CN101563102A

CN101563102A - 治疗内皮功能障碍的方法

Info

Publication number: CN101563102A
Application number: CNA2007800398784A
Authority: CN
Inventors: D·H·卡尼; B·奥尔斯泽维斯卡-帕泽德雷克; T·W·福萨姆
Original assignee: University of Guelph; Orthologic Corp
Current assignee: Texas A&M University System; University of Texas System
Priority date: 2006-09-22
Filing date: 2007-09-21
Publication date: 2009-10-21
Anticipated expiration: 2027-09-21
Also published as: CA2663547C; WO2008036387A8; JP2010504336A; CN101563102B; US8334259B2; TW200829267A; TWI486168B; EP2063910A2; US20090304671A1; CA2663547A1; WO2008036387A2; US20130130978A1; WO2008036387A3; JP2013166774A

Abstract

内皮功能障碍(ED)与一系列疾病和紊乱有关。非蛋白水解激活的凝血酶受体的激动剂可以用于治疗ED或ED相关疾病和紊乱的方法中。

Description

治疗内皮功能障碍的方法

相关申请

本申请要求2006年9月22日提交的美国临时申请No.60/846,418、2006年9月28日提交的美国临时申请No.60/848,004和2007年4月10日提交的美国临时申请No.60/922,646的优先权。上述申请的完整教导在此引入作为参考。

背景技术

血管内皮功能障碍(ED)是一种常见的老化效应，并且和许多疾病相关，其中包括高血压、冠状动脉疾病、中风、脑血管疾病、外周血管疾病、糖尿病、勃起功能障碍、动脉粥样硬化、哮喘、类风湿性关节炎、肺动脉高压、高同型半胱氨酸血症、镰状细胞病、先兆子痫、慢性肾衰竭、脓毒症和多器官功能衰竭。组织响应于损伤或缺血而自身修复或对治疗性干预做出反应的能力似乎因为ED而被大大降低了。

内皮功能障碍可能是由于如下原因而导致的，诸如一氧化氮合酶(NOS)的表达的降低，阻断细胞内信号事件的途径激活的改变，内源性NOS抑制物如不对称二甲基精氨酸(ADMA)水平的升高，NO向过氧亚硝酸盐的降解或转换的增加(由高水平的活性氧导致)，或负责将L-精氨酸转化成尿素的精氨酸酶的活性增加，由此限制了作为NOS底物的L-精氨酸的可用性。

最近的大量研究表明，通过调节细胞内L-精氨酸的可用性，精氨酸酶在ED和NOS活性调节中起着关键性的作用。例如在患有ED的老化血管中，精氨酸酶是上调的，但是添加特异性的精氨酸酶抑制剂能够恢复血管的内皮功能和一氧化氮(NO)反应性。其他已证明精氨酸酶抑制可克服ED的疾病包括哮喘，其中精氨酸酶活性增加导致NO缺乏和气道平滑肌松弛降低；肺动脉高压；自发性高血压和盐诱导的高血压。在猪高血压模型、由缺血/再灌注引起的扩张缺陷中，也已证明添加L-精氨酸能够完全或部分逆转ED，甚至已证明能够改善外周动脉疾病患者的行走能力。这些研究提示了降低精氨酸酶上调或控制精氨酸酶活性的药物在多种血管疾病中的潜在治疗作用。

近期研究表明，缺氧和一些炎症介质，包括TNFα，能增加精氨酸酶或降低内皮细胞一氧化氮合酶(eNOS)活性。长期炎症和慢性缺血似乎都会导致ED。

内皮功能障碍是许多疾病和紊乱的原因或者导致这些疾病，亟需治疗内皮功能障碍的方法。

发明内容

申请人发现了能够刺激或激活非蛋白水解激活的凝血酶受体(下称NPAR)的化合物，通过阻断与内皮功能障碍相关的精氨酸酶的上调，并且通过促进一氧化氮合酶的激活或上调，由此增加一氧化氮的产量，能够逆转或抑制内皮功能障碍。NPAR激动剂TP508能够阻断由TNFα诱导的精氨酸酶1(ARG1)的上调(实施例2)。对ARG1表达的影响呈剂量依赖性。TP508处理也能增加在常氧(正常氧浓度)和低氧(1％氧)条件下培养的细胞中eNOS的磷酸化(实施例3)。此外，TP508刺激细胞能防止低氧诱导的eNOS表达下调，从而使eNOS保持在接近于在常氧条件下培养的细胞中所观测到的水平上。TP508对eNOS磷酸化的影响是剂量依赖性的。

本发明涉及在需要治疗的受试者的某一部位治疗内皮功能障碍的方法，包括给受试者施用治疗性有效量的NPAR激动剂，其中所述部位不是被血管成形术损伤的动脉、慢性皮肤溃疡、需要成骨诱导的部位或需要心血管再形成的部位。

更具体地讲，除了上述的情况外，本发明包括治疗受试者的内皮功能障碍的方法，其中所述受试者患有一种或多种疾病或状况，该疾病或状况选自：高血压、充血性心力衰竭、冠状动脉疾病、中风、脑血管疾病、外周血管疾病、糖尿病、勃起功能障碍、动脉粥样硬化、哮喘、类风湿性关节炎、肺动脉高压、急性肺损伤、慢性阻塞性肺病(COPD)、囊性纤维化、炎性肺病、高同型半胱氨酸血症、镰状细胞病、先兆子痫、慢性肾衰竭、慢性肾功能障碍、肾微血管疾病、肝再灌注损伤、神经病、阿尔茨海默氏症、甲状腺疾病、脓毒症、血栓症、多器官功能衰竭、炎性肠病和辐射损伤。

本发明涉及在需要治疗的受试者的某一部位治疗内皮功能障碍的方法，包括给受试者施用治疗性有效量的包括一种或多种NPAR激动剂和一种或多种血管生长因子的组合，其中所述部位不是被血管成形术损伤的动脉、慢性皮肤溃疡、需要成骨诱导的部位或需要心血管再形成的部位。

本发明还涉及一种在需要治疗的受试者的某一部位治疗内皮功能障碍的方法，包括给受试者施用治疗性有效量的一种组合，这种组合基本上由非蛋白水解激活的凝血酶受体的激动剂和血管生长因子组成，其中所述部位不是被血管成形术损伤的动脉、慢性皮肤溃疡、需要成骨诱导的部位或需要心血管再形成的部位。在本方法中，给受试者施用血管生长因子和NPAR激动剂，作为联合治疗中仅有的治疗活性剂。

在一些实施方案中，NPAR激动剂可以对受试者进行系统给药，并且在其他一些实施例中可以经血管给药，在其他一些实施例中可以进行局部给药。

在一个实施方案中，NPAR激动剂是一种在此公开的凝血酶肽衍生物。更具体地，一种凝血酶肽衍生物包含氨基酸序列Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X₁-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X₂-Val(SEQ IDNO：1)，或其C-末端截短的包含至少六个氨基酸的片段。在另一个具体的实施方案中，凝血酶肽衍生物包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列：Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X₁-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X₂-Val，具有至少十四个氨基酸的凝血酶肽衍生物的N-末端截短的片段，或包含至少十八个氨基酸的凝血酶肽衍生物的C-末端截短的片段。X₁是Glu或Gln，X₂是Phe、Met、Leu、His或Val。在另一个具体的实施方案中，凝血酶肽衍生物是多肽SEQ ID NO：3：H-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-NH₂(TP508)。

在另一个实施方案中，NPAR激动剂是在此公开的一种修饰的凝血酶肽衍生物。在一个具体的实施方案中，修饰的凝血酶肽衍生物包含氨基酸序列SEQ ID NO：4：Arg-Gly-Asp-Ala-Xaa-X₁-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X₂-Val，或其C-末端截短的具有至少六个氨基酸的片段。在另一个具体的实施方案中，修饰的凝血酶肽衍生物包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列：Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Xaa-X₁-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X₂-Val，或其包含SEQ ID NO：5的氨基酸10-18的片段。

