 이런 모티프를 가진 DR 대립유전자는 자가면역 질환인 소아기 류마티스 관절염(Juvenile rheumatoid arthritis)(JRA), 심상성 천포창(pemphigus vulgaris) 및 알레르기성 기관지폐 질환/증상(allergic bronchopulmonary disease/syndrome)과 관련이 있다.

β 체인의 위치 9에서 다형성(polymorphisms)은 모든 DR 대립유전자내에서 결합 포켓 9의 크기를 정의한다. 이 위치에서 Trp를 가진 대립유전자는 결합 펩타이드는 위치 9에서 예를 들면, Ala, Val, Gly, Ser, Thr, Pro의 오직 작은 아미노산만을 받아들인다(예를 들면, DRB1*0101 및 *1501내에서와 같은). 위치 57에서의 Asp와 결합하는 위치 9에서의 Glu는 포켓 9를 음으로 대전시키며, 양으로 대전된 아미노산 이를 테면 Lys(예를 들면, DRB1*0401 및 *0404내에서와 같은) 및 히스티딘(Histidine)(예를 들면, DRB1*0402내에서와 같은)의 축적을 용이하게 한다. 대부분의 MHC 클래스 II 대립유전자에 있어서, 위치 57에서의 Asp는 위치 76에서 Arg를 가진 솔트-브리지드 수소 결합(salt-bridged hydrogen bond)을 만들고, 또한 포켓이 지방족 및 극성 아미노산을 수용하도록 허용한다. 위치 57에서 Asp가 Ser(예를 들면, DRB1*0405) 또는 Ala(DQ8)에 의해 교체되는 경우, 상기 수소 결합 네트워크는 파괴되고 위치 76에서 Arg는 결합 펩타이드(예를 들면 DRB1*0405내에서와 같은)의 위치 9에서 Asp 또는 Glu와 같은 음으로 대전된 아미노산을 강하게 끌어당길 수 있다.

따라서 에피토프에 대한 바람직한 서열의 예는 위치 1에서 Trp, Tyr, Phe, Val 또는 Ala; 위치 4에서 Asp, Glu, Ser 또는 Thr; 및 위치 9에서 Ala, Val, Gly, Ser, Thr, Pro를 가진다. 에피토프에 대한 바람직한 서열의 또 다른 예는 위치 1에서 큰 방향성(aromatic) 또는 소수성 아미노산, 예를 들면 Tyr, Phe, Trp, Leu, Ile 또는 Val, 및 위치 6에서 작은, 비-대전된 아미노산, 예를 들면, Ser, Thr, Ala, Pro, Val, Ile 또는 Met를 가진다. DRB1*0101,*0401 및 *0701 대립유전자에 의해 암호화된 MHC 클래스 II 분자의 전부(all) 또는 조합(combination)에 결합하는 대략 87.5%의 펩타이드는 이러한 모티프(motif)를 포함한다. 또한, 알레르겐(allergens) 및 자가면역 항원으로부터 파생된 T 세포 에피토프는 보통 주어진 아미노산(들)의 다수의 반복(repeats)을 포함하지 않기 때문에, 본 발명의 바람직한 에피토프들은 보통 적어도 5,6,7 또는 8개의 다른 아미노산으로 이루어진다.

에피토프의 정확한 아미노 서열은 컴퓨터 기반 알고리듬에 의해 예상될 수 있고, 시험관내 생화학적 분석(in vitro biochemical analysis)에 의해 확인된다. 상업적으로 적당하고 이용가능한 알고리듬은 에피매트릭스 알고리듬(EpiMatrix Algorithm)(EpiVax Inc.)을 포함한다. 다른 알고리듬은 예를 들면 http://www.imtech.res.in/raghava/propred/ 및 http://www.imtech.res.in/raghava/mhc2pred/에서 이용가능하다. 이들 알고리듬을 가진 분석은 보통 큰 폴리펩타이드 서열을 다중 오버래핑하는 작은 펩타이드들로 파싱(parsing)하는 것을 포함한다. 이들 작은 펩타이드들의 서열은 MHC 클래스 II 분자를 결합할 것으로 예상된 것들을 확인하기 위해 상기 알고리듬을 이용하여 분석된다. 상기 오버래핑 작은 펩타이드들은 보통 9-mers이다.

이러한 분석에서 높은 점수를 내는 대부분의 후보 펩타이드는 보통 시험관내 결합 분석을 사용하는 다른 클래스 II 대립유전자에 의해 암호화된 MHC 클래스 II 분자의 패널을 결합하도록 능력이 평가된다. 예를 들면, 경쟁적인 MHC 클래스 II 결합 분석이 사용될 수 있는데, 여기서 각각의 펩타이드는 조사된 각각의 인간 MHC 클래스 II 알로타입(allotypes)으로부터 알려진 조절 바인더(control binder)를 옮기는(displace) 능력이 분석된다. 그러한 분석에 있어서 각각의 펩타이드는 IC50 값( 조절 펩타이드 결합의 50% 억제가 달성된 농도)이 할당된다. IC50이 낮을수록 주어진 MHC 클래스 II 알로타입에 대한 펩타이드의 친화도(affinity)가 더 높다.

폴리펩타이드에 있어서 에피토프 또는 에피토프들은 MHC 클래스 II 분자에 가장 높은 친화도를 보여주는 펩타이드에게 주어진다. 특히 바람직한 에피토프는 하나 이상 또는 바람직하게는 둘, 더욱 바람직하게는 셋, 넷 또는 다섯 MHC 클래스 대립유전자에 의해 암호화된 다른 클래스 II 분자에 결합하는 높은 친화도를 보여준다.

특히 바람직한 에피토프는 이량체를 형성하기 쉬운(prone to) 지역내에 구성된 것들이다. 이들 지역들은 아래 별도의 구획내에서 정의되었다.

MHC 클래스 I-결합 T 세포 에피토프

상기 논의된 바와 같이, MHC 클래스-I 결합 에피토프는 보통 특별한 면역 반응(이를 테면 종양 면역(tumour immunity) 또는 전염병을 일으키는 물질에 대항하는 면역 반응의 유도와 같은)의 유발(provocation)에 대해 더 관심을 가진다. 본 발명의 펩타이드내에 구성된 MHC 클래스 I-결합 T 세포 에피토프는 셀 표면상에 클래스 I과 관련된 T 세포가 존재할 때 클래스 I 분자에 결합가능하고 CD8 T 세포를 자극할 수 있는 보통 최소 아미노산 서열이다. 상기 에피토프는 보통 인간 MHC 클래스 I 분자에 결합하는 것으로서, 이를 테면 여기에 언급된 그러한 임의의 분자이다.

MHC 클래스 I 분자는 β2-마이크로글로블린(microglobulin)으로 불린 더 작은 펩타이드에 비공유결합으로(noncovalently) 링크된 무거운(heavy) 펩타이드 사슬로 구성된다. 무거운 펩타이드 사슬은 세 개의 큰 구상 영역(globular domains)인 α1,α2, 및 α3, 및 더 작은 막관통(transmembrane) 및 세포내 지역으로 조직된다(organized). 상기 무거운 펩타이드 사슬은 단일 유전자에 의해 암호화된다. 인간에 있어서, 다른 클래스 I 무거운 사슬을 암호화하는 세 개의 주요 유전자 클러스터와 세 개의 소수 클러스터가 있다. 이들은 인체 백혈구 항원(HLA) 클러스터들, HLA-A, HLA-B, HLA-C(주요) 및 HLA-E,HLA-F 및 HLA-G(소수)이다. 각각의 클러스터는 중쇄(heavy chain)의 다른 변종을 암호화하는 다중 다른 유전자를 포함한다. 따라서 결과적인 MHC 클래스 I 단백질은 매우 다양하고 그들이 결합하는 T 세포 에피토프들도 다양하다.

상기 MHC 클래스 I 분자의 결합 사이트는 α1 및α2, 도메인(셀 멤브레인으로부터 가장 먼) 사이의 클레프트(cleft)에 의해 형성된다. 상기 클레프트는 폐쇄된 포켓이고, 보통 클레프트내에서 펩타이드 결합은 아미노산 12개 까지의 최대 길이를 가진다. 클레프트를 차지하는 12개의 아미노산 까지의 동정(identities)은 주어진 펩타이드가 주어진 MHC 클래스 I 분자에 결합할 것인지 T 세포에 존재에 대해 이용가능하게 될 것인지 여부를 정의한다. 따라서 이들 아미노산은 MHC 클래스 I-결합을 위해 요구된 최소의 서열을 표현한다. 그것은 보통 그러한 서열은 세포 표면상에 클래스 I과 연관된 T세포가 존재할 때 T 세포를 자극할 수 있을 것이라는 것을 가정한다. 그러나, 이것은 클래스 II 에피토프에 대해 상기 설명된 바와 같은 동일한 방법인 종래기술에서 표준인 방법에 의해 실험적으로 확인될 수 있다.

본 발명의 MHC 클래스 I-결합 T 세포 에피토프는 보통 6 및 12사이, 더욱 일반적으로는 8 및 12개의 아미노산 또는 8 및 10개 사이의 아미노산으로 구성된다. 상기 에피토프는 8,9,10,11 또는 12개의 아미노산을 포함할 수 있다. 가장 일반적으로, 상기 에피토프는 9개의 아미노산 길이를 가진다. 상기 에피토프의 아미노산 서열은 MHC 클래스 I 분자의 결합 부위(binding site)에 추가적인 참고 자료에 의해 넓게 정의될 수 있다. 상기 MHC 클래스 I 결합 클레프트의 폐쇄 특성은 클래스 I 에피토프의 각각의 말단(terminus)에서의 잔기가 특히 인식을 위해 중요하다는 것을 의미한다. 상기 펩타이드의 아미노-말단 아민기(amine group)는 상기 펩타이드 결합부위(peptide groove)의 일단부에서 불변 부위(invariant site)와 접촉하고, 카르복시 말단에서 카르복시산염 기(carboxylate group)는 상기 펩타이드 결합부위의 타단에서 불변 부위에 결합한다. 그러나, 이들 불변성은 보통 상기 에피토프내에서 특별한 아미노산에 대해 절대적으로 차별적인 것은 아니다. 따라서, 임의의 주어진 MHC 분자의 상기 펩타이드 결합 특이성(specificity)은 상대적으로 폭이 넓다(broad). 따라서, 동일한 MHC 알로타입에 펩타이드 결합은 어느정도 유사성을 나타내지만, 동정(identity)을 위한 요구사항은 없다. 그렇기는 하지만, 보통, 클래스 I 에피토프는 소수성 또는 기본적 카르복시 말단을 가지며 및 맨 끝 아미노 말단에 프롤린(proline)이 없다. 상기 에피토프는 주-사슬(main-chain) 원자들 및 펩타이드 선단홈(groove)을 형성하는 보존된(conserved) 아미노산 측쇄들 사이에서 또 다른 접촉을 가지는 상기 펩타이드 결합부위를 따라 연장된 것을 확인한다. 길이의 변화는 상기 펩타이드 백본(backbone), 종종 프롤린 또는 글리신 잔기에서의 꼬임(kinking)에 의해 수용된다.

특히 바람직한 에피토프는 이량체를 형성하기 쉬운(prone to) 지역내에 구성된다. 이들 지역은 이하 별도의 부분 설명에서 정의된다.

적어도 하나의 T 세포 에피토프를 포함하는 지역

T 세포 에피토프의 동정(identification)을 위한 생화학적 분석은 대략 10 내지 12개의 아미노산내에서 및 더 일반적으로는 15,20개 이상의 아미노산내에서 보다 더 정확하게 더 큰 서열(sequence)내에서 최소 에피토프 서열의 위치를 보통 정의할 수 없다. 그 이유는 더 큰 서열은 물리적으로 더 작은 오버래핑 펩타이드로 분절되야만(fragmented) 하고, 또는 더 작은 오버래핑 펩타이드는 MHC 분자를 결합 위한 이들 펩타이드 성능을 시험관내에서 평가하기 이전에 처음부터 다시 만들어져야만 한다는 것 때문이다. 이 분야에 익숙한 기술자는 사용된 상기 오버래핑 펩타이드 조각들이 더 작을수록 제조과정에 더 많은 시간이 소요되고 더욱 더 노동 집약적이 될 것이라고 인식할 것이다. 따라서, 에피토프는 종종 더 큰 폴리펩타이드 영역내에 포함된 것처럼 동정된다. 본 발명의 펩타이드는 그런 더 큰 영역을 포함할 것이라고 예상된다.

따라서, 본 발명의 펩타이드에 있어서, T 세포 에피토프를 포함하는 영역은 보통 8 또는 9개의 아미노산 길이 이지만, 6,7,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,또는 25개의 아미노산 길이가 될 수도 있다. MHC 클래스-I 결합 T 세포 에피토프의 경우, 상기 영역의 처리는 상기 에피토프가 MHC 분자상에 제시될 수 있기 전에 요구될 수 있는 것으로 이해될 것이다. MHC 클래스 I 분자상에 제시(presentation) 전에 항원 처리는 그 분야 기술에 있어서 잘 알려진 것이다.

본 발명의 영역(region)은 보통 이량체 형성을 하기가 쉬운(prone to) 서열이다. 이것은 동질이량체(homodimer) 형성(즉, 펩타이드 단량체와 다른 동일한 펩타이드 단량체와의 관련성) 및 이형이량체(heterodimer) 형성(즉, 펩타이드 단량체와 다른 펩타이드 단량체와의 관련성) 둘 다를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 또한 이량체 형성을 하기가 쉬운 서열에 의하여, 고차의 올리고머, 이를 테면, 삼량체(trimer), 사량체(tetramers) 등을 형성하기가 쉬운 서열에 대해 또한 참조하게 하도록 의도된 것으로 이해될 것이다. 본 발명의 상기 영역은 이량체를 형성하기가 쉬운 임의의 서열로 포함하거나(comprise) 구성(consist)할 수 있다. 이량체 형성을 촉진하는 주어진 영역내에서의 상기 특별한 아미노산 서열은 상기 T 세포 에피토프의 최소의 MHC 클래스 II-결합 서열내에서 구성될 수 있고, 또는 이러한 서열 측면에(flank) 배치된 잔기내에서 구성될 수도 있다. 따러서 이량체를 형성하기 쉬운(prone to dimer formation) 상기 서열은 전체적으로 상기 T 세포 에피토프의 최소 MHC 결합 서열로 구성될 수 있다.

