JP3251012B2

JP3251012B2 - 室内塵から単離したヒトｔ細胞反応性猫蛋白質（ｔｒｆｐ）及びその利用

Info

Publication number: JP3251012B2
Application number: JP51589090A
Authority: JP
Inventors: ゲフター，マルコルム・エル; ガーマン，リチヤード・デイ; グリーンステイン，ジユリア・エル; クオ，メイ―チヤン; ロジヤーズ，ブルース・エル; ブラウアー，アンドリユー・ダブリユー
Original assignee: イミユロジク・フアーマシユーチカル・コーポレーシヨン
Priority date: 1989-11-03
Filing date: 1990-11-02
Publication date: 2002-01-28
Anticipated expiration: 2017-01-28
Also published as: DE69033949T2; DE69033949D1; CA2073045C; AU6733090A; FI921979A; ES2174822T3; DK0500785T3; EP0500785A1; WO1991006571A1; NO921697L; FI921979A0; EP0500785B1; ATE216401T1; CA2073045A1; AU650249B2; NO921697D0; JPH05502445A

Description

【発明の詳細な説明】背景人口の約10％にのぼる遺伝的に素因を与えられた人間
は、彼らがさらされている種々の環境源からの抗原に過
敏（アレルギー性）になる。人々に即時型及び／又は遅
延型過敏を引き起こすことができる抗原をアレルゲンと
呼ぶ。King,T.P.,Adv.Immun.,23:77−105（1976）。枯
草熱、喘息及びじんましんの症状は、草の生産物、木、
雑草、動物のふけ、昆虫、食物、薬品及び化学品などの
種々のアレルゲンにより引き起こされるアレルギーの形
態である。アレルギーに含まれる抗体は、主に免疫グロ
ブリンのIgEの種類に属する。IgEは、肥満細胞及び好塩
基球と結合する。特定のアレルゲンが肥満細胞と結合し
たIgEと組み合わさると、IgEは細胞表面で架橋し、IgE
−抗原相互作用の生理学的効果を起こす。脱顆粒によ
り、他の物質の中でもヒスタミン、ヘパリン、好酸球の
ための走化性因子及びロイコトリエン、C4、D4ならびに
E4が放出され、気管支平滑筋細胞の長期間の収縮を引き
起こす。Hood,L.E.等、Immunology,（第２版）、pp460
−462、The Benjamin/Cumming Publishing Co.,Inc.
（1984）。これらの放出物質は、IgEと特定のアレルゲ
ンの組み合わせにより起こるアレルギー症状を招く媒介
物である。それらを通してアレルゲンの効果が現れる。
そのような効果は本質的に全身的又は局所的であり、抗
原が体に入った経路及びIgE及び肥満細胞の沈着の様式
に依存する。一般に局所的の場合は、アレルゲンが体に
入った位置の上皮表面に現れる。全身的効果は、（血管
内）循環抗原に対するIgE−好塩基球応答の結果である
アナフィラキシー（アナフィラキシーショック）を含
む。

合衆国には約一千万人の猫アレルギーの患者がいると
見積もられている。J.L.,and Sundin,B.,Clin.Rev.All
ergy,５:37−47（1987）。多くの人々に特異的にかかわ
るアレルゲンは、家庭の猫の皮膚及び唾液線アレルゲ
ン、Felis domesticusアレルゲンＩ（Fel ｄＩ）で
あり、アレルゲンＩ、キャットＩ及び抗原４とも呼ばれ
る。Fel ｄＩは、サイズ排除HPLCによる分子量が約3
9,000、及び非還元条件下におけるゲル電気泳動におい
て17,000の酸性非−共有結合ホモダイマーであると記載
されている。Chapman,M.D.,等、J.Immunology,140
（３）:812−818（1988）。Chapman等は、Fel ｄＩ
の含有率の高い（50U/ml）室内塵粗抽出物からの、単ク
ローン性抗体アフィニティークロマトグラフィーを用い
たFel ｄＩの一段階精製法も記載している。さらに
彼らは、Fel ｄＩのアミノ酸組成及び部分的アミノ
酸配列も決定した。Fel ｄＩは又、２個の分子量が1
8,000のサブユニットが非共有結合により結合した、分
子量が35,000の二量体であり、３つの同種アレルゲン形
態として存在するとも記載されている（pI3.5−4.1）。
Ohman,J.L.,等、J.Allergy Clin.Immunol.,52:231（19
73）;Ohman J.L.,等、J.Immunol.,113:1668（1974）;L
eiterman,L.,and Ohman,J.L.,J.Allergy Clin.Immuno
l.,74:147（1984）。

猫アレルゲンへの暴露は、動物への暴露又は猫アレル
ゲンを含む室内塵との接触により起こる。これらのアレ
ルゲンを唾液、皮膚の削りくず、猫の洗浄液、血清、唾
液腺、猫の毛、猫のふけ及び室内塵で調べた。

猫アレルゲンへのアレルギー応答及び猫アレルゲンそ
のものが非常な注目を受けてきたにもかかわらず、猫に
過敏性の患者に悪影響を与えると思われるFel ｄＩ
アレルゲンの構造及び成分の定義又は特性化は完全から
は程遠く、現在の脱感作治療は複雑な、はっきりしない
動物のふけからの抽出物を用いた治療を含んでいる。

発明の要約本発明は、猫を飼っている数軒の家庭から集めた室内
塵のアフィニティー精製により単離した、TRFPとも呼ば
れる、約40,000MWの実質的に純粋なヒトＴ細胞反応性猫
蛋白質;TRFP又はペプチドの全体又は一部をコードするD
NA;そのような蛋白質又はペプチド、あるいは蛋白質又
はペプチドの一部を含む組成物；及びTRFP又はペプチド
と反応性の単クローン性抗体に関する。

本発明は又、組換え（以下、本明細書では「組み替
え」とも称する）法により生成したTRFP（組み替えTRF
P）又は組み替えTRFPあるいはペプチドの一部にも関す
る。さらに本発明は、少なくとも１個のアミノ酸の付
加、欠失又は置換、あるいは他の（アミノ酸でない）成
分の存在により、自然に存在するTRFPとアミノ酸配列が
異なる、改変（本明細書では、修正又は変異ともいう）
TRFPとも呼ばれるTRFPに関する。そのような組み替えTR
FPは、使用した宿主細胞に依存してグリコシル化又は非
グリコシル化であることができる。本文に記載する通
り、天然のTRFPはグリコシル化である（すなわち炭水化
物−含有である）ことが分かっている。

本発明はさらに、猫への暴露が猫アレルギー患者に通
常与える悪影響を軽減する又は予防する（すなわち猫ア
レルゲンに対して患者を脱感作する、又はアレルゲンの
効果を遮断する）ために、いずれかの形態のTRFP（すな
わち実質的に純粋なTRFP、組み替えTRFP、修正TRFP）又
はその一部、又はある形態のTRFP又はその一部を含む組
成物を投与する方法にも関する。

本発明は又、猫アレルゲンに対する感応性を診断す
る、又は脱感作養生法に有用なペプチド又はアミノ酸配
列を予測する方法に関する。例えば本文に記載する通
り、猫アレルギー患者からのＴ細胞を重大に刺激する数
種類のペプチドがTRFP内に存在することが示された。そ
れらのペプチドはさらに種々の方法でリンフォカイン分
泌プロフィールに影響し、ある場合にはＴ細胞をアレル
ギー化又は耐性化してTRFPに応答しないようにすること
が示された。そのようなペプチドは、猫アレルゲンに対
する患者のアレルギー応答を軽減する又は無くすために
投与することができる。さらに、これらのペプチドは、
どれが敏感性を引き起こすかを決定するために、猫アレ
ルギー患者に投与する又は生体外診断試験に使用するこ
とができる。適用できると決定したペプチドを、猫−過
敏性患者の脱感作に選択的に使用することができる。本
文で“脱感作”という言葉は、猫、猫のふけ又はその生
産物への暴露に対する猫−過敏性患者のアレルギー反応
を、（脱感作しなければ猫−過敏性患者が経験するであ
ろう程度以下に）軽減することと定義する。

本発明はさらに、Ｔ細胞エピトープから成る修正TRFP
ペプチド又は蛋白質；修正TRFP蛋白質又はその一部を含
む組成物；及び非修正の“天然に存在する”蛋白質が猫
−過敏性患者に与える悪影響を軽減する又は予防するた
めに、修正TRFP蛋白質又はその一部を単独であるいは組
み合わせて投与する方法に関する。

TRFPの全体又は一部をコードする本発明のDNAは、他
の種（例えばやぎ、羊、犬、兎、馬）に存在する同等の
配列の位置決定のためのプローブとして使用することが
でき、診断及び／又は治療の意味で有用である。

図面の簡単な説明図１は、TRFP、鎖１、リーダーＡ（下線）のDNA配列
及び推定アミノ酸配列である。

図２は、TRFP、鎖２、リーダーＢ（下線）のDNA配列
及び推定アミノ酸配列である。

図３は、TRFP、鎖２の長鎖の形態（476ヌクレオチ
ド）のDNA配列及び推定アミノ酸配列である。

図４は、TRFP、鎖２の短鎖の形態（469ヌクレオチ
ド）のDNA配列及び推定アミノ酸配列である。

図５は、TRFP、鎖２の先端を切った形態（465ヌクレ
オチド）のDNA配列及び推定アミノ酸配列である。

図６は、リーダーＡ及びリーダーＢ（上部２本線）を
含むTRFP、鎖１の蛋白質配列である。cDNAの配列決定に
よりリーダー及び鎖１（C1）のアミノ酸配列を推定し、
鎖１の蛋白質配列（PRO）を蛋白質配列決定法により決
定し、蛋白質配列決定法により決定した第１アミノ酸に
基づいてアミノ酸の番号をつけた。各リーダー配列中の
イニシエーターと推定されるメチオニンは、ボールド体
である。（−）は、（−）の上に挙げたアミノ酸残基と
の完全な一致又は同一性を示す。

図７は、リーダー配列を含むTRFP、鎖２の蛋白質配列
である。cDNAの配列決定により、リーダー及び鎖２（C
2）のアミノ酸配列を推定した。鎖２の蛋白質配列（PR
O）を蛋白質配列決定法により決定し、記載の蛋白質配
列決定法により検出した第１アミノ酸及び多型性に基づ
いてアミノ酸の番号をつけた。C2L:長鎖型の鎖２（92ア
ミノ酸）;C2S:短鎖型の鎖２（90アミノ酸）;C2ST 先端
を切った短鎖型の鎖２（80アミノ酸）。リーダー配列中
のイニシエーターと推定されるメチオニンは、ボールド
体であり、Ｎ−グリコシル化部位の可能性のある部分を
下線で示す。（−）は、（−）の上に挙げたアミノ酸残
基との完全な一致又は同一性を示す。

図８は、アフィニティー精製うさぎ抗−ペプチド抗体
（抗−Fel 2,Fel 4,及びFel 18）；単クローン性抗
−Fel ｄＩ抗体（6F9）及びプールされた猫アレルギ
ー性ヒト血清IgEをプローブとした、アフィニティー精
製TRFPの還元条件下におけるSDS/PAGEウェスターン法の
結果を示す。抗−Fel 2,Fel ４抗血清は、鎖１に特異
的である。抗−Fel 18抗血清は、鎖２に特異的であ
る。

