ES2427855T3

ES2427855T3 - Composiciones formación de dímeros reducida

Info

Publication number: ES2427855T3
Application number: ES09760560T
Authority: ES
Inventors: Roderick Peter Hafner; Paul Laidler
Original assignee: Circassia Ltd
Current assignee: Circassia Ltd
Priority date: 2008-11-28
Filing date: 2009-11-27
Publication date: 2013-11-04
Anticipated expiration: 2029-11-27
Also published as: GB201114575D0; GB2479515B; CN102227214A; JP5612592B2; EP2373293B1; KR20110092329A; NZ593145A; CN102227214B; SG171438A1; EP2649990A1; CA2744587C; IL213088A0; HK1161139A1; GB2479515A; EP2373293B8; EP2373293B2; WO2010061193A2; JP2015057383A; PL2373293T3; US20160367660A1

Abstract

Uso de trehalosa y tioglicerol en una composición desecada por congelación que comprende los péptidos de lasSEC ID Nº 1 a 4 para prevenir o reducir la dimerización de dichos péptidos en dicha composición

Description

Composiciones formación de dímeros reducida

5 Campo de la invención

La presente invención se refiere al uso de un carbohidrato o derivado de carbohidrato no reductor y al menos un agente que inhibe la formación de dímero en una composición desecada por congelación que comprende al menos un péptido que contiene un residuo de cisteína libre, para proporcionar una composición desecada por congelación

10 con mejor estabilidad durante el almacenamiento prolongado.

Antecedentes de la invención

En la técnica se conocen varios procedimientos que se usan para conservar material perecedero o para hacer que el

15 material sea más cómodo de transportar. Para materiales farmacéuticos, biotecnológicos o alimentarios, un procedimiento típico es la desecación por congelación (también conocida como liofilización o criodesecación). Este es un procedimiento de deshidratación que funcional congelando el material y reduciendo después la presión que le rodea y añadiendo únicamente suficiente calor para permitir que el agua congelada en el material sublime directamente desde la fase sólida a gas. El producto desecado por congelación resultante se puede reconstituir

20 después en solución para su futuro uso.

La ventaja de un producto desecado por congelación es que generalmente es más estable durante el almacenamiento y el transporte y tiene una semivida más prolongada que el material equivalente en solución. No obstante, existen algunos problemas con la desecación por congelación en cuanto a que durante los procedimientos 25 de congelación y desecación se pueden producir daños en el material a conservar. Estos problemas se abordan, en cierta medida, mediante la adición de crioprotectores y lioprotectores al material que se va a desecar por congelación. No obstante, lo que está bien reconocido es que algunos materiales perecederos, especialmente péptidos que contienen al menos un residuo de cisteína libre, son objeto de degradación y daños incluso después de finalizado el procedimiento de desecación por congelación. Es decir, aunque la desecación por congelación tiene un

30 efecto conservante, los productos desecados por congelación que comprenden péptidos que comprenden al menos un residuo de cisteína libre suelen tener una semivida más corta de lo deseado. Existe una clara necesidad de medios para mejorar la estabilidad de las composiciones desecadas por congelación que comprenden dichos péptidos.

35 Un ejemplo de una forma previa de almacenamiento para un polipéptido específico se encuentra en el documento WO/1999/032135, que trata de formas líquidas y liofilizadas del factor de crecimiento de queratinocitos 2 (KGF-2) y derivados del mismo.

El documento EP1958645 se refiere a péptidos derivados del alérgeno del polen de ambrosía Amb a 1. El

40 documento WO/1999/034826 se refiere a un procedimiento para desensibilizar a un paciente frente a un alérgeno polipeptídico que comprende administrar al paciente un péptido derivado del alérgeno.

Sumario de la invención

45 La invención se refiere al uso de trehalosa y tioglicerol en una composición desecada por congelación que comprende los péptidos de las SEC ID Nº 1 a 4 para prevenir o reducir la dimerización de dichos péptidos en dicha composición.

La invención se refiere además a un procedimiento de producir una composición desecada por congelación estable 50 que comprende los péptidos de las SEC ID Nº 1 a 4, comprendiendo dicho procedimiento:

a) preparar una composición que comprende en solución (i) trehalosa, (ii) tioglicerol y (iii) dichos péptidos; y

b) desecar por congelación la composición resultante de la etapa (a).

55 En una realización, la composición desecada por congelación resultante es estable durante al menos 2 años cuando se almacena a una temperatura de 2 – 8 ºC.

La invención también proporciona un procedimiento de reconstituir una composición desecada por congelación estable producida de acuerdo con el procedimiento de la invención, donde dicho procedimiento comprende

60 reconstituir dicha composición desecada por congelación en solución.

La invención se refiere además a una composición desecada por congelación estable que comprende los péptidos de las SEC ID Nº 1 a 4 %, tioglicerol y trehalosa.

Descripción de las figuras

Las Figuras 1 a 83 muestran la estabilidad de los péptidos almacenados en diferentes condiciones como se ha indicado cuando están comprendidos en diferentes composiciones desecadas por congelación como se describe en

5 los ejemplos (T= trehalosa, S= sacarosa, M= manitol, TG= tioglicerol, G= glicina, Met= metionina). El tiempo (semanas) se muestra en el eje X. La cantidad de péptido no degradado presente en una solución reconstituida a partir de una composición dada se muestra en el eje Y. La cantidad se muestra como un porcentaje relativo a la cantidad de un patrón del péptido MLA07 que no se ha desecado por congelación.

Cada figura muestra siete conjuntos de resultados diferentes que corresponden a cada uno de los siguientes péptidos diferentes: MLA05 (línea oscura, puntos circulares pequeños); MLA12 (línea oscura, puntos cuadrados), MLA03 (línea gris claro, puntos triangulares); MLA14 (línea gris claro, puntos en forma de x); MLA01 (línea oscura, puntos en forma de x), MLA04 (línea oscura, puntos circulares grandes); MLA07 (línea oscura, puntos en forma de línea vertical). Se generaron datos tras la desecación por congelación de una mezcla de los siete péptidos en cada

15 composición.

La Figura 84 muestra la estabilidad a 30 °C/HR del 65 % durante 12 meses de una mezcla de los siete péptidos: MLA05; MLA12, MLA03; MLA14; MLA01; MLA04 y MLA07, comprendidos en las composiciones específicas descritas en el ejemplo 4, que es tioglicerol "bajo" (rombos) y tioglicerol "alto" (cuadrados).

Descripción de las secuencias

Las SEQ ID Nº: 1 a 4 representan las secuencias de péptidos que se usan para incluir en las composiciones de la invención. Las SEQ ID Nº: 84 a 86 representan las secuencias de péptidos adicionales que se pueden incluir en las

25 composiciones de la invención.

Descripción detallada de la invención

Desecación por congelación

La desecación por congelación es una operación compleja donde el disolvente (normalmente agua) se extrae de un producto mediante sublimación. Como se sabe bien, la sublimación se produce cuando un líquido congelado pasa directamente a la fase gaseosa sin pasar por la fase de líquido. La sublimación es una función de la presión y la temperatura cuyo equilibrio es crucial para el éxito de la desecación por congelación.

35 El procedimiento de desecación por congelación consiste en tres etapas: congelación, desecación primaria y desecación secundaria. Durante la etapa de congelación, la solución se convierte en un sólido. El procedimiento de congelación debe controlarse cuidadosamente, ya que la velocidad de congelación afecta al tamaño de los cristales de hielo formados en el producto que pueden afectar a la estabilidad y también pueden afectar a la velocidad de desecación durante las fases de desecación primaria y secundaria.

Es muy importante realizar la etapa de congelación por debajo de una temperatura crítica. Esta temperatura es la temperatura eutéctica (Teut) para materiales cristalinos o la temperatura de transición vítrea (Tv’) del soluto concentrado máximamente congelado para productos amorfos.

