ES2287660T3 - Composicion farmaceutica de los derivados peptidicos de trombina. - Google Patents

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Abstract

Una composición farmacéutica que comprende: a) un derivado peptídico de trombina con una longitud de 14 a 23 aminoácidos y que comprende la secuencia de aminoácidos Asp- Ala-R, en la que R es el dominio conservado de la esterasa de la serina; y b) un agente quelante y/o un compuesto que contiene tiol aceptable desde el punto de vista farmacéutico.

Description

Composición farmacéutica de los derivados peptídicos de trombina.
La trombina es una proteasa de serina presente en el plasma sanguíneo en forma de precursor, protrombina. Se conoce por su actividad promotora de crecimiento de una amplia variedad de células de diversos tejidos por activación de un receptor específico de superficie celular conocido como el receptor de trombina no activado proteolíticamente. Por ejemplo, se ha demostrado que la trombina promueve la angiogénesis, desarrollo de nuevos vasos sanguíneos, y estimula la proliferación de células endoteliales (ver, ej., Patentes EE.UU. Nos. 5. 352.664, 5. 500.412).
Los derivados peptídicos de trombina son análogos sintéticos de la trombina que poseen una secuencia de aminoácidos derivada por lo menos en parte de la trombina y son activos en el receptor de trombina no activado proteolíticamente. Por ejemplo, los inventores de la presente invención han descrito que los derivados peptídicos de trombina de los aminoácidos 508-530 de la protrombina humana promueven la estimulación de células mediada por el receptor de trombina y que se pueden utilizar en el tratamiento de heridas, estimulando el crecimiento óseo y el crecimiento o reparación de cartílagos y promueven la reparación del tejido cardíaco (ver, ej., Patentes EE.UU. Nos. 5.352.664, 5.500.412, WO 02/07748, WO 02/005836, WO 02/004008 y WO 03/013569).
Los derivados peptídicos de trombina muestran un gran potencial como productos farmacéuticos debido a su actividad terapéutica en el tratamiento de heridas, estimulación del crecimiento óseo y crecimiento de cartílagos y en la promoción de la reparación cardíaca. Sin embargo, desafortunadamente los derivados peptídicos de trombina son altamente susceptibles a la dimerización. Por ejemplo, TP508, ejemplo de un derivado peptídico de trombina que posee la secuencia de aminoácidos H-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-N-H2 (SEQ ID NO: 4), dimeriza con el tiempo y tiene una vida media de alrededor de 2 a aproximadamente 4 horas en ciertas soluciones tamponadas a pH neutro y, una vida media de aproximadamente 7 días a altas concentraciones de péptidos en salina estéril (Ver ejemplo 1).
Por tanto, es necesario desarrollar métodos para mantener la pureza de los derivados peptídicos de trombina durante períodos de tiempo prolongados y evitar o reducir la dimerización de manera que los derivados peptídicos de trombina tengan un tiempo de vida largo en almacenamiento y sea posible ofrecer dosis precisas y reproducibles, incluso después del almacenamiento durante períodos de tiempo prolongados.
Sumario de la invención
En la actualidad se ha encontrado que una composición farmacéutica que incluya a un derivado peptídico de trombina y un inhibidor de dimerización retiene la forma monomérica del derivado peptídico de trombina esencialmente libre de dímeros. Un inhibidor de dimerización es un compuesto que inhiba o reduzca la dimerización de un derivado peptídico de trombina. Los inhibidores de dimerización incluyen agentes quelantes y/o compuestos que contienen tiol. En un ejemplo, TP508 en presencia de un agente quelante, ácido etilen-diamino-tetra-acético (EDTA), retenía su forma monomérica por encima del 90% en peso durante 2 semanas a 4ºC (ver Ejemplo 3). También se puede utilizar un antioxidante en combinación con el agente quelante y/o el compuesto que contiene tiol. En base a este hallazgo, la invención ofrece una composición farmacéutica que comprende:
a)
un derivado peptídico de trombina con una longitud de 14 a 23 residuos de aminoácidos y que comprende la secuencia de aminoácidos Asp-Ala-R, en la que R es el dominio conservado de la esterasa de la serina; y
b)
un agente quelante y/o un compuesto, que contiene tiol, aceptable desde el punto de vista farmacéutico.
y el uso de la composición farmacéutica según la reivindicación 1 en la fabricación de un medicamento para activar el receptor de trombina no activado proteolíticamente en un sujeto.
La composición farmacéutica además comprende opcionalmente un antioxidante.
Las ventajas de la composición farmacéutica de la presente invención incluyen una vida de almacenamiento más prolongada para los derivados peptídicos de trombina que la que anteriormente era posible. Por tanto, es posible ofrecer dosis precisas y reproducibles con derivados peptídicos de trombina incluso después del almacenamiento durante prolongados períodos de tiempo. La composición farmacéutica se puede utilizar en el tratamiento y/o prevención de enfermedades y/o condiciones, en las que la angiogénesis y la proliferación celular serían beneficiosas. La composición farmacéutica se puede utilizar para acelerar, por ejemplo, el crecimiento óseo, crecimiento o reparación de cartílagos, y la cicatrización de heridas como úlceras diabéticas, y para estimular el crecimiento óseo en lugares donde el mismo no ocurriría con ausencia de tratamiento (ej., fractura sin unión, vacíos o huecos en los huesos o injertos óseos). La composición farmacéutica de la presente invención también se puede utilizar para prevenir la restenosis en pacientes después de la angioplastia y para regenerar los vasos sanguíneos en el tejido cardíaco.
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Breve descripción de las figuras
La Figura 1 es un gráfico que muestra el dímero del monómero TP508, y otros (aductos, etc.) en el momento de la mezcla (Tiempo 0) con inhibidor de dimerización (Tioglicerol (T), EDTA (E), Tioglicerol y EDTA (TE), y EDTA en atmósfera de N2 (EN).
La Figura 2 es un gráfico que muestra la estabilidad de TP508 en geles Pluronic después de 2 semanas de almacenamiento a 4ºC en presencia del inhibidor de dimerización (Tioglicerol (T), EDTA (E), Tioglicerol y EDTA (TE), y EDTA en atmósfera de N2 (EN).
La Figura 3 es un gráfico que muestra la estabilidad de TP508 en geles Pluronic después de dos meses de almacenamiento a 4ºC en presencia del inhibidor de dimerización (Tioglicerol) (T). EDTA (E), Tioglicerol y EDTA (TE), y EDTA en atmósfera de 2 (EN).
Descripción detallada de la invención
Los solicitantes han encontrado que ciertos derivados peptídicos de trombina retienen su forma monomérica esencialmente libre de dímeros en presencia de un inhibidor de dimerización tales como un agente quelante o un compuesto que contiene tiol, ej., por encima del 90% libre por peso durante un período de tiempo de 2 meses y preferiblemente por encima del 95% libre por peso durante un período de tiempo de 2 meses (Ejemplo 3). El agente quelante y el compuesto que contiene tiol se pueden utilizar juntos o por separado para prevenir o reducir la dimerización de los derivados peptídicos de trombina. Opcionalmente se puede utilizar un antioxidante en combinación con el agente quelante y/o el compuesto que contiene tiol.
Un "agente quelante," tal como se utiliza aquí, es un compuesto que posee múltiples sitios (dos, tres, cuatro o más) que pueden simultáneamente enlazarse a un ión de metal o iones de metal tales como, por ejemplo, iones de plomo, cobalto, hierro o cobre. Los sitios de enlace típicamente comprenden oxígeno, nitrógeno, azufre o fósforo. Por ejemplo, las sales de EDTA (ácido etilen-diamino-tetra-acético) pueden formar por lo menos de cuatro a seis enlaces con un ión de metal o iones de metal por vía de los átomos de oxígeno de las cuatro restos de ácido acético (-CH_{2}C(O)O-) y los átomos de nitrógeno de los restos de etilen-diamino (>N-CH_{2}-CH_{2}-N<) de EDTA. Se entiende que un agente quelante también incluye un polímero que tiene múltiples sitios de enlace con un metal o iones de metal. Preferiblemente, un agente quelante de la invención no es tóxico y no provoca efectos secundarios inaceptables a las dosis que se administran. Como un agente quelante de la invención, se prefiere un agente quelante de cobre. Un "agente quelante de cobre" se refiere a un agente quelante que puede enlazarse a un ión de cobre o iones de cobre. Ejemplos de agente quelante de cobre incluyen el ácido etilen-diamino-tetra-acético (EDTA), penicilamina, trientina, N,N'-dietil-ditio-carbamato (DDC), 2,3,2'-tetramina (2,3,2'-tet), neocuproína, N,N,N',N'-tetrakis(2-piridil-metil) etilen-diamina (TPEN), 1,10-fenantrolina (PHE), tetraetilen-pentamina (TEPA), trinquetilla-tetramina y tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP). Otros agentes quelantes son ácido dietilen-triamino-penta-acético (DTPA) y ácido batofenantrolina-disulfónico (BPADA). EDTA es un agente quelante preferido. Las cantidades típicas de un agente quelante presentes en la composición farmacéutica de la presente invención se encuentran en un rango entre aproximadamente 0,00001% y aproximadamente 0,1% en peso, preferiblemente entre aproximadamente 0,0001% y aproximadamente 0,05% en peso.