在另一个实施方案中，NPAR是在此公开的由两个凝血酶肽衍生物形成的一种凝血酶肽衍生物二聚体。更具体地，二聚体中的凝血酶肽衍生物包含氨基酸序列Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X₁-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X₂-Val(SEQ ID NO：1)，或其C-末端截短的具有至少六个氨基酸的片段。在另一个具体的实施方案中，二聚体中的凝血酶肽衍生物包括一种多肽，该多肽具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列：Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X₁-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X₂-Val，或其包含SEQ ID NO：2的氨基酸10-18的片段。在本发明的另一个实施方案中，二聚体中的凝血酶肽衍生物是多肽H-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-NH₂(SEQ ID NO：3)，在另一个具体的实施方案中，凝血酶肽衍生物二聚体由结构式(IV)表示。

在更进一步的实施方案中，NPAR激动剂是能与互补肽结合的抗体或其抗原结合片段，其中互补肽由编码凝血酶一部分的核苷酸序列的互补序列编码。

上面提及的凝血酶可以是哺乳动物的凝血酶，并且更特别地，是人凝血酶。凝血酶的部分可以是凝血酶受体结合域或其一部分。在一个实施方案中，凝血酶受体结合域或其部分包含氨基酸序列Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(SEQ ID NO：6)。凝血酶受体结合域的另一个部分包含氨基酸序列Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly(SEQID NO：7)。

能与抗体或其抗原结合片段结合的互补肽可由反义RNA链的5’-3’序列编码，或由反义RNA链的3’-5’序列编码。

在具体的实施方案中，互补肽包含氨基酸序列Lys-Gly-Ser-Pro-Thr-Val-Thr-Phe-Thr-Gly-Ile-Pro-Cys-Phe-Pro-Phe-Ile-Arg-Leu-Val-Thr-Ser(SEQ ID NO：8)，或Thr-Phe-Thr-Gly-Ile-Pro-Ser-Phe-Pro-Phe(SEQ IDNO：9)，或Arg-Pro-Met-Phe-Gly-Leu-Leu-Pro-Phe-Ala-Pro-Leu-Arg-Thr-Leu-Pro-Leu-Ser-Pro-Pro-Gly-Lys-Gln(SEQ ID NO：10)，或Lys-Pro-Phe-Ala-Pro-Leu-Arg-Thr-Leu-Pro(SEQ ID NO：11)。

本发明方法中使用的NPAR激动剂可以是多克隆抗体，或单克隆抗体或其抗原结合片段。在特定的实施方案中，它们是人抗体。在治疗方法中作为NPAR激动剂使用的单克隆抗体可以是人源化抗体、嵌合抗体或任何前述抗体的抗原结合片段，可包括Fab片段、Fab’片段、F(ab’)₂片段和Fv片段。

附图说明

图1显示来自于实验的代表性Western Blot的X射线胶片和相应的条图，该条图显示来自于Western印迹上条带的光密度分析读数的比值，该实验用来检验TP508对在有或无TNFα情况下培养的细胞中精氨酸酶1表达水平的影响。在不含(CTR)或存在TP508(TP)的情况下将人冠状动脉内皮(HCAE)细胞培养1h，之后使用TNFα处理24小时。通过使用该酶特异性的抗体进行免疫印迹实验来分析细胞裂解物的人精氨酸酶1表达。剥膜后，用GAPDH抗体重新探查该膜，以显示蛋白质载量。(甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH水平未受TNFα和低氧的影响)。相应光密度值数据代表四次独立实验的平均值±SD[p＜0.05；CTR对TNFα(*)或TNFα对TP+TNFα(^#)]。

图2显示来自于Western Blot实验的X射线胶片和相应的条图，该条图显示来自于Western印迹上条带的光密度分析读数的比值，显示出TP508对TNFα上调精氨酸酶1的剂量-反应效应。在使用TNFα刺激24h之前，HCAE细胞用指定浓度的TP508预处理1h，通过免疫印迹实验来分析细胞裂解物中精氨酸酶1的表达。光密度分析显示出精氨酸酶1表达的相对强度。

图3显示来自于实验的Western Blots的X射线胶片和相应的条图，该条图显示来自于Western印迹上的条带的光密度分析读数的比值，该实验显示TP508对eNOS表达和磷酸化(激活)的影响。HCAE细胞用TP508或TNFα刺激并在正常氧或1％氧(低氧)条件下孵育24h。通过使用针对S1177位点处磷酸化的eNOS的特异性抗体进行免疫印迹实验，分析细胞裂解物的eNOS激活。剥膜后，用抗体再探查该膜的eNOS和GAPDH总量。相应光密度值数据代表三次独立实验的平均值±SD[*代表p＜0.05；CTR对TP(*)(常氧)；CTR对TP(*)(低氧)]。

图4显示来自于Western Blot实验的X射线胶片和相应的条图，该条图显示来自于Western印迹上的条带的光密度分析读数的比值，该实验用来检验TP508对eNOS激活的影响的剂量依赖性。HCAE细胞用指定浓度的TP508处理24h后，分析eNOS活性和表达，如图3所示。光密度分析显示TP508处理后eNOS磷酸化相对于总eNOS的变化。

图5显示设计用于研究TP508对eNOS mRNA影响的实验产生的RT-PCR产物的染色凝胶。用TNFα或TP508刺激6h的细胞内eNOSmRNA表达的变化使用RT-PCR进行分析。

图6是eNOS mRNA表达的定量分析数据的条图。HCAE细胞用TP508或TNFα刺激，然后在正常氧或低氧(1％氧)条件下孵育24h。使用SYBR Green实时PCR来分析RNA的eNOS表达。每种条件下与缺少TP508(CTR)相比p＜0.05。

图7显示了编码人凝血酶原的氨基酸序列(SEQ ID NO：12)。氨基酸508-530，其含有凝血酶受体结合域，用下划线表示。凝血酶由凝血酶原的C-端579个氨基酸残基组成。参见GenBank登录号AJ972449。

图8显示用TP508、VEGF或其组合处理后HCAE细胞中激活的内皮一氧化氮合酶(eNOS)的Western印迹的光密度分析。

图9A是一个示意图，显示了测量内皮细胞向化学引诱剂迁移的实验装置和实验设计。

图9B是一个条图，显示了TP508处理对内皮细胞向血管生成因子VEGF迁移的影响。

图10A是一个示意图，显示了测量内皮细胞通过Matrigel向化学引诱剂侵入的实验装置和实验设计。

图10B是一个条图，显示了TP508处理对内皮细胞向血管生成因子VEGF侵入的影响。

图11显示了在正常氧条件或低氧条件下，使用VEGF或TP508处理的人心脏微血管内皮细胞中VEGF mRNA的增加。

图12是测量大鼠主动脉环来评估TP508的松弛效果的数据图。

图13A-13D显示了在所示条件下来自缺血心脏的冠状小动脉扩张的程度。图13A-13B显示内皮依赖性、一氧化氮介导的血管舒张。通过测量指定浓度的腺苷(图13A)或5-羟色胺(图13B)引起的血管舒张程度作为最大扩张的百分比，评估小动脉中内皮功能障碍的程度，所述小动脉分离自安慰剂(缺血安慰剂)或TP508处理的(缺血TP508)心脏的正常氧对照左前降支动脉(非缺血)或缺血冠状动脉左旋支。*与非缺血相比p＜0.05；#与缺血安慰剂相比p＜0.05。图13C和13D显示不依赖于内皮的一氧化氮介导的血管舒张。为了测量缺血和TP508对不依赖于一氧化氮的血管舒张的潜在影响，分离的小动脉使用指定浓度的硝普盐(图13C)或吡那地尔(图13D)进行刺激。

