DE69033949T2

DE69033949T2 - Aus hausstaub isoliertes t-zellreaktives katzenprotein, und dessen verwendungen

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Publication number: DE69033949T2
Application number: DE69033949T
Authority: DE
Inventors: Julian Bond; W. Brauer; D. Garman; L. Gefter; L. Greenstein; Irwin. J. Griffith; Mei-Chang Kuo; Boston Morgenstern Jay; L. Rogers
Original assignee: Immulogic Pharmaceutical Corp
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 1989-11-03
Filing date: 1990-11-02
Publication date: 2002-11-14
Anticipated expiration: 2010-11-03
Also published as: DK0500785T3; FI921979A0; DE69033949D1; AU6733090A; CA2073045A1; FI921979L; ATE216401T1; EP0500785A1; CA2073045C; NO921697L; NO921697D0; FI921979A7; ES2174822T3; JP3251012B2; AU650249B2; JPH05502445A; WO1991006571A1; EP0500785B1

Description

Genetisch prädisponierte Individuen, die ungefähr 10% der Bevölkerung ausmachen, werden gegenüber Antigenen aus einer Vielzahl von Umweltquellen, denen sie ausgesetzt werden, hypersensibilisiert bzw. überempfindlich (allergisch). Diese Antigene, die eine Überempfindlichkeit vom Soforttyp und/oder Spättyp in Menschen induzierten können, werden Allergene genannt. King, T. P., Adv. Immun. 23: 77-105 (1976). Die Symptome von Heuschnupfen, Asthma und Nesselsucht sind Formen einer Allergie, die durch eine Vielzahl von Allergenen verursacht werden kann, wie z. B. durch die Produkte von Gräsern, Bäumen, Unkräutern, Hautschuppen von Tieren, Insekten, Nahrungsmitteln, Arzneistoffen und Chemikalien. Die in die Allergie involvierten Antikörper gehören in erster Linie zur IgE-Klasse der Immunglobuline. IgE bindet an Mastzellen und Basophile. Nach Vereinigung eines speziellen Allergens mit IgE, das an Mastzellen gebunden ist, wird das IgE auf der Zelloberfläche vernetzt, was die physiologischen Wirkungen der IgE-Antigeninteraktion zur Folge hat. Eine Degranulierung hat, neben anderen Substanzen, eine Freisetzung von Histamin, Heparin, eines chemotaktischen Faktor für eosinophile Leukozyten und der Leukotriene, C4, D4 und E4 zur Folge, die eine lang andauernde Konstriktion der glatten Bronchialmuskelzellen verursacht. Hood, L. E. et al., Immunology, (2nd Hrsg.), Seiten 460-462. Diese freigesetzten Substanzen sind die Mediatoren, die die allergischen Symptome verursachen, die durch eine Vereinigung von IgE mit einem speziellen Allergen verursacht werden. Durch diese werden die Wirkungen eines Allergens manifestiert. Derartige Wirkungen können systemischer oder lokaler Natur sein, abhängig von dem Weg, durch das das Antigen in den Körper eingedrungen ist, und abhängig vom Ablagerungsmuster von IgE auf den Mastzellen. Lokale Manifestationen treten im Allgemeinen auf Epitheloberflächen an dem Ort auf, an dem das Allergen in den Körper eindrang. Systemische Wirkungen können eine Anaphylaxie (anaphylaktischer Schock) einschließen, der die Folge einer IgE-Basophilen Reaktion auf zirkulierendes (intravaskuläres) Antigen ist.
Es wurde geschätzt, dass ungefähr 10 Millionen Katzen-allergischer Individuen bzw. Personen in den Vereinigten Staaten leben. Ohman, J. L., und Sundin, B., Clin. Rev. Allergy 5: 37-47 (1987). Ein Allergen, das viele Menschen von besonderer Bedeutung ist, ist das Allergen der Felinen bzw. Katzen-Haut und der Speicheldrüse des Allergens I (Fel d I) der Hauskatze Felis domesticus, das auch als Allergen I, Katze I und Antigen 4 bezeichnet wird. Fel d I wurde als ein saures, nicht kovalent gebundenes Homodimer eines Molekulargewichts von ungefähr 39 000 auf Größenausschluss-HPLC und von einem Molekulargewicht von 17 000 bei nichtreduzierenden Bedingungen auf einer Gelelektrophorese beschrieben. Chapman, M. D. et al. J. Immunology, 140(3) 812-818 (1988). Chapman und Mitarbeiter beschreiben ebenfalls ein Ein- Schritt-Verfahren zur Aufreinigung von Fel d I aus einem Rohhausstaubextrakt mit einem hohen Fel d I Gehalt (50 U/ml) unter Verwendung einer monoklonalen Antikörper- Affinitätschromatographie. Sie bestimmten zusätzlich die Aminosäurezusammensetzung und die Teillaminosäuresequenz von Fel d I. Fel d I wurde ebenfalls als ein Dimer mit einem Molekulargewicht von 35 000 aus zwei nicht kovalent gebundenen Untereinheiten eines Molekulargewichts von 18 000 beschrieben, das in drei isoallergenen Formen (pI 3,5 bis 4,1) auftritt. Ohman, J. L. et al., J. Allergy Clin. Immunol. 52: 231 (1973); Ohman, J. L. et al., J. Immunol. 113: 1668 (1974); Leiterman, K., und Ohman, J. L., J. Allergy Clin. Immunol. 74: 147 (1984).
Eine Exposition gegenüber Katzenallergen kann als Folge einer Exposition gegenüber dem Tier oder als Folge einer Berührung mit Hausstaub auftreten, der Katzenallergene enthält. Diese Allergene wurden in Speichel, Hauptabschabungen, Katzenwaschungen, Serum, Speicheldrüsen, Katzenhaar, Katzenschuppen und Hausstaub untersucht.
Trotz der beträchtlichen Aufmerksamkeit, die allergische Reaktionen auf Katzenallergene und Katzenallergene selbst auf sich gezogen haben, ist die Definition oder Charakterisierung der Struktur und Bestandteile des Fel d I Antigens, von denen angenommen wurde, dass sie für die abträglichen Wirkungen auf Katzen-empfindliche Personen verantwortlich sind, weit von einer vollständigen Aufklärung entfernt ist, und geläufige Desensibilisierungstherapiebehandlungen schließen eine Behandlung mit einem komplexen, Krankheits-definierten Tierhautschuppenextrakt ein.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung gemäß einem ersten Grundgedanken eine Zusammensetzung zur Verwendung in der Medizin bereit, die ein erstes Polypeptid umfasst, das:
a) eine wie in einer der Fig. 3, 4, 5 oder 7 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist, oder
b) zumindest einen Teil einer Sequenz wie in a) oben beschrieben aufweist und ein Epitop damit gemeinsam hat, oder
c) eine modifizierte Form eines wie in a) oder b) oben beschriebenen Polypeptids ist, jedoch zumindest ein Epitop damit gemeinsam hat;
wobei die Zusammensetzung zur Reduktion einer allergischen Reaktion auf ein Katzenantigen bei einem Individuum verwendet werden kann, das gegenüber dem Antigen empfindlich ist.
Vorzugsweise umfasst eine Ausführungsform einer Zusammensetzung zur Verwendung in der Medizin gemäß der vorliegenden Erfindung ein erstes Polypeptid, wie es in Tabelle 3 dargestellt ist.
Vorzugsweise umfasst eine Ausführungsform einer Zusammensetzung zur Verwendung in der Medizin gemäß der vorliegenden Erfindung ein Gemisch der ersten Polypeptide.
Vorzugsweise umfasst eine Ausführungsform einer Zusammensetzung zur Verwendung in der Medizin gemäß der vorliegenden Erfindung ein zweites Polypeptid, das vom ersten Polypeptid verschieden ist und das:
a) eine Aminosäuresequenz wie in Fig. 1, Fig. 2 oder Fig. 6 dargestellt aufweist, oder
b) zumindest einen Teil einer Sequenz wie in a) oben beschrieben aufweist und ein Epitop mit diesem gemeinsam hat; oder
c) eine modifizierte Form eines wie in a) oder b) oben beschriebenen Polypeptids ist, jedoch zumindest ein Epitop damit gemeinsam hat.
Vorzugsweise umfasst eine Ausführungsform einer Zusammensetzung zur Verwendung in der Medizin gemäß der vorliegenden Erfindung ein zweites wie in a) oder b) oben beschriebenes Polypeptid.
Vorzugsweise umfasst eine Ausführungsform einer Zusammensetzung zur Verwendung in der Medizin gemäß der vorliegenden Erfindung ein zweites wie in Tabelle 2 dargestelltes Polypeptid.
Vorzugsweise umfasst eine Ausführungsform einer Zusammensetzung zur Verwendung in der Medizin gemäß der vorliegenden Erfindung ein Gemisch der zweiten Polypeptide oder ein Gemisch der ersten und zweiten Polypeptide.
Vorzugsweise umfasst eine Ausführungsform einer Zusammensetzung zur Verwendung in der Medizin gemäß der vorliegenden Erfindung erste und zweite Polypeptide, die kovalent in Form eines Heterodimers verbunden sind.
Vorzugsweise umfasst eine Ausführungsform einer Zusammensetzung zur Verwendung in der Medizin gemäß der vorliegenden Erfindung einen Stimulationsindex von zumindest ungefähr 4,0 oder einen Positivitätsindex von zumindest ungefähr 250 auf, wobei der Stimulationsindex als das Verhältnis der gemessenen Proliferation von T-Zellen Antigen-präsentierenden Zellen von einem reagierenden Individuum ist, wenn es gegenüber einem Antigen exponiert ist, gegenüber der gemessenen Proliferation dieser Zellen bei Fehlen des Antigens, und wobei der Positivitätsindex als der durchschnittliche Stimulationsindex einer Population von reagierenden Individuen, die getestet wurden, multipliziert mit dem Prozentsatz der Individuen in der Population, die eine positive Reaktion zeigen, definiert ist.
Bei einem zweiten Grundgedanken stellt die vorliegende Erfindung ein Polypeptid bereit, das:
a) eine wie in den Fig. 3, 4, 5 oder 7 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist, oder
b) zumindest einen Teil einer Sequenz wie oben in a) beschrieben aufweist und damit ein Epitop gemeinsam hat, oder
c) eine modifizierte Form eines wie in a) oder b) oben beschriebenen Polypeptids ist, jedoch zumindest ein Epitop damit gemeinsam hat.
Vorzugsweise ist eine Ausführungsform eines Polypeptids gemäß der Erfindung wie in Tabelle 3 dargestellt.
Vorzugsweise weist eine Ausführungsform eines Polypeptids gemäß der vorliegenden Erfindung einen Stimulationsindex von zumindest ungefähr 4,0 oder einen Positivitätsindex von zumindest ungefähr 250 auf, wobei der Stimulationsindex als das Verhältnis der gemessenen Proliferation von T-Zellen und Antigen-präsentierenden Zellen von einem reagierenden Individuum, wenn es einem Antigen ausgesetzt wird, zur gemessenen Proliferation der Zellen bei Fehlen eines Antigens definiert ist, und wobei der Positivitätsindex als der durchschnittliche Stimulationsindex einer Population reagierender Individuen, die getestet wurden, multipliziert mit dem Prozentsatz der Individuen in der Population, die eine positive Reaktion zeigen, definiert ist.
Vorzugsweise ist eine Ausführungsform eines Polypeptids gemäß der Erfindung zur Verwendung in der Medizin vorgesehen.
Bei einem dritten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Polypeptids oder einer Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung einer Katzenallergie bereit.
Gemäß eines vierten Grundgedankens stellt die vorliegende Erfindung ein Polypeptid oder eine Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung zur Verwendung in der Diagnose bereit.
Bei einem fünften Grundgedanken stellt die vorliegende Erfindung ein Ex-vivo- Verfahren zum Nachweis der Empfindlichkeit in einem Individuum gegenüber einem Katzenallergen bereit, das das Vereinigen einer Blutprobe, die von dem Individuum gewonnen wurde, mit einem Polypeptid oder einer Zusammensetzung gemäß der Erfindung umfasst.
Gemäß einem sechsten Grundgedanken stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit, das die Herstellung eines Polypeptids gemäß der Erfindung durch rekombinante Mittel bereitstellt.
Vorzugsweise stellt eine Ausführungsform eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung die Herstellung eines zweiten Polypeptids gemäß der Erfindung durch rekombinante Mittel bereit.
Vorzugsweise umfasst eine Ausführungsform eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung die Exprimierung des Polypeptids oder der Polypeptide in E. coli.
Vorzugsweise wird eine Ausführungsform eines Verfahrens gemäß der Erfindung zur Herstellung eines Heterodimers wie oben beschrieben verwendet.
Bei einem siebten Grundgedanken stellt die vorliegende Erfindung eine DNA bereit, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid kodiert.
Vorzugsweise ist eine Ausführungsform der DNA gemäß der Erfindung eine cDNA.
Bei einem achten Grundgedanken stellt die vorliegende Erfindung eine DNA bereit, die zur Hybridisierung an DNA gemäß des siebten Aspektes der Erfindung in der Lage ist.
Fig. 1 ist die DNA-Sequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz von TRFP, Kette 1, Leader A (unterstrichen).
Fig. 2 ist die DNA-Sequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz von TRFP, Kette 2, Leader B (unterstrichen).
Fig. 3 ist die DNA-Sequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz von TRFP, Kette 2, lange Form (476 Nukleotide).
Fig. 4 ist die DNA-Sequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz von TRFP, Kette 2, kurze Form (469 Nukleotide).
Fig. 5 ist die DNA-Sequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz von TRFP, Kette 2, verkürzte bzw. trunkierte Form (465 Nukleotide).
Fig. 6 ist die Proteinsequenz von TRFP, Kette 1, mit Leader A und Leader B (obere zwei Bahnen). Die abgeleitete Aminosäuresequenz der Leader für Kette 1 (C1) wurde durch Sequenzieren von cDNA gewonnen, und die Proteinsequenz für Kette 1 (PRO) wurde durch Proteinsequenzierungsverfahren bestimmt, wobei die Nummerierung der Aminosäure auf der ersten durch Proteinsequenzierungsverfahren bestimmten Aminosäure basiert. Das vermeintliche Start-Methionin in jeder Leadersequenz ist fett gedruckt. (-) symbolisiert eine völlige Übereinstimmung oder Identität mit dem über dem (-) aufgelisteten Aminosäurerest.
Fig. 7 ist die Proteinsequenz von TRFP, Kette 2, mit der Leadersequenz. Die abgeleitete Aminosäuresequenz des Leaders und für Kette 2 (C2) wurde durch Sequenzieren der cDNA gewonnen. Die Proteinsequenz für Kette 2 (PRO) wurde durch Proteinsequenzierungsverfahren bestimmt, wobei die Aminosäurenummerierung auf der ersten Aminosäure und auf den durch Proteinsequenzierungsverfahren nachgewiesenen Polymorphismen basierte. C2L: Kette 2 lang (92 Aminosäuren); C2S: Kette 2 kurz (90 Aminosäuren); C2ST: Kette 2 kurz trunkiert bzw. verkürzt (80 Aminosäuren). Das vermeintliche Start-Methionin in der Leadersequenz ist fett gedruckt und die potentielle N-Glycosylierungsstelle bzw. der N-Glycosylierungsort ist unterstrichen. (-) symbolisiert eine vollständige Übereinstimmung oder eine Identität mit dem über dem (-) aufgelisteten Aminosäurerest.
Fig. 8 zeigt die Ergebnisse einer SDS/PAGE Western Immunblotanalyse von unter reduzierenden Bedingungen gereinigtem TRFP, das mit Affinitäts-gereinigten Kaninchen-Anti-Peptid-Antikörpern (Anti-Fel 2, -Fel 4 und -Fel 18); monoklonalem Anti-Fel d1-Antikörper (6F9) und gepooltem Katzen-allergischem humanem Serum-IgE sondiert wurden. Die Anti-Fel 2-, -Fel 4-Antiseren sind für Kette 1 spezifisch. Das Anti- Fel 18-Antiserum ist für Kette 2 spezifisch.
Fig. 9 ist eine graphische Darstellung der sekundären T-Zellreaktion peripherer Blutlymphozyten von Patient 131, der mit verschiedenen Antigenen und Peptiden stimuliert wurde.
Wie hierin beschrieben, wurde TRFP durch Affinitätsreinigung von Staubsauberbeutel- Hausstaub, der aus mehreren Haushalten mit Katzen gesammelt wurde, isoliert und aufgereinigt. Die hierin beschriebene Arbeit hat die Isolierung und Reinigung eines TRFP-Proteins; die Bestimmung der Nukleotidsequenz, die TRFP kodiert, und die Aminosäuresequenz von TRFP (Fig. 1 bis 7); den Beweis, dass TRFP aus zwei kovalent gebundenen Peptidketten zusammengesetzt ist (die als Kette 1 und Kette 2 bezeichnet werden); die Identifizierung und Isolierung von T-Zell-reaktiven Peptiden oder Aminosäuresequenzen, die im TRFP-Protein vorliegen; und die Charakterisierung von TRFP zur Folge. Sie hatte ebenfalls das Klonieren und Exprimieren von TRFP in E. coli und die Charakterisierung der sich ergebenden rekombinanten TRFP-Proteine zur Folge. Wie in Beispiel 4 beschrieben, wurden cDNA-Klone, die die Gesamtheit oder einen Teil der TRFP-Kette 1 oder -Kette 2 kodieren, in E. coli als rekombinantes Fusionsprotein exprimiert. Bemerkenswert ist die Erkenntnis, dass die Kette 1 des zweikettigen TRFP- Proteins zwei alternative Leadersequenzen aufweist, und dass die Kette 2 zwei Hauptformen aufweist (die als lang und kurz bezeichnet werden).
Ein monoklonaler Antikörper, der mit dem Felis domesticus Allergen I, das als Fel d I bekannt ist, reaktiv ist, wurde zur Isolierung eines einzigen Proteins aus einer Zubereitung aus einem Staubsaugerbeutel verwendet. Das Affinitäts-gereinigte T-Zell- reaktiven Protein, das auf diese Weise isoliert wurde, wird als menschliches T-Zell- reaktives Felines Protein (humanes TRFP) bezeichnet. Es wurde gezeigt, dass TRFP eine biologische Aktivität bzw. Wirksamkeit aufweist (Fähigkeit, an menschliches IgE zu binden) und eine Kreuzreaktivität mit Kaninchen-Anti-Fel d I-Antiseren besitzt. Der Begriff "Allergen", wie er hierin bezüglich Peptiden oder Proteinen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, betrifft diejenigen Peptide oder Proteine, die IgE binden und/oder T-Zellen stimulieren.
Zusätzlich zur Bestimmung der Aminosäuresequenz der Ketten 1 und 2 des TRFPs wurde eine Fel d I Proteinzubereitung, die von Martin Chapman bereitgestellt wurde, untersucht, und das Protein wurde isoliert und sequenziert. Ein Vergleich der Aminosäuresequenz des Affinitäts-gereinigten TRFPs mit derjenigen der veröffentlichten Fel d I Proteinsequenz zeigte, dass ein hoher Grad an Homologie zwischen den ersten 33 Aminosäuresequenzen am Aminoterminus von Fel d I und Kette 1 von TRFP existiert.
Das Nachfolgende ist eine Beschreibung der Verfahren, durch die ein einziges Protein, das aus zwei kovalent verbundenen Ketten zusammengesetzt ist, aus Hausstaub isoliert wurde, ebenso wie eine Beschreibung von Ansätzen, die zur Identifizierung und Isolierung von DNA verwendet wurden, die das TRFP kodiert. Weiterhin wird eine Beschreibung der zur Erzeugung von rekombinanten TRFP-Ketten 1 und 2 verwendeten Verfahren präsentiert. Zusätzlich wurden humane bzw. menschliche T-Zell-Epitope aus dem TRFP-Protein identifiziert und werden hierin beschrieben.