Un "compuesto que contiene tiol aceptable desde el punto de vista farmacéutico", tal como se utiliza aquí, es un compuesto que comprende por lo menos un grupo tiol (-SH) y que no provoca efectos secundarios inaceptables a las dosis que se administran. Ejemplos del compuesto que contiene tiol aceptable desde el punto de vista farmacéutico incluyen tioglicerol, mercaptoetanol, tioglicol, tiodiglicol, cisteína, tioglucosa, ditiotreitol (DTT), y ditio-bis-maleímido-etano (DTME). Típicamente, entre aproximadamente 0,001% y aproximadamente 5% en peso, preferiblemente entre aproximadamente 0,05% y aproximadamente 1,0% en peso de un compuesto que contiene tiol aceptable desde el punto de vista farmacéutico está presente en la composición farmacéutica de la invención.
Un "antioxidante," tal como se utiliza aquí, es un compuesto que se usa para evitar o reducir una reacción de oxidación causada por un agente oxidante como el oxígeno. Ejemplos de antioxidante incluyen tocoferol, cisteína, metionina, glutatión, toco-trienol, dimetil-glicina, betaína, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, vitamina E, ácido ascórbico, palmitato de ascorbilo, ácido tioglicólico péptidos antioxidantes tales como, por ejemplo, turmerin. Típicamente, entre aproximadamente 0,001% y aproximadamente 10% en peso, preferiblemente entre aproximadamente 0,01% y aproximadamente 5%, más preferiblemente entre aproximadamente 0,05% y aproximadamente 2,0% en peso de un antioxidante está presente en la composición farmacéutica de la invención.
Se entiende que ciertos agentes quelantes o compuestos que contienen tiol pueden también funcionar como un antioxidante, por ejemplo, tris(2-carboxietil)fosfina, cisteína o ditio-treitol. Sin embargo, otros tipos de antioxidantes comúnmente utilizados no contienen un grupo tiol. También se entiende que ciertos compuestos que contienen tiol también pueden funcionar como un agente quelante, por ejemplo, ditio-treitol. Sin embargo, otros tipos de agentes quelantes comúnmente utilizados no contienen un grupo tiol. También se entiende que la composición farmacéutica de la presente invención puede comprender más de un agente quelante, un compuesto que contiene tiol o un antioxidante. Es decir, por ejemplo, que un agente quelante puede utilizarse solo o en combinación con uno o más agentes quelantes adecuados.
Un "agonista de receptor de trombina" se refiere a un compuesto que estimula o activa el receptor de trombina no activado proteolíticamente (NPAR) (R. Horvat, et. al., J. Cell Sci. 108, 1155-1164, 1995). Se dice que los compuestos que estimulan el NPAR son agonistas. El NPAR es un receptor de trombina de alta afinidad presente en la superficie de la mayoría de las células. Este compuesto NPAR es en gran medida responsable del enlace de alta afinidad de la trombina, de la trombina proteolíticamente inactivada y de los péptidos derivados de la trombina con las células. El NPAR parece mediar varias señales celulares que son iniciadas por la trombina independiente de su actividad proteolítica. Ejemplo de una de esas señales es la sobrerregulación de anexina V y otras moléculas identificadas por hibridización substractiva (ver Sower, et. al., Experimental Cell Research 247:422 (1999)). Por tanto, el NPAR se caracteriza por su interacción de alta afinidad con la trombina en las superficies celulares y su activación por derivados proteolítcamente inactivos de trombina y agonistas peptídicos derivados de trombina como se describe abajo. La activación del NPAR se puede evaluar en base a la capacidad de las moléculas de estimular la proliferación celular al ser añadido a fibroblastos en presencia de concentraciones submitogénicas de trombina o moléculas que activan la quinasa proteica C como se muestra en la Patente de EE.UU., Nos. 5.352.664 y 5.500.412. Los agonistas de NPAR se pueden identificar por esta activación o por su capacidad de competir con el enlace de trombina 125l con las células. Los derivados peptídicos de trombina son ejemplos del agonista receptor de trombina. Un derivado peptídico de trombina es un polipéptido con menos de alrededor de 50 aminoácidos, preferiblemente menos de alrededor de treinta y tres aminoácidos y tiene suficiente homología con el fragmento de trombina humana correspondiente a los aminoácidos de la protrombina 508-530 (Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val: SEQ ID NO: 3), de manera que el derivado peptídico de trombina posee por lo menos 25% de la actividad de TP508 en el NPAR, preferiblemente por lo menos 50%. Los derivados peptídicos de trombina descritos aquí tienen entre aproximadamente 14 y 23 aminoácidos, más preferiblemente entre aproximadamente 19 y 23 aminoácidos. Opcionalmente, los derivados peptídicos de trombina descritos aquí pueden tener amidas C-terminales y/o un extremo con terminación en N acilado.
Un "extremo con terminación en N acilado" es un extremo con terminación en N, en el que el nitrógeno del residuo aminoácido con terminación en N está acilado. Por ejemplo, los residuos aminoácidos terminales acilados tienen la fórmula: R3C(O)-N-H-CHRaC(O)-. R_{a} es una cadena lateral de aminoácidos y R3 es hidrógeno (-H) o un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, preferiblemente grupo metil (-CH_{3}). Un grupo acilo preferido es un grupo acetilo. Un "-H" en el extremo con terminación en N indica que el extremo con terminación en N es insustituido; y ninguna designación en el extremo con terminación en N indica que el terminal es acilado o insustituido.
Una "amida C-terminal" es una amida en el residuo aminoácido C-terminal en el que el ácido alfa carboxílico se sustituye por una amida. Por ejemplo, los residuos aminoácidos C-terminales amidados tienen la fórmula: -NH-CH(R_{a})C (O)-NR4R5. R_{a} es una cadena lateral de aminoácidos, y R4 y R5 son independientemente -H, un grupo alquilo C_{1}-C_{6} o, R4 y R5 son independientemente -H, un grupo alquilo C_{1}-C_{6} o, tomados juntos con el átomo de nitrógeno con el que se enlazan, un grupo heterocíclico como el piperidinil, morfolinil, tiomorfinil o pirolidinil. Preferiblemente, la amida C-terminal es una carboxamida (-C(O)NH_{2}). Tal como se usa aquí, "-NH_{2}" en el extremo C-terminal indica una carboxamida en el extremo C-terminal; "-OH" en el extremo C-terminal indica que el péptido tiene un extremo C-terminal libre, y ninguna designación en el extremo C-terminal indica que el péptido está amidado en el extremo C-terminal o tiene un extremo C-terminal libre.
Preferiblemente, el extremo con terminación en N de un derivado peptídico de trombina está libre (i.e., insustituido) y el extremo C-terminal está libre (i.e., insustituido) o amidado, preferiblemente una carboxamida (i.e.,
-C(O)NH_{2}).
Un derivado peptídico de trombina preferido para uso en la composición revelada está compuesto por la secuencia de aminoácidos siguiente: R1-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-R2: SEQ ID NO: 1. R1 es -H o R3-C(O)-; R2 es -OH o -NR4R5; R3 es -H o grupo alquilo C_{1}-C_{6} (preferiblemente -CH_{3}); y R4 y R5 son independientemente -H, un grupo alquilo C_{1}-C_{6} o, tomados juntos con el átomo de nitrógeno con el que se enlazan, un grupo heterocíclico no aromático tales como piperidinil, morfolinil, tiomorfinil o pirolidinil (preferiblemente, R4 y R5 son ambos -H). Preferiblemente R1 es -H y R2 es -NH_{2}; o R1 es -H y R2 es -OH.
Alternativamente, se puede utilizar en la formulación un fragmento con terminación en N truncado del derivado peptídico de trombina de SEQ ID NO: 1 que tiene por lo menos catorce aminoácidos o un fragmento C-terminal truncado del derivado peptídico de trombina de SEQ ID NO: 1 que tiene por lo menos dieciocho aminoácidos. Otra alternativa que se puede utilizar en la formulación es un fragmento con terminación en N truncado del derivado peptídico de trombina que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, R1-Asp-Asn-Met-Phe-Cys-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-Met-Lys-Ser-Pro-Phe-R2. R1 y R2 son según se describe arriba, teniendo por lo menos diecinueve aminoácidos o un fragmento C-terminal truncado del derivado peptídico de trombina de la SEQ ID NO: 5 que tiene veintitrés aminoácidos.