图13E是一个条图，显示了用安慰剂或TP508处理分离自非缺血和缺血心脏的小动脉并分析一氧化氮产量的结果。

具体实施方式

内皮功能障碍与一系列疾病的病因学有关，这些疾病包括高血压、充血性心力衰竭、冠状动脉疾病、中风、脑血管疾病、外周血管疾病、糖尿病、勃起功能障碍、动脉粥样硬化、哮喘、类风湿性关节炎、肺动脉高压、急性肺损伤、慢性阻塞性肺病(COPD)、囊性纤维化、炎性肺病、高同型半胱氨酸血症、镰状细胞病、先兆子痫、慢性肾衰竭、慢性肾功能障碍、肾微血管疾病、肝再灌注损伤、神经病、阿尔茨海默氏症、甲状腺疾病、脓毒症、血栓症、多器官功能衰竭、炎性肠病和辐射损伤等。

申请人发现了能够刺激或激活非蛋白水解激活的凝血酶受体(下称NPAR)的化合物，通过阻断与内皮功能障碍相关的精氨酸酶的上调，并且通过促进一氧化氮合酶的激活或上调，由此增加一氧化氮的产量，能够逆转或抑制内皮功能障碍。TP508能够阻断由TNFα诱导的精氨酸酶的上调。该效应是剂量依赖性的。TP508处理也能增加在常氧(正常氧浓度)和低氧(1％氧)条件下培养的细胞中eNOS的磷酸化。此外，TP508刺激细胞能防止低氧诱导的eNOS表达下调，从而使eNOS保持在接近于在常氧条件下培养的细胞中所观测到的水平上。TP508对eNOS磷酸化的影响是剂量依赖性的(实施例3)。

本发明包括在需要治疗的受试者的某一部位治疗内皮功能障碍的方法，和治疗内皮功能障碍的后果的方法，包括给受试者施用治疗性有效量的非蛋白水解激活的凝血酶受体的激动剂，其中所述部位不是被血管成形术损伤的动脉、慢性皮肤溃疡、需要成骨诱导的部位或需要心血管再形成的部位。在具体的实施方案中，接受治疗的受试者正患有或已患有一种或多种疾病，该疾病选自：高血压、充血性心力衰竭、冠状动脉疾病、中风、脑血管疾病、外周血管疾病、糖尿病、勃起功能障碍、动脉粥样硬化、哮喘、类风湿性关节炎、肺动脉高压、急性肺损伤、慢性阻塞性肺病(COPD)、囊性纤维化、炎性肺病、高同型半胱氨酸血症、镰状细胞病、先兆子痫、慢性肾衰竭、慢性肾功能障碍、肾微血管疾病、肝再灌注损伤、神经病、阿尔茨海默氏症、甲状腺疾病、脓毒症、血栓症、多器官功能衰竭、炎性肠病和辐射损伤等。

在一个特定方面，本发明涉及一种治疗内皮功能障碍的方法，由此治疗受试者的降低的葡萄糖耐量，包括给受试者施用治疗性有效量的非蛋白水解激活的凝血酶受体的激动剂。葡萄糖耐量降低的受试者包括那些具有发展为2型糖尿病的风险的人。在另一方面，本发明涉及一种治疗内皮功能障碍的方法，由此治疗受试者的糖尿病的并发症，包括给受试者施用治疗性有效量的非蛋白水解激活的凝血酶受体的激动剂。在这些方面，受试者不需要在被血管成形术损伤的动脉、慢性皮肤溃疡、需要成骨诱导的部位或需要心血管再形成的部位接受治疗。

在另一个方面，本发明涉及一种治疗受试者的动脉粥样硬化的方法，包括给受试者施用治疗性有效量的非蛋白水解激活的凝血酶受体的激动剂。在这些方面，受试者不需要在被血管成形术损伤的动脉、慢性皮肤溃疡、需要成骨诱导的部位或需要心血管再形成的部位接受治疗。

内皮功能障碍是电离辐射引起的毒性的一个原因。例如，在被照射的肠中，内皮细胞被消耗，导致粘膜屏障崩溃，接着导致炎症，产生活性氧类别，并释放信号分子如TGF-β和TNF-α。这种炎症反应的影响有隐窝细胞增殖的下降、粘膜炎、分泌型腹泻、以及间充质细胞增殖和胶原蛋白产生的增加，导致纤维化和结瘢。例如，在治疗各种癌症形式的高剂量治疗性辐射后，或者在工业事故中受到辐射照射时，受试者可能会因电离辐射而受到损伤。

在另一个方面，本发明涉及一种治疗受试者的辐射损伤的方法，包括给受试者施用治疗性有效量的非蛋白水解激活的凝血酶受体的激动剂。在这个方面，受试者不需要在被血管成形术损伤的动脉、慢性皮肤溃疡、需要成骨诱导的部位或需要心血管再形成的部位接受治疗。

NPAR激动剂

能够刺激NPAR的化合物称为NPAR激动剂。NPAR是一种高亲和性凝血酶受体，存在于大部分细胞的表面。这种NPAR组分主要负责高亲和性地结合凝血酶、蛋白水解灭活的凝血酶以及凝血酶衍生肽至细胞上。NPAR似乎介导一系列由凝血酶引发的细胞信号，并不依赖于它的蛋白水解活性。这些信号中的一个例子是通过扣除杂交确定的膜联蛋白V和其他分子的上调(参见Sower等，Experimental Cell Research 247：422(1999))。因此NPAR的特征在于它与凝血酶在细胞表面的高亲和性相互作用，以及它可以被下述的蛋白水解灭活的凝血酶衍生物和凝血酶衍生肽激动剂激活。正如美国专利号5,352,664和5,500,412中所公开的那样，在存在亚促有丝分裂浓度的凝血酶或能激活蛋白激酶C的分子的情况下，在加至成纤维细胞后，基于分子刺激细胞增殖的能力可以分析NPAR的激活。这些专利的完整教导在此引入作为参考。NPAR激动剂可以根据其激活或根据与¹²⁵I-凝血酶竞争结合到细胞上的能力来鉴定。

凝血酶受体结合域被定义为一种多肽或一种多肽的部分，其可以直接结合至凝血酶受体和/或竞争性抑制高亲和力凝血酶受体和α-凝血酶之间的结合。

本发明的NPAR激动剂包括在此公开的凝血酶衍生肽、修饰的凝血酶衍生肽、凝血酶衍生肽二聚体和针对凝血酶互补肽的NPAR激动剂抗体。

凝血酶衍生肽

在NPAR激动剂中有凝血酶肽衍生物(也称作：“凝血酶衍生肽”)，其属于凝血酶的类似物，具有至少部分来自于凝血酶氨基酸序列的氨基酸序列，并且对于非蛋白水解激活的凝血酶受体具有活性。例如，凝血酶肽衍生物包括：由重组DNA方法产生的肽、通过酶消化凝血酶产生的肽和合成产生的肽，相对于凝血酶和/或修饰的氨基酸，这些肽可以含有氨基酸置换，特别是在末端处。

本发明的NPAR激动剂包括美国专利号5,352,664和5,500,412中描述的凝血酶衍生肽。在一个实施方式中，本发明的NPAR激动剂是一种凝血酶肽衍生物或生理功能等价物，例如，一种不超过大约50个氨基酸的多肽，优选地不超过大约30个氨基酸，并且与对应于凝血酶氨基酸508-530(Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val；SEQ ID NO：6)的人凝血酶片段具有足以使该多肽激活NPAR的同源性。此处描述的凝血酶肽衍生物或修饰的凝血酶肽衍生物优选地具有大约12个至大约23个氨基酸残基，更优选地从大约19个至大约23个氨基酸残基。

在另一个实施方式中，本发明的NPAR激动剂是一种凝血酶肽衍生物，其包含由结构式(I)表示的部分：

Asp-Ala-R (I).