본 발명은 특히 시스테인 함유 펩타이드간에 공유 이량체의 형성과 관련된다. 따라서, 바람직한 서열은 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함한다. 이 분야에 익숙한 기술자는 단일 시스테인 잔기를 함유하는 임의의 펩타이드는 그 자체로 또는 접촉될 수도 있는 다른 시스테인 함유 펩타이드와 이량체를 형성할 수도 있다는 것을 인식할 것이다. 둘 또는 그 이상의 시스테인을 함유하는 펩타이드는 긴 체인을 형성하여 응집(aggregate)할 수도 있는 잠재성을 가진다. 그런 이량체/집합체 형성은 IgE 또는 IgG 결합의 위험을 야기하고 및 그로 인해 국부적인 염증 반응을 가지게 된다. 따라서, 본 발명의 바람직한 영역은 보통 높은 비율의 시스테인 잔기를 가진 단백질로부터 파생된다. 예를 들면, 본 발명의 영역은 단백질에 있어서 아미노산 잔기의 총수의 비율로서 20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34 또는 35% 시스테인 잔기다 비율보다 큰 비율을 가지는 단백질로부터 파생될 수 있다. 본 발명의 영역은 바람직하게는 더 낮은 비율의 시스테인 잔기를 가지는 그러한 단백질내에서의 서열로부터 선택된다. 따라서, 상기 영역은 상기 지역내에서 아미노산의 총수의 비율로서 최대 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 또는 20%까지 시스테인 잔기를 포함할 수 있다. 상기 시스테인 잔기는 상기 에피토프의 최소 MHC 결합 서열내에 구성될 수도 있고, 또는 이러한 서열 옆에 배치된(flank) 잔기내에서 구성될 수도 있다.

이량체를 형성하기 쉬운 다른 서열들은 적당한 계산 방법을 사용하는 인실리코 분석(in silico analysis), 또는 이하에 설명되는 것처럼 단량체 또는 이량체 형성에서 존재하는 서열의 비율을 수량화하는 적당한 실험 방법에 의한 시험관내 분석에 의해 확인될 수 있다. 이합체화(dimerisation)가 쉬운 서열에 대하여 이량체로서 존재하는 서열의 비율은 즉 고체상태에서 약 0.5% 또는 1% 이하로 최소화 될 수 있지만, 이것은 보통 적당한 조건하에서 적당한 시간 주기동안 용액으로 저장된 재료에 대하여 적어도 약 0.5%,1%,2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,또는 90%로 시간에 따라 증가할 것이다. 적당한 시간 주기 및 조건은 사용 이전에 익숙한 기술자가 용액에서 서열을 유지하는데 합리적으로 기대할 수 있는 시간 및 조건의 범위를 포함한다. 비록 어떤 해결책이 더 긴 주기동안, 예를 들면 일주, 한 달, 6개월, 1년, 2년, 3년 또는 그 이상 유지될 수 있지만, 예를 들면, 약 24시간, 약 48시간, 또는 약 72시간의 시간 주기가 보통이다. 저장 조건은 보통 상온 및 상대습도가 될 수 있고, 또는 보통 25℃ 및 60% 상대습도가 될 수 있지만, 익숙한 기술자가 접하게 되는 임의의 표준 저장 조건인 예를 들면 대략 5±3℃, -20℃ 또는 -80℃를 포함할 수 있다.

면역 시스템의 민감도(sensitivity)는 이를 테면 단지 이량체의 적은 비율이 바람직하지 않은 면역 반응을 촉발시킬 가능성이 높은 것으로 고려되는 것과 같은 것이다.

주어진 형태(given form)내에 존재하는 서열의 비율 평가를 위하여 적당한 방법은 예를 들면, 비-변성(non-denaturing) 조건하에서 분석 겔 전기영동(analytical gel electrophoresis)이다. 그런 방법에서, 서열 용액은 일련의(a set of) 표준 분자 중량 마커(markers)와 함께 폴리아크릴아미드 겔내에서 흐르게 된다(run). 만약 서열이 이량체를 형성하면, 단백질 밴드(protein band)는 상기 서열의 아미노산 합계가 계산된 것에 두 배의 분자 무게를 가진 종(species)에 대응하는 겔 내에서 관찰될 것이다.(유사하게, 제시된 임의의 삼량체 또는 사량체는 상기 서열의 아미노산의 잔기 무게의 합계가 계산된 것에 대략 세 배 또는 네 배의 분자 무게를 가진 종에 대응하는 밴드들로서 관찰될 것이다). 100% 서열이 올리고메릭(oligomeric) 형태로 존재하는 것은 드물기 때문에, 제2 밴드는 또한 상기 서열의 아미노산 총계가 계산된 대략적인 분자 무게를 가진 종에 대응하여 관찰될 수 있으며, 이것은 단량체(monomeric) 형태로 서열을 표현한다. 상기 밴드의 상대적 강도는 각각의 형태내에 제시된(present) 서열의 비율을 수량화하는데 사용될 수 있다. 유사한 방법은 다른 수단에 의해 분자 무게를 평가할 수 있는데, 예를 들면, 분석 원심분리법(analytical centrifugation), 질량분석법(mass spectrometry) 또는 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromtography)등이다. 다르게는, 올리고머는 이량체 및 고차의 올리고메릭 종이 그들의 소수성 차이에 기초하여 단량체로부터 분리되는 역상 고성능 액체 크로마토그래피(reverse phase high performance liquid chromatography)(RP-HPLC)를 사용하여 수량화될 수 있다. 종의 동정(identification)은 질량 분석 검사를 사용하여 달성된다. 동일한 방법들이 주어진 펩타이드가 임의의 다른 펩타이드 또는 분자로 헤테로다이머화(heterodimerise)하는 경향을 보이는지를 평가하기 위해 채택될 수 있다.

추가적으로, 본 발명의 영역은 pH 2.0 내지 12.0에서, 또는 pH 2.0 내지 11.0에서, pH 2.0 내지 10.0에서, pH 2.0 내지 9.0에서, pH 2.0 내지 8.0에서, pH 2.0 내지 7.0에서 수용액 3.5 mg/ml 이하의 용해도를 가질 수 있고; 및/또는 1,2,3 또는 4 시스테인 잔기를 포함할 수 있고; 및/또는 4.5 이하의 등전점(isoelectric point)을 가질 수 있고; 및/또는 +0.25 이상의 GRAVY 점수를 가질 수 있다. 이들 변수들은 임의의 적당한 방법에 의해 평가될 수 있다. 예를 들면, 용해도는 표준 시험관내 방법, GRAVY에 의해 평가될 수 있고 등전점은 이를 테면, http://www.expasy.ch/tools/protpraram.html.에서 이용가능한 ProtParan tool(Gasteiger E. et al pp.571-607 프로테오믹스 프로토콜 핸드북, Human Press(2005);John M. Walker(ed))같은 적당한 계산 방법을 사용하여 인실리콘 (in silico)방법으로 평가될 수 있다.

펩타이드

본 발명의 펩타이드는 상기와 같이 정의된 영역의 선천적 서열(native sequence)을 포함하거나 구성될 수 있고 또는 이형체 제형을 환원시키거나 용해도를 개선하도록 처리된 영역의 선천적 서열을 포함하거나 구성될 수 있다. 그러나, 처리된 영역의 콘텍스트(context)에 있어서, 본 발명은 이형체 형성의 받아들일 수 없는(unacceptable) 수준을 여전히 겪을 수 있는 펩타이드들에 특히 적용가능하다는 것이 이해될 것이다. 그런 펩타이드들은 보통 적어도 하나의 시스테인 잔기를 여전히 포함할 것이다.

영역이 이형체 제형을 환원시키도록 처리되는 경우, 이것은 보통 그의 선천적 서열의 개질(modification)에 의해 될 것이다. 특히 바람직한 개질은 이하와 같으며 여기서:

- 상기 지역의 선천적 서열에서 적어도 하나의 시스테인 잔기는 세린(serine), 2-아미노뷰티르 산(2-aminobutyric acid), 알라닌(alanine) 또는 글리신(glycine); 및/또는

- 상기 지역의 선천적 서열에서 적어도 하나의 시스테인 잔기는 시스테인 잔기를 생성하도록 시스테인화된다(cysteinylated).

본 발명의 펩타이드는 상기 펩타이드의 어떤 변종을 포함하도록 의도된 것으로 이해될 것이다. 상기 논의된 이량체 제형(formation)을 환원하는 처리와는 다르게, 펩타이드의 선천적 아미노산 서열에 대한 다른 개질이 만들어 질 수 있다. 예를 들면, 펩타이드 서열내의 하나, 둘, 셋, 넷, 또는 다섯개의 아미노산에 대해 만들어 질 수 있다. 임의의 개질은 보통 보존적(conservative)이 될 것이며, 만약 선천적 서열내에서 아미노산이 다른 아미노산으로 바뀌면, 다른 아미노산은 보통 선천적 아미노산과 유사한 특성을 가진다. 이하의 표는 아미노산의 특성을 나타낸다. 분자 무게는 각각의 아미노산에 대해 3-문자 코드 옆에 도시되었다. 주어진 분자 무게는 중립적이고, 자유로운 아미노산의 분자 무게이고; 잔기 무게는 물의 일당량의 차감(substration of one equivalent of water)에 의해 얻어질 수 있다(18 g/mol). 본 발명은 또한 엑스펩티다아제(exopeptidase) 효소에 의해 분해(degradtion)를 줄이거나 억제하도록 개질되거나 차단된 펩타이드 함유 N- 및 C-말단부를 포함한다.

Ala 89	지방성, 소수성, 중성	Met 149	소수성, 중성
Cys 121	극성, 소수성, 중성	Asn 132	극성, 친수성, 중성
Asp 133	극성, 친수성, 대전됨(-)	Pro 115	소수성, 중성
Glu 147	극성, 친수성, 대전됨(-)	Gln 146	극성, 친수성, 중성
Phe 165	방향성, 소수성, 중성	Arg 174	극성, 친수성, 대전됨(+)
Gly 75	지방성, 중성	Ser 105	극성, 친수성, 중성
His 155	방향성, 극성, 소수성, 대전됨(+)	Thr 119	극성, 친수성, 중성
Ile 131	지방성, 소수성, 중성	Val 117	지방성, 소수성, 중성
Lys 146	극성, 친수성, 대전됨(+)	Trp 204	방향성, 소수성, 중성
Leu 131	지방성, 소수성, 중성	Tyr 181	방향성, 극성, 소수성

개질된 잔기 또는 잔기들은 상기 영역의 서열의 임의 부분내에 포함될 수 있다. 일 실시예에 있어서 개질된 잔기 또는 잔기들은 상기 영역의 최소 MHC 결합 서열내에 포함되지 않는다. 바람직한 실시예에 있어서, 상기 개질은 새로운 에피토프를 생성하지 않거나 상기 지역의 MHC 결합 특성에 악영향을 끼치지 않는다.

본 발명의 펩타이드는 보통 8 부터 30개의 아미노산을 포함하고, 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 또는 29개의 아미노산을 포함할 수 있다. 본 발명의 펩타이드는 상기에서 정의된 바와 같이 상기 영역에 전체적으로 포함될 수 있거나, 또는 최대 30개의 아미노산까지 상기 영역 측면에 배치되는 추가 아미노산을 포함할 수 있을 것으로 인식될 것이다.

30개의 아미노산보다 더 긴 펩타이드는 바람직하지 않은 면역 반응 이를 테면 B 세포 활성화(activation) 또는 비만 세포 탈과립(mast cell degranulation)을 가져오는 세포 표면상의 IgG 또는 IgE를 크로스링크(cross-link)하기에 충분한 3차 구조(tertiary structure)를 포함할 것으로 예상된다.

펩타이드 합성

본 발명의 펩타이드는 상기 정의된 것과 같은 영역을 포함하는 폴리펩타이드로부터 파생된 지능적 감각(intellectual sense)에 있다. 이것은 상기 영역의 아미노산 서열의 사용방법을 만들고 서열에 기초하여 펩타이드를 합성함으로써 이루어진다. 펩타이드는 그 기술 분야에서 잘 알려진 방법들을 사용하여 합성될 수 있다. 바람직한 방법들은 고체-상태(solid-phase) 펩타이드 합성 기술을 포함하며 가장 바람직하게는 자동화되거나 반자동화된 펩타이드 합성기(synthesizer)를 포함한다. 보통, 그런 기술을 사용하는 것은, 수지상에 성장하는 펩타이드 사슬(chain)에 부착된 α-N-카르바모일(carbamoyl) 보호(protected) 아미노산 및 아미노산이 상온에서 이를테면 디메틸폼아마이드(dimethylformamide), N-메틸피롤리디논(N-methylpyrrolidinone) 또는 메틸렌 클로라이드와 같은 비활성 용매 내에서 이를테면 디사이클로헥실카르보디이미드(dicyclohexylcarbodiimide) 및 1-하이드록시벤조트라이아졸(hydroxybenzotriazole)과 같은 결합제(coupling agent)가 있는데서 이를테면 디이소프로필-에틸아민(diisopropyl-ethylamine)과 같은 염기(base)가 있는데서 결합된다. 상기 α-N-카르바모일(carbamoyl) 보호기(protecting group)는 트리플루오로아세틱산(trifluoroacetic acid) 또는 피페리딘(piperidine)과 같은 시약(reagent)을 사용하여 상기 결과로 만들어진 펩타이드-수지로부터 제거되고, 결합 반응(coupling reaction)은 펩타이드 사슬에 부가되도록 다음의 원하는 N-보호 아미노산과 함께 반복된다. 적당한 N-보호기들은 그 기술분야에서 잘 알려진 것이며, t-뷰틸옥시카르보닐(t-butyloxycarbonyl)(tBoc) 및 플루오르에닐메톡시카르보닐(fluorenylmethoxycarbonyl)(Fmoc)를 포함한다.