Un "fragmento C-terminal truncado" se refiere a un fragmento que queda después de eliminar un aminoácido o bloque de aminoácidos del extremo C-terminal. Un "fragmento con terminación en N truncado" se refiere a un fragmento que queda después de eliminar un aminoácido o bloque de aminoácidos del extremo con terminación en N. Es para entender que los términos "fragmento C-terminal truncado" y "fragmento con terminación en N truncado" abarcan la acilación en el extremo con terminación en N y/o amidación del extremo C-terminal, según se describe arriba. También se entiende que la invención incluye fragmentos C-terminales truncados y fragmentos con terminaciones en N con las modificaciones de residuos aminoácidos hechas en los derivados peptídicos originales de trombina antes de la truncación, según se describe arriba.
Otro derivado peptídico de trombina preferido que se describe aquí comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2: R1-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X1-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X2-Val-R2. X1 es Glu o Gln; X2 es Phe, Met, Leu, His o Val; y R1 y R2 son según se describe arriba. Alternativamente, se puede utilizar en la formulación un fragmento con terminación en N truncado del derivado peptídico de trombina de SEQ ID NO: 2 que tiene por lo menos catorce aminoácidos o un fragmento C-terminal truncado del derivado peptídico de trombina de SEQ ID NO: 2 que tiene por lo menos dieciocho aminoácidos. Otra alternativa es que se puede utilizar en la formulación un fragmento con terminación en N truncado del derivado peptídico de trombina que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, R1-Asp-Asn-Met-Phe-Cys-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X1-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X2-Val-Met-Lys-Ser-Pro-Phe-R2. X1 es Glu o Gln; X2 es Phe, Met, Leu, His o Val; y R1 y R2 son según se describe arriba teniendo por lo menos diecinueve aminoácidos o un fragmento C-terminal truncado del derivado peptídico de trombina de SEQ ID NO: 6 que tiene veintitrés aminoácidos.
Otro derivado peptídico de trombina preferido para uso en la composición revelada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3: Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val. Este péptido tiene preferiblemente una longitud de 23 aminoácidos.
Otro derivado peptídico de trombina preferido para uso en la composición revelada es TP508. TP508 es un ejemplo de un derivado peptídico de trombina con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4: H-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-NH_{2}. Otro ejemplo de un derivado peptídico de trombina tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7: H-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-OH ("deamida TP508").
En la formulación revelada se utiliza un derivado peptídico de trombina representado por la Fórmula Estructural (I), entre 14 y 23 aminoácidos de longitud:
(I),Asp-Ala-R
Donde R es un dominio conservado de la esterasa de serina. Las esterasas de serina, ej., tripsina, quimotripsina de trombina, etc., poseen una región que es altamente conservada. "Dominio conservado de la esterasa de serina" se refiere a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de una de estas regiones conservadas o es suficientemente homólogo a una de estas regiones conservadas de manera que el derivado peptídico de trombina retiene su capacidad de activación del NPAR. En una realización, la secuencia conservada de la esterasa de serina tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 8 (Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val) o un fragmento C-terminal truncado de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 8.
Otros ejemplos de derivados peptídicos de trombina que se pueden utilizar en la formulación revelada incluyen fragmentos con terminaciones en N truncados de TP508 (o deamida TP508), los fragmentos con terminaciones en N truncados que tienen por lo menos catorce aminoácidos o fragmentos C-terminales truncados de TP508 (o deamida TP508), los fragmentos C-terminales truncados que tienen por lo menos dieciocho aminoácidos. Opcionalmente, estos péptidos están amidados en el extremo C-terminal y son insustituidos en el extremo con terminación en N. En otra alternativa, opcionalmente, estos péptidos están amidados en el extremo C-terminal como -C(O)-NH_{2} y son insustituidos en el extremo con terminación en N.
Una "sustitución conservadora" es la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que tiene la misma carga electrónica neta y aproximadamente el mismo tamaño y la misma forma. Los aminoácidos con cadenas laterales de aminoácidos alifáticas o alifáticas sustituidas tienen aproximadamente el mismo tamaño cuando el número total de carbono y heteroátomos en sus cadenas laterales difieren en no más de alrededor de cuatro. Ellos tienen aproximadamente la misma forma cuando el número de ramificaciones en sus cadenas laterales difieren en no más de una. Se considera que los aminoácidos con grupos de fenil o fenil sustituidos en sus cadenas laterales tienen aproximadamente el mismo tamaño y la misma forma. Abajo aparecen cinco grupos de aminoácidos. La sustitución de un aminoácido en un polipéptido por otro aminoácido del mismo grupo tiene como resultado una sustitución conservadora:
Grupo I: glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina, cisteína y aminoácidos que no ocurren de forma natural con cadenas laterales alifáticas C1-C4 o cadenas laterales alifáticas sustituidas hidroxiladas C_{1}-C_{4} (cadena lineal o monoramificada).
Grupo II: ácido glutámico, ácido aspártico y aminoácidos que no ocurren de forma natural con cadenas laterales alifáticas de ácidos carboxílicas C_{1}-C_{4} sustituidos (sin ramificar o un punto de ramificación).
Grupo III: lisina, orinitina, arginina y aminoácidos que no ocurren de forma natural con cadenas laterales alifáticas sustituidas aminas o guanidina C_{1}-C_{4} (sin ramificar o un punto de ramificación).
Grupo IV: glutamina, asparagina y aminoácidos que no ocurren de forma natural con cadenas laterales alifáticas sustituidas de amidas C_{1}-C_{4} (sin ramificar o un punto de ramificación).
Grupo V: fenilalanina, fenilglicina, tirosina y triptófano.
Una "sustitución altamente conservadora" es la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que tiene el mismo grupo funcional en la cadena lateral y casi el mismo tamaño y la misma forma. Los aminoácidos con cadenas laterales alifáticas o de aminoácidos alifáticos sustituidos tienen casi el mismo tamaño cuando el número total de carbono y heteroátomos en sus cadenas laterales difieren en no más de dos. Tienen casi la misma forma cuando tienen el mismo número de ramificaciones en sus cadenas laterales. Ejemplos de sustituciones altamente conservadoras incluyen valina por leucina, treonina por serina, ácido aspártico por ácido glutámico y fenilglicina por fenilalanina. Ejemplos de sustituciones que no son altamente conservadoras incluyen la alanina por valina, alanina por serina y ácido aspártico por serina.
En una realización, la composición farmacéutica revelada comprende un derivado peptídico de trombina y un agente quelante o un compuesto que contiene tiol aceptable desde el punto de vista farmacéutico. Preferiblemente, la composición farmacéutica revelada comprende un derivado peptídico de trombina; el agente quelante; y el compuesto que contiene tiol aceptable desde el punto de vista farmacéutico. Como agente quelante de la invención se prefiere un agente quelante de cobre tal como se describe previamente.
Alternativamente, la composición farmacéutica revelada comprende un derivado peptídico de trombina y un agente quelante, preferiblemente un agente quelante de cobre y/o un compuesto que contiene tiol aceptable desde el punto de vista farmacéutico, y además comprende un antioxidante.
En una realización preferida, la composición farmacéutica revelada comprende un derivado peptídico de trombina y un agente quelante, preferiblemente un agente quelante de cobre, y un antioxidante. En una realización más preferida, la composición farmacéutica revelada comprende un derivado peptídico de trombina y un agente quelante, preferiblemente un agente quelante de cobre, y metionina. Preferiblemente, el agente quelante es EDTA.
Preferiblemente, la composición farmacéutica revelada se encuentra en un rango de pH entre aprox. 5 y aprox. 6, más preferiblemente, entre aprox. 5,5 y aprox. 6. En un ejemplo, la composición farmacéutica, que comprende un derivado peptídico de trombina y un agente quelante, preferiblemente un agente quelante de cobre, y un antioxidante, se encuentra en un rango de pH entre aprox. 5 y aprox. 6, más preferiblemente, entre aprox. 5,5 y aprox. 6. En esta composición, preferiblemente, el antioxidante es metionina.
Otra realización de la invención es el uso de la composición farmacéutica en la fabricación de un medicamento para activar el receptor de trombina no activado proteolíticamente en un sujeto.
Un "sujeto" es preferiblemente un humano pero también puede ser un animal que necesite tratamiento con un agonista de receptor de trombina, ej., animales de compañía (e.g., perros, gatos, etc), animales de granja (ej., vacas, cerdos, caballos, etc) y animales de laboratorio (ej., ratas, ratones, curieles, etc).
