JP2010504336A - 血管内皮機能不全を治療する方法 - Google Patents

Abstract

内皮機能不全（ＥＤ）は、多数の疾患および障害と関連している。非タンパク質分解的に活性化されたトロンビン受容体のアゴニストは、ＥＤまたはＥＤ関連の疾患および障害を治療する方法に使用することができる。一つの実施形態において、本発明は、治療を必要とする対象における部位で内皮機能不全を治療する方法に関し、この方法は、対象に１以上のＮＰＡＲアゴニスト、１以上の血管新生増殖因子を含む組み合わせを治療有効量で投与することを含み、ここで、上記部位は、血管形成により損傷を受けた動脈、慢性皮膚潰瘍、骨誘導を必要とする部位、心臓血管再開通を必要とする部位ではない。

Description

（関連出願）
本願は、２００６年９月２２日に出願された米国仮特許出願第６０／８４６，４１８号、２００６年９月２８日に出願された米国仮特許出願第６０／８４８，００４号、２００７年４月１０日に出願された米国仮特許出願第６０／９２２，６４６号の利益を請求する。これらの米国仮特許出願の全体の教示は、本明細書中に参考として援用される。

（発明の背景）
血管内皮機能不全（ＥＤ）は、加齢の共通の作用であり、高血圧、冠動脈疾患、脳卒中、脳血管疾患、末梢血管疾患、糖尿病、勃起機能不全、アテローム性動脈硬化症、喘息、関節リウマチ、肺高血圧症、高ホモシステイン血症、鎌状赤血球病、子癇前症、慢性腎機能不全、敗血症、および多臓器障害を含む多くの疾患に関連している。損傷もしくは虚血に応答して組織を修復しようとするかまたは治療的介入に応答しようとする組織自体の能力は、ＥＤのために非常に減退されるように見える。

内皮機能不全は、一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）発現の減少、細胞内シグナル伝達事象をブロックする経路の活性化の変更、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）などの内因性ＮＯＳ阻害剤レベルの増加、ＮＯの分解またはペルオキシ亜硝酸への変換の増加（高レベルの活性酸素種による）、あるいはＬ−アルギンを尿素に変換し、それによって、ＮＯＳに対する基質としてのＬ−アルギンの利用性を制限するアルギナーゼ活性の増加に起因する可能性がある。

最近の多数の研究では、アルギナーゼがＥＤおよび細胞内Ｌ−アルギン利用可能性を制御することによるＮＯＳ活性の調節において主要な役割を果たすことが指示されている。例えば、ＥＤを伴う老化している血管では、アルギナーゼがアップレギュレートされるが、特定のアルギナーゼ阻害剤の添加によって、血管の内皮機能および一酸化窒素（ＮＯ）反応性が回復する。ＥＤを克服するアルギナーゼ阻害が示された他の疾患には、アルギナーゼ活性の増加がＮＯの欠乏と気道筋弛緩の減少に寄与する喘息、肺高血圧、並びに自然発生および食塩誘発性高血圧が含まれる。また、Ｌ−アルギニン補足は、高血圧のブタモデルにおいて、虚血／再潅流によって引き起こされる拡張不良において、完全にまたは部分的にＥＤを食い止めることが示され、さらに、末梢動脈疾患の患者における歩行能力を改善することが示されている。これらの研究は、多数の血管疾患においてアルギナーゼのアップレギュレーションを減少させるかまたはアルギナーゼの活性を調節する薬物に関する潜在的な治療的役割を示唆する。

最近の研究によって、低酸素症およびＴＮＦαを含むある種の炎症性メディエーターはともに、アルギナーゼを増加させるかまたは内皮細胞の一酸化窒素シンターゼ（ｅＮＯＳ）活性を減少させることが示されている。長期の炎症および慢性虚血は、ＥＤに寄与しているようである。

非常に多数の疾患および障害に関与するかまたは寄与する内皮機能不全を治療する方法が必要となる。

（発明の要旨）
本出願人は、非タンパク質分解的に活性化されたトロンビン受容体（以下「ＮＰＡＲ」）を刺激または活性化する化合物が、内皮機能不全と関連したアルギナーゼのアップレギュレーションをブロックし、一酸化窒素シンターゼの活性化またはアップレギュレーションを促進することによって内皮機能不全を食い止めるかまたは阻害し、それによって、一酸化窒素の産生を増加させることができることを見出した。ＮＰＡＲアゴニストであるＴＰ５０８は、ＴＮＦαによって誘導されるアルギナーゼ１（ＡＲＧ１）のアップレギュレーションをブロックする（実施例２）。ＡＲＧ１発現に対する効果は、投薬量に依存していることが示された。また、ＴＰ５０８処理は、正常酸素（ｎｏｒｍｏｘｉｃ）（正常な酸素）状態および低酸素（１％酸素）状態下で培養された細胞にｅＮＯＳのリン酸化を増加させる（実施例３）。さらに、細胞のＴＰ５０８は、ｅＮＯＳ発現の低酸素誘導のダウンレギュレーションを妨げ、正常酸素条件下で培養された細胞において観察されたものに近い状態のレベルでｅＮＯＳを維持する。ｅＮＯＳリン酸化に対するＴＰ５０８の効果は、投薬量依存的である。

本発明は、治療を必要とする対象における部位で内皮機能不全を治療するための方法に関し、該方法は、対象に治療有効量のＮＰＡＲアゴニストを投与することを含み、ここで、該部位は、血管形成により損傷を受けた動脈、慢性皮膚潰瘍、骨誘導を必要とする部位、心臓血管再開通を必要とする部位ではない。

より具体的には、本発明は、上記で列挙された例外を除いて、対象における内皮機能不全を治療する方法を含み、ここで、該対象は、高血圧、うっ血性心不全、冠動脈疾患、脳卒中、脳血管疾患、末梢血管疾患、糖尿病、勃起機能不全、アテローム性動脈硬化症、喘息、関節リウマチ、肺高血圧症、急性肺損傷、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、炎症性肺疾患、高ホモシステイン血症、鎌状赤血球病、子癇前症、慢性腎障害、慢性腎機能不全、腎微小血管疾患、肝臓再潅流損傷、ニューロパシー、アルツハイマー病、甲状腺疾患、敗血症、血栓症、多臓器障害、炎症性大腸炎、および放射線損傷からなる群から選択される１以上の疾患または状態に罹患している。

また、本発明は、治療を必要とする対象における部位で内皮機能不全を治療する方法に関し、該方法は、対象に１以上のＮＰＡＲアゴニスト、１以上の血管新生増殖因子を含む組み合わせを治療有効量で投与することを含み、ここで、該部位は、血管形成により損傷を受けた動脈、慢性皮膚潰瘍、骨誘導を必要とする部位、心臓血管再開通を必要とする部位ではない。

また、本発明は、治療を必要とする患者における部位で内皮機能不全を治療する方法であって、該方法は、対象に、本質的には、非タンパク質分解的に活性化されたトロンビン受容体のアゴニストおよび血管新生増殖因子からなる組み合わせを治療有効量で投与することを含み、ここで、該部位は、血管形成により損傷を受けた動脈、慢性皮膚潰瘍、骨誘導を必要とする部位、心臓血管再開通を必要とする部位ではない。この方法では、血管新生増殖因子およびＮＰＡＲアゴニストは、併用療法における唯一の治療的に活性な薬物として対象に投与される。

いくつかの態様では、ＮＰＡＲアゴニストは、対象に全身的に投与することができ、他の態様では、血管内に投与することができ、さらに他の態様では、部分的に（ｌｏｃａｌｌｙ）または局所的に投与することができる。

一態様は、ＮＰＡＲアゴニストは、本明細書に開示されているトロンビンペプチド誘導体である。より具体的には、あるトロンビンペプチド誘導体は、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｘ_１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ_２−Ｖａｌ（配列番号１）、または少なくとも６個のアミノ酸を含むＣ末端切断のそのフラグメントを含む。別の具体的な態様では、トロンビンペプチド誘導体は、配列番号２：Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｘ_１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ_２−Ｖａｌのアミノ酸配列、少なくとも１４個のアミノ酸を有するトロンビンペプチド誘導体のＮ末端切断フラグメント、または少なくとも１８個のアミノ酸を含むトロンビンペプチド誘導のＣ末端切断フラグメントを含む。Ｘ_１はＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ｘ_２はＰｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＶａｌである。別の具体的な態様では、トロンビンペプチド誘導体は、ポリペプチド配列番号３：Ｈ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−ＮＨ_２（ＴＰ５０８）である。

別の態様では、ＮＰＡＲアゴニストは、本明細書に開示されている修飾されたトロンビンペプチド誘導体である。具体的な態様では、修飾されたトロンビンペプチド誘導体は、配列番号４：Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｘ_１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ_２−Ｖａｌのアミノ酸配列、または少なくとも６個のアミノ酸を有するＣ末端切断フラグメントを含む。別の具体的な態様では、修飾されたトロンビンペプチド誘導体は、配列番号５：Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｘ_１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ_２−Ｖａｌのアミノ酸配列、または配列番号５のアミノ酸１０〜１８を含むそのフラグメントを含む。

別の態様では、ＮＰＡＲアゴニストは、本明細書に開示されている２つのトロンビンペプチド誘導体のトロンビンペプチド誘導体二量体である。より具体的には、二量体のトロンビンペプチド誘導体は、アミノ酸配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｘ_１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ_２−Ｖａｌ（配列番号１）または少なくとも６個のアミノ酸を有するＣ末端切断のそのフラグメントを含む。別の具体的な態様では、二量体のトロンビンペプチド誘導体は、配列番号２：Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｘ_１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ_２−Ｖａｌのアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号２のアミノ酸１０〜１８を含むそのフラグメントを含む。本発明の別の態様では、二量体のトロンビンペプチド誘導体は、ポリペプチドＨ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−ＮＨ_２（配列番号３）である。別の具体的な態様では、トロンビンペプチド誘導体二量体は、構造式（ＩＶ）によって表される。

更なる態様では、ＮＰＡＲアゴニストは、相補的ペプチドに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであり、ここで、該相補的ペプチドは、トロンビンの一部をコードするヌクレオチド配列の相補体によってコードされる。

上記に言及されているトロンビンは、哺乳動物のトロンビン、特にヒトのトロンビンであることができる。トロンビンの部分は、トロンビン受容体結合ドメインまたはその一部であり得る。一態様では、トロンビン受容体結合ドメインまたはその一部は、アミノ酸配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号６）を含む。トロンビン受容体結合ドメインの別の一部は、アミノ酸配列Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ（配列番号７）を含む。

前記抗体またはその抗原結合フラグメントが結合する相補的ペプチドは、アンチセンスＲＮＡ鎖の５’−３’配列によって、またはアンチセンス鎖の３’−５’配列によってコードされることができる。

具体的な態様では、相補的ペプチドは、アミノ酸配列Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ（配列番号８）またはＴｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（配列番号９）またはＡｒｇ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ（配列番号１０）またはＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ（配列番号１１）を含む。

本発明の方法に用いられるべきＮＰＡＲアゴニストは、ポリクローナル抗体、またはモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントであり得る。具体的な態様では、これらは、ヒト抗体である。治療法においてＮＰＡＲアゴニストとして使用されるべきモノクローナル抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体または前述のいずれかの抗原結合フラグメントであってもよく、該フラグメントには、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントおよびＦｖフラグメントが含まれ得る。

代表的なウェスタンブロットのＸ線フィルム、ＴＮＦαの有無によって培養された細胞のアルギナーゼ１の発現レベルに対するＴＰ５０８の効果を調べる実験のウェスタンブロット上のバンドの密度読み取りの比率である対応する棒グラフを示す。ヒト冠動脈内皮（ＨＣＡＥ）細胞は、２４時間のＴＮＦαを用いた処置前の１時間、ＴＰ５０８が存在しない場合（ＣＴＲ）または存在する場合（ＴＰ）でインキュベートされた。細胞溶解物は、ヒトのアルギナーゼ１発現について、この酵素に特異的な抗体を用いてイムノブロッティングによって分析された。ストリッピング後、タンパク質充填量を示すためにメンブレンをＧＡＰＤＨ抗体でリプローブする。（グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）レベルは、ＴＮＦαまたは低酸素症によって影響を受けない。）対応する密度データは、４つの個別の実験の平均±ＳＤを表す［ｐ＜０．０５；ＣＴＲ ｖｓ．ＴＮＦα（^＊）またはＴＮＦα ｖｓ．ＴＰ＋ＴＮＦα（^＃）］。 ウェスタンブロット実験のＸ線フィルム、ＴＮＦαによるアルギナーゼ１アップレギュレーションに対するＴＰ５０８の薬物応答効果を示すウェスタンブロット上のバンドの密度読み取りの比率である対応する棒グラフを示す。ＨＣＡＥ細胞は、ＴＮＦαの２４時間による刺激前の１時間、所定の濃度のＴＰ５０８を用いて前処理され、細胞溶解物は、イムノブロッティングによるアルギナーゼ１発現について分析された。密度分析は、アルギナーゼ１発現の相対強度を示す。 ウェスタンブロットのＸ線フィルム、ｅＮＯＳの発現およびリン酸化（活性）におけるＴＰ５０８の効果を示す実験のウェスタンブロット上のバンドの密度読み取りの比率である対応する棒グラフを示す。ＨＣＡＥ細胞は、ＴＰ５０８またはＴＮＦαで刺激され、正常酸素または１％酸素（低酸素）条件で２４時間インキュベートされた。細胞溶解物は、ｅＮＯＳ活性について、Ｓ１１７７でリン酸化されたｅＮＯＳに特異的な抗体を使用するイムノブロッティングによって分析された。ストリッピング後、総ｅＮＯＳおよびＧＡＰＤＨに対する抗体を用いてメンブレンをリプローブした。対応する密度データは、３つの個別の実験の平均±ＳＤを表す［^＊はｐ＜０．０５を表す；ＣＴＲ ｖｓ．ＴＰ（^＊）（正常酸素）；ＣＴＲ ｖｓ．ＴＰ（^＊）（低酸素）］。 ウェスタンブロット実験のＸ線フィルム、ｅＮＯＳ活性化に対するＴＰ５０８の効果の投薬量依存性を調べる実験のウェスタンブロット上のバンドの密度読み取りの比率である対応する棒グラフを示す。ＨＣＡＥ細胞は、２４時間、所定濃度のＴＰ５０８を用いて処理され、図３に示されるようにｅＮＯＳ活性および発現について分析された。密度分析は、ＴＰ５０８処理後の総ｅＮＯＳと比較したｅＮＯＳリン酸化における変化を示す。 ｅＮＯＳ ｍＲＮＡにおけるＴＰ５０８の効果を調査するために設計された実験のＲＴ−ＰＣＲの産物の染色されたゲルを示す。ＴＮＦαまたはＴＰ５０８による６時間刺激された細胞におけるｅＮＯＳ ｍＲＮＡ発現の変化をＲＴ−ＰＣＲを用いて分析した。 ｅＮＯＳ ｍＲＮＡ発現の定量的分析データの棒グラフである。ＨＣＡＥ細胞をＴＰ５０８またはＴＮＦαを用いて刺激後、正常酸素または低酸素（１％酸素）条件で２４時間インキュベートした。ＲＮＡは、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎリアルタイムＰＣＲを用いて、ｅＮＯＳ発現についてＲＮＡを分析した。各条件についてＴＰ５０８（ＣＴＲ）が存在しないものと比較した場合、ｐ＜０．０５。 ヒトのプロトロンビン（配列番号１２）のコードされたアミノ酸配列を示す。アミノ酸５０８〜５３０は、トロンビン受容体結合ドメインを含み、下線を付している。トロンビンは、プロトロンビンのＣ末端の５７９個のアミノ酸残基からなる。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＪ９７２４４９を参照されたい。 ＴＰ５０８、ＶＥＧＦまたはそれらの併用による処置後、ＨＣＡＥ細胞における活性化された内皮の一酸化窒素シンターゼ（ｅＮＯＳ）のウェスタンブロットの密度分析を示すグラフである。 走化性因子に関して内皮細胞の移動を測定するための実験装置および実験設計を示す図である。 血管新生因子ＶＥＧＦに関して内皮細胞の移動におけるＴＰ５０８処理の効果を示す棒グラフである。 走化性因子に関してマトリゲルを通過する内皮細胞の浸潤を測定するための実験装置および実験設計を示す図である。 血管新生因子ＶＥＧＦに関して内皮細胞の浸潤におけるＴＰ５０８処理の効果を示す棒グラフである。 正常な酸素濃度または低酸素条件下でのＶＥＧＦまたはＴＰ５０８によって処理されたヒトの心臓微小血管の内皮細胞におけるＶＥＧＦ ｍＲＮＡの増加を示すグラフである。 ＴＰ５０８の弛緩作用を評価するためのラット大動脈の環の測定データのグラフである。 示される条件下での虚血心臓からの冠状細動脈の拡張の程度を示すグラフである。図１３Ａ〜１３Ｂは、内皮に依存したＮＯ媒介の血管拡張を示す。内皮機能不全の程度は、アデノシン（図１３Ａ）またはセロトニン（図１３Ｂ）の指示された濃度に応答して、最大拡張の割合として血管拡張の程度を測定することによって、正常酸素対照の左前方の下行口蓋動脈（非虚血性）またはプラセボ（虚血プラセボ）もしくはＴＰ５０８処理された（虚血ＴＰ５０８）心臓の虚血性左回旋冠動脈から単離した細動脈において評価された。非虚血と比較して^＊ｐ＜０．０５；虚血プラセボと比較して^＃Ｐ＜０．０５。図１３Ｃおよび１３Ｄは、内皮依存したＮＯ媒介の血管拡張を示す。ＮＯに依存しない血管拡張における虚血およびＴＰ５０８の潜在的効果を測定するために、単離された細動脈をニトロプルシド（図１３Ｃ）またはピナシジル（図１３Ｄ）の所定濃度で刺激した。図１３Ｅは、プラセボまたはＴＰ５０８のいずれかを用いて非虚血性および虚血性心臓から単離された細動脈を処理し、ＮＯ産生について分析した結果を示す棒グラフである。

（発明の詳細な説明）
内皮機能不全は、高血圧、うっ血性心不全、冠動脈疾患、脳卒中、脳血管疾患、末梢血管疾患、糖尿病、勃起機能不全、アテローム性動脈硬化症、喘息、関節リウマチ、肺高血圧症、急性肺損傷、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、炎症性肺疾患、高ホモシステイン血症、鎌状赤血球病、子癇前症、慢性腎障害、慢性腎機能不全、腎微小血管疾患、肝臓再潅流損傷、ニューロパシー、アルツハイマー病、甲状腺疾患、敗血症、血栓症、多臓器障害、炎症性大腸炎、および放射線損傷を含む様々な疾患の病因に関係していると見なされている。