R为丝氨酸酯酶保守域。丝氨酸酯酶，例如胰蛋白酶、凝血酶、胰凝乳蛋白酶等，具有高度保守的区域。“丝氨酸酯酶保守域”是指具有这些保守区域之一的氨基酸序列的多肽，或与这些保守区域之一有足够的同源性以便凝血酶肽衍生物能保留NPAR激活能力。

凝血酶衍生物的生理功能等价物涵盖与凝血酶衍生物在一些细节上有所不同，但不影响凝血酶受体结合域的功能或丝氨酸酯酶保守氨基酸序列的分子。这些细节包括，但并不局限于，保守的氨基酸置换(如以下对NPAR激动剂所述的)和修饰，例如羧基末端的酰胺化、氨基末端的酰化、多肽与生理惰性载体分子的偶联，或依据丝氨酸酯酶保守序列的序列改变。

具有丝氨酸酯酶保守序列的域可以包括含有十二肽的至少4-12个N末端氨基酸的多肽序列，该十二肽在丝氨酸蛋白酶中显示出高度保守性(Asp-X₁-Cys-X₂-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X₃-Val；SEQ ID NO：13；其中X₁是Ala或Ser；X₂是Glu或Gln；X₃是Phe、Met、Leu、His、或Val)。

在一个实施方式中，丝氨酸酯酶保守序列包含SEQ ID NO：14(Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val)的氨基酸序列，或具有SEQID NO：14氨基酸序列的多肽的C-末端截短片段。但是，应当理解，丝氨酸酯酶保守序列中的零、一、二、或三个氨基酸可以和SEQ ID NO：14中的相应氨基酸序列不同。优选地，丝氨酸酯酶保守序列中和SEQ IDNO：14的相应氨基酸不同的氨基酸是如下所述的保守置换，并且更优选地是高度保守的置换。“C-末端截短的片段”是指从C-末端移除一个氨基酸或一段氨基酸后剩余的片段，该片段具有至少六个并且更优选地至少九个氨基酸。

在另一个实施方式中，丝氨酸酯酶保守序列包含SEQ ID NO：15(Cys-X₁-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X₂-Val；X₁是Glu或Gln，X₂是Phe、Met、Leu、His或Val)的氨基酸序列，或其C-末端截短的片段，该片段具有至少六个氨基酸，优选地具有至少九个氨基酸。

在一个优选的实施方式中，凝血酶肽衍生物包含丝氨酸酯酶保守序列和具有更具体的凝血酶氨基酸序列Arg-Gly-Asp-Ala(SEQ ID NO：16)的多肽。该类型的凝血酶肽衍生物的一个实例包含Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X₁-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X₂-Val(SEQ IDNO：1)。X₁和X₂如上所述。该凝血酶肽衍生物可以包含氨基酸序列SEQID NO：6(Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val)，或其N-末端截短的片段，条件是凝血酶肽衍生物的第1-9位的零、一、二或三个氨基酸与SEQ ID NO：6相应位点的氨基酸不同。优选地，凝血酶肽衍生物中和SEQ ID NO：6相应氨基酸残基不同的氨基酸残基是如下对于NPAR激动剂所述的保守置换，并且更优选地是高度保守的置换。“N-末端截短的片段”是指从N-末端移除一个氨基酸或一段氨基酸后剩余的片段，优选地是不超过六个氨基酸的片段，更优选地是不超过三个氨基酸的片段。

任选地，此处描述的凝血酶肽衍生物可以在C-末端酰胺化和/或在N-末端酰化。在一个具体的实施方式中，凝血酶肽衍生物包含C-末端酰胺和任选地包含酰化的N-末端，其中所述的C-末端酰胺由-C(O)NR_aR_b表示，其中R_a和R_b独立地是氢、C₁-C₁₀取代的或非取代的脂肪族基团，或R_a和R_b同与它们键合的氮一起形成一个C₁-C₁₀非芳香族杂环基团，并且所述的N-末端酰基基团由R_cC(O)-表示，其中R_c独立地是氢、C₁-C₁₀取代的或非取代的脂肪族基团，或C₁-C₁₀取代的或非取代的芳香族基团。在另一个具体的实施方式中，凝血酶肽衍生物的N-末端是自由的(即非取代的)并且C-末端是自由的(即非取代的)或酰胺化的，优选地为甲酰胺(即-C(O)NH₂)。在一个具体的实施方式中，凝血酶肽衍生物包含以下氨基酸序列：Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(SEQ IDNO：6)。在另一个具体的实施方式中，凝血酶肽衍生物包含氨基酸序列Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(SEQ IDNO：17)。可选择地，凝血酶肽衍生物包含氨基酸序列SEQ ID NO：18：Asp-Asn-Met-Phe-Cys-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-Met-Lys-Ser-Pro-Phe。包含SEQ ID NO：6，17或18的氨基酸的凝血酶肽衍生物可以任选地在C-末端酰胺化和/或在N-末端酰化。优选地，N-末端是自由的(即非取代的)并且C-末端是自由的(即非取代的)或酰胺化的，优选地为甲酰胺(即-C(O)NH₂)。但是应当理解，凝血酶肽衍生物的第1-9位点和第14-23位点的零、一、二或三个氨基酸可与SEQ ID NO：6中的相应氨基酸不同。同样应当理解，凝血酶肽衍生物的第1-14位点和第19-33位点的零、一、二或三个氨基酸可与SEQ ID NO：18中的相应氨基酸不同。优选地。凝血酶肽衍生物中与SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：18中相应氨基酸不同的氨基酸是如下所述的保守性置换，并且更优选地是高度保守性的置换。可选择地，具有至少十四个氨基酸的凝血酶肽衍生物的N-末端截短片段，或具有至少十八个氨基酸的凝血酶肽衍生物的C-末端截短片段，是将要用作NPAR激动剂的凝血酶肽衍生物。

“C-末端截短的片段”是指从C-末端移除一个氨基酸或一段氨基酸后剩余的片段。“N-末端截短的片段”是指从N-末端移除一个氨基酸或一段氨基酸后剩余的片段。如上所述，应当理解术语“C-末端截短的片段”和“N-末端截短的片段”可含有N-末端的酰胺化和/或C-末端的酰化。

公开的方法中使用的一种优选的凝血酶肽衍生物包含氨基酸序列SEQ ID NO：2：Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X₁-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X₂-Val。公开的方法中使用的另一种优选的凝血酶肽衍生物包含氨基酸序列SEQ ID NO：19：Asp-Asn-Met-Phe-Cys-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X₁-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X₂-Val-Met-Lys-Ser-Pro-Phe。X₁是Glu或Gln；X₂是Phe、Met、Leu、His或Val。SEQ ID NO：2和SEQID NO：19的凝血酶肽衍生物任选地可包含如上所述的C-末端酰胺和/或酰化的N-末端。优选地，N-末端是自由的(即非取代的)并且C-末端是自由的(即非取代的)或酰胺化的，优选地为甲酰胺(即-C(O)NH₂)。可选择地，这些优选的凝血酶肽衍生物的N-末端截短的片段、具有至少十四个氨基酸的N-末端截短的片段、或这些优选的凝血酶肽衍生物的C-末端截短的片段、具有至少十八个氨基酸的C-末端截短的片段，也可以在公开的方法中使用。