Sujetos "que necesitan tratamiento" con un agonista de receptor de trombina, son sujetos con enfermedades y/o condiciones que pueden tratarse con agonistas de receptor de trombina y derivados peptídicos de trombina para lograr un resultado terapéutico y/o profiláctico beneficioso. Un resultado beneficioso incluye una disminución en la severidad de los síntomas o retardo del comienzo de los síntomas, longevidad incrementada y/o resolución más rápida o más completa de la enfermedad o condición. Por ejemplo, un sujeto que necesita tratamiento requiere proliferación celular que implique condrocitos, angiogénesis, crecimiento óseo, reparación cardíaca, cicatrización de heridas, crecimiento o reparación de cartílago o inhibición de restenosis.
Se ha demostrado que los derivados peptídicos de trombina estimulan la proliferación de las células endoteliales, fibroblastos y queratinocitos (ver, ej., Patentes de E.U Nos. 5.500.412 y 5.352.664). Por tanto, los derivados peptídicos de trombina se pueden utilizar para promover la cicatrización en heridas agudas tales como, por ejemplo, quemaduras, heridas en la piel, heridas quirúrgicas y fracturas óseas. Además, se ha demostrado recientemente que los derivados peptídicos de trombina son particularmente efectivos en promover la cicatrización de heridas crónicas tales como úlceras diabéticas, úlceras venosas y llagas (ver, ej., WO 03/013569). También se ha demostrado que los derivados peptídicos de trombina estimulan el crecimiento o reparación de cartílago y el crecimiento de los condrocitos (ver, ej., WO 02/07748). Así, los derivados peptídicos de trombina se pueden utilizar para estimular el crecimiento o reparación de cartílago o el crecimiento y reparación de condrocitos en, por ejemplo pacientes con osteoartritis o lesiones en las articulaciones. Otros usos de los derivados peptídicos de trombina incluyen la estimulación del crecimiento óseo para promover la curación de fracturas simples, fracturas sin uniones, vacíos y huecos en el hueso e injertos óseos, evitando la restenosis en pacientes después de la angioplastia y promoviendo la regeneración de vasos sanguíneos en el tejido cardíaco (ver, ej., WO 02/005836, WO 02/004008, y US Pat Appl. Publ. No. 2002/0128202).
El crecimiento óseo inducido también puede ser beneficioso desde el punto de vista terapéutico en ciertos sitios dentro de un sujeto (referidos como sitios "ectópicos") donde normalmente no se encontraría tejido óseo, como el caso de un sitio que necesite un injerto óseo o fusión ósea. Las fusiones comúnmente se utilizan para tratar el dolor en la parte inferior de la espalda acoplando físicamente una o más vértebras a su vecina. El hueso que se crea con esa fusión se coloca en un sitio que normalmente no está ocupado por tejido óseo. El crecimiento óseo inducido en estos sitios ectópicos puede actuar como un "sustituto de injerto" mediante el cual el crecimiento óseo inducido entre las vértebras toma el lugar de un injerto y obvia la necesidad de una segunda operación para cosechar tejido óseo del procedimiento de injerto. La inducción del crecimiento óseo también es necesaria para tratar anomalías adquiridas y congénitas craneofaciales y otras del esqueleto y los dientes (ver ej., Glowacki et al., Lancet 1: 959 (1981)); realizar reconstrucciones dentales y periodontales donde se requiere la sustitución del hueso perdido o aumento óseo como en un hueso mandibular; y suplir la pérdida ósea alveolar provocada por enfermedad periodontal para retardar o prevenir la pérdida de los dientes (ver ej., Sigurdsson et al., J. Periodontol., 66: 511 (1995)).
La composición farmacéutica de la presente invención que comprende un derivado peptídico de trombina puede por tanto utilizarse en los tratamientos descritos arriba.
Una "cantidad eficaz" es la cantidad de un derivado peptídico de trombina en la composición farmacéutica de la presente invención que tiene como resultado la mejoría clínica de la condición que se está tratando con el derivado peptídico de trombina comparado con la ausencia del tratamiento. La cantidad de derivados peptídicos de trombina administrados dependerá del grado, severidad, y tipo de la enfermedad o condición, la cantidad de terapia deseada, y las características de liberación de la formulación farmacéutica. También dependerá de la salud, tamaño, peso, edad, sexo y tolerancia a las drogas del sujeto. Típicamente, el derivado peptídico de trombina se administra durante un período de tiempo suficiente para lograr le efecto terapéutico deseado. Para la indicación de reparación cardíaca, se administra típicamente entre aprox. 0,1 \muM a 10 \muM o más típicamente entre aprox. 50 a 250 \mug por una sola inyección del derivado peptídico de trombina al tejido dañado para el aumento satisfactorio en la tasa de reparación. Para la indicación de crecimiento o reparación de cartílago, típicamente se administra entre aprox. 0,1 \mug por una sola aplicación y aprox. 1 mg por una sola aplicación del derivado peptídico de trombina, preferiblemente entre aprox. 25 \mug y aprox. 100 \mug por 20 mm cúbicos. Para el tratamiento de úlcera crónica de la piel, se administra típicamente entre aprox. 0,1 \mug y aprox. 1 mg por una sola aplicación, preferiblemente entre aprox. 1 \mug y aprox. 100 \mug por una sola aplicación, del derivado peptídico de trombina. Particularmente, se administra de una a siete aplicaciones por semana del derivado peptídico de trombina para el tratamiento de úlcera crónica de la piel. Para la indicación de crecimiento óseo, se administra típicamente entre aprox. 1 \mug y aprox. 1 mg por día, preferiblemente entre aprox. 5 \mug y aproximadamente 100 \mug por día, del derivado peptídico de trombina.
En otra realización, la composición farmacéutica revelada además comprende un portador aceptable desde el punto de vista farmacéutico como parte de la composición farmacéutica. Los portadores farmacéuticos adecuados pueden contener ingredientes inertes que no inhiben la actividad biológica de un derivado peptídico de trombina y la función de un agente quelante, un compuesto que contiene tiol y un antioxidante. Los portadores deben ser biocompatibles, es decir, no tóxicos, no inflamatorios, no inmunogénicos y desprovistos de otras reacciones indeseables en el sitio de administración. Los portadores aceptables desde el punto de vista farmacéutico varían de acuerdo a la ruta de administración seleccionada y la indicación que se está tratando. Ejemplos de portadores aceptables desde el punto de vista farmacéutico incluyen, por ejemplo, salina, aerosoles, geles inertes comercialmente disponibles, o líquidos suplementados con albúmina, metilcelulosa o una matriz de colágeno. Se pueden utilizar técnicas de formulación farmacéutica estándar como las descritas en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA.
Las composiciones de la presente invención pueden ser soluciones, suspensiones, emulsiones, siropes, geles, ungüentos, lociones, cremas, pastas, masillas, extrusiones, micropartículas, cápsulas, tabletas, etc.
Comúnmente se utiliza una formulación en gel cuando el derivado peptídico de trombina se usa para promover la reparación cardíaca y la cicatrización de heridas. Los geles están formados por una base seleccionada de una base oleaginosa, agua, o una base emulsión-suspensión. La base oleaginosa contiene aceites fijos o hidrocarburos como petrolato blanco o aceite mineral, o una base absorbente, ej., compuesta por una sustancia o sustancias anhidras absorbentes, por ejemplo lanolina anhidra. La base emulsión-suspensión comprende una fase oleosa (fase interna) que típicamente contiene aceites fijos, hidrocarburos, etc, tales como ceras, petrolato, aceite mineral, etc, y una fase acuosa (fase continua) que contiene agua y cualquier sustancia soluble en agua como sales añadidas. Las dos fases se estabilizan con el uso de un agente emulsificante, por ejemplo, un agente surfactante como el lauril-sulfato sódico, coloides hidrófilos como las arcillas coloidales de acacia, beegum, etc. A la base se añade un agente gelificante que forma una matriz en la base, aumentando su viscosidad hasta una consistencia semisólida. Ejemplos de agentes gelificantes adecuados incluyen celulosa de hidroxipropilo, polímeros de ácido acrílico, polímeros de óxido de polietileno o copolímeros de oxido de etileno y propileno (ver Cao et al., J. Biomater. Sci 9:475 (1998) y Sims et al., Plast Reconstr.Surg. 98:_843 (1996)). Los geles Pluronic son copolímeros en bloque no tóxicos de óxido de etileno y óxido de propileno. Exhiben propiedades termoestabilizadoras que les permite existir como líquidos viscosos a temperatura ambiente, pero como geles a temperaturas corporales. Los ingredientes activos se añaden a la formulación a la concentración deseada en un punto que precede la adición del agente gelificante o puede mezclarse después del proceso de gelificación. Los geles para el tratamiento de cicatrización de heridas se pueden administrar en una administración local tópica. En el ejemplo 7 se describe la preparación de los geles.
