PT1559431E - Composição farmacêutica para derivados peptídicos de trombina. - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Composição farmacêutica para derivados peptídicos de trombina"

Antecedentes do invento A trombina é uma serina-protease presente no plasma na forma de um precursor, pro-trombina. A trombina tem sido conhecida pela actividade promotora do crescimento de uma ampla variedade de células de vários tecidos, por activação de um receptor da superfície celular específico conhecido como o receptor da trombina não proteoliticamente activado. Por exemplo, a trombina tem mostrado promover a angiogénese, o desenvolvimento de novos vasos sanguíneos e estimular a proliferação de células endoteliais (ver, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos Nos. 5352664 e 5500412).

Os derivados peptidicos de trombina são análogos sintéticos da trombina que têm uma sequência de aminoácidos derivada, pelo menos em parte, da trombina e que são activos no receptor da trombina não proteoliticamente activado. Por exemplo, os derivados peptídicos de trombina dos aminoácidos 508-530 da pro-trombina humana foram descritos pelos presentes inventores para promoção da estimulação de células mediada pelo receptor da trombina e para sua utilização no tratamento de feridas, estimulação do crescimento ósseo e crescimento ou reparação da cartilagem e promoção da reparação do tecido cardíaco (ver, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos Nos. 5352664, 5500412, WO 02/07748, WO 02/005836, WO 02/004008 e WO 03/013569).

Os derivados peptidicos de trombina mostram grande potencial como fármacos devido à sua actividade terapêutica para o tratamento de feridas, estimulação do crescimento ósseo e crescimento da cartilagem e promoção da reparação cardíaca. No entanto, infelizmente, os derivados peptidicos de trombina são altamente susceptíveis a dimerização. Por exemplo, ο TP508, um exemplo de um derivado peptídico de trombina que tem a sequência de aminoácidos H-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-NH2 (SEQ ID NO:4), dimeriza ao longo do tempo, tendo uma semi-vida de cerca de 2 a cerca de 4 horas 2

ΕΡ 1 559 431 /PT em certas soluções tamponadas a pH neutro e uma semi-vida de cerca de 7 dias a concentrações peptídicas elevadas em solução salina estéril (Ver Exemplo 1).

Por conseguinte, é necessário desenvolver métodos para manter a pureza dos derivados peptídicos de trombina durante períodos de tempo prolongados e prevenir ou reduzir a dimerização, de modo a que os derivados peptídicos de trombina tenham uma semi-vida de armazenamento longa e seja possível distribuir doses precisas e reprodutíveis, mesmo após armazenamento durante períodos de tempo prolongados.

Sumário do invento

Verificou-se agora que uma composição farmacêutica que inclua um derivado peptídico de trombina e um inibidor de dimerização retém a forma monomérica do derivado peptídico de trombina essencialmente livre de dímeros. Um inibidor de dimerização é um composto que inibe ou reduz a dimerização de um derivado peptídico de trombina. Os inibidores de dimerização incluem agentes quelantes e/ou compostos contendo tiol. Num exemplo, ο TP508 na presença de um agente quelante, o ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA), reteve a sua forma monomérica em mais de 90% do peso durante 2 semanas a 4°C (ver Exemplo 3). Um antioxidante pode também ser utilizado em combinação com o agente quelante e/ou o composto contendo tiol. Com base nesta descoberta, o invento proporciona uma composição farmacêutica que compreende: a) um derivado peptídico de trombina que tem 14 a 23 resíduos de aminoácidos de comprimento e que compreende a sequência de aminoácidos Asp-Ala-R, em que R é um domínio serina-esterase conservado; e b) um agente quelante e/ou um composto contendo tiol farmaceuticamente aceitável, e a utilização da composição farmacêutica no fabrico de um medicamento para activação do receptor da trombina não proteoliticamente activado num sujeito. A composição farmacêutica compreende ainda opcionalmente um antioxidante. 3

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As vantagens da composição farmacêutica do presente invento incluem uma vida de armazenamento mais longa para derivados peptidicos de trombina da que era previamente possível. Por conseguinte, é possível distribuir doses precisas e reprodutíveis com derivados peptidicos de trombina, mesmo após armazenamento durante períodos de tempo prolongados. A composição farmacêutica pode ser utilizada no tratamento e/ou prevenção de doenças e/ou condições nas quais podia ser benéfica a angiogénese e proliferação celular. A composição farmacêutica pode ser utilizada para acelerar, por exemplo, o crescimento ósseo, o crescimento ou reparação da cartilagem e a cicatrização de feridas tais como úlceras causadas pela diabetes e para estimular o crescimento ósseo nos sítios onde não podia ocorrer crescimento ósseo na ausência de tratamento (por exemplo, fractura de não-união, espaços vazios ou intervalos nos ossos ou enxertos ósseos). A composição farmacêutica do presente invento pode também ser utilizada para prevenir a restenose nos doentes após angioplastia e regenerar os vasos sanguíneos no tecido cardíaco.

Breve descrição dos desenhos A Fig. 1 é um gráfico que mostra o monómero, dímero e outros (adutos, etc.) de TP508 no momento da mistura (Tempo 0) com inibidor de dimerização (Tioglicerol (T), EDTA (E), Tioglicerol e EDTA (TE) e EDTA sob N2 (EN)). A Fig. 2 é um gráfico que mostra a estabilidade do TP508 em gel Pluronic após 2 semanas de armazenamento a 4 graus C na presença de inibidor de dimerização (Tioglicerol (T), EDTA (E), Tioglicerol e EDTA (TE) e EDTA sob N2 (EN)). A Fig. 3 é um gráfico que mostra a estabilidade do TP508 em gel Pluronic após dois meses de armazenamento a 4°C na presença de inibidor de dimerização (Tioglicerol (T), EDTA (E), Tioglicerol e EDTA (TE) e EDTA sob N2 (EN)).

Descrição detalhada do invento A Requerente constatou que certos derivados peptidicos de trombina retêm a sua forma monomérica essencialmente livre 4

ΕΡ 1 559 431 /PT de dímeros na presença de um inibidor de dimerização tal como um agente quelante ou um composto contendo tiol, por exemplo, mais de 90% em peso livre durante um período de tempo de 2 meses e, de preferência, mais de 95% em peso livre durante um período de tempo de 2 meses (Exemplo 3). O agente quelante e o composto contendo tiol podem ser utilizados em conjunto ou separadamente para prevenir ou reduzir a dimerização de derivados peptídicos de trombina. Pode-se utilizar opcionalmente um antioxidante em combinação com o agente quelante e/ou o composto contendo tiol.

Um "agente quelante", como aqui utilizado, é um composto que tem sítios múltiplos (dois, três, quatro ou mais) que se podem ligar simultaneamente a um ião metálico ou iões metálicos tais como, por exemplo, iões chumbo, cobalto, ferro ou cobre. Os sítios de ligação compreendem tipicamente oxigénio, azoto, enxofre ou fósforo. Por exemplo, os sais de EDTA (ácido etilenodiaminotetra-acético) podem formar, pelo menos, quatro a seis ligações com um ião metálico ou iões metálicos através dos átomos de oxigénio de quatro porções de ácido acético (-CH2C(0)0“) e os átomos de azoto das porções etilenodiamina (>N-CH2-CH2-N<) de EDTA. Deve-se compreender que um agente quelante inclui também um polímero que tem sítios de ligação múltiplos para um metal ou iões metálicos. Um agente quelante do invento é, de preferência, não tóxico e não causa efeitos secundários inaceitáveis nas doses a serem administradas. Como agente quelante do invento, prefere-se um agente quelante de cobre. Um "agente quelante de cobre" refere-se a um agente quelante que se pode ligar a um ião cobre ou iões cobre. Exemplos do agente quelante de cobre incluem ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA), penicil-amina, trientina, N,N'~dietilditiocarbamato (DDC), 2,3,2'-tetraamina (2,3,2 '-tet), neocuproína, N, N, Ν',Ν'-tetraquis-(2-piridilmetil)etilenodiamina (TPEN), 1,10-fenantrolina (PHE), tetraetilenopentamina (ΤΕΡΑ), trietilenotetraamina e tris (2-carboxietil)fosfina (TCEP). Agentes quelantes adicionais são o ácido dietilenotriaminapentacético (DTPA) e o ácido batofenantrolina-dissulfónico (BPADA). O EDTA é o agente quelante preferido. As quantidades típicas de um agente quelante presentes nas composições farmacêuticas do presente invento estão num intervalo entre cerca de 0,00001% e cerca de 0,1% em peso, de preferência, entre cerca de 5

ΕΡ 1 559 431 /PT 0,0001% e cerca de 0,05% em peso.

Um "composto contendo tiol farmaceuticamente aceitável", como aqui utilizado, é um composto que compreende, pelo menos, um grupo tiol (-SH) e que não causa efeitos secundários inaceitáveis nas doses a serem administradas. Exemplos do composto contendo tiol farmaceuticamente aceitável incluem tioglicerol, mercaptoetanol, tioglicol, tiodiglicol, cisteina, tioglucose, ditiotreitol (DTT) e ditio-bis-maleimidoetano (DTME). Está tipicamente presente nas composições farmacêuticas do invento, entre cerca de 0,001% e cerca de 5% em peso, de preferência, entre cerca de 0,05% e cerca de 1,0% em peso de um composto contendo tiol farmaceuticamente aceitável.