Isolierung eines einzigen Proteins aus einer Zubereitung aus einem Staubsaugerbeutel

Eine Proteinzubereitung wurde aus dem Inhalt von Staubsaugerbeuteln durch ein Verfahren extrahiert, das auf demjenigen von M. D. Chapman und Mitarbeitern basiert. Chapman, M. D. et al., J. Immunol. 140(3): 812-818 (1988). Ein monoklonaler Antikörper, der mit Fel d I reaktiv ist, produziert von Chapman und Mitarbeitern; wurde zur Identifizierung eines Proteins in der Zubereitung verwendet. De Groot H. et al., J. Allergy Clin. Immunol. 82: 778-786 (1988). Ausgewählte monoklonale Antikörper (die als 1G9 und 6F9 bezeichnet werden), die das native Fel d I Protein erkennen, wurden zur Affinitätsreinigung eines Proteins aus einer Hausstaubprobe verwendet, das als menschliches T-Zell-reaktives Felines Protein (TRFP) bezeichnet wird (das ebenfalls als VCB oder Staubsaugerbeutel-Protein bezeichnet wird). Dies wurde unter Verwendung bekannter Techniken durchgeführt, indem der erwünschte monoklonale Antikörper produziert, dieser in großen Mengen aus Ascites isoliert und auf Sepharose 4B (Pharmacia) immobilisiert wurde. Die Proteinzubereitung wurde aus Staubsaugerbeuteln mit Hausstaub extrahiert, die aus mehreren Haushalten mit Katzen gewonnen wurden. Ein wässriger Staubsaugerbeutelextrakt wurde zunächst einer Gelfiltration und Entfärbung und anschließend einer Affinitätschromatographie-Aufreinigung unterworfen. Der wässrige Staubsaugerbeutelextrakt wurde über die den monoklonalen Antikörper enthaltende Säule geführt und eine Proteinart bzw. Proteinspezies wurde eluiert. Es wurde gezeigt, dass das auf diese Weise isolierte Protein unter Verwendung sowohl eines Western Blots als auch einer ELISA-Technik an menschliches IgE bindet, wodurch bewiesen wurde, dass TRFP eine allergene Wirksamkeit besitzt. Das Affinitäts-gereinigte TRFP wurde einer Anzahl von Protein-chemischen Verfahren unterworfen, um primäre Aminosequenzdaten zu gewinnen. Die aus TRFP abgeleiteten Sequenzen sind in den Fig. 6 und 7 dargestellt. Die in der Proteinsequenzanalyse verwendeten Verfahren sind weiter in Beispiel 1 beschrieben. Die Western-Blot-Analyse zeigte unter nichtreduzierenden Bedingungen die Existenz einer 40 kD- und einer 20 kD-Spezies, wohingegen eine 10-18 kD- und eine 5 kD-Spezies unter reduzierenden Bedingungen nachgewiesen wurde (Fig. 8).
Die 5 kD-Bande wechselwirkt mit Affinitäts-gereinigten Anti-Peptid-Antiseren, die gegen Peptide gezüchtet wurden, die aus der Kette 1-Proteinsequenz abgeleitet waren (Anti-Fel 2 und Anti-Fel 4), wohingegen die 10-18 kD-Bande mit Antipeptid-Antiserum interagiert, das gegen aus der Kette 2-Proteinsequenz abgeleitetes Peptid (Anti-Fel 18) gezüchtet wurde. Somit wird das 5 kD-Band, das 10-18 kD-Band jeweils aus der TRFP- Kette 1 und der Kette 2 abgeleitet. TRFP kann als eine aggregierte Form existieren, wie es durch das ungefähr 40 kD-Molekulargewicht der Affinitäts-gereinigten TRFP bewiesen wurde (dies kann ein Dimer des Kette 1- und Kette 2-Heterodimers sein) und der ungefähr 130 kD-Spezies, die in der Gelflitration vor der Affinitätsreinigung nachgewiesen wurde.

Identifizierung von Klonen, die DNA-Inserte enthalten, und die das menschliche T-Zell- reaktive Feline Protein (TRFP) kodieren