図９は、種々の抗原及びペプチドで刺激した患者131
からの末梢血リンパ球のＴ細胞２次応答のグラフ図であ
る。

発明の詳細な説明本文に記載の通りTRFPは、猫を飼っている数軒の家庭
から集めた掃除機バッグの室内塵のアフィニティー精製
により単離精製した。本文に記載する研究により、TRFP
蛋白質の単離精製;TRFPをコードするヌクレオチド配列
及びTRFPのアミノ酸配列の決定（図１−７）;TRFPが、
共有結合した２個のペプチド鎖（鎖１及び２と示す）か
ら成ることの立証;TRFP蛋白質中に存在するＴ細胞反応
性ペプチド又はアミノ酸配列の同定及び単離；及びTRFP
の特性化を行うことができた。又、本研究により、E.co
li中におけるTRFPのクローニング及び発現ならびに得ら
れた組み替えTRFP蛋白質の特性化を行うことができた。
実施例４に記載の通り、TRFP鎖１又は鎖２の全体又は一
部をコードするcDNAクローンを、組み替え融合蛋白質と
してE.coli中に発現することができた。２本鎖TRFP蛋白
質の鎖１が２個の２者択一的なリーダー配列を持ち、鎖
２が２種類の主な形態（長鎖及び短鎖と示す）を有する
ことの発見は、注目に値する。

Fel ｄＩとして周知のFulis domesticusアレルゲ
ンＩと反応する単クローン性抗体を、掃除機バッグの標
本からの単一蛋白質の単離に使用した。この方法で単離
したアフィニティー精製Ｔ細胞反応性蛋白質をヒトＴ細
胞反応性猫蛋白質（ヒトTRFP）と呼ぶ。TRFPは生物活性
（ヒトIgE結合能力）を有し、うさぎ抗−Fel ｄＩ抗
血清と交叉反応性を有することが示された。本発明のペ
プチド又は蛋白質に関連して本文で使用する“アレルゲ
ン性”という言葉は、IgEと結合する及び／又はＴ細胞
を刺激するペプチド又は蛋白質を言う。

TRFPの鎖１及び２のアミノ酸配列の決定の他に、Mart
in Chapmanの提供によるFel ｄＩ蛋白質標本を分析
し、蛋白質を単離し、配列を決定した。アフィニティー
精製TRFPのアミノ酸配列及び公開されたFel ｄＩ蛋
白質配列の比較により、Fel ｄＩ及びTRFPの鎖１の
間でアミノ末端における最初の33アミノ酸の配列に高度
の相同性があることが示された。

以下は、２個の共有結合する鎖から成る単一の蛋白質
を室内塵から単離する方法、ならびにTRFPをコードする
DNAの同定及び単離に使用した方法の記載である。さら
に、組み替えTRFP鎖１及び２を形成するのに使用した方
法も記載する。さらに、TRFP蛋白質からのヒトＴ細胞エ
ピトープを同定し、本文に記載する。

掃除機バッグ標本からの単一蛋白質の単離 M.D.Chapman等の方法に基づく方法により、掃除機バ
ッグの内容物から蛋白質標本を抽出した。Chapman,M.
D.,等,J.Immunol.,140（３）:812−818（1988）。Chapm
an等により製造されたFel ｄＩと反応する単クロー
ン性抗体を標本中の蛋白質の同定に使用した。de Groo
t H.等,J.Allergy Clin.Immunol.,82:778−786（198
8）。Fel ｄＩ本来の蛋白質を認識する選ばれた単ク
ローン性抗体（1G9及び6F9と示す）を用いて蛋白質をア
フィニティー精製し、それを室内塵試料からのヒトＴ細
胞反応性猫蛋白質（TRFP）と呼ぶ（VCB又は掃除機バッ
グ蛋白質とも呼ばれる）。これは周知の方法を用いて所
望の単クローン性抗体を生成し、それを腹水から大量に
単離し、セファロース4B（Pharmacia）に固定すること
により行う。蛋白質標本は、猫を飼っている数軒の家庭
から得た室内塵の掃除機バッグから抽出した。掃除機バ
ッグ水性抽出物を最初にゲル濾過して脱色し、続いてア
フィニティークロマトグラフィー精製をした。掃除機バ
ッグ水性抽出物に単クローン性抗体−含有カラム上を通
過させ、蛋白質種を溶離した。この方法により単離した
蛋白質は、ウェスターン法及びELISA法を用いて、ヒトI
gEと結合することが示され、従ってTRFPがアレルゲン活
性を有することが示された。アフィニティー精製TRFPに
関して多数の蛋白質化学的方法を行い、一次アミノ酸配
列データを誘導した。TRFPから誘導した配列を図６及び
７に示す。蛋白質配列分析に用いた方法はさらに実施例
１に記載する。非還元性条件下におけるウェスターン法
により40kD及び20kDの種の存在が示され、還元性条件下
で10−18kD及び5kDの種が検出された（図８）。

5kDのバンドは、鎖１蛋白質配列から誘導したペプチ
ドに対して誘起されたアフィニティー精製抗−ペプチド
抗血清（抗−Fel ２及び抗−Fel ４）と相互作用を
し、10−18kDのバンドは、鎖２蛋白質配列から誘導した
ペプチドに対して誘起された抗ペプチド抗血清（抗−Fe
l 18）と相互作用をする。従って5kDバンド及び10−18
kDバンドはそれぞれTRFP鎖１及び鎖２から誘導されたも
のである。アフィニティー精製TRFPの約40kDという分子
量（おそらく鎖１及び鎖２ヘテロダイマーの二量体であ
ろう）、及びアフィニティー精製前のゲル濾過において
検出される約130kDの種が示す通り、TRFPは集合した形
態で存在することができる。

ヒトＴ細胞反応性猫蛋白質（TRFP）をコードするDNA挿
入物を含むクローンの同定アフィニティー精製TRFPの蛋白質化学的分析により、
TRFPが２個の共有結合したペプチド鎖（鎖１及び２と示
す；詳細は実施例１を参照）から成ることが決定され
た。さらにペプチド配列分析により、鎖１（70アミノ
酸；図６を参照）及び鎖２（93アミノ酸；図７を参照）
と両方に関するかなりの一次配列データが決定された。
アミノ酸配列データは、TRFP鎖１及び２をコードするcD
NA及びゲノムクローンのクローニング及び完全なヌクレ
オチド配列決定を可能にする種々のクローニング戦略の
案出に使用した（詳細を実施例２及び３に示す）。

TRFPのクローニングのためのmRNAの単離に最も良い組
織材料を決定するために、種々の猫の組織を単クローン
性抗体（Fel ｄＩに対する）を用いたELISA法により
調べた。いくつかの唾液腺及び皮膚がかなりの量のTRFP
を含み、従ってTRFPをコードするクローンcDNA配列を得
る有用な材料となることが決定された（表１を参照、表
中−−−は分析を行わなかったことを示す）。

TRFPコードcDNAのクローニングのために、λgt10又は
λgt11 cDNAライブラリのオリゴヌクレオチドスクリー
ニングを含む数種の方法を使用することができる。別法
として、TRFPアミノ酸配列（図６及び７を参照）と反応
性の抗−ペプチド抗血清を、標準的方法を用いたgt11ラ
イブラリのスクリーニングに使用することができる。Yo
ung,R.A.and R.W.Davis,Proceedings of the Natio
nal Academy of Scienses,USA,80:1194−1198（198
3）。DNAを反応性クローンから単離し、Sanger等の方法
を用いて配列決定することができる。Sanger.F.等,Pro
c.Matl.Acad.Sci.,USA,74:5463（1977）。

ヒトＴ細胞反応性猫蛋白質をコードするDNAをクロー
ニングする他の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）
法を用いて猫の唾液腺mRNAからのDNA又はゲノムDNAを増
幅してクローニングする方法である。混合オリゴヌクレ
オチドプライマー（前向き及び逆向き）を既知のアミ
ノ酸配列から推定し、PCRにおいて使用し、部分的cDNA
クローンを生成する。cDNAの混合オリゴヌクレオチド感
作増幅（MOPAC）と言われるこの戦略は、Lee等（Lee等,
Science,239:1288−1291（1988））により記載されてい
る。MOPAC（及び誘導法）は、TRFP鎖１及び２をコード
する部分的及び全長cDNAの両方の単離に使用した（詳細
を実施例２に記載し、ヌクレオチド配列を図１−６に図
示する）。PCR誘導cDNAクローンは、実施例３に記載の
猫ゲノムEMBL4ライブラリのスクリーニングのための³²P
−標識プローブとして使用した。

本文に記載の研究の結果、TRFPの鎖１及び鎖２をコー
ドするcDNA及びゲノムクローンをクローニングし、単離
し、配列を決定し；コードされる蛋白質のアミノ酸配列
を推定し;TRFPから誘導されるペプチドを周知の方法を
用いて同定し単離した。TRFPの両鎖をコードする完全な
ヌクレオチド配列を図１−５に示す。各ゲノムクローン
のハイブリッド形成パターンは、鎖１及び鎖２のcDNAが
異なる遺伝子の生産物であることを証明する。猫の唾液
腺RNAのノザン法も、２種類の別のmRNAの存在を示して
いる。ゲノムクローンの配列決定によりハイブリッド形
成の結果が確認された。実施例２に記載の通り、PCRに
より生成された各全長鎖１クローンは、その5'末端にお
いて２種類の異なる配列を持つことが示され、鎖１が２
種類の二者択一的リーダー配列を有することを示唆して
いる。これは、鎖１ゲノムクローンのDNA配列分析によ
り確認され、その分析はひとつの鎖１の遺伝子が構造遺
伝子の5'末端で近接して結合する両方の２者択一的リー
ダー配列を持つことを示している（図1,2及び６を参
照）。

実施例４に記載の通り、TRFPの鎖１又は鎖２の全体又
はフラグメントをコードするcDNAクローンは、E.coli発
現ベクター中にサブクローンされ、調べた組み替えTRFP
蛋白質を発現した。鎖１配列又は鎖２配列のいずれかに
対するうさぎ抗−ペプチド抗血清を用いたウェスターン
法は、適した結合特異性を示した。

主題であるヒトＴ細胞反応性猫蛋白質（TRFP）及びそれ
をコードするDNAの利用本文に記載の研究により得られる材料ならびにこれら
の材料を含む組成物は、猫アレルギーの診断、治療及び
予防の方法に使用することができる。さらにcDNA（又は
cDNAの逆転写のもとであるmRNA）は、他の種（例えば
羊、やぎ、犬、うさぎ、馬）における類似配列の同定、
従ってTRFP cDNAとハイブリッド形成するのに十分な相
同性を有する配列の同定又は“抽出”に使用することが
できる。他の種からのそのような配列は、人間における
これらの動物に対するアレルギーの治療に有用な蛋白質
をコードし得る。これは例えば低緊縮条件下で行うこと
ができ、本文に記載の方法を用いてさらに評価するため
に十分な相同性（一般に40％以上）を有する配列を選ぶ
ことができる。別法として、高緊縮条件を用いることが
できる。この方法の場合本発明のDNAは、他の種類の動
物（例えば犬、うさぎ、羊、やぎ、馬）において、TRFP
と類似のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする配
列の同定に使用することができる。これは、ハイブリッ
ド形成又はPCRクローニング法により行うことができ
る。従って本発明は、本発明のDNA配列によりコードさ
れるTRFP又はペプチドのみでなく、本発明のDNAとハイ
ブリッド形成するDNAによりコードされる他のTRFP−類
似蛋白質又はアレルゲン性ペプチドも含む。

本発明のcDNAによりコードされるTRFPペプチドは、例
えば猫−アレルギー患者の治療のための組成物におい
て、猫アレルギーの診断法において、又は猫アレルギー
の診断あるいは治療の主要試薬であるアレルゲン抽出物
の標準化において、“精製"TRFPとして使用することが
できる。本発明の蛋白質の使用により、終始一貫した、
定義の明確な組成及び生物活性を持つアレルゲン標本を
作ることができ、治療の目的で（例えば猫−過敏性患者
の猫アレルギーに対するアレルギー応答を修正するため
に）投与することができる。そのような蛋白質又はペプ
チド（あるいは下記に記載するその修正物）は、例えば
猫アレルゲンに対するＢ−細胞応答、猫アレルゲンに対
するＴ−細胞応答又は両応答を修正することができる。
その精製TRFP又はペプチドも、猫アレルギーの免疫療法
の機構の研究、及び免疫療法において非修正（“天然に
存在する”）蛋白質又はペプチドより有用な修正誘導体
又は類似体の設計に利用することができる。