Um "antioxidante", como aqui utilizado, é um composto que é utilizado para prevenir ou reduzir uma reacção de oxidação causada por um agente de oxidação tal como oxigénio. Exemplos do antioxidante incluem tocoferol, cistina, metionina, glutationa, tocotrienol, dimetilglicina, betaina, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, vitamina E, ácido ascórbico, palmitato de ascorbilo, ácido tioglicólico e péptidos antioxidantes tais como, por exemplo, turmerina. Está tipicamente presente nas composições farmacêuticas do invento, entre cerca de 0,001% e cerca de 10% em peso, de preferência, entre cerca de 0,01% e cerca de 5%, mais preferivelmente, entre cerca de 0,05% e cerca de 2,0% em peso de um antioxidante.

Deve-se compreender que certos agentes quelantes ou compostos contendo tiol podem também funcionar como um antioxidante, por exemplo, tris(2-carboxietil)fosfina, cisteina ou ditiotreitol. No entanto, outros tipos de antioxidantes normalmente utilizados não contêm um grupo tiol. Deve-se também compreender que certos compostos contendo tiol podem também funcionar como um agente quelante, por exemplo, ditiotreitol. No entanto, outros tipos de agentes quelantes normalmente utilizados não contêm um grupo tiol. Deve-se também compreender que as composições farmacêuticas do presente invento podem compreender mais de um agente quelante, composto contendo tiol ou antioxidante. Isto é, por exemplo, um agente quelante pode ser utilizado ou 6

ΕΡ 1 559 431 /PT isoladamente ou em combinação com um ou mais de outros agentes quelantes adequados.

Um "agonista do receptor da trombina" refere-se a um composto que estimula ou activa o receptor da trombina não proteoliticamente activado (NPAR) (r. Horvat, et al., J. Cell Sei. 108, 1155-1164, 1995). Os compostos que estimulam NPAR são referidos como agonistas NPAR. NPAR é um receptor da trombina de elevada afinidade presente na superfície da maioria das células. Este componente NPAR é largamente responsável pela ligação de elevada afinidade da trombina, trombina proteoliticamente inactivada e péptidos derivados da trombina às células. NPAR parece mediar um certo número de sinais celulares que são iniciados pela trombina independentemente da sua actividade proteolítica. Um exemplo de um tal sinal é a suprarregulação da anexina V e de outras moléculas identificadas por hibridação subtractiva (ver Sower, et al., Experimental Cell Research 247: 422 (1999)).

Por conseguinte, NPAR é caracterizado pela sua elevada afinidade de interaeção com a trombina na superfície das células e pela sua activação por derivados proteoliticamente inactivos da trombina e agonistas peptídicos derivados da trombina, como descrito abaixo. A activação de NPAR pode ser analisada com base na capacidade das moléculas para estimular a proliferação de células quando adicionadas a fibroblastos na presença de concentrações submitogénicas de trombina ou moléculas que activam a proteína-quinase C, como descrito nas Patentes U.S. Nos. 5352664 e 5500412. Os agonistas NPAR podem ser identificados por esta activação ou pela sua capacidade para competir com a ligação da I-trombina as células. Os derivados peptídicos de trombina são exemplos do agonista do receptor da trombina. Um derivado peptídico de trombina é um polipéptido com menos de cerca de cinquenta aminoácidos, de preferência, menos de cerca de trinta e três aminoácidos e tem homologia suficiente a um fragmento de trombina humana correspondente aos aminoácidos pró-trombina 508-530 (Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val; SEQ ID NO:3), de modo a que o derivado peptídico de trombina tenha, pelo menos, 25% da actividade de TP508 em NPAR, de preferência, pelo menos, 50%. Os derivados peptídicos de trombina aqui descritos têm entre cerca de 14 e 23 aminoácidos, mais preferivelmente entre 7

ΕΡ 1 559 431 /PT cerca de 19 e 23 aminoácidos. Os derivados peptídicos de trombina aqui descritos podem ter, opcionalmente, amidas C-terminais e/ou um N-terminal acilado.

Um "N-terminal acilado" é um N-terminal no qual o azoto do residuo de aminoácido N-terminal é acilado. Por exemplo, os resíduos de aminoácidos N-terminais acilados têm a fórmula: R3C(0)-NH-CHRaC (0) -. Ra é uma cadeia lateral de aminoácidos e R3 é hidrogénio (-H) ou um grupo alquilo-(Ci-C6), de preferência grupo metilo (-CH3) . Um grupo acilo preferido é um grupo acetilo. Um "-ti" no N-terminal indica que o N-terminal não é substituído; e nenhuma designação no N-terminal indica que o terminal é acilado ou não substituído.

Uma "amida C-terminal" é uma amida no resíduo de aminoácidos C-terminal em que o ácido alfa carboxílico é substituído por uma amida. Por exemplo, os resíduos de aminoácidos C-terminais amidados possuem a fórmula: -NH-CH(Ra)C(0)-NR4R5. Ra é uma cadeia lateral de aminoácidos e R4 e R5 são independentemente -H, um grupo alquilo(Ci-Cê) ou, tomados em conjunto com o átomo de azoto ao qual estão ligados, um grupo heterocíclico tal como piperidinilo, morfolinilo, tiomorfinilo ou pirolidinilo. A amida C-terminal é, de preferência, uma carboxamida (-C(0)NH2). Como aqui utilizado, "-NH2" no C-terminal indica uma carboxamida C-terminal; "-0H" no C-terminal indica que o péptido tem um C-terminal livre; e nenhuma designação no C-terminal indica que o péptido é amidado no C-terminal ou tem um C-terminal livre.

De preferência, o N-terminal de um derivado peptídico de trombina é livre (i.e., não substituído) e o C-terminal é livre (i.e., não substituído) ou amidado, de preferência, uma carboxamida (i.e., -C(0)NH2).

Um derivado peptídico de trombina preferido para utilização na composição descrita consiste na sequência de aminoácidos seguinte: Rl-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-R2: SEQ ID NO:1. Rl é -H ou R3-C(0)-; R2 é -OH ou -NR4R5; R3 é -H ou grupo alquilo (Ci-C6) (de preferência, -CH3); e R4 e R5 são independentemente -H, um grupo alquilo (Ci-C6) ou, tomados em 8

ΕΡ 1 559 431 /PT conjunto com o átomo de azoto ao qual estão ligados, um grupo heterocíclico não aromático tal como piperidinilo, morfolinilo, tiomorfinilo ou pirolidinilo (de preferência, R4 e R5 são ambos -H) . De preferência, Rl é -H e R2 é -NH2; ou RI é -H e R2 é -OH. Alternativamente, pode ser utilizado na formulação um fragmento truncado N-terminal do derivado peptidico de trombina de SEQ ID N0:1 tendo, pelo menos, catorze aminoácidos ou um fragmento truncado C-terminal do derivado peptidico de trombina de SEQ ID N0:1 tendo, pelo menos, dezoito aminoácidos. Numa outra alternativa pode ser utilizado na formulação um fragmento truncado N-terminal do derivado peptidico de trombina tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:5, Rl-Asp-Asn-Met-Phe-Cys-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-Met-Lys-Ser-Pro-Phe-R2. Rl e R2 são como acima descrito, tendo, pelo menos, dezanove aminoácidos ou um fragmento truncado C-terminal do derivado peptidico de trombina de SEQ ID NO:5 tendo vinte e três aminoácidos.

Um "fragmento truncado C-terminal" refere-se a um fragmento que permanece após remoção de um aminoácido ou bloqueio de aminoácidos do C-terminal. Um "fragmento truncado N-terminal" refere-se a um fragmento que permanece após remoção de um aminoácido ou bloqueio de aminoácidos a partir do N-terminal. Deve-se compreender que os termos "fragmento truncado C-terminal" e "fragmento truncado W-terminal" abrangem a acilação no N-terminal e/ou amidação no C-terminal, como acima descrito. Deve-se também compreender que o invento inclui fragmentos truncados C-terminais e fragmentos truncados N-terminais com as modificações dos resíduos de aminoácidos realizadas nos derivados peptídicos de trombina originais antes do truncamento, como acima descrito.

Um outro derivado peptidico de trombina preferido aqui descrito consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID N0:2: Rl-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Xi-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X2-Val-R2. Xi é Glu ou Gin; X2 é Phe, Met, Leu, His ou Vai; Rl e R2 são como acima descrito. Alternativamente, pode ser utilizado na formulação um fragmento truncado N-terminal do derivado peptidico de trombina de SEQ ID N0:2 tendo, pelo menos, catorze 9

ΕΡ 1 559 431 /PT aminoácidos ou um fragmento truncado C-terminal do derivado peptídico de trombina de SEQ ID NO: 2 tendo, pelo menos, dezoito aminoácidos. Numa outra alternativa pode ser utilizado na formulação um fragmento truncado N-terminal do derivado peptídico de trombina tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:6, Rl-Asp-Asn-Met-Phe-Cys-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Xi-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X2-Val-Met-Lys-Ser-Pro-Phe-R2. Xi é Glu ou Gin; X2 é Phe, Met, Leu, His ou Vai; e Rl e R2 são como acima descrito, tendo, pelo menos, dezanove aminoácidos ou um fragmento truncado C-terminal do derivado peptídico de trombina de SEQ ID NO:6 tendo, vinte e três aminoácidos.

Um outro derivado peptídico de trombina preferido para utilização na composição descrita compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:3: Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val. Este péptido tem, de preferência, 23 aminoácidos de comprimento.

Um outro derivado peptídico de trombina preferido para utilização na composição descrita é TP508. 0 TP508 é um exemplo de um derivado peptídico de trombina com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:4: H-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-NH2. Um outro exemplo de um derivado peptídico de trombina tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7: H-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-OH ("TP508-desamida").