용어 "펩타이드"는 펩타이드(-CO-NH-) 연결(linkage)에 의해 아미노산 잔기들이 결합하는 분자들 뿐만 아니라 펩타이드 결합이 역전된 분자들을 포함한다. 그러한 레트로-인버소(retro-inverso) 펩티도미메틱스(peptidomimetics)는 그 기술분야에서 알려진 방법, 예를 들면, Meziere et al(1997)J.immunol.159,3230-3237에 설명된 것과 같은 것을 사용하여 만들어 질 수 있다. 이런 접근은 측쇄의 배향(orientation)이 아닌 백본(backbone)을 포함하는 수도펩타이드(pseudopeptides) 함유(containing) 변화들을 만드는 것을 포함한다. Meziere 등은 적어도 MHC 클래스 II 및 T 헬퍼(helper) 세포 반응에 대하여, 이들 수도펩타이드가 유용하다는 것을 보여준다. CO-NH 펩타이드 결합 대신에 NH-CO 결합을 포함하는 레트로-인버스 펩타이드는 단백질 분해(proteolysis)에 더욱 더 저항력이 있다.

유사하게, 상기 펩타이드 결합은 전체적으로보아 아미노산 잔기의 탄소 원자들 사이에 간격(spacing)을 보유하는 적당한 링커 부분(linker moiety)이 사용된다면생략될 수 있고; 만약 상기 링커 부분이 실질적으로 펩타이드 결합처럼 동일 전하 분포 및 동일 평면(planarity)을 가진다면 특히 바람직하다. 상기 펩타이드는 엑소프로테오리틱(exoproteolytic) 소화(digestion)에 대한 민감성을 줄이는데 도움을 주기 위하여 N- 또는 C-말단에서 편리하게 차단될 수 있다는 것 또한 인식될 것이다. 예를 들면, 펩타이드의 N-말단 아미노기는 카르복실산과 반응하여 보호될 수 있고 펩타이드의 C-말단 카르복실기는 아민과 반응하여 보호될 수 있다. 개질의 다른 예는 글리코실화반응(glycosylation) 및 인산화반응(phosphorylation)을 포함한다. 다른 잠재적인 개질은 측쇄 아민 R 또는 K의 수소가 메틸렌(methylene)기(-NH₂가 -NH(Me) 또는 -N(Me)₂로 바뀜)로 바뀔 수 있다는 것이다.

본 발명에 따른 펩타이드 유사체(analogues)는 또한 생체내에서 펩타이드의 반감기를 증가시키거나 감소시키는 펩타이드 변종을 포함할 수 있다. 본 발명에 따라 사용된 펩타이드들의 반감기를 증가시킬 수 있는 유사체(analogues)의 예는 펩타이드의 펩토이드 유사체, 펩타이드의 D-아미노산 유도체, 및 펩타이드-펩토이드 혼합물(hybride)을 포함한다. 본 발명에 따라 사용된 변종 폴리펩타이드의 또 다른 실시예는 D-아미노산 형태의 폴리펩타이드로 구성된다. L-아미노산보다 오히려 D-아미노산을 이용하는 폴리펩타이드의 제조는 정상적인 대사과정에 의해 그런 작용제의 임의의 원하지 않는 파괴를 감소시키고, 그의 투여 빈도에 따라 투여될 필요가 있는 작용제의 양을 감소시킨다.

관심 펩타이드

관심 펩타이드는 보통 적어도 하나의 자유 시스테인 잔기를 포함한다. 보통 "자유(free)"는 이량체 형성을 억제하는 작용제(agent)가 없는 상태에서 시스테인 잔기가 화학적 개질(modification) 및/또는 다른 시스테인-함유 펩타이드와의 이합체화(dimerisation)를 위하여 이용가능하다는 것을 의미한다. 다르게 말하자면, 자유 시스테인은 (-SH)로부터 환원된 것 내에 티올기(thiol group)를 포함하며, 이량체 형성을 억제하는 작용제(agent)가 없는 상태에서 이황화결합(-S-S-)을 형성하도록 그 환원된 형태(-SH)내에 티올기를 가진 다른 시스테인과 또한 산화 반응을 겪을 수 있는 것이다.

또한 관심 펩타이드는 보통 알레르겐 또는 알로-항원(allo-antigen)으로부터 파생된 적어도 하나의 MHC-결합 T 세포 에피토프를 포함하는 지역으로 구성된다. 따라서, 관심 펩타이드를 포함하는 수용액은 보통 알레르겐에 민감한 개인이 후기 단계 반응(late phase response)을 유도할 수 있다. 용어 "후기 단계 반응(late phase response)"은 A.B.Kay(Ed.) Blackwell Science, pp1113-1130, 알레르기 및 알레르기 질환(1997)에서 설명된 것과 같은 의미를 포함한다. 후기 단계 반응은 임의의 후기 단계 반응(LPR)이 될 수 있다. 바람직하게는, 단백질 알레르겐으로부터 파생된 에피토프를 포함하는 상기 조성물은 후기 천식(asthmatic) 반응(LAR) 또는 후기 비염(rhinitic) 반응, 또는 후기 단계 피부 반응 또는 후기 단계 시각(ocular) 반응을 유도할 수 있다. 특별한 조성물이 LPR을 일으킬 수 있는지 여부는 그 기술 분야에서 잘 알려진 방법을 사용하여 결정될 수 있는데; 특히 바람직한 방법은 Cromwell O, Durham SR, Shaw RJ, Mackay J 및 Kay AB에 서술된 바와 같다. 천식(asthma) 및 알레르기성 비염에서 비만 세포 및 호염기성 백혈구(basophils)로부터 매개체(mediators) 유발 시험(provocation test) 및 측정. 실험 면역학 핸드북(4), 제127장, 편집자:Weir DM, Blackwell Scientific Publications, 1986 에서. 따라서, 바람직하게는, 본 발명의 개별적인 조성물은 에피토프를 파생하는 단백질 알레르겐에 감작된(sensitised) 개인에 있어서 LPR을 유도할 수 있다.

개인이 에피토프를 파생하는 단백질에 감작되는지 여부는 단백질에 특이적인 개인의 혈액 또는 혈청내에서 항체 검지(detection)와 같은 잘 알려진 과정에 의해 결정될 수 있다. 에피토프가 알레르겐으로부터 파생되는 경우, 알레르겐 감작에 대한 적당한 시험은 단백질 특이적인 IgE의 측정을 위한 단백질 추출물 용액으로 피부 단자(prick) 시험, 피부(cataneous) LPR들의 유도, 병력(clinical history), 알레르겐 면역성(challenge) 및 방사선 알레르기흡착 검사(radioallergosorbent test)(RAST)를 포함한다. 특별한 개인이 치료를 통해 이득을 얻을 것으로 기대되는지 아닌지 여부는 예를 들면, 그러한 시험 또는 결정에 기초한 의사에 의해 결정될 수 있다.

에피토프를 파생시키는 단백질에 대해 개인이 탈감작(desensitizing)하거나 내성을가지는(tolerizing) 것은 적당하게 감작된(sensitized) 개인에 있어서 상기 단백질에 의해 유도된 면역학적 조직 반응의 억제 또는 제동(dampening)을 의미한다. T 세포는 선택적으로 활성화될 수 있고 무반응적으로 만들어 질 수 있다는 것이 보여졌다. 또한 이들 T 세포의 무기력(anergising) 또는 제거는 특별한 단백질에 대한 환자의 탈감작을 초래한다. 상기 탈감작은 상기 단백질 또는 단백질-파생 펩타이드의 두 번째 이상의 투여에 대하여 단백질 또는 단백질-파생 펩타이드에 응답하여 환원(reduction)으로, 또는 바람직하게는 그런 응답의 제거로서 그 자체를 나타낸다. 상기 두 번째의 투여는 탈감작 발생을 허용하도록 적당한 시간 주기가 경과된 후에 될 수 있으며; 이것은 바람직하게는 하루 및 몇 주 사이의 임의의 주기이다. 대략 두 주 간격이 바람직하다.

비록 본 발명의 조성물은 단백질에 감작된 개인에 있어서 LPR을 유도할 수 있지만, 조성물이 환자를 치료하는데 사용될 때 이를 테면 관찰가능한 LPR이 생기지 않지만, 반응은 부분적으로 T 세포를 감작하기 위해 충분한 것으로서 이를 테면, 다음(바람직하게는 더 높은) 복용량(dose)이 주어질 수 있는 식으로, 충분히 적은 농도의 조성물이 사용되는 것이 바람직하다는 것이 인식되어야만 한다. 이런식으로 상기 복용량은 환자에게 있어서 한번이라도 LPR을 유도함이 없이 그러나 종종 충분한 탈감작을 제공하도록 조성된다. 비록 조성물 또는 펩타이드는 투여된 것 보다 더 높은 농도에서 그렇게 될 가능성이 있다.

본 발명의 조성물은 개인에 있어서 보통 초기 반응(early phase response)을 유발하는 환원 능력(reduced ability)을 가진다. "초기 반응을 유발하는 환원 능력"에 의해, 본 발명의 조성물(composition)은 본 발명의 조성물내에서와 동일한 지역을 포함하는 펩타이드로 이루어지지만 이량체 제형을 환원시키는 서열의 개질이없고, 이량체 제형을 환원시키는 작용제가 결핍된 조성물과는 상대적으로 초기 증상(early phase symptoms)의 혹독함(severity)을 낮추는 결과(이를 테면 호염기성 세포 또는 비만 세포 탈과립(degranulation)과 같은)를 가져올 것이라는 것이 이해될 것이다. 따라서, 본 발명의 조성물은 이량체 형태에 대부분 존재하는 동등한 펩타이드보다 초기 반응이 더 적게 발생 할 것이다. 상기 펩타이드는 동일한 MHC 클래스 II-결합 T 세포 에피토프로 구성되기 때문에 동등하다.

대안으로 또는 추가적으로, 본 발명의 조성물은 보통 개인에 있어서 내성(tolerance)을 유도하는 개선된 능력을 가진다. "내성을 유도하는 개선된 능력"에 의하여, 본 발명의 조성물은 이량체 제형을 환원하는 서열의 개질이나 이량체 제형을 환원하는 작용제가 결핍된, 본 발명의 조성물내에서 처럼 동일한 지역을 포함하는 펩타이드로 이루어지는 조성물보다 더 큰 수준의 탈감작(desensitisatoin)을 생성할 것으로 이해될 것이다. 따라서, 본 발명의 조성물은 이량체 형태에 대부분 존재하는 동등한 펩타이드보다 더 큰 수준의 탈감작이 생성될 것이다. 상기 펩타이드는 동일한 MHC 클래스 II-결합 T 세포 에피토프로 구성되기 때문에 동등하다.

탈감작은 상기 설명된 바와 같으며, 그 수준은 임의의 적당한 수단에 의해 특성화될 것이다. 예를 들면, 알레르기성 천식(asthma)에 있어서, 에피토프를 파생하는(또는 단백질-파생 펩타이드)로부터의 단백질의 흡입(inhalation)에 반응하여 생성된 더 작은 LAR은 본 발명의 조성물에 따른 치료에 이어져 더 높은 수준의 탈감작을 나타낼 것이다. LAR의 크기는 그 분야의 기술 수준에서 임의의 적당한 수단에 의해 평가될 수 있는데, 예를 들면, 개인의 선 단백질 투여의 노력호기량(FEV) 감소 측정을 통해서이다. FEV에서 감소가 커지면 LAR이 커지는 것을 나타낸다. 본 발명의 조성물은 바람직하게는 이량체 형태에 대부분 존재하는 동등 펩타이드를 포함하는 조성물보다 적어도 10%,20%,30%,40% 또는 50% 더 작아지는 결과를 가져온다.

다르게는, 더 큰 수준의 탈감작은 이를 테면 인터페론 감마, 인터루킨 4 및 인터루킨 13과 같은 염증을 일으키는 사이토카인의 T 세포에 의한 단백질-특이적 생산(production)에 있어서 더 큰 감소를 나타낼 수도 있다. T 세포에 의한 사이토카인 생산은 임의의 적당한 방법, 예를 들면, ELISA, ELISPOT 분석 또는 유세포 분석법(flow cytometric assay)에 의해 검출될 수도 있다. 특히 바람직한 방법은 예를 들면, de Jager et al; 임상 및 진단 실험 면역학, 2003, Vol 10(1) p.133-139에 서술된 것과 같은 멀티플렉스 비드 어레이 분석(multiplex bead array assays)을 포함한다. "더 큰 감소"에 의하여, 본 발명의 조성물을 통한 치료(treatment)는 이량체 형태에 대부분 존재하는 동등 펩타이드를 포함하는 조성물보다 바람직하게는 적어도 10%,20%,30%,40% 또는 50% 이하의 염증을 일으키는 사이토카인의 생산을 가져올 것이라는 것은 바람직하다.