他の研究者の研究により、免疫療法の間のアレルゲン
の大量の投薬が一般に最も良い結果（すなわち症状を最
も軽減）を与えることが示された。しかし多くの人々
は、アレルゲンに対する不利な反応のためにアレルゲン
の大量の投薬に耐えることができない。

本発明は、現在のアレルゲン免疫療法と類似又はそれ
以上の効力を持ち、そのような治療の形態に通常伴う不
利な反応のない、猫アレルギー患者のための治療法を示
すことができる。改良された治療は、修正天然TRFP又は
ペプチド、本文で同定されたTRFP遺伝子又はその適当な
修正物（変異体）の発現生成物、又はTRFPあるいはその
修正物の構造から誘導したペプチドを使用して行うこと
ができる。

例えば天然のTRFP又はペプチドは、A.Sehon等のポリ
エチレングリコール法を用いて、あるいは天然のアレル
ゲンのIgE反応性を減少させる他の方法で修正すること
ができ、それによってその不利な反応の可能性を減少さ
せることができる。

他の場合、本文で定義するTRFP cDNA又はその一部
は、適した系において発現し、治療活性が強いがIgEと
結合して不利な反応を起こす力が非常に弱められた蛋白
質を生産することができる。これを容易にするために、
有効な精製の助剤として鎖１及び／又は２のポリペプチ
ドバックボーンにリポーター基を加えることができる。
そのようなリポーター基のひとつはポリヒスチジンであ
り、これは固定金属イオンアフィニティークロマトグラ
フィー上で組み替え蛋白質を精製するために有効に使用
されてきた（Hochuli,E.等,Bic/Technology ６:1321−
1325（1988））。特異的切断部位をリポーター基及び鎖
１及び２のポリペプチド配列の間に導入し、これらの部
位における切断により不適切な配列を含まないTRFP鎖又
はフラグメントの単離を容易にすることができる。TRFP
鎖１及び２の修正の他の例は、ジスルフィド複合体を還
元するためにシステイン残基をセリン（又は他の残基）
などの他のアミノ酸残基で置換する例である。

TRFP cDNAの特定部位の突然変異誘発は、鎖１及び２
の構造の修正にも使用することができる。２本の鎖はそ
れぞれ＜400bpのコード配列から成るので、そのような
方法はPCRにより（Ho等,Gene 77:51−59（1989））、
又は突然変異遺伝子の全合成により（Hostomsky,Z.等,B
iochem.Biophys.Res.Comm.161:1056−1063（1989））行
うことができる。細菌における発現を強化するために、
前記の方法を他の方法と組み合わせて使用し、構築物の
哺乳類のコドンをE.coliで使用し易いコドンに変えるこ
とができる。

TRFP遺伝子の他の修正には遺伝子キメラの構築が含ま
れ、その場合は鎖１及び２又はそれらの一部を結合して
１本の連続した鎖を形成することができる。例えば鎖１
の全体又は一部を鎖２のcDNAの全体又は一部と結合し、
得られたキメラを組み替えハイブリッドとすることがで
きる（Horton等,Gene 77:61−68（1989））。又、多重
結合遺伝子を構築し、発現生成物の安定性を増す、又は
その治療力を強化することもできる（Shen等,Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 81:4627−4631（1984））。

さらに本文に記載の研究により、猫アレルギー患者か
らのＴ細胞を強力に刺激するペプチドエピトープ配列
を含むTRFP蛋白質のある領域を同定することができた。
これらのＴ細胞エピトープは本質的に、猫アレルギーの
臨床的症状に対応する猫アレルゲンに対する免疫応答の
開始及び永続に含まれると思われる。天然の猫アレルゲ
ンからのそのようなエピトープは、抗原提示細胞の表面
の適当なHLA分子と結合して関連したＴ細胞下部集団を
刺激することにより、アレルギーカスケードの初期の現
象をＴヘルパー細胞のレベルで開始させると思われる。
これらの現象がＴ細胞の増殖、リンフォカインの分泌、
局所的炎症反応及びその部位への免疫細胞の補充、なら
びにＢ細胞カスケードの活性化を導き、抗体が生成され
る。これらの抗体のひとつのイソタイプであるIgEは、
アレルギー症状の発生に基本的に重要であり、その生成
はカスケード現象の初期のＴヘルパー細胞のレベルで分
泌されるリンフォカインの性質に影響される。従って外
部から投与されたＴ細胞エピトープペプチドは、猫アレ
ルゲンに対するアレルギー応答の発生又は永続に影響
し、猫アレルギー患者の治療に利点を与える。従って猫
アレルギー患者を本文の記載の通りに同定されたＴ細胞
エピトープペプチドに暴露すると、相当するＴ細胞下部
集団が耐性になり、又はアネルギー化してもはや猫アレ
ルゲンに応答せず、そのような暴露に対する免疫応答の
増加に関与しない。別の場合、Ｔ細胞エピトープペプチ
ドの投与により、リンフォカイン分泌の様相が天然のア
レルゲンに暴露した場合とは異なった方向に向くことが
でき（例えばIL−４の減少及び／又はIL−２の増加）、
局所的炎症が軽減し、及び／又は抗体の分泌の様相を有
利に変えることができる。別の場合、Ｔ細胞エピトープ
ペプチドへの暴露により、通常猫アレルゲンへの応答に
関与するＴ細胞下部集団を、通常のアレルゲンへの暴露
の部位（鼻粘膜、皮膚、肺）からペプチドの治療的投与
の部位に引っ張ることができる。このＴ細胞下部集団の
再分布は、通常の暴露の部位でアレルゲンに対して通常
の免疫応答を開始する患者の免疫系の能力を改善する又
は減少させることができ、アレルギー症状を軽減するこ
とができる。

TRFPの構造内からの種々の大きさのペプチドを合成
し、従来の方法で精製し、ヒト猫アレルギー患者から得
たＴ細胞ライン及びクローンに対する生物学的効果を調
べた。使用した方法を実施例5,6及び７に記載する。

TRFPの構造内からのペプチドは、TRFP感作Ｔ細胞培養
における増殖応答を刺激することが示された。実際ある
場合には（図９）、ペプチドを用いて得られた増殖応答
は、TRFP又は猫皮膚試験アレルゲン標本を用いて得られ
る応答以上である。

TRFP配列のある領域が強いＴ細胞刺激活性を持ち（例
えばFel4−３、Fel28−１）、他のある領域が弱い活性
を持つ（例えばFel8−３、Fel14）ことも明らかである
（表２及び３）。この活性の範囲は、純粋な一次配列の
差、又は一次配列の変化により誘起された生理化学的差
から起こる。猫アレルギー患者からのＴ細胞との反応性
の高い、TRFPの構造内からの主要ペプチドエピトープ
は、本発明及び周知の方法を用いて同定することができ
る。

さらに、治療管理条件をまねた条件下の試験管内でＴ
細胞をエピトープペプチドに暴露すると、アレルゲン
（TRFP）へのその後の応答をアレルゲンのみを用いた場
合の応答と比較して非常に抑制することができることが
示された（実施例6,表４）。このデータは、本研究によ
り同定されたエピトープペプチドを選択し、猫アレルギ
ー患者において猫アレルゲン暴露に対する応答を抑制す
るよう設計した治療例にそれを適用する明確な機会を示
している。

さらに猫アレルギー患者からのＴ細胞をTRFPからの種
々のエピトープペプチドに暴露することにより、明確に
異なるリンフォカイン分泌の様相が現れることが示され
た（実施例7,表５）。従って本発明を用いて、猫アレル
ギー患者の治療上有利な応答と一致する様相でリンフォ
カインを分泌させるエピトープペプチドを、治療に使用
するために選ぶことが可能である。

実質的に純粋なTRFP、組み替えTRFP又は修正TRFPであ
ることができる本発明のTRFP蛋白質又はペプチドの、脱
感作したい患者への単独の、又は組み合わせた投与は、
周知の方法を用いて行うことができる。ペプチド又は２
種類かそれ以上のペプチドの組み合わせは、例えば適し
た緩衝液、キャリヤー及び／又はアジュバントをも含む
組成物として患者に投与することができる。そのような
組成物は一般に注射、吸入、経皮膚適用、鼻孔内適用、
経口適用又は経直腸投与により投与する。現在得られる
構造に関する情報を用いて、猫アレルギー患者に十分な
量で投与した場合に猫アレルゲンに対する患者のアレル
ギー応答を改良することができるTRFP又はペプチドを設
計することができる。これは例えばTRFPの構造を調べ、
ペプチドを生成して猫アレルギー患者のＢ−細胞及び／
又はＴ−細胞応答に影響する能力を調べ、細胞が認識す
る適したエピトープを選ぶことにより行うことができ
る。エピトープの配列に似せてあり、猫アレルゲンに対
するアレルギー応答をダウンレギュレーションすること
ができる合成アミノ酸配列を製造することができる。本
発明の蛋白質、ペプチド又は抗体は、周知の方法で猫ア
レルギーの検出及び診断に使用することもできる。例え
ば猫アレルゲンに対する感応性を評価するべき患者から
得た血液を、TRFPの単離ペプチドと、血液中の成分（例
えば抗体、Ｔ細胞、Ｂ細胞）のペプチドとの結合に適し
た条件下で合わせる。その後直接（例えばＴ細胞活性の
決定）又は間接法により結合が起きた程度を測定する。

ここで、猫アレルギー患者においてアレルギー反応を
起こす猫アレルゲンの能力を遮断する又は阻害すること
のできる試薬又は薬剤を設計することもできる。そのよ
うな試薬は、例えば対応する抗−猫アレルゲンIgEと結
合し、IgE−アレルゲン結合及びその後の肥満細胞の脱
顆粒を防ぐように設計することができる。別の場合、免
疫系の細胞成分と結合し、猫アレルゲンへのアレルギー
応答を抑制する、又は脱感作する試薬を設計することが
できる。これらの中で非−制限的な例は、本発明のヒト
Ｔ細胞反応性猫蛋白質のcDNA/蛋白質構造に基づく適し
たＢ−及びＴ−細胞エピトープペプチド、又はそれらの
修正物を利用して猫アレルゲンに対するアレルギー応答
を抑制する例である。これは、猫−過敏性患者からの血
液細胞を用いた試験管内研究により、Ｂ−及びＴ−細胞
機能に影響するＢ−及びＴ−細胞エピトープペプチドの
構造を定義することにより行うことができる。この方法
は実施例５に詳細に記載する。

治療又は予防効率、安定性（例えば保存できる期間の
長さ）及び体内におけるTRFPペプチドの分解に対する抵
抗性の増進のために、TRFPのエピトープを修正する、エ
ピトープを結合する、又はその両方を行うこともでき
る。例えばエピトープ機能に必須のアミノ酸残基を周知
の方法（例えば各残基を置換しＴ細胞活性の存在又は不
在を決定する）を用いて決定することができる。必須で
あることが示されたアミノ酸残基を（例えばＴ細胞活性
を強化することが示された他のアミノ酸により置換する
ことにより）修正することができるし、Ｔ細胞活性に不
必要な残基を（例えば挿入することによりＴ細胞活性を
強化する他のアミノ酸により置換することにより）修正
することもできる。

２個又はそれ以上のTRFPエピトープを、例えば治療効
果の増進のために結合させることもできる。例えば最初
の30N−末端アミノ酸内に存在する２個のエピトープの
アミノ酸配列を生成してリンカーにより結合することが
できる。エピトープを結合するリンカーは、いずれの非
−エピトープアミノ酸配列、又は他の適した結合試薬で
あることもできる。このようにして結合するエピトープ
は、TRFPの同一鎖からのエピトープ、又は異なるTRFP鎖
からのエピトープ（例えば１個が鎖１からであり他が鎖
２から）であることができる。得られる２−エピトープ
構築物は、猫−過敏性患者の治療に使用することができ
る。別の場合、TRFPの第１鎖に存在するエピトープ及び
第２鎖に存在する１個（又はそれ以上）のエピトープを
結合して単一のエピトープペプチドより治療効果の大き
い構築物とすることができる。さらに各エピトープを物
理的に混合して治療薬として投与することができる。