本出願人は、非タンパク質分解的に活性化されたトロンビン受容体（以下「ＮＰＡＲ」）を刺激するかまたは活性化する化合物が内皮機能不全と関連したアルギナーゼのアップレギュレーションをブロックし、一酸化窒素シンターゼの活性化またはアップレギュレーションを促進することによって内皮機能不全を食い止めるかまたは阻害することができ、それによって、一酸化窒素の産生を増加することを発見した。ＴＰ５０８は、ＴＮＦαによって誘導されたアルギナーゼのアップレギュレーションをブロックする。この作用は投薬量依存的である。また、ＴＰ５０８処理は、正常酸素（正常な酸素）条件および低酸素条件下で培養された細胞におけるｅＮＯＳのリン酸化を増加させる。さらに、細胞のＴＰ５０８は、ｅＮＯＳ発現の低酸素誘導のダウンレギュレーションを妨げ、正常酸素条件下で培養された細胞において観察されたものに近い状態のレベルでｅＮＯＳを維持する。ｅＮＯＳリン酸化に対するＴＰ５０８の効果は、投薬量依存的である（実施例３）。

本発明は、治療を必要とする対象における部位で、内皮機能不全を治療する方法、内皮機能不全の結果を治療する方法を含み、該方法は、対象に治療有効量の非タンパク質分解的に活性化されたトロンビン受容体を投与することを含み、ここで、該部位は、血管形成により損傷を受けた動脈、慢性皮膚潰瘍、骨誘導を必要とする部位および心臓血管再開通を必要とする部位ではない。具体的な態様では、治療されるべき対象は、高血圧、うっ血性心不全、冠動脈疾患、脳卒中、脳血管疾患、末梢血管疾患、糖尿病、勃起機能不全、アテローム性動脈硬化症、喘息、関節リウマチ、肺高血圧症、急性肺損傷、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、炎症性肺疾患、高ホモシステイン血症、鎌状赤血球病、子癇前症、慢性腎障害、慢性腎機能不全、腎微小血管疾患、肝臓再潅流損傷、ニューロパシー、アルツハイマー病、甲状腺疾患、敗血症、血栓症、多臓器障害、炎症性大腸炎、および放射線損傷からなる群から選択される１以上の疾患（単数または複数）に罹患しているかまたは患っていた。

具体的な局面では、本発明は、内皮機能不全を治療する方法であって、それによって対象における耐糖能異常を治療するものであり、該方法は、非タンパク質分解的に活性化されたトロンビン受容体のアゴニストの治療有効量を対象に投与することを含む。耐糖能異常の対象には、２型糖尿病の発症の危険にあるものが含まれる。別の局面では、本発明は、内皮機能不全を治療する方法であって、それによって対象における糖尿病の合併症を治療し、該方法は、非タンパク質分解的に活性化されたトロンビン受容体のアゴニストの治療有効量を対象に投与することを含む。これらの局面では、対象は、血管形成により損傷を受けた動脈、慢性皮膚潰瘍、骨誘導を必要とする部位および心臓血管再開通を必要とする部位といった部位での治療を必要としていない。

別の局面では、本発明は、対象におけるアテローム性動脈硬化症を治療する方法であり、該方法は、非タンパク質分解的に活性化されたトロンビン受容体のアゴニストの治療有効量の投与することを含む。これらの局面では、対象は、血管形成により損傷を受けた動脈、慢性皮膚潰瘍、骨誘導を必要とする部位および心臓血管再開通を必要とする部位といった部位での治療を必要としていない。

内皮機能不全は、イオン化放射からの毒性の原因である。例えば、照射された内臓では、内皮細胞は枯渇され、粘膜障壁の崩壊をもたらし、次に、炎症、活性酸素種の産生、ＴＧＦ−βおよびＴＮＦ−αなどのシグナル伝達分子の放出へと導く。この炎症反応の作用の中には、腺窩細胞増殖の減少、粘膜炎および分泌性下痢、並びに間葉細胞増殖およびコラーゲン産生の増加が含まれ、線維症および瘢痕化をもたらす。対象は、イオン化放射により損傷を受け、次に、例えば、種々の形態の癌に対する治療として、または労働災害からの放射線被曝の場合において、高い放射線量の放射線治療を受ける場合がある。

さらに別の局面では、本発明は、対象における放射線損傷を治療する方法であり、該方法は、非タンパク質分解的に活性化されたトロンビン受容体のアゴニストの治療有効量を対象に投与することを含む。これらの局面では、対象は、血管形成により損傷を受けた動脈、慢性皮膚潰瘍、骨誘導を必要とする部位および心臓血管再開通を必要とする部位といった部位での治療を必要としていない。

ＮＰＡＲアゴニスト
ＮＰＡＲを刺激する化合物は、ＮＰＡＲアゴニストと呼ばれる。ＮＰＡＲは、ほとんどの細胞の表面上に存在する高親和性トロンビン受容体である。このＮＰＡＲ成分は、主にトロンビンの高親和性結合、タンパク質分解的に不活性化されたトロンビン、細胞に対するトロンビン誘導ペプチドの原因である。ＮＰＡＲは、タンパク分解活性から独立したトロンビンによって開始された多数の細胞シグナルを媒介するようである。このようなシグナルの１つの例は、アネキシンＶのアップレギュレーションおよびサブストラクティブハイブリダイゼーションによって同定された他の分子である（Ｓｏｗｅｒ，ｅｔ．ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４７：４２２（１９９９）を参照されたい）。したがって、ＮＰＡＲは、細胞表面でのトロンビンによる高親和性相互作用、以下に記載のトロンビンのタンパク分解的に不活性なトロンビン誘導体およびトロンビン誘導ペプチドアゴニストによる活性化によって特徴付けられる。米国特許第５，３５２，６６４号および第５，５００，４１２号に開示されるように、ＮＰＡＲ活性は、分裂促進濃度下のトロンビンまたはプロテインキナーゼＣを活性化する分子の存在下で線維芽細胞に添加された場合、細胞増殖を刺激する分子の能力に基づいて評価され得る。これらの特許の教示全体は、参照により本明細書中に援用される。ＮＰＡＲアゴニストは、細胞に結合する^１２５Ｉ−トロンビンと競合するこの活性化またはそれらの能力によって同定することができる。

トロンビン受容体結合ドメインは、トロンビン受容体に直接的に結合し、および／または高親和性トロンビン受容体とアルファ−トロンビンとの間の結合を競合的に阻害するポリペプチドまたはポリペプチドの部分として定義される。

本発明のＮＰＡＲアゴニストには、トロンビン誘導体ペプチド、修飾されたトロンビン誘導体ペプチド、トロンビン誘導体ペプチド二量体、および本明細書に開示されているトロンビンの相補的ペプチドに対するＮＰＡＲアゴニスト抗体が含まれる。

トロンビン誘導体ペプチド
ＮＰＡＲアゴニストの中には、トロンビンペプチド誘導体（また、「トロンビン誘導体ペプチド」）があり、それは、トロンビンのアミノ酸配列から少なくとも部分的に誘導されたアミノ酸配列を有するトロンビンの類似体であり、非タンパク質分解的に活性化されたトロンビン受容体で活性である。トロンビンペプチド誘導体には、例えば、組換えＤＮＡ法によって生産されるペプチド、トロンビンの酵素消化によって生産されるペプチド、合成的に生産されたペプチドが含まれ、それらは、トロンビンおよび／または修飾されたアミノ酸と比較して、特に末端で、アミノ酸置換を含むことができる。

本発明のＮＰＡＲアゴニストには、米国特許第５，３５２，６６４号および同第５，５００，４１２号に記載されているトロンビン誘導体ペプチドが含まれる。一態様では、本発明のＮＰＡＲアゴニストは、トロンビンペプチド誘導体または生理学的に機能的な同等物、即ち、約５０個未満のアミノ酸、好ましくは約３０個未満のアミノ酸を含み、ポリペプチドがＮＰＡＲを活性化するトロンビンアミノ酸５０８−５３０（Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ；配列番号６）に対応するヒトトロンビンのフラグメントに十分に相同性を有するポリペプチドである。本明細書の記載されているトロンビンペプチド誘導体または修飾されたトロンビンペプチド誘導体は、好ましくは、約１２〜約２３個のアミノ酸残基、より好ましくは約１９〜約２３個のアミノ酸残基を有する。

別の態様では、本発明のＮＰＡＲアゴニストは、構造式（Ｉ）：
Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｒ （Ｉ）
によって表される部分を含むトロンビンペプチド誘導体である。Ｒは、セリンエステラーゼ保存ドメインである。セリンエステラーゼ、例えばトリプシン、トロンビン、キモトリプシンなどは、高度に保存された領域を有する。「セリンエステラーゼ保存ドメイン」は、これら保存領域の１つのアミノ酸配列を持つポリペプチドを指すか、またはトロンビンペプチド誘導体がＮＰＡＲ活性化能を保持するように、これら保存領域の１つに対して十分に相同的である。

トロンビン誘導体の生理学的に機能的な同等物は、特に、トロンビン受容体結合ドメインまたはセリンエステラーゼ保存アミノ酸配列の機能に影響を及ぼさないトロンビン誘導体とは異なっている分子を包含する。このような事項には、限定されないが、保存アミノ酸置換（ＮＰＡＲアゴニストについては以下に定義される）および修飾、例えばカルボキシル末端のアミド化、アミノ末端のアセチル化、生理学的に不活性な担体分子へのポリペプチドの結合、またはセリンエステラーゼ保存配列に従った配列の変更が含まれる。

セリンエステラーゼ保存配列を有するドメインは、セリンプロテアーゼ（Ａｓｐ−Ｘ_１−Ｃｙｓ−Ｘ_２−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ_３−Ｖａｌ；配列番号１３）；ここで、Ｘ_１はＡｌａまたはＳｅｒのいずれかであり；Ｘ_２はＧｌｕまたはＧｌｎのいずれかであり；Ｘ_３は、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、またはＶａｌである）の中で高度に保存されていることが従来示されているドデカペプチドのＮ末端アミノ酸の少なくとも４〜１２を含むポリペプチド配列を含むことができる。

一態様では、セリンエステラーゼ保存配列は、配列番号１４（Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ）のアミノ酸配列または配列番号１４のアミノ酸配列を有するポリペプチドのＣ末端切断フラグメントを含む。しかしながら、セリンエステラーゼ保存配列における０、１、２または３個のアミノ酸は、配列番号１４における対応するアミノ酸とは相違することができることは理解される。好ましくは、配列番号１４における対応アミノ酸とは異なっているセリンエステラーゼ保存配列におけるアミノ酸は、以下に定義される保存的置換体であり、より好ましくは高度に保存された置換体である。「Ｃ末端切断フラグメント」は、Ｃ末端からアミノ酸の除去またはアミノ酸のブロック後に残っているフラグメントを指し、このフラグメントは、少なくとも６個、より好ましくは少なくとも９個のアミノ酸を有する。

別の態様では、セリンエステラーゼ保存配列は、配列番号１５（Ｃｙｓ−Ｘ_１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ_２−Ｖａｌ；Ｘ_１はＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ｘ_２はＰｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＶａｌである）のアミノ酸配列または少なくとも６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも９個のアミノ酸を有するＣ末端切断されたそのフラグメントを含む。

好ましい態様では、トロンビンペプチド誘導体は、セリンエステラーゼ保存配列と、より特異的なトロンビンアミノ酸配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ（配列番号１６）を有するポリペプチドとを含む。このタイプのトロンビンペプチド誘導体の一例には、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｘ_１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ_２−Ｖａｌ（配列番号１）が含まれる。Ｘ_１およびＸ_２は、上記で定義されているとおりである。トロンビンペプチド誘導体は、配列番号６（Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ）のアミノ酸配列またはＮ末端切断されたそのフラグメントを含むことができ、ただし、トロンビンペプチド誘導体における位置１〜９での０、１、２または３個のアミノ酸は、配列番号６の対応する位置のアミノ酸とは異なっている。好ましくは、配列番号６における対応するアミノ酸残基とは異なっているトロンビンペプチド誘導体のアミノ酸残基は、ＮＰＡＲアゴニストについて以下に定義される保存的置換体であり、より好ましくは高度に保存された置換体である。「Ｎ末端切断されたフラグメント」は、Ｎ末端からのアミノ酸の除去またはアミノ酸のブロック、好ましくは、６個未満のアミノ酸のブロック、より好ましくは３個未満のアミノ酸のブロック後に残っているフラグメントを指す。

場合により、本明細書に記載されているトロンビンペプチド誘導体は、Ｃ末端でアミド化および／またはＮ末端でアシル化することができる。具体的な態様では、トロンビンペプチド誘導体は、Ｃ末端アミドを含み、場合により、アシル化されたＮ末端を含み、ここで、Ｃ末端アミドは、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ_ａＲ_ｂによって表され、ここで、Ｒ_ａおよびＲ_ｂは、独立して、水素、Ｃ_１−Ｃ_１０置換されたかまたは置換されていない脂肪族基であり、あるいはＲ_ａおよびＲ_ｂは、それらが結合される窒素と一緒になって、Ｃ_１−Ｃ_１０非芳香族複素環式基を形成し、Ｎ末端のアシル基は、Ｒ_ｃＣ（Ｏ）−によって表され、ここで、Ｒ_ｃは、水素、Ｃ_１−Ｃ_１０置換もしくは非置換脂肪族基、またはＣ_１−Ｃ_１０置換または非置換芳香族基である。別の具体的な態様では、トロンビンペプチド誘導体のＮ末端は、何もなく（即ち、非置換）、Ｃ末端は何もない（即ち、非置換）かまたは好ましくはカルボキシアミド（即ち、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２）としてアミド化されている。具体的な態様では、トロンビンペプチド誘導体は、下記のアミノ酸配列：Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号６）を含む。別の具体的な態様では、トロンビンペプチド誘導体は、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含む。あるいは、トロンビンペプチド誘導体は、配列番号１８のアミノ酸配列：Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅを含む。配列番号６、１７、または１８のアミノ酸を含むトロンビンペプチド誘導体は、場合により、Ｃ末端でアミノ化され、および／またはＮ末端でアシル化されてもよい。好ましくは、Ｎ末端は何もなく（即ち、非置換）、Ｃ末端は何もない（即ち、非置換）かまたはアミド化され、好ましくはカルボキシアミド（即ち、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２）である。しかしながら、トロンビンペプチド誘導体における１〜９位および１４〜２３位の０、１、２または３個のアミノ酸は、配列番号６における対応するアミノ酸とは異なっていてもよい。また、トロンビンペプチド誘導体における１〜１４位および１９〜３３位での０、１、２または３個のアミノ酸は、配列番号１８における対応するアミノ酸とは異なっていてもよい。好ましくは、配列番号６または配列番号１８における対応するアミノ酸とは異なっているトロンビンペプチド誘導体におけるアミノ酸は、以下に定義される保存的置換体であり、より好ましくは高度に保存された置換である。あるいは、少なくとも１４個のアミノ酸を有するトロンビンペプチド誘導体のＮ末端切断のフラグメント、または少なくとも１８個のアミノ酸を有するトロンビンペプチド誘導体のＣ末端切断のフラグメントは、ＮＰＡＲアゴニストとして使用されるトロンビンペプチド誘導体である。

「Ｃ末端切断のフラグメント」とは、Ｃ末端からアミノ酸を除去またはアミノ酸のブロック後に残っているフラグメントを指す。「Ｎ末端切断のフラグメント」とは、Ｎ末端からアミノ酸を除去またはアミノ酸のブロック後に残っているフラグメントを指す。用語「Ｃ末端切断のフラグメント」および「Ｎ末端切断のフラグメント」は、上述されるように、Ｎ末端でのアシル化および／またはＣ末端でのアミド化を含む。

開示されている方法において使用するための好ましいトロンビンペプチド誘導体は、アミノ酸配列の配列番号２：Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｘ_１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ_２−Ｖａｌを含む。開示されている方法において使用するための別の好ましいトロンビンペプチド誘導体は、配列番号１９のアミノ酸配列：Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｘ_１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ_２−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅを含む。Ｘ_１はＧｌｕまたはＧｌｎであり；Ｘ_２はＰｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＶａｌである。配列番号２および配列番号１９のトロンビンペプチド誘導体は、場合により、上述されるように、Ｃ末端アミドおよび／またはアシル化されたＮ末端を含むことができる。好ましくは、Ｎ末端は何もなく（即ち、非置換）、Ｃ末端は何もない（即ち、非置換）かまたはアミド化され、好ましくはカルボキシアミド（即ち、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２）である。あるいは、これらの好ましいトロンビンペプチド誘導体のＮ末端切断のフラグメント、少なくとも１４個のアミノ酸を有するＮ末端切断のフラグメント、またはこれらの好ましいトロンビンペプチド誘導体のＣ末端切断のフラグメント、少なくとも１８個のアミノ酸を有するＣ末端切断のフラグメントも開示されている方法に用いることができる。

ＴＰ５０８は、トロンビンペプチド誘導体の一例であり、２３個のアミノ酸残基の長さであり、ここで、Ｎ末端アミノ酸残基Ａｌａは非置換であり、Ｃ末端アミノ酸ＶａｌのＣＯＯＨは−Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２（配列番号３）によった表されるアミドに修飾されている。トロンビンペプチド誘導体の別の例は、配列番号６のアミノ酸配列を含み、ここで、Ｎ−およびＣ−末端の両方は非置換である（「デアミドＴＰ５０８」）。開示されている方法において用いることができるトロンビンペプチド誘導体の他の例には、ＴＰ５０８（またはデアミドＴＰ５０８）のＮ末端切断のフラグメント、少なくとも１４個のアミノ酸を有するＮ末端切断のフラグメント、ＴＰ５０８（またはデアミドＴ５０８）のＣ末端切断のフラグメント、少なくとも１８個のアミノ酸を有するＣ末端切断のフラグメントが挙げられる。

本明細書中で使用するとき、ポリペプチドにおける「保存的置換体」とは、あるアミノ酸を同じ正味の電荷およびほぼ同じ大きさと形状を有する別のアミノ酸で置き換えることをいう。脂肪族または置換脂肪族アミノ酸側鎖を有するアミノ酸は、側鎖中の炭素およびヘテロ原子の総数の相違が約４以下であれば、ほぼ同じ大きさを持つ。脂肪族または置換脂肪族アミノ酸側鎖を持つアミノ酸は、側鎖中の分枝数の相違が１以下であれば、ほぼ同じ形状を持つ。それらの側鎖にフェニルまたは置換フェニル基を有するアミノ酸は、ほぼ同じ大きさと形状を有するとみなされる。以下に５つのアミノ酸群を挙げる。ポリペプチド中のアミノ酸を同じ群由来の別のアミノ酸で置換すると保存的置換体になる。

Ｉ群：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、システイン、およびＣ１−Ｃ４脂肪族またはＣ１−Ｃ４ヒドロキシル置換脂肪族側鎖（直鎖または一分岐）を有する天然に存在しないアミノ酸
ＩＩ群：グルタミン酸、アスパラギン酸およびカルボン酸置換Ｃ１−Ｃ４脂肪族側鎖（非分岐または一分岐点）を有する非天然アミノ酸
ＩＩＩ群：リジン、オルニチン、アルギニン、およびアミンまたはグアニジノ置換Ｃ１−Ｃ４脂肪族側鎖（非分岐または一分岐点）を有する天然に存在しないアミノ酸
ＩＶ群：グルタミン、アスパラギン、およびアミド置換Ｃ１−Ｃ４脂肪族側鎖（非分岐または一分岐点）を有する天然に存在しないアミノ酸
Ｖ群：フェニルアラニン、フェニルグリシン、チロシン、およびトリプトファン。