Um derivado peptídico de trombina representado pela Fórmula Estrutural (I), entre 14 e 23 aminoácidos de comprimento, é utilizado na formulação descrita:

Asp-Ala-R (I), em que R é um domínio serina-esterase conservado. As serina-esterases, por exemplo, tripsina, quimotripsina de trombina e semelhantes, têm uma região que é altamente conservada. "Domínio serina-esterase conservado" refere-se a um polipéptido tendo a sequência de aminoácidos de uma destas regiões conservadas ou é suficientemente homólogo a uma destas regiões conservadas de forma a que o derivado 10

ΕΡ 1 559 431 /PT peptídico de trombina retenha a capacidade de activação de NPAR. Numa concretização, a sequência serina-esterase conservada tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:8 (Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val) ou um fragmento truncado C-terminal de um polipéptido tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:8.

Outros exemplos de derivados peptidicos de trombina que podem ser utilizados na formulação descrita incluem fragmentos truncados N-terminais de TP508 (ou TP508-desamida), tendo os fragmentos truncados W-terminais, pelo menos, catorze aminoácidos ou fragmentos truncados C-terminais de TP508 (ou TP508-desamida), tendo os fragmentos truncados C-terminais, pelo menos, dezoito aminoácidos. Estes péptidos são, opcionalmente, amidados no C-terminal e não substituídos no N-terminal. Numa outra alternativa, estes péptidos são opcionalmente amidados no C-terminal como -C(0)-NH2 e não substituídos no N-terminal.

Uma "substituição conservativa" é a substituição de um aminoácido por um outro aminoácido que tem a mesma carga electrónica líquida e aproximadamente a mesma dimensão e forma. Os aminoácidos com cadeias laterais de aminoácidos alifáticos ou alifáticos substituídos têm aproximadamente a mesma dimensão quando o número total de carbonos e heteroátomos nas suas cadeias laterais difere em não mais do que cerca de quatro. Eles têm aproximadamente a mesma forma quando o número de ramificações nas suas cadeias laterais difere em não mais de um. Os aminoácidos com grupos fenilo ou fenilo substituído nas suas cadeias laterais são considerados ter aproximadamente a mesma dimensão e forma. São indicados abaixo cinco grupos de aminoácidos. A substituição de um aminoácido num polipéptido por um outro aminoácido do mesmo grupo resulta numa substituição conservativa:

Grupo I: glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina, cisteína e aminoácidos que não ocorrem naturalmente com cadeias laterais alifáticas(C1-C4) ou alifáticas(C1-C4) substituídas por hidroxilo (de cadeia linear ou mono-ramifiçada). 11

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Grupo II: ácido glutâmico, ácido aspártico e aminoácidos que não ocorrem naturalmente com cadeias laterais alifáticas(C1-C4) substituídas por ácido carboxílico (não ramificadas ou com um ponto de ramificação).

Grupo III: lisina, ornitina, arginina e aminoácidos que não ocorrem naturalmente com cadeias laterais alifáticas-(C1-C4) substituídas por amina ou guanidino (não ramificadas ou com um ponto de ramificação).

Grupo IV: glutamina, asparagina e aminoácidos que não ocorrem naturalmente com cadeias laterais alifáticas(C1-C4) substituídas por amida (não ramificadas ou com um ponto de ramificação).

Grupo V: fenilalanina, fenilglicina, tirosina e triptofano.

Uma "substituição altamente conservativa" é a substituição de um aminoácido por um outro aminoácido que tenha 0 mesmo grupo funcional na cadeia lateral e quase a mesma dimensão e forma. Os aminoácidos com cadeias laterais de aminoácidos alifáticos ou alifáticos substituídos têm quase a mesma dimensão quando 0 número total de carbonos e heteroátomos nas suas cadeias laterais difere em não mais de dois. Eles têm quase a mesma forma quando têm o mesmo número de ramificações nas suas cadeias laterais. Exemplos de substituições altamente conservativas incluem valina por leucina, treonina por serina, ácido aspártico por ácido glutâmico e fenilglicina por fenilalanina. Exemplos de substituições que não são altamente conservativas incluem alanina por valina, alanina por serina e ácido aspártico por serina.

Numa concretização, a composição farmacêutica descrita compreende um derivado peptídico de trombina e ou um agente quelante ou um composto contendo tiol farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica descrita compreende, de preferência, um derivado peptídico de trombina; o agente quelante; e o composto contendo tiol farmaceuticamente aceitável. Como agente quelante do invento, prefere-se um agente quelante de cobre tal como previamente descrito. 12

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Alternativamente, a composição farmacêutica descrita compreende um derivado peptidico de trombina e um agente quelante, de preferência, um agente quelante de cobre e/ou um composto contendo tiol farmaceuticamente aceitável e compreende adicionalmente um antioxidante.

Numa concretização preferida, a composição farmacêutica descrita compreende um derivado peptidico de trombina e um agente quelante, de preferência, um agente quelante de cobre e um antioxidante. Numa concretização mais preferida, a composição farmacêutica descrita compreende um derivado peptidico de trombina e um agente quelante, de preferência, um agente quelante de cobre e metionina. 0 agente quelante é, de preferência, EDTA. A composição farmacêutica descrita está, de preferência, num intervalo de pH entre cerca de 5 e cerca de 6, mais preferivelmente, entre cerca de 5,5 e cerca de 6. Num exemplo, a composição farmacêutica, que compreende um derivado peptidico de trombina e um agente quelante, de preferência, um agente quelante de cobre, e um antioxidante, está num intervalo de pH entre cerca de 5 e cerca de 6, mais preferivelmente, entre cerca de 5,5 e cerca de 6. Nesta composição, o antioxidante é, de preferência, metionina.

Numa outra concretização do invento está a utilização da composição farmacêutica no fabrico de um medicamento para activação do receptor da trombina não proteoliticamente activado, num sujeito.

Um "sujeito" é, de preferência, um humano, mas pode ser também um animal em necessidade de tratamento com um agonista do receptor da trombina, por exemplo, animais de companhia (por exemplo, cães, gatos e semelhantes), animais de quinta (por exemplo, vacas, porcos, cavalos e semelhantes) e animais de laboratório (por exemplo, ratos, ratinhos, cobaias e semelhantes).

Os sujeitos "em necessidade de tratamento" com um agonista do receptor da trombina são sujeitos com doenças e/ou condições que possam ser tratados com agonistas dos receptores da trombina e derivados peptídicos de trombina 13

ΕΡ 1 559 431 /PT para alcançar um resultado terapêutico e/ou profiláctico benéficos. Um resultado benéfico inclui a diminuição da gravidade dos sintomas ou o atraso do inicio dos sintomas, longevidade aumentada e/ou resolução mais rápida e mais completa da doença ou condição. Por exemplo, um sujeito em necessidade de tratamento requer a proliferação de células envolvendo condrócitos, angiogénese, crescimento ósseo, reparação cardíaca, cicatrização de feridas, crescimento ou reparação da cartilagem ou inibição da restenose.

Os derivados peptídicos de trombina têm mostrado estimular a proliferação de células endoteliais, fibroblastos e queratinócitos (ver, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos Nos. 5500412 e 5352664). Por conseguinte, os derivados peptídicos de trombina podem ser utilizados para promover a cicatrização de feridas agudas tais como, por exemplo, queimaduras, feridas dérmicas, feridas cirúrgicas e fracturas ósseas. Adicionalmente, os derivados peptídicos de trombina têm recentemente mostrado ser particularmente eficazes na promoção da cicatrização de feridas crónicas tais como, úlceras causadas pela diabetes, úlceras venosas e escaras (ver, por exemplo, WO 03/013569). Os derivados peptídicos de trombina têm também mostrado estimular o crescimento ou reparação da cartilagem e o crescimento de condrócitos (ver, por exemplo, WO 02/07748). Assim, os derivados peptídicos de trombina podem ser utilizados para estimular o crescimento ou reparação da cartilagem ou o crescimento e reparação de condrócitos em, por exemplo, doentes com osteoartrite ou lesões das articulações. Outras utilizações para os derivados peptídicos de trombina incluem a estimulação do crescimento ósseo para promover a cicatrização de fracturas simples, fracturas de não-união, vazios e intervalos nos ossos e enxertos ósseos, prevenção da restenose em doentes após angioplastia e promoção da regeneração dos vasos sanguíneos no tecido cardíaco (ver, por exemplo, WO 02/005836, WO 02/004008 e Publicação de Pedido de Patente US No. 2002/0128202. O crescimento ósseo induzido pode também ser terapeuticamente benéfico em certos sítios num sujeito (referidos como "sítios ectópicos") onde o tecido ósseo não seria normalmente encontrado, tal como um sítio em 14

ΕΡ 1 559 431 /PT necessidade de um enxerto ósseo ou fusão de ossos. As fusões são normalmente utilizadas para tratar dor da parte inferior das costas por acoplamento físico de uma ou mais vértebras à sua vizinhança. 0 osso criado por uma tal fusão é localizado num sítio não normalmente ocupado por tecido ósseo. 0 crescimento ósseo induzido nestes sítios ectópicos pode actuar como um "substituto de enxerto" pelo qual o crescimento ósseo induzido entre as vértebras toma o lugar de um enxerto e obvia a necessidade de uma segunda operação para colher osso para o procedimento de enxerto. A indução de crescimento ósseo é também necessária para tratar anomalias craniofaciais e outras do esqueleto ou dentárias, adquiridas e congénitas (ver, por exemplo, Glowacki et al., Lancet 1: 959 (1981)); realizar reconstruções dentárias e periodontais nas quais é necessária substituição de osso perdido ou aumento do osso tal como num osso maxilar; e suplementação de perda de osso alveolar resultante de doença periodontal para atrasar ou prevenir a perda de dentes (ver, por exemplo, Sigurdsson et al., J. Periodontol., 66: 511 (1995)). A composição farmacêutica do presente invento compreendendo um derivado peptídico de trombina pode então ser utilizada em tal tratamento como acima descrito.