Protein-chemische Analysen von Affinitäts-gereinigtem TRFP führten zur Feststellung, dass TRFP aus zwei kovalent gebundenen Peptidketten zusammengesetzt ist (die als Ketten 1 und 2 bezeichnet werden; siehe Beispiel 1 für weitere Einzelheiten). Darüber hinaus führt die Peptidsequenzanalyse zur Bestimmung von beträchtlichen Primärsequenzdaten sowohl für Kette 1 (70 Aminosäuren; siehe Fig. 6) und Kette 2 (83 Aminosäuren; siehe Fig. 7). Die Aminosäuresequenzdaten wurden dazu verwendet, verschiedene Klonierungsstrategien zu entwickeln, die das Klonieren und die vollständige Nukleotidsequenzbestimmung der cDNAs und der genomischen Klone, die die TRFP- Ketten 1 und 2 kodieren, zu ermöglichen (Einzelheiten sind in den Beispielen 2 und 3 dargestellt).
Um die beste Gewebsquelle (-quellen) zur Isolierung von mRNA für das Klonieren von TRFP zu bestimmen, wurden zahlreiche Katzengewebe durch ELISA-Techniken unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern untersucht (die gegen Fel d I gerichtet waren). Es wurde festgestellt, dass mehrere Speicheldrüsen und Haut signifikante Konzentrationen an TRFP enthalten und somit eine wertvolle Quelle bereitstellen, aus der cDNA-Sequenzen kloniert werden können, die das TRFP kodieren (siehe Tabelle 1, in der - anzeigt, dass eine Analyse nicht durchgeführt wurde). Tabelle 1
Mehrere Ansätze können dazu verwendet werden, die TRFP-kodierenden cDNAs zu klonieren, einschließlich eines OligoNukleotid-Screenings aus einer λ gt10 oder λ gt11 cDNA-Bank. Alternativ können Anti-Peptid-Antiseren, die mit TRFP- Aminosäuresquenzen reaktiv sind (siehe Fig. 6 und 7), dazu verwendet werden, eine gtl 1-Bank unter Verwendung von Standardverfahren zu screenen bzw. zu durchmustern. Young, R. A. und R. W. Davis, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 80: 1194-1198 (1983). DNA kann aus reaktiven Klonen isoliert und sequenziert werden, indem das Verfahren von Sanger und Mitarbeitern verwendet wird. Sanger, F. et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA 74: 5463 (1977).
Ein weiterer Ansatz, die DNA zu klonieren, die das menschliche T-Zell-reaktive Feline Protein kodiert, besteht darin, eine Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction = PCR)-Technologie zu verwenden, um DNA aus Katzenspeicheldrüsen-mRNA oder genomischer DNA zu amplifizieren und zu klonieren. Gemischte OligoNukleotid-Primer (vorwärts- und rückwärts) wurden aus der bekannten Aminosäuresequenz abgeleitet und in einem PCR dazu verwendet, einen partialen cDNA-Klon zu erzeugen. Diese Strategie, die als gemischte OligoNukleotid-geprimte Amplifikation von cDNA (mixed oligoNukleotide primed amplification = MOPAC) bezeichnet wird, wird von Lee und Mitarbeitern beschrieben (Lee et al., Science 239: 1288-1291 (1988)). MOPAC (und davon abgeleitete Verfahren) wurden dazu verwendet, sowohl die partiale als auch die Volle-Länge-cDNAs zu isolieren, die die TRFP-Ketten 1 und 2 kodieren (ausführlich beschrieben in Beispiel 2 und in den in Fig. 1 bis 6 dargestellten Nukleotidsequenzen). Die PCR-abgeleiteten cDNA-Klone wurden als ³²P-markierte Sonden dazu verwendet, eine genomische Katzen-EMBL4-Bank zu screenen, wie in Beispiel 3 beschrieben ist.
Als eine Folge der Arbeit, die hierin beschrieben ist, wurden cDNAs und genomische Klone kloniert, die die Kette 1 und Kette 2 von TRFP kodieren, wurden isoliert und sequenziert; die kodierten Aminosäuresequenzen des Proteins wurden abgeleitet; und die von TRFP abgeleiteten Peptide wurden identifiziert und unter Verwendung bekannter Verfahren isoliert. Die vollständigen Nukleotidsequenzen, die beide TRFP-Ketten kodieren, sind in den Fig. 1 bis 5 dargestellt. Das Hybridisierungsmuster einzelner genomischer Klone verifizierte, dass die Kette 1- und Kette 2-cDNAs Produkte unterschiedlicher Gene sind. Eine Northern-Blot-Untersuchung der Katzenspeicheldrüsen-RNA zeigte weiterhin das Vorhandensein zweier getrennter mRNAs. Eine Sequenzierung der genomischen Klone bestätigte die Hybridisierungsergebnisse. Wie in Beispiel 2 beschrieben, wurde gezeigt, dass einzelne durch PCR erzeugte Volle-Länge-Kette 1-Klone zwei unterschiedliche Sequenzen an ihren 5'-Enden aufweisen, was nahelegt, dass die Kette 1 zwei alternative Leadersequenzen aufweist. Dies wurde durch die DNA-Sequenzanalyse des genomischen Kette 1-Klons bestätigt, die deutlich bewies, dass das einzige Kette 1-Gen beide alternativen Leadersequenzen am 5'-Ende des strukturellen Genes in enger Verbindung aufweist (siehe die Fig. 1, 2 und 6).
Wie in Beispiel 4 beschrieben, wurden cDNA-Klone, die die gesamte TRFP-Kette 1 oder -Kette 2 oder einen Teil hiervon kodierten, in E. coli Expressionsvektoren subkloniert, und die exprimierten rekombinanten TRFP-Proteine wurden untersucht. Eine Western- Blot-Analyse unter Verwendung von Kaninchen-Antipeptid-Antisera, die entweder gegen Kette 1-Sequenzen oder Kette 2-Sequenzen gerichtet waren, zeigten deutlich die geeignete Bindungsspezifität.

Verwendungen des erfindungsgemäßen menschlichen T-Zell-reaktiven Felinen Proteins (TRFP) und der DNA, die dieses kodiert