本明細書中で使用するとき、ポリペプチドにおける「高度に保存的な置換」とは、あるアミノ酸を、側鎖中に同じ官能基を有し、かつ、ほぼ同じ大きさと形状を有する別のアミノ酸で置き換えることをいう。脂肪族または置換脂肪族アミノ酸側鎖を持つアミノ酸は、側鎖中の炭素およびヘテロ原子の総数の相違が２以下であれば、ほぼ同じ大きさを持つ。脂肪族または置換脂肪族アミノ酸側鎖を有するアミノ酸は、側鎖中の分枝の数が同じであれば、ほぼ同じ形状を有する。高度に保存された置換の例としては、バリンによるロイシンの置換、スレオニンによるセリンの置換、アスパラギン酸によるグルタミン酸の置換、フェニルグリシンによるフェニルアラニンの置換が挙げられる。高度に保存的な置換ではない置換の例としては、アラニンによるバリンの置換、アラニンによるセリンの置換、アスパラギン酸によるセリンの置換が挙げられる。

修飾されたトロンビンペプチド誘導体
本発明の一態様では、ＮＰＡＲアゴニストは、上述されるトロンビンペプチド誘導体と比較して修飾され、ここで、前述のトロンビンペプチド誘導体のシステイン残基は、類似のサイズおよび電荷特性を有するアミノ酸で置換され、ペプチドの二量化を最小にする。適切なアミノ酸の例には、アラニン、グリシン、セリン、またはＳ−保護されたシステインが挙げられる。好ましくは、システインは、アラニンで置換される。修飾されたトロンビンペプチド誘導体は、未修飾のトロンビンペプチド誘導体とほぼ同じの生物学的活性を有する。参照により本明細書中に援用される米国出願公開第ＵＳ２００５／０１５８３０１Ａ１号を参照されたい。

本明細書に開示されている修飾されたトロンビンペプチド誘導体は、上述されるように、場合によりＣ末端アミドおよび／またはＮ末端アシル基を含むことが理解される。好ましくは、トロンビンペプチド誘導体のＮ末端は何もなく（即ち、非置換）、Ｃ末端は何もない（即ち、非置換）かまたはアミド化され、好ましくはカルボキシアミド（即ち、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２）である。

具体的な態様では、修飾されたトロンビンペプチド誘導体は、配列番号４のアミノ酸配列：Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｘ_１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ_２−Ｖａｌを有するポリペプチド、または少なくとも６個のアミノ酸を有するＣ末端切断されたそのフラグメントを含む。より具体的には、トロンビンペプチド誘導体は、配列番号２０のアミノ酸配列：Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌまたは配列番号２０のアミノ酸１０〜１８を含むそのフラグメントを含む。さらにより具体的には、トロンビンペプチド誘導体は、アミノ酸配列の配列番号５：Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｘ_１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ_２−Ｖａｌ、または配列番号５のアミノ酸１０〜１８を含むそのフラグメントを含む。Ｘａａは、アラニン、グリシン、セリンまたはＳ−保護システインである。Ｘ_１はＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ｘ_２はＰｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＶａｌである。このタイプのトロンビンペプチド誘導体の一例は、アミノ酸配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号２１）を有するポリペプチドである。このタイプのトロンビンペプチド誘導体の更なる例は、ポリペプチドＨ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−ＮＨ_２（配列番号２２）である。トロンビンペプチド誘導体における０、１、２または３基のアミノ酸は、配列番号４、２０、５、２１または２２の対応する位置のアミノ酸とは異なっているが、ただし、Ｘａａは、アラニン、グリシン、セリンまたはＳ−保護システインである。好ましくは、この相違は、ＮＰＡＲアゴニストの保存的置換体について定義したように保存的である。

別の具体的な態様では、トロンビンペプチド誘導体は、アミノ酸配列の配列番号２３：Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｘｂｂ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅを有するポリペプチド、またはアミノ酸６〜２８を含むそのフラグメントを含む。より好ましくは、トロンビンペプチド誘導体は、アミノ酸配列の配列番号２４：Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｘｂｂ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｘ_１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ_２−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅを有するポリペプチド、または、アミノ酸６〜２８を含むそのフラグメントを含む。ＸａａおよびＸｂｂは、独立して、アラニン、グリシン、セリンまたはＳ−保護システインである。Ｘ_１はＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ｘ_２はＰｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＶａｌである。好ましくは、Ｘ_１はＧｌｕであり、Ｘ_２はＰｈｅであり、ＸａａおよびＸｂｂはアラニンである。このタイプのトロンビンペプチド誘導体の一例は、アミノ酸配列Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（配列番号２５）を含むポリペプチドである。このタイプのトロンビンペプチド誘導体の更なる例は、ポリペプチドＨ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＮＨ_２（配列番号２６）である。トロンビンペプチド誘導体における０、１、２または３個のアミノ酸は、配列番号２３、２４、２５または２６の対応する位置のアミノ酸とは異なっていてもよい。ＸａａおよびＸｂｂは、独立して、アラニン、グリシン、セリンまたはＳ−保護システインである。好ましくは、この相違は、ＮＰＡＲアゴニストの保存的置換体におけるような保存である。

「Ｓ−保護システイン」は、チオール部分、−ＳＨの反応性が保護基でブロックされているシステイン残基である。適切な保護基は、当該技術分野において知られ、例えば、Ｔ．Ｗ．ＧｒｅｅｎｅおよびＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第３版，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，（１９９９），ｐｐ．４５４−４９３に開示され、そこでの教示は、参照により全体として本明細書中に援用される。適切な保護基は、医薬製剤において非毒性であって安定であり、トロンビンペプチド誘導体の活性を維持するために最小の付加的な官能性を有していなければならない。遊離のチオールは、チオエーテル、チオエステルとして保護され得て、または非対称のジスルフィドに酸化され得る。好ましくは、このチオールは、チオエーテルとして保護される。適切なチオエーテルには、限定されないが、Ｓ−アルキルチオエーテル（例えば、Ｃ_１−Ｃ_５アルキル）、Ｓ−ベンジルチオエーテル（例えば、システイン−Ｓ−Ｓ−ｔ−Ｂｕ）が挙げられる。好ましくは、保護基は、アルキルチオエーテルである。より好ましくは、Ｓ−保護システインは、Ｓ−メチルシステインである。あるいは、保護基は、１）ジスルフィド結合によってトロンビンペプチド誘導体のシステインチオール基に結合されたシステインまたはシステイン含有ペプチド（「保護ペプチド」）；または２）トロンビンペプチド誘導体のシステインチオール基と保護ペプチドのカルボン酸（例えば、Ｃ末端またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸の側鎖）との間のチオアミドによって結合されたアミノ酸またはペプチド（「保護ペプチド」）であり得る。保護ペプチドは、生理学的に不活性であり得て（例えば、場合によりシステインによって中断された５個以下のアミノ酸のポリグリシンまたはポリアラニン）、または所望の生物活性を有することができる。

トロンビンペプチド誘導体二量体
本発明のいくつかの局面では、本方法のＮＰＡＲアゴニストは、トロンビンペプチド誘導体二量体である。参照により本明細書中に援用される米国特許出願公開第ＵＳ２００５／０１５３８９３を参照されたい。この二量体は、本質的には、単量体に戻らず、なおも、上述したトロンビンペプチド誘導体単量体とほぼ同じ生物活性を有する。「トロンビンペプチド誘導体二量体」は、共有結合、好ましくはシステイン残基間のジスルフィド結合によって連結された２つのトロンビンペプチド誘導体を含む分子である。トロンビンペプチド誘導体二量体は、典型的には、対応する単量体を本質的には含まず、例えば９５重量％を超えて含まず、好ましくは９９重量％を超えて含まない。好ましくは、これらのポリペプチドは同じであり、ジスルフィド結合を介して共有結合的に連結されている。

本発明のトロンビンペプチド誘導体二量体は、上述されるトロンビンペプチド誘導体を含む。具体的には、トロンビンペプチド誘導体は、約５０個以下のアミノ酸、好ましくは３３個以下のアミノ酸を有する。また、トロンビンペプチド誘導体は、トロンビンのアミノ酸残基５０８〜５３０：Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号６）に対応するヒトのトロンビンのフラグメントに十分に相同性を有し、その結果、このポリペプチドはＮＰＡＲを活性化する。本明細書に記載されているトロンビンペプチド誘導体二量体は、典型的には、少なくとも６個のアミノ酸、好ましくは約１２〜約３３個のアミノ酸残基、より好ましくは約１２個〜約２３個のアミノ残基を有するポリペプチドから形成される。

具体的な態様では、二量体を含む各々のトロンビンペプチド誘導体は、アミノ酸配列の配列番号１：Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｘ_１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ_２−Ｖａｌを有するポリペプチド、または少なくとも６個のアミノ酸を含むＣ末端切断されたそのフラグメントを含む。より具体的には、各々のトロンビンペプチド誘導体は、配列番号６のアミノ酸配列：Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ、または配列番号５のアミノ酸１０〜１８を含むそのフラグメントを含む。さらにより具体的には、トロンビンペプチド誘導体は、アミノ酸配列の配列番号２：Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｘ_１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ_２−Ｖａｌ、または配列番号２のアミノ酸１０〜１８を含むそのフラグメントを含む。Ｘ_１はＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ｘ_２はＰｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＶａｌである。好ましくは、Ｘ_１はＧｌｕであり、Ｘ_２はＰｈｅである。このタイプのトロンビンペプチド誘導体の一例は、アミノ酸配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号６）を含むポリペプチドである。このタイプのトロンビンペプチド誘導体の更なる例には、アミノ酸配列Ｈ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−ＮＨ_２（配列番号３）を有するポリペプチドである。トロンビンペプチド誘導体における０、１、２または３個のアミノ酸は、配列番号６、１、２、または３の対応する位置のアミノ酸とは異なる。好ましくは、この相違は、ＮＰＡＲアゴニストの保存的置換体に関して保存的である。

本発明のトロンビンペプチド誘導体二量体の一例は、式（ＩＶ）：

によって表される。

別の具体的な態様では、二量体を含むトロンビンペプチド誘導体の各々は、アミノ酸配列の配列番号２７：Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒを含むポリペプチド、または少なくとも２３個のアミノ酸を有するＣ末端切断されたそのフラグメントを含む。より好ましくは、各々のトロンビンペプチド誘導体は、アミノ酸配列の配列番号２８：Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｘ_１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ_２−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ、または少なくとも２３個のアミノ酸を含むＣ末端切断されたそのフラグメントを含む。Ｘ_１はＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ｘ_２はＰｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＶａｌである。好ましくは、Ｘ_１はＧｌｕであり、Ｘ_２はＰｈｅである。このタイプのトロンビンペプチド誘導体の一例は、アミノ酸配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ（配列番号２７）を含むポリペプチドである。このタイプのトロンビンペプチド誘導体の更なる例は、アミノ酸配列Ｈ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−ＮＨ_２（配列番号２９）を含むポリペプチドである。トロンビンペプチド誘導体における０、１、２または３個のアミノ酸は、配列番号２７、２８または２９個の対応する位置のアミノ酸とは異なっている。好ましくは、この相違は、ＮＰＡＲアゴニストの保存的置換体について定義されたように保存的である。

ＮＰＡＲアゴニスト抗体
ＮＰＡＲの特定の種類には、非タンパク質分解的に活性化されたトロンビン受容体（ＮＰＡＲ）に結合し、活性化することができ、後述する１以上の相補的ペプチドに結合することができる抗体および抗原結合フラグメントが含まれる。トロンビン受容体に結合するアゴニスト抗体は、当該技術分野において記載されている。例えば、Ｆｒｏｓｔらは、モノクローナル抗体であるＴＲ−９が高親和性のトロンビン受容体とのトロンビンの高親和性相互作用の効果を模倣することができることを教示する（Ｆｒｏｓｔ，Ｇ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０５（６ ＰＴ．１）：２５５１−５８（１９８７））。

ＮＰＡＲアゴニストである抗体またはその抗原結合フラグメントは、トロンビンの一部をコードするヌクレオチド配列の相補体によってコードされる相補的ペプチドへのそれらの結合によって見出すことができる。下記のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ Ｔｈｅｏｒｙを参照されたい。一例では、ＮＰＡＲアゴニスト抗体または抗原結合フラグメントは、トロンビンの一部をコードするヌクレオチド配列の相補体によってコードされる相補的ペプチドに結合する。別の例では、ＮＰＡＲアゴニスト抗体または抗原結合フラグメントは、トロンビンの一部をコードするヌクレオチド配列の相補体によってコードされる相補的ペプチドへのその結合によって見出すことができる。一態様では、トロンビンまたはその一部（センスまたは＋ＲＮＡ鎖によってコードされ、抗体または抗原結合フラグメントが結合する相補的ペプチドをコードするＲＮＡ鎖の相補体である）は、哺乳動物のトロンビンであるかまたは哺乳動物のトロンビンの一部である。別の態様では、トロンビンまたはその一部は、ヒトのトロンビンまたはヒトのトロンビンの一部である。

相補的ペプチドに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントは、該相補的ペプチドがトロンビンまたはその一部をコードするヌクレオチド配列の相補体によってコードされており、ＮＰＡＲアゴニストであり得る。一態様では、トロンビンの一部（センスまたは＋ＲＮＡ鎖によってコードされ、抗体または抗原結合フラグメントが結合する相補的ペプチドをコードするＲＮＡ鎖の相補体である）は、哺乳動物のトロンビンであるかまたは哺乳動物のトロンビンの一部である。本明細書中で使用するとき、トロンビン受容体結合ドメインまたはその部分は、高親和性のタンパク質分解的に活性化されたトロンビン受容体（ＮＰＡＲ）に選択的に結合することができる。このようなトロンビン受容体結合ドメインは、フィブロネクチンのトリペプチド細胞結合ドメインであるＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐに対する配列相同性を有するドメインの一部（ヒトのトロンビンのアミノ酸残基５１７−５２０によって表される；ヒトのプロトロンビンのアミノ酸配列（配列番号１２）を示す図７を参照されたいを含む。特定の態様では、トロンビン受容体結合ドメインまたはその一部は、アミノ酸配列ＡＧＹＫＰＤＥＧＫＲＧＤＡＣＥＧＤＳＧＧＰＦＶ（即ち、ヒトのトロンビンのアミノ酸配列５０８−５３０（配列番号６））を含む。別の態様では、トロンビン受容体結合ドメインまたはその一部は、トロンビン受容体結合ドメインの一部であり、アミノ酸配列ＥＧＫＲＧＤＡＣＥＧ（配列番号７）を含む。

本明細書に記載されるように、アンチセンスＲＮＡの５’−３’配列とアンチセンス鎖の３’−５’配列の両方によってコードされているトロンビンのドメインの相補的ペプチドを用いて、本発明のＮＰＡＲアゴニスト抗体抗原結合ドメインを生成することができる。したがって、一態様では、相補的ペプチド（抗体および抗原結合フラグメントが結合する）は、アンチセンスＲＮＡ鎖の５’−３’配列によってコードされる。別の態様では、相補的ペプチドは、アンチセンスＲＮＡ鎖の３’−５’配列によってコードされる。

一例では、相補的ペプチド（本発明のＮＰＡＲアゴニスト抗体および抗原結合フラグメントが結合する）は、アミノ酸配列ＫＧＳＰＴＶＴＦＴＧＩＰＣＦＰＦＩＲＬＶＴＳ（ＡＣ−２３；配列番号３０）を含む。別の例では、相補的ペプチドは、アミノ酸配列ＫＧＳＰＴＶＴＦＴＧＩＰＳＦＰＦＩＲＬＶＴＳ（２３Ｃ５３；配列番号３１）を含む。さらに別の例では、相補的ペプチドは、アミノ酸配列ＴＦＴＧＩＰＳＦＰＦ（Ｃ１０５３；配列番号３２）を含む。なお別の例では、相補的ペプチドは、アミノ酸配列ＲＰＭＦＧＬＬＰＦＡＰＬＲＴＬＰＬＳＰＰＧＫＱ［ＡＣ−２３ｒｅｖ（配列番号３３）、ＡＣ−２３に対応する相補５’−３’ペプチドである］を含む。なお更なる例では、相補的ペプチドは、アミノ酸配列ＬＰＦＡＰＬＲＴＬＰ［Ｃ１０５３ｒｅｖ（配列番号３４）、Ｃ１０５３に対応する相補５’−３’ペプチドである］を含む。

ＮＰＡＲアゴニスト抗体またはその抗原結合フラグメントの一例は、アミノ酸配列ＫＧＳＰＴＶＴＦＴＧＩＰＳＦＰＦＩＲＬＶＴＳ（２３Ｃ５３；配列番号３１）を含むシステイン変換相補的ペプチドに結合する。２３Ｃ５３は、ＡＣ−２３とは１個のアミノ酸によって相違するが、ＣｙｓからＳｅｒへの１個のアミノ酸変換を有することを除けば、ＴＰ５０８の相補的ペプチドである。

ビオチン結合のトロンビンを用いた結合実験では、トロンビンは、ＡＣ２３および２３Ｃ５３に特異的に結合することが見出された。ビオチン標識したトロンビンのＡＣ−２３への最大半分の結合は、４．８±０．２ｎＭ（ｎ＝２±ＳＤ）であった。

ＴＰ５０８の添加は、ビオチン標識したトロンビンのＡＣ−２３への特異的な結合を阻害した。ＡＣ−２３へのトロンビン結合の最大６０％が、ＴＰ５０８の添加によって阻害することができる。したがって、トロンビンおよびＴＰ５０８は、相補的ペプチドＡＣ−２３に結合する。これは、ＡＣ−２３が、細胞上のトロンビン−ＴＰ５０８受容体に類似した３次元構造を有することを示唆している。よって、ＡＣ−２３およびトロンビンの他の相補的ペプチドの抗体は、ＴＰ５０８によって活性化されるトロンビン結合部位を特徴付けるために用いることができ、本明細書に記載されている治療的および他の方法に用いることができる。

トロンビン受容体結合ドメインに加えて、刺激性（アゴニスト性）トロンビンポリペプチド誘導体は、多数のセリンエステラーゼに対して高度な相同性を有するドメイン（ヒトのトロンビンのアミノ酸残基５１９−５３０によって表される）を有する。しかしながら、阻害性（アンタゴニスト性）トロンビンポリペプチド誘導体は、セリンエステラーゼドメインを含まない。

ヒトのトロンビンのアミノ酸残基５０８−５３０由来のトロンビンペプチド誘導体は、トロンビン受容体媒介の細胞刺激を促進することが記載されている。さらに、フィブロネクチン−およびセリンプロテアーゼ−相同ドメイン（ヒトのトロンビンの残基５０８〜５３０）を含む刺激性（アゴニスト性）トロンビンポリペプチド誘導体は、高親和性でトロンビン受容体に結合し、受容体占有に関連した細胞増殖シグナルの開始剤としてＤＩＰ−アルファ−トロンビンと置き換わる。（ＤＩＰ−アルファ−トロンビンは、受容体結合活性を保持しているトロンビンのタンパク質分解的に不活性な誘導体である。）対照的に、フィブロネクチン−相同ドメイン（ｐ５１７−５２０）（セリンプロテアーゼ−相同ドメインではない）だけを含む阻害性（アンタゴニスト性）トロンビンポリペプチド誘導体は、有子分裂を誘導することなしにトロンビン受容体に結合する。中間体のトロンビンペプチド誘導体（ｐ５１９−５３０）は、有子分裂を誘導するが、ｐ５０８−５３０と比較して非常に程度が小さい。