45 Durante la desecación primaria, el hielo se extrae del producto congelado mediante sublimación, que da como resultado un producto desecado estructuralmente intacto. Esto requiere un control cuidadoso de la temperatura de conservación y la presión de la cámara en el dispositivo de desecación. La velocidad de sublimación del hielo desde un producto congelado depende de varios factores que el experto en la técnica apreciará. Es importante que durante la desecación primaria la temperatura del producto en la interfaz de sublimación (Tp) no supere la “temperatura crítica” de la formulación, es decir no debe conseguir suficiente fluidez para fluir y, por tanto, destruir la estructura de la torta. Esta también se conoce como la temperatura de colapso (Tc) y normalmente es varios grados más alta que la Tv’.

55 Como se ha mencionado, la temperatura crítica es Teut para los materiales principalmente cristalinos y la Tv’ o la Tc para los amorfos. Los materiales cristalinos son fáciles de desecar por congelación, ya que la Teut suele ser alta (p. ej., la Teut del agente espesante muy popular manitol es de -3 ºC). Además, la “torta" desecada por congelación resultante normalmente tiene un aspecto atractivo cuando deriva de materiales cristalinos. No obstante, a menudo, los materiales cristalinos no son muy adecuados para estabilizar péptidos durante los procedimientos de congelación y desecación. En el presente documento, generalmente se usan azúcares amorfos, polioles y otros excipientes. El inconveniente es que la Tv’ de estas sustancias es, generalmente, mucho menor que las temperaturas eutécticas (p. ej., sacarosa: -32 °C).

Una vez completada la desecación primaria y sublimado todo el hielo, todavía hay humedad unida presente en el

65 producto. El producto parece desecado, pero el contenido en humedad residual puede ser tan alto como 7 -8%. Es necesaria la desecación continua a una temperatura de conservación más alta para reducir el contenido en humedad residual hasta valores óptimos (para muchas formulaciones < 1 %). Este procedimiento, o desecación secundaria, también se conoce como desorción isotérmica, ya que el agua unida sale del producto. Normalmente, la desecación secundaria procede a una temperatura del producto superior a la ambiente pero todavía inferior a la temperatura de transición vítrea (Tv) o a la temperatura de fusión de la formulación.

5 Se apreciará que el experto entiende la necesidad de considerar cuidadosamente los parámetros anteriores, teniendo en cuenta adecuadamente las diferencias en las propiedades entre diferentes composiciones y la potencial necesidad de ensayo y error para establecer las condiciones de congelación y desecación óptimas.

10 El procedimiento de desecación por congelación para estabilizar productos delicados (p. ej., proteínas, péptidos, etc.) tiene varias ventajas. Por ejemplo, a menudo los productos desecados por congelación adecuadamente no necesitan refrigeración, se pueden almacenar a temperaturas ambiente y se pueden reconstituir completamente con rapidez con agua u otro disolvente adecuado para inyección. Normalmente, cabría esperar que una composición desecada por congelación tuviera un tiempo de conservación estable de más de 2 años. En este contexto,

15 normalmente se toma que estable significa que la composición desecada por congelación se puede reconstituir sin dificultades y que la solución reconstituida es adecuada para uso farmacéutico. También se considera que estable es la ausencia de cualquier cambio en el aspecto físico o estético del producto, con la excepción de la rotura de la torta liofilizada por desecación, antes de la reconstitución. La idoneidad para uso farmacéutico depende del material biológico y el uso específico en cuestión, pero habitualmente la puede evaluar fácilmente el experto en la técnica. En

20 términos generales, cabría esperar que el material biológico en la solución reconstituida tenga actividad comparable al material equivalente en solución antes de desecar por congelación. En el caso de una solución reconstituida que comprende un péptido o proteína, la solución reconstituida habitualmente se consideraría adecuada para uso farmacéutico, en particular para inyección, si es estéril y carece de partículas visibles.

25 Con la desecación por congelación existen varias dificultades que pueden acortar el tiempo de conservación estable de un producto, en ocasiones espectacularmente, en particular para composiciones que comprenden proteínas o péptidos que tienen al menos un residuo de cisteína libre. Dichos materiales pueden sufrir cambios irreversibles, o degradación, durante el procedimiento de desecación por congelación, pero también después de este procedimiento, es decir, durante el almacenamiento del producto desecado por congelación.

30 La degradación durante el procedimiento de desecación por congelación se puede producir durante la congelación, durante la desecación o durante tanto la congelación como la desecación. Si el producto se degrada durante la congelación, habitualmente se añade un “crioprotector”. Los crioprotectores estabilizan durante la congelación, pero no necesariamente estabilizan durante la liofilización (es decir, durante tanto la congelación como la desecación).

35 Entre los crioprotectores se incluyen concentraciones elevadas de disacáridos y algunos aminoácidos (hasta 0,5M) y niveles bajos de polietilenglicol (<1 %, p/p) u otros polímeros. El término “lioprotección” hace referencia a la estabilización durante todo el procedimiento de liofilización (es decir, durante tanto la congelación como la desecación). Dicha estabilización a menudo es necesaria para la desecación por congelación de materiales biológicos, tales como proteínas y péptidos. Esto es porque las moléculas biológicas complejas como las proteínas a

40 menudo requieren un nivel moderado de agua residual para mantener la estructura y la función. De acuerdo con esto, habitualmente se puede añadir un "lioprotector". Los lioprotectores conocidos en la técnica habitualmente son compuestos de polihidroxi tales como azúcares (mono, di y polisacáridos), polialcoholes y sus derivados.

Al contrario que lo anterior, es más difícil abordar los daños y la degradación que se producen después del

45 procedimiento de desecación por congelación, es decir durante el almacenamiento o el transporte del producto desecado por congelación. Dichos daños pueden tomar la forma de, por ejemplo, desamidación, hidrolización, racemización u oxidación, todo lo cual puede dar lugar normalmente a agregación y/o desnaturalización de un proteína o péptido almacenados. La oxidación de las cadenas laterales de residuos de cisteína, que conducen a la formación de enlaces disulfuro entre las moléculas y su posterior dimerización, es un problema concreto. Dichos

50 daños se pueden producir lentamente durante un periodo de tiempo prolongado o se pueden producir rápidamente durante un cambio a corto plazo en las condiciones de almacenamiento, tal como un incremento repentino de la temperatura debido a un fallo en el sistema de control del clima o incluso una sencilla variación estacional en la temperatura ambiente.

55 La presente invención aborda los problemas de los daños y a degradación que se producen después del procedimiento de desecación por congelación, en las composiciones desecadas por congelación que comprenden al menos un péptido, específicamente un péptido que comprende al menos un residuo de cisteína libre, mediante inhibición o reducción de la dimerización de dicho al menos un péptido.

60 Composiciones desecadas por congelación de la invención

La presente invención se refiere particularmente a composiciones desecadas por congelación que comprenden al menos un péptido que comprende al menos un residuo de cisteína libre. Los péptidos que son particularmente de interés son los que son útiles para modular el sistema inmunológico, específicamente modulando las respuestas de

65 los linfocitos T.

El reconocimiento por los linfocitos T de los antígenos requiere células presentadoras de antígeno (CPA) para presentar fragmentos (péptidos) de la proteína antigénica sobre su superficie celular en asociación con moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). Los linfocitos T usan sus receptores de linfocitos T específicos de antígeno (TCR) para reconocer con una especificidad elevada los fragmentos presentados por las CPA. Dicho

5 reconocimiento actúa como desencadenante para el sistema inmunitario para generar una serie de respuestas para erradicar el antígeno que se ha reconocido.

La mayoría de la especificidad del reconocimiento por los linfocitos T de los fragmentos de antígeno se proporciona mediante una subsecuencia más pequeña de aminoácidos dentro de los fragmentos. Esta subsecuencia se conoce como el epítopo de los linfocitos T. Por tanto, los péptidos que comprenden dichos epítopos son de interés para usar como agentes terapéuticos para modular los sistemas inmunitarios de los sujetos. En el caso de los alérgenos extracelulares y los auto o aloantígenos, normalmente los péptidos se presentan sobre las moléculas de clase II del MHC, que son reconocidas por los linfocitos T CD4. De acuerdo con esto, el interés en los trastornos alérgicos y auto o aloinmunitarios se ha centrado en los epítopos de los linfocitos T que se unen a las moléculas de clase II del

15 MCH. No obstante, los epítopos de los linfocitos T que se unen a las moléculas de clase I del MHC, que son reconocidos por los linfocitos T CD8, también pueden ser de interés. Por ejemplo, cuando sea necesario modular las respuestas inmunitarias a antígenos endógenos y/o intracelulares. Esto puede ser deseable en el caso de ciertos marcadores de cáncer, péptidos que se pueden usar para inducir inmunidad tumoral o para el tratamiento de enfermedades infecciosas tales como las causadas por los virus de la hepatitis y el papiloma humano.