Uma "quantidade eficaz" é a quantidade de um derivado peptídico de trombina na composição farmacêutica do presente invento que resulta num resultado clínico melhorado da condição a ser tratada com o derivado peptídico de trombina quando comparada com a ausência de tratamento. A quantidade de derivados peptídicos de trombina administrados vai depender do grau, gravidade e tipo de doença ou condição, da quantidade de terapêutica desejada e das características de libertação da formulação farmacêutica. Vai também depender da saúde, altura, peso, idade, sexo e tolerância a fármacos do sujeito. 0 derivado peptídico de trombina é tipicamente administrado durante um período de tempo suficiente para alcançar o efeito terapêutico desejado. Para a indicação de reparação cardíaca, são tipicamente administrados entre cerca de 0,1 μΜ a 10 μΜ ou mais tipicamente entre cerca de 50 a 250 pg por injecção única do derivado peptídico de trombina num tecido lesado para aumento satisfatório da velocidade de reparação. Para a indicação de crescimento ou reparação da 15

ΕΡ 1 559 431 /PT cartilagem, são tipicamente administrados entre cerca de 0,1 pg por aplicação única a cerca de 1 mg por aplicação única do derivado peptidico de trombina, de preferência, entre cerca de 25 pg e cerca de 100 pg por 20 mm cúbicos. Para o tratamento de úlcera dérmica crónica, são tipicamente administrados entre cerca de 0,1 pg e cerca de 1 mg por aplicação única, de preferência, entre cerca de 1 pg e cerca de 100 pg por aplicação única, do derivado peptidico de trombina. São, particularmente, administradas uma a sete aplicações por semana do derivado peptidico de trombina para o tratamento de úlcera dérmica crónica. Para a indicação de crescimento ósseo, são tipicamente administrados entre cerca de 1 pg e cerca de 1 mg por dia, de preferência, entre cerca de 5 pg e cerca de 100 pg por dia, do derivado peptidico de trombina.

Numa outra concretização, a composição farmacêutica descrita compreende adicionalmente um veiculo farmaceuticamente aceitável como parte da composição farmacêutica. Os veículos farmacêuticos adequados podem conter ingredientes inertes que não inibem a actividade biológica de um derivado peptidico de trombina e a função de um agente quelante, um composto contendo tiol e um antioxidante. Os veículos devem ser biocompatíveis, í.e., não tóxicos, não-inflamatórios, não-imunogénicos e desprovidos de outras reacções indesejáveis no sítio de administração. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis variam de acordo com a via de administração seleccionada e a indicação a ser tratada. Exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem, por exemplo, solução salina, aerossóis, geles inertes comercialmente disponíveis ou líquidos suplementados com albumina, metilcelulose ou uma matriz de colagénio. Podem ser utilizadas técnicas de formulação farmacêutica, padrão, tais como aquelas descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, P.A.

As composições do presente invento podem ser soluções, suspensões, emulsões, xaropes, geles, pomadas, loções, cremes, pastas, betume, extrusões, micropartículas, cápsulas, comprimidos ou semelhantes. 16

ΕΡ 1 559 431 /PT

Uma formulação em gel é normalmente utilizada quando o derivado peptidico de trombina está a ser utilizado para promover a reparação cardiaca e a cicatrização de feridas. Os geles são compreendidos por uma base seleccionada a partir de uma base oleaginosa, água ou uma base de emulsão-suspensão. A base oleaginosa contém óleos fixos ou hidrocarbonetos, tais como vaselina branca ou óleo mineral, ou uma base absorvente constituída, por exemplo, por uma substância ou substâncias anidras absorventes, por exemplo, lanolina anidra. A base de emulsão-suspensão compreende uma fase oleosa (fase interna) contendo tipicamente óleos fixos, hidrocarbonetos e semelhante, tais como ceras, vaselina, óleo mineral e semelhante, e uma fase aquosa (fase continua) compreendendo água e quaisquer substâncias solúveis em água tais como sais adicionados. As duas fases são estabilizadas por utilização de um agente emulsionante, por exemplo, um agente tensioactivo tal como laurilsulfato de sódio, colóides hidrofilicos tais como argilas coloidais de acácia, goma de abelha e similares. À base adiciona-se um agente gelificante que forma uma matriz na base, aumentando a sua viscosidade para uma consistência semi-sólida. Exemplos de agentes gelificantes adequados incluem hidroxipropilcelulose, polímeros de ácido acrilico, polímeros de poli(óxido de etileno) ou copolímeros de etileno e óxido de propileno (ver Cao et al., J. Biomater. Sei 9:475 (1998) e Sims et al., Plast Reconstr. Surg. 98:843 (1996). Os geles Pluronic são copolimeros de bloqueio, não tóxicos, de óxido de etileno e óxido de propileno. Eles exibem propriedades de termoendurecimento que lhes permitem existir como liquidos viscosos à temperatura ambiente, e como geles às temperaturas corporais. Os ingredientes activos são adicionados à formulação na concentração desejada num ponto que precede a adição do agente gelificante ou podem ser misturados após o processo de gelificação. Os geles para o tratamento da promoção da cicatrização de feridas podem ser administrados numa administração cutânea local. A preparação de geles é descrita no Exemplo 7.

As formulações para administração cutânea local diferentes dos geles incluem pomadas e cremes. As pomadas são tipicamente preparadas utilizando a base oleaginosa previamente descrita. Os cremes compreendem, em geral, a base 17

ΕΡ 1 559 431 /PT emulsão-suspensão previamente descrita. Após a formação da base, os ingredientes activos são adicionados na concentração desejada.

Numa outra concretização preferida, as composições farmacêuticas descritas são pelotas liofilizadas que podem ser reconstituídas antes da utilização. As pelotas liofilizadas são normalmente utilizadas para indicações tais como crescimento ósseo e reparação cardíaca. As composições liofilizadas compreendem opcionalmente um agente encorpante adicionalmente aos outros ingredientes activos previamente descritos. Os agentes encorpantes adequados incluem manitol, lactose, celulose, sorbitol, dextrose, dextrano, polidextrose, maltitol, xilitol, isomalte, eritritol, glicerol e semelhantes. As composições liofilizadas podem ser reconstituídas para formar soluções e podem conter substâncias auxiliares tais como agentes humectantes ou emulsionantes, agentes tamponantes de pH, aditivos intensificadores de viscosidade, conservantes e semelhantes, dependendo da via de administração e da preparação desejada.

As composições farmacêuticas do presente invento são tipicamente formulações de libertação prolongada para indicações tais como crescimento ósseo, crescimento ou reparação da cartilagem e reparação cardíaca. As formulações de libertação prolongada podem proporcionar a libertação contínua de medicação durante um período de horas. Os polímeros são frequentemente utilizados para formar as formulações de libertação prolongada. Exemplos dos polímeros incluem poli-a-hidroxi-ésteres tais como homopolímeros e copolímeros de ácido poliláctico/ácido poliglicólico (PLGA), polifosfazenos (PPHOS), poli-anidridos e poli(fumaratos de propileno) (PPF).

Os homo e copolímeros de ácido poliláctico/ácido poliglicólico (PLGA) são bem conhecidos na arte como veículos de libertação prolongada. A velocidade de libertação pode ser ajustada pelo técnico perito por variação da relação de ácido poliláctico para ácido poliglicólico e do peso molecular do polímero (ver Anderson et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 28: 5 (1997)). A incorporação de poli(etilenoglicol) no polímero como uma mistura para formar veículos de micropartículas 18

ΕΡ 1 559 431 /PT permite adicionalmente a alteração do perfil de libertação do ingrediente activo (ver Cleek et al., J. Control Release 48: 259 (1997)). Os cerâmicos tais como fosfato de cálcio e hidroxiapatite podem também ser incorporadas na formulação para melhorar as qualidades mecânicas. As microparticulas de PLGA podem também ser misturadas com geles pluronic ou colagénio para prevenir a agregação e produzir microparticulas adequadas para injecção directa. A preparação de microesferas de PLGA de TP508 é descrita em detalhe no documento WO 03/061690.

Os polímeros PPHOS contém alternadamente azoto e fósforo sem qualquer carbono na estrutura do polímero, como mostrado abaixo na Fórmula Estrutual (I):

As propriedades do polímero podem ser ajustadas por variação adequada dos grupos laterais R e R' que estão ligados à estrutura do polímero. Por exemplo, a degradação e a libertação de fármaco por PPHOS podem ser controladas por variação da quantidade de grupos laterais hidroliticamente instáveis. Por exemplo, com maior incorporação de PPHOS substituído por imidazolilo ou etilglicol observa-se um aumento na velocidade de degradação (ver Laurencin et al., J. Biomed Mater. Res. 27:963 (1993)), aumentando assim a velocidade de libertação do fármaco.