TP508是凝血酶肽衍生物的一个实例，其长度为23个氨基酸残基，其中N-末端氨基酸残基Ala未被置换，且C-末端氨基酸Val的COOH被修饰成由-C(O)NH₂表示的酰胺(SEQ ID NO：3)。凝血酶肽衍生物的另一个实例包含氨基酸序列SEQ ID NO：6，其中N-末端和C-末端都未被取代(“脱酰胺TP508”)。可在公开方法中使用的凝血酶肽衍生物的其他实例包括TP508的N-末端截短的片段(或脱酰胺TP508)、具有至少十四个氨基酸的N-末端截短的片段、或TP508的C-末端截短的片段(或脱酰胺TP508)、具有至少十八个氨基酸的C-末端截短的片段。

此处使用的多肽的“保守性置换”是指一种氨基酸被另一种具有同样净电荷和近似大小和形状的氨基酸代替。当它们侧链中碳原子和杂原子总数相差不超过大约四个时，具有脂肪族或取代的脂肪族氨基酸侧链的氨基酸具有大约相同的大小。当它们侧链中的分枝数目不超过一个时，它们还具有大约相同的形状。侧链中含有苯基或取代的苯基基团的氨基酸被认为具有大约相同的大小和形状。下面列出了五组氨基酸。多肽中的一个氨基酸如果被另一个来自同组的氨基酸替换会导致保守性置换：

I组：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸以及非天然存在的具有C1-C4脂肪族或C1-C4羟基取代的脂肪族侧链(直链或单支链的)的氨基酸。

II组：谷氨酸、天冬氨酸以及非天然存在的具有羧酸取代的C1-C4脂肪族侧链(非支链的或一个支链点)的氨基酸。

III组：赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸以及非天然存在的具有胺基或胍基取代的C1-C4脂肪族侧链(非支链的或一个支链点)的氨基酸。

IV组：谷氨酰胺、天冬酰胺以及非天然存在的具有酰胺取代的C1-C4脂肪族侧链(非支链的或一个支链点)的氨基酸。

V组：苯丙氨酸、苯甘氨酸、酪氨酸以及色氨酸。

此处使用的多肽的“高度保守性置换”是指一种氨基酸被另一种具有同样侧链官能团以及近似相同的大小和形状的氨基酸代替。当它们侧链中碳原子和杂原子总数相差不超过两个时，具有脂肪族或取代的脂肪族氨基酸侧链的氨基酸具有大约相同的大小。当它们侧链中的分枝数目相同时，它们还具有大约相同的形状。高度保守性置换的实例包括缬氨酸替代亮氨酸、苏氨酸替代丝氨酸、天冬氨酸替代谷氨酸以及苯甘氨酸替代苯丙氨酸。不是高度保守性的置换的实例包括丙氨酸替代缬氨酸、丙氨酸替代丝氨酸以及天冬氨酸替代丝氨酸。

修饰的凝血酶肽衍生物

在本发明的一个实施方式中，相对于以上描述的凝血酶肽衍生物来说，NPAR激动剂是修饰过的，其中上述的凝血酶肽衍生物的半胱氨酸残基被具有类似大小和电荷特性的氨基酸替代，以使肽的二聚化减至最少。适合的氨基酸的实例包括丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸，或S-保护的半胱氨酸。优选地，半胱氨酸由丙氨酸替代。修饰的凝血酶肽衍生物与未修饰的凝血酶肽衍生物相比具有大约相同的生物活性。参见公开号为US2005/0158301A1的申请，在此引入作为参考。

应当理解，此处公开的修饰的凝血酶肽衍生物可以任选地包含C-末端酰胺和/或N-末端酰基基团，如上所述。优选地，凝血酶肽衍生物的N-端是自由的(即未取代的)以及C-端是自由的(即未取代的)或酰胺化的，优选地是甲酰胺(即-C(O)NH₂)。

在一个具体的实施方式中，修饰的凝血酶肽衍生物包含具有氨基酸序列SEQ ID NO：4的多肽：Arg-Gly-Asp-Ala-Xaa-X₁-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X₂-Val，或其C-末端截短的含有至少六个氨基酸的片段。更优选地，凝血酶肽衍生物包含氨基酸序列SEQ ID NO：20：Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Xaa-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val，或其包含SEQ ID NO：20的氨基酸10-18的片段。更优选地，凝血酶肽衍生物包含氨基酸序列SEQ ID NO：5：Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Xaa-X₁-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X₂-Val，或其包含SEQ ID NO：5的氨基酸10-18的片段。Xaa是丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸或S-保护的半胱氨酸。X₁是Glu或Gln以及X₂是Phe、Met、Leu、His或Val。优选地X₁是Glu，X₂是Phe，并且Xaa是丙氨酸。这种类型的凝血酶肽衍生物的一个实例是具有氨基酸序列Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Ala-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(SEQ ID NO：21)的多肽。这种类型的凝血酶肽衍生物的一个更进一步的实例是多肽H-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Ala-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-NH₂(SEQ ID NO：22)。该凝血酶肽衍生物中的零、一、二或三个氨基酸与SEQ ID NO：4，20，5，21或22的相应位置处的氨基酸不同，条件是Xaa是丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸或S-保护的半胱氨酸。优选地，正如在NPAR激动剂的保守性置换中描述的，这种不同是保守性的。

在另一个具体的实施方式中，凝血酶肽衍生物包含具有氨基酸序列SEQ ID NO：23：Asp-Asn-Met-Phe-Xbb-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Xaa-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-Met-Lys-Ser-Pro-Phe的多肽，或其包含氨基酸6-28的片段。更优选地，凝血酶肽衍生物包含具有氨基酸序列SEQ ID NO：24：Asp-Asn-Met-Phe-Xbb-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Xaa-X₁-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X₂-Val-Met-Lys-Ser-Pro-Phe的多肽，或其包含氨基酸6-28的片段。Xaa和Xbb独立地是丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸或S-保护的半胱氨酸。X₁是Glu或Gln，X₂是Phe、Met、Leu、His或Val。优选地X₁是Glu，X₂是Phe，并且Xaa和Xbb是丙氨酸。这种类型的凝血酶肽衍生物的一个实例是包含氨基酸序列Asp-Asn-Met-Phe-Ala-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Ala-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-Met-Lys-Ser-Pro-Phe(SEQ ID NO：25)的多肽。这种类型的凝血酶肽衍生物的另一个实例是多肽H-Asp-Asn-Met-Phe-Ala-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Ala-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-V al-Met-Lys-Ser-Pro-Phe-NH2(SEQ ID NO：26)。该凝血酶肽衍生物中的零、一、二或三个氨基酸与SEQ ID NO：23，24，25或26相应位置处的氨基酸不同。Xaa和Xbb独立地是丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸或S-保护的半胱氨酸。优选地，正如在NPAR激动剂的保守性置换中描述的，这种不同是保守性的。

“S-保护的半胱氨酸”是其中的巯基-SH的反应性被一个保护基团封闭的半胱氨酸残基。合适的保护基团在本领域中是众所周知的，并且例如在T.W.Greene和P.G.M.Wuts，Protective Groups in OrganicSynthesis，3^rd Edition，John Wiley & Sons，(1999)，pp.454-493中公开，其教导在此引入作为参考。合适的保护基团应当是非毒性的、在药物制剂中稳定的、并且具有最小的额外功能性以维持凝血酶肽衍生物的活性。自由的巯基可以作为硫醚、硫酯被保护、或可被氧化成不对称的二硫化物。优选地巯基作为硫醚被保护。合适的硫醚包括，但不局限于，S-烷基硫醚(例如C₁-C₅烷基)，和S-苯甲基硫醚(例如半胱氨酸-S-S-t-Bu)。优选地保护基团是烷基硫醚。更优选地，S-保护的半胱氨酸是S-甲基半胱氨酸。或者，保护基团可以是：1)通过二硫键连接到凝血酶肽衍生物的半胱氨酸巯基上的半胱氨酸或含半胱氨酸的肽(“保护性肽”)；或2)通过凝血酶肽衍生物的半胱氨酸巯基和保护性肽的羧酸(例如，在天冬氨酸或谷氨酸的C-端或侧链)之间的硫酰胺键连接的氨基酸或肽(“保护性肽”)。保护性肽可以是生理惰性的(例如，不超过50个氨基酸的聚甘氨酸或聚丙氨酸，任选地被一个半胱氨酸打断)，或可以具有理想的生物学活性。