Se ha demostrado que la administración a sujetos de epítopos peptídicos derivados de alérgenos extracelulares y auto o aloantígenos tiene como resultado la inducción de tolerancia al antígeno del que deriva el epítopo. Los agentes terapéuticos basados en este efecto tienen un gran potencial en la prevención y el tratamiento de la alergia y enfermedades auto o aloinmunitarias donde se desee una regulación por disminución de una respuesta inmunitaria

25 específica.

Se ha demostrado que la administración a sujetos de epítopos peptídicos derivados de, por ejemplo, ciertas proteínas asociadas con cáncer o enfermedades infecciosas tiene como resultado la inducción de inmunidad específica frente al antígeno del que deriva el epítopo. Los agentes terapéuticos basados en este efecto tienen un gran potencial en la prevención y el tratamiento de enfermedades donde se desee una regulación por aumento de una respuesta inmunitaria específica.

La progresión adicional en el uso de epítopos peptídicos para producir tolerancia o inmunidad frente a un antígeno específico se ve dificultada por una serie de problemas. Uno de estos problemas es que las secuencias del epítopo,

35 en particular las secuencias del epítopo de alérgenos y auto y aloantígenos a menudo son poco solubles y, por tanto, son problemáticos de fabricar, de almacenar y de administrar a sujetos. En concreto, los péptidos que comprenden secuencias de epítopo que contienen residuos de cisteína pueden ser vulnerables a la dimerización o agregación de orden mayor, que conduce a una respuesta inmunitaria inadecuada, normalmente inflamación resultante de la unión de IgE o IgG.

De acuerdo con esto, cuando los péptidos que comprenden dichos epítopos están comprendidos dentro de una composición desecada por congelación son particularmente vulnerables a los tipos de daños y degradación que se producen durante el transporte y el almacenamiento, es decir después del procedimiento de desecación por congelación, como se ha indicado anteriormente. A su vez, esto conduce a una solución reconstituida que es

45 inadecuada para el uso farmacéutico para el que está destinada, ya que cuando se requiere tolerancia, la provocación de respuestas inmunitarias inadecuadas, como la inflamación, es altamente indeseable. De un modo similar, cuando se requiere inducción de inmunidad específica, la formación de dímeros o de agregados de orden mayor inhibirá la unión a las moléculas de clase I del MCH o la posterior unión a los linfocitos T adecuados, de modo que se previene la estimulación de las respuestas inmunitarias mediadas por linfocitos T.

Síntesis peptídica

Los péptidos usados en la invención se pueden sintetizar usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Los procedimientos preferidos incluyen técnicas de síntesis peptídica en fase sólida y, lo más preferentemente, un

55 sintetizador peptídico automático o semiautomático. Normalmente, usando dichas técnicas, un aminoácido protegido con α-N-carbamoílo y un aminoácido unido a la cadena peptídica en crecimiento sobre una resina se acopla a temperatura ambiente en un disolvente inerte tal como dimetilformamida, N-metilpirrolidona o cloruro de metileno en presencia de agentes de acoplamiento tales como diciclohexilcarbodiimida y 1-hidroxibenzotriazol y una base tal como diisopropiletilamina. El grupo protector α-N-carbamoílo se elimina de la resina peptídica resultante usando un reactivo tal como ácido trifluoroacético o piperidina y la reacción de acoplamiento se repite con el siguiente aminoácido N-protegido que se va a añadir a la cadena peptídica. Los grupos N-protectores adecuados son bien conocidos en la técnica e incluyen t-butiloxicarbonilo (t-boc) y fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc).

Péptidos

65 Los péptidos usados en la presente invención consisten en las secuencias de:

Alergia a gatos SEC ID

MLAO1 CPAVKRDVDLFLT 1

MLAO4 KALPVVLENARILKNCV 2

MLAO5 RILKNCVDAKMTEEDKE 3

MLAl2 TAMKKIQDCYVENGLI 4

Por tanto, la composición de la invención comprende los péptidos de SEC ID Nº 1 a 4. La composición puede comprender además los péptidos de SEC ID Nº 84 a 86 y, opcionalmente, sin péptidos adicionales. 5

Otros componentes

Como se apreciará a partir de la sección anterior en relación con la desecación por congelación, las composiciones que se van a desecar por congelación normalmente comprenderán componentes adicionales, así como los 10 materiales biológicos de interés. La presente invención se refiere al uso de una combinación de componentes adicionales para prevenir o reducir la dimerización de al menos un péptido en las composiciones de la invención, de modo que conducen a una composición desecada por congelación más estable. La presente invención se refiere también a procedimientos para fabricar dichas composiciones. Los presentes inventores han determinado que la combinación de (i) una trehalosa como carbohidrato no reductor y (ii) tioglicerol como agente que inhibe la formación

15 de dímero consigue este efecto.

Como se ha mencionado en el presente documento, los carbohidratos y compuestos relacionados tienen la ventaja de que son útiles como crio y lioprotectores durante el procedimiento de desecación por congelación. No obstante, no previenen la formación de dímeros mediante un péptido comprendido en el producto desecado por congelación

20 final durante su almacenamiento. Para conseguir esto se requiere un componente adicional, tioglicerol.

Con el fin de prevenir con eficacia la formación del dímero, dicho agente deberá estar presente, idealmente, en al menos una concentración molar equivalente a la del material que es susceptible a la formación de dímeros, cuando se mide antes de la congelación. Por tanto, cuando el material susceptible a la formación de dímeros es uno o más 25 péptidos que comprenden al menos un residuo de cisteína libre, el agente está presente al menos a una concentración molar equivalente a la concentración de uno o más péptidos que comprenden al menos un residuo de cisteína libre. La concentración de otros componentes, tales como péptidos que no contienen un residuo de cisteína libre, normalmente no se tiene en cuenta. Es decir, cuando una composición comprende, por ejemplo, cuatro péptidos que contienen un residuo de cisteína libre y tres péptidos que no contienen un residuo de cisteína libre, la

30 concentración del agente que inhibe la formación de dímero se determina respecto a la concentración global de los cuatro péptidos que contienen cisteína libre. La concentración de los tres péptidos que no contienen cisteína y de cualquier otro componente en la composición, no es relevante para el nivel de agente requerido.

En una realización, el agente que inhibe la formación de dímero puede estar presente en mayor o menor cantidad

35 que el material que es susceptible a la formación de dímero, cuando se mide antes de la congelación, con la condición de que la prevención del dímero se previene con eficacia. En una realización concreta, el agente está presente en una cantidad mayor que el material que es susceptible a la formación de dímero. Por ejemplo, el agente puede estar presente a una concentración molar que es, al menos aproximadamente, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 veces mayor que la concentración molar del

40 material que es susceptible a la formación de dímero. Preferentemente, el agente está presente a una concentración molar que es, al menos, entre 60 y 80 veces mayor que la concentración molar del material que es susceptible a la formación de dímero. Por ejemplo, cuando el material está presente a una concentración molar de 200 μM, el agente estará presente, preferentemente, a una concentración molar de entre 12 mM y 16 mM.

45 Dicha situación se aplica a, por ejemplo, la composición “baja” en tioglicerol del ejemplo 4, donde cuatro péptidos que contienen al menos una cisteína libre están, cada uno de ellos, presentes a 50 μM, y tres péptidos que no contienen cisteína también están presentes a 50 μM. Por tanto, en un litro de esta composición hay 350 micromoles de péptido total (siete péptidos) y 200 micromoles de péptidos con cisteína libre (4 péptidos con cisteína libre). De acuerdo con esto, el material susceptible a la formación de dímero está a 200 μM y el tioglicerol está presente a una

50 concentración de 14 mM, que es 70 veces mayor.