本発明のいずれの具体化においても、使用するDNAは
本文で得たcDNAであることができ、又は別の場合、図１
−７に示すアミノ酸列の全体又は一部をコードするいず
れのオリゴデオキシヌクレオチド配列又はその機能的同
等物であることもできる。そのようなオリゴヌクレオチ
ド配列は、周知の方法を用いて化学的に又は機械的に生
成することができる。オリゴヌクレオチド配列の機能的
同等物は、図１−７の配列（又は対応する配列部分）が
ハイブリッド形成することができる相補的オリゴヌクレ
オチド配列とハイブリッド形成することができる配列、
及び／又は図１−７の配列（又は対応する配列部分）に
よりコードされる生成物と同一の機能的特性を持つ生成
物をコードする配列である。機能的同等物がひとつ又は
両方の基準を満たすかどうかは、その利用に依存するで
あろう（例えばオリゴプローブとしてのみ使用する場
合、第１の基準のみを満たせば良く、アレルゲンの生成
に使用する場合は、第２の基準のみを満たせば良い）。

図１−７のアミノ酸配列から得られる、又は推定する
ことができる構造に関する情報（例えばDNA、蛋白質／
ペプチド配列）は、猫アレルギー反応において重要なＴ
細胞エピトープペプチド及び／又はＢ細胞エピトープペ
プチドの同定又は定義、及びこれらの反応が起こる機構
の媒介物（例えばインターリューキン−２、インターリ
ューキン−４、ガンマインターフェロン）の解明にも使
用することができる。これを知ることにより、ペプチド
に基づく猫アレルゲン治療薬、又はそれらの応答の軽減
に使用できる薬剤の設計が可能になる。

ここで以下の実施例により本発明をさらに説明する
が、これはいかようにも本発明を制限するものではな
い。

実施例1.T細胞反応性猫蛋白質（TRFP）の単離及び蛋白
質配列分析室内塵抽出物からのＴ細胞反応性猫蛋白質の単クローン
性アフィニティー精製猫を飼っている数軒の家庭から集めた室内塵試料を使
用してTRFPを単離、精製した。単クローン性抗体1G9又
は6F9をセファロース4Bとカップリングし、公開された
案に従った精製に使用した。Chapman,M.D.,等,J.Immuno
logy,140（３）:812−818（1988）。精製TRFPを、4NのN
aClを用いてフェニル−セファロースカラム（Pharmaci
a）に負荷し、2M及び1MのNaClを用いて溶離することに
より脱色した。2M及び1M塩溶離物を蒸留水に対して透析
するすることにより回収し、凍結真空乾燥した。アフィ
ニティー精製の前に室内塵抽出物をセファクリル200カ
ラム（Pharmacia）に通過させることによっても脱色を
行った。

TRFPペプチドの調製アフィニティー精製TRFPを最初にジチオトレイトール
で還元し、その後４−ビニルピリジンでアルキル化し
た。セファデックスG10カラムで脱塩した後、還元及び
アルキル化TRFPをシアノーゲンブロミド（CNBr）を用い
て化学的に、又は以下の酵素のひとつを用いて酵素的に
切断した：エンドプロテイナーゼ Glu−Ｃ（Boehringe
r Mannheim）、エンドプロテイナーゼ Asp−Ｎ（Boeh
ringer Mannheim）、エンドプロテイナーゼ Lys−Ｃ
（Boehringer Mannheim）。又、アフィニティー精製TR
FPを、還元及びアルキル化をせずにトリプシン（Worthi
ngton）により消化した。消化生成物をAquaport RP300
カラム（C8）上で0.1％の三フッ化酢酸（TFA）中のアセ
トニトリルの濃度勾配を用いて分離した。各ピークを蛋
白質配列分析装置にかけた。

ペプチド及び蛋白質配列分析 Applied Biosystems Model 477A気相配列分析装置
を単線フェニルチオヒダントイン（PTH）アミノ酸分析
（Model 120A）と共に用いた。アミノ酸回収を改良す
るために、抽出プログラムの修正、多重ブチルクロリド
抽出を使用した。プロリンがアミノ末端に位置する場合
は第１アミンの遮蔽のためにＯ−フタルアルデヒドを用
いた。Brauer,A.W.,等,Anal.Biochemstry,137:134−142
（1984）。非求核的還元剤、トリブチルホスフィンを用
いてその場アルキル化を行い、それに付随してエチルモ
ルホリン緩衝液中で４−ビニルピリジンによりアルキル
化を行った。Andrews,P.C.and Dixon,J.E.,Anal.Bioch
emistry,161:524−528（1987）。完全なTRFP蛋白質のＮ
−末端蛋白質配列分析により、１個の主要なアミノ酸配
列及び数個の微量アミノ酸配列があることが明らかにな
った。主要な配列（図６の鎖１）は、公開されたFel
ｄＩＮ−末端33アミノ酸残基に対応するが、２つの
重大な差がある。Chapman,M.D.等,J.Immunology,140
（３）:812−818（1988）。最も多い微量配列（主要配
列の55％の量）を鎖２とする（図７）。他の微量配列
は、鎖２のＮ−末端を切断した種々の形態である。鎖１
の４番目の残基及び鎖２の７番目の残基がプロリンなの
で、それぞれエドマン分解の第４循環又は第７循環の前
に鎖２又は鎖１の配列を遮蔽するために、Ｏ−フタルア
ルデヒドを適用した。鎖１（68N−末端アミノ酸残基）
及び鎖２（58N−末端アミノ酸残基）の蛋白質配列に関
する情報は、鎖１及び鎖２に関するそれぞれ第32循環及
び第37循環の前の別のOPA遮蔽によりさらに増加した。
蛋白質配列は、酵素的又は化学的消化ペプチドの配列分
析により確認され、拡張された。配列分析装置のガラス
フィルター円板上でのTRFPの時間依存性その場CNBr消化
により、さらに蛋白質配列に関する情報を得ることがで
きた。Simpson,R.J.and Nice,E.C.,Biochem.Internati
onal,８:787−791（1984）。その場CNBr消化の前に、５
回の配列分析循環を行い、その後蛋白質試料を酢酸無水
物で処理してすべてのアミノ基を遮蔽した。これらの段
階により、両鎖からＮ−末端５残基が除去され、両鎖及
び試料中の他のすべてのペプチドから次の残基のアミノ
基が遮蔽された。その場CNBr消化の５時間後、ひとつの
主要ペプチド配列、CB−１及び主要ペプチド配列の60％
（CB−２）、38％（CB−３）及び12％（CB−４）のシグ
ナルレベルを持つ３個の微量ペプチドが同定された。CB
−１は、鎖２の残基43から出発し、鎖２のＮ−末端配列
を68残基まで伸びていた。CB−２は、鎖２の精製CNBrペ
プチド配列と同一であった（75−80）。CB−３は、鎖２
の短鎖の形態のペプチド配列65−68に対応した。CB−４
は、鎖１のペプチド配列50−66に対応した。トリプシン
ペプチド、TRYP−１（鎖２の短鎖型、58−80）を、エン
ドペプチダーゼ Asp−Ｎ生成ペプチド、Ｄ−10（鎖2,7
2−83）を用いて68残基Ｎ−末端ペプチドと結合し、鎖
２を83アミノ酸残基まで伸長した。エンドペプチダーゼ
Lys−Ｃ生成ペプチド、K13（鎖1,64−70）は、鎖１を
70アミノ酸残基まで伸長した。他の酵素及びCNBr生成ペ
プチドにより、鎖１及び鎖２のＮ−末端配列を確認し
た。短鎖トリプシンペプチド、TRYP−２（長鎖型鎖2,58
−69）、及びエンドペプチダーゼ Asp−Ｎペプチド、
Ｄ−10の配列は、鎖２の残基65−72に配列の多型性があ
ることを明らかにした。蛋白質配列分析法により得られ
たTRFP鎖１及び２の一次アミノ酸配列をまとめて図６及
び７に示す。cDNA由来のアミノ酸配列、Asn₃₃−Ala₃₄−
Thr₃₅には、有力なＮ−グリコシル化部位が存在する。
蛋白質配列分析は、鎖２のAla₃₄及びThr₃₅を同定した
が、33位にはなにも同定できなかった。これは、鎖２の
Asn₃₅において翻訳後修正が起こり、その修正が蛋白質
配列分析の間の三フッ化酢酸処理に安定であることを示
唆している。この仮定は、SDS−PAGE/ウェスターン法に
おいて鎖２の大きさを７−12kDに減少させるＮ−ペプチ
ダーゼＦ（Boehringer Mannheim）を用いてTRFPを処
理することにより確認された。さらに両鎖は、β−脱離
により修正することができ、Ｏ−結合グリコシル化を有
することを意味する。２本の鎖は、ジスルフィド結合に
より互いに共有結合している（約20kD）。

実施例2.ヒトＴ細胞反応性猫蛋白質（TRFP）の鎖１及び
２をコードするcDNAのクローニング MOPAC（及び誘導法）を、TRFP鎖１及び２をコードす
る部分的及び全長cDNAの単離に使用した。使用したPCR
法を下記に詳細に記載する。

TRFP鎖１のcDNAのクローニング第１鎖cDNAの合成を、１μｇのポリアデニル酸及び猫
の耳下腺及び下顎腺のプール試料からオリゴdTプライマ
ーを用いて単離したRNAを用いて行った。

鎖１の内部のMOPAC PCR増幅（Lee等,Science 239:1
288−1291（1988））は、それぞれ鎖１のアミノ酸１−
６及び50−54をコードする退化オリゴヌクレオチドプラ
イマーのセンス／アンチセンス対を用いて行った（下記
参照）。これらのオリゴヌクレオチド（プライマー１及
び２）は、Perkin Elmer/Cetus PCRキットと共に用
い、以下のサイクルを用いて上記のcDNAのアリコートを
増幅した： 94℃ １分（変性） 45℃ １分30秒（アニーリング） 72℃ １分（重合）５サイクル 94℃ １分（変性） 55℃ １分30秒（アニーリング） 72℃ １分（重合） 20サイクル上記PCR反応物の10分の１を３％NuSieve Agaroseゲ
ル上で分別した。予想した大きさのDNAバンド（172塩基
対）が観察された。その後このゲルを変性条件下にてGe
neScreen Plusナイロン膜上で“サザン”分析し、35℃
にて6xSSC中で³²P末端標識特異的オリゴヌクレオチドプ
ローブ（Fel １）とハイブリッド形成させ、48℃で2xS
SCで洗浄した。173塩基対バンドが鎖１特異的プローブ
にハイブリッド形成した。

PCR反応物の残りをCla Ｉ及びXho Ｉを用いて制限
消化し、分取３％NuSieveアガロースゲル上で分別し、1
73塩基対バンドを切り出した。フラグメントをCla I/X
ho Ｉ消化Bluescriptプラスミド（Stratagene）中に連
結し、Sequanaseキット（US Biochemicals）を用いてS
anger/ジデオキシDNA配列分析を行った。図１に示すこ
の分析によるデータは、PCR増幅DNAフラグメントの配列
が、翻訳されるとTRFPの鎖１の蛋白質配列の内部と一致
することを示している。

TRFPをコードする鎖1cDNAの3'末端をRACE PCR法に従
ってクローニングした。Frohman,M.A.,Dush,M.K.and M
artin,G.R.Science 85:8998−9002（1988）。

第１鎖cDNAの合成を、１μｇのポリアデニル酸及び猫
の耳下腺及び下顎腺のプール試料からEDTプライマー及
びSuperscript逆転写酵素を用いて単離したRNAを用いて
行った。