凝血酶肽衍生物二聚体

本发明的一些方面，本方法的NPAR激动剂是凝血酶肽衍生物二聚体。参见公开No.US2005/0153893，在此引入作为参考。二聚体基本上不会回转成单体并且具有与上述凝血酶肽衍生物单体大约相同的生物学活性。“凝血酶肽衍生物二聚体”是包含通过共价键(优选地是半胱氨酸残基之间的二硫键)连接的两个凝血酶肽衍生物的分子。凝血酶肽衍生物二聚体典型地基本上不含相应的单体，例如，大于95％(重量)不含相应单体，并且优选地99％(重量)不含有单体。优选地，多肽是相同的且通过二硫键共价连接在一起。

本发明的凝血酶肽衍生物二聚体包含上述凝血酶肽衍生物。具体地说，凝血酶肽衍生物具有少于大约五十个氨基酸，优选地少于大约三十三个氨基酸。凝血酶肽衍生物与对应于凝血酶氨基酸残基508-530：Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(SEQ ID NO：6)的人凝血酶片段也具有足够的同源性，使得该多肽能激活NPAR。此处描述的凝血酶肽衍生物二聚体由多肽形成，这些多肽典型地具有至少六个氨基酸，优选地具有大约12个到大约33个氨基酸残基，并且更优选地具有大约12个到大约23个氨基酸残基。

在一个具体的实施方式中，组成二聚体的每个凝血酶肽衍生物包含具有氨基酸序列SEQ ID NO：1：Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X₁-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X₂-Val的多肽，或其C-末端截短的包含至少六个氨基酸的片段。更优选地，每个凝血酶肽衍生物包含氨基酸序列SEQ ID NO：6：Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val，或其包含SEQ ID NO.5的氨基酸10-18的片段。更优选地，凝血酶肽衍生物包含氨基酸序列SEQ ID NO：2：Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X₁-ly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X₂-Val，或其包含SEQ ID NO：2的氨基酸10-18的片段。X₁是Glu或Gln，X₂是Phe、Met、Leu、His或Val。优选地X₁是Glu，X₂是Phe。这种类型的凝血酶肽衍生物的一个实例是一个包含氨基酸序列Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(SEQ ID NO：6)的多肽。这种类型的凝血酶肽衍生物的另一个实例是包含氨基酸序列H-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-NH₂(SEQ ID NO：3)的多肽。凝血酶肽衍生物中的零、一、二或三个氨基酸与SEQ ID NO：6、1、2或3相应位点的氨基酸不同。优选地，如NPAR激动剂的保守性置换一样，该不同也是保守性的。

本发明的凝血酶肽衍生物二聚体的一个实例由结构式(IV)表示：

在另一个具体的实施方式中，组成二聚体的每个凝血酶肽衍生物包含具有氨基酸序列SEQ ID NO：27：Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-Met-Lys-Ser-Pro-Phe-Asn-Asn-Arg-Trp-Tyr的多肽，或其C-末端截短的具有至少23个氨基酸的片段。更优选地，每个凝血酶肽衍生物包含氨基酸序列SEQ ID NO：28：Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X₁-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X₂-Val-Met-Lys-Ser-Pro-Phe-Asn-Asn-Arg-Trp-Tyr，或其C-末端截短的包含至少23个氨基酸的片段。X₁是Glu或Gln，X₂是Phe、Met、Leu、His或Val。优选地X₁是Glu，X₂是Phe。这种类型的凝血酶肽衍生物的一个实例是包含氨基酸序列Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-Met-Lys-Ser-Pro-Phe-Asn-Asn-Arg-Trp-Tyr(SEQ ID No：27)的多肽。这种类型的凝血酶肽衍生物的另一个实例是包含氨基酸序列H-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-Met-Lys-Ser-Pro-Phe-Asn-Asn-Arg-Trp-Tyr-NH₂(SEQ ID NO：29)的多肽。凝血酶肽衍生物中的零、一、二或三个氨基酸与SEQ ID NO：27、28或29相应位点的氨基酸不同。优选地，如对于NPAR激动剂的保守性置换所述，该不同也是保守性的。

NPAR激动剂抗体

一种特定种类的NPAR激动剂包括能够结合至并激活非蛋白水解激活的凝血酶受体(NPAR)并且能结合至一种或多种下面描述的互补肽的抗体和抗原结合片段。结合至凝血酶受体的激动剂抗体在本领域中已有描述。例如，Fost等教导了单克隆抗体TR-9能够模拟凝血酶与高亲和性凝血酶受体的高亲和性相互作用的效应(Frost，G.H.等，J.Cell Biol.105(6 PT.1)：2551-58(1987))。

作为NPAR激动剂的抗体或其抗原结合片段可通过它们与互补肽的结合来发现，该互补肽由编码一部分凝血酶的核苷酸序列的互补序列编码。参见下面的“分子识别理论”部分。在一种情况下，NPAR激动剂抗体或抗原结合片段与互补肽结合，该互补肽由编码一部分凝血酶的核苷酸序列的互补序列编码。在另一种情况下，NPAR激动剂的抗体或其抗原结合片段可通过它们与互补肽的结合来发现，该互补肽由编码一部分凝血酶的核苷酸序列的互补序列编码。在一个实施方式中，凝血酶或其部分(由正义或+RNA链编码并且与编码抗体或抗原结合片段所结合的互补肽的RNA链是互补的)是哺乳动物凝血酶或哺乳动物凝血酶的一部分。在另一个实施方式中，凝血酶或其部分是人凝血酶或人凝血酶的一部分。

可与互补肽(其中互补肽由编码凝血酶或其部分的核苷酸序列的互补序列编码)结合的抗体或其抗原结合片段可以是NPAR激动剂。在一个实施方式中，凝血酶的部分(由正义或+RNA链编码并且与编码抗体或抗原结合片段所结合的互补肽的RNA链是互补的)是凝血酶受体结合域或其部分。如此处所使用的，凝血酶受体结合域或其部分是凝血酶的一个区段，它能够选择性地结合至高亲和性非蛋白水解激活的凝血酶受体(NPAR)。此类凝血酶受体结合域含有结构域的一部分(由人凝血酶氨基酸残基517-520表示，参见图7，其显示了人凝血酶原的氨基酸序列(SEQ ID NO：12))，与纤连蛋白的三肽细胞结合域Arg-Gly-Asp有序列同源性。在一个特定的实施方式中，凝血酶受体结合域或其部分包含氨基酸序列AGYKPDEGKRGDACEGDSGGPFV(即，人凝血酶的氨基酸508-530(SEQ ID NO：6))。在另一个实施方式中，凝血酶受体结合域或其部分是凝血酶受体结合域的一部分并且包含氨基酸序列EGKRGDACEG(SEQ ID NO：7)。

正如此处所描述的，由反义RNA链5’-3’序列和反义RNA链3’-5’序列编码的凝血酶域的互补肽，都可以用于产生本发明的NPAR激动剂抗体和抗原结合域。因此，在一个实施方式中，互补肽(可结合抗体和抗原结合片段)由反义RNA链的5’-3’序列编码。在另一个实施方式中，互补肽由反义RNA链的3’-5’序列编码。