Como alternativa, el agente puede estar presente a una concentración molar que es, al menos, entre 30 y 40 veces mayor que la concentración molar del material que es susceptible a la formación de dímero. Por ejemplo, cuando el material está presente a una concentración molar de 400 μM, el agente estará presente, preferentemente, a una

55 concentración molar de entre 12 mM y 16 mM.

Dicha situación se aplicaría a, por ejemplo, la composición “pobre” en tioglicerol del ejemplo 4, si todos los péptidos estaban presentes a 100 μM y no a 50 μM. Es decir, en un litro de esta composición hay 700 micromoles de péptido total (siete péptidos) y 400 micromoles de péptidos con cisteína libre (4 péptidos con cisteína libre). De acuerdo con esto, el material susceptible a la formación de dímero está a 400 μM y el tioglicerol está presente a una concentración de 14 mM, que es 35 veces mayor.

El límite inferior de la cantidad de péptido presente en la composición antes de congelar como proporción será,

5 normalmente, aproximadamente 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,15, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, o 1,5 % en peso/peso o peso/volumen. Los límites superiores de la cantidad de péptido presente en la composición antes de congelar como proporción será, normalmente, aproximadamente, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 3, 4 o 5% peso/peso o peso/volumen. Se reconocerá que la cantidad de péptido puede estar, normalmente, entre cualquiera de los límites inferiores combinados independientemente con cualquiera de los límites superiores indicados anteriormente. Por tanto, el agente que inhibe la formación de dímero estará presente en un intervalo similar como proporción de la composición, siempre que la concentración total del agente sea al menos una concentración molar equivalente a la concentración total de los péptidos que comprenden al menos un residuo de cisteína libre en la composición antes de congelar. Por ejemplo, si la concentración total de péptidos que comprenden al menos un residuo de cisteína libre es 0,03 nmol/ml, la concentración total del agente

15 será de al menos 0,03 nmol/ml. Si la concentración total de péptidos que comprenden al menos un residuo de cisteína libre es 500 nmol/ml, la concentración total del agente será de al menos 500 nmol/ml.

También se apreciará que el agente puede estar incluido, típicamente, en una proporción más alta respecto al péptido como se ha explicado anteriormente, por ejemplo para asegurar que la formación de dímero se reduce con eficacia. Además, el límite superior para la concentración local del agente puede tener en cuenta, normalmente, los requisitos clínicos o limitaciones tal como se aplican a composiciones farmacéuticas. Por ejemplo, una solución reconstituida para inyección normalmente no tendrá más de 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5 o 4,0 % en peso/peso o en peso/volumen del agente. Esto corresponde a aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35 o 40 %en peso/peso o en peso/volumen, respectivamente, en el producto desecado por congelación. De acuerdo

25 con esto, la cantidad de péptido en el producto puede tener que limitarse para adaptarse a estos requisitos clínicos.

El experto entenderá que la proporción de cualquier componente en la composición antes de congelar normalmente corresponderá a una proporción de aproximadamente 5 a 10 veces mayor en la composición desecada por congelación final.

La dificultad en la inclusión de al menos un agente que inhibe la formación de dímero en una composición desecada por congelación es que, como determinan los presentes inventores, dichos agentes escapan de un producto desecado por congelación, en particular cuando dicho producto se almacena durante periodos de tiempo prolongados a temperaturas ambiente o cuando dicho producto se expone a incrementos repentinos de temperatura.

35 Normalmente los agentes son volátiles y, por tanto, no se retienen en el producto final, que o bien experimenta daños y degradación durante el almacenamiento y transporte de modo que se reduce su tiempo de conservación estable o bien es inaceptable para uso farmacéutico. Por ejemplo, debido a los cambios en el aspecto de la composición desecada por congelación o a la solución reconstituida a partir de ella.

Con el fin de superar esta dificultad, los presentes inventores han concebido combinaciones de trehalosa como carbohidrato no reductor y tioglicerol como agentes inhibidores de dímero que no dan lugar a la salida de dichos agentes de un producto desecado por congelación final. Con el fin de conseguir esto, es necesario que la composición desecada por congelación tenga una estructura amorfa. De acuerdo con esto, la trehalosa como carbohidrato no reductor es particularmente adecuada para usar en la presente invención. Tras la desecación por

45 congelación es amorfa. Con el fin de garantizar que la composición como un todo tiene una estructura amorfa tras la desecación por congelación, el carbohidrato o carbohidratos amorfos en las composiciones de la invención normalmente estarán presentes en una cantidad que es al menos un 50%, pero más preferentemente al menos un 60%, 70% u 80% y, lo más preferentemente, al menos un 90% como una proporción de los componentes totales de la composición desecada por congelación.

Como se ha demostrado la presente invención, la estructura amorfa del carbohidrato desecado por congelación atrapa al agente que inhibe la formación de dímero dentro del producto desecado por congelación final. Esto contrasta con los materiales que tienen una estructura cristalina tras la desecación por congelación. Los materiales amorfos/cristalinos o mixtos se han preferido anteriormente para aplicaciones de desecación por congelación del tipo

55 descrito en el presente documento, en parte porque la "torta" final desecada por congelación normalmente tiene un aspecto más atractivo y se pueden usar ciclos de desecación más cortos y más agresivos.

Por tanto, la presente invención se refiere al uso de (i) trehalosa como carbohidrato no reductor y (ii) tioglicerol como agente que inhibe la formación de dímero en una composición desecada por congelación que comprende los péptidos de las SEC ID Nº 1 a 4, donde el uso es para prevenir o reducir la dimerización de dichos péptidos en dicha composición. El agente que inhibe la formación de dímero se retiene en el producto desecado por congelación mediante la estructura amorfa del carbohidrato y, de este modo, es capaz de reducir o prevenir la dimerización de los péptidos en el mismo mediante el tiempo de conservación del producto. De este modo se consigue un tiempo de conservación estable que idealmente es de al menos 1 año o al menos 2 años, a 5 ± 3 °C, 25 °C/HR del 60 %, 30

65 °C/HR del 65 % o 40 °C/HR del 75 %.

Sin desear quedar anclado a ninguna hipótesis específica, los inventores consideran que esta realización es particularmente ventajosa por la buena retención del tioglicerol en la torta desecada por congelación. El tioglicerol se ha considerado anteriormente menos adecuado para incorporar en composiciones desecadas por congelación porque no se congela para formar un cristal en las condiciones de desecación por congelación típicas, es decir

5 permanece líquido a temperaturas tan bajas como de -80 ºC. No obstante, en la presente invención se demuestra que el tioglicerol se puede retener; particularmente en combinación con trehalosa, sin signos de salida o impacto negativo sobre la calidad física de la torta desecada por congelación. La presencia de tioglicerol previene con eficacia la formación de dímeros peptídicos en la composición.

Composiciones reconstituidas de la invención

Se apreciará que las composiciones desecadas por congelación fabricadas de acuerdo con la invención se pueden reconstituir en solución, normalmente en una solución acuosa adecuada para inyección, tal como agua estéril sin pirógenos. Idealmente, la solución será isotónica/isoosmolar y, de este modo, adecuada para inyección parenteral.

15 Normalmente, la composición reconstituida tiene una proporción mínima de péptido presente como dímero. Es decir, la formación de dímero se prevendrá de un modo eficaz. Por una proporción mínima de péptido presente como dímero se quiere decir que hay un máximo de 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2%, 0,1%, 0,05% o 0,01% en solución como dímero. Se entenderá que la proporción de péptido presente como dímero en solución será la proporción presente como dímero tras un periodo de tiempo adecuado en solución. Periodos de tiempo adecuados incluyen intervalos de tiempo que un experto podría esperar razonablemente que mantengan una secuencia en solución antes de usar. Por ejemplo, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 48 horas o aproximadamente 72 horas. La proporción de un péptido presente en una forma dada se puede evaluar mediante cualquier procedimiento adecuado.