分子認識理論
ＢｌａｌｏｃｋおよびＳｍｉｔｈ（１９８４）は、アミノ酸残基のヒドロパシー特性が、転写されるトリプレットコドンの中央の文字の固有性に関連することを観察した（Ｂｌａｌｏｃｋ，Ｊ．Ｅ．，およびＳｍｉｔｈ，Ｅ．Ｍ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２：２０３−０７（１９８４））。具体的には、中央の塩基としてチミン（Ｔ）のトリプレットコドンは疎水性残基をコードし、アデニン（Ａ）は親水性残基をコードする。シトシン（Ｃ）またはグアニン（Ｇ）の中央の塩基のトリプレットコドンは、相対的に中性である残基をコードし、同様のヒドロパシースコアを有する。ヒドロパシーは、極性環境に対するアミノ酸のアフィニティーの指標である；親水性残基はより負のスコアを生じ、疎水性残基はより正のスコアを提示する。ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）は、幅広く用いられるヒドロパシースケールであると考えた（（Ｋｙｔｅ，Ｊ．，およびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５：１０５−３２（１９８２））。トリプレットコドンの中央の塩基と残基のヒドロパシーとの間の観察された関係は、相補ＤＮＡによってコードされたペプチドが相補的であり、または反転したヒドロパシープロフィールを示すことを伴う。相補ＤＮＡ鎖においてコードされた２つのペプチド配列は、反転したヒドロパシープロフィールを示すため、それらは、両親媒性の二次構造を形成し、互いに結合してもよいことが提案された（Ｂｏｓｔ，Ｋ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：１３７２−７５（１９８５））。相補的ペプチドは、異なる多数の系のためのそれらの「センス」ペプチド対応物との結合複合体を形成することが報告されている（Ｒｏｏｔ−Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｒ．Ｓ．，およびＨｏｌｓｗｏｒｔｈｙ，Ｄ．Ｄ．，Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．１９０：１０７−１９（１９８８））。例えば、ＧｈｏおよびＣｈａｅは、アンギオジェニンの受容体結合部位に対応するアンチセンスＲＮＡ配列によってコードされる相補的ペプチドであるヒトのアンギオジェニンのペプチドアンタゴニストを記載する（Ｇｈｏ，Ｙ．Ｓ．およびＣｈａｅ，Ｃ．Ｂ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（３９）：２４２９４−９９（１９９７））。Ｇｈｉｓｏらは、阻害活性を示すシステインＣの領域に相補的なペプチドを記載し（Ｇｈｉｓｏ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７（４）：１２８８−９１（１９９０））、ＢｏｓｔおよびＢｌａｌｏｃｋは、相補的ペプチドの対を用いた免疫化によってアンチイディオタイプの抗体の生成を記載する（Ｂｏｓｔ．Ｋ．Ｌ．，およびＢｌａｌｏｃｋ，Ｊ．Ｅ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１：１７９−８３（１９８９））。

タンパク質間の相互作用を説明するためのこの分析の範囲は、Ｂｌａｌｏｃｋによってさらに広げられ、分子認識理論（ＭＲＴ）が提案された（Ｂｏｓｔ，Ｋ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：１３７２−７５（１９８５）；Ｂｌａｌｏｃｋ，Ｊ．Ｅ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１：８７６−７８（１９９５））。この理論は、相互作用の「分子認識」コードが、このようなペプチドが反転したヒドロパシープロフィールを示すようになるという観察に基づいて、ＤＮＡの相補鎖によってコードされるペプチド間に存在することを示唆している。ＭＲＴは、特定の結合相互作用の予測に成功した。

Ｂｌａｌｏｃｋは、二次構造環境を明確するのは、（特定の残基の固有性の組合せというよりはむしろ）配列におけるアミノ酸のヒドロパシースコアの線形パターンであることを示唆した。さらに、彼は、反転したヒドロパシープロフィールを有する配列は、それらの立体的関係を決定する反転力のために、形状において相補的であることを示唆した。
３’−５’リーディングフレームにおける相補的ペプチドの誘導
Ｂｌａｌｏｃｋの最初の作業に対する当然の結果として、彼は、通常の５’−３’方向における相補コドンを読むことと同様に、３’−５’方向における相補コドンを読むことも反対のヒドロパシープロフィールを示すアミノ酸配列を与えることを主張した（Ｂｏｓｔ，Ｋ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：１３７２−７５（１９８５））。これは、トリプレットコドンの中央の塩基が、それがコードする残基のヒドロパシー指標を決定し、したがって、逆方法にコドンを読むことは固有性を変化させるが、コードされたアミノ酸のヒドロパシー性を変化しない場合があるという観察から得られる。

（表１：アミノ酸と相補鎖においてコードされた残基と間の関係）

抗体および抗体を生成する細胞
本明細書に言及されるＮＰＡＲアゴニストは、本明細書に記載されている相補的ペプチドに結合し、非タンパク質分解的に活性化されたトロンビン受容体を活性化するる抗体およびその抗原結合フラグメントを含む。本明細書に言及される抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであってもよく、用語「抗体」とは、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の両方を含むことが意図される。用語のポリクローナルおよびモノクローナルとは、抗体調製物の均一性の程度を指し、特定の生成法に限定することは意図されない。一態様では、抗体または抗原を結合するフラグメントは、モノクローナル抗体または抗原を結合するそのフラグメントである。用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、本明細書中で使用するとき、本発明のポリペプチドの特定のエピトープと免疫反応することができる、たった１種類の抗原結合部位を含む抗体分子の集合を意味する。このようにして、モノクローナル抗体組成物は、典型的には、それが免疫反応する本発明の特定のポリペプチドに対する１つの結合親和性を示す。

また、用語「抗体」は、本明細書中で使用するとき、抗体の機能性フラグメントを含み、キメラ、ヒト化、霊長類化合板状（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）または一本鎖抗体のフラグメントが含まれる。機能性フラグメントには、相補的ペプチドに結合する抗体の抗原を結合するフラグメントを含み、ここで、相補的ペプチドは、トロンビンをコードするヌクレオチド配列またはその一部の相補体によってコードされる。例えば、相補的ペプチドに結合することができる抗体フラグメントには、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）_２フラグメントが含まれる。このようなフラグメントは、酵素的開裂によるかまたは組換え技術によって生成可能である。例えば、パパインまたはペプシン開裂により、それぞれＦａｂまたはＦ（ａｂ’）_２フラグメントが生じ得る。また、必須の基質特異性を有する他のプロテアーゼを用いて、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）_２フラグメントを生成することができる。抗体はまた、１以上の終止コドンが天然の終止コドンの上流に導入された抗体遺伝子を用いて種々の切断形態で生成することができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）_２重鎖部分をコードするキメラ遺伝子を設計して、ＣＨ_１ドメインおよびこの重鎖のヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含むことができる。

異種由来の部分を含む、一本鎖抗体、キメラ、ヒト化または霊長類化（ＣＤＲ−グラフト化）、または合板状抗体、並びにキメラ、ＣＤＲ−グラフト化または合板状一本鎖抗体はまた、抗体なる用語に含まれる。これらの抗体の種々の部分は、慣用的な技術によって化学的に一緒になって連結することができ、または遺伝子工学的技術を用いて隣接タンパク質として調製可能である。例えば、キメラまたはヒト化した鎖をコードする核酸を発現させて、隣接タンパク質を生成することができる。例えば、Ｃａｂｉｌｌｙら，米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙら，欧州特許第０，１２５，０２３Ｂ１号；Ｂｏｓｓら，米国特許第４，８１６，３９７号；Ｂｏｓｓら，欧州特許第０，１２０，６９４Ｂ１号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら，国際公開第ＷＯ８６／０１５３３号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら，欧州特許第０，１９４，２７６Ｂ１号；Ｗｉｎｔｅｒ，米国特許第５，２２５，５３９号；Ｗｉｎｔｅｒ，欧州特許第０，２３９，４００Ｂ１；Ｑｕｅｅｎら，欧州特許第０４５１２１６Ｂ１号；Ｐａｄｌａｎ，Ｅ．Ａ．ら，欧州特許第０５１９５９６Ａ１号を参照されたい。また、霊長類化抗体に関するＮｅｗｍａｎ，Ｒ．ら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１４５５−１４６０（１９９２）、一本鎖抗体に関するＬａｄｎｅｒら，米国特許第４，９４６，７７８号、Ｂｉｒｄ， Ｒ．Ｅ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３−４２６（１９８８））を参照されたい。

ヒト化した抗体は、標準的な方法または他の適切な技術を用いて、合成または組換えＤＮＡ技術により生成することができる。また、ヒト化した可変領域をコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡ）配列は、ヒトまたはヒト化された鎖をコードするＤＮＡ配列、例えば、以前にヒト化された可変領域（例えば、Ｋａｍｍａｎ，Ｍ．ら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１７：５４０４（１９８９））；Ｓａｔｏ，Ｋ．ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５３：８５１−８５６（１９９３）；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ，Ｂ．Ｌ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９（９）：２４７１−２４７６（１９９１）；ａｎｄ Ｌｅｗｉｓ，Ａ．Ｐ．およびＪ．Ｓ．Ｃｒｏｗｅ，Ｇｅｎｅ，１０１：２９７−３０２（１９９１）を参照されたい）由来のＤＮＡ鋳型を変更するためのＰＣＲ突然変異生成を用いて構築することもできる。これらまたは他の適切な方法を用いて、変異体はまた、容易に生成することができる。一態様では、クローニングされた可変領域を突然変異することができ、所望の特異性を有する変異体をコードする配列を（例えば、ファージライブラリーから；Ｋｒｅｂｂｅｒら，米国特許第５，５１４，５４８号；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら，国際公開第ＷＯ９３／０６２１３号）選択することができる。

抗体は、１以上の免疫グロブリン鎖［例えば、非ヒト起源の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体（例えば、非ヒト起源の抗体由来の１以上のＣＤＲ）］、ヒト起源の軽鎖および／または重鎖由来のフレームワーク領域（例えば、フレームワーク変化の有無によるＣＤＲをグラフト化した抗体）］を含むヒト化抗体であり得る。一態様では、抗体または抗原を結合するそのフラグメントは、特定の免疫グロブリンの軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）および重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）を含む。別の態様では、抗体または抗原を結合することができるフラグメントは、さらにヒトフレームワーク領域を含む。

相補的ペプチドがトロンビンをコードするヌクレオチド配列またはその一部の相補体によってコードされる抗体は、合成もしくは組換え相補的ペプチドまたはその一部などの適切な免疫原に対して生じ得る。また、抗体は、相補的ペプチドを発現するトランスフェクトされた細胞を用いて適切な宿主（例えば、マウス）を免疫することによって生じさせることができる。また、このような細胞は、それに結合する抗体に対するスクリーニングにおいて用いることができる（例えば、Ｃｈｕｎｔｈａｒａｐａｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：１７８３−１７８９（１９９４）；Ｃｈｕｎｔｈａｒａｐａｉら，米国特許第５，４４０，０２１号を参照されたい）。

免疫抗原の調製、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体生成は、任意の適切な技術（例えば、本明細書の例示されるもの）を用いて行うことができる。種々の方法が記載されている（Ｋｏｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７（１９７５）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９（１９７６）；Ｍｉｌｓｔｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ ２６６：５５０−５５２（１９７７）；Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉら，米国特許第４，１７２，１２４号；Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＤ．Ｌａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ２７，Ｓｕｍｍｅｒ’９４），Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，Ｅｄｓ．，（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ），１１章，（１９９１）を参照されたい）。一般に、ハイブリドーマは、適切な不死化細胞株（例えば、ＳＰ２／０、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３またはヘテロ骨髄腫細胞株などの骨髄腫細胞株）と抗体産生細胞とを誘導することによって生産される。抗体産生細胞は、相補的ペプチドで免疫したヒトまたは他の適切な動物の末梢血、または、好ましくは脾臓もしくはリンパ節から得ることができる。融合細胞（ハイブリドーマ）は、選択的培養条件を用いて単離し、限外希釈によってクローニングすることができる。所望の特異性を有する抗体を生成する細胞は、適切なアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）によって選択され得る。

必要な特異性（例えば、ヒト抗体または抗原を結合するフラグメント）の抗体を生成または単離する他の適切な方法を用いることができ、例えば、ライブラリー（例えば、ファージディスプレイライブラリー）から組換え抗体を選択する方法が挙げられる。ヒト抗体のレパートリーを生成することができるトランスジェニック動物（例えば、Ｘｅｎｏｍａｕｓｅ（登録商標）（Ａｂｇｅｎｉｘ，カリフォルニア州フレモント（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ））は、適切な方法を用いて生成することができる（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１−２５５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）を参照されたい）。ヒト抗体のレパートリーを生成することができるトランスジェニック動物の生成に適した追加の方法は、記載されている（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇら，米国特許第５，５４５，８０６号；Ｓｕｒａｎｉら，米国特許第５，５４５，８０７号；Ｌｏｎｂｅｒｇら，国際公開第ＷＯ９７／１３８５２号）。

また、本発明は、本明細書に記載されている相補的ペプチド、および少なくとも１つのホ他の抗原（例えば、腫瘍抗原、ウイルス抗原）に結合する二重特異性抗体、またはその機能性フラグメントを含む。二重特異性抗体は、トリオーマ（ｔｏｒｉｏｍａ）およびハイブリッドハイブリドーマによって分泌され得る。一般に、トリオーマは、ハイブリドーマおよびリンパ球（例えば、抗体分泌Ｂ細胞）の融合によって形成され、ハイブリッドハイブリドーマは、２つのハイブリドーマの融合によって形成される。融合細胞（即ち、ハイブリドーマ、リンパ球）の各々は、一重特異性抗体を生成する。しかしながら、トリオーマおよびハイブリッドハイブリドーマは、種々の抗原を認識する抗原結合部位を含む抗体を生成することができる。トリオーマおよびハイブリッドハイブリドーマの上清は、適切なアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）を用いて二重特異性抗体についてアッセイすることができ、二重特異性抗体は、従来の方法を用いて精製され得る。（例えば、米国特許第５，９５９，０８４号（Ｒｉｎｇら）、米国特許第５，１４１，７３６号（Ｉｗａｓａら）、米国特許第４，４４４，８７８、同第５，２９２，６６８号、同第５，５２３，２１０号（全てＰａｕｌｕｓら）、および米国特許第５，４９６，５４９号（Ｙａｍａｚａｋｉら）を参照されたい））。

血管新生増殖因子
「血管新生増殖因子」は、血管の発達を刺激するポリペプチドであり、例えば、血管新生、内皮細胞増殖、血管の安定性、および／または脈管形成を促進する。例えば、血管新生因子には、限定されないが、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦファミリー、ＰｌＧＦ、ＰＤＧＦファミリー、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＴＩＥリガンド（アンジオポイエチン）、エフリン（ｅｐｈｒｉｎ）、ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＮＧＰＴＬ４などが挙げられる。また、血管新生因子には、増殖ホルモン、インスリン様増殖因子−Ｉ（ＩＧＦ−１）、ＶＩＧＦ、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、ＣＴＧＦおよびそのファミリーのメンバー、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βなどのポリペプチドが含まれる。例えば、ＫｌａｇｓｂｒｕｎおよびＤ’Ａｍｏｒｅ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，５３：２１７−３９（１９９１）；ＳｔｒｅｉｔおよびＤｅｔｍａｒ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２２：３１７２−３１７９（２００３）；Ｆｅｒｒａｒａ ＆ Ａｌｉｔａｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５（１２）：１３５９−１３６４（１９９９）；Ｔｏｎｉｎｉら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２２：６５４９−６５５６（２００３）；Ｓａｔｏ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，８：２００−２０６（２００３）を参照されたい。

用語「ＶＥＧＦ」（「ＶＥＧＦ−Ａ」とも呼ばれる）とは、本明細書中で使用するとき、血管内皮増殖因子タンパク質Ａを指す。用語「ヒトＶＥＧＦ」（「ヒトＶＥＧＦ−Ａ」とも呼ばれる）とは、本明細書中で使用するとき、ヒト血管内皮細胞増殖因子のアイソフォームのいずれかを指す。所望のアイソフォーム（デファレンシャルｍＲＮＡスプラシング）には、１２１、１４５、１４８、１６５、１６５ｂ、１８３、１８９および２０６が含まれる。例えば、表２およびＬｅｕｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１３０６（１９８９），Ｈｏｕｃｋら，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．５：１８０６（１９９１）を参照されたい。また、「ヒトＶＥＧＦ」には、天然に存在するヒトＶＥＧＦ−Ａの対立遺伝子の変異体、翻訳後の修飾における変化によって生じる変異体が含まれる。表２は、包括的および限定的であるとを意図しない。表２に記載の血管新生増殖因子ｈ、他に指示がなければ、ヒトである。

（表２ ＶＥＧＦファミリーの血管新生増殖因子の例）

参考文献

ヒトＶＥＧＦ−Ａは、第６染色体に位置した第８エクソンに編成された一本鎖遺伝子のｍＲＮＡの選択的スプラシングから生じる多数のアイソフォームとして存在する（例えば、Ｆｅｒｒａｒａ Ｎ，Ｄａｖｉｓ Ｓｍｙｔｈ Ｔ．Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｖ １８：１−２２（１９９７）；ＨｅｎｒｙおよびＡｂｒａｈａｍ，Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｉｔｈ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２：２２８−２４１（２０００）を参照されたい）。また、米国特許第５，３３２，６７１号および同第６，８９９，８８２号を参照されたい。一態様では、ＶＥＧＦ_１６５は、本発明の方法において投与される（例えば、組換えヒトＶＥＧＦ_１６５）。ＶＥＧＦ_１６５は、最も豊富なアイソフォームであり、約４５，０００ダルトン（Ｉｄ）の分子量を有する塩基性ヘパリン結合の二量体共有結合の糖タンパク質である。ＶＥＧＦ_１６５ホモ二量体は、２つの１６５個のアミノ酸鎖からなる。タンパク質は、２種のドメイン：受容体結合ドメイン（残基１〜１１０）およびヘパリン結合ドメイン（残基１１０〜１６５）を有する。これらのドメインは、７つの分子内ジスルフィド結合によって安定化され、単量体は、２つの鎖間のジスルフィド結合によって連結され、天然のホモ二量体を形成する。ＶＥＧＦ_１２１は、ヘパリン結合ドメインを欠損し（例えば、米国特許第５，１９４，５９６号を参照されたい）、ＶＥＧＦ_１８９（例えば、米国特許第５，００８，１９６号；同第５，０３６，００３号；および同第５，２４０，８４８号を参照されたい）、ＶＥＧＦ_２０６は、細胞外マトリックス内に隔離されている。

また、用語「血管新生増殖因子」は、表３において以下のものを含む。表３のリストは、包括的および限定的であるとを意図しない。

（表３）

参考文献

「自然の」ポリペプチド（例えば、天然の血管新生因子）は、天然起源から単離されたポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドである。このようにして、自然のポリペプチドは、いずれかの哺乳動物、例えばヒト由来の自然に存在しているポリペプチドのアミノ酸配列を有することができる。このような自然のポリペプチドは、天然から単離することができ、組換えまたは合成手法によって生成することができる。用語である自然のポリペプチドには、天然に存在する、ポリペプチド（例えば、細胞外ドメイン配列）の切断または分泌形態、野生型として示される対立遺伝子の形態、天然に存在している変異形態（例えば、選択的にスプライスされたイソ形態）、天然に存在している、ポリペプチドの対立遺伝子変異体が含まれる。