Os polianidridos, apresentados na Fórmula Estrutural (II), têm características de degradação e libertação bem definidas que podem ser controladas incluindo quantidades variáveis de monómeros hidrofóbicos ou hidrofílicos tais como ácido sebácico e 1,3-bis(p-carboxifenoxi)propano (ver Leong et al., J. Biomed. Mater. Res. 19:941 (1985)). Para aumentar a força mecânica, os anidridos são frequentemente copolimerizados com imidas para formar polianidrido-co-imidas. Exemplos de polianidrido-co-imidas que são adequadas 19

ΕΡ 1 559 431 /PT para aplicações ortopédicas são os copolimeros de poli(trimelitilimido-glicina-co-1,6-bis(carboxifenoxi)hexano e piromeliti-imidoalanina-1,6-bis(p-carboxifenoxi)hexano.

CD) u J n

As composições farmacêuticas do presente invento podem ser administradas por uma qualquer via adequada, cutânea ou sistemicamente. A via de administração depende tipicamente do tipo de formulação a ser utilizada e da indicação tratada. A administração cutânea é normalmente utilizada para tratar feridas. Para a administração cutânea, as composições farmacêuticas são tipicamente cremes, geles, pomadas ou aerossóis, como previamente descrito em detalhe. Para certas indicações tais como estimulação do crescimento ósseo, reparação ou crescimento da cartilagem e reparação cardíaca, é vantajoso injectar ou implantar a composição farmacêutica do presente invento directamente no sítio de tratamento.

Para as indicações em necessidade de reparação cardíaca, crescimento ou reparação da cartilagem e crescimento ósseo, as composições farmacêuticas do invento são tipicamente formas injectáveis. Por exemplo, as composições injectáveis descritas podem ser directamente injectadas no sítio em necessidade de crescimento ósseo e podem ser adequadamente utilizadas para preencher vazios e fundir ossos sem a necessidade de cirurgia invasiva. "Injectável" significa que o material pode ser injectado por seringa através de uma agulha padrão utilizada para injectar soluções, pastas ou geles. A composição injectável pode ser administrada intravenosamente ou directamente no sítio em necessidade de tratamento. As composições injectáveis podem incluir adicionalmente solução salina fisiológica, solução salina bacteriostática (solução salina contendo cerca de 0,9% mg/ml de álcool benzílico) solução salina tamponada com fosfato, solução de Hank, lactato de Ringer ou líquidos suplementados com albumina, metilcelulose ou ácido hialurónico. As composições injectáveis podem também incluir polímeros de 20

ΕΡ 1 559 431 /PT poli(óxido de etileno) ou copolimeros de óxido de etileno e propileno. Os geles Pluronic são exemplos de tais polímeros, exibindo propriedade de termofixação que lhes permite existir como líquidos viscosos à temperatura ambiente, e como geles à temperatura corporal, como previamente referido. Outras composições para as composições de distribuição injectável incluem as soluções de copolimeros de poli(fumarato de propileno) (PPF) e pastas de cerâmicos de fosfato de cálcio (ver Schmitz et al., J. Oral Maxillofacial Surgery 57:1122 (1999)) .

As composições farmacêuticas implantáveis são especialmente benéficas para indicações tais como estimulação do crescimento ósseo, crescimento ou reparação da cartilagem e reparação cardíaca. A "implantação" ou "administração num sítio" significa em proximidade suficiente do sítio em necessidade de tratamento de modo a ocorrer a cicatrização desejada (por exemplo, um resultado clínico melhorado da condição a ser tratada na presença do fármaco quando comparado com a sua ausência) no sítio quando o derivado peptídico de trombina é libertado a partir da composição farmacêutica. Compreende-se que uma composição farmacêutica implantável possa ser também uma formulação de libertação prolongada ou uma formulação injectável previamente descrita. Por exemplo, as composições farmacêuticas implantáveis podem compreender também um veículo de libertação prolongada para alcançar medicação lenta e contínua no sítio de implantação.

As composições farmacêuticas implantáveis podem ser modeladas como desejado antes da cirurgia ou modeladas pelo médico ou técnico durante a cirurgia. É preferível modelar a matriz para abranger um defeito do tecido e tomar a forma desejada do novo tecido. Por exemplo, no caso da reparação óssea de um defeito de não-união, é desejável utilizar dimensões que abranjam a não-união. Nos procedimentos de formação óssea, o material é lentamente absorvido pelo corpo sendo substituído pelo osso na forma do ou numa forma muito próxima da do implante.

Alternativamente, a composição farmacêutica implantável pode ser parcialmente encerrada numa estrutura física de suporte tal como uma rede, matriz de arame, gaiola de aço 21

ΕΡ 1 559 431 /PT inoxidável, gaiola de fusão intercorpos com rosca e semelhante antes da administração no sitio, por exemplo, em necessidade de crescimento ósseo.

Ainda numa outra alternativa, as composições farmacêuticas descritas especialmente para estimulação do crescimento ósseo e reparação ou crescimento da cartilagem compreendem vantajosamente veículos que incluem matrizes porosas que podem depois servir como um suporte para o crescimento de ossos e tecidos sobre o qual as células progenitoras de osso e as células osteogénicas podem migrar e fixar. Tais veículos são referidos como osteocondutores. Para certas aplicações, o veículo deve ter força mecânica suficiente para manter a sua estrutura tridimensional e auxiliar o suporte da imobilização dos segmentos de osso ou tecido a serem unidos ou enxertados. Exemplos de veículos osteocondutores adequados incluem colagénio (por exemplo, colagénio de bovino), fibrina, cerâmicas de fosfato de cálcio (por exemplo, hidroxiapatite e fosfato tricálcico), sulfato de cálcio, osso alogénico extractado com guanidina e suas combinações. Estão comercialmente disponíveis um certo número de veículos adequados, tais como COLLAGRAFT® (Cohension Technologies, Inc., Paio Alto, CA), que é uma mistura de hidroxiapatite, fosfato tricálcico e colagénio fibrilar e PRO OSTEON 500™ (Interpore Cross International, Irvine, CA), que é uma biomatriz de hidroxiapatite formada pela conversão de carbonato de cálcio de coral marinho em hidroxiapatite cristalina. As descrições de polímeros biodegradáveis sintéticos que podem servir como veículos osteocondutores com características de libertação prolongada, podem ser encontradas em Behravesh et al., Clinicai Orthopaedics 367: S118 (1999) e Lichun et al., Polymeric Delivery Vehicles for Bone Growth Factors em "Controlled Drug Delivery - Designing Technologies for the Future" Park e Mrsny eds., American Chemical Society, Washington, DC (2000) . Exemplos dos polímeros biodegradáveis incluem poli-a-hidroxi-ésteres tais como homopolímeros e copolímeros de ácido poliláctico/ácido poliglicólico, polifosfazenos (PPHOS), polianidridos e poli(fumaratos de propileno), que são descritos acima em detalhe. 22

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Alternativamente, as composições farmacêuticas podem ser implantadas no sitio na forma de micropartículas ou microsferas. Por exemplo, as micropartículas são colocadas em contacto ou na proximidade do sitio em necessidade de reparação cardiaca, crescimento ósseo ou reparação da cartilagem quer por exposição cirúrgica do sítio quer por aplicação das micropartículas no ou na proximidade do sítio por pintura, pipetagem, pulverização, injecção ou semelhante. As micropartículas podem também ser distribuídas no sítio por endoscopia ou por laparoscopia. Os poli(fumaratos de propileno) (PPF) são veículos implantáveis biocompatíveis altamente desejáveis para utilização na reparação de defeitos ósseos porque são um material biodegradável, polimerizável ín situ, injectável. 0 PPF, combinado com um monómero de vinilo (N-vinilpirrolidinona) e um iniciador (peróxido de benzoílo), forma uma solução injectável que pode ser polimerizada in situ. É particularmente adequada para enchimento de defeitos do esqueleto de uma variedade de dimensões e formas (ver, Suggs et al., Macromolecules 30:4318 (1997), Peter et al., J. Biomater. Sei. Poly. Ed. 10:363 (1999) e Yaszemski et al., Tissue Eng. 1:41 (1995)). A adição de componentes de fase sólida tais como fosfato de β-tricálcio e cloreto de sódio pode melhorar as propriedades mecânicas dos polímeros PPF (ver Peter et al., J. Biomed. Mater. Res. 44:314 (1999)). São conhecidos na arte os métodos para encapsulamento de composições (tais como num revestimento de gelatina dura ou ciclodextrano) (Baker et al., "Controlled Release of Biological Active Agents", John Wiley and Sons, 1986).

As doenças e condições, tratáveis com a composição farmacêutica descrita que compreende um derivado peptídico de trombina, por exemplo, feridas e angioplastia, são frequentemente acompanhadas por sintomas e enfermidades tais como dor e infecção. Em certos casos, pode ser vantajoso co-administrar um ou mais agente(s) farmacologicamente activo(s) adicional(ais) juntamente com a composição farmacêutica do presente invento para resolver tais problemas. Por exemplo, o controlo da dor e inflamação pode necessitar da co-administração de um agente analgésico ou anti-inflamatório. 0 controlo da infecção pode necessitar da co-administração de agentes antimicrobianos, antibióticos ou desinfectantes. 23

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Os derivados peptídicos de trombina podem ser sintetizados pelo método de síntese de péptidos em fase sólida (por exemplo, BOC ou FMOC), por síntese em fase de solução ou por quaisquer outras técnicas adequadas incluindo combinações dos métodos anteriores. Os métodos BOC e FMOC, que estão estabelecidos e amplamente utilizados, são descritos em Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 88:2149 (1963);

Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, C.H. Li, Ed., Academic Press, 1983, pp. 48-267; e Barany e Merrifield, em The Peptides, E. Gross and J. Meienhofer, Eds., Academic Press, New York, 1980, pp. 3-285. Os métodos de síntese de péptidos em fase sólida são descritos em Merrifield, R.B., Science, 232:341 (1986); Carpino, L.A. e Han, G.Y., J. Org. Chem., 37:3404 (1972); e Gauspohl, H. et ai., Synthesis, 5:315 (1992)). O invento é ilustrado pelos exemplos seguintes que não se destinam, de modo nenhum, a ser limitantes.