본 발명의 바람직한 조성물은 다음으로부터 파생되는 에피토프로 구성되거나 포함하는 적어도 하나의 펩타이드를 포함한다:

식물 알레르겐(특히 풀(grass) 알레르겐), 동물 비듬(dander) 알레르겐, 곰팡이(mold) 또는 균류(fungal) 알레르겐, 먼지 알레르겐, 항생제 또는 다른 약, 쏘는 곤충 독(stinging insect venom), 환경적인 알레르겐 또는 음식 알레르겐으로부터 선택된 알레르겐; 또는

급성 파종성 뇌척수염(ADEM); 애디슨 병; 강직성 척추염; 항인지질 항체 증후군(APS); 재생불량성 빈혈(aplastic anemia); 자가면역성 간염; 자가면역성 난소염; 만성소화 장애증; 크론씨 병; 제1형 당뇨병; 임신 유천포창(gestational pemphigoid); 굿파스튜어 증후군(Goodpasture's syndrome); 그레이브스병(Graves' disease); 길랑 바레 증후군(Guillain-Barre syndrome)(GBS); 하시모토병; 특발성 혈소판 감소성 자반병; 카와사키병; 전신성홍반성 낭창; 다발성 경화증; 중증 근무력증; 기면증, 안간대증 근육간대경련(OMS); 시신경염; 위축성 자가면역 갑상선염(Ord's thyroiditis); 천포창(Pemphigus); 악성 빈혈; 개의 다발성관절염; 원발 담즙성 간경변; 류마티스 관절염; 라이터 증후군; 쇼그랜 증후군; 다까야수 혈관염(Takayasu's arteritis); 측두 동맥염(또한 "거세포 동맥염"으로 알려짐); 온난항체에 의한 용혈성 빈혈; 또는 베게너 육아종증과 관련된 주요 항원으로부터 선택된 항원.

특히 바람직한 에피토프는 다음의 이소폼(isoform)으로부터 파생된다: 고양이 비듬 단백질 Fel d1; 집먼지 진드기 단백질 Der p 1, Der p2, Der p7, Der p3 내지 15, Der p 18, 20, 21 및 23, Der f 1,2,7,10,11 내지 18 및 20 내지 22; 돼지풀(ragweed) 단백질 amb a 1,2,3,5,6,7,8,9 및 amb a 1.1, a 1.2, a1.3 및 a 1.4를 포함하는 그의 이소폼(isoform); 호밀풀(rye grass) 단백질 lol p1 및 lol p5; 티모시(timothy) 그라스(grass) 단백질 phl p1 및 phl p5; 우산 잔디(Bermuda grass) 단백질 Cyn d5; 알터나리아(Alternaria) 알테나타 단백질 Alt a 1, Alt a 2, Alt a 3 내지 Alt a 10, Alt a 12, Alt a 13 및 에놀라아제(enolase)(Alt a6), Cla h1, 2,5 내지 10,12, GST, HCh1, HSP 70, NTF2, TCTP; 자작나무(Birch) 단백질 Bet v1,2,3,4,6,7,8 및 P14; 저먼 코크라우치(German Cockroach) 단백질 Bla g 1, Bla g 2, Bla g 3, Bla g 4, Bla g 5 및 Bla g 6,7,8,9, GSTD1, 트립신(Trypsin); 머그워트(mugwort) 단백질 Art v 1; 명아줏과 식물(Russian thistle) 단백질 Sal k 1, Sal k 2 및 Sal k8; 땅콩(peanut) Ara h1, Ara h2, Ara h3, Ara h4, Ara h5, Ara h6, 식물 프롤린(profilins) 또는 지질 전달 단백질 또는 인간 백혈구 항원.

특히 바람직한 펩타이드는 [표 2] 및 [표 3]와 같은 서열로 이루어지거나 구성된다(관련 알레르기성 또는 자가면역/동종면역 장애와 관련하여 순서가 정해진(ordered)):

상기 도시된 집먼지 진드기 서열은 보통 더마토파고이데스 프테로니시누스(dermatophagoides pteronyssinus) 진드기 종으로부터 파생된다. 이들 서열의 바람직한 변종은 더포토파고이데스 파리내(dermatophagoides farinae) 관련 진드기 종으로부터 파생된 상동 서열을 포함한다. 이들은 동정(identifier) "_f"에 의해 이하의 표에 나타내었다.

본 발명의 펩타이드의 다른 바람직한 변종은 주어진 펩타이드의 N 및/또는 C 말단에서 1,2,3,4,5,6,7,10,11,12,13,14,15,16, 또는 17개의 아미노산에 의한 절단(truncations) 또는 연장(extensions)을 포함한다. 집먼지 진드기 펩타이드 HDM03C의 바람직한 절단 및 연장의 실시예는 HDM03M, P 및 W로서 이하 [표 4]에 도시된다.

폴리펩타이드는 보통 제조과정동안 보존하기가 어려운 잔기로 구성되어, 이들 잔기는 바뀔 수 있다. 예를 들면, 글루타민산염(glutamate) 또는 글루타민(glutamine) 잔기는 자발적으로 펩타이드의 N 말단에서 존재할 때 특히 용액에서 피로글루타메이트(pyroglutamate)를 형성한다. 따라서, 생단백질(native protein)t서열의 서열에서 글루타민산염 또는 글루타민에 대응하는 본 발명의 펩타이드의 잔기는 그러한 잔기가 펩타이드의 N 말단에 존재할 때 본 발명의 펩타이드에서 피로글루타메이트로 바뀔 수 있다. 예를 들면, HDM03W_n(SEQ ID NO:54)는 N 말단에서 E 대신에 피로글루타메이트를 가질 수 있다.

일 실시예에 있어서, 본 발명의 조성물은 SEQ ID NOS. 1 내지 4의 펩타이드를 포함한다. 상기 조성물은 SEQ ID NOS.83 내지 85의 펩타이드를 더 포함할 수 있고 선택적으로 더 이상의 펩타이드를 가지지 않을 수도 있다.

다른 구성성분들

동결-건조와 관련하여 상기 부분으로부터 인식될 수 있는 것처럼, 동결-건조되는 조성물은 보통 관심 생물학적 물질 뿐만 아니라 추가적인 구성성분들을 보통 포함할 것이다. 본 발명은 본 발명의 조성물내에서 적어도 하나의 펩타이드의 이합체화를 방지하거나 환원하기 위한 추가적인 구성성분의 결합 사용에 관한 것으로, 이에 따라 더욱 안정한 동결-건조 조성물을 이끌어내는 것이다. 본 발명은 또한 그런 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 (i) 비-환원 탄수화물 및 (ii) 이량체 형성을 억제하는 적어도 하나의 에이전트(agent)의 결합이 이러한 효과를 달성하는 것을 밝혀냈다.

여기에 언급된 것처럼, 탄수화물 및 관련 화합물은 그들이 동결-건조 과정동안 저온-(cryo)- 및 리오프로텍턴트(lyoprotectant)로서 유용하다는 장점을 가진다. 그러나, 저장중에 최종 동결-건조 제품내에 포함된 펩타이드에 의한 이량체 형성을 방지하지 않는다. 추가적인 구성성분은 이것을 달성하기 위해 요구된다. 즉, 펩타이드에 의한 이량체 형성을 억제하는 적어도 하나의 에이전트(agent)가 또한 포함되어야만 한다. 제약(pharmaceutical) 목적을 위한 펩타이드 조성물에서 이량체 형성을 억제하는 에이전트는 보통 제약학적으로 받아들일 수 있어야만 한다. 그런 에이전트는 이황화결합을 환원하기 위해 적당한 에이전트인, 산화방지제 또는 방부제를 포함한다. 적당한 환원제는 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP),2-메르캅토에탄올 및 디티오트레이톨(DTT)을 포함하는 임의의 트리알킬포스핀(trialkylphosphine) 화합물을 포함한다. 다른 적당한 에이전트는 티오글리세롤, 사이오아니졸(thioanisole), 및 시스테인을 포함한다. 티오글리세롤은 특히 바람직하다.

효과적으로 이량체 형성을 방지하기 위하여, 그런 에이전트는 동결 전에 측정될 때, 이량체 형성이 쉬운 물질의 농도에 적어도 동등한 몰라(molar) 농도에서 이상적으로 존재해야만 한다. 따라서, 이량체 형성이 쉬운 물질이 적어도 하나의 자유 시스테인 잔기를 포함하는 하나 이상의 펩타이드인 경우, 상기 에이전트는 적어도 하나의 자유 시스테인 잔기를 포함하는 하나 이상의 펩타이드의 농도에 동등한 몰라 농도에서 적어도 존재한다. 이를 테면 자유 시스테인 잔기를 포함하지 않는 펩타이드와 같은 다른 구성성분의 농도는 보통 고려되지 않는다. 그것은 예를 들면, 조성물이 자유 시스테인 잔기를 포함하는 4개의 펩타이드 및 자유 시스테인 잔기를 포함하지 않는 3개의 펩타이드로 구성된 경우이며, 이량체 형성을 억제하는 에이전트의 농도는 4개의 자유 시스테인 함유 펩타이드의 전체적인 농도와 관련하여 결정된다. 시스테인을 포함하지 않는 세 개의 펩타이드 및 조성물내의 다른 구성성분들의 농도는 요구된 에이전트의 수준에 무관하다.

일 실시예에서, 만약 이량체 방지가 효과적으로 되지 않는다면, 동결 전에 측정된 때, 이량체 형성을 억제하는 적어도 하나의 에이전트가 이량체 형성이 쉬운 물질보다 더 크거나 혹은 더 적은 양으로 존재할 수도 있다. 특별한 실시예에 있어서, 상기 에이전트는 이량체 형성이 쉬운 상기 물질보다 더 많은 양으로 존재한다. 예를 들면, 상기 에이전트는 이량체 형성이 쉬운 상기 재료의 몰라 농도보다 적어도 대략 10,20,30,40,50,60,70,80,90,100,150,200,250,300,400,500,600,700,800,900 또는 1000배 더 크게 존재될 수도 있다. 바람직하게는, 상기 에이전트는 이량체 형성이 쉬운 상기 재료의 몰라 농도보다 적어도 60 및 80 사이의 배수보다 더 큰 몰라 농도로 존재된다. 예를 들면, 상기 물질이 200μM이 몰라 농도로 존재하는 경우, 상기 에이전트는 바람직하게는 12mM 및 16mM사이의 몰라 농도로 존재될 수 있다.

그러한 상황은 예를 들면, 실시예 4에서의 티오글리세롤 "로우(low)" 조성물에 적용하는데, 여기서 적어도 하나의 자유 시스테인을 함유하는 4개 펩타이드는 각각 50μM로 존재하고, 시스테인을 함유하지 않은 세개 펩타이드는 또한 각각 50μM로 존재한다. 이렇게 해서, 이 조성물 1 리터에 있어서, 350 마이크로몰의 총 펩타이드(7개 펩타이드) 및 자유 시스테인을 가진 200 마이크로몰의 펩타이드(자유 시스테인을 가진 4 펩타이드)가 있다. 따라서, 이량체 형성이 쉬운 물질은 200μM로 제시되고 티오글리세롤은 70배 더 큰 14mM의 농도로 존재된다.

다르게는 상기 에이전트는 이량체 형성이 쉬운 상기 물질의 몰라 농도보다 적어도 30 및 40 배수사이의 더 큰 배수의 몰라 농도로 존재 할 수도 있다. 예를 들면, 상기 물질이 400μM의 몰라 농도로 존재하는 경우, 상기 에이전트는 바람직하게는 12mM 및 16mM사이의 몰라 농도로 존재할 것이다.

그런 상황은 만약 모든 펩타이드가 50μM보다 오히려 100μM로 존재한다면 예를 들면, 실시예 4에 있어서 티오글리세롤 "로우(low)" 조성물에 적용될 것이다. 즉, 이런 조성물 1 리터에 있어서, 700 마이크로몰의 총 펩타이드(7개 펩타이드) 및 자유 시스테인을 가진 400 마이크로몰의 펩타이드(자유 시스테인을 가진 4 펩타이드)가 있다. 따라서, 이량체 형성이 쉬운 물질은 400μM로 제시되며 티오글리세롤은 35배 더 큰 14mM의 농도로 존재한다.

상기 물질은 보통 적어도 하나의 자유 시스테인 잔기를 포함하는 적어도 하나의 펩타이드이다. 비율로서 동결전에 조성물내에 존재하는 펩타이드 양의 최소치수는 보통 약 0.01,0.02,0.03,0.04,.0.05,0.06,0.07,0.08,0.09,0.1,0.15,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0,1.1,1.2,1.3,1.4, 또는 1.5 %wt/wt 또는 w/v가 될 수 있다. 비율로서 동결전에 조성물내에 존재하는 펩타이드 양의 최대치는 보통 약 1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2.0,2.1,2.2,2.3,2.4,2.5,3,4 또는 5 % wt/wt 또는 w/v가 될 수 있다. 펩타이드의 양은 보통 상기 설명된 임의의 상한치에 독립적으로 결합된 임의의 하한치 사이가 될 것으로 인식될 것이다. 따라서, 만약 에이전트 총 농도가 적어도 동결이전에 상기 조성물내에 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 펩타이드의 총 농도에 동등한 몰라 농도에 적어도 있다면, 이량체 형성을 억제하는 적어도 하나의 에이전트는 상기 조성물 비율과 유사한 범위내에서 존재할 것이다. 예를 들면, 만약 적어도 하나의 자유 시스테인 잔기를 포함하는 펩타이드의 총 농도가 0.03 nmol/ml이면, 총 에이전트 농도는 적어도 0.03nmol/ml가 될 것이다. 만약 적어도 하나의 자유 시스테인 잔기를 포함하는 펩타이드의 총 농도가 500 nmol/ml이면, 총 에이전트 농도는 적어도 500nmol/ml가 될 것이다.

또한 예를 들면 이량체 제형이 효과적으로 환원된다는 것을 보장하기 위하여 상기 적어도 하나의 에이전트가 보통 상기 설명된 것과 같은 펩타이드에 상대적으로 더 높은 비율이 포함될 수 있는 것으로 인식될 것이다. 추가적으로, 상기 에이전트의 총 농도의 상한치는 보통 제약학적 조성물에 적용되는 것처럼 임상학적 요구사항 또는 제한사항들을 고려할 수 있을 것이다. 예를 들면, 주입을 위해 재구성된 용액은 보통 0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5 또는 4.0%wt/wt 또는 w/v 에이전트를 가질 것이다. 이것은 동결 건조 제품에 있어서, 대략 5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35 또는 40%wt/wt 또는 w/v 각각에 대응한다. 따라서, 제품에 있어서 펩타이드의 양은 이들 임상학적 요구사항에 일치하도록 제한될 필요가 있을 것이다.