Die sich aus der hierin beschriebenen Arbeit ergebenden Materialien, ebenso wie die Zusammensetzungen, die diese Materialien enthalten, können in Verfahren zur Diagnose, Behandlung oder Vorbeugung einer Katzenallergie verwendet werden. Zusätzlich kann die cDNA (oder die mRNA, aus der sie revers transkribiert wurde) dazu verwendet werden, ähnliche Sequenzen in anderen Spezies zu identifizieren (beispielsweise Schaf, Ziege, Hund, Kaninchen, Pferd) und um somit Sequenzen zu identifizieren oder "herauszuziehen", die eine ausreichende Homologie zur Hybridisierung an die TRFPcDNA aufweisen. Derartige Sequenzen von anderen Species könnten Proteine kodieren, die bei der Behandlung von Allergien gegen diese Tiere beim Menschen von Nutzen sein könnten. Dies kann beispielsweise unter Bedingungen einer niedrigen Stringenz durchgeführt werden, und diese Sequenzen, die eine ausreichende Homologie aufweisen (im Allgemeinen größer als 40%) können für eine weitere Untersuchung ausgewählt werden, die die hierin beschriebenen Verfahren verwendet. Alternativ können hoch stringente Bedingungen verwendet werden. Auf diese Weise kann die DNA der vorliegenden Erfindung dazu verwendet werden, bei anderen Säugetier-Typen (beispielsweise Hund, Kaninchen, Schaf, Ziege, Pferd) Sequenzen zu identifizieren, die Peptide kodieren, die Aminosäuresequenzen aufweisen, die derjenigen des TRFP ähnlich sind. Dies kann durch Hybridisierungs- oder PCR-Klonierungsverfahren durchgeführt werden. Somit schließt die vorliegende Erfindung nicht nur das TRFP oder ein Peptid ein, das durch die vorliegenden DNA-Sequenzen kodiert ist, sondern auch andere TRFP- artige Proteine oder allergene Peptide, die durch DNA kodiert werden, die an DNA der vorliegenden Erfindung hybridisiert.
Das durch die cDNA der vorliegenden Erfindung kodierte Peptid kann beispielsweise als "gereinigtes" TRFP, in einer Zusammensetzung zur Behandlung von Katzen-allergischen Patienten, wie in einem Verfahren zur Diagnose einer Katzenallergie oder bei der Standardisierung von Allergenextrakten verwendet werden, die Schlüsselreagenzien für die Diagnose und Behandlung der Katzenallergie darstellen. Durch Verwendung des Proteins der vorliegenden Erfindung können Allergenzubereitungen mit einer konsistenten, wohl definierten Zusammensetzung und biologischen Aktivität hergestellt und für therapeutische Zwecke verabreicht werden (beispielsweise, um die allergene Reaktion eines Katzen-empfindlichen Individuums auf Katzenallergien zu modifizieren). Ein derartiges Protein oder Peptid (oder eine modifizierte Version hiervon, wie unten beschrieben wird) kann beispielsweise die B-Zell-Reaktion auf ein Katzenallergen, die T- Zell-Reaktion auf ein Katzenallergen oder beide Reaktionen modifizieren. Gereinigtes TRFP oder Peptid hiervon kann ebenfalls dazu verwendet werden, die Mechanismen der Immuntherapie der Katzenallergie zu untersuchen und modifizierte Derivate oder Analoge zu konzipieren, die in der Immuntherapie brauchbarer sind als das nichtmodifizierte ("natürlich vorkommende") Protein oder Peptid.
Arbeiten von anderen haben gezeigt, dass hohe Dosen an Allergenen während der Immuntherapiebehandlung im Allgemeinen die besten Ergebnisse produzieren (d. h. das beste Symptomrelief). Jedoch sind viele Menschen nicht dazu in der Lage, große Dosen an Allergenen zu tolerieren, weil diese Allergene nachteilige Reaktionen aufweisen.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Erzeugung therapeutischer Behandlungen von Katzen-allergischen Personen, die eine ähnliche oder verbesserte Leistungsfähigkeit gegenüber derjenigen von geläufigen Allergenimmuntherapien besitzen werden, ohne jedoch die nachteiligen Reaktionen aufzuweisen, die normalerweise mit dieser Form an Therapie verbunden sind. Eine verbesserte Therapie könnte aus der Verwendung eines modifizierten, natürlich vorkommenden TRFP oder Peptidexpressionsproduktes des TRFP-Gens abgeleitet werden, das hierin definiert wurde, oder von geeigneten Modifikationen (Mutationen) hiervon oder von Peptiden, die aus der Struktur von TRFP oder Modifikationen hiervon abgeleitet wurden.
Beispielsweise kann das natürlich vorkommende TRFP oder Peptid unter Verwendung des Polyethylenglycolverfahrens von A. Sehon und Mitarbeitern oder auf den Wegen, die die IgE-Reaktivität des natürlichen Allergens reduzieren und dadurch sein Nebenwirkungspotential verringern, modifiziert werden.
Alternativ können die TRFP-cDNAs, die hierin definiert sind oder Anteile hiervon in geeigneten Systemen exprimiert werden, um ein Protein (Proteine) mit einer starken therapeutischen Wirksamkeit zu erzeugen, jedoch mit einer stark reduzierten Fähigkeit, an IgE zu binden und dadurch abträgliche Reaktionen zu erzeugen. Um dies zu erleichtern, ist es möglich, dem Kette 1- und/oder -2-Polypeptidgrundgerüst eine Reportergruppe (-gruppen) als ein Hilfsmittel für eine effiziente Reinigung zuzusetzen. Eine derartige Reportergruppe ist Polyhistidin, die effektiv dazu verwendet wurde, rekombinante Proteine auf einer immobilisierten Metallionenaffinitätschromatographie zu reinigen (Hochuli, E. et al., Bio/Technology 6: 1321-1325 (1988)). Spezielle Spaltstellen können zwischen der Reportergruppe und den Sequenzen der Kette 1- und Kette 2- Polypeptide eingeführt werden und eine Spaltung an diesen Stellen kann die Isolierung der TRFP-Ketten oder Fragmente, die frei von irrelevanten Sequenzen sind, erleichtern. Ein weiteres Beispiel der Modifikation der TRFP-Ketten 1 und 2 ist die Substitution von Cysteinresten durch einen anderen Aminosäurerest, wie beispielsweise Serin (oder irgendeinen anderen Rest), um Disulfidkomplexe zu verringern.
Eine ortsgerichtete Mutagenese der TRFP-cDNAs kann ebenfalls dazu verwendet werden, die Strukturen der Kette 1 und Kette 2 zu modifizieren. Derartige Verfahren können PCR einschließen (Ho et al., Gene 77: 51-59 (1989)) oder eine Gesamtsynthese mutierter Gene (Hostomsky, Z. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 161: 1056-1063 (1989)), weil die beiden Gene jeweils aus kodierenden Sequenzen < 400 bp zusammengesetzt sind. Um die bakterielle Expression zu steigern, können die vorher erwähnten Verfahren in Verbindung mit anderen Verfahren zur Veränderung der Säugetier-Codone in den Konstrukten zu solchen verwendet werden, die vorzugsweise in E. coli verwendet werden.
Weitere Modifikationen der TRFP-Gene können die Konstruktion von Gen-Chimären einschließen, wobei die Ketten 1 und 2 oder Teile hiervon zur Bildung einer einzigen angrenzenden Kette verbunden werden können. Beispielsweise kann die gesamte Kette 1 oder ein Teil hiervon mit der gesamten Kette 2-cDNA oder einem Teil hiervon verbunden werden, und die sich ergebende Chimäre kann als rekombinantes Hybrid hergestellt werden (Horton et al., Gene 77: 61-68 (1989)). Es ist ebenfalls möglich, multiple verbundene Gene zur Förderung der Stabilität des exprimierten Produktes oder zur Vergrößerung von dessen therapeutischen Potential zu konstruieren (Shen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 4627-4631 (1984)).
Die hierin beschriebene Arbeit hatte weiterhin die Identifizierung bestimmter Gegenden des TRFP-Proteins zur Folge, die Peptidepitopsequenzen enthalten, die T-Zellen aus Katzen-allergischen Individuen kraftvoll stimulieren. Es wird angenommen, dass diese T- Zell-Epitope innig in den Start und die Fortführung der Immunreaktionen auf Katzenallergene involviert sind, die für die klinischen Symptome der Katzenallergie verantwortlich sind. Es wird angenommen, dass derartige Epitope aus dem natürlichen Katzenallergen (-allergenen) Frühereignisse in der allergischen Kaskade auf der Ebene der T-Helferzellen auslösen, indem sie an ein geeignetes HLA-Molekül auf der Oberfläche einer Antigen-präsentierenden Zelle binden und die relevante T-Zell- Subpopulation stimulieren. Diese Ereignisse führen zu einer T-Zell-Proliferation, Lymphokinsekretion, zu lokalen entzündlichen Reaktionen und zur Rekrutierung zusätzlicher Immunzellen an die Stelle und eine Aktivierung der B-Zell-Kaskade, die zur Produktion von Antikörpern führt. Ein Isotyp dieser Antikörper, IgE, ist fundamental wichtig für die Entwicklung allergischer Symptome, und dessen Produktion wird in der Kaskade der Ereignisse auf der Ebene der T-Helferzellen früh beeinflusst, und zwar durch die Art der sezemierten Lymphokine. Exogen verabreichte T-Zell-Epitoppeptide können somit die Entwicklung oder Fortdauer der allergischen Reaktion auf Katzenallergene beeinflussen und einen therapeutischen Vorteil bei Katzen-allergischen Individuuen produzieren. Somit kann eine Exposition Katzen-allergischer Patienten gegenüber T-Zell- Epitoppeptiden, die wie hierin beschrieben identifiziert wurden, geeignete T-Zell- Subpopulationen tolerant oder energielos machen, sodass sie nicht mehr länger auf ein Katzenallergen (Katzenallergene) reagieren, und nehmen an der Zunahme der Immunreaktion auf eine derartige Exposition nicht mehr teil. Alternativ kann die Verabreichung der T-Zell-Epitoppeptide das Lymphokinsekretionsprofil in einer unterschiedlichen Richtung antreiben, als dies bei der Exposition mit einem natürlichen Allergen (Allergenen) der Fall ist (beispielsweise vermindertes IL-4 und/oder erhöhtes IL-2), was eine Reduktion von lokalen entzündlichen Ereignissen und/oder vorteilhafte Veränderung im Antikörpersekretionsprofil zur Folge hat. Alternativ mag die Exposition gegenüber T-Zell-Epitoppeptiden verursachen, dass T-Zell-Subpopulationen, die normalerweise in der Reaktion auf Katzenallergene teilnehmen, von dem Ort (den Orten) einer normalen Exposition gegenüber dem Allergen (Nasenschleimhaut, Haut, Lunge) hin zu der Stelle (den Stellen) einer therapeutischen Abreichung der Peptide abgezogen werden. Diese Umverteilung von T-Zell-Subpopulationen könnte die Fähigkeit des Immunsystems eines Individuums, die übliche Immunreaktion gegenüber einem Allergen (Allergenen) an der Stelle einer normalen Exposition in Gang zu setzen, verbessern oder reduzieren, was eine Verminderung der allergischen Symptome zur Folge hat.
Peptide variierender Größen von innerhalb der Struktur des TRFPs wurden synthetisiert und durch herkömmliche Techniken gereinigt und bezüglich ihrer biologischen Wirkungen auf T-Zelllinien und Klone überprüft, die von menschlichen Katzenallergischen Individuen erzielt wurden. Die verwendeten Methodologien sind in den Beispielen 5, 6 und 7 beschrieben.
Peptide von innerhalb der Struktur von TRFP haben sich als eine proliferative Reaktion in TRFP-geprimten T-Zellkulturen stimulierend gezeigt. Tatsächlich können in bestimmten Fällen (Fig. 9) die proliferative Reaktion, die mit den Peptiden erzielt wurde, diejenige, die mit TRFP- oder Katzenhaut-Testallergen-Zubereitungen erzielbar sind, beträchtlich überschreiten.
Es ist ebenfalls offensichtlich (Tabellen 2 und 3), dass bestimmte Gegenden der TRFP- Sequenz eine schwache T-Zell-stimulatorische Wirksamkeit aufweisen (beispielsweise Fel 4-3, Fel 28-1); bestimmte andere Bereiche weisen eine kraftvolle Aktivität auf (beispielsweise Fel 8-3, Fel 14). Dieser Bereich an Aktivitäten kann aus reinen Unterschieden in der Primärsequenz abgeleitet sein oder kann sich aus physikochemischen Unterschieden ergeben, die durch Veränderungen der Primärsequenz induziert wurden. Schlüsselpeptidepitope von innerhalb der Struktur von TRFP, die mit T-Zellen von Katzen-allergischen Patienten hoch reaktiv sind, können unter Verwendung der erfindungsgemäßen Offenbarung und bekannter Techniken identifiziert werden.
Es wurde darüber hinaus bewiesen, dass eine Exposition von T-Zellen gegenüber Epitoppeptiden in vitro unter Bedingungen, die therapeutische Behandlungsvorschriften simulieren, eine anschließende Reaktion auf das Allergen (TRFP) in einem größeren Ausmaß unterdrücken kann als diejenige, die mit dem Allergen alleine erzielt wird (Beispiel 6, Tabelle 4). Diese Daten weisen auf die klare Gelegenheit hin, Epitoppeptide zu selektieren, die durch die gegenwärtige Arbeit identifiziert wurden und diese in Behandlungsparadigmen bei Katzen-allergischen Patienten anzuwenden, die so konzipiert sind, dass ihre Reaktion auf Katzenallergenexpositionen unterdrückt wird.
Es wurde zusätzlich gezeigt, dass eine Exposition von T-Zellen aus Katzen-allergischen Individuuen gegenüber unterschiedlichen Epitoppeptiden von TRFP verschiedene unterschiedliche Lyniphokinsekretionsprofile erzeugen kann (Beispiel 7, Tabelle 5). Es ist somit unter Verwendung der vorliegenden Erfindung möglich, für eine therapeutische Anwendung Epitoppeptide auszuwählen, die ein Lymphokinsekretionsprofil steuern, das mit einer therapeutisch vorteilhaften Reaktion auf die Behandlung von Katzenallergischen Patienten konsistent ist.
Die Verabreichung eines TRFP-Protein oder -Peptids der vorliegenden Erfindung, das ein im Wesentlichen reines TRFP, eine rekombinantes TRFP, ein modifiziertes TRFP, alleine oder in Kombination sein kann, an ein Individuum, das desensibilisiert werden soll, kann unter Verwendung bekannter Techniken durchgeführt werden. Ein Peptid oder eine Kombination von zwei oder mehreren unterschiedlichen Peptiden kann einem Individuum in einer Zusammensetzung verabreicht werden, die weiterhin beispielsweise einen geeigneten Puffer, einen Träger und/oder ein Adjunvans enthält. Derartige Zusammensetzungen werden im Allgemeinen durch Injektion, Inhalation, transdermale Applikation, intranasale Applikation, orale Applikation oder rektale Verabreichung verabreicht. Unter Verwendung der nunmehr verfügbaren Strukturinformation ist es möglich, ein TRFP oder ein Peptid zu konzipieren, das, wenn es einem Katzenallergischen Individuum in ausreichenden Mengen verabreicht wird, die allergischen Reaktionen des Individuums gegenüber einem Katzenallergen modifizieren wird. Dies kann beispielsweise durch Überprüfen der Strukturen des TRFPs durchgeführt werden, indem Peptide erzeugt werden, die bezüglich ihrer Fähigkeit, B-Zell- und/oder T-Zell- Reaktionen in Katzen-allergischen Individuen zu beeinflussen, überprüft werden und indem geeignete Epitope ausgewählt werden, die von diesen Zellen erkannt werden. Synthetische Aminosäuresequenzen, die diejenigen der Epitope nachahmen und die dazu in der Lage sind, allergische Reaktionen gegenüber einem Katzenallergen nach unten zu regulieren, können hergestellt werden. Das Protein, das Peptid oder die Antikörper der vorliegenden Erfindung können ebenfalls in bekannten Verfahren zum Nachweis und zur Diagnose einer Katzenallergie verwendet werden. Beispielsweise wird Blut, das von einem Individuum gewonnen wurde, das bezüglich einer Sensibilisierung gegenüber Katzenallergen untersucht werden soll, mit einem isolierten Peptid von TRFP vereinigt, und zwar unter Bedingungen, die zur Bindung der Bestandteile (beispielsweise Antikörper, T-Zellen, B-Zellen) im Blut mit dem Peptid geeignet sind. Anschließend wird das Ausmaß, in dem eine derartige Bindung eintritt, unter Verwendung direkter (beispielsweise Bestimmung der T-Zell-Aktivierung) oder indirekter Methoden bestimmt.
Es ist nunmehr ebenfalls möglich, ein Mittel oder einen Arzneistoff zu konzipieren, der zur Blockierung oder Hemmung der Fähigkeit von Katzenallergenen in der Lage ist, eine allergische Reaktion bei Katzen-allergischen Individuen zu induzieren. Derartige Mittel können beispielsweise in einer derartigen Art und Weise konzipiert werden, dass sie an relevante Anti-Katzenallergen-IgEs binden würden und somit einer IgE-Allergenbindung und anschließender Mastzelldegranulierung verhindern würden. Es ist alternativ möglich, Mittel zu konzipieren, die an zelluläre Bestandteile des Immunsystems binden, was eine Unterdrückung oder Desensibilisierung der allergischen Reaktion auf ein Katzenallergen zur Folge hat. Ein nicht-einschränkendes Beispiel hiervon ist die Verwendung von geeigneten B- und T-Zell-Epitoppeptiden oder Modifikationen hiervon, auf Grundlage der cDNA/Proteinstruktur des menschlichen T-Zell-reaktiven Felinen Proteins der vorliegenden Erfindung, um die allergische Reaktion gegenüber einem Katzenallergen zu unterdrücken. Dies kann durch Definieren der Strukturen von B- und T-Zell- Epitoppeptiden durchgeführt werden, die die B- und T-Zellfunktion in In-vitro-Studien mit Blutzellen von Katzen-empfindlichen Individuen beeinflussen. Dieses Verfahren ist ausführlich in Beispiel 5 beschrieben.
Es ist ebenfalls möglich, Epitope des TRFP zu modifizieren oder Epitope zu kombinieren, oder beides zu tun, und zwar für solche Zwecke wie eine Steigerung der therapeutischen oder präventiven Wirksamkeit, der Stabilität (Länge der Zeit, für die diese aufbewahrt werden können); und der Widerstandsfähigkeit gegenüber einem Abbau der TRFP-Peptide im Körper. Beispielsweise können die Aminosäurereste, die für die Epitopfunktion essentiell sind, unter. Verwendung bekannter Techniken bestimmt werden (beispielsweise Substitution jedes Restes und Bestimmung des Vorliegens oder des Fehlens einer T-Zellreätivität). Diejenigen Reste, von denen gezeigt wurde, dass sie essentiell sind, können modifiziert werden (beispielsweise durch eine andere Aminosäure ersetzt werden, deren Gegenwart die T-Zellreaktivität erhöht hat), wie es mit solchen getan werden kann, die filz die T-Zellreaktivität nicht erforderlich sind (beispielsweise indem sie durch eine andere Aminosäure ersetzt werden, deren Einbau die T- Zellreaktivität erhöht).
Zwei oder mehr TRFP-Epitope können ebenfalls kombiniert werden, um beispielsweise die therapeutische Wirksamkeit zu erhöhen. Beispielsweise können die Aminosäuresequenzen von zwei Epitopen, die innerhalb der ersten 30 N-terminalen Aminosäuren vorliegen, produziert und durch einen: Linker verbunden werden. Der Linker, durch den die Epitope verbunden werden, kann irgendeine nicht-epitop Aminosäuresequenz oder ein geeignetes. Verbindungs- und Bindungsmittel sein. Die auf diese Weise verbundenen Epitope können von derselben Kette des TRFP stammen oder können von unterschiedlichen TRFP-Kettenstammen (beispielsweise eines von Kette 1 und eines von Kette 2). Das sich ergebende Zwei-Epitop-Konstrukt kann bei der Behandlung von Katzen-empfindlichen Individuen verwendet werden. Alternativ kann ein Epitop (oder Epitope), die in der ersten Kette des TRFP vorliegen, und ein (oder mehrere), die in der zweiten Kette vorliegen; zur Erzeugung eines Konstrukts verbunden werden, das eine größere therapeutische Wirksamkeit als ein einzelnes Epitoppeptid aufweist. Zusätzlich können einzelne Peptide physikalisch vermischt und als ein Therpeutikum verabreicht werden.
Die in einer Ausführungsform dieser Erfindung zu verwendende DNA kann cDNA sein, wie sie hierin beschrieben ist, oder kann alternativ irgendeine OligodeoxyNukleotidsequenz sein, die die gesamte Aminosäuresequenz, die in den Fig. 1 bis 7 dargestellt ist, oder einen Teil hiervon, oder das funktionelle Äquivalent hiervon kodiert. Derartige OligodeoxyNukleotidsequenzen können chemisch oder mechanisch unter Verwendung bekannter Techniken hergestellt werden. Ein funktionelles Äquivalent einer OligoNukleotidsequenz ist eines, das zur Hybridisierung an eine komplementäre OligoNuldeotidsequenz in der Lage ist, an die die Sequenz (oder entsprechende Sequenzanteile) von den Fig. 1 bis 7 hybridisiert und/oder die ein Produkt (beispielsweise ein Polypeptid oder Peptid) kodiert, das dieselben funktionellen Eigenschaften des Produktes aufweist, das durch die Sequenz der Fig. 1 bis 7 kodiert wird (oder eines entsprechenden Sequenzanteiles). Ob ein funktionelles Äquivalent ein oder beide Kriterien erfüllen muss, hängt von dessen Anwendung ab (beispielsweise wenn es nur als eine Oligo-Sonde verwendet werden soll, muss es nur das erste Kriterium erfüllen, und wenn es zur Erzeugung eines Allergens verwendet werden soll, muss es nur das zweite Kriterium erfüllen).
Die strukturelle Information, die verfügbar ist oder die aus den Aminosäuresequenzen der Fig. 1 bis 7 (beispielsweise DNA, Protein/Peptidsequenzen) abgeleitet wird, kann ebenfalls dazu verwendet werden, T-Zell-Epitoppeptide und/oder B-Zell-Epitoppeptide zu identifizieren oder zu definieren, die bei Katzen-allergischen Reaktionen von Bedeutung sind und zur Beleuchtung von Mediatoren oder Mechanismen (beispielsweise Interleukin-2, Interleukin-4, Gammainterferon), durch die diese Reaktionen eintreten. Dieses Wissen sollte es möglich machen, therapeutische Katzenallergen-Wirkstoffe oder - Arzneistoffe auf Peptidgrundlage zu konzipieren, die zur Modulierung dieser Reaktionen verwendet werden können.
Die vorliegende Erfindung wird nunmehr durch die nachfolgenden Beispiele veranschaulicht werden, die keinesfalls als einschränkend aufgefasst werden sollen.