「ポリペプチド変異体」（例えば、血管新生因子のポリペプチド変異体）は、自然のポリペプチドと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する生物学的に活性なポリペプチドを意味する。このような「ポリペプチド変異体」には、例えば、１以上のアミノ酸残基が、自然のポリペプチドと比較してポリペプチドのＮ−および／またはＣ末端で付加、または欠失されるポリペプチドが含まれる。通常、ポリペプチド変異体は、自然のポリペプチドと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有する。ポリペプチド変異体には、自然のポリペプチドからの１以上のアミノ酸置換、付加もしくは欠失を含むポリペプチド、またはこれらの相違のいずれかの組み合わせを含むポリペプチドが含まれる。ポリペプチド変異体は、例えば、自然のポリペプチドと比較して、いくつかの、例えば５〜１０、１〜５、または４、３、２もしくは１個の置換、欠失、または付加された、そのいずれかの組合せであるアミノ酸を有することができる。一態様では、変異体は、自然のポリペプチドと比較して、ポリペプチドの性質および活性を有意に変更しないサイレントな置換、付加および／または欠失を有する。また、ポリペプチド変異体は、１以上のアミノ酸残基が修飾されている修飾されたポリペプチドであり得る。ポリペプチド変異体は、当該技術分野において周知の種々の方法によって調製され得る。自然のポリペプチドとはアミノ酸配列が異なっているポリペプチド変異体は、コーディングＤＮＡにおける突然変異によって調製可能である。また、ポリペプチド変異体には、糖付加または他の翻訳後の修飾において自然のポリペプチドとは異なっているポリペプチドが含まれる。

ポリペプチド変異体は、例えば、自然のポリペプチドをコードするＤＮＡにおけるヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発、またはファージディスプレイ技術により、変異体をコードするＤＮＡを生成し、その後に組換え細胞培養においてＤＮＡを発現することによって調製することができる。

アミノ酸欠失は、一般に、約１〜３０残基、場合により１〜１０残基、場合により１〜５未満の範囲であり、典型的には、隣接している。

アミノ酸配列の付加には、１残基から本質的には長さを限定しないポリペプチドまでのアミノ−および／またはカルボキシル−末端融合、並びに１個または複数個のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。配列内付加（即ち、自然のポリペプチド配列内の付加）は、一般に、約１〜１０残基、場合により１〜５、または場合により１〜３の範囲であってもよい。末端挿入の例には、宿主細胞に対して異種または同種である一本鎖配列によるＮ末端への誘導が含まれ、それにより、組換え宿主からの分泌悦を促進する。

付加的なポリペプチド変異体は、自然のポリペプチドにおける少なくとも１つのアミノ酸残基が取り除かれ、異なったアミノ酸残基がその場所に挿入（置換）されたものである。血管新生増殖因子のポリペプチド変異体における保存的置換体は、表４に示されるものに従って行われてもよく、ここで、例示的な置換および好ましい置換は、血管新生増殖因子のポリペプチド変異体における保存的置換体である。また、ポリペプチド変異体は、本明細書に記載される天然にはないアミノ酸を含むことができる。

アミノ酸は、それらの側鎖の性質における類似性に従って分類することができる（Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２版，ｐｐ．７３−７５，Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７５））：
（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）
（２）非電荷極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）
（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）
（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）
あるいは、自然に存在しているアミノ酸は、共通の側鎖の性質に基づいてグループに分けてもよい：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。

「天然に存在するアミノ酸残基」（即ち、遺伝コードによってコードされたアミノ酸）は、アラニン（Ａｌａ）；アルギニン（Ａｒｇ）；アスパラギン（Ａｓｎ）；アスパラギン酸（Ａｓｐ）；システイン（Ｃｙｓ）；グルタミン（Ｇｌｎ）；グルタミン酸（Ｇｌｕ）；グリシン（Ｇｌｙ）；ヒスチジン（Ｈｉｓ）；イソロイシン（Ｉｌｅ）：ロイシン（Ｌｅｕ）；リジン（Ｌｙｓ）；メチオニン（Ｍｅｔ）；フェニルアラニン（Ｐｈｅ）；プロリン（Ｐｒｏ）；セリン（Ｓｅｒ）；スレオニン（Ｔｈｒ）；トリプトファン（Ｔｒｐ）；チロシン（Ｔｙｒ）；およびバリン（Ｖａｌ）からなる群から選択されてもよい。「天然に存在しないアミノ酸残基」とは、上記で列挙した天然に存在するアミノ酸残基を以外のアミノ酸残基を指す。ペプチド結合を介したポリペプチド鎖における隣接したアミノ酸残基（単数または複数）に結合し得る、天然に存在しないアミノ酸残基の例には、例えば、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン、Ｅｌｌｍａｎら．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２０２：３０１−３３６（１９９１）、米国特許出願公開第２００３０１０８８８５号および同第２００３００８２５７号他のアミノ酸残基類似体が挙げられる。

「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、本明細書において、配列を整列させ、最大パーセント配列同一性を達成するために、必要に応じてギャップを導入し、配列同一性の一部として任意の保存的置換体を考慮しないようにした後に、選択された配列におけるアミノ酸残基と同一である血管新生増殖因子の候補配列におけるアミノ酸残基の百分率として定義される。パーセントアミノ酸配列同一性の目的のための整列は、当該分野の技術に含まれる種々の方法、例えば、公知の利用可能なコンピューターソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを用いて達成することができる。当業者は、比較される全長の配列に対する最大の整列を達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含む、整列を測定するための適切なパラメータを決定することができる。

本明細書における目的のために、所定のアミノ酸配列Ａの、所定のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、またはそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、所定のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、またはそれに対してある程度の％アミノ酸配列同一性を有するまは含む所定のアミノ酸配列Ａと記載することもできる）は次のように計算される：分率Ｘ／Ｙの１００倍、ここで、Ｘは、ＡおよびＢの整列によって同一であると一致したスコアのアミノ酸前記の数であり、Ｙは、Ｂの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性と等しくないことは承認される。

血管新生増殖因子の一部には、自然のポリペプチドと７５％〜１００％のアミノ酸配列同一性を共有する、対応する自然のポリペプチドよりも短く、対応する自然のポリペプチドの少なくとも２０個の隣接するアミノ酸残基を含むポリペプチドが含まれる。特定の態様では、その一部は、自然のポリペプチドと少なくとも９０％または９５％のアミノ酸配列同一性を共有する。血管新生増殖因子の一部を合成することができ、それらが天然起源から単離されたタンパク質に発生する場合にＮ末端アミノ酸およびＣ末端カルボキシル基を有することができ、修飾されたＮ末端（例えば、アシル化）および／または修飾されたＣ末端（例えば、アミド化）を有することができる。血管新生増殖因子の一部は、その一部を生成するという目的のために構築された遺伝子の発現を通じて生じることができる。一部は環状または線状であってもよい。全ての場合において、血管新生増殖因子の一部は、対応する天然のポリペプチドの血管新生活性を測定するのに適切なアッセイによって測定されるように、対応する自然なポリペプチドの生物活性の少なくとも５０％を有する。

すでに、多数のアッセイが、血管新生を測定するために用いられ、記載されている。自然のポリペプチド、ポリペプチド変異体、血管新生増殖因子の一部、または血管新生増殖因子の融合部分であろうとなかろうと、血管新生増殖因子は、その活性を評価するためにインビトロまたはインビボアッセイによって試験され得て、本明細書に記載されるアッセイ、または当業者に知られている方法などの他の適切なアッセイが用いられる。全てのアッセイが、所定の血管新生増殖因子の血管新生活性を測定するために適切である訳ではない。

ウサギの角膜アッセイが記載され、そこでは、角膜に移植された血管新生増殖因子が新しい毛細血管の増殖を刺激する。Ｚｉｃｈｅら，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６１：６２９−６３４（１９８９）を参照されたい。インビトロでの血管新生アッセイシステムは、血管新生増殖因子によって刺激された内皮細胞における形態変化を観察することを可能にする。Ｍｏｎｔｅｓａｎｏら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９７：１６４８−１６５２（１９８３）を参照されたい。また、血管新生増殖因子は、血管新生増殖因子に応答して、細胞増殖のためのアッセイ［Ｍａｒｃｏｎｃｉｎｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：９６７１−９６７６（１９９９）］によって、または実施例６および７に記載されている走化性アッセイによって測定することができる。

血管新生増殖因子の融合タンパク質は、自然のポリペプチドには存在しない第２の部分に連結された第１部分としての生物学的に活性な自然のポリペプチドまたは生物学的に活性なその一部（上述される）を含む。このようにして、第２の部分は、アミノ酸またはポリペプチドであり得る。第１部分は、融合タンパク質のＮ末端位置、Ｃ末端位置に、または内部にあり得る。一態様では、融合タンパク質は、天然に存在している血管新生増殖因子のアミノ酸配列からなる生物学的に活性なポリペプチド、または第１部分として、生物学的に活性なその一部、およびリンカー配列およびアフィニティーリガンドを含む第２部分を含む。

血管新生増殖因子の融合タンパク質は、種々の方法によって生成することができる。例えば、融合タンパク質は、血管新生増殖因子をコードする遺伝子またはその一部を適切な発現ベクターに挿入することによって生成することによって生成することができる。得られる構築物は、発現のために適切な宿主細胞に導入することができる。発現に応じて、融合タンパク質は、適切なアフィニティーによって細胞溶解物から生成され得る。例えば、（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，ｅｄｓ．，ｐｐ．１６．４．１−１６．７．８，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ２８，１９９４の付録を含む、を参照されたい）。ＶＥＧＦ融合（キメラ）タンパク質の例については、Ｚｈｅｎｇ，ら，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓ．Ｂｉｏｌ．２００６；２６：２０１９−２０２６、Ｉｎｏｕｅら，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２００７；２７：９９−１０５を参照されたい。

血管新生増殖因子は、ヒト起源、または非ヒト（好ましくは、哺乳動物）起源であってもよい。ヒト血管新生増殖因子および非ヒト種のホモログは、血管新生増殖因子であって、本発明の併用療法に用いることができる。ホモログは、好ましくは、ヒト血管新生増殖因子と少なくとも７０％アミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも８０％アミノ酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９０％アミノ酸配列同一性を有する。

本発明によれば、「血管新生増殖因子」には、上述されるように、自然の血管新生増殖因子、血管新生増殖因子の一部、血管新生増殖因子のポリペプチド変異体、および血管新生増殖因子の融合タンパク質が含まれる。

ＮＰＡＲアゴニストを用いる治療法
本発明は、治療有効量のＮＰＡＲアゴニストを対象の血管に投与することを含む、治療を必要と対象の部位の内皮機能不全を治療する方法に関し、ここで、前記部位は、血管形成により損傷を受けた動脈、慢性皮膚潰瘍、骨誘導を必要とする部位または心臓血管再開通を必要とする部位ではない。対象は、内皮機能不全を食い止めるかまたは阻害することから恩恵を受ける１以上の種々の疾患または状態に罹患していてもよい。このような疾患または状態には、限定されないが、高血圧、うっ血性心不全、冠動脈疾患、脳卒中、脳血管疾患、末梢血管疾患、糖尿病、勃起機能不全、アテローム性動脈硬化症、喘息、関節リウマチ、肺高血圧症、急性肺損傷、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、炎症性肺疾患、高ホモシステイン血症、鎌状赤血球病、子癇前症、慢性腎障害、慢性腎機能不全、腎微小血管疾患、肝臓再潅流損傷、ニューロパシー、アルツハイマー病、甲状腺疾患、敗血症、血栓症、多臓器障害、炎症性大腸炎、および放射線損傷が含まれてもよい。具体的な態様では、疾患は高血圧である。別の具体的な態様では、疾患はアテローム性動脈硬化症である。さらに別の具体的な態様では、疾患は末梢血管疾患である。さらに別の具体的な態様では、疾患は喘息である。

「対象」は、好ましくはヒトであるが、本明細書に開示されているＮＰＡＲアゴニストによる治療を必要とする動物であってもよく、例えば、ペット（例えば、イヌ、ネコ等）、家畜（例えば、ウシ、ブタ、ウマ等）、および実験動物（例えば、ラット、マウス、モルモット等）が挙げられる。

ＮＰＡＲアゴニストによる「治療を必要とする」対象は、有益な治療的結果および／または予防的結果を達成するＮＰＡＲアゴニストを用いて治療され得る疾患および／または状態を有する対象である。有益な結果には、症状の重症度の低下、または症状の開始の遅延、寿命の向上および／または疾患もしくは状態のより迅速なもしくはより完全な解析が含まれる。

「有効な量」とは、治療を行わない場合と比較して、ＮＰＡＲアゴニストを用いて治療される状態の改善された臨床的結果をもたらすＮＰＡＲアゴニストの量をいう。投与されるＮＰＡＲアゴニストの量は、疾患または状態の程度、重症度、およびタイプ、望まれる治療量、医薬製剤の放出的特徴に依存する。また、対象の健康状態、サイズ、体重、年齢、性別および薬物に対する寛容に依存する。典型的には、このアゴニストは、所望の治療的効果を達成するのに十分な時間投与される。典型的には、１日あたりＮＰＡＲアゴニストの約１μｇ〜１ｍｇ（好ましくは１日あたり約５μｇ〜約１００μｇ）が、特に局所的な投与手段のために、治療を必要とする対象に投与される。また、ＮＰＡＲアゴニストは、特に、全身の投与手段のために、約０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日の投薬量で投与することができ、約０．２ｍｇ／ｋｇ／日〜約１ｍｇ／ｋｇ／日が好ましい。また、本発明のＮＰＡＲアゴニストの典型的な投薬量は、特に、全身の投薬手段のために、５〜５００ｍｇ／日であり、好ましくは２５〜２５０ｍｇ／日である。ＮＰＡＲアゴニストと血管新生増殖因子との併用が対象に投与される方法に関して、血管新生増殖因子（例えば、ＶＥＧＦ−Ａ）は、疾患または障害の性質、治療の部位、対象の年齢、性別、体重および他の状態により、当業者によって決定され得る投薬量で投与され得る。血管新生増殖因子の適切な投薬量は、１μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）である。

「治療すること」とは、ＮＰＡＲアゴニストまたはＮＰＡＲアゴニストを含む組成物を投与する期間後、有益な治療的結果および／または予防的結果が達成されることを意味し、この有益な結果には、症状の重症度の低下、または症状の開始の遅延、寿命の向上および／または疾患もしくは状態のより迅速もしくはより完全な解析、あるいは観察されている部位または特定の疾患もしくは障害を測定するパラメーターに従って測定される他の改善された臨床結果が含まれる。また、「治療すること」には、疾患、障害または病状を阻害するかまたはその開始を遅延することが含まれ、対象におけるこのような疾患、障害または病状を進行させる可能性を低下させることを意味し得て、ここで、該対象は、例えば、その疾患、疾病または状態を進行させる危険にある対象である。

開示されているＮＰＡＲアゴニストは、任意の適切な経路によって、例えば非経口投与によることを含む、局所的（例えば、局所的（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ））または全身的に投与することができる。非経口投与には、例えば、筋内、静脈内、皮下、もしくは腹腔内注射または血管内投与が挙げられ、また、経皮パッチ、ポンプなどの移植された持続放出装置が含まれ得る。典型的な投与には、例えばクリーム、ゲル、軟膏またはエアロゾルが含まれ得る。呼吸器内投与には、例えば吸入または鼻腔内点滴が含まれる。ある種の指示については、治療部位へ直接的にＮＰＡＲアゴニストを注射または移植することが有利である。ＮＰＡＲアゴニストは、持続放出製剤に有意には投与され得る。ＮＰＡＲアゴニストは、慢性的に投与することができ、ここで、該アゴニストは、長期間（少なくとも６０日間、より典型的には少なくとも１年間）、間隔をおいてまたは連続的な送達法によって投与され、慢性または再発の疾患または状態を治療する。

治療薬を含む組み合わせの投与には、同時（同時（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ））投与および治療期間の全体で任意の順番で連続的な投与が含まれる。この薬剤は、１つの組成物に一緒にして投与することができ、または別々の組成物にして投与することができる。ＮＰＡＲアゴニストは、血管新生増殖因子と同じ投薬経路を通じて投与することができる。また、ＮＰＡＲアゴニストは、血管新生増殖因子の経路とは異なる投与経路を通じて投与することができる。ＮＰＡＲアゴニストおよび血管新生増殖因子は、同じであるかまたは異なっている投与スケジュールを有することができる。

ＮＰＡＲアゴニストは、医薬組成物の一部として、許容される医薬的な担体と併せて、対象に投与してもよい。この医薬組成物の調合は、選択される投与経路に従って変更される。適切な医薬的な担体は、該化合物と相互作用しない不活性な成分を含んでもよい。この担体は、生体適合性でなければならず、即ち、無毒性、非炎症性、非免疫原性であり、投与部位での他の望ましくない反応がないものである。医薬として許容される担体の例には、例えば、生理食塩水、エアロゾル、市販されている不活性ゲル、またはアルブミン、メチルセルロースもしくはコラーゲンマトリックスを補足した液体が挙げられる。標準的な医薬製剤技術を用いることができ、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに記載されているものである。

内皮機能不全を治療するための本発明に用いられる組成物は、トロンビンペプチド誘導体またはＮＰＡＲアゴニストが溶解するかまたは懸濁する医薬としての担体を付加的に含むことができる。医薬として許容される担体の例には、例えば、生理食塩水、エアロゾル、市販されている不活性ゲル、またはアルブミン、メチルセルロースもしくはコラーゲンマトリックスを補足した液体が挙げられる。このような製剤のうち典型的なものはゲルである。ゲルは、前述されるような脂肪性基剤、水、またはエマルジョン−懸濁液基材から選択される基材で構成されている。この基材でマトリックスを形成するゲル化剤をこの基材に添加し、半固体の稠度までその粘度を増加させる。ゲル化剤の例には、ヒドロキシプロピルセルロース、アクリル酸ポリマーなどが挙げられる。有効成分は、ゲル化剤の添加前の時点で所望の濃度で製剤に添加されるかまたはゲル化工程後に混合されてもよい。

一態様では、ＮＰＡＲアゴニストは、持続放出製剤に投与される。ポリマーは、多くの場合、持続放出製剤を形成するために用いられる。これらのポリマーの例には、ポリ乳酸／ポリグリコール酸ホモポリマーおよびコポリマー、ポリホスファゼン（ＰＰＨＯＳ）、ポリ無水物およびポリ（プロピレンフマレート）などのポリα−ヒドロキシエステルが含まれる。

ポリ乳酸／ポリグリコール酸（ＰＬＧＡ）ホモポリマーおよびコポリマーは、持続放出ビヒクルとして当該技術分野において周知である。放出速度は、ポリ乳酸とポリグリコール酸との比、ポリマーの分子量を変化させることによって調製可能である（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２８：５（１９９７）を参照されたい。これらの教示事項全ては参照により本明細書中に援用される）。微粒子担体を形成するために、混和物として該ポリマーへのポリ（エチレングリコール）の取り込みは、さらに、有効成分の放出プロフィールの変更を可能にする（Ｃｌｅｅｋら，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ４８：２５９（１９９７）、その全体の教示は参照により本明細書中に援用される）。また、リン酸カルシウムおよびヒドロキシアパタイトなどのセラミックスは、機械的性質を向上するために製剤に取り込ませることができる。