Exemplificação

Exemplo 1

Experiência de controlo: Estabilidade de TP508 na ausência de um inibidor de dimerização Ο TP508 foi dissolvido em solução salina estéril 150mM para dar uma concentração final de 5 mg/ml. As amostras (100 μΐ) foram transferidas para um tubo Cryo estéril de 2 ml e armazenadas protegidas da luz a 4°C. As amostras foram diluídas para 1 mg/ml e analisadas por HPLC de fase inversa utilizando coluna C18 (coluna C18 Alltech Adsorbosphere XL 90A 5 pm 250x4,6 mm) a tempos definidos. Realizou-se um método de gradientes no qual a fase móvel B é aumentada de 20% para 50% de 1-15 min (fase móvel A - TFA a 0,1% em água; fase móvel B - TFA a 0,1% em acetonitrilo) e o volume de injecção é de 10 μΐ. Ο TP508, o dímero de TP508 e os picos não identificados foram identificados e quantificados a partir da área do cromatograma. 24

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Tabela 1. Estabilidade de TP508 na ausência de inibidor de dimerização a 4°C Área média do pico, % Tempo (dias) TP508 Dimero de TP508 Picos não identificados 0 92, 45 3,03 4, 52 0,33 90,21 5, 29 4, 50 1 88, 06 7, 28 4, 66 2 84, 87 10, 88 4, 25 4 70, 98 24, 85 4, 17 14 4, 67 91, 4 3, 93 21 3, 61 93, 23 3, 16 28 2, 54 93, 73 3, 73 90 0 96, 51 3, 49 183 0 97, 02 2, 98 273 0 96, 53 3, 74 425 0 92, 31 7, 69

Exemplo 2

Estabilidade de TP508 na presença de um agente quelante 0 TP508 foi dissolvido a 1 mg/ml em soluções tamponadas ou não tamponadas, com ou sem EDTA. As soluções foram incubadas à temperatura ambiente e as amostras colhidas a intervalos para análise por HPLC. A percentagem de formação de dimero foi calculada a partir dos cromatogramas resultantes. As soluções seguintes foram utilizadas para dissolver ο TP508 (1 mg/ml): PBS, pH 7,4 (borbulhado com N2 durante 30 min)

Hepes lOmM, NaCl 150mM, pH 7,0

Hepes lOmM, NaCl 150mM, EDTA 5mM, pH 7,0

Colocou-se um ml de cada solução num tubo de microcentrifuga de polipropileno de 1,5 ml e deixou-se repousar à temperatura ambiente. A intervalos definidos, removeram-se 100 μΐ para análise pelo método de HPLC mencionado no exemplo 1. A percentagem de dimeros formados ao longo do tempo está sumarizada na Tabela 2.

Tabela 2. Percentagem de dimero 0 min 30 min 60 min 90 min PBS 4,8 8,8 14,3 26, 7 Hepes/NaCl 5,7 13,3 31,3 53, 9 Hepes/NaCl/EDTA 6,1 5,9 6,1 6,2 25

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Em solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou Hepes/NaCl a velocidade de formação de dimero foi muito rápida. Como mostrado, a adição de EDTA 5mM reduziu muito a velocidade de formação de dimero. Estes resultados sugerem que a formação de dimero pode ser promovida pela presença de quantidades vestigiais de iões divalentes uma vez que a formação de dimeros é prevenida ou reduzida pelo EDTA.

Exemplo 3

Estabilidade de TP508 na presença de um inibidor de dimerização, tioglicerol, EDTA ou da combinação dos dois

As amostras preparadas como descrito na Tabela 3 continham tipicamente 50 pg/ml de TP508 dissolvido em geles Pluronic. As amostras foram então armazenadas a 4°C. Para a análise, as amostras foram diluidas dez vezes com TFA a 0,1% e analisadas por HPLC. Analisaram-se, tipicamente, 50 μΐ da amostra diluida. A quantificação do TP508 foi realizada por um padrão externo. Antes da análise da amostra analisou-se um padrão duplo de TP508. Analisou-se uma amostra de cada grupo da Tabela 3.

Tabela 3. Composição das amostras

Ingredientes Fornecedor Tioglicerol 1 EDTA E Tioglicerol /EDTA TE EDTA Coberto com N2 EN Tampão de citrato pH 5,5 Preparado no laboratório usando ácido cítrico+NaOH 82% 82,496% 82,3996% 82,496% Álcool Benzilico, NF Espectro 0,5% 0, 5% 0, 5% 0,5% Pluronic F-127 Espectro 17% 17% 17% 17% Monotioglicerol Espectro 0,5% N/A 0,1% N/A EDTA Dissódico Espectro N/A 0,004% 0,0004% 0,004% pH Final N/A 5,7 5,7 5,7 5,7 T - Tioglicerol E - EDTA TE - Tioglicerol/EDTA EN - EDTA com N2

Tempo 0:

Como mostrado na Figura 1, observou-se ao tempo 0 uma concentração muito baixa de dimero para todas as amostras preparadas como descrito na Tabela 3. Observaram-se picos desconhecidos compreendendo cerca de 20% e 6% da amostra 26

ΕΡ 1 559 431 /PT total nas amostras contendo tioglicerol (Grupo T) e tioglicerol/EDTA (Grupo TE), respectivamente. Estes picos desconhecidos tinham um tempo de retenção ligeiramente superior ao do TP508, o que sugere que eles podiam corresponder a um aducto de TP508 e tioglicerol, uma vez que a quantidade de formação de aducto é um pouco proporcional ao conteúdo de tioglicerol nas duas amostras.

Duas semanas de armazenamento a 4°C:

As amostras armazenadas durante duas semanas a 4°C mostraram essencialmente a mesma concentração de dimeros que ao tempo 0, como mostrado na Figura 2. Na amostra contendo EDTA (Grupo E) ou EDTA com N2 (Grupo EN), cerca de 90% do TP508 mantinha ainda a sua forma monomérica.

Dois meses de armazenamento a 4°C:

Como mostrado na Figura 3, todas as amostras contendo um inibidor de dimerização (Grupo T, E, TE e EN) tinham estabilidade aumentada do TP508 quando comparadas com as amostras sem um inibidor de dimerização. A amostra contendo tioglicerol e EDTA (Grupo TE) mostrou essencialmente a mesma quantidade de dimeros que a do tempo 0, o que indica que o TP508 manteve a sua forma monomérica essencialmente livre de dimeros mesmo após dois meses de armazenamento na presença de tioglicerol e EDTA com apenas 10% de aducto de TP508- tioglicerol. Aproximadamente 80% do TP508 mantiveram-se como um monómero na amostra contendo EDTA (Grupo E) ou EDTA com N2 (Grupo EN) . Ter uma cobertura de azoto durante a preparação de geles não parece afectar a dimerização. A amostra contendo tioglicerol (Grupo T) mostrou que aproximadamente 60% do TP508 mantinha a sua forma monomérica e os restantes 40% do TP508 formavam um aducto de TP508-tioglicerol. Estes resultados demonstram que o EDTA e o químico contendo tio podem ser utilizados para estabilizar ο TP508 da dimerização.

Exemplo 4

Estabilidade de TP508 na presença de EDTA e um antioxidante

Os antioxidantes seguintes foram testados quanto à sua capacidade para inibir a dimerização do TP508 em combinação 27

ΕΡ 1 559 431 /PT com EDTA. A % normal utilizada na formulação é mostrada na Tabela 4 seguinte:

Tabela 4: Composição das amostras

Antioxidantes Baixa Elevada Acido ascórbico 0,1 1,0 Ácido tioglicólico 0,05 0,2 Cloridrato de cisteina 0,1 LO O Metionina 0,1 0, 5

Preparou-se e utilizou-se uma base de gel (Pluronic a 17%, EDTA a 0,0004% e tampão de citrato, pH 5,0 com conservantes). Cada tipo de antioxidante (quer % baixa quer % elevada) foi adicionado à concentração desejada. Em seguida, adicionou-se ao gel TP508 para dar uma concentração de 50 pg/ml. As amostras foram incubadas a 4°C durante 3 semanas. Em seguida, diluíram-se 100 μΐ de amostra com 900 μΐ de TFA a 0,1% e analizou-se por HPLC de acordo com o método descrito no Exemplo 1. Antes da análise da amostra analisou-se um padrão duplo. Analisou-se também um gel de branco com conservantes e antioxidante.

Os resultados são mostrados na Tabela 5 abaixo. Em resumo, ο TP508 foi muito estável a concentração elevada de antioxidantes a 4°C durante três semanas. Com excepção do ácido ascórbico, foram também eficazes concentrações baixas de antioxidantes.