동결 전에 조성물에 있어서 임의의 구성성분의 비율은 보통 최종 동결 건조 조성물에서 5 내지 10 배 더 높은 비율에 대응할 것이라는 것은 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다.

동결 건조 조성물에서 이량체 형성을 억제하는 적어도 하나의 에이전트를 포함하는 어려움은 본 발명의 발명자들에 의해 결정된 것처럼, 상기 제품이 주변 온도에서 연장된 시간주기로 저장되었을 때, 또는 상기 제품이 온도의 갑작스런 증가에 노출되었을 때, 동결 건조된 제품으로부터 빠져나온 그러한 에이전트에 대한 것이다. 상기 에이전트는 보통 휘발성(volatile)이고 따라서 최종 제품내에 함유되지 않으며, 저장 및 수송 중에 손상 및 분해(degradation)를 경험하며, 안정한 저장수명이 줄어들며, 제약학적 사용을 위하여는 받아들일만한 것은 아니다. 예를 들면, 동결-건조 조성물 또는 그로부터 재구성된 용액의 출현에 있어서 변화들 때문에.

이러한 어려움을 극복하기 위하여, 본 발명은 최종 동결 건조 제품으로부터 상기 에이전트의 이탈을 야기하지 않는 비-환원 탄수화물 및 이량체 억제제의 결합을 고안했다. 이것을 달성하기 위하여, 동결 건조 조성물은 무정형 구조를 가져야 한다는 것이 필수적이다. 따라서, 본 발명에 있어서 사용하기에 특히 적당한 비-환원 탄수화물은 "무정형(amorphous) 탄수화물"로서 이후에 언급된 동결 건조에 의한 무정형의 탄수화물이다.

상기 조성물이 전체로서 동결 건조에 의해 무정형 구조를 가진다는 것을 보증하기 위하여, 본 발명의 조성물에 있어서 상기 무정형 탄수화물 또는 탄수화물은 동결 건조 조성물의 총 구성성분의 비율로서 보통 적어도 50%의 양이 존재되어야 하며, 그러나 더욱 바람직하게는 60%,70%, 또는 80%의 양으로, 가장 바람직하게는 적어도 90% 양이 존재되어야 한다.

다르게는, 전체 무정형 구조는 상기 조성물의 총 구성성분(components)의 비율로서 50% 이하인 무정형 탄수화물의 비율로 달성될 수 있다. 이것은 만약 무정형 탄수화물이 "결정질 탄수화물"로 이하에 언급된 동결 건조에 의해 결정을 이루는 탄수화물과 함께 사용된다면 달성될 수 있다. 그러나, 생물학 분자 또는 관심이 분산된 몇몇 무정형 구조를 보유하기 위한 그런 결합(combination)에 대하여 동결 건조 과정의 동결 단계중에 조성물의 순환적인 가열과 냉각을 수행하는 것이 보통 필요하게 될 것이다. 이러한 순환적인 가열과 냉각은 어닐링(annealing)으로서 보통 언급되고, 적당한 조건에서 수행될 때 혼합된 결정성/무정형 케이크 구조의 형성을 가져올 수 있다. 이런 예에 있어서, 본 발명의 조성물내에서의 무정형 탄수화물 또는 조성물 탄수화물들은 보통 조성물의 총 구성성분의 비율로서 적어도 20%인 양이 존재한다.

본 발명의 사용을 위해 특히 바람직한 탄수화물은 말투로스(maltulose), 이소-말투로스, 락툴로오스 및 슈크로스, 말토오스, 락토오스, 이소말토오스 및 그의 당알코올, 말티톨, 락티톨, 팔라티닛(palatinit), α-글루코피래노실-만니톨의 혼합물, 및 α-D-글루코피래노실-소르비톨, 및 그의 개개의 당알코올, 당알코올로부터 선택된 폴리히드록시 화합물의 비-환원 글리코시드, 다른 직쇄 폴리알코올, 트레할로스, 슈크로스, 라피노오스, 스타키오즈, 멜레치토오스 및 덱스트란을 포함한다.

바람직한 탄수화물은 트레할로스, 슈크로스, 라피노오스, 스타키오즈, 및 멜레치토오스를 포함하는 비-환원성 디(di)-, 트리(tri)- 및 테트라사카리드(tetrasaccharides)이다. 트레할로스는 특히 바람직하다.

이상적으로는, 상기 탄수화물은 최적의 안정성을 위하여 최종 동결 건조 제품의 가장 높은 선행 저장 온도 이상인 적어도 5,10,15, 또는 가장 바람직하게는 20℃에서 Tg(유리 천이 온도)를 가져야만 한다. 몇몇 바람직한 탄수화물에 대한 Tg 및 관련 변수의 보고된 값들은 이하 [표 5]에 도시된 바와 같다.

화합물	Tg(℃)	Tg'
슈크로스	43-65	대략 -46
라피노오스	70-106	대략 -36
트레할로스	63-115	대략 -27
멜레치토오스	>100
스타키오즈	81-123

Tg=유리 천이 온도; Tg'= 최대 동결 농도 상태에 대한 Tg

여기에서 판명된 것처럼, 동결 건조 탄수화물의 무정형 구조는 최종 동결-건조 제품내에 이량체 형성을 억제하는 작용제를 트랩한다(traps). 이것은 동결 건조에 의한 결정 구조를 가지는 물질에 대조적이다. 결정 또는 혼합/무정형 재료는 이전에는 여기에 설명된 형태의 동결 건조 응용에 바람직하였는데, 왜냐하면 부분적으로 최종 동결 건조 "케이크"가 보통 더욱 매력적인 모습을 가지며 더 짧은 더 공격적인 건조 사이클이 이용될 수도 있었기 때문이다.

따라서, 본 발명은 (i) 적어도 하나의 비-환원(non-reducing) 탄수화물(carbohydrate) 및 (ii) 자유 시스테인 잔기를 포함하는 적어도 하나의 펩타이드로 이루어지는 동결 건조 조성물내에서 이량체 형성을 억제하는 적어도 하나의 작용제(agent)의 사용에 관한 것으로, 상기 사용은 상기 조성물에 있어서 상기 적어도 하나의 펩타이드의 이합체화(dimerisation)를 방지하거나 환원시키기 위한 것이다. 이량체 형성을 억제하는 상기 적어도 하나의 에이전트는 상기 적어도 하나의 탄수화물의 무정형 구조에 의해 동결 건조 제품내에 보유되며, 그에 의해 상기 제품의 저장 수명(storage life)내내 그 안에 있는 상기 펩타이드 또는 펩타이드들의 이합체화를 환원하거나 방지할 수 있다. 이런식으로, 안정한 저장 수명이 이상적으로 5±3℃, 25℃/60%RH, 30℃/65%RH 또는 40℃/75%RH에서 적어도 1년, 또는 적어도 2년정도 달성된다.

상기 설명한 바에 따라, 본 발명의 바람직한 실시예는 (i) 트레할로스, 슈크로스, 라피노오스, 스타키오즈 또는 멜레치토오스 및 (ii) 적어도 하나의 자유 시스테인 잔기를 포함하는 적어도 하나의 펩타이드로 이루어지는 동결 건조 조성물내에서의 티오글리세롤의 사용에 관한 것으로, 여기서 상기 사용은 상기 조성물내에서 상기 적어도 하나의 펩타이드의 이형체화를 방지하거나 환원시키기 위한 것이다.

특히 바람직한 실시예에 있어서, 상기 비-환원 탄수화물은 트레할로스 또는 슈크로스, 가장 바람직하게는 트레할로스이다.

임의의 특별한 가정에 의해 제한되기를 바라지 않으며, 본 발명자들은 이 실시예가 특히 동결 건조 케이크내에서 티오글리세롤의 우수한 보유력(good retention) 때문에 장점이 있다는 것을 고려한다. 티오글리세롤은 동결 건조 조성물에서 결합하기에는 덜 적당한 것으로 이미 고려되었는데, 왜냐하면 전형적인 동결 건조 조건하에서 유리를 형성하기 위해 스스로 얼지않기 때문인데, 즉 -80℃정도 낮은 온도에서 액체로 남아있다. 그러나, 본 발명에 있어서, 동결 건조 케이크의 물리적 특성에 있어서 이탈 또는 부정적 충격을 주는 어떠한 신호없이 티오글리세롤은 특히 트레할로스와 결합하여 유지(retained)될 수 있다는 것이 판명되었다. 티오글리세롤의 존재는 효과적으로 조성물내에서 펩타이드 이량체의 형성을 방지한다.

본 발명의 재구성된 조성물

본 발명에 따라 만들어진 동결 건조된 조성물은 주입을 위해 용액, 특히 수용액(aqueous solution), 이를 테면 멸균 주사용 증류수와 같은 것내에서 재구성될 수 있다는 것은 인식될 것이다. 이상적으로, 상기 용액은 등장성(isotonic)/등침투성(iso-osmolar)용액이고 그에 의해 비경구적(parenteral) 주입에 적당하다.

재구성된 조성물은 보통 이량체로서 존재하는 펩타이드의 최소 비율을 가진다. 즉, 이량체 형성은 효과적으로 방지될 것이다. 이량체로서 존재하는 펩타이드의 최소 비율에 의해, 최대 5%,4%,3%,2%,1%,0.9%,0.8%,0.7%,0.6%,0.5%,0.4%,0.3%,0.2%,0.1%,0.05% 또는 0.01%가 이량체로서 용액내에 존재한다는 것을 의미한다. 용액내에 이량체로서 존재하는 펩타이드의 비율은 용액내에 적당한 시간 주기에 이어지는 이량체로서 존재하는 비율이 될 것이라는 것이 이해될 것이다. 적당한 시간 주기는 익숙한 기술자가 사용전에 용액내에서 서열을 유지하기 위해 합리적으로 기대할 수 있는 범위를 포함한다. 예를 들면, 약 24시간, 약 48시간, 또는 약 72시간이다. 주어진 형태내에 존재하는 펩타이드의 비율은 임의의 적당한 방법에 의해 평가될 수 있을 것이다.

상기 재구성된 조성물은 상기 조성물내에 구성된 펩타이드가 파생시키는 단백질에 대해 개인이 내성화하거나 또는 면역화하기 위한 보통 약학적 제형이 될 것이다. 그와 같이, 상기 재구성된 조성물은 하나 이상의 제약학적으로 받아들일만한 캐리어(carrier) 또는 희석제(diluents) 및 선택적으로 하나 이상의 다른 치료 성분(therapeutic ingredients)을 포함할 수 있다. 상기 캐리어는 상기 제형의 다른 성분들과 양립가능한(compatible) 의미로(특히 그들은 이량체 형성을 촉진하지 않아야만 한다) '받아들일만한' 것이어야 하고 수여자(recipient)에게 해로운 것이어서는 안된다. 보통, 주입용 캐리어, 및 최종 제형은 멸균이고 발열원이 없는 것이다(sterile and pyrogen free). 추가적 구성성분은 동결 건조 조성물내에 존재할 수 있거나 또는 재구성 중에 또는 그 이후에 이어 추가될 수도 있다. 따라서, 보조 물질, 예를 들면 습윤제 또는 유화제, pH 개질(modifying) 또는 완충 물질, 산화방지제, 킬레이트제 등등이 존재할 수 있다. 이들 부형제(excipients), 전색제(vehicles) 및 보조 물질들은 보통 상기 조성물에 수용하는 개인에 있어서 면역 반응을 유도하지 않고, 지나친 독성없이 투여될 수 있는 약학제이다. 약학적으로 받아들일만한 부형제는 이에 제한되지는 않지만 물과 같은 액체, 염분(saline), 폴리에틸렌글리콜, 히알루론산(hyaluronic acid) 및 에탄올을 포함한다. 약학적으로 받아들일만한 염(salts)은 또한 그 안에 예를 들면 하이드로클로라이드(hydrochlorides), 브롬화수소산염(hydrobromides), 인산염, 황산염 등과 같은 무기산(mineral acid) 염; 및 아세트산염, 프로피온산(propionate), 말론산(malonates), 벤조산염(benzoates) 등과 같은 유기산 염이 포함될 수 있다. 약학적으로 받아들일만한 부형제(excipients), 전색제(vehicles) 및 보조 물질의 철저한 논의는 Remington의 Pharmaceutical Sciences에서 이용가능하다(Mack Pub. Co., N.J.1991).

본 발명의 조성물은 유해 작용을 야기하지 않고 효과적이 되도록 적당한 농도의 각각의 펩타이드를 포함할 것이다. 보통, 내성을 위해 사용하는 경우, 상기 조성물의 각 펩타이드의 농도는 0.03 내지 500 nmol/ml 또는 0.02 내지 200 nmol/ml의 범위내에 있을 것이다. 더욱 바람직하게는 0.3 내지 200 nmol/ml, 3 내지 180 nmol/ml, 10 내지 150 nmol/ml 또는 30 내지 120 nmol/ml의 범위내이다. 특별히 바람직하게는 3 내지 12 nmol/ml 범위이다. 상기 조성물은 90%, 또는 95% 또는 98% 또는 적어도 99%의 순도를 가져야만 한다. 주입 용량은 보통 60μl 또는 120μl 가 될 수 있다.

따라서 조성물은 본 발명의 분자 및/또는 세포 및 또는 하나 이상의 다른 치료 분자로 구성되어 제형될 수 있다. 다르게는 본 발명의 조성물은 결합된 치료의 일부로서 하나 이상의 다른 치료 조성물을 가지고 동시에 사용될 수 있고, 순차적으로 또는 별도로 사용될 수 있다.