25 La composición reconstituida normalmente será una formulación farmacéutica para tolerar o inmunizar a un individuo frente a una proteína de la que deriva un péptido comprendido en la composición. Como tal, la composición reconstituida puede comprender uno o más vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables y opcionalmente uno o más de otros ingredientes terapéuticos. El(los) vehículo(s) deben ser "aceptables" en el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de la formulación (en particular no deben estimular la formación de dímeros) y no dañinos para el receptor de los mismos. Normalmente, los vehículos para inyección y la formulación final son estériles o libres de pirógenos. Los componentes adicionales pueden estar presentes en la composición desecada por congelación o se pueden añadir durante o después de la reconstitución. Por tanto, pueden estar presentes sustancias coadyuvantes, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias modificadoras del pH o

35 tampón, antioxidantes, agentes quelantes y similares. Estos excipientes, vehículos y sustancias coadyuvantes son, generalmente, agentes farmacéuticos que no inducen una respuesta inmunitaria en el individuo que recibe la composición y que se pueden administrar sin una toxicidad indebida. Excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, entre otros, líquidos tales como agua, solución salina, polietilenglicol, ácido hialurónico y etanol. También se pueden incluir sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo sales de ácidos minerales tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, sulfatos y similares, y las sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y similares. Se dispone de una exhaustiva discusión de excipientes, vehículos y sustancias coadyuvantes farmacéuticamente aceptables en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co.,

N.J. 1991).

45 Las composiciones de la invención comprenderán una concentración adecuada de cada péptido que sea eficaz sin causar reacciones adversas. Normalmente, para uso en la tolerización, la concentración de cada péptido en la composición estará en el intervalo de 0,03 a 500 nmol/ml o 0,03 a 200 nmol/ml. Más preferentemente en el de 0,03 a 200 nmol/ml, de 3 a 180 nmol/ml, 10, de 10 a 150 nmol/ml o de 30 a 120 nmol/ml. Particularmente preferido es el intervalo de 3 a 12 nmol/ml. La composición tendrá una pureza de más del 90% o 95% o 98% o una pureza de al menos 99%. Volúmenes de inyección puede ser, normalmente, de 60 μl o 120 μl.

Por tanto, se puede formular una composición que comprende también una o más moléculas terapéuticas distintas. Una composición de la invención se puede usar, como alternativa, de forma simultánea, secuencial o por separado con una o más composiciones terapéuticas distintas como parte de un tratamiento combinado.

55 Normalmente, para usar in inmunización, la composición proporcionará una presentación que, una vez reconstituida, permita la administración de entre 1 μg y 10 mg de cada péptido. Más preferentemente, una cantidad de cada péptido en el intervalo de 3 μg a 5mg, de 5 μg a 5mg,de 10 μg a 2mg o de20 μg a 1mg. La concentración de cada péptido dependerá de la vía de administración, pero normalmente se puede liberar por vía intradérmica, subcutánea, intramuscular, intravenosa, oral, intranasal o mediante inhalación. La composición tendrá una pureza de más del 90% o 95% o 98% o una pureza de al menos 99%.

Procedimientos terapéuticos e individuos a tratar

65 La presente invención se refiere a composiciones que comprenden los péptidos de las SEC ID Nº 1 a 4, que pueden modular el sistema inmunitario de un individuo. “Modular” puede significar desensibilizar o tolerizar individuos frente a una proteína de la que derivan los péptidos de las composiciones de la invención. En este caso, la proteína es un alérgeno para el que no se desea una respuesta inmunitaria. Por tanto, las composiciones de la invención son útiles en la prevención o tratamiento de una enfermedad alérgica.

5 La invención proporciona composiciones para usar en la prevención o tratamiento de las enfermedades anteriores. Las enfermedades anteriores se pueden prevenir o tratar en un sujeto administrando una composición reconstituida de la invención. El individuo a tratar o proporcionado con la composición de la invención es, preferentemente, un ser humano.

10 Cuando se desea desensibilización/tolerización, se apreciará que se sabe que el individuo a tratar se puede sensibilizar al alérgeno concreto, estar en riesgo de estar sensibilizado o se sospecha que está sensibilizado. El individuo se puede analizar para determinar la sensibilización usando técnicas bien conocidas en la materia y como se describe en el presente documento. Como alternativa, el individuo puede tener antecedentes familiares de las enfermedades descritas anteriormente Puede no ser necesario analizar en un individuo la sensibilización a

15 alérgenos porque el individuo puede mostrar síntomas de alergia cuando se acerca a una fuente de alérgeno adecuada. Por cerca se quiere decir 10 metros o menos, 5 metros o menos, 2 metros o menos, 1 metro o menos o 0 metros con respecto a la fuente. Los síntomas de alergia pueden incluir picor de ojos, rinorrea, dificultades para respirar, enrojecimiento y picor de la piel o exantema. El individuo a tratar por enfermedad alérgica puede haber sufrido alergia durante al menos 2 semanas, 1 mes, 6 meses, 1 año o 5 años. El individuo puede sufrir un exantema,

20 congestión nasal, secreción nasal y/o tos caudados por la alergia. Puede o no haberse administrado al individuo otras composiciones/compuestos que tratan la alergia.

En general, el individuo a tratar puede ser de cualquier edad. No obstante, preferentemente, el individuo puede estar en el grupo de edad de 1 a 90, de 5 a 60, de 10 a 40, o, más preferentemente, de 18 a 35. Preferentemente, el

25 individuo a tratar es de una población que tiene frecuencias del alelo del MHC dentro del intervalo de frecuencias que son representativas de la población caucásica. A continuación se muestran las frecuencias del alelo de la población de referencia para 11 familias del alelo DRB 1 común:

DRB1: 1 3 4 7 8 11 12 13 14 15 16

%: 6,4 14,7 15,7 8,8 3,4 8,3 3,9 14,7 2,9 17,6 2,5

Población de referencia, %: 9,4 11,1 12,8 13,2 3,7 13,4 2,3 10,2 3,2 10,7 3,6

30 Las frecuencias de referencia se obtuvieron mediante análisis de múltiples estudios que notifican frecuencias y las cifras mostradas son los valores medios. Por tanto, preferentemente, el individuo a tratar es de una población que tiene frecuencias del alelo de MHC equivalentes a la población de referencia para los alelos a los que se hace referencia en la tabla anterior (tal como, para al menos 1, 2, 3, 4, 5 o todos los alelos), por ejemplo dentro de los intervalos de dichas cifras más menos 1, 2, 3, 5, 10, 15 o 20%.

35 Preferentemente, el individuo es de una población donde las frecuencias de alelo de los siguientes alelos de DRB1 son:

4 -de al menos 9 %.

40 7 -de al menos 10 %. 11 -de al menos 8 %.

La invención es particularmente adecuada para usar con individuos que pueden necesitar recibir varias administraciones de las composiciones de la invención como se ha descrito anteriormente. Es más probable que los 45 péptidos que son más propensos a la formación de dímero que los péptidos de la invención induzcan una respuesta adversa en un individuo que recibe varias administraciones. Dado que normalmente los péptidos monoméricos son menos inflamatorios que los péptidos diméricos, la invención también es particularmente adecuada para administrar a un individuo que sufre una enfermedad o está en riesgo de sufrirla, donde la enfermedad se caracteriza por una reacción inflamatoria adversa a un tratamiento que comprende un péptido. Una reacción inflamatoria adversa a un 50 tratamiento que comprende un péptido se puede diagnosticar como resultado del inicio de cualquiera de los síntomas de alergia como se ha definido anteriormente tras la administración de un tratamiento que comprende un péptido. Se puede considerar que un individuo está en riesgo de dicha reacción por cualquier razón médica adecuada, por ejemplo, antecedentes familiares de reacciones similares, antecedentes médicos personales de múltiples respuestas alérgicas o respuestas fuertemente positivas a la prueba de punción cutánea o de parche

55 cutáneo a alérgenos comunes.