Tabela 5: Concentração de TP508 (pg/ml) ao longo do tempo Ácido ascórbico 1% 0,1% Tempo 0 43,4 pg/ml 39,6 pg/ml 3 semanas (4°C) 44,0 pg/ml 23,8 pg/ml Ácido tioglicólico 0, 2% 0,05% Tempo 0 46,7 pg/ml 47,1 pg/ml 3 semanas (4 0C) 46,8 pg/ml 43,7 pg/ml Cloridrato de cisteina 0, 5% 0,1% Tempo 0 51,5 pg/ml 49,8 pg/ml 3 semanas (4°C) 48,9 pg/ml 53,3 pg/ml Metionina 0, 5% 0,1% Tempo 0 46,9 pg/ml 45,3 pg/ml 3 semanas (4°C) 51,6 pg/ml 48,8 pg/ml 28

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Exemplo 5

Estabilidade de TP508 na presença de um agente quelante (EDTA) e um antioxidante a vários intervalos de pH

Testaram-se quanto à sua capacidade para inibir a dimerização do TP508 e a formação de outras formas moleculares, preparações de amostras tamponadas com EDTA ΙΟμΜ a pH diferente e a pH 5,5 com adição de antioxidantes. As amostras testadas a vários pH e percentagens de oxidante são mostradas na Tabela 6.

Tabela 6: Composições das amostras de teste

Grupos: Condições: 1 pH 4,5 2 pH 5,0 3 pH 5,5 4 pH 5,5, cisteína a 0,5% (p/v) 5 pH 5,5, metionina a 0,5% (p/v) 6 pH 5,5, ácido tioglicólico a 0,2% (v/v) 7 pH 6,0 0 TP508 foi preparado em tampão de citrato 50mM de pH 4,5 a 6,0 com EDTA ΙΟμΜ. As amostras foram esterilizadas por filtração e incubadas à temperatura ambiente longe de qualquer fonte de luz. A tempos indicados, cada amostra foi analisada por HPLC para determinar a concentração de monómero de TP508 (Tabela 7), percentagem de dimero (Tabela 8), percentagem de aducto (Tabela 9) e entidades moleculares desconhecidas (Tabela 10).

Tabela 7: Concentração de TP508 (pg/ml) do tempo 0 ao dia 28

Condições: Tempo 0 Dia 4 Dia 12 Dia 2 8 pH 4, 5 48,03 45, 13 43, 27 37,77 pH 5,0 50,50 48, 35 47, 99 44,26 pH 5, 5 52,07 48, 51 48, 76 45,61 pH 5,5, cisteína a 0,5% (p/v) 50,35 41,55 32,85 31,77 pH 5,5, metionina a 0,5% (p/v) 51,29 48,96 49,18 45,79 pH 5,5, ácido tioglicólico a 0,2% (v/v) 48, 57 41, 28 38, 54 30,29 pH 6,0 50,95 48, 64 50, 86 46,21 29

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Tabela 8: % de dímero do tempo 0 ao dia 28

Condições: Tempo 0 Dia 4 Dia 12 Dia 28 pH 4,5 0, 66 1,92 3,44 6, 75 pH 5,0 0, 77 1,22 1,42 1,93 pH 5,5 0, 73 1,40 1,76 2,69 pH 5,5, cisteína a 0,5% (p/v) 0, 00 0, 00 0, 00 0,00 pH 5,5, metionina a 0,5% (p/v) 0, 80 O i—1 T-1 | 1, 36 1,38 pH 5,5, ácido tioglicólico a 0,2% (v/v) 0,00 0,00 0,00 0,00 pH 6,0 0, 87 1,66 2,13 3,38

Tabela 9: % de outros + % de pico de aducto do tempo 0 ao dia 28

Condições: Tempo 0 Dia 4 Dia 12 Dia 28 pH 4,5 0, 00 1,83 3, 72 13,69 pH 5,0 0, 00 1,33 2, 72 10,06 pH 5,5 0, 00 0,79 1,28 6, 55 pH 5,5, cisteína a 0,5% (p/v) 1, 63 16, 32 31, 86 34, 73 pH 5,5, metionina a 0,5% (p/v) 0, 00 0,80 1,31 7, 22 pH 5,5, ácido tioglicólico a 0,2% (v/v) 4, 85 15, 62 21, 36 38, 97 pH 6,0 0, 00 0,87 0, 45 5,18

Tabela 10: Velocidade de formação de dímero e desconhecidos pH Velocidade de dimerização Velocidade de formação de desconhecidos 4,5 0,2121 0,4862 5, 0 0,0376 0,3574 5, 5 0,0644 0,2328 6, 0 0,0835 0,1791* 5,5 + Met 0,0183* 0,2574 * Valores mais baixos

Os resultados demonstram que todos os antioxidantes testados neste estudo previnem ou reduzem a dimerização do TP508 como mostrado na Tabela 8 relativamente à formada nos tampões de citrato no intervalo de pH de 4,5 a 6,0. Os resultados na Tabela 9 mostram que a metionina é incapaz de criar aductos de TP508 devido à ausência de um grupo tiol. Estes resultados sugerem que o melhor pH para inibir a formação de dimero de TP508 foi a pH 6,0, a partir desta experiência sem qualquer antioxidante. Com a adição de metionina a 0,5% (p/v) a pH 5,5, obteve-se a velocidade mais lenta (0,0183) mostrada na Tabela 10. A velocidade de formação de desconhecidos é inversamente proporcional ao pH de 4,5 a 6,0, o que indica que ο TP508 é susceptível à hidrólise ácida com este sistema de tampão. Nesta experiência 30

ΕΡ 1 559 431 /PT a metionina também não preveniu ou causou a formação de desconhecidos. Em resumo, a metionina parece ser o melhor antioxidante para prevenir ou reduzir a dimerização de TP508 sem formação de aductos de TP508 e a velocidade mais lenta de formação de picos de desconhecidos foi a pH 6,0 nesta experiência.

Exemplo 6

Efeito dos quelantes divalentes na dimerização de TP508

Testaram-se quanto à sua capacidade para inibir a formação de dímero de TP508, os agentes quelantes divalentes, ácido dietilenotriaminopentacético (DTPA) e ácido batofenantrolina-dissulfónico (BPADA), que são conhecidos por quelar um ião cobre.

Condições: A. acetato 50 mM/NaCl 100 mM, PH 5,4 B. acetato 50 mM/NaCl 100 mM, pH 5,4 com DTPA 10 μΜ C. acetato 50 mM/NaCl 100 mM, pH 5,4 com BPADA 10 μΜ

Procedimentos: Ο TP508 (10 pg/ml) foi incubado com ou sem quelantes em tubos de centrífuga de polipropileno à temperatura ambiente e analizado nos tempos indicados por electroforese capilar para monitorizar qualquer formação de dimero.

Resultados:

Tabela 11: Percentagem de dímero da Amostra A: acetato 50mM/NaCl lOOmM, pH 5, 4

Tempo % De dímero 2 min 0 1 h 17 3,5 h 30 4,5 h 37 5,5 h 47 21 h 81 28 h 74 4 dias 100 5 dias 100 31

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Tabela 12: Percentagem de dímero da Amostra B: acetato 50mM/NaCl lOOmM, pH 5,4 com DTPA ΙΟμΜ

Tempo % De dímero 22 min 0 2,5 h 0 4 h 0 5 h 0 6 h 0 21 h 0 28 h 0 4 dias 0 5 dias 0

Tabela 13: Percentagem de dímero da Amostra C: acetato 50mM/NaCl lOOmM, pH 5,4 com BPADA ΙΟμΜ

Tempo % De dímero 40 min 0 3 h 0 4 h 0 5 h 41 6 h 0 22 h 0 29 h 0 4 dias 0 5 dias 17

Estes resultados demonstram que os quelantes diferentes de EDTA podem também estabilizar ο TP508 para prevenir ou reduzir a formação de dimeros.

Exemplo 7

Preparação de TP508 em Geles Pluronic Ο TP508 (3,60 mg, Bachem Fmoc) foi adicionado a geles

Pluronic (72 ml), resultando numa concentração de 50 pg/ml numa proveta de vidro de 100 ml com uma barra de agitação magnética. Os geles foram agitados a 4°C durante 1 hora para facilitar a mistura completa. Para a Amostra D, os geles foram agitados sob uma atmosfera de azoto utilizando uma cobertura de gás de azoto. Os geles foram então introduzidos até ao bordo de um frasco de polipropileno de 1 ml. O frasco foi tapado com uma tampa revestida por Teflon para prevenir a introdução de qualquer bolha de ar nos geles. As amostras foram armazenadas ou a 4°C ou na gaveta (25°C) longe da luz. 32

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Numa formulação comercial, ο TP508 podia ser adicionado a um gel totalmente formulado ou a uma fase intermédia contendo estabilizantes adequados como descrito no Exemplo 3, Tabela 3.

Embora este invento tenha sido particularmente apresentado e descrito com referência às suas concretizações preferidas deve ser entendido por aqueles peritos na arte que podem ser realizadas nele várias alterações de forma e detalhe sem se afastar do âmbito do invento abrangido pelas reivindicações em anexo.

Listagem de sequências <110> The Board of Regents, The University of Texas System Hobson, David W.

Crowther, Roger S.

Carney, Darrel H.