プライマー３及びEDプライマーをそれぞれ5'及び3'特
異的プライマーとして使用して、鎖１のカルボキシ末端
部分のRACE PCR増幅を行った。プライマーをPerkin E
lmer/Cetus PCRキットと共に用い、以下のサイクルを
用いて上記cDNAのアリコートを増幅した： 94℃ １分（変性） 55℃ １分30秒（アニーリング） 72℃ １分（重合） 30サイクル上記PCR反応物の10分の１を２％アガロースゲル上で
分別した。上記のようなGeneScreen Plusナイロン膜上
へのゲルの“サザン”分析、及び鎖１特異的オリゴヌク
レオチドプローブ（Fel １）へのハイブリッド形成の
後、TRFP鎖１の3'末端をコードするcDNAと考えられるバ
ンドは検出されなかった。

鋳型として最初のPCR反応生成物の1/100アリコートを
用い、プライマーとしてプライマー４（プライマー３で
コードされるアミノ酸のちょうど3'のアミノ酸をコード
する）及びEDオリゴヌクレオチドを用い、第１の増幅の
場合に用いたサイクルと同一サイクルで第２のPCR反応
を行った。この“ネスト"PCR反応は、TRFP鎖１のcDNAか
ら誘導した第１のPCR反応の生成物を特異的に再増幅す
る。

この第２のPCR反応物の10分の１を２％アガロースゲ
ル上で分別した。上記のようなGeneScreen Plusナイロ
ン膜上へのゲルの“サザン”分析、及び鎖１特異的オリ
ゴヌクレオチドプローブへのハイブリッド形成の後、約
350塩基対の長さのDNAバンドが検出された。

第２のPCR反応物の残りをCla Ｉ及びXho Ｉを用い
て制限消化し、分取１％SeaPlaqueアガロースゲル上で
分別し、350塩基対バンドを切り出した。フラグメント
をCla I/Xho Ｉ消化Bluescriptプラスミド（Stratage
ne）中に連結し、Sequenaseキット（US Biochemical
s）を用いてSanger/ジデオキシDNA配列分析を行った。
図１に示すこの分析によるデータは、PCR増幅350塩基対
DNAフラグメントの配列が、翻訳されるとTRFPの鎖１の
カルボキシ末端の蛋白質配列と一致することを示してい
る。DNA配列分析は、72の位置のシステインコドンに隣
接する停止コドンも明らかにしており、TRFPの鎖１の蛋
白質配列分析が完全に行われたことを示している。さら
に、350塩基対フラグメントの3'非翻訳DNA配列は、cDNA
の3'末端に特異的な原型的ポリアデニル化信号を有す
る。

プライマー及びプローブ TRFP鎖２のcDNAのクローニング第１鎖cDNAを、５匹の猫の耳下腺／下顎腺のプールか
ら調製したmRNAのオリゴ（dT）感作を用いて市販のキッ
トにより合成した。MOPACを用いて鎖２の内部配列を決
定した。

ヒトＴ細胞反応性猫蛋白質鎖２の蛋白質配列に基づい
て２個の過剰オリゴマーを合成した：これは、アミノ酸２−８（KMAEPCT）をコードするコー
ド鎖配列に対応する。

これは、アミノ酸42−48（MKKIQDCY）と相補的な非−
コード鎖配列に対応する。

オリゴマー56は、クローニングのために付加されたEc
o R I制限部位を持ち（下線）、オリゴマー57は、クロ
ーニングのために付加されたPst Ｉ制限部位を持つ
（下線）。Knoth等,1988.Nucl.Acids Res.16:10932に
記載の通り、各オリゴマーにおいてイノシン（Ｉ）を１
回用いて最終的オリゴマーの過剰性を減少させた。

100ピコモルの各プライマー及び第１鎖cDNAを用い、
増幅のために以下の条件を用いてPCRを行った： 94℃にて１分間の変性;45℃にて1.5分間のプライマー
アニーリング;72℃にて２分間の伸長；繰り返しサイク
ル４回。

上記の変性;55℃にて1.5分間のアニーリング；上記の
伸長；第２の繰り返しサイクル19回（合計25サイク
ル）。

鎖２の配列を含む２個のcDNAクローンを同定した。両
クローンは同一の配列を持っていた。原型クローンは、
F2.mである。

TRFPをコードする鎖２のcDNAのCOOH末端をRACE PCR
法に従ってクローニングした。第１鎖cDNAを上記の記載
の通りにmRNAから合成した。

鎖２の増幅に使用したオリゴマーは：オリゴマー＃50 5'GGATCGATGAATTCGGTGGCCAATGGAAAT
G、これは鎖２のアミノ酸19−23（VANGN）をコードする
コード鎖配列に対応し、クローニングのためのCla Ｉ
及びEco R I制限部位を含む。

オリゴマー＃61 5'ATTACTGTTGGACTTGTCCCT、これは
鎖２のアミノ酸23−28（LLLDLS）に対応する。

及び上記のED/EDTプライマー。

“ネストプライマー”を用いて２回のPCR反応を行っ
た。最初のPCR反応では、100ピコモルのオリゴマー59及
び3:1の比率のED及びEDTプライマーを100ピコモル使用
した。増幅条件は、鎖２の内部配列を得る場合に使用し
た条件と同一である。プライマーPCRの0.01体積を、100
ピコモルのオリゴマー＃61（“ネストプライマー”）及
び100ピコモルのEDプライマーを用い、標準的条件で再
増幅した。

増幅フラグメントをクローニングし、配列分析をして
鎖２のCOOH末端を得た。２種類の原型クローン:F15.a及
びF15.dがあった。F15.aは、鎖２の主要蛋白質配列のひ
とつと一致し、F15.dは、第２の蛋白質配列と一致し
た。F15.aを、“長鎖”配列と呼び、F15.dを“短鎖”配
列と呼んだ。F15.a及びF15.dの間には７群のアミノ酸の
違いがあり、５群はアミノ酸の変化であり、２群はF15.
aに対してF15.dのアミノ酸の欠失である（図６及び７参
照）。

２匹の猫の皮膚からのmRNA、ならびプールされた唾液
腺からのmRNAから、鎖２を単離した。皮膚の試料は別々
の採取した。皮膚Ａ（唾液腺プールの形成に使用した５
匹の猫の１匹）は、鎖２の短鎖の形態のみをコードする
mRNAを有していた。皮膚Ｂ（唾液腺プールの形成に使用
した５匹の猫に含まれない６番目の猫から）は、鎖２の
短鎖及び長鎖の両形態のためのmRNAを3:1（S:L）の比率
で含んでいた。皮膚中に鎖２の３番目の形態が見いださ
れた。これを先端を切り落とした短鎖という意味で“S
T"と呼ぶ（図５）。STは、連続した16個のアミノ酸が短
鎖型と異なり、短鎖の配列の最後の10アミノ酸が欠失し
ている。このクローンの例は、皮膚Ａ及び皮膚Ｂの両方
からのmRNAに見いだされた。鎖２の長鎖は、唾液腺の鎖
２の主要形態である（23/24クローン）。鎖２の短鎖
は、皮膚の鎖２の主要形態であり（２匹の猫から20/25
クローン）、長鎖の形態（皮膚Ａでは0/13クローン、皮
膚Ｂでは3/12クローン）及びST形（２匹の猫から2/25ク
ローン）は微量形態であることがわかる。上記の方法に
よって得たTRFP鎖１及び２の完全なヌクレオチド配列の
まとめを図１−５に示す。

鎖２の長鎖の多型性が１匹の猫からの皮膚のmRNA中に
検出された。この多型性には、アミノ酸55におけるイソ
ロイシンのロイシンへの置換、及び位置74におけるメチ
オニンのトレオニンへの置換が含まれる。

TRFP鎖１及び鎖２のNH₂末端のクローニング第１及び第２鎖cDNAを、市販のキットを用い、５匹の
猫の耳下腺／下顎腺のプールから調製したmRNAのオリゴ
dT感作により合成した。二重鎖cDNAをブラントし、ブラ
ントエンドを、アニールしたオリゴマー＃68及び＃69
（下記参照）に連結した。Rafnar等式,J.Biol.Chem.,印
刷中、に記載のこれらのオリゴマーは、Frohman等,198
8.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:8998−9002に記載の
“アンカードPCR"を使用するように設計され、Roux an
d Dhanarajan.1990 BioTech.８:48−57により修正さ
れた。これらのオリゴヌクレオチドは完全に相同ではな
く、従って自己感作をしない。オリゴマーはすべてのcD
NAにブラントエンドするであろう。

オリゴマー＃68 鋳型、ブラントアンカー 5'GGGTCTAGAGGTACCGTCCGATCGATCATT オリゴマー＃69 リンカー、ブラントアンカー 5'p−AATGATCGATGCT オリゴマー＃64アンカープライマー（AP）は、 5'GGGTCTAGAGGTACCGTCCGであった。

TRFP鎖２のNH₂末端のクローニング鎖２の内部ヌクレオチド配列に基づいて２個のオリゴ
マーを合成した：オリゴマー＃60 5'CGGGCTCGAGCTGCAGCTGTTCTCTCTGGTTC
AGT、これはアミノ酸35−40（TEPERT）をコードする配
列と相補的な非−コード鎖配列に対応する。

オリゴマー＃70 5'GGGCTGCAGATTCTAGTCAGCCTGATTGA、
これは、3'UT領域の非−コード鎖配列に対応する。両オ
リゴマーは、アンチセンス鎖配列と一致し、クローニン
グのためのPst Ｉ及びXho Ｉ制限部位（下線、オリゴ
マー60）又はPst Ｉ（下線、オリゴマー70）を含む。

“ネストプライマー”を用いて２回のPCR反応を行っ
た。増幅条件は、MOPACで使用した条件と同一である。
第１の増幅反応は、オリゴマー＃64（AP）及び＃70を用
いて行った。第1PCRの生成物の0.01体積をオリゴマー＃
64及び＃60（これは“ネスト”、すなわちオリゴ＃70に
対して内部である）を用いて再増幅した。増幅した素材
を回収し、クローニングし、配列分析した。

TRFP鎖１のNH₂末端のクローニング鎖１の内部配列に基づくオリゴマーを合成した：オリゴマー＃66 5'GGGCTCGAGCTGCAGTTCTTCAGTATTCTGGC
A、これは鎖１のアミノ酸38−43（ARILKN）をコードす
る配列と相補的な非−コード鎖配列に対応する。クロー
ニングのために、制限部位Pst Ｉ及びXho Ｉを付加し
た。

“ネストプライマー”を用いて２回のPCR反応を行っ
た。増幅条件は、MOPACで使用した条件と同一である。
第１の増幅反応は、プライマー２（上記）及び＃64（A
P）を用いて行った。第1PCRの生成物の0.01体積をオリ
ゴマー＃64及び＃66（これは“ネスト”、すなわちプラ
イマー２に対して内部である）を用いて再増幅した。増
幅した素材を第1PCRから回収し、クローニングし、配列
分析した。２種類の5'配列を得、リーダーＡ及びＢと名
付けた（図１及び２）。

リーダーＡを持つ鎖１は、唾液腺及び皮膚mRNAの両方
において主要配列である。皮膚ＡからのmRNA標本中にリ
ーダーＢ配列を持つ鎖１を検出することはできなかっ
た。リーダーＢ配列を持つ鎖１は、唾液腺及び皮膚Ｂの
プール標本の両方においてmRNAの微量成分であった。

実施例3.TRFPをコードするDNAを含むクローンの同定の
ため猫ゲノムDNAライブラリのスクリーニング出発材料として猫肝臓DNAを用いたEMBL4猫ゲノムライ
ブラリを、Frischauf,A.−M.等,J.Mol.Biol.170:827−8
42（1983）に記載の推奨法を用いて構築した。EMBL4猫
ゲノムライブラリを、プローブとして³²P−標識鎖１及
び鎖2cDNAを用いてスクリーニングした。ライブラリを
プレート化し、スクリーニングすることにより、鎖１又
は鎖2cDNAプローブのどちらかとハイブリッド形成する
が両方とはしない各ゲノムクローンを得た。このハイブ
リッド形成パターンは、鎖１及び鎖2cDNAが異なる遺伝
子の生産物であることを証明した。³²P−標識TRFP鎖１
又は２のcDNAを用いて試験した猫唾液腺RNAのノザン分
析も、２種類の異なるmRNAの存在を示した。ゲノムクロ
ーン（CTGch1及びCTGch2と呼ぶ）のDNA配列を決定し、
ハイブリッド形成の結果を確認した。