보통, 면역을 위해 사용하는 경우, 상기 조성물은 각 펩타이드의 1μg 및 10mg 사이의 투여를 허용하여 재구성된 것을 제공할 것이다. 더욱 바람직하게는 각 펩타이드의 양은 3μg 내지 5mg, 5μg 내지 5mg, 10μg 내지 2mg 또는 20μg 내지 1mg의 범위내이다. 각 펩타이드의 농도는 투입 경로에 의존될 것이며, 그러나 보통 피내로(intradermally), 피하로(subcutaneously), 근육내로(intramuscularly), 정맥안으로(intravenously), 입을통해(orally), 비강을(intranasally) 통해 또는 흡입(inhalation)에 의해 전달될 것이다. 상기 조성물은 90%, 또는 95% 또는 98% 또는 적어도 99%의 순도를 가져야만 한다.

치료 방법 및 치료된 개인

본 발명은 개인의 면역 시스템을 조절이 가능한 적어도 하나의 펩타이드를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

"조절(modulating)"은 본 발명의 조성물의 적어도 하나의 펩타이드가 파생시키는 단백질에 대한 개인의 면역을 감작(sensitizing) 또는 유도(inducing)하는 것을 의미할 수 있다. 이런 예에 있어서, 상기 단백질은 보통 전염병으로부터의 종양 항원 단백질 또는 항원 단백질이며, 이를 테면 간염 및 인유두종 바이러스(HPV)에 의해 야기된다. 따라서 본 발명의 조성물은 암 또는 전염병의 예방 또는 치료에 유용하다.

다르게는, "조절"은 본 발명의 조성물의 적어도 하나의 펩타이드가 파생시키는 단백질에 대한 개인의 탈감작(desensitizing) 또는 내성(tolerising)을 의미할 수 있다. 이런 예로, 상기 단백질은 보통 면역 반응이 바람직하지 않은 알레르겐 또는 다른 항원이다. 그러한 항원의 예는 자가면역 질환과 관련된 항원, 이식편대숙주병(graft-versus-host disease) 또는 이식 거부(여기서는 동종면역 조건으로 언급됨)과 관련된 항원 및 모자태동 면역반응(maternal-foetal immune response), 예를 들면 레서스(Rhesus) D 신생아 용혈성 질환과 관련된 항원을 포함한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 알레르기성 질환, 자가면역 질환, 동종면역 조건 또는 모자-태동 면역 반응의 방지 또는 치료에 유용하다.

본 발명은 상기 조건들을 방지하거나 치료하는데 사용하기 위한 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 본 발명의 재구성된 조성물을 투여하는 것을 포함하여 상기 조건들을 가진 피험자를 예방하거나 치료하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 조성물로 치료되거나 제공받는 개체는 바람직하게는 인간이다.

탈감작/내성이 요구되는 경우, 치료할 개인은 감작 위험이 있거나 감작된 것으로 의심되는 특별한 알레르겐 또는 항원에 감작되는 것으로 알려질 수 있다는 것이 인식될 것이다. 개인은 종래에 이 분야에서 알려진 기술 및 여기에 설명된 것과 같은 기술을 사용하여 감작을 위해 시험될 수 있다. 다르게는, 개인은 상기 설명된 조건의 가족력을 가질 수 있다. 개인은 적당한 알레르겐 소스에 근접할 때 알레르기의 증상을 표시하기 때문에 알레르겐에 대한 감작을 위해 개인을 시험하는 것이 필수적이지 않을 수 있다. 근접성은 소스로부터 10 미터 이하, 5 미터 이하, 2 미터 이하, 1 미터 이하, 또는 0 미터를 의미한다. 알레르기 증상은 가려운 눈(itchy eyes), 콧물 흐름(runny nose), 호흡 곤란(breathing difficulties), 붉고 가려운 피부 또는 발진(red itchy skin or rash)를 포함할 수 있다. 알레르기 질환을 치료할 개인은 적어도 2주, 1달, 6개월, 1년 또는 5년동안 알레르기를 가졌을 수도 있다. 상기 개인은 알레르기에 의해 야기된 발진, 비충혈(nasal congestion), 비루 및/또는 기침으로 고통받을 수 있다. 상기 개인은 알레르기를 치료하는 다른 조성물/화합물을 투여하거나 하지 않을 수 있다.

일반적으로, 치료할 개인은 임의 연령이 될 수 있다. 그러나, 바람직하게는, 상기 개인은 1 내지 90, 5 내지 60, 10 내지 40, 또는 더욱 바람직하게는 18 내지 35세의 나이 군이 될 수 있다. 바람직하게는, 치료될 개인은 백인 인구의 대표적인 사례가 되는 빈도수 범위내에서의 MHC 대립유전자 빈도를 가지는 인구로부터이다. 11 일반 DRB 1 대립유전자 가족들에 대한 참고 인구 대립 유전자빈도는 이하에 [표 6]에 도시된다:

DRB1	1	3	4	7	8	11	12	13	14	15	16
%	6.4	14.7	15.7	8.8	3.4	8.3	3.9	14.7	2.9	17.6	2.5
참고인구 %	9.4	11.1	12.8	13.2	3.7	13.4	2.3	10.2	3.2	10.7	3.6

참고 빈도수는 빈도수를 보고하는 많은 연구자료의 분석에 의해 얻어지며 도시된 수치는 평균값이다. 따라서 바람직하게는 치료될 개인은 상기 표에서 참고된(이를 테면 적어도 1,2,3,4,5 또는 모든 대립유전자에 대한) 모든 대립유전자에 대한 참고 모집단(population)으로서 동등한 MHC 대립유전자 빈도를 가지는 모집단으로부터 나온 것으로서, 예를 들면 그 수치에 플러스 또는 마이너스 1,2,3,5,10,15 또는 20%의 범위내이다.

바람직하게 상기 개인은 다음 DRB 1 대립유전자의 대립 유전자 빈도가 다음과 같은 경우의 모집단으로부터 나온 것이다:

4-적어도 9%

7-적어도 10%

11-적어도 8%.

본 발명은 상기 설명된 것처럼 본 발명의 조성물의 많은 투여를 받을 필요가 있을 수 있는 개인들에게 특히 사용하기 위해 적당하다. 본 발명의 펩타이드보다 더 이량체 형성이 쉬운 펩타이드는 많은 투여를 받는 개인에 있어서 유해 작용을 유도할 가능성이 더 높다. 단량체 펩타이드는 보통 이량체 펩타이드보다 염증을 덜 발생시키기 때문에, 본 발명은 또한 조건의 위험을 가지거나 있는 개인에게 투여하기 위하여 적당하며, 그 조건은 펩타이드를 포함하는 치료에 유해한 염증 반응에 의한 것을 특징으로 한다. 펩타이드를 포함하는 치료에 대한 유해한 염증 반응은 펩타이드를 포함하는 치료의 상기 정의된 바와 같은 투여에 따르는 임의의 알레르기 증상의 시작의 결과로서 진단될 수 있다. 개인은 임의의 적당한 의학적 이유로 예를 들면, 유사한 반응의 가족력, 많은 알레르기 반응들의 개인적 의학기록, 또는 보통의 알레르기에 대한 강한 양성 피부 단자(prick) 또는 피부 패치 반응과 같은 그런 반응이 위험한 것으로 고려될 수 있다.

다음 예들은 본 발명은 나타낸다:

실시예

*다음 실시예 및 비교예들은 다른 저장 조건들하에서 다른 조성물의 성능을 나타낸다. 각각의 다른 조성물은 SEQ ID NOS: 1 내지 4(펩타이드 MLA01,04,05 및 12), 및 세 개의 추가 펩타이드: MLA03 (EQVAQYKALPVVLENA (SEQ ID NO:84)), MLA07 (KENALSLLDKIYTSPL (SEQ ID NO:85)) 및 MAL14 (SRVLDGLVMTTISSSK (SEQ ID NO:86))의 서열로 이루어지는 펩타이드로 구성된다.

모든 경우에 있어서, 상기 조성물은 동결-건조 수행 이전에 용액으로 제조된다. 동결 건조 조건들은 각각의 조성물에 대해 적당하게 선택되며 전형적인 동결 건조 사이클은 각각에 대해 도시되었다. 동결 건조 과정 중에 펩타이드의 분해는 과정 전후에 용액의 시료에서 펩타이드 분해 수준을 비교함으로써 측정되었다. 시험된 모든 조성물은 동결 건조 과정동안 펩타이드의 분해가 단지 소수로 경험되었다(데이터는 도시안됨).

동결 건조 다음에, 각각 조성물 시료는 매우 다른 다양한 조건에서 28주 까지 저장된다 (-80℃, 5℃, 25℃/65%RH, 40℃/75% RH) (RH:상대 습도). 최종 동결 건조 제품의 저장 동안 분해는 간격을 두고 시료를 재구성하며 펩타이드 분해 수준을 막 제조된 표준 용액 MLA 07과 비교하여 검사된다.

시험된 각각의 조성물에 있어서, 유일한 휘발성 구성성분은 티오글리세롤이다. 따라서, 티오글리세롤의 보유는 저장 바이얼(vials)의 벽상에 물방울(condensation)의 존재 혹은 부재를 관찰함으로써 결정된다.

실시예 1- 트레할로오스 제형

전형적 동결-건조 사이클

단계	보관 온도(℃)	챔버 압력(mbar)	지속시간(h.min)
1	20	1000	0
2	-40	1000	00.36
3	-40	1000	1.30
4	-24	0.05	2.00
5	-24	0.05	24.00
6	24	0.05	9.20
7	24	0.05	6.00

비- 펩타이드 구성성분(괄호내의 값들은 mM 농도를 나타낸다)

트레할로오스/지오글리세룰/메티오닌(250:46:5)

특징

Tg'=-31.9℃

Tg=83-87℃(최초 런(run))

잔류 습기= 검출안됨

WAXS 디프렉토그램(diffractogram): 완전 무정형(fully amorphous)

티오글리세롤의 보유(retention)는 우수하다. 응결(condensation)은 모든 저장 조건에서 바이얼 벽상에 관찰되지 않았다. 티오글리세롤은 명백하게 상기 무정형 케이크내에서 고정되었다.

케이크 외양은 갈라졌고 그래서 미적으로는 만족스럽지 않으나, 저장 안정성은 도 17 내지 19에 도시된 것처럼 우수하다. 약 8주후에 가장 극심한 조건하에서(40℃/75% RH) 시험된 것을 제외하고는 현저한 펩타이드 분해는 관찰되지 않았다.

실시예 2-'무정형' 이성분 혼합물 계열( binary mixture series )

전형적인 동결-건조 사이클

단계	보관 온도(℃)	챔버 압력(mbar)	지속시간(h.min)
1	-40	1000	0
2	-40	1000	1.00
3	-15	0.03	0.30
4	-15	0.03	20.00
5	30	0.03	0.25
6	30	0.03	8.00

트레할로오스/글리신/티오글리세롤/메티오닌(165:95:46:5)

특징

Tg'=-36.7℃

Tg=62.5℃

잔류 습기= 0.61% w/v

케이크 구조: 완전 무정형(fully amorphous)

티오글리세롤의 보유는 우수하다. 응결(condensation)은 모든 저장 조건에서 바이얼(vial) 벽상에 관찰되지 않았다. 티오글리세롤은 명백하게 상기 무정형 케이크내에서 고정되었다.

케이크 외양은 갈라졌고 그래서 미적으로는 만족스럽지 않으나, 저장 안정성은 도 20 내지 23에 도시된 것처럼 우수하다. 가장 극심한 조건하에서(40℃/75% RH) 시험된 것을 제외하고는 현저한 펩타이드 분해는 관찰되지 않았으며, 펩타이드 내용물내에서 거듭 감소(decline)가 관찰되었다.

2B

슈크로스/글리신/티오글리세롤/메티오닌(182:78:46:5)

특징

Tg'=-37.8℃

Tg=38.6℃

잔류 습기= 0.56% w/v

WAX 디프렉토그램(diffractogram): 완전 무정형(fully amorphous)

티오글리세롤의 보유는 실시예 2A에서 보다는 덜 우수하며, 응결(condensation)은 25℃/65% RH에서 저장된 바이얼(vial) 벽상에 관찰되었다. 티오글리세롤은 명백하게 상기 무정형 케이크내에서 고정되지 않았다.

케이크 외양은 갈라졌고 그래서 미적으로는 만족스럽지 않으나, 저장 안정성은 도 24 내지 27에 도시된 것처럼 우수하다. 현저한 펩타이드 분해는 가장 극심한 조건하에서 시험된 것:25℃/65% RH(5주 후에 특히 명백한 감소를 보여줌) 및 40℃/75% RH(매우 불안한 펩타이드 안정성을 보여줌)에 대해서만 관찰되었다.

2C

트레할로오스/만니톨/티오글리세롤/메티오닌(160:100:46:5)

특징

*Tg'=-36.6℃

Tg=51.6℃

잔류 습기= 0.42% w/v

WAX 디프렉토그램(diffractogram): 완전 무정형(fully amorphous)

티오글리세롤의 보유는 실시예 2A에서 보다는 덜 우수하며, 응결(condensation)은 25℃/65% RH에서 저장된 바이얼(vial) 벽상에 관찰되었다. 티오글리세롤은 완전한 것을 아니지만 명백하게 상기 무정형 케이크내에서 고정되지 않았다.

케이크 외양은 갈라졌고 그래서 미적으로는 만족스럽지 않으나, 저장 안정성은 도 28 내지 31에 도시된 것처럼 우수하다. 가장 극심한 조건하에서(40℃/75% RH) 시험된 것을 제외하고는 현저한 펩타이드 분해는 관찰되지 않았으며, 펩타이드 내용물내에서 거듭 감소(decline)가 관찰되었다. 실시예 2A에 대한 것처럼 좋은 것은 아니지만, 25℃/65% RH에서의 안정성은 양호하다.

2D

슈크로스/만니톨/티오글리세롤/메티오닌(150:110:46:5)

특징

Tg'=-38.7℃

Tg=검출안됨(<25℃)

잔류 습기= 0.34% w/v

WAX 디프렉토그램(diffractogram): 완전 무정형(fully amorphous)

티오글리세롤의 보유는 실시예 2A에서 보다는 덜 우수하며, 응결(condensation)은 25℃/65% RH에서 저장된 바이얼(vial) 벽상에 관찰되었다. 티오글리세롤은 완전하지는 않지만 명백하게 상기 무정형 케이크내에서 고정되지 않았다.