在一个实例中，互补肽(可结合本发明的NPAR激动剂抗体和抗原结合片段)包含氨基酸序列KGSPTVTFTGIPCFPFIRLVTS(AC-23；SEQID NO：30)。在另一个实例中，互补肽包含氨基酸序列KGSPTVTFTGIPSFPFIRLVTS(23C53；SEQ ID NO：31)。在另一个实例中，互补肽包含氨基酸序列TFTGIPSFPF(C1053；SEQ ID NO：32)。在另一个实例中，互补肽包含氨基酸序列RPMFGLLPFAPLRTLPLSPPGKQ[AC-23rev(SEQ ID NO：33)，它是相对于AC-23互补的5’-3’肽]。在另一个实例中，互补肽包含氨基酸序列LPFAPLRTLP[C1053rev(SEQ IDNO：34)，它是相对于C1053互补的5’-3’肽]。

NPAR激动剂抗体或其抗原结合片段的一个实例可以与包含氨基酸序列KGSPTVTFTGIPSFPFIRLVTS(23C53；SEQ ID NO：31)的半胱氨酸改变的互补肽结合。23C53，其与AC-23有一个氨基酸不同，是TP508的互补肽，除了它拥有一个从Cys至Ser的单氨基酸改变以外。

在使用生物素偶联的凝血酶的结合实验中，发现凝血酶可特异性地结合AC23和23C53。生物素标记的凝血酶与AC-23的半数最大结合是4.8±0.2nM(n＝2±SD)。

添加TP508可抑制生物素标记的凝血酶与AC-23的特异性结合。通过加入TP508，凝血酶与AC-23的结合可被抑制达60％。因此，不论是凝血酶还是TP508都能结合互补肽AC-23。这提示AC-23具有与细胞上凝血酶-TP508受体相类似的三维结构。抗AC-23的抗体和凝血酶的其他互补肽因此可用于鉴定被TP508激活的凝血酶结合位点，并且可以用于此处描述的治疗方法和其他方法中。

除凝血酶受体结合域之外，刺激性的(激动性的)凝血酶多肽衍生物拥有与许多丝氨酸酯酶有高度同源性的结构域(由人凝血酶的氨基酸残基519-530表示)。然而，抑制性的(拮抗性的)凝血酶肽衍生物并不包括丝氨酸酯酶域。

来自于人凝血酶氨基酸残基508-530的凝血酶肽衍生物据描述可以促进凝血酶受体介导的细胞刺激。此外，含有纤连蛋白同源域和丝氨酸蛋白酶同源域(人凝血酶的残基508-530)的刺激性的(激动性的)凝血酶多肽衍生物可高亲和性地结合凝血酶受体并替代DIP-α-凝血酶作为引发与受体占据相关的有丝分裂信号的引发物(DIP-α-凝血酶是保留受体结合活性的蛋白水解失活的凝血酶衍生物)。相比之下，仅含有纤连蛋白同源域(p517-520)(而不含丝氨酸蛋白酶同源域)的抑制性的(拮抗性的)凝血酶多肽衍生物可结合至凝血酶受体但并不引发有丝分裂。一种中间凝血酶肽衍生物(p519-530)保留有介导有丝分裂的能力，但比p508-530的能力小很多。

分子识别理论

Blalock和Smith(1984)观察到，氨基酸残基的亲水特征与转录为它的三联密码子的中间字母的身份有关(Blalock，J.E.和Smith，E.M.，Biochem.Biophys.Res.Commun.12：203-07(1984))。具体地，中间碱基密码为胸腺嘧啶(T)的三联密码子编码疏水性残基，而中间碱基为腺嘌呤(A)的三联密码子编码亲水性残基。中间碱基为胞嘧啶(C)或鸟嘌呤(G)的三联密码子编码具有类似亲水得分且相对中性的残基。亲水性是氨基酸对于极性环境的亲和性的指标；亲水性残基产生一个更加负值的得分，而疏水性残基呈现更加正值的得分。Kyte和Doolittle(1982)构思了一种亲水性分级，被广泛应用(Kyte，J.和Doolittle，R.F.，J.Mol.Biol.5：105-32(1982))。观测到的三联密码子中间碱基和残基亲水性之间的这种关系导致由互补DNA编码的肽将会呈现互补的或逆转的亲水性特征。据推测，由于两个由互补DNA链编码的肽序列显示出相反的亲水特征，它们可能会形成两亲性二级结构，并且会彼此结合(Bost，K.L.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：1372-75(1985))。据报道互补肽可以与它们对于许多不同系统而言的“正义”肽对应物形成结合复合物(Root-Bernstein，R.S.和Holsworthy，D.D.，J.Theor.Biol.190：107-19(1988))。例如，Gho和Chae描述了人血管生成素的肽拮抗剂，它们是由对应于血管生成素受体结合位点的反义RNA序列编码的互补肽(Gho，Y.S.和Chae，C.B.J.Biol.Chem.272(39)：24294-99(1997))。Ghiso等描述了一种与胱蛋白酶抑制剂C的一个区域互补的肽，其呈现出抑制性活性(Ghiso，J.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(4)：1288-91(1990))，并且Bost和Blalock描述了通过使用一对互补肽免疫从而产生了抗独特型抗体(Bost.K.L.和Blalock，J.E.，J.Molec.Recognit.1：179-83(1989))。

Blalock提出了一种分子识别理论(MRT)，进一步发展了该分析用于解释蛋白质间相互作用的范围(Bost，K.L.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：1372-75(1985)；Blalock，J.E.，Nature Med.1：876-78(1995))。基于由互补DNA链编码的肽会呈现出逆转的亲水特征这一观察，这种理论提出在肽之间存在着一种“分子识别”相互作用密码。MRT已经被证明在预测特定结合相互作用子方面是成功的。

Blalock提出正是序列中氨基酸亲水性得分的线性模式(而非特定残基的组合)决定了二级结构环境。而且，他提出具有相反亲水性特征的序列在形状上是互补的，这是由于相反的力决定了它们的空间关系。

在3′-5′阅读框内衍生互补肽

作为起始工作的结果，Blalock主张正如以通常的5′-3′方向阅读一个互补密码子一样，以3′-5′方向阅读一个互补密码子将会产生一个呈现相反亲水性特征的氨基酸序列(Bost，K.L.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：1372-75(1985))。这是根据以下发现得出的：三联密码子的中间碱基决定它所编码的残基的亲水指数，因此从相反方向阅读一个密码子会改变身份，但不会改变编码的氨基酸的亲水性质(表1)。

表1：互补链中编码的氨基酸和残基之间的关系

抗体和产生抗体的细胞

此处所指的NPAR激动剂包括能结合此处描述的互补肽并激活非蛋白水解激活的凝血酶受体的抗体和其抗原结合片段。此处所指的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，并且术语“抗体”包括多克隆和单克隆抗体。术语多克隆和单克隆是指抗体制备物的均质性程度，并非有意限定于某种特定生产方法。在一个实施方式中，抗体或抗原结合片段是单克隆抗体或其抗原结合片段。此处使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组分”，指一种抗体分子的群体，其仅含有一种类型的抗原结合位点，该抗原结合位点能够与本发明多肽的特定表位免疫反应。单克隆抗体组分因此通常呈现对与它免疫反应的本发明特定多肽的单一结合亲和性。

此处使用的术语“抗体”也包括抗体的功能性片段，包括嵌合的、人源化的、灵长类化的、镶饰的(veneered)或单链抗体。功能性片段包括可与互补肽结合的抗体的抗原结合片段，其中互补肽由编码凝血酶或其部分的核苷酸序列的互补序列编码。例如，能够结合互补肽的抗体片段包括，但并不局限于Fv、Fab、Fab’和F(ab’)₂片段。这些片段可通过酶解或重组技术产生。例如，木瓜蛋白酶或胃蛋白酶裂解可分别产生Fab或F(ab’)₂片段。其他具有必要的底物特异性的蛋白酶也可用于产生Fab或F(ab’)₂片段。应用在天然终止位点的上游已经引入一个或多个终止密码子的抗体基因，也可以产生多种截短形式的抗体。例如，编码F(ab’)₂重链部分的嵌合基因可以设计成包含编码重链CH₁域和铰链区的DNA序列。