Las formulaciones para una administración local tópica además de los geles incluyen ungüentos y cremas. Los ungüentos típicamente se preparan utilizando la base oleaginosa descrita previamente. Las cremas generalmente comprenden la base emulsión-suspensión descrita previamente. Después de formada la base, los ingredientes activos se añaden a la concentración deseada.
En otra realización preferida, las composiciones farmacéuticas reveladas son pelets liofilizados que se pueden reconstituir antes del uso. Los mismos se utilizan comúnmente para indicaciones como el crecimiento óseo y reparación cardíaca. Las composiciones liofilizadas comprenden opcionalmente un agente de relleno de cargas además de los otros ingredientes activos descritos previamente. Agentes de carga adecuados incluyen manitol, celulosa, sorbitol, dextrosa dextrana, polidextrosa, maltitol, xilitol, isomaltosa, eritritol, glicerol, etc. Las composiciones liofilizadas se pueden reconstituir para formar soluciones, y pueden contener sustancias auxiliares como agentes emulsificantes o humectantes, agentes tampones de pH, aditivos mejoradores de la viscosidad, preservantes, etc, en dependencia de la ruta de administración y la preparación deseadas.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención son típicamente formulaciones de liberación sostenida para indicaciones como el crecimiento óseo, crecimiento o reparación de cartílago y reparación cardíaca. Estas formulaciones pueden ofrecer la liberación continua del medicamento durante horas. Los polímeros se utilizan con frecuencia para crear las formulaciones de liberación sostenida. Ejemplos de polímeros incluyen poli-\alpha-hidroxi-ésteres como los homopolímeros y copolímeros de ácido poliláctico/ácido poliglicólico, (PLGA), polifosfacenos (PPHOS), polianhídridos y poli (fumaratos de propileno) (PPF).
Los homopolímeros y copolímeros de ácido poliláctico/ácido poliglicólico (PLGA) son muy bien conocidos en la técnica como vehículos de liberación sostenida. La tasa de liberación se puede ajustar por un artesano experto mediante la variación de la proporción ácido poliláctico:ácido poliglicólico y del peso molecular del polímero (ver Anderson, et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 28: 5 (1997)). La incorporación de polietilenglicol en el polímero como una mezcla para formar portadores de micropartículas permite la modificación adicional del perfil de liberación del ingrediente activo (ver Cleek et al., J. Control Release 48:259 (1997)). Las cerámicas como el fosfato de calcio y la hidroxiapatita también pueden ser incorporadas en la formulación para mejorar las cualidades mecánicas. Las micropartículas de PLGA también pueden mezclarse con geles Pluronic o colágeno para prevenir la agregación y hacer que las micropartículas sean convenientes para la inyección directa. La preparación de microesferas PLGA de TP508 se describe detalladamente en WO 03/061690.
Los polímeros PPHOS contienen nitrógeno y fósforo alternantes sin carbono en la cadena principal del polímero, según se muestra en la Fórmula Estructural (I):
1
Las propiedades del polímero pueden ajustarse con la variación conveniente de los grupos laterales R y R' que están enlazados a la cadena principal del polímero. Por ejemplo, la degradación de y liberación del medicamento por PPHOS puede ser controlada variando la cantidad de grupos laterales hidrolíticamente inestables. Con mayor incorporación de PPHOS sustituidos con imidazolil o etilglicol, por ejemplo, se observa un aumento en el índice de degradación (ver Laurencin et al., J Biomed Mater. Res. 27:963 (1993)), incrementando así el índice de liberación del medicamento.
Los polianhídridos, mostrados en la Fórmula Estructural (II), han definido bien la degradación y las características de liberación que pueden controlarse por la inclusión de cantidades variables de monómeros hidrofóbicos o hidrofílicos como el ácido sebácico y 1,3-bis(p-carboxifenoxi) propano (ver Leong et al., J. Biomed. Mater. Res. 19:941 (1985)). Para mejorar la fuerza mecánica, los anhídridos están a menudo copolimerizados con imidas para formar polianhidridos-co-imidas. Ejemplos de polianhidrido-co-imidas que son convenientes para aplicaciones ortopédicas son los copolímeros poli(trimelitilimido-glicina-co-1,6-bis(carboxifenoxi)hexano y piromeliti-imido-alanina:1,6-bis (p-carboxifenoxi) hexano.
2
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse por cualquier ruta adecuada, localmente o sistemáticamente. Típicamente, la ruta de administración depende del tipo de formulación usada y la indicación tratada. La administración tópica se usa comúnmente para tratar heridas. Para la administración tópica, las composiciones farmacéuticas son típicamente cremas, geles, ungüentos o aerosoles, como se describe previamente en detalle. Para ciertas indicaciones como la estimulación de crecimiento óseo, reparación o crecimiento de cartílago y reparación cardíaca, es ventajoso inyectar o implantar la composición farmacéutica de la presente invención directamente al sitio de tratamiento.
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Para las indicaciones con necesidad de reparación cardíaca, crecimiento o reparación de cartílago y crecimiento óseo, las composiciones farmacéuticas de la invención son formas típicamente inyectables. Por ejemplo, las composiciones inyectables reveladas pueden ser inyectadas directamente al sitio con necesidad de crecimiento óseo y pueden ser usadas convenientemente para llenar vacíos y unir huesos sin necesidad de cirugía invasiva. "Inyectable" significa que el material puede inyectarse con la jeringuilla a través de una aguja estándar usada para inyectar soluciones, pastas o geles. Las composiciones inyectables pueden ser administradas intravenosa o directamente en el sitio con necesidad de tratamiento. Las composiciones inyectables pueden incluir además salina fisiológica, salina bacteriostática (salina que contiene aproximadamente 0,9% mg/ml de bencil alcohol), salina de fosfato tamponada, solución de Hank, lactato de Ringer's, o líquidos suplementados con albúmina, metil celulosa, o ácido hialurónico. Las composiciones inyectables también pueden incluir polímeros de (óxido de polietileno) o copolímeros de óxido de etileno y propileno. Los geles Pluronic son ejemplos de tales polímeros, y exponen propiedades termoestabilizadoras que les permite existir como líquidos viscosos a temperatura ambiente, pero como geles a temperatura corporal, como se discute previamente. Otras composiciones para las composiciones para dispensar inyectables incluyen las soluciones de copolímeros de poli(fumarato de propileno) (PPF) y las pastas de cerámicas de fosfato de calcio (ver Schmitz et al., J Oral Maxillofacial Surgery 57:1122 (1999)).
Las composiciones farmacéuticas implantables son beneficiosas especialmente para indicaciones como la estimulación de crecimiento óseo, crecimiento o reparación de cartílagos y reparación cardíaca. "La implantación" o "administración en un sitio" significa en la suficiente proximidad al sitio con necesidad de tratamiento de modo que ocurra la curación deseada (p. ej, un resultado clínico mejorado de la condición tratada en presencia del medicamento comparado con su ausencia) en el sitio cuando el derivado peptídico de trombina es liberado desde la composición farmacéutica. Se entiende que una composición farmacéutica implantable también puede ser una formulación de liberación sostenida o una formulación inyectable descrita anteriormente. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas implantables también pueden comprender a un portador de liberación sostenida para lograr medicaciones lentas y continuadas en el sitio de implantación.
Las composiciones farmacéuticas implantables pueden moldearse como se desee antes de la cirugía o moldearse por el médico o técnico durante la cirugía. Se prefiere moldear la matriz para cubrir un defecto del tejido y lograr la forma deseada del nuevo tejido. En caso de reparación ósea de un defecto sin unión, por ejemplo, es deseable usar dimensiones que cubran la no-unión. En procedimientos de formación ósea, el material es lentamente absorbido por el cuerpo y es sustituido por el hueso en forma de o muy cercano a la forma del implante.
Alternativamente, la composición farmacéutica implantable puede ser parcialmente encerrada en una estructura física de apoyo como una malla, matriz de alambre, jaula de acero inoxidable, jaula de fusión intercorporal enhebrada, etc., antes de administrar al sitio, por ejemplo, en la necesidad de crecimiento óseo.