ＰＰＨＯＳポリマーは、下記の構造式（ＩＩ）：

に示されるポリマー骨格において窒素とリンとが交互に含まれ、炭素を含まない。このポリマーの特性は、ポリマー骨格に結合されている側基ＲおよびＲ’の適切なバリエーションによって調整され得る。例えば、ＰＰＨＯＳの分解およびそれによる薬物放出は、加水分解的に不安定な側基の量を変化させることによって調節可能である。イミダゾリルまたはエチレングリコール置換されたＰＰＨＯＳのより多くの取り込みにより、例えば、分解速度の増加が観察され（Ｌａｕｒｅｎｃｉｎら，Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．２７：９６３（１９９３）参照、その全体の教示は参照により本明細書中に援用される）、それによって、薬物放出が増加する。

構造式（ＩＩＩ）に示されるポリ無水物は、様々な量のセバシン酸および１，３−ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）プロパンなどの疎水性または親水性モノマーを含むことによって調節することができる十分に定義された分解および放出特徴を有する（その全体の教示が参照により本明細書中に援用される、Ｌｅｏｎｇら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１９：９４１（１９８５）を参照されたい）。機械的強度を改善するために、無水物は、多くの場合、イミド類とともに共重合され、ポリ無水物−ｃｏ−イミド類を形成する。整形外科応用に適したポリ無水物−ｃｏ−イミド類の例には、ポリ（トリメリチルイミド−グリシン−ｃｏ−１，６−ビス（カルボキシフェノキシ）ヘキサンおよびピロメリチイミドアラニン：１，６−ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）ヘキサンコポリマーが挙げられる。

注射可能な送達製剤は、治療を必要とする部位で血管内または直接的に投与されてもよい。注射可能な担体は、粘性の溶液またはゲルであってもよい。

送達製剤には、生理学的な生理食塩水、静菌性の生理食塩水（約０．９％ｍｇ／ｍＬのベンジルアルコールを含む生理食塩水）、リン酸緩衝生理食塩水、ハンクス溶液、乳酸リンゲル液、またはアルブミン、メチルセルロース、もしくはヒアルロン酸を補足された液体が含まれる。注射可能な基質には、ポリ（エチレンオキシド）のポリマー、エチレンとプロピレンオキシドとのコポリマーが含まれる（それらの全教示は参照により本明細書中に援用される、Ｃａｏら，Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ ９：４７５（１９９８）、Ｓｉｍｓら，Ｐｌａｓｔ Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．Ｓｕｒｇ．９８：８４３（１９９６）を参照されたい）。

組成物を（例えば、硬質ゼラチンまたはシクロデキストリンのコーティングにおいて）カプセル化する方法は、当該技術分野において知られている（Ｂａｋｅｒら，“Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｅ Ａｇｅｎｔｓ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９８６）。

軟膏は、典型的には、例えば固定油または炭化水素を含む、白ワセリンもしくは鉱油などの油性基材、あるいは、例えば１つまたは複数の無水物質からなる、例えば無水ラノリンなどの無水基材を用いて調製される。基材の製剤化後、有効成分が所望の濃度で添加される。

クリームは、一般に、固定油、炭化水素などを典型的に含む、ワックス、ワセリン、鉱油などの油相（内部相）、ならびに水および添加される塩などの任意の水溶性物質を含む、水相（連続相）を含む。二相は、例えばラウリル硫酸ナトリウムなどの表面活性剤；アカシアコロイド状粘土、ハチの粘性物質（ｂｅｅｇｕｍ）などの親水性コロイドである乳化剤の使用により安定化される。エマルジョンの形成により、有効成分は、所定の濃度で添加される。

ゲルは、前記の油性基材、水、またはエマルジョン−懸濁基材から選択される基材を含む。基材中にマトリックスを形成するゲル化剤を基材に添加し、粘性を半固体の稠度に増加させる。ゲル化剤の例には、ヒドロキシプロピルセルロース、アクリル酸ポリマーなどが挙げられる。有効成分は、ゲル化剤の添加前の時点で所定の濃度で製剤に添加される。

開示されているＮＰＡＲアゴニストを用いて治療し得る疾患および状態は、多くの場合、疼痛および感染などの症状および虚弱を伴う。ある種の場合において、このような課題に取り組むには、ＮＰＡＲアゴニストとともに、１以上の更なる薬理学的に活性な薬物を同時投与することが有利であり得る。例えば、疼痛および炎症を管理するには、鎮痛薬または抗炎症剤との同時投与を必要としてもよい。感染の管理には、抗菌性、抗生物質のまたは殺菌性薬剤との同時投与を必要としてもよい。

ＮＰＡＲアゴニストは、単独で、または１以上の他の治療薬、例えばコレステロール低下剤、降圧剤、ベータ−ブロッカー、抗凝固剤、血栓溶解剤、鎮痛剤、抗炎症剤、抗プラーク剤、インスリン、一酸化窒素発生剤、抗ウイルス剤もしくは抗生物質を併用して、対象に投与することができる。１つの方法では、ＮＰＡＲアゴニストは、アルギニン、例えば経口栄養補給剤としてのアルギニンを併用して対象に投与され得る。

トロンビンペプチド誘導体および修飾されたトロンビンペプチド誘導体は、固相ペプチド合成（例えば、ＢＯＣまたはＦＭＯＣ）法、溶液相合成、または前述の方法の組み合わせを含む他の適切な技術によって合成され得る。確立され、広く用いられているＢＯＣ法およびＦＭＯＣ法は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８８：２１４９，（１９６３）；Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｈｏｒｍｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｃ．Ｈ．Ｌｉ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８３，ｐｐ．４８−２６７；ＢａｒａｎｙおよびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ，Ｅ．ＧｒｏｓｓおよびＪ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８０，ｐｐ．３−２８５に記載されている。固相ペプチド合成の方法は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３２：３４１，（１９８６）；Ｃａｒｐｉｎｏ，Ｌ．Ａ．およびＨａｎ，Ｇ．Ｙ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，３７：３４０４（１９７２）；Ｇａｕｓｐｏｈｌ，Ｈ．ら，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，５：３１５（１９９２）に記載されている。これら６つの文献の教示は、全体として参照により援用される。

トロンビンペプチド誘導体二量体は、モノマーの酸化によって調製することができる。トロンビンペプチド誘導体二量体は、トロンビンペプチド誘導体を過剰の酸化剤と反応させることによって調製することができる。周知の適切な酸化剤は、ヨウ素である。

「非芳香族の複素環」は、本明細書中で使用するとき、３〜１０個の原子を有し、窒素、酸素、または硫黄などの少なくとも１個のヘテロ原子を含む非芳香族炭素環式環系である。非芳香族複素環式基の例には、ピペラジニル、ピペリジニル、ピロリジニル、モルホリニル、チオモルホリニルが挙げられる。

用語「アリール基」には、炭素環式および複素環式の芳香族環系が含まれる。アリール基の例には、フェニル、インドリル、フラニルおよびイミダゾリルが挙げられる。

「脂肪族基」は、直鎖、分岐または環状の非芳香族炭化水素である。脂肪族基は、完全に飽和されてもよく、または１以上の不飽和単位（例えば、二重および／または三重結合）を含んでもよいが、好ましくは飽和されている、即ち、アルキル基である。典型的には、直鎖または分岐の脂肪族基は、１から約１０個の炭素原子、好ましくは１から約４個を有し、環状の脂肪族基は、３から約１０個の炭素原子、好ましくは３から約８個を有する。脂肪族基としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、シクロペンチル、ヘキシル、シクロヘキシル、オクチルおよびシクロオクチルが挙げられる。

脂肪族基、アリール基または非芳香族複素環式基に対する適切な置換基は、ＮＰＡＲアゴニストの治療的活性を有意に低下させない置換基であり、例えば天然に存在するアミノ酸に見出されるものである。例としては、−ＯＨ、ハロゲン（−Ｂｒ、−Ｃｌ、−Ｉおよび−Ｆ）、−Ｏ（Ｒ_ｅ）、−Ｏ−ＣＯ−（Ｒ_ｅ）、−ＣＮ、−ＮＯ_２、−ＣＯＯＨ、＝Ｏ、−ＮＨ_２、−ＮＨ（Ｒ_ｅ）、−Ｎ（Ｒ_ｅ）_２。−ＣＯＯ（Ｒ_ｅ）、−ＣＯＮＨ_２、−ＣＯＮＨ（Ｒ_ｅ）、−ＣＯＮ（Ｒ_ｅ）_２、−ＳＨ、−Ｓ（Ｒ_ｅ）、脂肪族基、アリール基および非芳香族複素環式基が挙げられる。各々のＲ_ｅは、独立して、アルキル基またはアリール基である。置換された脂肪族基は、１を超える置換基を有し得る。

本発明は、下記の実施例によって例証されるが、何ら限定を意図するものではない。

（実施例１）
材料および方法
内皮細胞培養
ヒトの冠動脈内皮細胞（ＨＣＡＥ細胞、Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）は、５％ＣＯ２、３７℃で、２％ウシ胎児血清およびＳｉｎｇｌｅ Ｑｕｏｔサプルメント（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；上皮細胞増殖因子、ヒドロコルチゾン、血管内皮細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子、インスリン増殖因子、アスコルビン酸、ヘパリン、ゲンタマイシン、およびアンホテリシンＢを含む）で補足された内皮細胞増殖培地（ＥＧＭ）中で培養された。細胞は、これらの研究のために４〜６の継代で用いた。ＨＣＡＥ細胞は、１２ウェルプレートにウェルあたり５０，０００細胞の密度で播種し、３日間増殖させて、コンフルエントに達した。コンフルエントの２日後の細胞をＴＮＦαまたはＴＰ５０８で処理した。次に、細胞は、所定時間、正常酸素条件または１％低酸素条件でインキュベートされた。いくつかの実験では、ＴＮＦα刺激前の１時間ＴＰ５０８で細胞を前処理した。ＲＮＡ抽出に関しては、ＨＣＡＥ細胞を６ウェルプレートで培養した。

ＲＴ−ＰＣＲ
総ＲＮＡは、製造業者によって説明されるように、Ａｍｂｉｏｎ単離キットを用いて単離された。

ｅＮＯＳについてのＲＴ−ＰＣＲは、２工程プロトコールを用いて、Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−Ｇｏ ＲＴ−ＰＣＲビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって行った。はじめに、ｃＤＮＡ合成は、１μｇの総ＲＮＡを、プライマーとしての１μｇのランダムヘキサマー（ｐｄＮ６）およびＭ．−ＭｕＬＶ逆転写酵素とともに４２℃で６０分間インキュベートすることによって達成された。次に、９５℃で５分間加熱後、ＰＣＲを行い、変性（９５℃、３０秒）、アニーリング（６２℃、３０秒）、および伸長（７２℃、３０秒）の２５または３０サイクルを行い、７２℃で７分の１回の最終伸長によって終了した。ヒトｅＮＯＳプライマーに関する配列は、次の通りであった：センス５’−ＧＣＡ ＣＣＧ ＧＣＡ ＴＣＡ ＣＣＡ ＧＧＡ ＡＧＡ ＡＧＡ−３’（配列番号３５）およびアンチセンス５’−ＣＣＧ ＣＣＧ ＣＣＡ ＡＧＡ ＧＧＡ ＣＡＣ ＣＡＧ Ｔ−３’（配列番号３６）（Ｓｉｔｇｅｓ，Ｍ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．１０５（１）：７４−７９，２００５）。１８Ｓプライマー（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて、内部標準化対照として１８ＳリボソームＲＮＡを増幅した。ＰＣＲ増幅産物は、１％アガロースゲル電気泳動によって視覚した。

ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎリアルタイムＰＣＲ
リアルタイム定量的ＰＣＲを用いて、ＴＰ５０８またはＴＮＦで処理された内皮細胞においてｅＮＯＳ ｍＲＮＡの相対的発現を測定した。試料をコード化して、ブラインド分析を行った。１μｇの総ＲＮＡは、製造業者によって指示されるように、Ｔａｑｍａｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｋｉｔ（ＡＢＩ）を用いて逆転写された。定量的ＰＣＲ増幅は、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＡＢＩ）に含まれるＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎプローブを用いて、全量２５μｌで２μｌのｃＤＮＡを用いて行った。全てのＰＣＲアッセイは、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７０００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍで実行された。ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ＰＣＲプライマーは、下記の通りであった：ヒトｅＮＯＳセンス：５’−ＧＣＧ ＧＣＴ ＧＣＡ ＴＧＡ ＣＡＴ ＴＧＡ Ｇ−３’（配列番号３７）、アンチセンス：５’−ＧＴＣ ＧＣＧ ＧＴＡ ＧＡＧ ＡＴＧ ＧＴＣ ＡＡＧ Ｔ−３’（配列番号３８）。逆転写されたｃＤＮＡ試料のサイクル閾値は、３点の試料から測定し、１８Ｓ「ハウスキーピング」遺伝子に対して標準化された。

ウェスタンブロット分析
１０％ポリアクリルアミドゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥに細胞溶解物を供し、ニトロセルロースメンブレン（０．２−μｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に転写した。５％ミルクでブロッキング後、このメンブレンを一晩４℃で、ホスホ−ｅＮＯＳ（Ｓｅｒ１１７７）およびｅＮＯＳに対する抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、ヒトの１型アルギナーゼ（クローン９Ｃ５）（Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｎｔｏｎ，ＭＡ）、またはＧＡＰＤＨ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）とともにインキュベートした。ＨＲＰ結合の抗マウス抗体または抗ウサギ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を二次抗体として用いた（ＨＲＰ、西洋ワサビペルオキシダーゼ）。イムノブロットは、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて発色させた。

（実施例２）
ＴＰ５０８はＴＮＦα誘導のアルギナーゼ１のアップレギュレーションをブロックする
上述したように、ＥＤおよびＮＯの喪失に依存するシグナルは、ＮＯＳ活性の減少またはＬ−アルギニンの細胞レベルを枯渇するアルギナーゼ活性の増大によって生じ得る。低酸素症および炎症の両方において、ＴＮＦαのレベルが上昇し、これらのＮＯ関連の活性の１つまたはその両方に影響を与えることによって、ＥＤに寄与するものと考えられていることが報告されている。ＥＤに対するＴＰ５０８の潜在的な影響を評価するために、本発明者らは、正常酸素条件下で、初期の継代ヒト冠動脈内皮細胞（ＨＣＡＥ細胞）を培養し、ＴＮＦα単独であるかまたはＴＮＦαとＴＰ５０８の併用で該細胞を処理した。

ＨＣＡＥ細胞溶解物のウェスタンブロットは、ヒトの１型アルギナーゼに特異的な抗体を用いると、ＴＮＦα処理は、対照の培養物と比較して、アルギナーゼ１（ＡＲＧ１）の発現の有意な増加を引き起こしたことを示している（図１）。図１および２に示されるように、ＴＰ５０８の単独での処理は、ＡＲＧ１に対して効果がないが、ＡＲＧ１発現のＲＮＦα誘導の増加を完全にブロックした。ＴＮＦα刺激したＡＲＧ１発現のＴＰ５０８阻害は、投薬量に依存し、最大半分の阻害は、ＴＰ５０８の濃度が１０μｇ／ｍｌで起こった（図２）。したがって、ＴＰ５０８は、ＡＲＧ１の増加をもたらすＴＮＦα誘導のシグナルをブロックするようである。ＴＰ５０８のこの阻害効果は、ＴＮＦα効果のサブセットに特異的であるように考えられ、それは、Ｅｒｋ１／２およびｐ７０Ｓ６キナーゼのＴＮＦα刺激のリン酸化がＴＰ５０８によって阻害されなかったためである。

（実施例３）
ＴＰ５０８はｅＮＯＳ発現およびｅＮＯＳリン酸化を刺激する
ＨＣＡＥ細胞溶解物のウェスタンブロットは、Ｓ１１７７でリン酸化されたｅＮＯＳに特異的な抗体を用いると、ＴＮＦα処理、または細胞の低酸素条件（１％Ｏ_２）への２４時間の曝露は、正常酸素対照と比較して、それぞれ６５％および４５％にｅＮＯＳの発現を減少させたことを示している（図３）。示されるように、ＴＰ５０８は、低酸素によって引き起こされるｅＮＯＳの発現減少を妨げ、正常酸素条件下で培養した細胞に見られるのと類似したレベルでｅＮＯＳ発現レベルを維持した。対照的に、ＴＮＦαとともにＴＰ５０８付加は、ｅＮＯＳ発現におけるＴＮＦα誘導の減少を阻害できなかった（図示せず）。正常酸素および低酸素条件下では、ＴＰ５０８は、正常酸素および低酸素対照培養物と比較して、それぞれ１．８倍および２．５倍、ｅＮＯＳのリン酸化を増加させた（図３）。このリン酸化のいくつかは、ｅＮＯＳの発現増加に起因する場合があるが、リン酸化の増加は、発現増加だけでは説明することができない。ｅＮＯＳ発現に対するＴＰ５０８の効果、正常酸素条件下で培養された細胞におけるリン酸化を調べる追試験により、ＴＰ５０８がｅＮＯＳリン酸化を刺激することが確認され、この効果は、投薬量に依存し、最大半分の応答は約１０μｇ／ｍｌであった（図４）。

（実施例４）
ＴＰ５０８はｅＮＯＳ ｍＲＮＡをアップレギュレートする
タンパク質発現データと一致して、ＨＣＡＥ細胞からのｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析により、ＴＰ５０８はｅＮＯＳ ｍＲＮＡ発現をアップレギュレートすることが示された（図５）。ＴＰ５０８のこの効果は、ＲＴ−ＰＣＲの２５サイクルで示され、そこでは、ｅＮＯＳ ｍＲＮＡバンドは、ＴＰ５０８処理された細胞でみられるが、対照細胞ではみられない。対照的に、ＴＮＦα処理は、ＲＴ−ＰＣＲの３０サイクル後に示される対照と比較して、発現を劇的に減少させた。ＴＰ５０８のこの効果を定量するために、本発明者らは、逆転写されたｍＲＮＡ試料のＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎリアルタイムＰＣＲ分析を用いた。図６に示されるように、正常酸素条件下での培養２４時間後、ＴＰ５０８は、対照と比較して、４０％までｅＮＯＳ ｍＲＮＡのレベルを増加させた（ｐ＜０．０５）。対照的に、ＴＮＦαは、約８０％までｅＮＯＳ ｍＲＮＡレベルを減少させた。また、低酸素（１％酸素）への細胞の２４時間曝露は、ｅＮＯＳ ｍＲＮＡの対照レベルを約６０％まで減少させた。これらの細胞のＴＰ５０８処理は、低酸素誘導の減少を部分的に妨げた。示されるように、ＴＰ５０８処理された低酸素細胞は、低酸素の対照細胞に対して、ｅＮＯＳ ｍＲＮＡレベルが約４０％であった（ｐ＜０．０５）。