Beispiel 1: Isolierung und Proteinsequenzanalyse des T-Zell-reaktiven Felinen Proteins (TRFP)

Monoklonale Affinitätsreinigung eines T-Zell-reaktiven Felinen Proteins aus einem Hausstaubextrakt

Eine Hausstaubprobe, die aus mehreren Haushalten mit Katzen gesammelt wurde, wurde zur Isolierung und Reinigung von TRFP verwendet. Die monoklonalen Antikörper 1G9 oder 6F9 wurden an Sepharose 4B gekoppelt und zur Reinigung gemäß einer veröffentlichten Vorschrift verwendet. Chapman, M. D. et al., J. Immunology 140(3): 812-818 (1988). Das gereinigte TRFP wurde durch Aufladen desselben auf eine Phenyl- Sepharose-Säule (Pharmacia) mit 4 N NaCl entfärbt, dann mit 2M und 1M NaCl eluiert. Das entfärbte TRFP wurde durch Dialysieren der 2M und 1M Salzeluate gegen destilliertes Wasser wieder gewonnen und lyophiliziert. Eine Entfärbung wurde ebenfalls durch Leiten des Hausstaubextraktes durch eine Sephacryl-200-Säule (Pharmacia) vor der Affinitätsreinigung durchgeführt.

Zubereitung der TRFP-Peptide

Affinitäts-gereinigtes TRFP wurde zuerst mit Dithiothreitol reduziert und dann mit 4- Vinylpyridin alkyliert. Nach Entsalzen mit einer Sephadex-G10-Säule wurde das reduzierte und alkylierte TRFP chemisch mit Cyanbromid (CNBr) gespalten oder wurde enzymatisch mit einem der nachfolgenden Enzyme gespalten: Endoproteinase Glu-C (Boehringer Mannheim), Endoproteinase Asp-N (Boehringer Mannheim), Endoproteinase Lys-C (Boehringer Mannheim). Das Affinitäts-gereinigte TRFP wurde ebenfalls durch Typsin (Worthington) ohne Reduktion und Alkylierung digeriert bzw. verdaut. Die Digestionsprodukte wurden auf einer Aquaport-RP300-Säule (C8) mit einem Acetonitrilgradienten in 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) getrennt. Die individuellen Peaks wurden einem Proteinsequenziergerät unterworfen.

Peptid- und Proteinsequenzanalyse

Ein Applied Biosystems Model 477A Gasphasensequenziergerät mit einer On-Line Phenylthiohydantoin(PTH)aminosäureanalyse (Model 120A) wurde verwendet. Eine Modifikation des Extraktionsprogrammes, multiple Butylchloridextraktionen, wurde verwendet, um die Aminosäuregewinnung zu verbessern. O-Phthalaldehyd wurde zur Blockierung primärer Amine verwendet, wenn Prolin sich am Amino-Terminus befand. Brauer, A. W. et al., Anal. Biochemistry 137: 134-142 (1984). Eine In-situ-Alkylierung wurde durch Verwendung des nicht-Nukleophilen Reduktionsmittels Tributylphosphin mit gleichzeitiger Alkylierung durch 4-Vinylpyridin in Ethylmorpholin-Puffer durchgeführt. Andrews, P. C. und Dixon, J. E., Anal. Biochemistry 161: 524-528 (1987). Die N-terminale Proteinsequenzanalyse des intakten TRFP-Proteins enthüllte, dass eine Hauptaminosäuresequenz und mehrere kleinere Aminosäuresequenzen existieren. Die Hauptsequenz (Kette 1 in Fig. 6) entspricht den N-terminalen 33 Aminosäureresten des veröffentlichten Fel d I mit zwei signifikanten Unterschieden. Chapman, M. D. et al., J. Immunology 140(3): 812-818 (1988). Die häufigst vorhandene kleinere Sequenz (in einer Konzentration von 55% der Hauptsequenz) wurde als Kette 2 bezeichnet (Fig. 7). Die weiteren kleineren Sequenzen waren verschiedene N-terminale trunkierte Formen von Kette 2. Weil der vierte Rest von Kette 1 und der siebte Rest von Kette 2 Prolin war, wurde O-Phthalaldehyd vor dem vierten Umlauf oder dem sieben Umlauf des Edman- Abbaus aufgebracht, um jeweils Kette 2- oder Kette 1-Sequenzen zu blockieren. Die Proteinsequenzinformation der Kette 1 (68 N-terminale Aminosäurereste) und Kette 2 (58 N-terminale Aminosäurereste) wurde weiterhin durch ein zusätzliches OPA-Blockieren vor Umlauf 32 und Umlauf 37 für Kette 1 bzw. Kette 2 weiter gesteigert. Die Proteinsequenzen wurden bestätigt und durch Sequenzanalyse enzymatisch und chemisch digerierter Peptide expandiert. Eine Zeit-abhängige In-situ-CNBr-Digerierung von TRFP auf der Glasfilterplatte des Sequenziergerätes konnte zusätzliche Proteinsequenzinformation bereitstellen. Simpson, R. J. und Nice, E. C., Biochem.
International 8: 787-791 (1984). Vor der In-situ-CNBr-Digerierung wurden fünf Sequenzierumläufe durchgeführt, und darauf wurde die Proteinprobe mit Acetanhydrid behandelt, um alle Aminogruppen zu blockieren. Diese Schritte entfernten die fünf N- terminalen Reste von beiden Ketten und blockieren die Aminogruppen des nächsten Restes von beiden Ketten und jedes andere Peptid in der Probe. Nach fünf Stunden einer In-situ-CNBr-Digerierung wurde eine Hauptpeptidsequenz, CB-1 und drei kleinere Peptide, die Signalebenen von 60% (CB-2), 38% (CB-3) und 12% (CB-4) der Hauptpeptidsequenz aufwiesen, identifiziert. CB-1 startete von Rest 43 der Kette 2 und verlängerte die N-terminale Sequenz von Kette 2 auf 68 Reste. CB-2 war einer gereinigten CNBr-Peptidsequenz von Kette 2 (75-80) identisch. CB-3 entsprach der Peptidsequenz 65-68 der kurzen Form Kette 2. CB-4 entsprach der Peptidsequenz 50-66 von Kette 1. Ein tryptisches Peptid TRYP-1 (kurze Form Kette 2, 58-80) verband die 68 Reste N-Terminalpeptid mit einem Endopeptidase ASP-N erzeugten Peptid, D1-10 (Kette 2, 72-83) und verlängerte die Kette 2 auf 83 Aminosäurereste. Ein Endopeptidase Lys-C erzeugtes Peptid, K13 (Kette 1, 64-70), verlängerte Kette 1 auf 70 Aminosäurereste. Andere enzymatisch und CNBr-erzeugte Peptide bestätigten die N-terminalen Sequenzen der Kette 1 und Kette 2. Die Sequenzen eines kurzen tryptischen Peptids, TRYP-2 (lange Form Kette 2, 58-69) und ein Endopeptidase Asp-N Peptid, D-10, zeigten, dass ein Sequenzpolymorphismus in Kette 2, Reste 65-72 vorlag. In Zusammenfassung wird die Aminosäuresequenz der TRFP-Ketten 1 und 2, die durch Proteinsequenzierungsverfahren gewonnen wurden, in den Fig. 6 und 7 präsentiert.
Es existiert eine potentielle N-Glycosylierungsstelle in der cDNA-abgeleiteten Aminosäuresequenz, Asn&sub3;&sub3;-Ala&sub3;&sub4;-Thr&sub3;&sub5;. Die Proteinsequenzanalyse identifiziert das Ala&sub3;&sub4; und Thr&sub3;&sub5; von Kette 2; jedoch an der Position 33 nichts identifiziert werden. Dies legt eine posttranslationale Modifikation nahe, die bei Asn&sub3;&sub5; an Kette 2 auftritt, und die Modifikation ist gegenüber Trifluoressigsäurebehandlung während der Proteinsequenzierung stabil. Die Hypothese wurde durch Behandlung von TRFP mit N- Peptidase F (Boehringer Mannheim) bestätigt, was die Größe der Kette 2 auf 7 bis 12 kD in SDS-PAGE/Western Immunblot reduzierte. Darüber hinaus können beide Ketten durch β-Eliminierung modifiziert werden, das impliziert, dass sie eine O-gebundene Glycosylierung aufweisen. Die beiden Ketten sind aneinander durch die Sulfidbrücken kovalent gebunden (ungefähr 20 kD).

Beispiel 2: Klonierung der cDNAs, die die Ketten 1 und 2 des menschlichen T-Zell- reaktiven Felinen Proteins (TRFP) kodieren

MOPAC (und abgeleitete Verfahren) wurden dazu verwendet, sowohl partiale als auch Volle-Länge-cDNAs zu isolieren, die die TRFP-Ketten 1 und 2 kodieren. Die PCR- Verfahren, die verwendet wurden, sind unten ausführlich beschrieben.

Klonierung der TRFP-Kette 1-cDNAs

Eine Erststrang-cDNA-Synthese wurde mit 1 ug Poly A plus RNA durchgeführt, die aus einer gepoolten Probe von Katzenparotis- und Unterkieferdrüsen unter Verwendung von Oligo-dT-Primern isoliert wurde.
MOPAC PCR Amplifizierung (Lee et al., Science 239: 1288-1291 (1988)) eines inneren Abschnittes der Kette 1 wurde unter Verwendung eines Sense/Antisense-Paares degenerierter OligoNukleotid-Primer durchgeführt, die jeweils die Aminosäuren 1-6 und 50-54 der Kette 1 kodierten (siehe unten). Diese OligoNuldeotide (Primer 1 und 2) wurden mit einer Perkin Elmer/Cetus PCR-Kit zur Amplifizierung einer Teilmenge der obigen cDNA unter Verwendung der nachfolgenden Zyklen bzw. Umläufe verwendet:
Ein Zehntel der obigen PCR-Reaktion wurde auf einem 3% NuSieve Agarosegel fraktioniert. Eine DNA-Bande der vorhergesagten Größe (172 Basenpaare) wurde beobachtet. Dieses Gel wurde dann auf eine GeneScreen Plus Nylonmembran unter denaturierenden Bedingungen "Southern" geblottet und an eine ³²P endmarkierte Kette 1 spezifische OligoNukleotidsonde (Fel 1) in 6 · SSC bei 35ºC hybridisiert und in 2 · SSC bei 48ºC gewaschen. Die 173 Basenpaar-Bande hybridisierte an die Kette 1 spezifische Sonde.
Der Rest der PCR-Reaktion wurde mit Cla I und Xho I Restriktions-verdaut und über ein präparatives 3% NuSieve Agarosegel fraktioniert und die 173 Basenpaar-Bande wurde ausgeschnitten. Das Fragment wurde in Cla I/Xho I digeriertes Blueskript-Plasmid (Stratagene) digiert und einer Sanger/Dideoxy-DNA-Sequenzanalyse unter Verwendung eines Sequenase-Kits (US Biochemicals) unterworfen. Die Daten von dieser Analyse, die in Fig. 1 dargestellt sind, zeigen, dass die Sequenz des PCR-amplifizierten DNA- Fragments, wenn sie translatiert wurde, mit einem inneren Anteil der Proteinsequenz der Kette 1 von TRFP übereinstimmt.
Das 3'-Ende der Kette 1-cDNA, die TRFP kodiert, wurde gemäß dem RACE PCR Verfahren kloniert. Frohman, M. A., Dush, M. K und Martin, G. R., Science 85: 8998-9002 (1988).
Eine Erststrang-cDNA-Synthese wurde mit 1 ug Poly A plus RNA durchgeführt, die aus einer gepoolten Probe von Katzenparotis- und Unterkiefer-Drüsen unter Verwendung des EDT-Primers mit Superskript reverser Transkriptase isoliert wurden.
Eine RACE PCR Amplifikation des Carboxy-terminalen Anteils der Kette 1 wurde unter Verwendung von Primer 3 und dem ED-Primer als dem 5'- bzw. 3'-spezifischen Primern durchgeführt. Die Primer wurden mit einem Perkin Elmer/Cetus PCR-Kit verwendet, um eine Teilmenge der obigen cDNA unter Verwendung des nachfolgenden Zyklus zu amplifizieren:
Ein Zehntel der obigen PCR-Reaktion wurde auf einem 2%igen Agarosegel fraktioniert. Nach "Southern" Blotting des Gels auf eine GeneScreen Plus Nylonmembran und Hybridisierung an eine Kette 1-spezifische OligoNukleotidsonde (Fel 1), wie oben, wurden keine Banden, die Kandidaten für cDNAs sein könnten, die den 3'-Anteil der TRFP-Kette 1 kodieren, nachgewiesen.
Eine zweite PCR-Reaktion mit einem zu demjenigen für die erste Amplifikation identischen Cycling wurde mit einer 1/100-Teilmenge der ursprünglichen PCR- Reaktionsprodukte als Matrize und den Primern 4 (der die 3' von denjenigen in Primer 3 kodierten Aminosäuren kodiert) und mit dem ED-OligoNukleotid als Primer durchgeführt. Diese "nested" PCR-Reaktion diente dazu, speziell Produkte aus der primären PCR-Reaktion zu reamplifizieren, die aus der TRFP-Kette 1-cDNA gewonnen wurde.
Ein Zehntel dieser zweiten PCR-Reaktion wurde auf 2% Agarosegel fraktioniert. Nach "Southern" Blotting des Gels auf eine GeneScreen Plus Nylonmembran und Hybridisierung an eine Kette 1-spezifische OligoNukleotidsonde, wie oben, wurde eine DNA-Bande einer Länge von ungefähr 350 Basenpaaren nachgewiesen.
Der Rest der zweiten PCR-Reaktion wurde mit Cla I und Xba I Restriktions-digeriert und über ein präparatives 1%iges SeaPlaque Agarosegel fraktioniert und die 30 Basenpaar- Bande wurde ausgeschnitten. Das Fragment wurde in ein Cla I/Xba I digeriertes BlueSkript Plasmid (Stratagene) ligiert und einer Sanger/Dideoxy-DNA-Sequenzanalyse unter Verwendung eines Sequenase-Kits (US Biochemicals) unterworfen. Die Daten aus dieser Analyse, die in Fig. 1 dargestellt sind, zeigen, dass die Sequenz des PCR- amplifizierten 350 Basenpaar-DNA-Fragments, wenn es translatiert wurde, mit der Proteinsequenz am Carboxy-Terminus von Kette 1 von TRFP übereinstimmt. Die DNA- Sequenzanalyse zeigt ebenfalls ein Stopp-Codon, das dem Cystein-Codon an Position 72 benachbart ist, was darauf hinweist, dass die Proteinsequenzanalyse von Kette 1 von TRFP in ihrer Gesamtheit durchgeführt wurde. Zusätzlich enthält die 3'-untranslatierte DNA-Sequenz des 350 Basenpaar-Fragmentes ein prototypisches Polyadenylierungssignal, das für das 3'-Ende einer cDNA charakteristisch ist.