Incluso, en otra alternativa, las composiciones farmacéuticas reveladas especialmente para estimular el crecimiento óseo y reparación o crecimiento de cartílago ventajosamente comprenden a portadores que incluyen matrices porosas que pueden servir entonces como andamiaje para crecimiento óseo y de tejido sobre el cual las células progenitoras de hueso y las células osteogénicas pueden emigrar y atarse. Se dice que tales portadores son osteoconductivos. Para ciertas aplicaciones, el portador debe tener la suficiente fuerza mecánica para mantener su estructura tridimensional y ayudar a apoyar la inmovilización de los segmentos de hueso o tejido unidos o injertados juntos. Ejemplos de portadores osteoconductivos convenientes incluyen colágeno (p. ej, colágeno bovino), fibrina, cerámica de fosfato de calcio (p. ej, hidroxiapatita y fosfato tricálcico), sulfato de calcio, hueso alogénico extraído de guanidina y combinaciones por el estilo. Varios portadores convenientes están comercialmente disponibles, como COLLAGRAFT ® (Cohension Technologies, Inc, Palo Alto, CA), que es una mezcla de hidroxiapatita, fosfato tricálcico y colágeno fibrilar, y PRO OSTEON 500 ^{TM} (Interpore Cross International, Irvine, CA), que es una biomatriz de hidroxiapatita formada por la conversión del carbonato de calcio de coral marino en hidroxiapatita cristalina. Las descripciones de polímeros biodegradables sintéticos que pueden servir como portadores osteoconductivos con características de liberación sostenida, pueden encontrarse en Behravesh et al., Clinical Orthopaedics 367:S118 (1999) y Lichun et al., Polymeric Delivery Vehicles for Bone Growth Factors en "Controlled Drug Delivery - Designing Technologies for the Future" Park and Mrsny eds., American Chemical Society, Washington, DC (2000). Ejemplos de los polímeros biodegradables incluyen ésteres poli \alpha-hidroxi como los homopolímeros y copolímeros de ácido poliláctico/poliglicólico, polifosfacenos (PPHOS), polianhídridos y poli(fumaratos de propileno), que arriba se describen
detalladamente.
Alternativamente, las composiciones farmacéuticas pueden implantarse al sitio en forma de micropartículas o microesferas. Por ejemplo, las micropartículas se colocan en contacto o en cercana proximidad al sitio con necesidad de reparación cardíaca, crecimiento óseo, o reparación de cartílago, exponiendo quirúrgicamente el sitio y aplicando las micropartículas en o en cercana proximidad al sitio, pintando, pipeteando, rociando, inyectando, etc. Las micropartículas también pueden entregarse al sitio por endoscopía o por laparoscopía. Los poli(fumaratos de propileno) (PPF) son portadores implantables biocompatibles muy deseables para el uso en la reparación de defectos óseos porque constituyen un material biodegradable, inyectable, polimerizable in situ. PPF, combinado con un vinilo monómero (N-vinil pirrolidinona) y un iniciador (peróxido de benzoílo), forma una solución inyectable que se puede polimerizar in situ. Está particularmente preparado para rellenar defectos del esqueleto de una amplia variedad de tamaños y formas (ver Suggs et al., Macromolecules 30:4318 (1997), Peter et al., J. Biomater. Sci. Poly,. Ed. 10:363 (1999) y Yaszemski et al., Tissue Eng. 1:41 (1995)). La adición de componentes de fase sólida como \beta-fosfato tricálcico y cloruro de sodio puede mejorar las propiedades mecánicas de los polímeros de PPF (ver Peter et al., J. Biomed. Mater. Res. 44: 314 (1999)). Los métodos para encapsular las composiciones (tales como en un revestimiento de gelatina dura o ciclodextrano) se conocen en la técnica (Baker, et al., "Controlled Release of Biological Active Agents", John Wiley y Sons, 1986).
Las enfermedades y condiciones, tratables con la composición farmacéutica revelada que comprende un derivado peptídico de trombina, por ejemplo, heridas y angioplastia, están a menudo acompañadas de síntomas y dolencias como dolor e infección. En ciertos ejemplos, puede ser ventajoso coadministrar uno o más agentes adicionales farmacológicamente activos junto con la composición farmacéutica de la presente invención para tratar tales cuestiones. Por ejemplo, tratar el dolor y la inflamación puede requerir la coadministración con agente analgésico o anti-inflamatorio. Tratar la infección puede requerir la coadministración con agentes antimicrobianos, antibióticos o desinfectantes.
Los derivados peptídicos de trombina pueden ser sintetizados por método de síntesis del péptido de fase sólida (p. ej, BOC o FMOC), por síntesis de la fase de solución, o por otras técnicas convenientes incluyendo combinaciones de los métodos anteriores. Los métodos BOC y FMOC, que están establecidos y son utilizados ampliamente, se describen en Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 88:2149 (1963); Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, C.H. Li, Ed., Academic Press, 1983, pp. 48-267; y Barany and Merrifield, en The Peptides, E. Gross y J. Meienhofer, Eds., Academic Press, New York, 1980, pp. 3-285. Los métodos de la síntesis del péptido de fase sólida se describen en Merrifield, R.B., Science, 232: 341 (1986); Carpino, L.A. y Han, G.Y., J. Org. Chem., 37: 3404 (1972); y Gauspohl, H. et al., Synthesis, 5: 315 (1992)).
La invención se ilustra en los siguientes ejemplos que no se pretende sean limitados de ninguna manera.
Ejemplificacion Ejemplo 1 Experimento de Control: Estabilidad de TP508 en Ausencia de un Inhibidor de Dimerización
TP508 fue disuelto en 150 mM salina estéril para dar una concentración final de 5 mg/ml. Las muestras (100 \mul) fueron transferidas a un tubo Cryo estéril de 2 ml y almacenadas, protegidas de la luz, a 4ºC utilizando la columna C18 (Alltech Adsorbosphere XL columna C18 90A 5 Pm 250 x 4,6 mm) en puntos de tiempo definidos. Se realizó un método de gradiente en el que fase móvil B se incrementa de 20% a 50% desde 1-15 minutos (fase móvil A - TFA al 0,1% en agua; fase móvil B - 0,1% TFA in acetonitrilo) y el volumen de inyección es 10 \mul. TP508, el dímero de TP508 y los pico no identificados se identificaron y se cuantificaron a partir del área de cromatograma.
TABLA 1 Estabilidad de TP508 en Ausencia de un Inhibidor de Dimerización a 4ºC
3
Ejemplo 2 Estabilidad de TP508 en Presencia de un Agente Quelante
TP508 fue disuelto a 1 mg/ml en soluciones tamponadas o no tamponadas, con o sin EDTA. Las soluciones fueron incubadas a temperatura ambiente y las muestras tomadas a intervalos para análisis por HPLC. La formación porcentaje de dímero se calculó a partir de los cromatogramas resultantes. Las soluciones siguientes fueron utilizadas para disolver TP508 (1 mg/ml):
PBS, pH 7.4 (rociada con N2 durante 30 min)
10 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7,0
10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 7,0
Se colocó 1 ml de cada solución en un tubo microcentrífuga de polipropileno de 1.5 ml, y se dejó en reposo a temperatura ambiente. A intervalos definidos, se tomaron 100 uL para análisis por el método HPLC mencionado en el Ejemplo 1. El porcentaje de dímeros formado con el tiempo se resume en la Tabla 2.
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TABLA 2 Porcentaje de Dímeros
4
En fosfato salino tamponado (PBS) o Hepes/NaCL, el índice de formación de dímeros fue muy rápido. Como se muestra, la adición de 5 mM EDTA redujo en gran medida el índice de formación de dímeros. Estos resultados sugieren que la formación de dímeros puede ser promovida por la presencia de cantidades traza de iones divalentes ya que la formación de dímeros se evita o reduce por EDTA.
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Ejemplo 3 Estabilidad de TP508 en Presencia de un Inhibidor de Dimerización, Tioglicerol, EDTA o la combinación de ambos
Las muestras preparadas como se describe en la Tabla 3 típicamente contenían 50 ug/ml de TP508 disuelto en geles Pluronic. Luego las mismas fueron almacenadas con el tiempo a 4ºC. Para el análisis, las muestras fueron diluidas diez veces con 0,1% TFA y analizadas por HPLC. Típicamente, 50 uL de la muestra diluida fue analizado. La cuantificación de TP508 se realizó por un estándar externo. Un estándar TP508 dual se analizó antes del análisis de la muestra. Se analizó una muestra de cada grupo de la Tabla 3.
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TABLA 3 Composición de las Muestras
5
Tiempo 0
Como se muestra en la Figura 1, se observó una concentración de dímero muy baja en el tiempo 0 para todas las muestras preparadas como se describe en la Tabla 3. Los picos desconocidos que comprenden aproximadamente el 20% y 6% de la muestra total se observaron en las muestras que contienen tioglicerol (Grupo T) y tioglicerol/EDTA (Grupo TE), respectivamente. Estos picos desconocidos tuvieron un tiempo de retención ligeramente más prolongado que el de TP508, lo que sugiere que ellos pudieran corresponder a un aducto de TP508 y tioglicerol ya que la cantidad de la formación de aducto es proporcional al contenido de tioglicerol en las dos muestras.