Los ejemplos siguientes ilustran la invención.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos y ejemplos comparativos muestran el rendimiento de diferentes composiciones en diferentes condiciones de almacenamiento. Cada una de las diferentes composiciones comprende los péptidos que

5 consisten en las secuencias de SEC ID Nº: 1 a 4 (péptidos MLA01, 04, 05 y 12), y tres péptidos adicionales: MLA03 (EQVAQYKALPVVLENA (SEC ID Nº: 84)), MLA07 (KENALSLLDKIYTSPL (SEC ID Nº: 85)) y MLA14 (SRVLDGLVMTTISSSK (SEC ID Nº: 86)).

En cada caso, la composición se preparó en solución antes de someterla a desecación por congelación. Las

10 condiciones de desecación por congelación se seleccionaron según sea adecuado para cada composición y para cada uno se muestra un ciclo típico de desecación por congelación. La degradación de los péptidos durante el procedimiento de desecación por congelación se midió comparando el nivel de degradación del péptido en una muestra de solución antes y después del procedimiento. Todas las composiciones analizadas experimentaron únicamente degradación minoritaria de los péptidos durante el procedimiento de desecación por congelación (datos

15 no mostrados).

Tras la desecación por congelación, se almacenó una muestra de cada composición en varias condiciones diferentes (-80 °C, 5 °C, 25 °C / HR del 65 %, 40 °C/HR del 75%) (HR: humedad relativa) durante hasta 28 semanas. La degradación durante el almacenamiento del producto desecado por congelación final se monitorizó

20 reconstituyendo una muestra a intervalos y comparando el nivel de degradación peptídica con el de una solución patrón de reciente preparación de MLA07.

En cada composición analizada, el único componente volátil es tioglicerol. De acuerdo con esto, la retención del tioglicerol se determina observando la presencia o ausencia de condensación en las paredes de los viales de

25 almacenamiento.

Ejemplo 1-formulación de trehalosa

Ciclo de desecación por congelación típico 30

Etapa: Temp. de almacenamiento (°C) Presión de la cámara (mbar) Duración (h. min)

1: 20 1000 0

2: -40 1000 00,36

3: -40 1000 1,30

4: -24 0,05 2,00

5: -24 0,05 24,00

6: 24 0,05 9,20

7: 24 0,05 6,00

Componentes no peptídicos (los valores entre paréntesis indican concentraciones en mM) trehalosa/tioglicerol/metionina (250:46:5).

35 Características

Tv' = -31,9 °C Tv = 83 -87 °C (primera ronda) Humedad residual = nd

40 Difractograma WAXS: completamente amorfo

La retención del tioglicerol es excelente. No hay condensación visible sobre las paredes de los viales para todas las condiciones de almacenamiento. El tioglicerol se inmoviliza de forma evidente dentro de la torta amorfa.

45 El aspecto de la torta es agrietado y no agradable estéticamente, pero la estabilidad durante el almacenamiento es excelente como se muestra en las Figuras 17 a 19. No se observó degradación peptídicas significativa aparte de para las condiciones más extremas analizadas (40 °C/HR del 75%) tras aproximadamente 8 semanas.

Ejemplo 2-Serie de mezclas binarias “amorfas”

50 Ciclo de desecación por congelación típico

1: -40 1000 0

2: -40 1000 1,00

3: -15 0,03 0,30

4: -15 0,03 20,00

5: 30 0,03 0,25

6: 30 0,03 8,00

2A

Componentes no peptídicos (los valores entre paréntesis indican concentraciones en mM) 5 trehalosa/glicina/tioglicerol/metionina (165:46:5).

Características

Tv' = -36,7 °C

10 Tv = 62,5 °C Humedad residual = 0,61 % p/v Estructura de la torta: completamente amorfa

La retención del tioglicerol es excelente. No hay condensación visible sobre las paredes de los viales para todas las 15 condiciones de almacenamiento. El tioglicerol se inmoviliza de forma evidente dentro de la torta amorfa.

El aspecto de la torta es agrietado y no agradable estéticamente, pero la estabilidad durante el almacenamiento es excelente como se muestra en las Figuras 20 a 23. No se observó degradación peptídicas significativa aparte de para las condiciones más extremas analizadas (40 °C/HR del 75%), a la cual se observó una disminución continua

20 del contenido en péptido.

2B

Componentes no peptídicos 25 (los valores entre paréntesis indican concentraciones en mM) sacarosa/glicina/tioglicerol/metionina (182:78:46:5).

Características

30 Tv' = -37,8 °C Tv = 38,6 °C Humedad residual = 0,56 % p/v Difractograma WAXS: completamente amorfo

35 La retención de tioglicerol es menos buena que en ejemplo 2A, la condensación es visible en las paredes del vial almacenado a 25 ºC/HR del 65%. El tioglicerol no se inmoviliza de forma evidente completamente dentro de la torta amorfa.

El aspecto de la torta es agrietado y, por tanto, no agradable estéticamente, pero la estabilidad durante el

40 almacenamiento es buena, como se muestra en las Figuras 24 a 27. Solo se observó degradación peptídica significativa para las condiciones más extremas analizadas: 25 °C/HR del 65% (que mostró una disminución clara particularmente tras 5 semanas) y 40 °C/HR del 75% (que mostró una estabilidad peptídica muy pobre).

2C

45 Componentes no peptídicos (los valores entre paréntesis indican concentraciones en mM) trehalosa/manitol/tioglicerol/metionina (160:100:46:5).

Características

50 Tv' = -36,6 °C Tv = 51,6 °C Humedad residual = 0,42 % p/v Difractograma WAXS: completamente amorfo La retención de tioglicerol es menos buena que en ejemplo 2A, la condensación es visible en las paredes del vial almacenado a 25 ºC/HR del 65%. El tioglicerol no se inmoviliza de forma evidente completamente dentro de la torta amorfa.

5 El aspecto de la torta es agrietado y no agradable estéticamente, pero la estabilidad durante el almacenamiento es buena como se muestra en las Figuras 28 a 31. No se observó degradación peptídicas significativa aparte de para las condiciones más extremas analizadas (40 °C/HR del 75%), a la cual se observó una disminución continua del contenido en péptido. La estabilidad a 25 °C/HR del 65% fue buena, aunque no tan buena como para el Ejemplo 2A.

10 2D

Componentes no peptídicos (los valores entre paréntesis indican concentraciones en mM) sacarosa/manitol/tioglicerol/metionina (150:110:46:5).

15 Características

Tv' = -38,7 °C Tv = nd (<25 °C) Humedad residual = 0,34 % p/v

20 Difractograma WAXS: completamente amorfo

La retención de tioglicerol es menos buena que en ejemplo 2A, la condensación es visible en las paredes del vial almacenado a 25 ºC/HR del 65%. El tioglicerol no se inmoviliza de forma evidente completamente dentro de la torta amorfa.

25 El aspecto de la torta es agrietado y, por tanto, no agradable estéticamente, pero la estabilidad durante el almacenamiento es menos buena que la otra formulación, como se muestra en las Figuras 32 a 35. Solo se observó degradación peptídica a 25 °C/HR del 65% (poca estabilidad) y 40 °C/HR del 75% (estabilidad muy escasa:

30 Ejemplo comparativo 1-Serie de manitol

Ciclo de desecación por congelación típico

1: 20 1000 0

2: -5 1000 00,25

3: -5 1000 00,30

4: -40 1000 1,10

5: -40 1000 1,00

6: -20 1000 0,20

7: -20 1000 4,30

8: -40 1000 0,20

9: -40 1000 1,00

10: -15 0,09 0,50

11: -15 0,09 14,00

12: 25 0,05 6,00

13: 25 0,05 12,00

35 C1A Componentes no peptídicos (los valores entre paréntesis indican concentraciones en mM) manitol/tioglicerol (265:14). 40 Características Tg' = ninguna Tv = ninguna

Humedad residual = 0,75 % p/v Estructura de la torta: cristalina

La retención del tioglicerol es mala. Hay condensación visible sobre las paredes de los viales para todas las 5 condiciones de almacenamiento. El tioglicerol se inmoviliza de forma evidente dentro de la torta cristalina.

El aspecto de la torta es bueno y, por tanto, es agradable estéticamente, pero la estabilidad durante el almacenamiento es mala, como se muestra en las Figuras 1 a 4. Se observó degradación peptídica significativa en todas las condiciones aparte de las más favorables (-80 ºC). Esta condición de almacenamiento es improbable que sea comercialmente viable para un producto farmacéutico.