Klonierung der TRFP-Kette 2-cDNAs

Eine Erststrang-cDNA wurde mit einem kommerziellen Kit unter Verwendung von Oligo(dT)Priming von mRNA synthetisiert, die aus einem Pool der Parotis/Unterkieferdrüsen von vier Katzen hergestellt wurde. Eine innere Sequenz der Kette 2 wurde unter Verwendung von MOPAC bestimmt.
Zwei redundante Oligomere wurden auf Grundlage der Proteinsequenz der menschlichen T-Zell-reaktiven Felinen Proteinkette 2 synthetisiert:
was einer kodierenden Strangsequenz entspricht, die die Aminosäuren 2-8 (KMAETCP) kodiert und
was einer nicht-kodierenden Strangsequenz entspricht, die zu den Aminosäuren 42-48 komplementär ist (MKKIQDCY). Oligomer 56 wies eine EcoRI-Restriktionsstelle hinzugefügt auf (unterstrichen), und das Oligomer 57 wies eine Pst I-Restriktionsstelle auf, die für Klonierungszwecke hinzugefligt wurde (unterstrichen). Inosin (I) wurde einmal in jedem Oligomer verwendet, um die Redundanz der Endoligomere zu reduzieren, wie bei Knoth et al., 1988 (Nucl. Acids Res. 16: 10932) beschrieben.
Eine PCR wurde unter Verwendung von 100 umol jedes Primers plus Erststrang-cDNA unter Verwendung der nachfolgenden Bedingungen für die Amplifikation durchgeführt: Denaturieren bei 94ºC für 1 Min.; Primer Annealing bei 45ºC für 1,5 Min.; Verlängern bei 72ºC für 2 Min.; Wiederholung des Zyklus viermal.
Denaturieren wie oben; Annealing bei 55ºC für 1,5 Min.; Verlängern wie oben; Wiederholen des zweiten Zyklus 19-mal (insgesamt 25 Zyklen).
Es wurden zwei cDNA-Klone, die eine Kette 2-Sequenz enthielten, identifiziert. Beide Klone wiesen identische Sequenz auf. Der Prototyp-Klon ist F2.m.
Das COOH-Ende der Kette 2-cDNA, die TRFP kodiert, wurde gemäß dem RACE PCR Verfahren kloniert. Eine Erststrang-cDNA wurde aus mRNA wie oben beschrieben synthetisiert.
Die in der Amplifikation von Kette 2 verwendeten Oligomere waren:
was einer kodierenden Strangsequenz entspricht, die die Aminosäuren 19-23 (VANGN) von Kette 2 kodiert und Cla I und Eco RI Restriktionsstellen für Klonierungszwecke enthielt.
Was den Aminosäuren 23-28 (LLLDLS) von Kette 2 und den ED/EDT-Primern, oben beschrieben, entspricht.
Zwei PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung von "nested" Primern durchgeführt. Die primäre PCR-Reaktion verwendete 100 umol von Oligomer 59 und 100 umol der ED- und EDT-Primer in einem 3 : 1-Verhältnis. Die Amplifikationsbedingungen waren dieselben wie diejenigen, die bei der Gewinnung der inneren Kette 2-Sequenz verwendet wurden. Ein 0,01-Volumen der Primer-PCR wurden unter Verwendung von 100 umol Oligo Nr. 61 (ein "nested" Primer) und 100 umol des ED-Primers unter Verwendung der Standardbedingungen erneut amplifiziert.
Das amplifizierte Fragment wurde kloniert und sequenziert, um das COOH-Ende von Kette 2 zu ergeben. Es existieren zwei Prototyp-Klone: F15.a und F15.d. F15.a stimmte mit einer Proteinsequenz der dominanten Proteinsequenz für Kette 2 überein, wohingegen F15.d zu einer zweiten Proteinsequenz passte. F15.a wurde die "lange" Sequenz genannt und F15.d wurde als die "kurze" Sequenz bezeichnet. Es existieren sieben geclusterte Aminosäureunterschiede zwischen F15.a und F15.d, die 5 Aminosäuredeletionen in F15.d bezüglich F15.a einschließen (siehe Fig. 6 und 7).
Die Kette wurde aus der mRNA aus zwei Katzenhäuten isoliert, ebenso wie aus der mRNA von gepoolten Speicheldrüsen. Die Hauptproben wurden separat entnommen. Haut A (eine der fünf Katzen, die zur Herstellung des Speicheldrüsen-Pools verwendet wurden) wies mRNA auf, die nur die kurze Form von Kette 2 kodierte. Haut B (von einer sechsten Katze, die nicht Teil der fünf war und die zur Herstellung des Speicheldrüsen- Pools verwendet wurde) enthielt mRNA für sowohl die kurzen als auch langen Formen von Kette 2 in einem 3 : 1 (S : L = K : L)-Verhältnis. Eine dritte Form von Kette 2 wurde in der Haut gefunden. Sie wird "ST" für kurze trunkierte (Short Truncated) Form genannt (Fig. 5). ST weist 16 benachbarte Aminosäureunterschiede bezüglich der kurzen Form auf und hat die letzten 10 Aminosäuren der kurzen Sequenz deletiert. Beispiele dieses Klons wurden in mRNA sowohl von Haut A als auch Haut B gefunden. Kette zwei lang ist die dominante Form von Kette 2 in den Speicheldrüsen (23/24 Klone). Kette zwei kurz ist die dominante Form von Kette 2 in der Haut (20/25 Klone von zwei Katzen), wohingegen die lange Form (0/13 Klone in Haut A und 3/12 Klone in Haut B) und die ST-Form (2/2 5 Klone von zwei Katzen) unbedeutendere Formen zu sein scheinen. Eine Zusammenfassung der vollständigen Nukleotidsequenz der TRFP-Ketten 1 und 2, die durch die obigen Verfahren gewonnen wurden, wird in Fig. 1 bis 5 dargestellt.
Ein Polymorphismus in der langen Form von Kette 2 wurde in der Haut-mRNA von einer Katze nachgewiesen. Dieser Polymorphismus schloss die Substitution eines Leucins für ein Isoleucin an Aminosäure 55 und eines Threonins für ein Methinin in Position 74 ein.

Klonierung der NH&sub2;-Termini von TRFP-Kette 1 und -Kette 2

Erst- und Zweistrang-cDNA wurde mit einem kommerziellen Kit unter Verwendung von Oligo-dT-Priming von mRNA synthetisiert, die aus einem Pool der Parotis/Unterkieferdrüsen von fünf Katzen hergestellt wurden. Die doppelsträngige cDNA wurde mit stumpfen Enden abgeschnitten und dann mit stumpfen Enden an die annealten Oligomere Nr. 68 und 69 (siehe unten) ligiert. Diese Oligomere, beschrieben in Rafnar et al., J. Biol. Chem., im Druck, wurden konzipiert, um die "Verankerte PCR" zu verwenden, wie sie von Frohman et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8998-9002 beschrieben wurde und wie sie von Roux und Dhanarajan modifiziert wurde. (1990, BioTech. 8: 48-57). Diese OligoNukleotide sind nicht vollständig homolog und werden sich somit nicht selbst primen. Die Oligomere werden mit stumpfen Enden an jede cDNA angelagert.

Klonierung des NH&sub2;-Terminus von TRFP-Kette 2

Es wurden zwei Oligomere auf Grundlage der inneren Kette 2-Nukleotidsequenz synthetisiert:
die einer nicht-kodierenden Strang-Sequenz entspricht, die zu derjenigen komplementär ist, die die Aminosäuren 35-40 (TEPERT) kodiert, und
die der nicht-kodierenden Strang-Sequenz der 3'-UT-Region entspricht. Beide Oligomere passten zur Antisense-Strang-Sequenz und enthielten Pst I und Xho I Restriktionsstellen (unterstrichen, Oligomer 60) oder Pst I (unterstrichen, Oligomer 70) für Klonierungszwecke.
Zwei PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung von "nested" Primern durchgeführt. Die Amplifikationsbedingungen waren dieselben wie diejenigen, die für MOPAC verwendet wurden. Die 1º-Amplifikationsreaktion wurde mit Oligomeren Nr. 64 (AP) und Nr. 70 durchgeführt. 0,01 Vol. des 1º-PCR-Produktes wurde mit den Oligomeren Nr. 64 und Nr. 60 reamplifiziert (was "nested" ist, d. h. intern bzw. innen, bezüglich Oligo Nr. 70). Das amplifizierte Material wurde gewonnen, kloniert und sequenziert.

Klonieren des NH&sub2;-Terminus der TRFP-Kette 1

Es wurde ein Oligomer auf Grundlage einer inneren Kette 1-Sequenz synthetisiert:
das der nicht-kodierenden Strang-Sequenz entsprach, die derjenigen komplementär ist, die die Aminosäuren 38-43 (ARILKN) der Kette 1 kodiert. Die Restriktionsstellen Pst I und Xho I wurden für Klonierungszwecke hinzugefügt.
Zwei PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung von "nested" Primern durchgeführt. Die Amplifikationsbedingungen waren dieselben wie diejenigen, die für MOPAC verwendet wurden. 1º-PCR wurde mit Primer 2 (oben beschrieben) und Nr. 64 (AP) durchgeführt. 0,01 Vol. des 1º-PCR-Produktes wurde mit den Oligomeren Nr. 64 und Nr. 66 reamplifiziert (was "nested" ist, d. h. innen bezüglich Primer 2). Das amplifizierte Material wurde aus dem 2º-PCR gewonnen, kloniert und sequenziert. Zwei unterschiedliche 5'-Sequenzen wurden gewonnen und als Leader A und B bezeichnet (Fig. 1 und 2).
Kette 1 mit Leader A ist eine dominante Sequenz sowohl in Speicheldrüse als auch Haut- mRNA. Es war nicht möglich, die Kette 1 mit Leader-B-Sequenz in der mRNA zur Bereitung aus Haut A nachzuweisen. Die Kette 1 mit der Leader-B-Sequenz war eine unbedeutendere Komponente der mRNA sowohl in der gepoolten Speicheldrüse als auch in Haut-B-Zubereitungen.