各PCR生成鎖１全長クローン（実施例２）は、その5'
末端に２種類の配列を有することが示された（図１及び
２参照）。鎖１が２個の二者択一的リーダー配列を持つ
というのがひとつの説明である。鎖１ゲノムクローン
（CTGch1）のDNA配列はこの説明を実証し、１個の鎖１
遺伝子は構造遺伝子の5'末端で近接して結合する二者択
一的配列の両方を持つことを示した。

鎖２ゲノムクローン（CTGch2）のDNA配列は、猫ゲノ
ム中に鎖２の長鎖及び短鎖型（図３及び４参照）をコー
ドする異なる遺伝子セグメントが存在することを示し
た。TRFP鎖２をコードする２種類の遺伝子が単離される
ことは、猫皮膚及び唾液腺における２種類のmRNAの形態
の組織特異的発現と矛盾しない（図3,4及び7;実施例２
参照）。

ゲノム配列を単離cDNAの配列と比較すると、TRFPが配
列の微細な構造変化を有することが示されることは注目
に値する。

実施例4.組み替えTRFP鎖１及び２の発現 TRFP鎖１又は鎖２の全体又は一部をコードするcDNAク
ローンをE.coli発現ベクター、特にpSEM−1,−２及び−
３にサブクローニングした（Knapp.S.Broker,M.and E.
Amann.BioTechniques ８:280−281。これらのベクター
は、ベータガラクトシダーゼ（Beta−gal）のＮ−末端3
75アミノ酸をコードする、先端を切った型のE.coli la
c Ｚ遺伝子（lacZ'）を持つ。PCR法を用いて、5'末端
が構造内ポリ−ヒスチジン配列及びそれに続く酸感応性
asp−pro結合を有するように、TRFPの鎖１及び鎖２をコ
ードするcDNAクローンを変えた。鎖１又は２発現構築物
を含む培養は、IPTG誘導により実質的量の組み替え融合
蛋白質を生産した。ポリ−ヒスチジンリポーター群の存
在により、固定金属−イオンアフィニティークロマトグ
ラフィーを用いて組み替え体を高度に精製することがで
きる（Hochuli,E.等,BioTechnology ６:1321−1325（1
988）。Asp−Pro部位の緩和−酸切断により、完全な全
長TRFP鎖１又は鎖２蛋白質が放出される。標準的蛋白質
精製法により、不適切な配列を持たない実質的量の組み
替え蛋白質を得る。精製ペプチドの蛋白質配列分析によ
り、配列の信頼性が実証された。鎖１の配列（Fel 1,E
ITPAVKRDVDLFLTGT;Fel 2,DVDLFLTGTPDEYVEQV;Fel 4,N
ARILKNCVDAKMTEEDKE）又は鎖２の配列（Fel 18,LLLDLS
LTKVNATEPERTAMKKIQDC）に対する、うさぎ抗−ペプチド
抗血清を生成した。抗−ペプチド抗血清は、ウェスター
ン法にて組み替え蛋白質（上記）と反応する。

組み替え鎖１及び鎖２ペプチド、ならびにそのフラグ
メント又は修正物は、脱感作治療薬として使用すること
ができる。

実施例5.精製Ｔ細胞反応性蛋白質を用いたＴ細胞研究猫アレルギー患者からの60mlのヘパリン血から抹消血
単核細胞（PBMC）を精製した。その後PBMCを下記のよう
に処理したが、IL−２及び／又はIL−４を用いた培養の
時間及び刺激に用いた特異的ペプチドは変えた。

患者131からの、濃度が10⁶/mlのPBMC10mlを、プール
された５％のヒトAB血清を補った精製TRFP5マイクログ
ラム/ml RPMI−1640の存在下で37℃にて７日間培養し
た。Ficoll−Hypaque遠心により生存細胞を精製し、５
単位の組み替えヒト IL−2/ml及び５単位の組み替えヒ
ト IL−4/mlにて３週間培養した。その後休止Ｔ細胞
を、濃度が5x10⁵/mlの照射（3500Rads）オートロガスPB
MCの存在下で濃度が2x10⁵/mlのTRFP5マイクログラムを
用いて３日間再刺激（二次）し、Ficoll−Hypaque遠心
により精製し、５単位のIL−２及び５単位のIL−4/ml中
で２週間成育した。分析のために2x10⁴個の休止Ｔ細胞
を、96−ウェル丸底分析プレート中で5x10⁴個の照射（3
500Rads）オートメガスPBMC又は2x10⁴個の形質転換Ｂ細
胞（20,000Rads）の存在下、200マイクロリットルの体
積中種々の濃度のアレルゲン又はそのフラグメントを用
いて再刺激（三次）した。その後各ウェルに、１マイク
ロキューリーのトリチウム化（メチル）チミジンを16時
間与えた。挿入されたカウントをガラス繊維フィルター
上に集め、液体シンチレーションカウンターにかけた。

使用抗原:T細胞反応性猫蛋白質（TRFP）、Hollister
−Stier猫上皮細胞皮膚試験試薬（CST）、IPCぶたくさ
花粉抽出物（pollen）、及びTRFP蛋白質配列から誘導し
た合成ペプチド（図６及び７参照）。重要なＴ細胞の多
型性は一般に培地標準（Ｔ細胞及び抗原提示細胞のみ）
の2.5倍以上であると思われる。

別法としてPBMCを以下のように処理した：一次刺激細
胞をIL−2/IL−４中で２週間培養した。この培養からの
休止Ｔ細胞を、上記アレルゲンの全部ではなくいくつか
を用いた二次分析において調べた。これらの評価の結果
を表２及び３に示す。図９は、患者131からのＴ細胞がF
el 1,5及び８ペプチド中に存在するＴ細胞エピトープ
に応答することを示している（なお、図９に示されるグ
ラフの縦軸に「Ｔ細胞多型性」とあるのは、「Ｔ細胞増
殖」を意味する。）。この種のエピトープ分析により、
TRFP中に存在するＴ細胞エピトープを特定することがで
きる。より大きな患者団を用い、陽性指数を得ることに
より、不均一集団の主要エピトープ（PI）を示した。PI
は、応答集団の平均刺激指数に、ペプチドに対して陽性
応答を示した患者のパーセントを乗ずることにより得
る。この分析を表２及び３に示す。

このデータは、TRFP蛋白質のほとんどが何人かの患者
からのＴ細胞を刺激することができるＴ細胞エピトープ
を含むが、TRFP分子の異なる部分を用いて得たＴ細胞応
答の強度に大きな差があることを示している。データ
は、各エピトープが何人かの患者に作用し、各患者は特
徴的応答パターンを有することを示した。例えば、Fel
28はTRFPの領域を含む最も弱いＴ細胞エピトープであ
るが（表３）、ほとんどの主要Ｔ細胞エピトープは、Fe
l ８ペプチドに含まれる（表２）。

実施例6.ペプチドを含むTRFP Ｔ細胞エピトープによる
Ｔ細胞アネルギーの誘導ペプチド特異的Ｔ細胞をその特異的なペプチドに暴露
することにより、Ｔ細胞エピトープを含む蛋白質に対す
るアネルギーを誘導することができる（Jenkins,M.K.an
d Schwartz,R.H.J.Exp.Med.165:302−319（1987））。
いずれの強いＴ細胞エピトープも全アレルゲンに対する
耐性の誘導に使用することができると予想される。その
結果患者は自然のアレルゲンに対して応答しなくなる。
患者は、ヘルパーＴ細胞の刺激により応答しないであろ
う。ヘルパーＴ細胞がない場合、変化したリンフォカイ
ン応答及び／又はIgE応答の不在が起こり、その結果猫
アレルゲンに対するアレルギー応答が減少する。

患者155のTRFP二次感作Ｔ細胞（2.5x10⁶）を休止さ
せ、12x75mmのポリプロピレンスナップキャップ管中で1
0％AB血清を含む1mlの完全RPMI中の（2.5x10⁶）オート
ロガス照射エプスタイン−バールウィルス形質転換Ｂ細
胞（EBV）を用いて培養し、連続５日間で抗原の量を増
加させた。Ｔ細胞培養を０日に５μg/mlのTRFP、その後
５μg/ml、10μg/ml、10μg/ml及び20μg/mlに暴露し
た。ペプチド処理培養を０日に１μg/mlのペプチド、そ
の後１μg/ml、１μg/ml、２μg/ml及び５μg/mlに暴露
した。さらに第２日に0.5mlの新しい培地を置換した。
その後細胞を洗浄し、2x10⁴T細胞及び2x10⁴照射（2500R
ads）EBVならびに種々の投薬量の抗原を用いて多型性分
析を開始した。第９日にトリチウム化チミジンの挿入と
してＴ細胞多型性を測定した。アネルギー又は耐性の試
験管内誘導を表４に示す。この実験は、TRFP及びそのペ
プチドの抗原特異的Ｔ細胞ラインにおけるアネルギー又
は耐性誘導能力を示す。

実施例7.精製TRFP又はTRFP蛋白質配列から誘導した合成
ペプチドに応答するＴ細胞のサイトカインプロフィール実施例５に記載の通りに抹消血単核細胞（PBMC）を猫
アレルギー患者から精製した。5x10⁶個のPBMCを2x10⁶/m
lの濃度において培地のみ、あるいは精製TRFP20μg/ml
又はペプチド50μg/mlの存在下で36時間培養した。その
後細胞をリン酸塩緩衝食塩水（PBS,Ph7.2）で２回洗浄
し、2mlの0.4Mグアニジニウムイソチオシアナート、0.5
％Sarkosyl、5mMのクエン酸ナトリウム、0.1M2−メルカ
プトエタノール、pH7.0を用いて細胞溶解した。その後
溶解細胞を26ゲージ針を通してゲノムDNAをせん断し、
ジエチルピロカーボネート（DEPC）−処理水中の5.7Mの
CsCl、0.01MのEDTA、pH7.5から成る2mlのクッション上
の層とした。溶解細胞を、Beckman SW41ローター中で3
5,000RPM、20℃にて18時間遠心した。RNAペレットを0.4
mlのTE（10mMトリス、1mMEDTA）、pH7.5、0.1％SDS中に
再懸濁し、0.5mlフェノール/0.2mlクロロホルムを用い
て３回抽出した。その後RNAをドライアイス上でDEPC−
処理水中の2.5体積の氷冷エタノール、1/10体積の3M酢
酸ナトリウム、pH5.2を用いて沈澱させ、DEPC−処理水
中の70％エタノールを用いて１回濯ぎ、乾燥した。RNA
ペレットをDEPC−処理水中の２μｌのTE、pH7.5に再懸
濁した。

細胞RNA全体をSuperscriptキット（BRL,Bethesda,M
D）を用いてcDNAに変換した。２μｌのRNAを１μｌのオ
リゴ（dT）_12-18（500μg/ml）及び９μｌの水に加え
た。試料を70℃に10分間加熱し、氷で急冷した。４μｌ
の5X緩衝液を0.1MのDTT2μｌ及び１μｌのdNTP混合物
（それぞれ10mMのdATP,dCTP,dGTP,dTTP）と共に試料に
加えた。１μｌの逆転写酵素（200U）を加え、42℃で１
時間反応させた。試料を90℃にて５分インキュベートす
ることにより反応を終結させ、−80℃で保存した。