C1B

Componentes no peptídicos 15 (los valores entre paréntesis indican concentraciones en manitol/tioglicerol (265:46).

Características

Tv' = ninguna Tv = ninguna Humedad residual = 0,33 % p/v Estructura de la torta: cristalina

25 La retención del tioglicerol es mala. Hay condensación visible sobre las paredes de los viales en un grado similar a C1A. El tioglicerol se inmoviliza de forma evidente dentro de la torta cristalina, incluso cuando está presente a niveles más altos.

El aspecto de la torta es bueno y, por tanto, es agradable estéticamente, pero la estabilidad durante el almacenamiento es mala, como se muestra en las Figuras 5 a 8. Se observó degradación peptídica significativa en todas las condiciones aparte de las más favorables (-80 ºC).

C1C

35 Componentes no peptídicos (los valores entre paréntesis indican concentraciones en mM) manitol/tioglicerol/metionina (265:14:5).

Características

Tv' = ninguna Tv = ninguna Humedad residual = 1,04 % p/v Estructura de la torta: cristalina

45 La retención del tioglicerol es mala. Hay condensación visible sobre las paredes de los viales en un grado similar a C1A. El tioglicerol se inmoviliza de forma evidente dentro de la torta cristalina en presencia de metionina.

El aspecto de la torta es bueno y, por tanto, es agradable estéticamente, pero la estabilidad durante el almacenamiento es mala, como se muestra en las Figuras 9 a 12. Se observó degradación peptídica significativa en todas las condiciones aparte de las más favorables (-80 ºC). La metionina no ha mejorado las propiedades de esta composición.

C1D

55 Componentes no peptídicos (los valores entre paréntesis indican concentraciones en mM) manitol/tioglicerol/metionina (265:46:5).

Características

Tv' = ninguna Tv = ninguna Humedad residual = 0,61 % p/v Estructura de la torta: cristalina

65 La retención del tioglicerol es mala. Hay condensación visible sobre las paredes de los viales en un grado similar a C1A. El tioglicerol se inmoviliza de forma evidente dentro de la torta cristalina, incluso cuando está presente a una concentración más alta y en presencia de metionina.

El aspecto de la torta es bueno y, por tanto, es agradable estéticamente, pero la estabilidad durante el almacenamiento es mala, como se muestra en las Figuras 13 a 16. Se observó degradación peptídica significativa 5 en todas las condiciones aparte de las más favorables (-80 ºC). La metionina no ha mejorado las propiedades de esta composición.

Ejemplo comparativo 2-Serie de mezclas binarias “cristalinas” de trehalosa

10 Ciclo de desecación por congelación típico

1: 20 1000 0

2: -40 1000 00,36

3: -40 1000 1.30

4: -24 0,05 2.00

5: -24 0,05 24.00

6: 24 0,05 9.20

1: 24 0,05 6.00

C2A

15 Componentes no peptídicos (los valores entre paréntesis indican concentraciones en mM) manitol/trehalosa/tioglicerol/metionina (245:10:46:5).

Características

20 Tv' = -58,3 °C Tv = 70-73 °C Tm = aprox. 160 °C Humedad residual = 0,11 % p/v Estructura de la torta: cristalina (no completamente)

25 La retención del tioglicerol es mala. La condensación es visible en las paredes del vial tras 6 semanas a 25 ºC y 40 ºC. El tioglicerol no está evidentemente inmovilizado dentro de la torta cristalina.

El aspecto de la torta es bueno y, por tanto, es agradable estéticamente, pero la estabilidad durante el 30 almacenamiento es mala, como se muestra en las Figuras 36 a 39. Se observó degradación peptídica significativa en todas las condiciones aparte de las dos más favorables (5 ºC y -80 ºC).

C2B

35 Componentes no peptídicos (los valores entre paréntesis indican concentraciones en mM) manitol/trehalosa/tioglicerol/metionina (235:20:46:00:5).

Características

40 Tv' = nd Tv = nd Tm = nd Humedad residual = nd Estructura de la torta: cristalina (no completamente)

45 La retención del tioglicerol es mala. La condensación es visible en las paredes del vial especialmente a 25 ºC y 40 ºC. El tioglicerol no está evidentemente inmovilizado dentro de la torta cristalina, incluso a una concentración más alta de trehalosa.

50 El aspecto de la torta es bueno y, por tanto, es agradable estéticamente, pero la estabilidad durante el almacenamiento es mala, como se muestra en las Figuras 40 a 43. Se observó degradación peptídica significativa en todas las condiciones aparte de las dos más favorables (5 ºC y -80 ºC).

C2C

Componentes no peptídicos (los valores entre paréntesis indican concentraciones en mM) manitol/trehalosa/tioglicerol/metionina (225:30:46:5). 5 Características

Tv' = nd Tv = nd Tm = nd Humedad residual = nd Estructura de la torta: cristalina (no completamente)

La retención del tioglicerol es mala. La condensación es visible en las paredes del vial especialmente a 25 ºC y 40 15 ºC. El tioglicerol no está evidentemente inmovilizado dentro de la torta cristalina, incluso a una concentración todavía más alta de trehalosa.

El aspecto de la torta es bueno y, por tanto, es agradable estéticamente, pero la estabilidad durante el almacenamiento es mala, como se muestra en las Figuras 44 a 47. Se observó degradación peptídica significativa en todas las condiciones aparte de las dos más favorables (5 ºC y -80 ºC).

C2D

Componentes no peptídicos (los valores entre paréntesis indican concentraciones en mM) 25 manitol/trehalosa/tioglicerol/metionina/EDTA (245:10:46:5:0,5).

Características

35 El aspecto de la torta es bueno y, por tanto, es agradable estéticamente, pero la estabilidad durante el almacenamiento es mala, como se muestra en las Figuras 48 a 51. Se observó degradación peptídica significativa en todas las condiciones aparte de las dos más favorables (5 ºC y -80 ºC). La adición de EDTA no afecta a las propiedades de esta composición.

C2E

Componentes no peptídicos (los valores entre paréntesis indican concentraciones en mM) manitol/trehalosa/tioglicerol/metionina/EDTA (235:20:46:5:0,5).

45 Características

El aspecto de la torta es bueno y, por tanto, es agradable estéticamente, pero la estabilidad durante el almacenamiento es mala, como se muestra en las Figuras 52 a 55. Se observó degradación peptídica significativa 55 en todas las condiciones aparte de las dos más favorables (5 ºC y -80 ºC). La adición de EDTA no afecta a las propiedades de esta composición.

C2F

Componentes no peptídicos (los valores entre paréntesis indican concentraciones en mM) manitol/trehalosa/tioglicerol/metionina/EDTA (225:30:46:5:0,5).

Características

65 Tv' = nd Tv = nd

Tm = nd Humedad residual = nd Estructura de la torta: cristalina (no completamente)

5 La retención del tioglicerol es mala. La condensación es visible en las paredes del vial especialmente a 25 ºC y 40 ºC. El tioglicerol no está evidentemente inmovilizado dentro de la torta cristalina, incluso a una concentración alta de trehalosa y en presencia de EDTA.

El aspecto de la torta es bueno y, por tanto, es agradable estéticamente, pero la estabilidad durante el

10 almacenamiento es mala, como se muestra en las Figuras 56 a 59. Se observó degradación peptídica significativa en todas las condiciones aparte de las más favorables (-80 ºC). La adición de niveles incrementados de EDTA no afecta significativamente a las propiedades de esta composición.

Ejemplo comparativo 3-Serie de mezclas binarias “cristalinas” de sacarosa

15 Ciclo de desecación por congelación típico

1: 20 1000 0

2: -40 1000 00,36

3: -40 1000 1,30

4: -24 0,05 2,00

5: -24 0,05 24,00

6: 24 0,05 9,20

7: 24 0,05 6,00

C3A

20 Componentes no peptídicos (los valores entre paréntesis indican concentraciones en mM) manitol/sacarosa/tioglicerol/metionina (250:10:46:5).