Beispiel 3: Screening einer Katzengenom-DNA-Bank zur Identifizierung von Klonen, die DNA enthalten, die das TRFP kodiert

Eine EMBL4 Katzengenombank wurde unter Verwendung von Katzenleber-DNA als Ausgangsmaterial unter Verwendung der empfohlenen Verfahren konstruiert, die in Frischauf, A.-M. et al., J. Mol. Biol. 170: 827-742 (1983) beschrieben wurden. Die EMBL4 Katzengenombank wurde unter Verwendung von ³²P-radiomarkierten Keifen 1- und Ketten2-cDNA als Sonden gescreent. Die Bank wurde ausplattiert und gescreent, wodurch individuelle genomische Klone gewonnen wurden, die entweder an Kette 1- oder Kette 2-cDNA-Sonden hybridisierten, jedoch nicht mit beiden. Dieses Hybridisierungsmuster verifizierte, dass die Kette 1- und Kette 2-cDNAs Produkte aus verschiedenen Genen sind. Eine Northern-Blot-Analyse der Katzenspeicheldrüsen-RNA, die mit ³²P-radiomarkierter TRFP-Kette 1 oder 2 cDNA sondiert wurde, zeigte ebenfalls das Vorhandensein der zwei getrennten mRNAs. Die DNA-Sequenz der genomischen Klone (die als CTGch1 und CTGch2 bezeichnet wurden) wurde bestimmt und bestätigte die Hybridisierungsergebnisse.
Es wurde gezeigt, dass individuelle PCR erzeugte Kette-1-Volle-Länge-Klone (Beispiel 2) zwei unterschiedliche Sequenzen an deren 5'-Ende (siehe Fig. 1 und 2) aufweisen. Eine Interpretation besteht darin, dass Kette 1 zwei alternative Leadersequenzen aufweist. Die DNA-Sequenz des genomischen Kette 1-Klons (CTGch1) bestätigte diese Interpretation und zeigte, dass das einzige Kette 1-Gen beide alternativen Sequenzen eng verbunden am 5'-Ende des Strukturgens besitzt.
Die DNA-Sequenz des genomischen Kette 2-Klons (CTGch2) zeigte das Vorhandensein von unterschiedlichen Gensegmenten im Katzengenom, die die lange und kurze Form von Kette 2 kodieren (siehe Fig. 3 und 4). Die Isolierung von zwei Genen, die die TRFP-Kette 2 kodieren, ist mit der gewebsspezifischen Expression der beiden unterschiedlichen mRNA-Formen in Katzenhaut und Speicheldrüse konsistent (Fig. 3, 4 und 7; siehe Beispiel 2).
Es sei angemerkt, dass ein Vergleich der genomischen Sequenzen mit derjenigen der isolierten cDNAs zeigte, dass das TRFP eine Sequenzmikroheterogenität aufwies.

Beispiel 4: Expression von rekombinanten TRFP-Ketten 1 und 2

cDNA-Klone, die die gesamte TRFP-Kette 1 oder -Kette 2 oder Teile hiervon kodieren, wurden in E.-coli-Expressionsvektoren subkloniert, insbesondere in pSEM-1, -2 und -3 (Knapp, S. Broker, M. und E. Amann. BioTechniques 8: 280-281 (1990)). Diese Vektoren tragen eine trunkierte Form des E. coli lac Z Gens (lacZ'), das die N-terminalen 375 Aminosäuren der Betagalactosidase (Beta-gal) kodiert. cDNA-Klone, die die Kette 1 und Kette 2 von TRFP kodieren, wurden unter Verwendung von PCR-Verfahren derartig verändert, dass das 5'-Ende eine In-frame-Polyhistidin-Sequenz, gefolgt von einer asp-pro säureempfindlichen Bindung besaß. Kulturen, die die Kette 1- oder -2- Expressionskonstrukte enthielten, erzeugen beträchtliche Mengen von rekombinanten Fusionsproteinprodukten nach IPTG-Induktion. Die Gegenwart der Polyhistidin- Reportergruppe ermöglichte es den Rekombinanten, unter Verwendung einer immobilisierten Metallionenaffinitätschromatographie hoch gereinigt zu werden (Hochuli, E. et al., BioTechnology 6: 1321-1325 (1988)). Eine milde Säurespaltung der asp-pro-Stelle führt zur Freisetzung des intakten Volle-Länge-TRFP-Kette 1- oder -Kette 2-Proteins. Standardproteinreinigungsverfahren führen zu beträchtlichen Mengen an rekombinantem Protein, das frei von irrelevanten Sequenzen ist. Eine Proteinsequenzanalyse des gereinigten Peptids hat die Authentizität der Sequenz verifiziert. Kaninchen-Anti-Peptid-Antiseren, die gegen entweder die Kette 1-Sequenz (Fel 1, EITPAVKRDVDLFLTGT; Fel 2, DVDLFLTGTPDEYVEQV; Fel 4, NARILKNCVDAKMTEEDKE); oder Kette 2-Sequenzen gerichtet waren (Fel 18, LLLDLSLTKVNATEPERTAMKKIQDC), wurden erzeugt. Die Antipeptid-Antiseren reagieren mit den rekombinanten Proteinen (oben beschrieben) auf Western Blots.
Die rekombinanten Kette 1- und Kette 2-Peptide und Fragmente und Modifikationen hiervon können als desensibilisierende Therapeutika verwendet werden.

Beispiel 5: T-Zell-Studien mit gereinigtem T-Zell-reaktivem Protein

Periphere mononukleäre Blutzellen (peripheral blood mononuclear cells = PBMC) wurden aus 60 ml heparinisiertem Blut von Katzen-allergischen Patienten gereinigt. PBMC wurden anschließend wie unten beschrieben behandelt, obwohl in individuellen Fällen die Zeitspanne der Kultivierung mit IL-2 und/oder IL-4 und die spezifischen, für die Stimulation verwendeten Peptide, variierten.
10 ml PBMC von Patient 131 zu 106/ml wurden bei 37ºC 7 Tage lang in Gegenwart von 5 ug gereinigtem TRFP/ml RPMI-1640, ergänzt mit 5% gepooltem menschlichen AB- Serum, kultiviert. Lebensfähige Zellen wurden durch Ficoll-Hypaque-Zentrifugation gereinigt und für 3 Wochen zu 5 Einheiten rekombinanten menschlichen IL-2/ml und 5 Einheiten rekombinanten menschlichen IL-4/ml kultiviert. Die ruhenden T-Zellen wurden dann restimuliert (sekundär) mit 5 ug TRFP zu 2 · 10&sup5;/ml in Gegenwart von bestrahlten (3500 Rad) autologen PBMC in einer Konzentration von 5 · 10&sup5;/ml für 3 Tage, gereinigt durch Ficoll-Hypaque-Zentrifugation und gezüchtet in 5 Einheiten IL-2 und 5 Einheiten IL-4/ml für 2 Wochen. Für den Assay wurden 2 · 10&sup4; ruhende sekundäre T-Zellen restimuliert (tertiär) und zwar in Gegenwart von 5 · 10&sup4; bestrahlten (3500 Rad) autologen PBMC oder 2 · 10&sup4; transformierten B-Zellen (20 000 Rad) mit verschiedenen Konzentrationen an Allergenen oder deren Fragmenten in einem Volumen von 200 ul in einem 96-Well bzw. Vertiefungs Rundbodenassayplatten für drei Tage. Jede Well erhielt dann ein MicroCurie mit Tritium markiertes (Methyl) Thymidin für 16 Stunden. Die eingebauten Zähler wurden in Glasfaserfiltern gesammelt und für eine Flüssigkeitsszintillationszählung verarbeitet.
Verwendete Antigene: T-Zell-reaktives Felines Protein (TRFP), Hollister-Stier Katzenepithel-Hauttestreagenz (CST), IPC-Ragweed (Ambrosie-) Pollenextrakt (Pollen) und synthetische Peptide, die aus der TRFP-Proteinsequenz abgeleitet wurden (siehe Fig. 6 und 7). Eine signifikante T-Zell-Proliferation wird im Allgemeinen als 2,4 mal größer als die Medium-Kontrolle betrachtet (T-Zellen und Antigen-präsentierende Zellen alleine).
Alternativ wurden PBMC wie folgt behandelt: Die primären stimulierten Zellen wurden in IL-2/IL-4 für 2 Wochen kultiviert. Die ruhenden T-Zellen, die aus dieser Kultur abgeleitet wurden, wurden in einem sekundären Assay mit einigen, jedoch nicht allen, der oben genannten Allergene getestet. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in den Tabellen 2 und 3 dargestellt. Fig. 9 demonstriert, dass T-Zellen von Patient 131 auf T- Zellepitope reagieren, die in den Fel 1, 5 und 8 Peptiden vorliegen. Dieser Typ einer Epitopanalyse ermöglichte die Definition von T-Zellepitopen, die in TRFP vorliegen. Unter Verwendung einer größeren Patientengruppe haben wir die dominanten Epitope in einer heterogenen Population durch Ableiten eines Positivitätsindexes (positivity index = PI) demonstriert. Der PI wird aus dem durchschnittlichen Stimulationsindex der reagierenden Population multipliziert mit der Prozentzahl an Individuen, die eine positive Reaktion auf das Peptid zeigen, abgeleitet. Diese Analyse ist in Tabelle 2 und 3 dargestellt.
Diese Daten zeigen, dass, während der größte Teil des TRFP-Proteins T-Zellepitope enthält, die zur Stimulierung von T-Zellen aus einigen Individuen in der Lage sind, es bedeutende Unterschiede in der Stärke der hervorgerufenen T-Zellreaktion gibt, die mit unterschiedlichen Anteilen des TRFP-Moleküls erzielt wurden. Diese Daten haben gezeigt, dass jedes Epitop in einigen Individuen arbeitet und dass jedes Individuum ein charakteristisches Reaktionsmuster aufweist. Es scheint beispielsweise, dass Fel 28 die schwächste T-Zellepitop-enthaltende Region von TRFP ist (Tabelle 3), wohingegen die dominantesten T-Zellepitope im Fel 8 Peptid enthalten sind (Tabelle 2). Tabelle 2
¹PI: Durchschnittlicher SI aller reagierenden Patienten, die getestet wurden, multipliziert mit der Prozentzahl derjenigen Patienten mit einer positiven Reaktion
²SI: Durchschnitt der CPMs (counts per minute = CPM) der T-Zell- und Antigen-präsentierenden Zell- Proliferation gegenüber dem Antigen, geteilt durch die CPM von T-Zellen und Antigen-präsentierenden Zellen alleine von reagierenden Patienten. Ein SI von ≥ 2,5 wird als positiv angesehen.
³N: Anzahl der getesteten Patienten
&sup4;: Aminosäure 3 verändert zu T
&sup5;: Aminosäure 70 ist zu R verändert
&sup6;: Aminosäuren 31 und 32 wurden zu P bzw. D geändert Tabelle 3
¹ Basiert auf der kurzen Form der Kette 2-Sequenz (C2S)

Beispiel 6: Induktion einer T-Zellanergie durch ein TRFP-T-Zellepitop-enthaltendes Peptid

Eine Exposition von Peptid-spezifischen T-Zellen gegenüber ihrem spezifischen Peptid kann eine Anergie gegenüber dem Protein induzieren, dass die T-Zellepitope enthält (Jenkins, M. K. und Schwartz, R. H., J. Exp. Med. 165: 302-319 (1987)). Es wird vorhergesehen, dass jedes starke T-Zellepitop zur Induktion einer Toleranz gegenüber dem gesamten Allergen verwendet werden kann. Dies hätte die Unfähigkeit des Individuums zur Folge, auf eine natürliche Allergenexposition zu reagieren. Das Individuum würde nicht mehr durch Stimulation von T-Helferzellen reagieren. Das Fehlen der T-Helferzellen würde eine veränderte Lymphokinreaktion und/oder das Fehlen einer IgE-Reaktion zur Folge haben und folglich eine reduzierte allergische Reaktion auf Katzenallergene zur Folge haben.
Mit TRFP sekundär geprimte T-Zellen (2,5 · 10&sup6;) von Patient 155 wurden ruhengelassen und mit (2,5 · 10&sup6;) bestrahlten autologen Epstein-Barr-Virustransformierten B-Zellen (EBV) in 1 ml vollständigem RPMI mit 10% AB-Serum in 12 · 75 mm Polypropylen Schnappdeckelröhrchen und zunehmenden Mengen an Antigen über 5 aufeinanderfolgende Tage kultiviert. Die T-Zellkulturen wurden gegenüber 5 ug/ml TRFP am Tag 0 und gegenüber 5 ug/ml, 10 ug/ml, 10 ug/ml und 20 ug/ml danach exponiert. Die Peptid-behandelten Kulturen wurden gegenüber 1 ug/ml Peptid am Tag 0 und 1 ug/ml, 1 ug/ml, 2 ug/ml und 5 ug/ml hiernach exponiert. Zusätzlich wurde am Tag 2 0,5 ml frisches Medium zugesetzt. Die Zellen wurden dann gewaschen und dann für ein Proliferationsassay mit 2 · 10&sup4; T-Zellen und 2 · 10&sup4; bestrahlten (2500 Rad) autologen EBV und verschiedenen Antigen-Dosen aufgenommen. Die T-Zellproliferation wurde als Einbau von Tritium-markiertem Thymidin am Tag 9 gemessen. Die Induktion der In- vitro-Anergie oder Toleranz ist in Tabelle 4 dargestellt. Dieses Experiment demonstriert die Fähigkeit von TRFP und Peptiden hiervon, eine Anergie oder Toleranz in Antigenspezifischen T-Zelllinien zu induzieren. Tabelle 4

Beispiel 7: Cytokinprofile von T-Zellen, die gegenüber gereinigtem TRFP oder synthetischen Peptiden, die von der TRFP-Proteinsequenz abgeleitet waren, responsiv sind.

Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) wurden aus Katzen-allergischen Patienten wie in Beispiel 5 beschrieben aufgereinigt. 5 · 10&sup6; PBMC wurden zu 2 · 10&sup6;/ml für 36 Stunden in Gegenwart von Nur-Medium, von 20 Mikrogramm gereinigtem TRFP/ml oder 50 Mikrogramm Peptid/ml kultiviert. Die Zellen wurden zweimal mit Phosphatgepufferter Salzlösung (phosphate buffered sahne = PBS, pH 7,2) gewaschen und mit 2 ml 0,4 M Guanidinisothiocyanat, 0,5% Sarkosyl, 5 mM Natriumcitrat, 0,1 M 2- Mercaptoethanol, pH 7,0 lysiert. Das Lysat wurde dann durch eine Nadel Größe 26 gezwungen, um genomische DNA zu scheren, und wurde auf ein 2 ml Kissen aus S. 7 M CsCl, 0,01 M EDTA, pH 7,5 in Diethylpyrocarbonat (DEPC)-behandeltem Wasser geschichtet. Das Lysat wurde bei 35 000 UpM in einem Beckman SW41 Rotor 18 Stunden lang bei 20ºC zentrifugiert. Das RNA-Pellet wurde in 0,4 ml TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA) pH 7,5, 0,1 % SDS resuspendiert und dann dreimal mit 0,5 ml Phenol/0,2 ml Chloroform resuspendiert. Die RNA wurde dann auf Trockeneis mit 2,5 Volumina eiskaltem Ethanol, 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat, pH 5,2 in DEPC-behandeltem Wasser ausgefällt, einmal mit 70% Ethanol in DEPC-behandeltem Wasser gespült und getrocknet. Das RNA-Pellet wurde in 2 ul TE, pH 7,5 in DEPC-behandeltem Wasser resuspendiert.
Die Gesamtzell-RNA wurde zu cDNA unter Verwendung des Superskript-Kits (BRL, Bethesda, MD) umgewandelt. 2 Mikroliter RNA wurden 1 Mikroliter Oligo (DT)12-18 (500 Mikrogramm/ml) und 9 Mikrolitern Wasser zugesetzt. Die Probe wurde für 10 Minuten auf 70ºC erhitzt und auf Eis abgelöscht. 4 Mikroliter 5X-Puffer wurden der Probe zusammen mit 2 Mikrolitern 0,1 M DTT und 1 Mikroliter dNTP-Gemisch (10 mM jeweils, dATP, dCTP, dGTP und dTTP) zugesetzt. 1 Mikroliter reverse Transkriptase (200 U) wurden zugesetzt und die Umsetzung für 1 Stunde bei 42ºC durchgeführt. Die Reaktion bzw. Umsetzung wurde durch Inkubation der Probe beim 90ºC für 5 Minuten beendet und bei -80ºC aufbewahrt.
Zehnfache Reihenverdünnungen von T-Zell-cDNA in 10 mM TRIS, pH 7,5, wurden unter Verwendung des Standardkits und der von Perkin Elmer-Cetus empfohlenen Vorschrift (Redwood City, CA) amplifiziert. Jede Probe empfing 26,65 Mikroliter Wasser, S Mikroliter 10X PCR-Puffer, 8 Mikroliter dNTP-Gemisch (1,25 mM von jeweils dATP, dCTP, dGTP und dTTP), 0,1 Mikroliter Alpha ³²P-dCTP (3000 Ci/mmol), 0,25 Mikroliter AmpliTaq, S Mikroliter cDNA und 5 Mikroliter Cytokin-spezifische 5'- und 3'-Primer (20 micromolar). Die für die meisten Cytokine verwendeten Primer und die Betaactin-Kontrolle wurden von Clontech (Redwood City, CA) bezogen. Die menschlichen IL-4-Primer wurden von Research Genetics (Huntsville, AL) bezogen und hatten die nachfolgenden Sequenzen:
Die Reaktionen wurden nach Überlagern jeder Probe mit einem Tropfen Mineralöl mit dem nachfolgenden Programm in einem programmierbaren Thermalcycler (MJ Research, Cambridge, MA)durchgeführt.
Die PCR-Produkte wurden einmal mit 25 Mikroliter Chloroform extrahiert und 25 Mikroliter jeder Probe wurden dann auf einem 8%igen Polyacrylamidgel bei 250 V elektrophoretisiert. Das Gel wurde getrocknet und gegenüber einem vor-geflashten Röntgenfilm exponiert. Mehrere Expositionen jedes Gels wurden dann unter Verwendung eines Shimadzu Flying Spot Laserdensitometers gescannt. Die Werte auf dem linearen Anteil der Titrationen wurden dann mit den Mediumkontrollwerten verglichen, um einen Stimulationsindex für jede Probe zu erhalten. Die Primer für Beta-Actin wurden als Kontrolle für allgemeine cDNA-Konzentrationen in jeder Probe eingeschlossen. Wo die Mediumkontrollwerte nicht nachweisbar waren, wurde die niedrigst messbare Reaktion bei 1,00 eingestellt. In anderen Experimenten können die Konzentrationen der CytokincDNA direkt mit vorher amplifizierten Cytokin-spezifischen cDNAs als Standards verglichen werden. Somit können absolute Konzentrationen spezieller Cytokin-cDNAs von einer Probe mit einer anderen und von einem Experiment mit einem anderen verglichen werden. Die Ergebnisse eines repräsentativen Experimentes sind in Tabelle 5 dargestellt. Bei diesem Experiment wurden die IL-2, IL-4 und IFN- Gammakonzentrationen gemessen. Wie dargestellt erzeugen bei diesen speziellen Katzen-allergischen Patienten Peptide, wie beispielsweise Fel 18, mehr IL-4 als bestimmte TRFP-abgeleitete Peptide (Fel 14 und Fel 17). Diese Analyse wird auf Untersuchungen weiterer Cytokine ausgedehnt werden, die in der Erzeugung allergischer Reaktionen involviert sind, wie beispielsweise IL-5, IL-8, IL-9, TGF-Beta. cDNA-Proben von jeder Behandlung können ebenfalls für eine spätere Analyse aufbewahrt werden, wenn einmal zusätzliche Cytokine identifiziert und sequenziert sind. Peptide, die ein Spektrum an Cytokinen erzeugen, die die Erzeugung allergischer Reaktionen begünstigen, können für die therapeutische Verwendung bei der Behandlung der Katzenallergie vermieden werden. In ähnlicher Weise können TRFP-abgeleitete Peptide, von denen gezeigt wird, dass sie Cytokine erzeugen, die die allergische Reaktion unterdrücken, wie beispielsweise IFN-Gamma und IL-10, für die Behandlung der Katzenallergie ausgewählt werden. Tabelle 5

Claims

1. Zusammensetzung zur Verwendung in der Medizin, die ein erstes Polypeptid umfaßt, das

a) eine wie in einer der Fig. 3, 4, 5 oder 7 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist, oder

b) zumindest einen Teil einer Sequenz wie in a) oben beschrieben aufweist und ein Epitop damit gemeinsam hat, oder

c) eine modifizierte Form eines wie in a) oder b) oben beschriebenen Polypeptids ist, jedoch zumindest ein Epitop damit gemeinsam hat;

wobei die Zusammensetzung zur Reduktion einer allergischen Reaktion auf ein Katzen-Antigen bei einem Individuum verwendet werden kann, das gegenüber dem Antigen empfindlich ist.

2. Zusammensetzung zur Verwendung in der Medizin nach Anspruch 1, wobei das erste Polypeptid ein wie in a) oder

b) von Anspruch 1 beschriebenes Polypeptid ist.

3. Zusammensetzung zur Verwendung in der Medizin nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das erste Polypeptid ein wie in Tabelle 3 dargestelltes Polypeptid ist.

4. Zusammensetzung zur Verwendung in der Medizin nach einem der Ansprüche 1 bis 3, die ein Gemisch der ersten Polypeptide umfasst.

5. Zusammensetzung zur Verwendung in der Medizin nach irgend einem vorhergehenden Anspruch, die weiterhin ein zweites Polypeptid umfaßt, das von dem ersten Polypeptid verschieden ist und das:

a) eine Aminosäuresequenz wie in der Fig. 1, Fig. 2 oder Fig. 6 dargestellt aufweist, oder

b) zumindest einen Teil einer Sequenz wie in a) oben beschrieben aufweist und ein Epitop mit dieser gemeinsam hat; oder

c) eine modifizierte Form eines wie in a) oder b) oben beschriebenen Polypeptids ist, jedoch zumindest ein Epitop damit gemeinsam hat.

6. Zusammensetzung zur Verwendung in der Medizin nach Anspruch 5, wobei das zweite Polypeptid ein wie in a) oder b) von Anspruch 4 beschriebenes Polypeptid ist.

7. Zusammensetzung zur Verwendung in der Medizin nach Anspruch 5 oder Anspruch 6, wobei das zweite Polypeptid ein wie in Tabelle 2 dargestelltes Peptid ist.

8. Zusammensetzung zur Verwendung in der Medizin nach einem der Ansprüche 5 bis 7, die ein Gemisch der zweiten Polypeptide oder ein Gemisch der ersten und zweiten Polypeptide umfasst.

9. Zusammensetzung zur Verwendung in der Medizin nach einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei das erste und zweite Polypeptid in Form eines Heterodimers kovalent gebunden ist.

10. Zusammensetzung zur Verwendung in der Medizin nach irgend einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Zusammensetzung einen Stimulationsindex von zumindest ungefähr 4,0 oder einen Positivitätsindex von zumindest ungefähr 250 aufweist, wobei der Stimulationsindex als das Verhältnis der gemessenen Proliferation von T-Zellen und Antigen-präsentierenden Zellen von einem reagierenden Individuum, wenn es gegenüber dem Antigen ausgesetzt ist, gegenüber der gemessenen Proliferation der Zellen bei Fehlen des Antigens definiert ist, und wobei der Positivitätsindex als der durchschnittliche Stimulationsindex einer Population von reagierenden Individuen, die getestet wurden, multipliziert mit dem Prozentsatz der Individuen in der Population, die eine positive Reaktion zeigen, definiert ist.

11. Polypeptid, das:

a) eine wie in einer der Fig. 3, 4, 5 oder 7 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist oder

b) zumindest einen Teil einer Sequenz wie oben in a) beschrieben aufweist und damit ein Epitop gemeinsam hat, oder

12. Polypeptid nach Anspruch 11, das eine wie in irgend einer der Fig. 3, 4, 5 oder 7 dargestellte Aminosäuresequenz aufweist, oder zumindest einen Teil der Sequenz aufweist.

13. Polypeptid nach Anspruch 11 oder 12, das ein wie in Tabelle 3 dargestelltes Peptid ist.

14. Polypeptid nach einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei das Polypeptid einen Stimulationsindex von zumindest ungefähr 4,0 oder einen Positivitätsindex von zumindest ungefähr 250 aufweist, wobei der Simulationsindex als das Verhältnis der gemessenen Proliferation von T-Zellen und Antigen präsentierenden Zellen von einem reagierenden Individuum, wenn es einem Antigen ausgesetzt wird, zur gemessenen Proliferation der Zellen bei Fehlen eines Antigens definiert ist und wobei der Positivitätsindex als der durchschnittliche Stimulationsindex einer Population reagierender Individuen, die getestet wurden, multipliziert mit dem Prozentsatz der Individuen in der Population, die eine positive Reaktion zeigen, definiert ist.

15. Polypeptid nach einem der Ansprüche 11 bis 13 zur Verwendung in der Medizin.

16. Verwendung eines Polypeptids wie in einem der Ansprüche 1 bis 14 beschrieben oder einer Zusammensetzung wie in einem der Ansprüche 1 bis 10 beschrieben bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung einer Katzenallergie.

17. Polypeptid wie in einem der Ansprüche 1 bis 14 beschrieben oder eine Zusammensetzung wie in einem der Ansprüche 1 bis 10 beschrieben, zur Verwendung in der Diagnose.

18. Ex vivo Verfahren zum Nachweisen der Sensitivität in einem Individuum gegenüber einem Katzen-Allergen, umfassend das Vereinigen einer Blutprobe, die von dem Individuum gewonnen wurde, mit einem wie in einem der Ansprüche 1 bis 14 beschriebenen Polypeptid oder mit einer Zusammensetzung, wie in einem der Ansprüche 1 bis 10 beschrieben.

19. Verfahren, das das Herstellen eines Polypeptids wie in einem der Ansprüche 11 bis 13 beschrieben durch rekombinante Mittel umfaßt.

20. Verfahren nach Anspruch 19, das weiter die Herstellung eines zweiten wie in einem der Ansprüche 5 bis 7 beschriebenen Polypeptids durch rekombinante Mittel umfaßt.

21. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, das das Exprimieren des Polypeptids oder der Polypeptide in E. coli umfasst.

22. Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, das zur Erzeugung eines Heterodimers, wie in Anspruch 9 beschrieben, verwendet wird.

23. DNA, die ein Polypeptid wie in einem der Ansprüche 11 bis 14 beschrieben kodiert.

24. DNA nach Anspruch 23 in Form von cDNA.

25. DNA, die zum Hybridisieren an DNA nach Anspruch 23 oder 24 in der Lage ist.