10mMのTRIS,pH7.5中でＴ細胞cDNAを連続して10倍に希
釈した液を、標準キット及びPerkin Elmer−Cetus（Re
dwook City,CA）推奨の案を用いて増幅した。各試料に
26.65μｌの水、５μｌの10X PCR緩衝液、８μｌのdNT
P混合物（それぞれ1.25mMのdATP,dCTP,dGTP,dTTP）、0.
1μｌのアルファ³²P−dCTP（3000Ci/ミリモル）、0.25
μｌのAmpliTaq、５μｌのcDNA及び５μｌのサイトカイ
ン特異的5'及び3'プライマー（20μモル）を加えた。ほ
とんどのサイトカイン及びベータ−アクチン標準に使用
したプライマーはClontech（Redwood City,CA）から購
入した。ヒトIL−４プライマーは、Research Genetics
（Huntsville,AL）から購入し、以下の配列をもつ： 5'hIL−４プライマー 5'−GTC−CAC−GGA−CAC−AAG−TGC−GAT−ATC−ACC
−3' 3'hIL−４プライマー 5'−GTT−GGC−TTC−CTT−CAC−AGG−ACA−GGA−ATT
−Ｃ−3' 各試料を１滴の鉱油と共に載せた後、プログラム可能
熱サイクル機（MJ Research,Cambridge,MA）で以下の
プログラムにより反応を行った。

段階温度時間１ 94℃ １分２ 60℃ １分３ 72℃ ２分４段階１に循環、29回５ 72℃ ７分６４℃ 保持 PCR生成物を25μｌのクロロホルムを用いて１回抽出
し、25μｌの各試料を８％ポリアクリルアミドゲル上で
250Vにて電気泳動させた。ゲルを乾燥し、予備−フラッ
シュｘ−線フィルムに露出した。その後Shimazuのフ
ライングスポットレーザーデンシトメーターを用いて各
ゲルの数回の露出を走査した。滴定の直線部分の値を培
地標準値と比較し、各試料について刺激指数を得た。一
般的cDNA量の参照標準として、ベータアクチンのための
プライマーを各試料に加えた。培地標準値が検出されな
い場合、最低測定可能応答を1.00に設定した。他の実験
の場合、サイトカインcDNAの量を、標準として前に増幅
したサイトカイン特異的cDNAと直接比較することができ
る。従って特定のサイトカインcDNAの絶対量をひとつの
試料から多の試料へ、及びひとつの実験から多の実験に
比較することができる。代表的実験の結果を表５に示
す。この実験でIL−2,IL−４及びIFN−ガンマ量を測定
した。示される通り、この特定の猫アレルギー患者の場
合、Fel 18などのペプチドが、ある他のTRFP−誘導ペ
プチド（Fel 14及びFel−17）より多量のIL−４を生成
する。この分析は、IL−5,IL−8,IL−9,TGF−ベータな
どのアレルギー応答の形成に含まれる他のサイトカイン
の研究に拡張されるであろう。各処理からのcDNAの試料
は、一度付加的サイトカインを同定し、配列を決定した
後、後の分析のために保存することができる。アレルギ
ー応答を形成し易い範囲のサイトカインを生成するペプ
チドは、猫アレルギーの治療において治療に使用するの
を避けることができる。同様に、アレルギー応答を減少
させるサイトカイインを生成することが示されたTRFP−
誘導ペプチド、例えばIFN−ガンマ及びIL−10を、猫ア
レルギーの治療のために選ぶことができる。

本発明の特徴的な態様をまとめると次のとおりであ
る。

1.分子量が約40,000の、実質的に純粋な共有結合ヒトＴ
細胞反応性猫蛋白質、又はその一部。

2.a）CIMKGARVLVLLWAALLLIWGGNCEICPAVKRDVDLFLTGTPDEY
VEQVAQYKALPVVLENARILKNCVDAKMTEEDKENALSLLDKIYTSPLC; ｂ）AWRCSWKRMLDAALPPCPTVAATADCEICPAVKRDVDLFLTGTP
DEYVEQVAQYKALPVVLENARILKNCVDAKMTEEDKENALSLLDKIYTSP
LC; ｃ）DTMRGALLVLALLVTQALGVKMAETCPIFYDVFFAVANGNELLL
DLSLTKVNATEPERTAMKKIQDCYVENGLISRVLDGLVMTTISSSKDCMG
EAVQNTVEDLKLNTLGR; ｄ）DTMRGALLVLALLVTQALGVKMAETCPIFYDVFFAVANGNELLL
DLSLTKVNATEPERTAMKKIQDCYVENGLISRVLDGLVMIAINEYCMGEA
VQNTVEDLKLNTLGR;及びｅ）DTMRGALLVLALLVTQALGVKMAETCPUFYDVFFAVANGNELLL
DLSLTKVNATEPERTAMKKIQDCYVENGLISRVLDGLVMPSTNIAWVKQF
RTPから成る群より選んだアミノ酸配列の全体又は一部
を有する、ヒトＴ細胞反応性猫蛋白質。

3.修正ヒトＴ細胞反応性猫蛋白質である、前記２に記載
のヒトＴ細胞反応性猫蛋白質。

4.それを投与した猫アレルゲン−過敏性患者において、
猫アレルゲンへのアレルギー応答を修正することができ
る、前記１に記載のヒトＴ細胞反応性猫蛋白質。

5.猫アレルゲンに対するＢ−細胞応答、猫アレルゲンに
対するＴ−細胞応答、又はその両方を修正することがで
きる。前記４に記載のヒトＴ細胞反応性猫蛋白質。

6.a）図６に示すＴ細胞反応性猫蛋白質鎖1; ｂ）図７に示すＴ細胞反応性猫蛋白質鎖2; ｃ）図７に示すＴ細胞反応性猫蛋白質鎖２の短鎖型；ｄ）図７に示すＴ細胞反応性猫蛋白質鎖２の切断短鎖
型；及びｅ）その機能的同等物から成る群より選んだアミノ酸
配列の全体又は一部を含むヒトＴ細胞反応性猫蛋白質か
ら誘導された単離アレルゲンペプチド。

7.IgEと結合しない、前記６に記載の単離ペプチド。

8.猫アレルギー患者からのＴ細胞を刺激する、前記６に
記載の単離ペプチド。

9.IgEと結合しない、ヒトＴ細胞反応性猫蛋白質の修正
ペプチド。

10.T細胞を刺激する、ヒトＴ細胞反応性猫蛋白質の修正
ペプチド。

11.IgEと結合せず、Ｔ細胞を刺激するヒトＴ細胞反応性
蛋白質の修正ペプチド。

12.投与した猫アレルゲン−過敏性患者を脱感作するこ
とができる、前記９に記載の修正ペプチド。

13.投与した猫アレルゲン−過敏性患者を脱感作するこ
とができる前記10に記載の修正ペプチド。

14.投与した猫アレルゲン−過敏性患者を脱感作するこ
とができる前記11に記載の修正ペプチド。

15.猫−過敏性患者に投与すると、猫アレルゲンに対す
る患者のアレルギー応答を軽減する、ヒトＴ細胞反応性
猫蛋白質の修正ペプチド。

16.ヒトＴ細胞反応性猫蛋白質から誘導されたものであ
って、かつリンカーにより結合した少なくとも２個のＴ
細胞反応性エピトープを含む修正ヒトＴ細胞反応性猫蛋
白質。

17.少なくとも１つのＴ細胞反応性エピトープがＴ細胞
反応性猫蛋白質鎖１から誘導されたものであり、そして
少なくとも１つのＴ細胞反応性エピトープがＴ細胞反応
性猫蛋白質鎖２から誘導されたものである前記16に記載
の修正ヒトＴ細胞反応性猫蛋白質。

18.組み換えヒトＴ細胞反応性猫蛋白質鎖１で表される
蛋白質又はその一部。

19.組み換えヒトＴ細胞反応性猫蛋白質鎖２で表される
蛋白質又はその一部。

20.a）図６のアミノ酸配列の全体又は一部、あるいはｂ）図７のアミノ酸配列の全体又は一部をさらに含
む、前記18に記載の組み換えヒトＴ細胞反応性猫蛋白
質。

21.a）図６のアミノ酸配列の全体又は一部、あるいはｂ）図７のアミノ酸配列の全体又は一部をさらに含
む、前記19に記載の組み換えヒトＴ細胞反応性猫蛋白
質。

22.5'末端にインフレームでポリヒスチジン配列及びそ
れに続くasp−pro酸−感応性結合をさらに含む、前記18
に記載の組み換えヒトＴ細胞反応性猫蛋白質。

23.5'末端にインフレームでポリヒスチジン配列及びそ
れに続くasp−pro酸−感応性結合をさらに含む、前記19
に記載の組み換えヒトＴ細胞反応性猫蛋白質。

24.組み換え融合蛋白質生産物としてE.coli中に発現し
た、前記18に記載の組み換えヒトＴ細胞反応性猫蛋白
質。

25.組み換え融合蛋白質生産物としてE.coli中に発現し
た、前記19に記載の組み換えヒトＴ細胞反応性猫蛋白
質。

26.ヒトＴ細胞反応性猫蛋白質鎖２のアミノ酸配列に結
合したヒトＴ細胞反応性猫蛋白質鎖１のアミノ酸配列、
及び該アミノ酸配列の修正物を含む組み換えＴ細胞反応
性猫蛋白質。

27.a）１）アミノ酸３がＴであるアミノ酸１−17; ２）アミノ酸１−17; ３）アミノ酸４−17; ４）アミノ酸６−17; ５）アミノ酸８−17; ６）アミノ酸10−17; ７）アミノ酸９−25; ８）アミノ酸31がＰであり、アミノ酸32がＤである
アミノ酸18−33; ９）アミノ酸18−33; 10）アミノ酸18−31; 11）アミノ酸18−30; 12）アミノ酸18−29; 13）アミノ酸18−28; 14）アミノ酸18−27; 15）アミノ酸１−30; 16）アミノ酸５−33; 17）アミノ酸６−33; 18）アミノ酸７−33; 19）アミノ酸18−43; 20）アミノ酸23−36; 21）アミノ酸25−36; 22）アミノ酸26−36; 23）アミノ酸27−42; 24）アミノ酸29−42; 25）アミノ酸37−55; 26）アミノ酸37−52; 27）アミノ酸37−49; 28）アミノ酸37−46; 29）アミノ酸25−49; 30）アミノ酸25−48; 31）アミノ酸25−47; 32）アミノ酸29−55; 33）アミノ酸29−54; 34）アミノ酸29−53; 35）アミノ酸26−55; 36）アミノ酸28−55; 37）アミノ酸44−60; 38）アミノ酸51−66;及び 39）アミノ酸70がＲであるアミノ酸56−70;から成
る群より選んだ猫蛋白質の鎖１のアミノ酸、ならびにｂ）１）アミノ酸１−22; ２）アミノ酸12−33; ３）アミノ酸12−24; ４）アミノ酸14−24; ５）アミノ酸16−24; ６）アミノ酸23−48; ７）アミノ酸26−36; ８）アミノ酸26−38; ９）アミノ酸26−40; 10）アミノ酸14−40; 11）アミノ酸14−39; 12）アミノ酸14−38; 13）アミノ酸14−37; 14）アミノ酸14−36; 15）アミノ酸15−40; 16）アミノ酸15−36; 17）アミノ酸34−59; 18）アミノ酸49−68; 19）アミノ酸60−82; 20）アミノ酸74−92; ｃ）ヒトＴ細胞反応性猫蛋白質の鎖２の短鎖型のアミ
ノ酸60−82;及びｄ）上記アミノ酸配列ａ）、ｂ）又はｃ）の修正物か
ら成る群より選んだヒトＴ細胞反応性猫蛋白質の鎖２の
長鎖型のアミノ酸、からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含むヒトＴ細胞
反応性猫蛋白質から誘導されたペプチド。

28.刺激指数が少なくとも約4.0であるか又は陽性指数が
少なくとも約250である、ヒトＴ細胞反応性猫蛋白質。

29.投与した猫アレルギー患者においてアネルギーを生
じさせるか、又は投与した猫アレルギー患者においてＴ
細胞のリンフォカイン分泌プロフィールを修正する、ヒ
トＴ細胞反応性猫蛋白質から誘導されたペプチド。