Almacenamiento durante dos semanas a 4ºC
Las muestras almacenadas durante dos semanas a 4ºC mostraron esencialmente la misma concentración de dímeros que la del tiempo 0, según se muestra en la Figura 2. En la muestra que contiene EDTA (Grupo E) o EDTA c/N2 (Grupo EN), más del 90% de TP508 todavía retenía su forma monomérica.
Almacenamiento durante dos meses a 4ºC
Como se muestra en la Figura 3, todas las muestras que contienen un inhibidor de dimerización (Grupo T, E, TE y EN) mostraron estabilidad incrementada de TT508 comparado con las muestras sin un inhibidor de dimerización. La muestra que contiene tioglicerol y EDTA (Grupo TE) mostró esencialmente la misma cantidad de dímeros que la del tiempo 0, lo que indica que TP508 retuvo su forma monomérica esencialmente libre de dímeros incluso después de dos meses de almacenamiento en presencia de tioglicerol y EDTA con sólo 10% del aducto TP508-tioglicerol. Aproximadamente el 80% de TP508 permaneció como monómero en la muestra que contenía EDTA (Grupo E) o EDTA c/N2 (Grupo EN). Tener manta de nitrógeno durante la preparación de geles no parece afectar la dimerización. La muestra que contiene tioglicerol (Grupo T) mostró que aproximadamente el 60% de TP508 retuvo su forma monomérica y aproximadamente el 40% restante de TP508 formó un aducto TP508-tioglicerol. Estos resultados demuestran que EDTA y las sustancias químicas que contienen tio- se pueden utilizar para estabilizar TP508 de la dimerización.
Ejemplo 4 Estabilidad de TP508 en Presencia de EDTA y un Antioxidante
Los siguientes antioxidantes fueron evaluados por su capacidad de inhibir la dimerización de TP508 en combinación con EDTA. El % normal utilizado en la formulación se muestra en la Tabla 4:
TABLA 4 Composiciones de las Muestras
6
Se preparó y utilizó una base de gel (17% Pluronic, 0,0004% EDTA y citrato tamponado, pH 5.0 con preservantes). Cada tipo de antioxidante (% bajo o alto) se añadió a la concentración deseada. Luego, TP508 fue añadido al gel para dar una concentración de 50 \mug/ml. Las muestras se incubaron a 4ºC durante 3 semanas. Luego se diluyeron 100 \mul de la muestra con 900 \mul de TFA al 0,1% y se analizaron por HPLC según el método descrito en el Ejemplo 1. Se analizó un estándar antes del análisis de la muestra. También se analizó un gel blanco con preservantes y antioxidantes.
Los resultados se muestran abajo en la Tabla 5. En resumen, TP508 fue muy estable a una concentración alta de antioxidantes a 4ºC durante tres semanas. A excepción del ácido ascórbico, las concentraciones bajas de antioxidantes fueron también eficaces.
TABLA 5 Concentración de Top508 (\mug/ml) con el Tiempo
7
Ejemplo 5 Estabilidad de TP508 en Presencia de un Agente Quelante (EDTA) y un Antioxidante con Varios Rangos de pH
Se evaluaron las preparaciones de muestras tamponadas con 10 \muM de EDTA a pH diferente y a pH 5,5 con adición de antioxidantes para valorar su capacidad de inhibir la dimerización de TP508 y la formación de otras formas moleculares. Las muestras evaluadas a varios pH y el por ciento de oxidante se muestran en la Tabla 6.
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TABLA 6 Composiciones de las Muestras de Ensayo
8 
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Se preparó TP508 en citrato tamponado 50 mM desde un pH 4.5 hasta 6,0 con 10 mM de EDTA. Las muestras se filtraron, se esterilizaron y se incubaron a temperatura ambiente alejadas de cualquier fuente de luz. A puntos de tiempo indicados, cada muestra fue analizada por HPLC para determinar la concentración de monómero TP508 (Tabla 7), porcentaje de dímero (Tabla 8), porcentaje de aducto (Tabla 9), y entidades moleculares desconocidas (Tabla 10).
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TABLA 7 Concentración de TP508 ug/ml) desde Tiempo 0 hasta el Día 28
9 
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TABLA 8 % de Dímeros desde el tiempo 0 al día 28
10
TABLA 9 Otros % + % del pico de aducto desde el tiempo 0 hasta el día 28
11 
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TABLA 10 Índice de formación de dímero y formación desconocida
12
Los resultados muestran que todos los antioxidantes evaluados en este estudio previenen o reducen la dimerización de TP508 como se muestra en la Tabla 8 con relación a lo que se forma en tampones de citrato con un pH que oscila entre 4.5 y 6,0. Los resultados de la Tabla 9 muestran que la metionina es incapaz de crear aductos de TP508 debido a la carencia de un grupo tiol. Estos resultados sugieren que el mejor pH para inhibir la formación de dímeros de TP508 fue a pH 6,0 de este experimento sin ningún antioxidante. Con la adición de 0,5% (p/v) de metionina a pH 5,5, se obtuvo el índice más lento (0.0183) mostrado en la Tabla 10. El índice de formación desconocida es inversamente proporcional al pH de 4.5 a 6,0, lo que indica que TP508 es propenso a la hidrólisis ácida en este sistema tamponado. También, en este experimento, la metionina no previno o causó la formación desconocida. En resumen la metionina parece ser el mejor antioxidante para prevenir o reducir la dimerización de TP508 sin formar aductos TP508 y el índice más lento de la formación pico desconocida estuvo a pH 6,0 en este experimento.
Ejemplo 6 Efecto de Agentes Quelantes Divalentes sobre la Dimerización de TP508
Los quelantes divalentes, ácido dietilen-triamino-penta-acético (DTPA) y ácido bato-fenantrolina disulfónico
(BPADA), que se conocen por la quelación de un ión de cobre, se evaluaron para conocer su capacidad de inhibir la formación del dímero TP508.
Condiciones
A. 50 mM acetato/ 100 mM NaCl, pH 5.4
B. 50 mM acetato/ 100 mM NaCl, pH 5.4 con 10 uM DTPA
C. 50 mM acetato/ 100 mM NaCl, pH 5.4 con 10 uM BPADA
Procedimientos
TP508 (10 ug/ml) se incubó con o sin agentes quelantes en tubos de centrífuga de polipropileno a temperaturas ambientes y se analizaron en los puntos de tiempo indicados mediante electrofóresis capilar para monitorear cualquier formación de dímeros.
Resultados 
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TABLA 11 Porciento de dímero de la Muestra A: 50 mM acetato/100 mM NaCl, pH 5,4
13 
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TABLA 12 Porciento de dímero de la Muestra B: 50 mM acetato/100 mM NaCl, pH 5. con 10 uM DTPA
14 
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TABLA 13 Porciento de dímeros de la Muestra C: 50 mM acetato/100 mM NaCl, pH 5.4 con 10 uM BPADA
15 
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Estos resultados muestran que los agentes quelantes además de EDTA también pueden estabilizar a TP508 para evitar o reducir la formación de dímeros.
Ejemplo 7 Preparación de TP508 en Geles Pluronic
Se añadió TP508 (3,60 mg., Bachem Fmoc) a geles Pluronic (72 ml), teniendo como resultado una concentración de 50 ug/ml en un beaker de cristal de 100 ml con una barra de agitación magnética. Los geles se removieron a 4ºC durante 1 hora para facilitar la mezcla completa. Para la Muestra D, los geles fueron removidos bajo una atmósfera de nitrógeno usando un manta de gas de nitrógeno. Luego los geles se llenaron por el borde de un bulbo de polipropileno de 1 ml. El frasco fue cubierto con una tapa rayada de Teflón para evitar la introducción de cualquier burbuja de aire en los geles. Las muestras se almacenaron a 4ºC o en la gaveta (25ºC) lejos de la luz.
En una formulación comercial, TP508 podría añadirse a un gel completamente formulado o a una fase intermedia que contiene estabilizadores apropiados como se describe en el Ejemplo 3, Tabla 3.
Mientras esta invención se ha mostrado en particular y descrito con referencias a expresiones preferidas, se entenderá por aquellos expertos en la técnica, que se pueden realizar varios cambios de forma y detalles sin apartarse del alcance de la invención abarcado por las reivindicaciones añadidas.
<110> The Board of Regents, El Sistema de la Universidad de Texas
\hskip1cm
Hobson, David W._ 
\hskip1cm
Crowther, Roger S._ 
\hskip1cm
Carney, Darrel H. 