（実施例５）
ＴＰ５０８はｅＮＯＳリン酸化にシグナルを与えるＶＥＧＦの能力を促進する
ヒトの冠動脈内皮（ＨＣＡＥ）細胞（Ｌｏｎｚａ Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）は、正常酸素条件および低酸素［１％Ｏ_２］条件下で２４時間、ＴＰ５０８［５０μｇ／ｍｌ］の有無により培養され、次に、血管新生増殖因子、ヒトＶＥＧＦ［５０ｎｇ／ｍｌ］を用いて１または５分間刺激された。ヒトＶＥＧＦ湯動のｅＮＯＳ活性化は、ｅＮＯＳの活性型（Ｓ１１７７でリン酸化されている）を認識する抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）を用いてウェスタンブロットにより測定された。メンブレンを抗ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）抗体で再探査し、等しいタンパク質装填を示す。種々の処理後に活性化されたｅＮＯＳウェスタンブロットの密度分析を示す棒グラフを図８に示す。

図８に示されるように、正常酸素細胞では、ヒトＶＥＧＦは、ｅＮＯＳのセリン１１７７上で一時的なリン酸化を誘導し、１分で最大（２倍）になり、５分の刺激後、減衰する酵素を活性化する。ヒトＶＥＧＦ刺激前にＴＰ５０８で細胞を前処理すると、ｅＮＯＳのリン酸化は延長され、５分間、最大に近い刺激を維持した。このようにして、ＴＰ５０８は、ヒトＶＥＧＦが最大刺激時間を延ばすことによってｅＮＯＳリン酸化のシグナルを与える能力を促進する。

低酸素細胞（１％Ｏ_２で２４時間培養される）では、ヒトＶＥＧＦで刺激したｅＮＯＳリン酸化のれベルは、正常酸素の細胞と非開くして、１分処理で約４倍減少した。このようにして、低酸素は、ヒトＶＥＧＦ刺激のｅＮＯＳ活性化を有意に低下させた。しかしながら、ＴＰ５０８で前処理された低酸素細胞は、正常酸素でみられるものと同等のレベルで、ヒトＶＥＧＦ刺激のｅＮＯＳ活性化を示した。したがって、低酸素細胞のＴＰ５０８処理は、ヒトＶＥＧＦが正常酸素細胞において観察されたレベルにｅＮＯＳ活性化を刺激する能力を回復する。

（実施例６）
ＴＰ５０８はＶＥＧＦに対する内皮細胞移動を増加する
試験物質が内皮細胞を引きつけ、メンブレンの孔を通過するそれらの移動を刺激する能力は、試験物質の血管新生潜在力を測定するためのいくつかの試験の１つである。図９Ａは、化学誘因物質に向かう内皮細胞の移動を測定するための実験の設計を示す。移動アッセイ前に、ＴＰ５０８の有無により細胞を培養し、内皮移動に対するＴＰ５０８の効果を測定した。

ヒト冠動脈内皮（ＨＣＡＥ）細胞（Ｌｏｎｚａ Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）は、ＴＰ５０８［５０μｇ／ｍｌ］（図９Ａおよび図９Ｂにおける「ＴＰｐｒｅｔ」）が存在しない場合（対照）または存在する場合に２４時間培養された。膜透過細胞移動アッセイは、製造供給元によって説明されるように、ＢＤ ＦｌｕｏｒｏＢｌｏｋインサート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いて行われた。対照またはＴＰ５０８で前処理された細胞は、この挿入の上部に添加された。ヒトＶＥＧＦ［１０ｎｇ／ｍｌ］（Ｖ）または培地単独（Ｃ）が、化学誘因物質としてインサートプレートのより低いチャンバーに添加された。内皮移動は、正常酸素または１％低酸素条件で行われた。２２時間のインキュベーション後、細胞を移動後にＣａｌｃｅｉｎ ＡＭで標識し、インサートメンブレンの下側に移動した細胞の経口を検出することによって測定された。

図９Ｂは、血管新生因子であるヒトＶＥＧＦ（ヒト組換えＶＥＧＦ−Ａ １６５、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）に向かう内皮細胞の移動に対するＴＰ５０８処理の効果を示す。

結果は、ヒトＶＥＧＦが、正常酸素条件（１８０％）でアッセイした場合の培地対照細胞と比較して、約２倍まで正常対照内皮細胞移動を刺激し、培地対照細胞と比較して低酸素条件下では僅かに小さい（約１５０％）ことを示す。ＴＰ５０８で前処理された内皮細胞は、細胞が正常酸素および低酸素条件下で評価された場合、培地対照と比較してそれぞれ約５倍および約４倍、ヒトＶＥＧＦに向かって細胞移動を示した。したがって、ＴＰ５０８前処理は、未処理の対照細胞と比較して２〜３倍、ヒトＶＥＧＦに向かって内皮移動を増加する。この細胞移動アッセイは、細胞の血管新生の潜在性の１つの測定であるため、これらの結果は、ＴＰ５０８処理は、正常酸素条件下、およびヒトＶＥＧＦに対する血管新生応答が低下する低酸素条件下で、内皮細胞に対するヒトＶＥＧＦの血管新生潜在性を倍以上に増やすことを示す。

（実施例７）
ＴＰ５０８はヒトＶＥＧＦに向かう内皮細胞の血管新生応答を増加する
マトリゲルマトリックスを通過する内皮細胞の浸潤は、試験物質の血管新生潜在性を測定するために用いられる多くのアッセイの１つであり、開かれたメンブレンの穴を通過する単純な走化性アッセイよりもインビボにおいて血管新生をより多く予測するものと考えられる。それは、細胞が、メンブレンの穴の中に移動し、それを通過するためにマトリックスを分解し、浸潤しなければならないためである。図１０Ａは、化学誘因物質に向かうマトリゲルを通過する内皮細胞の浸潤を測定するための実験の設計を示す。

ヒト冠動脈内皮（ＨＣＡＥ）細胞（Ｌｏｎｚａ Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）は、ＴＰ５０８［５０μｇ／ｍｌ］（ＴＰ ｐｒｅｔ）が存在しない場合（対照）または存在する場合に２４時間培養された。内皮細胞浸潤アッセイは、ＢＤ Ｍａｔｒｉｇｅｌ Ｍａｔｒｉｘ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）で被覆されたＦｌｕｏｒｏＢｌｏｋインサートを利用するＢＤ ＢｉｏＣｏｒｔ（商標）Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いて行った。対照またはＴＰ５０８で前処理された細胞は、このインサートの上部に添加された。ヒトＶＥＧＦ［１０ｎｇ／ｍｌヒト組換えＶＥＧＦ−Ａ １６５ａａ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ］を含む培地（Ｖ）または培地単独（Ｃ）は、ヒトＶＥＧＦに対する血管新生応答を測定するために、化学誘因物質としてインサートプレートのより低いチャンバーに添加された。内皮細胞浸潤は、正常酸素または低酸素（１％Ｏ_２）条件で行った。インキュベーションの２２時間後、細胞を浸潤後にＣａｌｃｅｉｎ ＡＭを用いて標識し、インサートメンブレンの下側に移動した細胞の蛍光を検出することによって測定された。

図１０Ｂは、ヒトＶＥＧＦに向かう内皮細胞の浸潤に対するＴＰ５０８処理の効果を示す。結果は、正常酸素条件または低酸素条件下でアッセイされた対照内皮細胞は、ヒトＶＥＧＦによって刺激されず、マトリゲルを分解し、ヒトＶＥＧＦに向かって、メンブレンを通過して移動することを示す。対照的に、ＴＰ５０８で予め培養された内皮細胞は、ＴＰ５０８で前処理されなかった対照細胞に対して浸潤性の増加を示す。さらに、これらの細胞は、直ぐに、ヒトＶＥＧＦに応答する（ヒトＶＥＧＦなしにＴＰ５０８で前処理された細胞において観察されるものよりも約５０％多く浸潤し、ＶＥＧＦに向かう対照細胞よりも２倍近く浸潤する）。これらの結果は、ＴＰ５０８で処理されていない対照細胞がヒトＶＥＧＦ処理に対して全く応答しない条件下で、ヒトＶＥＧＦに血管新生的に応答する内皮細胞の能力を増加するＴＰ５０８処理の能力を示す。

（実施例８）
正常酸素および低酸素のＨＣＭＶＥ細胞におけるＶＥＧＦ ｍＲＮＡ発現に対するＴＰ５０８の効果
ヒト心臓微小血管内皮（ＨＣＭＶＥ）細胞は、ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）（Ｖ）またはＴＰ５０８（５０μｇ／ｍｌ）（ＴＰ）で処理され、正常酸素および１％低酸素条件で２４時間培養された。リアルタイムＰＣＲ分析は、処理後のＶＥＧＦ ｍＲＮＡの定常状態レベルでの変化を示す。３点測定で行った１つの実験からのデータは、平均±ＳＤとして図１１に示される。^＊正常酸素における対照（Ｃ）細胞と比較したｐ＜０．０１。^＃低酸素における対照（Ｃ）細胞と比較したｐ＜０．０１。

リアルタイムＰＣＲ分析は、ＶＥＧＦ刺激が正常酸素条件における対照と比較して、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ発現（２倍）を減少させたことを示した。期待されるように、低酸素は、正常酸素細胞と比較して、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ（２．４倍）増加させた。ＴＰ５０８処理は、正常酸素の細胞におけるＶＥＧＦ ｍＲＮＡの定常状態レベルに影響がなかった。しかしながら、ＴＰ５０８で処理された低酸素細胞は、対照の低酸素または対照の正常細胞と比較して、それぞれ、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ発現の約４倍および約１０倍高いレベルを発現した（図１１）。対照的に、ＶＥＧＦ刺激は、低酸素細胞において効果がないかまたはＶＥＧＦ ｍＲＮＡを減少させた。この実験によって、ＴＰ５０８は、ＶＥＧＦ発現をアップレギュレートする低酸素の効果を高める。

（実施例９）
カルバコール誘導の緩和に対するＴＰ５０８の前処理の効果
ラット大動脈輪（無傷の内皮細胞層）を調製した。輪は、ＴＰ５０８なし（対照）または１ｍＭ ＴＰ５０８で１時間処理された。輪は、５００ｎＭノルエピネフリンで収縮させ、次に、カルバコールの投薬量を増加させた（０、１、１０、１００、５００、７５０、１０００および５０００ｎＭ）。平均値±ＳＥＭを示す；ｎ＝２匹の動物。

ノルエピネフリンで収縮させた輪は、無傷の内皮であり、カルバコールの投薬量の増加に応答して弛緩する（Ｆｕｒｃｈｇｏｔｔ，Ｒ．Ｆ．およびＺａｗａｄｚｋｉ，Ｊ．Ｖ．，Ｎａｔｕｒｅ ２８８：３７３−３７６（１９８０））。ＴＰ５０８が平滑筋弛緩である場合、ノルエピネフリン−カルバコールの投薬処方前のＴＰ５０８前処理は、対照と比較して、カルバコール誘導の弛緩の増加、即ち、対照曲線と比較して左へのカルバコール投薬応答曲線のシフトを誘導をもたらされなければならない。

図１２は、カルバコール濃度の増加（２５０ｎＭを超える；長方形のボックス）で、ＴＰ５０８前処理した輪は、対照と比較して、弛緩の増加を示した。さらに、ＴＰ５０８の前処理は、Ｓ字のカルバコール投薬応答曲線をもたらす。対照の環は、直線上のカルバコール投薬応答曲線を生じた。

（実施例１０）
ヒト内皮細胞に関する研究
ＨＭＶＥＣ（ヒト微小血管内皮細胞
マイクロアレイを用いた実験は、アルギナーゼ１（ＡＲＧ１）の増加、低酸素に応答して期待された内皮一酸化窒素シンターゼ（ｅＮＯＳ）発現の減少を妨げるＴＰ５０８を示した。ＨＭＶＥＣに関する研究は、例えば、末梢血管疾患、および腎血管疾患に関する。

ＨＡＥ（ヒト大動脈内皮細胞）
ＨＡＥ細胞を用いて、下流の調節エレメントを研究した。正常酸素条件下での３０分間のインキュベーション後、ＴＰ５０８は、細胞内シグナル調節キナーゼ１および２（ＥＲＫ１／２）並びにセリン／スレオニンキナーゼｐ７０Ｓ６のリン酸化を減少し、焦点接着キナーゼ（ＦＡＫ）のリン酸化を増加させた。

ＨＡＥ細胞は、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）で処理され、ＡＲＧ１の発現が増加した。ＴＰ５０８による前処理は、ＡＲＧ１においてだけ、ＴＮＦα誘導の増加を阻害した。これは、ＴＰ５０８は、一酸化窒素（ＮＯ）経路に対するサイトカイン作用をくい止めることができることを示唆する。正常酸素条件下では、ＴＰ５０８は、ＴＮＦα／低酸素処理の有無によらず、リン酸化されたｅＮＯＳ（ｐ−ｅＮＯＳ）およびｅＮＯＳを増加した。

ＨＡＥ細胞における研究は、例えば、高血圧症、アテローム性動脈硬化症、大動脈弁狭窄症、および大動脈瘤に関する。

ＨＬＭＥ（ヒト肺微小欠陥内皮細胞；あるいは、ＨＬＭＶＥ細胞）
ＨＭＭＥ細胞は、ＶＥＧＦ、ＴＰ５０８および血清枯渇を用いて処理された。観察された両株は、ＶＥＧＦとＴＰ５０８との両方で治療されると生存が増加することが示された。ＶＥＧＦ単独は、より低いレベルで生存を増加し、ＴＰ５０８単独は殆ど効果がなかった。

ＶＥＧＦ、ｅＮＯＳ、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２は、低酸素および正常酸素条件下のＴＰ５０８処理に応答することが観察された。ＨＬＭＥ細胞を正常条件下で研究すると、ｅＮＯＳだけがＴＰ５０８処理によって正に調節された。ＨＬＭＥ細胞を低酸素条件下で研究すると、これらの４つの遺伝子の全ては、低酸素で未処理の対照と比べて、ｍＲＮＡレベルでアップレギュレートされた。

ＨＬＭＥ細胞における研究は、例えば、喘息、急性肺損傷、肺動脈高血圧症、嚢胞性線維症、および炎症性肺疾患に関する。

（実施例１１）
単離された冠状細動脈における内皮機能／機能不全に対する効果
冠状微小血管（細動脈）は、第６０日で、アメロイド・コンストリクター（ａｍｅｒｏｉｄ ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｏｒ）を用いて左冠動脈回旋枝（ＬＣＸ）の慢性的閉塞を患った成熟ユカタン（Ｙｕｃａｔａｎ）ブタの心臓から単離され、記載されるように非虚血性左下行前動脈（ＬＡＤ）から単離された。心外膜下細動脈枝（インサイチューにおいて、６０〜１００μｍ内径、１〜１．５ｍｍの枝を含まない長さ）をＬＡＤまたはＬＣＸから注意深く分析した。各々の細動脈は、ガラス製マイクロピペットを用いてカニュレートし、流れなしに、６０ｃｍ Ｈ_２Ｏ管腔内圧まで加圧した。血管の内径は、ＭａｃＬａｂ（ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ）データ収集システムを組み込んだビデオ顕微鏡技術を用いて、実験を通じて測定された。トーン（最大径の約７０％まで自然な収縮）の発生後、本発明者らは、内皮依存のＮＯ媒介の血管拡張剤のアデノシン（０．１Ｍ〜１０μＭ）およびセロトニン（０．１ｎＭ〜１μＭ）、ＡＴＰ感受性カリウムチャネル開口薬のピナシジル（０．１μＭ〜３μＭ）、内皮非依存性の血管拡張剤のニトロプルシドナトリウム（１ｎＭ〜０．１ｍＭ）に関して、径の関係に対する濃度を測定した。これらのアゴニストに対する血管拡張性応答は、細動脈の内腔外インキュベーションの前後で認められた。実験の終了時に、各血管は、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ、１ｍＭ）を含む生理学的に平衡状態のカルシウムを含まない塩溶液に含まれる１００μｍのニトロプルシドナトリウムで弛緩させ、６０ｃｍＨ_２Ｏ内腔内の圧力でその最大径を得た。アゴニストに応答した全ての径の変化は、この膨張に対して標準化し、最大膨張の割合として表した。

ＬＣＸ閉塞のこのモデルにおける慢性虚血は冠動脈内皮機能不全を生むかどうか、ＴＰ５０８がＮＯシグナリングに影響を及ぼすかどうかを測定するために、冠状細動脈が、左下行前動脈（ＬＡＤ）の非虚血枝、ＴＰ５０８およびプラセボ処置した心臓の閉塞した虚血性ＬＣＸから単離された。次に、単離された細動脈は、エクスビボで、アデノシン、セロトニン、ニトロプルシドナトリウム、またはピナシジルで処置された。細動脈は、障害のあるＮＯ産生を伴う内皮機能不全を有する場合、それらは、アデノシンおよびセロトニン（内皮に依存するＮＯ媒介の血管拡張剤である）に応答して、血管拡張の低下をしめさなければならないが、アデノシンおよびセロトニンではそうではなく、それらは、ＮＯを与えることによって内皮細胞応答に独立して平滑筋細胞を弛緩し、それぞれ、サイクリックＧＭＰを活性化し、平滑筋細胞ＡＴＰ感受性カリウムチャネルを開口する。

虚血性細動脈は、非虚血性血管と比較して、アデノシンまたはセロトニンに対する有意に低下した膨張応答を示す（図１３Ａおよび１３Ｂ）。示されるように、虚血は、非虚血性細動脈と同じ膨張の程度を達成するために、１０倍を超える薬物を必要とする虚血性細動脈を用いた薬物応答曲線において右方向への移動を引き起こす。この低酸素の効果は、単離された血管がニトロプルシドまたはピナシジルに晒された場合には観察されなかった（図１３Ｃおよび１３Ｄ）。このようにして、低酸素細動脈は、ＮＯドナーを介したＮＯ誘導、平滑筋弛緩薬に応答して、正常に拡張するが、セロトニンおよびアデノシンに応答して、ＮＯを産生する内皮細胞の能力低下を伴う伝統的な内皮機能不全を示す。

ＴＰ５０８は、虚血性プラセボ処理した心臓から単離した細動脈の応答と比較して、アデノシンおよびセロトニンに対する細動脈応答を有意に増加させた（図１３Ａおよび１３Ｂ）。アデノシンに対する応答は、実際に、非虚血性対照細動脈で観察されるレベルまで、虚血性ＴＰ５０８処理した心臓から単離された細動脈において回復するようである（図１３Ａ）。

血管拡張に対するこのＴＰ５０８は、これらの細動脈において内皮機能不全の反転を示すことを確かめるために、本発明者らは、これらの細動脈がＮＯを生じる能力、およびｅＮＯＳ発現のレベルに対する低酸素およびＴＰ５０８の効果を測定した。図１３Ｅに示されるように、プラセボ処理された心臓の虚血性ＬＣＸから単離された細動脈によるＮＯ産生は、ＬＡＤからの非虚血性対照の細動脈と比較して減少した。しかしながら、ＴＰ５０８処理された心臓の虚血性ＬＣＸ由来の細動脈は、非虚血性対照レベルを超えるＮＯ産生のレベルを有した。限定された数のこれらの細動脈からのｍＲＮＡのＰＣＲ分析は、ｅＮＯＳ ｍＲＮＡ発現は、非虚血性対照の細動脈と比較して、虚血性ＬＣＸ由来の細動脈において減少することを示した（図１３Ｆ）。ＮＯ産生に対するその効果と同じく、ＴＰ５０８処理は、非虚血性細動脈において見出されたものと同じレベルかまたはそれを超えるレベルまで、虚血性細動脈においてｅＮＯＳ ｍＲＮＡ発現を回復させた。これらの結果は、ＴＰ５０８が、より多くのＮＯ産生を可能にするｅＮＯＳのアップレギュレーションを誘導する工程によってこれらの細動脈における内皮機能不全を反転することを示唆している。