케이크 외양은 갈라졌고 그래서 미적으로는 만족스럽지 않으나, 저장 안정성은 도 32 내지 35에 도시된 것처럼 덜 우수하다. 펩타이드 분해는 25℃/65% RH(안정성 불량) 및 40℃/75% RH(안정성 매우 불량)에서만 관찰되었다.

비교 실시예 1- 만니톨 계열

전형적 동결-건조 사이클

단계	보관 온도(℃)	챔버 압력(mbar)	지속시간(h.min)
1	20	1000	0
2	-5	1000	00.25
3	-5	1000	00.30
4	-40	1000	1.10
5	-40	1000	1.00
6	-20	1000	0.20
7	-20	1000	4.30
8	-40	1000	0.20
9	-40	1000	1.00
10	-15	0.09	0.50
11	-15	0.09	14.00
12	25	0.05	6.00
13	25	0.05	12.00

C1A

만니톨/티오글리세롤(265:14)

특징

Tg'= 무(none)

Tg= 무(none)

잔류 습기= 0.75% w/v

케이크 구조: 결정질(crystalline)

티오글리세롤의 보유는 불량하다. 응결(condensation)은 모든 저장 조건에서 바이얼(vial) 벽상에 관찰된다. 티오글리세롤은 명백하게 상기 결정질 케이크내에서 고정되지 않았다.

케이크 외양은 양호하고 그래서 미적으로 만족스럽지만, 저장 안정성은 도 1 내지 4에 도시된 것처럼 불량하다. 가장 알맞은 조건(-80℃)을 제외하고는 현저한 펩타이드 분해는 모든 조건에서 관찰되었다. 이러한 저장 조건은 제약학적 제품을 위해 상업적으로 성공할 것 같지 않다.

C1B

만니톨/티오글리세롤(265:46)

특징

Tg'= 무(none)

Tg= 무(none)

잔류 습기= 0.33% w/v

케이크 구조: 결정질(crystalline)

티오글리세롤의 보유는 불량하다. 응결(condensation)은 C1A에 대한 것과 유사한 정도로 바이얼(vial) 벽상에 관찰된다. 티오글리세롤은 더 높은 온도에서 존재할 때 조차도 명백하게 상기 결정질 케이크내에서 고정되지 않았다.

케이크 외양은 양호하고 그래서 미적으로 만족스럽지만, 저장 안정성은 도 5 내지 8에 도시된 것처럼 불량하다. 가장 알맞은 조건(-80℃)을 제외하고는 현저한 펩타이드 분해는 모든 조건에서 관찰되었다.

C1C

만니톨/티오글리세롤/메티오닌(265:14:5)

특징

Tg'= 무(none)

Tg= 무(none)

잔류 습기= 1.04% w/v

케이크 구조: 결정질(crystalline)

티오글리세롤의 보유는 불량하다. 응결(condensation)은 C1A에 대한 것과 유사한 정도로 바이얼(vial) 벽상에 관찰된다. 티오글리세롤은 메티오닌의 존재하에서 명백하게 상기 결정질 케이크내에서 고정되지 않았다.

케이크 외양은 양호하고 그래서 미적으로 만족스럽지만, 저장 안정성은 도 9 내지 12에 도시된 것처럼 불량하다. 가장 알맞은 조건(-80℃)을 제외하고는 현저한 펩타이드 분해는 모든 조건에서 관찰되었다. 메티오닌은 이런 조성물의 특성을 개선하지 못하고 있다.

C1D

만니톨/티오글리세롤/메티오닌(265:46:5)

특징

*Tg'= 무(none)

Tg= 무(none)

잔류 습기= 0.61% w/v

케이크 구조: 결정질(crystalline)

티오글리세롤의 보유는 불량하다. 응결(condensation)은 C1A에 대한 것과 유사한 정도로 바이얼(vial) 벽상에 관찰된다. 티오글리세롤은 더 높은 농도로 존재할 때 조차 그리고 메티오닌의 존재하에서 명백하게 상기 결정질 케이크내에서 고정되지 않았다.

케이크 외양은 양호하고 그래서 미적으로 만족스럽지만, 저장 안정성은 도 13 내지 16에 도시된 것처럼 불량하다. 가장 알맞은 조건(-80℃)을 제외하고는 현저한 펩타이드 분해는 모든 조건에서 관찰되었다. 메티오닌은 이런 조성물의 특성을 개선하지 못하고 있다.

비교 실시예 2-'결정질' 이성분 혼합물(binary mixture) 트레할로오스 계열

전형적 동결-건조 사이클

C2A

만니톨/트레할로오스/티오글리세롤/메티오닌(245:10:46:5)

특징

Tg'= -58.3℃

Tg= 70-73℃

잔류 습기= 0.11% w/v

케이크 구조: 결정질(충분하지 않은)

티오글리세롤의 보유는 불량하다. 응결(condensation)은 25℃ 및 40℃에서 6주후에 바이얼(vial) 벽상에 관찰된다. 티오글리세롤은 명백하게 상기 결정질 케이크내에서 고정되지 않았다.

케이크 외양은 양호하고 그래서 미적으로 만족스럽지만, 저장 안정성은 도 36 내지 39에 도시된 것처럼 불량하다. 두 개의 가장 알맞은 조건(5℃ 및 -80℃)을 제외하고는 현저한 펩타이드 분해는 모든 조건에서 관찰되었다.

C2B

만니톨/트레할로오스/티오글리세롤/메티오닌(235:20:46:5)

특징

Tg'= 검출안됨

Tg= 검출안됨

Tm= 검출안됨

잔류 습기= 검출안됨

케이크 구조: 결정질(충분하지 않은)

티오글리세롤의 보유는 불량하다. 응결(condensation)은 특히 25℃ 및 40℃에서 바이얼(vial) 벽상에 관찰된다. 티오글리세롤은 트레할로오스의 더 높은 농도에서 조차 명백하게 상기 결정질 케이크내에서 고정되지 않았다.

케이크 외양은 양호하고 그래서 미적으로 만족스럽지만, 저장 안정성은 도 40 내지 43에 도시된 것처럼 불량하다. 두 개의 가장 알맞은 조건(5℃ 및 -80℃)을 제외하고는 현저한 펩타이드 분해는 모든 조건에서 관찰되었다.

C2C

만니톨/트레할로오스/티오글리세롤/메티오닌(225:20:46:5)

특징

Tg'= 검출안됨

Tg= 검출안됨

Tm= 검출안됨

잔류 습기= 검출안됨

케이크 구조: 결정질(충분하지 않은)

티오글리세롤의 보유는 불량하다. 응결(condensation)은 특히 25℃ 및 40℃에서 바이얼(vial) 벽상에 관찰된다. 티오글리세롤은 여전히 트레할로오스의 더 높은 농도에서 조차 명백하게 상기 결정질 케이크내에서 고정되지 않았다.

케이크 외양은 양호하고 그래서 미적으로 만족스럽지만, 저장 안정성은 도 44 내지 47에 도시된 것처럼 불량하다. 두 개의 가장 알맞은 조건(5℃ 및 -80℃)을 제외하고는 현저한 펩타이드 분해는 모든 조건에서 관찰되었다.

C2D

만니톨/트레할로오스/티오글리세롤/메티오닌/EDTA(245:10:46:5:0.5)

특징

Tg'= 검출안됨

Tg= 검출안됨

Tm= 검출안됨

잔류 습기= 검출안됨

케이크 구조: 결정질(충분하지 않은)

케이크 외양은 양호하고 그래서 미적으로 만족스럽지만, 저장 안정성은 도 48 내지 51에 도시된 것처럼 불량하다. 두 개의 가장 알맞은 조건(5℃ 및 -80℃)을 제외하고는 현저한 펩타이드 분해는 모든 조건에서 관찰되었다. EDTA의 추가는 이런 조성물의 특성에 영향을 주지는 않는다.

C2E

만니톨/트레할로오스/티오글리세롤/메티오닌/EDTA(235:20:46:5:0.5)

특징

Tg'= 검출안됨

Tg= 검출안됨

Tm= 검출안됨

잔류 습기= 검출안됨

케이크 구조: 결정질(충분하지 않은)

케이크 외양은 양호하고 그래서 미적으로 만족스럽지만, 저장 안정성은 도 52 내지 55에 도시된 것처럼 불량하다. 두 개의 가장 알맞은 조건(5℃ 및 -80℃)을 제외하고는 현저한 펩타이드 분해는 모든 조건에서 관찰되었다. EDTA의 추가는 이런 조성물의 특성에 영향을 주지는 않는다.

C2F

만니톨/트레할로오스/티오글리세롤/메티오닌/EDTA(225:30:46:5:0.5)

특징

Tg'= 검출안됨

Tg= 검출안됨

Tm= 검출안됨

잔류 습기= 검출안됨

케이크 구조: 결정질(충분하지 않은)

티오글리세롤의 보유는 불량하다. 응결(condensation)은 특히 25℃ 및 40℃에서 바이얼(vial) 벽상에 관찰된다. 티오글리세롤은 여전히 트레할로오스의 더 높은 농도에서 조차 그리고 EDTA의 존재하에서 명백하게 상기 결정질 케이크내에서 고정되지 않았다.

케이크 외양은 양호하고 그래서 미적으로 만족스럽지만, 저장 안정성은 도 56 내지 59에 도시된 것처럼 불량하다. 가장 알맞은 조건(-80℃)을 제외하고는 현저한 펩타이드 분해는 모든 조건에서 관찰되었다. EDTA의 증가된 수준의 추가는 이런 조성물의 특성에 현저하게 영향을 주지는 않는다.

비교 실시예 3-'결정질' 이성분 혼합물(binary mixture) 슈크로스 계열

전형적 동결-건조 사이클

C3A

만니톨/슈크로스/티오글리세롤/메티오닌(250:10:46:5)

특징

Tg'= 검출안됨

Tg= 검출안됨

Tm= 검출안됨

잔류 습기= 검출안됨

케이크 구조: 결정질(충분하지 않은)

티오글리세롤의 보유는 불량하다. 응결(condensation)은 25℃ 및 40℃에서 5주후에 바이얼(vial) 벽상에 관찰된다. 티오글리세롤은 명백하게 상기 결정질 케이크내에서 고정되지 않았다.

케이크 외양은 양호하고 그래서 미적으로 만족스럽지만, 저장 안정성은 도 60 내지 63에 도시된 것처럼 불량하다. 두 개의 가장 알맞은 조건(5℃ 및 -80℃)을 제외하고는 현저한 펩타이드 분해는 모든 조건에서 관찰되었다.

C3B

만니톨/슈크로스/티오글리세롤/메티오닌(235:20:46:5)

특징

Tg'= 검출안됨

Tg= 검출안됨

Tm= 검출안됨

잔류 습기= 검출안됨

케이크 구조: 결정질(충분하지 않은)

티오글리세롤의 보유는 불량하다. 응결(condensation)은 25℃ 및 40℃에서 바이얼(vial) 벽상에 관찰된다. 티오글리세롤은 더 높은 슈크로스 농도에서조차 명백하게 상기 결정질 케이크내에서 고정되지 않았다.

*케이크 외양은 양호하고 그래서 미적으로 만족스럽지만, 저장 안정성은 도 64 내지 67에 도시된 것처럼 불량하다. 두 개의 가장 알맞은 조건(5℃ 및 -80℃)을 제외하고는 현저한 펩타이드 분해는 모든 조건에서 관찰되었다.

C3C

만니톨/슈크로스/티오글리세롤/메티오닌(225:30:46:5)

특징

Tg'= 검출안됨

Tg= 검출안됨

Tm= 검출안됨

잔류 습기= 검출안됨

케이크 구조: 결정질(충분하지 않은)

티오글리세롤의 보유는 불량하다. 응결(condensation)은 특히 25℃ 및 40℃에서 5주 후에 바이얼(vial) 벽상에 관찰된다. 티오글리세롤은 여전히 슈크로스의 더 높은 농도에서 조차 명백하게 상기 결정질 케이크내에서 고정되지 않았다.

케이크 외양은 양호하고 그래서 미적으로 만족스럽지만, 저장 안정성은 도 68 내지 71에 도시된 것처럼 불량하다. 두 개의 가장 알맞은 조건(5℃ 및 -80℃)을 제외하고는 현저한 펩타이드 분해는 모든 조건에서 관찰되었다.

C3D

만니톨/슈크로스/티오글리세롤/메티오닌/EDTA(245:10:46:5:0.5)

특징

Tg'= 검출안됨

Tg= 검출안됨

Tm= 검출안됨

잔류 습기= 검출안됨

케이크 구조: 결정질(충분하지 않은)

케이크 외양은 양호하고 그래서 미적으로 만족스럽지만, 저장 안정성은 도 72 내지 75에 도시된 것처럼 불량하다. 두 개의 가장 알맞은 조건(5℃ 및 -80℃)을 제외하고는 현저한 펩타이드 분해는 모든 조건에서 관찰되었다.

C3E

만니톨/슈크로스/티오글리세롤/메티오닌/EDTA(235:20:46:5:0.5)

특징

Tg'= 검출안됨

Tg= 검출안됨

Tm= 검출안됨

잔류 습기= 검출안됨

케이크 구조: 결정질(충분하지 않은)

티오글리세롤의 보유는 불량하다. 응결(condensation)은 특히 25℃ 및 40℃에서 5주 후에 바이얼(vial) 벽상에 관찰된다. 티오글리세롤은 명백하게 상기 결정질 케이크내에서 고정되지 않았다.

케이크 외양은 양호하고 그래서 미적으로 만족스럽지만, 저장 안정성은 도 76 내지 79에 도시된 것처럼 불량하다. 두 개의 가장 알맞은 조건(5℃ 및 -80℃)을 제외하고는 현저한 펩타이드 분해는 모든 조건에서 관찰되었다. EDTA의 추가는 이런 조성물의 특성에 영향을 주지는 않는다.