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA DE LOS DERIVADOS PEPTIDICOS DE TROMBINA
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> 3033.1009-004
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/533,730
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2003-12-31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Alanina en la posición 1 está opcionalmente N-acilada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Valina en la posición 23 está opcionalmente C-aminada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Gly Tyr Lys Pro Asp Glu Gly Lys Arg Gly Asp Ala Cys Glu Gly}
\sac{Asp Ser Gly Gly Pro Phe Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Alanina en la posición 1 está opcionalmente N-acilada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Glu o Gln
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa-Phe, Met, Leu, His o Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Valina en la posición 23 está opcionalmente C-aminada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Gly Tyr Lys Pro Asp Glu Gly Lys Arg Gly Asp Ala Cys Xaa Gly}
\sac{Asp Ser Gly Gly Pro Xaa Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento de Trombina Humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Gly Tyr Lys Pro Asp Glu Gly Lys Arg Gly Asp Ala Cys Glu Gly}
\sac{Asp Ser Gly Gly Pro Phe Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Alanina es insustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Valina en la posición 23 está amidada con NH_{2}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Gly Tyr Lys Pro Asp Glu Gly Lys Arg Gly Asp Ala Cys Glu Gly}
\sac{Asp Ser Gly Gly Pro Phe Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El ácido aspártico en la posición 1 está opcionalmente N-acilado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fenilalanina en la posición 33 está opcionalmente C-amidada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Lys Pro Asp Glu Gly Lys Arg Gly}
\sac{Asp Ala Cys Glu Gly Asp Ser Gly Gly Pro Phe Val Met Lys Ser Pro}
\sac{Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El ácido aspártico en la posición1 está opcionalmente N-acilado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Glu o Gln
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Phe, Met, Leu, His o Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fenilalanina en la posición 33 está opcionalmente C-amidada
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Lys Pro Asp Glu Gly Lys Arg Gly}
\sac{Asp Ala Cys Glu Gly Asp Ser Gly Gly Pro Phe Val Met Lys Ser Pro}
\sac{Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Alanina en al posición 1 está insustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Valina en la posición 23 está insustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Gly Tyr Lys Pro Asp Glu Gly Lys Arg Gly Asp Ala Cys Glu Gly}
\sac{Asp Ser Gly Gly Pro Phe Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento de secuencia conservada de esterasa de serina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Glu Gly Asp Ser Gly Gly Pro Phe Val}

Claims (30)

1. Una composición farmacéutica que comprende:
a)
un derivado peptídico de trombina con una longitud de 14 a 23 aminoácidos y que comprende la secuencia de aminoácidos Asp-Ala-R, en la que R es el dominio conservado de la esterasa de la serina; y
b)
un agente quelante y/o un compuesto que contiene tiol aceptable desde el punto de vista farmacéutico.
2. La composición farmacéutica según la reivindicación 1, que además comprende un antioxidante.
3. La composición farmacéutica según la reivindicación 1, donde el agente quelante es un agente quelante de cobre.
4. La composición farmacéutica según la reivindicación 3, donde el agente quelante de cobre se selecciona entre un grupo que consta de ácido dietilen-triamino-penta-acético (DTPA) y ácido batofenantrolina-disulfónico (BPADA).
5. La composición farmacéutica según la reivindicación 3, donde el agente quelante de cobre se selecciona entre un grupo que consta de ácido etilen-diamino-tetra-acético (EDTA), penicilamina, trientina, N,N'-dietil-ditio-carbamato (DDC), 2,3,2'-tetramina (2,3,2'-tet), neocuproína, N,N,N',N'-tetrakis(2-piridil-metil)etilen-diamina (TPEN), 1,10-fenantrolina (PHE), tetraetilen-pentamina, trietilen-tetramina y tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP).
6. La composición farmacéutica según la reivindicación 1, donde la composición farmacéutica comprende un compuesto que contiene un tiol aceptable desde el punto de vista farmacéutico seleccionado entre un grupo que consta de tioglicerol, mercaptoetanol, tioglicol, tiodiglicol, cisteína, tioglucosa, ditiotreitol (DTT), y ditio-bis-maleímido-etano (DTME).
7. La composición farmacéutica según la reivindicación 2, donde el antioxidante se selecciona entre un grupo que consta de tocoferol, cisteína, metionina, glutatión, tocotrienol, dimetil-glicina, betaína, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, turmerin, vitamina E, ácido ascórbico, palmitato de ascorbilo y ácido tioglicólico
8. La composición farmacéutica según la reivindicación 1 que comprende un agente quelante de cobre y un compuesto que contiene un tiol aceptable desde el punto de vista farmacéutico.
9. La composición farmacéutica según la reivindicación 2, donde el compuesto comprende un agente quelante de cobre y un antioxidante.
10. La composición farmacéutica según la reivindicación 9, donde el antioxidante es la metionina.
11. La composición farmacéutica según la reivindicación 1, donde el derivado peptídico de trombina es:
a)
R1-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-!Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-R2 (SEQ ID NO: 1), donde:
R1 es -H o R3-C(O)-;
R2 es -OH o -NR4R5;
R3 es -H o un grupo alquilo C_{1}-C_{6}; y
R4 y R5 son independientemente -H, un grupo alquilo C_{1}-C_{6} o, tomados juntos con el átomo de nitrógeno con el que se enlazan, un grupo heterocíclico no aromático;
b)
un fragmento con terminación en N truncado de a) que tiene por lo menos catorce aminoácidos; o
c)
un fragmento C-terminal truncado de a) que tiene por lo menos dieciocho aminoácidos.
12. La composición farmacéutica según la reivindicación 1, donde el derivado peptídico de trombina es:
a)
R1-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X1-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X2-Val-R2 (SEQ ID NO: 2), donde:
X1 es Glu o Gln;
X2 es Phe, Met, Leu, His, o Val;
R1 es -H o R3-C(O)-;
R2 es -OH o -NR4R5;
R3 es -H o un grupo alquilo C_{1}-C_{6}; y
R4 y R5 son independientemente -H, un grupo alquilo C_{1}-C_{6} o, tomados junto con el átomo de nitrógeno con el que se enlazan, un grupo heterocíclico no aromático;
b)
un fragmento con terminación en N truncado de a) que tiene por lo menos catorce aminoácidos; o
c)
un fragmento C-terminal truncado de a) que tiene por lo menos dieciocho aminoácidos.
13. La composición farmacéutica según la reivindicación 1, donde el derivado peptídico de trombina es un polipéptido de 23 aminoácidos compuesto por Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val (SEQ ID NO: 3).
14. La composición farmacéutica según la reivindicación 1, donde el derivado peptídico de trombina es H-Ala-Gly-Tyr-Lis-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-NH_{2}
(SEQ ID NO: 4).
15. La composición farmacéutica según la reivindicación 14, donde la composición comprende un agente quelante y un antioxidante.
16. La composición farmacéutica según la reivindicación 15, donde el antioxidante es metionina.
17. La composición farmacéutica según la reivindicación 1, donde el derivado peptídico de trombina es un fragmento con terminación en N truncado que tiene por lo menos catorce aminoácidos de, o un fragmento C-terminal truncado que tiene por lo menos dieciocho aminoácidos de, H-Ala-my-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-NH_{2} (SEQ ID NO: 4), opcionalmente amidado al extremo C-terminal en forma de C(O)-NH_{2}.
18. La composición farmacéutica según la reivindicación 1, que se selecciona entre el grupo que consta de una tableta; una cápsula; una formulación de micropartículas; una solución; una suspensión o elixir, una formulación a liberación sostenida, una formulación inyectable; una formulación implantable y una formulación tópica.
19. Uso de la composición farmacéutica de la reivindicación 1 en la fabricación de un medicamento para activar el receptor de trombina no activado proteolíticamente en un sujeto.
20. Uso según la reivindicación 19, donde el medicamento es para promover el crecimiento o reparación del cartílago.
21. Uso según la reivindicación 19, donde el medicamento se utiliza para tratar a un sujeto con necesidad de crecimiento óseo.
22. Uso según la reivindicación 19, donde el medicamento se utiliza para promover la cicatrización de heridas.
23. Uso según la reivindicación 22, donde la herida es una herida crónica.
24. Uso según la reivindicación 19, donde el medicamento se utiliza para promover la reparación cardíaca o inhibir la restenosis.
25. Uso de una composición farmacéutica, donde la composición farmacéutica es un gel, que comprende:
a)
H-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-NH_{2} (SEQ ID NO. 4);
b)
un agente quelante; y
c)
un antioxidante en la fabricación de un medicamento para activar el receptor de trombina no activado proteolíticamente en un sujeto.
26. Uso según la reivindicación 25, donde el medicamento se utiliza para promover el crecimiento o reparación del cartílago.
27. Uso según la reivindicación 25, donde el medicamento se utiliza para tratar a un sujeto con necesidad de crecimiento óseo.
28. Uso según la reivindicación 25, donde el medicamento se utiliza para promover la cicatrización de heridas.
29. Uso según la reivindicación 28, donde la herida es una herida crónica.
30. Uso según la reivindicación 25, donde el medicamento se utiliza para promover la reparación cardíaca o inhibir la restenosis.
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