本発明は、その例示的な態様を参照にして、具体的に示され、記載されているが、当業者は、形態および詳細における種々の変更が、添付の特許請求の範囲によって含まれる本発明の範囲から逸脱することなしに、そこにおいてなされ得ることを理解するものである。

Claims (81)

1. 内皮機能不全の治療を必要とする対象の部位で内皮機能不全を治療する方法であって、該方法は、治療有効量の非タンパク質分解的に活性化されたトロンビン受容体のアゴニストを該対象に投与することを含み、ここで、該部位は、血管形成により損傷を受けた動脈、慢性皮膚潰瘍、骨誘導を必要とする部位または心臓血管再開通を必要とする部位ではない、方法。
2. 前記対象が、高血圧、うっ血性心不全、冠動脈疾患、脳卒中、脳血管疾患、末梢血管疾患、糖尿病、勃起機能不全、アテローム性動脈硬化症、喘息、関節リウマチ、肺高血圧症、高ホモシステイン血症、鎌状赤血球病、子癇前症、慢性腎障害、慢性腎機能不全、敗血症、多臓器障害、炎症性大腸炎、および放射線損傷からなる群から選択される１以上の疾患または状態に罹患している、請求項１に記載の方法。
3. 前記対象が高血圧に罹患している、請求項１に記載の方法。
4. 前記対象がアテローム性動脈硬化症に罹患している、請求項１に記載の方法。
5. 前記対象が末梢血管疾患に罹患している、請求項１に記載の方法。
6. 前記アゴニストが全身投与される、請求項１に記載の方法。
7. 前記アゴニストが慢性的に投与される、請求項１に記載の方法。
8. 前記方法が、内皮機能不全と関連したアルギナーゼのアップレギュレーションをブロックする、請求項１に記載の方法。
9. 前記方法が、内皮一酸化窒素シンターゼの活性化またはアップレギュレーションを促進する、請求項１に記載の方法。
10. 前記方法が一酸化窒素の産生を増加させる、請求項１に記載の方法。
11. 前記アゴニストが、アミノ酸配列Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｒを含むトロンビンペプチド誘導体であり、ここで、Ｒは、セリンエステラーゼ保存配列である、請求項１に記載の方法。
12. 前記トロンビンペプチド誘導体が、約１２〜約２３個のアミノ酸を含む、請求項１１に記載の方法。
13. 前記セリン保存配列が、Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌのアミノ酸配列（配列番号１４）、または少なくとも６個のアミノ酸を有するそのＣ末端切断フラグメントを含み、ただし、セリンエステラーゼ保存配列における０、１、２または３個のアミノ酸が配列番号１４の対応する位置とは異なっている、請求項１２に記載の方法。
14. 前記セリンエステラーゼ保存配列が、Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌのアミノ酸配列（配列番号１４）、または少なくとも９個のアミノ酸を有するそのＣ末端切断フラグメントを含み、ただし、セリンエステラーゼ保存領域における０、１または２個のアミノ酸が配列番号１４における対応するアミノ酸の保存的置換体である、請求項１２に記載の方法。
15. 前記セリンエステラーゼ保存配列が、Ｃｙｓ−Ｘ_１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ_２−Ｖａｌのアミノ酸配列（配列番号１５）、または少なくとも６個のアミノ酸を有する配列番号１５のＣ末端切断フラグメントを含み、ここで、Ｘ_１がＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ｘ_２がＰｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＶａｌである、請求項１２に記載の方法。
16. 前記トロンビンペプチド誘導体が、アミノ酸配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ（配列番号１６）を含む、請求項１５に記載の方法。
17. 前記トロンビンペプチド誘導体が、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌのアミノ酸配列（配列番号１７）、または少なくとも６個のアミノ酸を有するそのＣ末端切断フラグメントを含み、ここで、該ペプチドにおける０、１、２、または３個のアミノ酸が配列番号１７の対応する位置とは異なっている、請求項１２に記載の方法。
18. 前記トロンビン誘導体が、Ｃ末端のアミドを含み、場合により、アシル化されたＮ末端を含み、ここで、該Ｃ末端のアミドは、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ_ａＲ_ｂによって表され、ここで、Ｒ_ａおよびＲ_ｂは、独立して、水素、Ｃ_１−Ｃ_１０置換または非置換脂肪族基であり、あるいはＲ_ａおよびＲ_ｂは、それらが結合される窒素と一緒になってＣ_１−Ｃ_１０非芳香族複素環基を形成し、該Ｎ末端アシル基は、Ｒ_ｃＣ（Ｏ）−によって表され、ここで、Ｒ_ｃは、水素、Ｃ_１−Ｃ_１０置換もしくは非置換脂肪族基、またはＣ_１−Ｃ_１０置換もしくは非置換芳香族基である、請求項１７に記載の方法。
19. 前記トロンビンペプチド誘導体が、非置換であるＮ末端、および非置換であるＣ末端、またはＣ（Ｏ）ＮＨ_２で表されるＣ末端アミドを含む、請求項１７に記載の方法。
20. 前記トロンビンペプチド誘導体が、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌのアミノ酸配列（配列番号１７）を含むポリペプチド、または少なくとも６個のアミノ酸を有するそのＣ末端切断フラグメントを含み、該ペプチドにおける０、１、または２個のアミノ酸は、配列番号１７における対応するアミノ酸の保存的置換体である、請求項１９に記載の方法。
21. 前記トロンビンペプチド誘導体が、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｘ_１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ_２−Ｖａｌのアミノ酸配列（配列番号１）を有するポリペプチドを含み、ここで、Ｘ_１は、ＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ｘ_２は、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＶａｌである、請求項２０に記載の方法。
22. Ｘ_１はＧｌｕであり、Ｘ_２はＰｈｅである、請求項２１に記載の方法。
23. 前記トロンビンペプチド誘導体が、Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌのアミノ酸配列（配列番号６）、少なくとも１４個のアミノ酸を有するトロンビンペプチド誘導体のＮ末端切断フラグメント、または少なくとも１８個のアミノ酸を有するトロンビンペプチド誘導体のＣ末端切断フラグメントを含み、ただし、該トロンビン誘導体における位置１〜９および１４〜２３での０、１、２または３個のアミノ酸は、配列番号６の対応する位置でのアミノ酸とは異なっている、請求項１９に記載の方法。
24. 前記トロンビンペプチド誘導体が、Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌのアミノ酸配列（配列番号６）、少なくとも１４個のアミノ酸を有するトロンビンペプチド誘導体のＮ末端切断フラグメント、または少なくとも１８個のアミノ酸を有するトロンビンペプチド誘導体のＣ末端切断フラグメントを含み、ただし、トロンビン誘導体の位置１〜９および１４〜２３での０、１、または２個のアミノ酸は、配列番号６の対応する位置でアミノ酸の保存的置換体である、請求項１９に記載の方法。
25. 前記トロンビンペプチド誘導体が、Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｘ_１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ_２−Ｖａｌのアミノ酸配列（配列番号２）、少なくとも１４個のアミノ酸を有するトロンビンペプチド誘導体のＮ末端切断フラグメント、または少なくとも１８個のアミノ酸を有するトロンビンペプチド誘導体のＣ末端切断フラグメントを含み、ここで、Ｘ_１はＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ｘ_２はＰｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＶａｌである、請求項２４に記載の方法。
26. 前記トロンビンペプチド誘導体が、ポリペプチドＨ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−ＮＨ_２（配列番号３）である、請求項２４に記載の方法。
27. 前記トロンビンペプチド誘導体が、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌのアミノ酸配列（配列番号３９）、または少なくとも６個のアミノ酸を有するそのＣ末端切断フラグメントを含み、ここで、該ペプチドにおける０、１、２、または３個のアミノ酸は配列番号３９の対応する位置とは異なり、ただし、Ｘａａは、アラニン、グリシン、セリン、またはＳ−保護システインである、請求項１２に記載の方法。
28. 前記トロンビンペプチド誘導体が、Ｃ末端のアミドを含み、場合により、アシル化されたＮ末端を含み、ここで、該Ｃ末端のアミドは、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ_ａＲ_ｂによって表され、ここで、Ｒ_ａおよびＲ_ｂは、独立して、水素、Ｃ_１−Ｃ_１０置換または非置換脂肪族基であり、あるいはＲ_ａおよびＲ_ｂは、それらが結合される窒素と一緒になってＣ_１−Ｃ_１０非芳香族複素環基を形成し、該Ｎ末端アシル基は、Ｒ_ｃＣ（Ｏ）−によって表され、ここで、Ｒ_ｃは、水素、Ｃ_１−Ｃ_１０置換もしくは非置換脂肪族基、またはＣ_１−Ｃ_１０置換もしくは非置換芳香族基である、請求項２７に記載の方法。
29. 前記トロンビンペプチド誘導体が、非置換であるＮ末端、および非置換であるＣ末端、または−Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２で表されるＣ末端アミドを含む、請求項２７に記載の方法。
30. 前記トロンビンペプチド誘導体が、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌのアミノ酸配列（配列番号３９）、または少なくとも６個のアミノ酸を有するそのＣ末端切断フラグメントを含み、ただし、該ポリペプチドにおける０、１、または２個のアミノ酸は、配列番号３９における対応するアミノ酸の保存的置換体である、請求項２９に記載の方法。
31. Ｘａａがアラニンである、請求項３０に記載の方法。
32. 前記トロンビンペプチド誘導体が、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｘ_１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ_２−Ｖａｌ（配列番号４）のアミノ酸配列を含み、ここで、Ｘ_１は、ＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ｘ_２は、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＶａｌである、請求項２９に記載の方法。
33. 前記トロンビンペプチド誘導体が、アミノ酸配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号２０）、または配列番号２０のアミノ酸１０〜１８を含むそのフラグメントを含み、ただし、該トロンビンペプチド誘導体における０、１または２個のアミノ酸は、配列番号２０の対応する位置のアミノ酸とは異なっている、請求項２９に記載の方法。
34. 前記トロンビンペプチド誘導体が、アミノ酸配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号２０）、または配列番号２０のアミノ酸１０〜１８を含むそのフラグメントを含み、ただし、該トロンビンペプチド誘導体における０、１または２個のアミノ酸は、配列番号２０の対応する位置でアミノ酸の保存的置換体である、請求項２９に記載の方法。
35. 前記トロンビンペプチド誘導体が、Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｘ_１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ_２−Ｖａｌ（配列番号５）のアミノ酸配列、または配列番号５のアミノ酸１０〜１８を含むそのフラグメントを含み、ここで、Ｘ_１はＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ｘ_２はＰｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＶａｌである、請求項３４に記載の方法。
36. Ｘａａがアラニンである、請求項３５に記載の方法。
37. 前記トロンビンペプチド誘導体が、Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｘ_１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ_２−Ｖａｌ（配列番号５）のアミノ酸配列を含み、Ｘ_１はＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ｘ_２はＰｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＶａｌである、請求項２９に記載の方法。
38. Ｘａａがアラニンである、請求項３７に記載の方法。
39. Ｘ_１がＧｌｕであり、Ｘ_２がＰｈｅである、請求項３７に記載の方法。
40. 前記トロンビンペプチド誘導体が、ポリペプチドＨ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−ＮＨ_２（配列番号２２）である、請求項２９に記載の方法。
41. 前記アゴニストが、２つのトロンビンペプチド誘導体を含むペプチド二量体であり、該トロンビンペプチド誘導体は、独立して、配列番号１７のアミノ酸配列（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ）または少なくとも６個のアミノ酸を有するそのＣ末端切断フラグメントを含み、ただし、該ポリペプチドにおける０、１、２、または３個のアミノ酸は、配列番号１７の対応する位置とは異なり；該トロンビンペプチド誘導体は、場合によりＣ末端アミドを含み；該トロンビンペプチド誘導体は、場合によりアシル化されたＮ末端を含む、請求項１に記載の方法。
42. 前記二量体が、本質的に単量体を含まない、請求項４１に記載の方法。
43. 前記トロンビンペプチド誘導体は同一である、請求項４２に記載の方法。
44. 前記トロンビンペプチド誘導体が、ジスルフィド結合を介して共有結合される、請求項４３に記載の方法。
45. 前記トロンビンペプチド誘導体が、約１２〜約２３個のアミノ酸からなる、請求項４４に記載の方法。
46. 前記トロンビンペプチド誘導体は、Ｃ末端アミド、場合によりアシル化されたＮ末端を含み、ここで、該Ｃ末端アミドは、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ_ａＲ_ｂによって表され、Ｒ_ａおよびＲ_ｂは、独立して、水素、Ｃ_１−Ｃ_１０置換または非置換脂肪族基であり、あるいはＲ_ａおよびＲ_ｂは、それらが結合される窒素と一緒になってＣ_１−Ｃ_１０非芳香族複素環基を形成し、該Ｎ末端アシル基は、Ｒ_ｃＣ（Ｏ）−によって表され、ここで、Ｒ_ｃは、水素、Ｃ_１−Ｃ_１０置換もしくは非置換脂肪族基、またはＣ_１−Ｃ_１０置換もしくは非置換芳香族基である、請求項４５に記載の方法。
47. 前記トロンビンペプチド誘導体が、各々、非置換であるＮ末端；および非置換であるであるＣ末端、または−Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２で表されるＣ末端アミドを含む、請求項４５に記載の方法。
48. 前記トロンビンペプチド誘導体が、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号１７）のアミノ酸配列または少なくとも６個のアミノ酸を有するそのＣ末端切断フラグメントを含み、ただし、該トロンビンペプチド誘導体における０、１または２個のアミノ酸は、配列番号１７における対応するアミノ酸の保存的置換体である、請求項４７に記載の方法。
49. 前記トロンビンペプチド誘導体が、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｘ_１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ_２−Ｖａｌのアミノ酸配列（配列番号１）を含み、ここで、Ｘ_１がＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ｘ_２がＰｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＶａｌである、請求項４７に記載の方法。
50. 前記トロンビンペプチド誘導体が、アミノ酸配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号６）、または配列番号６のアミノ酸１０〜１８を含むそのフラグメントを含み、ただし、該トロンビンペプチド誘導体における０、１、２または３個のアミノ酸は、配列番号６の対応する位置のアミノ酸とは異なっている、請求項４７に記載の方法。
51. 前記トロンビンペプチド誘導体が、アミノ酸配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号６）、または配列番号６のアミノ酸１０〜１８を含むそのフラグメントを含み、ただし、トロンビンペプチド誘導体における０、１、２または３個のアミノ酸は、配列番号６の対応する位置でのアミノ酸の保存的置換体である、請求項４７に記載の方法。
52. 前記トロンビンペプチド誘導体が、アミノ酸配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｘ_１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ_２−Ｖａｌ（配列番号２）、または配列番号２のアミノ酸１０〜１８を含むそのフラグメントを含み、ここで、Ｘ_１はＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ｘ_２はＰｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＶａｌであり、、請求項４７に記載の方法。
53. 前記トロンビンペプチド誘導体は、アミノ酸配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｘ_１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ_２−Ｖａｌ（配列番号２）を含み、ここで、Ｘ_１はＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ｘ_２はＰｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＶａｌである、請求項４７に記載の方法。
54. Ｘ_１がＧｌｕであり、Ｘ_２がＰｈｅである、請求５３に記載の方法。
55. 前記トロンビンペプチド誘導体が、アミノ酸配列Ｈ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｘ_１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ_２−Ｖａｌ−ＮＨ_２（配列番号４０）を含み、ここで、Ｘ_１はＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ｘ_２は、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＶａｌである、請求項４６に記載の方法。
56. Ｘ_１がＧｌｕであり、Ｘ_２がＰｈｅである、請求項５５に記載の方法。
57. 前記アゴニストが、２つのトロンビン誘導体を含むペプチド二量体であり、各々、アミノ酸配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号６）を有し、ここで、該トロンビンペプチド誘導体は、ジスルフィド結合によって共有結合される、請求項１に記載の方法。
58. 前記アゴニストが、下記の構造式：
    

    

    によって表されるペプチド二量体である、請求項１に記載の方法。
59. 前記アゴニストが、相補的ペプチドに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであり、ここで、該相補的ペプチドが、トロンビンの一部分をコードするヌクレオチド配列の補体によってコードされる、請求項１に記載の方法。
60. 前記トロンビンの部分が、哺乳動物のトロンビンの一部である、請求項５９に記載の方法。
61. 前記トロンビンの部分が、ヒトトロンビンの一部である、請求項５９に記載の方法。
62. 前記トロンビンの部分が、トロンビン受容体結合ドメインまたはその一部である、請求項５９に記載の方法。
63. 前記トロンビン受容体結合ドメインまたはその一部が、アミノ酸配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号６）を含むトロンビン受容体結合ドメインである、請求項６２に記載の方法。
64. 前記トロンビン受容体結合ドメインまたはその一部が、トロンビン受容体結合ドメインの一部である、請求項６２に記載の方法。
65. 前記トロンビン受容体結合ドメインの一部が、アミノ酸配列Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ（配列番号７）を含む、請求項６４に記載の方法。
66. 前記相補的ペプチドが、アンチセンスＲＮＡ鎖の５’−３’配列によってコードされる、請求項５９に記載の方法。
67. 前記相補的ペプチドが、アンチセンスＲＮＡ鎖の３’−５’配列によってコードされる、請求項５９に記載の方法。
68. 前記相補的ペプチドが、アミノ酸配列Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ（配列番号３０）を含む、請求項５９に記載の方法。
69. 前記相補的ペプチドが、アミノ酸配列Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（配列番号３２）を含む、請求項５９に記載の方法。
70. 前記相補的ペプチドが、アミノ酸配列Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ（配列番号３３）を含む、請求項５９に記載の方法。
71. 前記相補的ペプチドが、アミノ酸配列Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ（配列番号３４）を含む、請求項５９に記載の方法。
72. 前記抗体または抗原結合ラグメントが抗体である、請求項５９に記載の方法。
73. 前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項５９に記載の方法。
74. 前記抗体または抗原結合フラグメントがモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項５９に記載の方法。
75. 前記抗体または抗原結合フラグメントが、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、および前述のいずれかの抗原結合フラグメントからなる群から選択される、請求項５９に記載の方法。
76. 前記抗体または抗原結合フラグメントが抗原結合フラグメントである、請求項５９に記載の方法。
77. 前記抗原結合フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントおよびＦｖフラグメントからなる群から選択される、請求項７６に記載の方法。
78. 前記方法が、治療有効量の血管新生増殖因子を前記対象に投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
79. 前記血管新生増殖因子が、ヒトＶＥＧＦ−Ａである、請求項７８に記載の方法。
80. 前記アゴニストが、配列番号３からなるポリペプチドである、請求項７８に記載の方法。
81. 前記血管新生増殖因子が、ヒトＶＥＧＦ−Ａである、請求項８０に記載の方法。

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