<120> COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA PARA DERIVADOS PEPTÍDICOS DE TROMBINA <130> 3033.1009-004 <150> 60/533,730 <151> 2003-12-31 <160> 8 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1 <211> 23 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Péptido sintético

<221> VARIANT <222> 1 <223> Alanina na posição 1 está opcionalmente N-acilada

<221> VARIANT <222> 23 <223> Valina na posição 23 está opcionalmente C-aminada 33

ΕΡ 1 559 431 /PT < 4 Ο Ο > 1

Ala Gly Tyr Lys Pro Asp Glu Gly Lys Arg Gly Asp Ala Cys Glu Gly 15 10 15

Asp Ser Gly Gly Pro Phe Vai 20

<210> 2 <211> 23 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Péptido sintético <221> VARIANT <222> 1 <223> Alanina na posição 1 está opcionalmente N-acilada

<221> VARIANT <222> 15 <223> Xaa = Glu ou Gin

<221> VARIANT <222> 22 <223> Xaa - Phe, Met, Leu, His ou Vai <221> VARIANT <222> 23 <223> Valina na posição 23 está opcionalmente C-aminada <400> 2

Ala Gly Tyr Lys Pro Asp Glu Gly Lys Arg Gly Asp Ala Cys Xaa Gly 1 5 10 15

Asp Ser Gly Gly Pro Xaa Vai 20

<210> 3 <211> 23 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Fragmento de Trombina Humana < 4 0 0 > 3

Ala Gly Tyr Lys Pro Asp Glu Gly Lys Arg Gly Asp Ala Cys Glu Gly 15 10 15

Asp Ser Gly Gly Pro Phe Vai 20 34

ΕΡ 1 559 431 /PT

<210> 4 <211> 23 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Péptido sintético <221> VARIANT <222> 1 <223> Alanina não está substituída <221> VARIANT <222> 23 <223> Valina na posição 23 está amidada com NH2 <400> 4

Ala Gly Tyr Lys Pro Asp Glu Gly Lys Arg Gly Asp Ala Cys Glu Gly 15 10 15

Asp Ser Gly Gly Pro Phe Vai 20

<210> 5 <211> 33 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Péptido sintético <221> VARIANT <222> 1 <223> Ácido aspártico na posição 1 está opcionalmente N-acilado

<221> VARIANT <222> 33 <223> Fenilalanina na posição 33 está opcionalmente C-amidada <400> 5

Asp Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Lys Pro Asp Glu Gly Lys Arg Gly 15 10 15

Asp Ala Cys Glu Gly Asp Ser Gly Gly Pro Phe Vai Met Lys Ser Pro 20 25 30

Phe

<210> 6 <211> 33 <212> PRT <213> Sequência artificial 35

ΕΡ 1 559 431 /PT <220> <223> Péptido sintético <221> VARIANT <222> 1 <223> Ácido aspártico na posição 1 está opcionalmente N-acilado <221> VARIANT <222> 20 <223> Xaa = Glu ou Gin <221> VARIANT <222> 27 <223> Xaa = Phe, Met, Leu, His ou Vai <221> VARIANT <222> 33 <223> Fenilalanina na posição 33 está opcionalmente C-amidada <400> 6

Asp Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Lys Pro Asp Glu Gly Lys Arg Gly 15 10 15

Asp Ala Cys Xaa Gly Asp Ser Gly Gly Pro Xaa Vai Met Lys Ser Pro

<210> 7 <211> 23 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Péptido sintético <221> VARIANT <222> 1 <223> Alanina na posição 1 não está substituída <221> VARIANT <222> 23 <223> Valina na posição 23 não está substituída < 4 0 0 > 7

Ala Gly Tyr Lys Pro Asp Glu Gly Lys Arg Gly Asp Ala Cys Glu Gly 15 10 15

Asp Ser Gly Gly Pro Phe Vai 20 36

ΕΡ 1 559 431 /PT

< 210 > 8 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Fragmento da sequência conservada de serina-esterase <400> 8

Cys Glu Gly Asp Ser Gly Gly Pro Phe Vai 15 10

Lisboa,

Claims (30)

1. ΕΡ 1 559 431 /PT 1/5 REIVINDICAÇÕES 1. Composição farmacêutica, que compreende: a) um derivado peptidico de trombina que tem 14 a 23 resíduos de aminoácidos de comprimento e que compreende a sequência de aminoácidos Asp-Ala-R, em que R é um domínio serina-esterase conservado; e b) um agente quelante e/ou um composto contendo tiol farmaceuticamente aceitável.
2. 2. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, que compreende adicionalmente um antioxidante.
3. 3. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, na qual o agente quelante é um agente quelante de cobre.
4. 4. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 3, na qual o agente quelante de cobre é seleccionado a partir do grupo constituído por ácido dietilenotriaminopentaacético (DTPA) e ácido batofenantrolina-dissulfónico (BPADA).
5. 5. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 3, na qual o agente quelante de cobre é seleccionado a partir de um grupo constituído por ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA), penicilamina, trientina, N,N'~dietilditiocarbamato (DDC), 2,3,2'-tetraamina (2,3,2'-tet), neocuproína, Ν,Ν,Ν',Ν'-tetraquis(2-piridilmetil)etilenodiamina (TPEN), 1,10- fenantrolina (PHE), tetraetilenopentamina, trietilenotetraamina e tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP).
6. 6. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, que compreende um composto contendo tiol farmaceuticamente aceitável seleccionado a partir de um grupo constituído por tioglicerol, mercaptoetanol, tioglicol, tiodiglicol, cisteína, tioglucose, ditiotreitrol (DTT) e ditio-bis-maleimidoetano (DTME).
7. 7. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 2, na qual o antioxidante é seleccionado a partir de um grupo constituído por tocoferol, cisteína, metionina, glutationa, ΕΡ 1 559 431 /PT 2/5 tocotrienol, dimetilglicina, betaína, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, turmerina, vitamina E, ácido ascórbico, palmitato de ascorbilo e ácido tioglicólico.
8. 8. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, gue compreende um agente guelante de cobre e um composto contendo tiol farmaceuticamente aceitável.
9. 9. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 2, que compreende um agente quelante e um antioxidante.
10. 10. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 9, na qual o antioxidante é metionina.
11. 11. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, na qual o derivado peptidico de trombina é: a) Rl-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-R2 (SEQ id NO:l), em que RI é -H ou R3-C(O) R2 é -OH ou -NR4R5; R3 é -H ou um grupo alquilo(Ci—C6); e R4 e R5 são independentemente -H, um grupo alquilo(Ci-C6) ou, tomados em conjunto com o átomo de azoto ao qual estão ligados, um grupo heterociclico não aromático; b) um fragmento truncado N-terminal de a) possuindo pelo menos catorze aminoácidos; ou c) um fragmento truncado C-terminal de a) possuindo pelo menos dezoito aminoácidos.
12. 12. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, na qual o derivado peptidico de trombina é: a) Rl-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Xl-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X2-Val-R2 (SEQ ID NO:2), em que XI é Glu ou Gin; X2 é Phe, Met, Leu, His ou Vai; Rl é -H ou R3-C(O)-; R2 é -OH ou -NR4R5; R3 é -H ou um grupo alquilo(Ci—C6); e ΕΡ 1 559 431 /PT 3/5 R4 e R5 são independentemente -H, um grupo alquilo(Ci-C6) ou, tomados em conjunto com o átomo de azoto ao qual estão ligados, um grupo heterociclico não aromático; b) um fragmento truncado N-terminal de a) possuindo pelo menos catorze aminoácidos; ou c) um fragmento truncado C-terminal de a) possuindo pelo menos dezoito aminoácidos.
13. 13. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, na qual o derivado peptídico de trombina é um polipéptido de 23 aminoácidos que compreende Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val (SEQ ID NO:3).
14. 14. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, na qual o derivado peptidico de trombina é H-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-NH2 (SEQ ID NO:4).
15. 15. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 14, que compreende um agente quelante e um antioxidante.
16. 16. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 15, na qual o antioxidante é metionina.
17. 17. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, na qual o derivado peptidico de trombina é um fragmento truncado N-terminal tendo pelo menos catorze aminoácidos de ou um fragmento truncado C-terminal tendo pelo menos dezoito aminoácidos de H-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-NH2 (SEQ ID NO:4), opcionalmente amidado no C-terminal como C(0)-NH2.
18. 18. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, que é seleccionada a partir do grupo constituído por um comprimido; uma cápsula; uma formulação de microparticulas; uma solução; uma suspensão ou elixir; uma formulação de libertação prolongada; uma formulação injectável; uma formulação implantável e uma formulação tópica. ΕΡ 1 559 431 /PT 4/5
19. 19. Utilização da composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 no fabrico de um medicamento para activação do receptor da trombina não proteoliticamente activado, num sujeito.
20. 20. Utilização de acordo com a reivindicação 19, em que o medicamento se destina à promoção do crescimento ou reparação da cartilagem.
21. 21. Utilização de acordo com a reivindicação 19, em que o medicamento se destina ao tratamento de um sujeito em necessidade de crescimento ósseo.
22. 22. Utilização de acordo com a reivindicação 19, em que o medicamento se destina à promoção da cicatrização de feridas.
23. 23. Utilização de acordo com a reivindicação 22, em que a ferida é uma ferida crónica.
24. 24. Utilização de acordo com a reivindicação 19, em que o medicamento se destina à promoção de reparação cardíaca ou inibição da restenose.
25. 25. Utilização de uma composição farmacêutica, em que a composição farmacêutica é um gel, que compreende: a) H-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-NH2 (SEQ ID NO:4); b) um agente quelante; e c) um antioxidante, no fabrico de um medicamento para activação do receptor da trombina não proteoliticamente activado, num sujeito.
26. 26. Utilização de acordo com a reivindicação 25, em que o medicamento se destina à promoção do crescimento ou reparação de cartilagem.
27. ΕΡ 1 559 431 /PT 5/5 27. utilização de acordo com a reivindicação 25, em que o medicamento se destina ao tratamento de um sujeito em necessidade de crescimento ósseo.
28. 28. Utilização de acordo com a reivindicação 25, em que o medicamento se destina à promoção da cicatrização de feridas.
29. 29. Utilização de acordo com a reivindicação 28, em que a ferida é uma ferida crónica.
30. 30. Utilização de acordo com a reivindicação 25, em que o medicamento se destina à promoção de reparação cardíaca ou inibição da restenose. Lisboa,