30.a）CIMKGARVLVLLWAALLLIWGGNCEICPAVKRDVDLFLTGTPDE
YVEQVAQYKALPVVLENARILKNCVDAKMTEEDKENALSLLDKIYTSPL
C; ｂ）AWRCSWKRMLDAALPPCPTVAATADCEICPAVKRDVDLFLTGTP
DEYVEQVAQYKALPVVLENARILKNCVDAKMTEEDKENALSLLDKIYTSP
LC; ｃ）DTMRGALLVLALLVTQALGVKMAETCPIFYDVFFAVANGNELLL
DLSLTKVNATEPERTAMKKIQDCYVENGLISRVLDGLVMTTISSSKDCMG
EAVQNTVEDLKLNTLGR; ｄ）DTMRGALLVLALLVTQALGVKMAETCPIFYDVFFAVANGNELLL
DLSLTKVNATEPERTAMKKIQDCYVENGLISRVLDGLVMIAINEYCMGEA
VQNTVEDLKLNTLGR;及びｅ）DTMRGALLVLALLVTQALGVKMAETCPUFYDVFFAVANGNELLL
DLSLTKVNATEPERTAMKKIQDCYVENGLISRVLDGLVMPSTNIAWVKQF
RTP、から成る群より選んだアミノ酸配列の全体又は一
部を含む、ヒトＴ細胞反応性猫蛋白質から誘導されたペ
プチドをコードする単離DNA。

31.ヒトＴ細胞反応性猫蛋白質又はそれから誘導された
ペプチドを含む治療用組成物。

32.ヒトＴ細胞反応性猫蛋白質又はペプチドが：ａ）前記２に記載のアミノ酸配列；ｂ）前記27に記載のアミノ酸配列；及びｃ）ａ）又はｂ）のアミノ酸配列の修正物から成る群
より選んだアミノ酸配列を有する、前記31に記載の治療
用組成物。

33.ヒトＴ細胞反応性猫蛋白質から誘導されたペプチド
と特異的に反応する抗体。

34.a）前記２に記載のアミノ酸配列；及びｂ）前記27に記載のアミノ酸配列から成る群より選ん
だアミノ酸配列を含むヒトＴ細胞反応性猫蛋白質から誘
導されたペプチドと特異的に反応する。前記33に記載の
抗体。

35.図１のアミノ酸配列の全部又は一部、図２のアミノ酸配列の全部又は一部、図３のアミノ酸配列の全部又は一部、図４のアミノ酸配列の全部又は一部及び図５のアミノ酸配列の全部又は一部から成る群より選んだアミノ酸配列を含み、かつ猫アレ
ルゲンに対する過敏症の処置に使用するための、ヒトＴ
細胞反応性猫蛋白質から誘導されたペプチド。

36.患者のペプチドへのアレルギー応答を決定するため
の診断薬として使用するための、前記15に記載のペプチ
ド。

37.血液成分とペプチドの結合に適した条件下で患者か
ら得た血液試料を猫のＴ細胞反応性蛋白質から誘導され
た単離ペプチドと混合し、そうして結合が起こる程度を
決定することを含む、患者の猫アレルゲンへの感応性の
試験管内検出法。

38.T細胞機能、Ｔ細胞増殖、Ｂ細胞機能、血液中に存在
する抗体へのペプチドの結合、又はそれらの組み合わせ
により結合の程度を決定する、前記37に記載の方法。

39.猫アレルゲンへの過敏性の治療薬の製造のための、
図１−５のアミノ酸配列の全体又は一部を有するヒトＴ
細胞反応性猫蛋白質から誘導したペプチドの使用。

40.ペプチドが前記18又は19に記載のペプチドである、
前記39に記載の使用。

41.患者のペプチドに対するアレルギー応答が起きたこ
とを決定するための診断薬の製造のための、前記15に記
載のペプチドの使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者グリーンステイン，ジユリア・エルアメリカ合衆国マサチユセツツ州02159 ニユートン・サンヒルレイン６ (72)発明者クオ，メイ―チヤンアメリカ合衆国マサチユセツツ州01890 ウインチエスター・コツクスロード５ (72)発明者ロジヤーズ，ブルース・エルアメリカ合衆国マサチユセツツ州02139 ケンブリツジ・ナンバー４・オツクスフオードストリート64 (72)発明者ブラウアー，アンドリユー・ダブリユーアメリカ合衆国マサチユセツツ州01970 セイレム・ゲドニーコート21 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 14/47 C12N 15/09 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪＭＥＤＬＩＮＥ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）図３、４、５もしくは７のいずれ
かに記載のアミノ酸配列を有するか、または（ｂ）該（ａ）に記載された配列の少なくとも１部を
有し、そして（ａ）に記載された配列と共通のＢ細胞エ
ピトープもしくはＴ細胞エピトープを有するか、または（ｃ）該（ａ）もしくは（ｂ）に記載されたポリペプ
チドの改変された形態にあるが、（ａ）もしくは（ｂ）
に記載されたポリペプチドと共通の少なくとも１種のＢ
細胞エピトープもしくはＴ細胞エピトープを有する第一ポリペプチドを含んでなり、かつ猫抗原に感受性の
患者における該抗原に対するアレルギー応答を低減する
のに使用できる医薬品用製剤。
【請求項２】第一ポリペプチドが請求項１の（ａ）もし
くは（ｂ）に記載されたポリペプチドである請求項１記
載の医薬品用製剤。
【請求項３】第一ポリペプチドが、図３のアミノ酸配列
におけるアミノ酸１−22、アミノ酸12−33、アミノ酸12
−24、アミノ酸14−24、アミノ酸16−24、アミノ酸23−
48、アミノ酸26−36、アミノ酸26−38、アミノ酸26−4
0、アミノ酸14−40、アミノ酸14−39、アミノ酸14−3
8、アミノ酸14−37、アミノ酸14−36、アミノ酸15−4
0、アミノ酸15−36、アミノ酸34−59、アミノ酸49−6
8、アミノ酸60−82およびアミノ酸74−92、ならびに図
４のアミノ酸配列におけるアミノ酸60−82からなる群よ
り選ばれるポリペプチドである請求項１記載の医薬品用
製剤。
【請求項４】複数の該第一ポリペプチドの混合物を含ん
でなる請求項１〜３のいずれかに記載の医薬品用製剤。
【請求項５】第一ポリペプチドと異なる第二ポリペプチ
ドをさらに含んでなり、該第二ポリペプチドが、（ａ）′ 図１、２もしくは６に記載のアミノ酸配列を
有するか、または（ｂ）′ 該（ａ）′に記載された配列の少なくとも１
部を有し、そして（ａ）′に記載された配列と共通のＢ
細胞エピトープもしくはＴ細胞エピトープを有するか、
または（ｃ）′ 該（ａ）′もしくは（ｂ）′に記載されたポ
リペプチドの改変された形態にあるが、該（ａ）′もし
くは（ｂ）′に記載されたポリペプチドと共通のＢ細胞
エピトープもしくはＴ細胞エピトープを有する、ものである請求項１〜４のいずれかに記載の医薬品用製
剤。
【請求項６】第二ポリペプチドが請求項５の（ａ）′も
しくは（ｂ）′に記載されたポリペプチドである請求項
５に記載の医薬品用製剤。
【請求項７】第二ポリペプチドが、図６のアミノ酸配列
におけるアミノ酸１−17（但し、アミノ酸３がＴに変化
したもの）、アミノ酸１−17、アミノ酸４−17、アミノ
酸６−17、アミノ酸８−17、アミノ酸10−17、アミノ酸
９−25、アミノ酸18−33（但し、アミノ酸31がＰに、そ
して32がＤに変化したもの）、アミノ酸18−33、アミノ
酸18−31、アミノ酸18−30、アミノ酸18−29、アミノ酸
18−28、アミノ酸18−27、アミノ酸１−30、アミノ酸５
−33、アミノ酸６−33、アミノ酸７−33、アミノ酸18−
43、アミノ酸23−36、アミノ酸25−36、アミノ酸26−3
6、アミノ酸27−36、アミノ酸29−42、アミノ酸37−5
5、アミノ酸37−52、アミノ酸37−49、アミノ酸37−4
6、アミノ酸25−49、アミノ酸25−48、アミノ酸25−4
7、アミノ酸29−55、アミノ酸29−54、アミノ酸29−5
3、アミノ酸26−55、アミノ酸28−55、アミノ酸44−6
0、アミノ酸51−66およびアミノ酸56−70（但し、アミ
ノ酸70がＲに変化したもの）からなる群より選ばれるポ
リペプチドである請求項５または６に記載の医薬品用製
剤。
【請求項８】複数の該第二ポリペプチドの混合物または
該第一ポリペプチドと該第二ポリペプチドの混合物を含
んでなる請求項５〜７のいずれかに記載の医薬品用製
剤。
【請求項９】第一ポリペプチドと第二ポリペプチドとが
ヘテロダイマーの形態で共有結合している請求項５〜８
のいずれかに記載の医薬品用製剤。
【請求項１０】ポリペプチドが、少なくとも約4.0の刺
激指数を有するか又は少なくとも約250の陽性指数を有
し、ここで刺激指数が抗原の不存在下での個体に由来す
る増殖されたＴ細胞及び抗原提示細胞の測定値に対する
抗原にさらされた応答性個体に由来する増殖されたＴ細
胞及び抗原提示細胞の測定値の割合と定義され、そして
陽性指数が試験された応答性個体の人数に陽性応答を示
した人数の個体内のパーセンテージを乗じた値と定義さ
れるものである請求項１〜９のいずれかに記載の医薬品
用製剤。
【請求項１１】（ａ）図３、４、５もしくは７のいず
れかに記載のアミノ酸配列を有するか、または（ｂ）該（ａ）に記載された配列の少なくとも１部を
有し、そして（ａ）に記載された配列と共通のＢ細胞エ
ピトープもしくはＴ細胞エピトープを有するか、または（ｃ）該（ａ）もしくは（ｂ）に記載されたポリペプ
チドの改変された形態であるが、（ａ）もしくは（ｂ）
に記載されたポリペプチドと共通する少なくとも１種の
Ｂ細胞エピトープもしくはＴ細胞エピトープを有する、ポリペプチド。
【請求項１２】図３、４、５もしくは７のいずれかに記
載のアミノ酸配列を有する請求項11に記載のポリペプチ
ド。
【請求項１３】図３のアミノ酸配列におけるアミノ酸１
−22、アミノ酸12−33、アミノ酸12−24、アミノ酸14−
24、アミノ酸16−24、アミノ酸23−48、アミノ酸26−3
6、アミノ酸26−38、アミノ酸26−40、アミノ酸14−4
0、アミノ酸14−39、アミノ酸14−38、アミノ酸14−3
7、アミノ酸14−36、アミノ酸15−40、アミノ酸15−3
6、アミノ酸34−59、アミノ酸49−68、アミノ酸60−82
およびアミノ酸74−92、ならびに図４のアミノ酸配列に
おけるアミノ酸60−82からなる群より選ばれるポリペプ
チドである請求項11に記載のポリペプチド。
【請求項１４】ポリペプチドが、少なくとも約4.0の刺
激指数を有するか又は少なくとも約250の陽性指数を有
し、ここで刺激指数が抗原の不存在下での個体に由来す
る増殖されたＴ細胞及び抗原提示細胞の測定値に対する
抗原にさらされた応答性個体に由来する増殖されたＴ細
胞及び抗原提示細胞の測定値の割合と定義され、そして
陽性指数が試験された応答性個体の人数に陽性応答を示
した人数の個体内のパーセンテージを乗じた値と定義さ
れるものである請求項11〜13のいずれかに記載のポリペ
プチド。
【請求項１５】請求項11〜14のいずれかに記載されたポ
リペプチドを有効成分とする診断用組成物。
【請求項１６】請求項11〜14のいずれかに記載のポリペ
プチドと接触させることを含んでなる猫アレルゲンに対
する患者の感受性の生体外検出法。