Características

25 Tv' = nd Tv = nd Tm = nd Humedad residual = nd

30 Estructura de la torta: cristalina (no completamente)

La retención del tioglicerol es mala. La condensación es visible en las paredes del vial tras 5 semanas a 25 ºC y 40 ºC. El tioglicerol no está evidentemente inmovilizado dentro de la torta cristalina.

35 El aspecto de la torta es bueno y, por tanto, es agradable estéticamente, pero la estabilidad durante el almacenamiento es mala, como se muestra en las Figuras 60 a 63. Se observó degradación peptídica significativa en todas las condiciones aparte de las dos más favorables (5 ºC y -80 ºC).

C3B

40 Componentes no peptídicos (los valores entre paréntesis indican concentraciones en mM) manitol/sacarosa/tioglicerol/metionina (235:20:46:5).

Características

45 Tv' = nd Tv = nd Tm = nd Humedad residual = nd

50 Estructura de la torta: cristalina (no completamente)

La retención del tioglicerol es mala. La condensación es visible en las paredes del vial especialmente a 25 ºC y 40 ºC. El tioglicerol no está evidentemente inmovilizado dentro de la torta cristalina, incluso a una concentración más

alta de sacarosa.

El aspecto de la torta es bueno y, por tanto, es agradable estéticamente, pero la estabilidad durante el almacenamiento es mala, como se muestra en las Figuras 64 a 67. Se observó degradación peptídica significativa 5 en todas las condiciones aparte de las dos más favorables (5 ºC y -80 ºC).

C3C

Componentes no peptídicos (los valores entre paréntesis indican concentraciones en mM) manitol/sacarosa/tioglicerol/metionina (225:30:46:5).

Características

Tv' = nd

15 Tv = nd Tm = nd Humedad residual = nd Estructura de la torta: cristalina (no completamente)

La retención del tioglicerol es mala. La condensación es visible en las paredes del vial especialmente tras 5 semanas a 25 ºC y 40 ºC. El tioglicerol no está evidentemente inmovilizado dentro de la torta cristalina, incluso a una concentración todavía más alta de sacarosa.

El aspecto de la torta es bueno y, por tanto, es agradable estéticamente, pero la estabilidad durante el 25 almacenamiento es mala, como se muestra en las Figuras ´68 a 71. Se observó degradación peptídica significativa en todas las condiciones aparte de las dos más favorables (5 ºC y -80 ºC).

C3D

Componentes no peptídicos (los valores entre paréntesis indican concentraciones en mM) manitol/sacarosa/tioglicerol/metionina/EDTA (245:10:46:5:0,5).

Características

35 Tv' = nd Tv = nd Tm = nd Humedad residual = nd Estructura de la torta: cristalina (no completamente)

45 El aspecto de la torta es bueno y, por tanto, es agradable estéticamente, pero la estabilidad durante el almacenamiento es mala, como se muestra en las Figuras 72 a 75. Se observó degradación peptídica significativa en todas las condiciones aparte de las dos más favorables (5 ºC y -80 ºC).

C3E

Componentes no peptídicos (los valores entre paréntesis indican concentraciones en mM) manitol/sacarosa/tioglicerol/metionina/EDTA (235:20:46:00:5:0,5).

Características

55 Tv' = nd Tv = nd Tm = nd Humedad residual = nd Estructura de la torta: cristalina (no completamente)

La retención del tioglicerol es mala. La condensación es visible en las paredes del vial tras 5 semanas, especialmente a 25 ºC y 40 ºC. El tioglicerol no está evidentemente inmovilizado dentro de la torta cristalina.

65 El aspecto de la torta es bueno y, por tanto, es agradable estéticamente, pero la estabilidad durante el almacenamiento es mala, como se muestra en las Figuras 76 a 79. Se observó degradación peptídica significativa en todas las condiciones aparte de las dos más favorables (5 ºC y -80 ºC). La adición de EDTA no afecta a las propiedades de esta composición.

C3F

5 Componentes no peptídicos (los valores entre paréntesis indican concentraciones en mM) manitol/sacarosa/tioglicerol/metionina/EDTA (225:30:46:5:0,5).

Características

10 Tv' = nd Tv = nd Tm = nd Humedad residual = nd

15 Estructura de la torta: cristalina (no completamente)

La retención del tioglicerol es mala. La condensación es visible en las paredes del vial tras 5 semanas especialmente a 25 ºC y 40 ºC. El tioglicerol no está evidentemente inmovilizado dentro de la torta cristalina, incluso a una concentración alta de sacarosa y en presencia de EDTA.

20 El aspecto de la torta es bueno y, por tanto, es agradable estéticamente, pero la estabilidad durante el almacenamiento es mala, como se muestra en las Figuras 80 a 83. Se observó degradación peptídica significativa en todas las condiciones aparte de las dos más favorables (5 ºC y -80 ºC). La adición de EDTA no afecta a las propiedades de esta composición.

25 Ejemplo 4

Una formulación basada en los hallazgos del ejemplo 1 se analizó adicionalmente para determinar la estabilidad a largo plazo. La formulación siguiente (denominada “rica” en tioglicerol) se almacenó durante hasta un año a 30 30 °C/HR del 65%:

Materia prima: Función Concentración nominal1

MLA01, sal de acetato: Ingrediente activo 50 μM 73,8 μg/ml

MLA03, sal de acetato: Ingrediente activo 50 μM 88,6 μg/ml

MLA04, sal de acetato: Ingrediente activo 50 μM 94,0 μg/ml

MLA05, sal de acetato: Ingrediente activo 50 μM 101,1 μg/ml

MLA07, sal de acetato: Ingrediente activo 50 μM 90,3 μg/ml

MLA12, sal de acetato: Ingrediente activo 50 μM 91,3 μg/ml

MLA14, sal de acetato: Ingrediente activo 50 μM 84,7 μg/ml

D(+) Trehalosa dihidrato: Agente de tonicidad 270 mM 102,149 mg/ml

1-tioglicerol: Agente reductor 46 mM 1,514 mg/ml

L-metionina: Antioxidante 5 mM 0,746 mg/ml

Ácido fosfórico: Ajuste de pH Según sea necesario

Las concentraciones se proporcionan para la composición cuando está en estado líquido, es decir antes de la desecación por congelación y después de la reconstitución. Una formulación alternativa (“pobre” en tioglicerol) se

35 analizó en las mismas condiciones y fue idéntica a excepción de que el tioglicerol estaba presente a 14 mM en lugar de a 46 mM. La degradación del péptido se monitorizó a intervalos como se muestra en la Figura 84. Los resultados indican que ambas formulaciones alcanzaron una excelente estabilidad del péptido a lo largo del periodo de prueba.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Uso de trehalosa y tioglicerol en una composición desecada por congelación que comprende los péptidos de las

SEC ID Nº 1 a 4 para prevenir o reducir la dimerización de dichos péptidos en dicha composición. 5
2.

Uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde la composición comprende además los péptidos de las SEC ID Nº 84 a 86.
3.

Uso de acuerdo con la reivindicación 2, donde la composición no comprende péptidos adicionales.

10 4 Un procedimiento de producir una composición desecada por congelación estable que comprende los péptidos de las SEC ID Nº 1 a 4, comprendiendo dicho procedimiento:

a) preparar una composición que comprende en solución: (i) trehalosa, (ii) tioglicerol y (iii) dichos péptidos; y 15 b) desecar por congelación la composición resultante de la etapa (a).
5. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, donde la composición comprende además los péptidos de las SEC ID Nº 84 a 86.

20 6. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, donde la composición no comprende péptidos adicionales.
7. Un procedimiento de reconstitución de una composición desecada por congelación estable producida de acuerdo con el procedimiento de la reivindicación 5 o 6, donde dicho procedimiento comprende reconstituir dicha composición desecada por congelación en solución.
8. Una composición desecada por congelación estable que comprende los péptidos de las SEC ID Nº 1 a 4 %, tioglicerol y trehalosa.
9. Una composición de acuerdo con la reivindicación 8, que comprende además los péptidos de las SEC ID Nº 84 a 30 86.
10. Una composición de acuerdo con la reivindicación 9, que no comprende péptidos adicionales.