C3F

만니톨/슈크로스/티오글리세롤/메티오닌/EDTA(225:30:46:5:0.5)

특징

Tg'= 검출안됨

Tg= 검출안됨

Tm= 검출안됨

잔류 습기= 검출안됨

케이크 구조: 결정질(충분하지 않은)

티오글리세롤의 보유는 불량하다. 응결(condensation)은 특히 25℃ 및 40℃에서 5주 후에 바이얼(vial) 벽상에 관찰된다. 티오글리세롤은 트레할로오스의 더 높은 농도에서 조차 그리고 EDTA의 존재하에서 명백하게 상기 결정질 케이크내에서 고정되지 않았다.

케이크 외양은 양호하고 그래서 미적으로 만족스럽지만, 저장 안정성은 도 80 내지 83에 도시된 것처럼 불량하다. 두 개의 가장 알맞은 조건(5℃ 및 -80℃)을 제외하고는 현저한 펩타이드 분해는 모든 조건에서 관찰되었다. EDTA의 추가는 이런 조성물의 특성에 현저하게 영향을 주지는 않는다.

실시예 4

실시예 1의 발견에 기초한 제형은 장기간 안정성을 위해 또한 시험되었다. 다음의 제형(티오글리세롤 "하이(high)"로 불린다) 30℃/65% RH에서 1년 까지의 기간 동안 저장되었다:

원료(raw material)	기능(function)	명목상 농도1
MLA01, 아세테이트 염	유효 성분	50μM	73.8μg/mL
MLA03, 아세테이트 염	유효 성분	50μM	88.6μg/mL
MLA04, 아세테이트 염	유효 성분	50μM	94.0μg/mL
MLA05, 아세테이트 염	유효 성분	50μM	101.1μg/mL
MLA07, 아세테이트 염	유효 성분	50μM	90.3μg/mL
MLA12, 아세테이트 염	유효 성분	50μM	91.3μg/mL
MLA14, 아세테이트 염	유효 성분	50μM	84.7μg/mL
D(+) 트레할로오스 디하이드레이트	등장화제(tonicity agent)	270mM	102.14μg/mL
1-티오글리세롤	환원제	46mM	1.514μg/mL
L-메티오닌	산화방지제	5mM	0.746μg/mL
인산	pH 조정	요구대로(as requested)

농도는 액체상태일 때 상기 조성물에 대해 주어지는데, 즉 동결 건조 전에 그리고 재구성 후에 주어진다. 다른 제형(티오글리세롤 "로우(low)")은 동일 조건하에서 시험되었고, 티오글리세롤이 46mM보다는 14mM에서 존재하는 것을 제외하고는 동일하였다. 펩타이드 분해는 도 84에서 도시된 것처럼 간격을 가지고 검사되었다. 결과는 두 제형이 시험 기간 전반에 걸쳐 우수한 펩타이드 안정성을 달성했음을 나타낸다.

Claims

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8개 내지 30개 길이의 아미노산을 가지며 적어도 하나의 자유 시스테인 잔기를 포함하는 적어도 하나의 펩타이드를 포함하며 무정형의 구조를 가지는 안정한 동결건조 조성물을 제조하는 방법에 있어서,
(a) (i) 유일한 비-환원 탄수화물로서 트레할로오스 (ii) 티오글리세롤 및 (iii)적어도 하나의 상기 펩타이드를 용액으로 포함하는 조성물을 준비하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계로부터 얻어지는 조성물을 동결건조하는 단계를 포함하는 제조방법.
제 10항에 있어서,
상기 조성물은 (a) 단계에서 상기 티오글리세롤이 적어도 하나의 자유 시스테인 잔기를 포함하는 상기 조성물의 펩타이드 구성성분의 농도에 대해 60 내지 80배 더 높은 몰 농도(equivalent molar)로 존재하도록 제조하는 방법.
제 10항에 있어서,
상기 조성물은 (a) 단계에서 상기 티오글리세롤이 적어도 하나의 자유 시스테인 잔기를 포함하는 상기 조성물의 펩타이드 구성성분의 농도에 대해 30 내지 40배 더 높은 몰 농도(equivalent molar)로 존재하도록 제조하는 방법.
제 10항에 있어서,
적어도 하나의 상기 펩타이드는 알레르겐이나 동종항원 (allo-antigen)으로부터 유래된 적어도 하나의 MHC-결합성 T 세포 에피토프를 함유하는 지역을 포함하는 방법.
제 13항에 있어서, 상기 에피토프는
(a) 식물 알레르겐, 동물 비듬 (dander) 알레르겐, 곰팡이 (mold) 또는 균류 (fungal) 알레르겐, 먼지 알레르겐, 항생제 또는 다른 약, 쏘는 곤충독 (stinging insect venom), 환경 알레르겐 또는 음식 알레르겐으로부터 선택된 알레르겐; 또는
(b) 급성 파종성 뇌척수염 (ADEM); 애디슨 병; 강직성 척수염; 항인지질성 항체 증후군 (APS); 재생불량성 빈혈 (aplastic anemia); 자가면역성 간염; 자가면역성 난소염; 만성소화 장애증; 크론씨 병; 제1형 당뇨병; 임신 유천포창 (gestational pemphigoid); 굿파스튜어 증후군 (Goodpasture's syndrome); 그레이브스병 (Graves' disease); 길링 바레 증후군 (Guillian-Barre syndrome) (GBS); 하시모토병; 특발성 혈소판 감소성 자반병; 카와사키병; 전신성홍반성 낭창; 다발성 경화증; 중증 근무력증; 기면증; 안간대증 근육간대경련 (OMS); 시신경염; 위축성 자가면역 갑상성염 (Ord's thyroiditis); 천포창 (Pemphigus); 악성 빈혈; 개의 다발성관절염 (polyarthritis in dogs); 원발 담즙성 간경변; 류마티스 관절염; 라이터 증후군; 쇼그랜 증후군; 다까야수 혈관염 (Takayasu's arteritis); 측두 동맥염 (또한 "거세포 동맥염"으로 알려짐); 온난항체에 의한 용혈성 빈혈; 또는 베게너 육아종증과 관련된 주요 항원으로부터 선택된 항원으로부터 유래된 것인 방법.
제 14항에 있어서, 상기 식물 알레르겐은 풀 알레르겐인 방법.
제 14항에 있어서, 상기 에피토프는
고양이 비듬 단백질 Fel d1; 집먼지 진드기 단백질 Der p 1, Der p2, Der p7, Der p3 내지 15, Der p 18, 20, 21 및 23, Der f 1,2,7,10,11 내지 18 및 20 내지 22; 돼지풀(ragweed) 단백질 amb a 1,2,3,5,6,7,8,9 및 amb a 1.1, a 1.2, a1.3 및 a 1.4를 포함하는 그의 이소폼(isoform); 호밀풀(rye grass) 단백질 lol p1 및 lol p5; 티모시(timothy) 그라스(grass) 단백질 phl p1 및 phl p5; 우산 잔디(Bermuda grass) 단백질 Cyn d5; 알터나리아(Alternaria) 알테나타 단백질 Alt a 1, Alt a 2, Alt a 3 내지 Alt a 10, Alt a 12, Alt a 13 및 에놀라아제(enolase)(Alt a6), Cla h1, 2,5 내지 10,12, GST, HCh1, HSP 70, NTF2, TCTP; 자작나무(Birch) 단백질 Bet v1,2,3,4,6,7,8 및 P14; 저먼 코크라우치(German Cockroach) 단백질 Bla g 1, Bla g 2, Bla g 3, Bla g 4, Bla g 5 및 Bla g 6,7,8,9, GSTD1, 트립신; 머그워트(mugwort) 단백질 Art v 1; 명아줏과 식물(Russian thistle) 단백질 Sal k 1, Sal k 2 및 Sal k8; 땅콩(peanut) Ara h1, Ara h2, Ara h3, Ara h4, Ara h5, Ara h6, 식물 프롤린(profilins) 또는 지질 전달 단백질 또는 인간 백혈구 항원으로부터 유래된 방법.
제 13항에 있어서, 상기 적어도 하나의 펩타이드는 서열번호 1 내지 58의 서열 중 어느 하나의 서열을 포함하거나 구성되는 조성물인 방법.
제 17항에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 1 내지 4의 펩타이드를 포함하는 방법.
제 18항에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 84 내지 86의 펩타이드를 더 포함하며, 선택적으로 더 이상의 펩타이드를 가지지 않는 것을 특징으로 하는 조성물인 방법.
제 10항 내지 제 19항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 무정형의 구조를 가지는 안정한 동결건조 조성물.
용액 내 동결건조 조성물을 복원하는 방법을 포함하는 제 20항 기재의 안정한 동결건조 조성물을 복원하는 방법.
제 21항에 기재된 방법에 따라 복원된 용액.
제 20항에 있어서, 상기 조성물은 8개 내지 30개의 아미노산을 가지며 적어도 하나의 자유 시스테인 잔기, 티오글리세롤 및 유일한 비환원성 탄수화물로서 트리할로스를 포함하는 내성 (tolerisation) 또는 면역화 (immunisation)를 위한 적어도 하나의 펩타이드를 포함하는 무정형의 구조를 가지는 안정된 동결건조 조성물.
제 23항에 있어서, 상기 적어도 하나의 펩타이드는 알레르겐이나 동종항원 (allo-antigen)으로부터 유래된 적어도 하나의 MHC-결합성 T 세포 에피토프를 포함하는 안정한 동결건조 조성물.
제 24항에 있어서, 상기 에피토프는
(a) 식물 알레르겐, 동물 비듬 (dander) 알레르겐, 곰팡이 (mold) 또는 균류 (fungal) 알레르겐, 먼지 알레르겐, 항생제 또는 다른 약, 쏘는 곤충독 (stinging insect venom), 환경 알레르겐 또는 음식 알레르겐으로부터 선택된 알레르겐; 또는
(b) 급성 파종성 뇌척수염 (ADEM); 애디슨 병; 강직성 척수염; 항인지질성 항체 증후군 (APS); 재생불량성 빈혈 (aplastic anemia); 자가면역성 간염; 자가면역성 난소염; 만성소화 장애증; 크론씨 병; 제1형 당뇨병; 임신 유천포창 (gestational pemphigoid); 굿파스튜어 증후군 (Goodpasture's syndrome); 그레이브스병 (Graves' disease); 길링 바레 증후군 (Guillian-Barre syndrome) (GBS); 하시모토병; 특발성 혈소판 감소성 자반병; 카와사키병; 전신성홍반성 낭창; 다발성 경화증; 중증 근무력증; 기면증; 안간대증 근육간대경련 (OMS); 시신경염; 위축성 자가면역 갑상성염 (Ord's thyroiditis); 천포창 (Pemphigus); 악성 빈혈; 개의 다발성관절염 (polyarthritis in dogs); 원발 담즙성 간경변; 류마티스 관절염; 라이터 증후군; 쇼그랜 증후군; 다까야수 혈관염 (Takayasu's arteritis); 측두 동맥염 (또한 "거세포 동맥염"으로 알려짐); 온난항체에 의한 용혈성 빈혈; 또는 베게너 육아종증과 관련된 주요 항원으로부터 선택된 항원으로부터 유래된 것인 안정한 동결건조 조성물.
제 25항에 있어서, 상기 식물 알레르겐은 풀 알레르겐인 안정한 동결건조 조성물.
제 25항에 있어서, 상기 에피토프는
고양이 비듬 단백질 Fel d1; 집먼지 진드기 단백질 Der p 1, Der p2, Der p7, Der p3 내지 15, Der p 18, 20, 21 및 23, Der f 1,2,7,10,11 내지 18 및 20 내지 22; 돼지풀(ragweed) 단백질 amb a 1,2,3,5,6,7,8,9 및 amb a 1.1, a 1.2, a1.3 및 a 1.4를 포함하는 그의 이소폼(isoform); 호밀풀(rye grass) 단백질 lol p1 및 lol p5; 티모시(timothy) 그라스(grass) 단백질 phl p1 및 phl p5; 우산 잔디(Bermuda grass) 단백질 Cyn d5; 알터나리아(Alternaria) 알테나타 단백질 Alt a 1, Alt a 2, Alt a 3 내지 Alt a 10, Alt a 12, Alt a 13 및 에놀라아제(enolase)(Alt a6), Cla h1, 2,5 내지 10,12, GST, HCh1, HSP 70, NTF2, TCTP; 자작나무(Birch) 단백질 Bet v1,2,3,4,6,7,8 및 P14; 저먼 코크라우치(German Cockroach) 단백질 Bla g 1, Bla g 2, Bla g 3, Bla g 4, Bla g 5 및 Bla g 6,7,8,9, GSTD1, 트립신; 머그워트(mugwort) 단백질 Art v 1; 명아줏과 식물(Russian thistle) 단백질 Sal k 1, Sal k 2 및 Sal k8; 땅콩(peanut) Ara h1, Ara h2, Ara h3, Ara h4, Ara h5, Ara h6, 식물 프롤린(profilins) 또는 지질 전달 단백질 또는 인간 백혈구 항원으로부터 유래된 것인 안정한 동결건조 조성물.
제 24항에 있어서, 상기 적어도 하나의 펩타이드는 서열번호 1 내지 58의 서열 중 어느 하나의 서열을 포함하거나 구성되는 것인 안정한 동결건조 조성물.
제28항에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 1 내지 4의 펩타이드를 포함하는 것인 안정한 동결건조 조성물.
제 29항에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 84 내지 86으로 표시되는 펩타이드를 더 포함하며, 선택적으로 더 이상의 펩타이드를 가지지 않는 것을 특징으로 하는 안정한 동결건조 조성물.
용액 내 동결건조 조성물을 복원하는 방법을 포함하는 제 23항 기재의 안정한 동결건조 조성물을 복원하는 방법.
제 31항에 기재된 방법에 의해 복원된 용액.