单链抗体，以及嵌合的、人源化的或灵长类化的(CDR-移植的)、或镶饰的抗体，以及包含来源于不同物种的部分的嵌合的、CDR-移植的或镶饰的单链抗体，也涵盖在术语抗体中。这些抗体的不同部分可以通过常规技术以化学方法结合在一起，或使用遗传工程技术制备成一个连续的蛋白质。例如，编码一个嵌合或人源化链的核酸可表达产生一个连续的蛋白质。例如参见，Cabilly等，美国专利No.4,816,567；Cabilly等，欧洲专利No.0,125,023 B1；Boss等，美国专利No.4,816,397；Boss等，欧洲专利No.0,120,694 B1；Neuberger，M.S.等，WO 86/01533；Neuberger，M.S.等，欧洲专利No.0,194,276 B1；Winter，美国专利No.5,225,539；Winter，欧洲专利No.0,239,400 B1；Queen等，欧洲专利No.0 451 216B1；和Padlan，E.A.等，EP 0 519 596 A1。有关灵长类化的抗体亦可参见，Newman，R.等，BioTechnology，10：1455-1460(1992)，有关单链抗体，可参见Ladher等，美国专利No.4,946,778和Bird，R.E.等，Science，242：423-426(1988)。

人源化抗体可通过标准方法或其他适当技术由合成或重组DNA技术产生。编码人源化可变区的核酸(例如，cDNA)序列也可通过PCR突变方法构建，从而改变编码人或人源化链的DNA序列，例如来自于早先人源化的可变区的DNA模板(例如参见，Kamman，M.等，Nucl.AcidsRes.，17：5404(1989))；Sato，K.等，Cancer Research，53：851-856(1993)；Daugherty，B.L.等，Nucleic Acids Res.，19(9)：2471-2476(1991)；和Lewis，A.P.和J.S.Crowe，Gene，101：297-302(1991))。使用这些或适当方法，也可以容易地制备变体。在一个实施方式中，可以突变克隆的可变区，并且可以选择编码具有所需特异性的变体的序列(例如，从噬菌体文库选择；例如参见Krebber等，U.S.5,514,548；Hoogenboom等，WO 93/06213)。

抗体可以是包含一个或多个免疫球蛋白链的人源化抗体[例如，一种抗体，其包含非人来源的互补决定区(CDR)(例如，来源于非人源抗体的一个或多个CDR)和来源于人源轻链和/或重链的框架区(例如，具有或不具有框架改变的CDR移植抗体)]。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含特定免疫球蛋白的轻链CDRs(CDR1、CDR2和CDR3)和重链CDRs(CDR1、CDR2和CDR3)。在另一个实施方式中，抗体或抗原结合片段还包含一个人源框架区。

可以产生对互补肽具有特异性的抗体(其中互补肽由编码凝血酶或其一部分的核苷酸序列的互补序列编码)，该抗体针对适当的免疫原，例如合成的或重组的互补肽或其一部分。通过使用能够表达互补肽的转染细胞免疫适当的宿主(例如小鼠)，也能产生抗体。这些细胞也可以用于筛选与之结合的抗体(例如参见，Chuntharapai等，J.Immunol.，152：1783-1789(1994)；Chuntharapai等，美国专利No.5,440,021)。

免疫抗原的制备，以及单克隆和多克隆抗体的产生，可使用任何适当的技术进行(例如，如此处例举的)。已经描述了许多方法(例如参见，Kohler等，Nature，256：495-497(1975)和Eur.J.Immunol.6：511-519(1976)；Milstein等，Nature 266：550-552(1977)；Koprowski等，美国专利No.4,172,124；Harlow，E.和D.Lane，1988，Antibodies：A LaboratoryManual，(Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY)；Current Protocols In Molecular Biology，Vol.2(Supplement 27，Summer′94)，Ausubel，F.M.等，Eds.，(John Wiley & Sons：New York，NY)，Chapter11，(1991))。总体上讲，通过将适当的永生细胞系(例如，骨髓瘤细胞系，如SP2/0、P3X63Ag8.653或杂合骨髓瘤(heteromyeloma))和抗体产生细胞融合而产生杂交瘤。抗体产生细胞可以从用互补肽免疫的人或其他适当动物的外周血获得，或优选地从其脾脏或淋巴结获得。融合的细胞(杂交瘤)可使用选择性培养条件分离，并且通过有限稀释来克隆。产生具有所需特异性的抗体的细胞可通过适当试验(例如，ELISA)来选择。

可以使用其他产生或分离具有必要特异性的抗体(例如，人抗体或抗原结合片段)的适当方法，包括，例如从文库(例如，噬菌体展示文库)筛选重组抗体的方法。能产生全套人抗体的转基因动物(例如，

(Abgenix，Fremont，CA))可以使用适当方法得到(参见，Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551-2555(1993)；Jakobovits等，Nature，362：255-258(1993))。其他适合产生能产生全套人抗体的转基因动物的额外方法已有描述(例如，Lonberg等，美国专利No.5,545,806；Surani等，美国专利No.5,545,807；Lonberg等，WO97/13852)。

本发明还包括双特异性抗体，或其功能性片段(例如，F(ab’)₂)，其能结合此处描述的互补肽以及至少一种其他抗原(例如，肿瘤抗原，病毒抗原)。双特异性抗体可由三杂交瘤(triomas)和杂合杂交瘤分泌。一般来讲，三杂交瘤由一个杂交瘤和一个淋巴细胞(例如，抗体分泌B细胞)融合而成，杂合杂交瘤由两个杂交瘤融合而成。每种融合细胞(即，杂交瘤，淋巴细胞)产生一种单特异性抗体。但是，三杂交瘤和杂合杂交瘤能产生含有识别不同抗原的抗原结合位点的抗体。三杂交瘤和杂合杂交瘤的上清液可使用适当试验(例如ELISA)检测双特异性抗体，并且双特异性抗体可使用常规方法纯化(例如参见，美国专利No.5,959,084(Ring等)，美国专利No.5,141,736(Iwasa等)，美国专利Nos.4,444,878，5,292,668，5,523,210(均为Paulus等)和美国专利No.5,496,549(Yamazaki等))。

血管生长因子

“血管生长因子”是一种多肽，其能刺激血管的发育，例如，促进血管生成、内皮细胞生长、血管的稳定性和/或血管发生。例如，血管生长因子包括，但并不局限于，例如VEGF和VEGF家族成员、P1GF、PDGF家族、成纤维细胞生长因子家族(FGFs)、TIE配体(血管生成素)、ephrins、ANGPTL3、ANGPTL4等。血管生长因子也包括诸如生长激素、胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、VIGF、表皮生长因子(EGF)、CTGF和它的家族成员，以及TGF-α和TGF-β等多肽。例如参见，Klagsbrun和D′Amore，Annu.Rev.Physiol.，53：217-39(1991)；Streit和Detmar，Oncogene，22：3172-3179(2003)；Ferrara和Alitalo，Nature Medicine5(12)：1359-1364(1999)；Tonini等，Oncogene，22：6549-6556(2003)；和，Sato Int.J.Clin.Oncol.，8：200-206(2003)。

此处使用的术语″VEGF″(也被称为“VEGF-A”)是指血管内皮细胞生长因子蛋白质A。此处使用的术语″人VEGF″(也被称为“人VEGF-A”)是指人血管内皮细胞生长因子的任何同种型。描述的同种型(由不同的mRNA剪接导致)包括121、145、148、165、165b、183、189和206。例如参见，表2和Leung等，Science 246：1306(1989)，以及Houck等，Mol.Endocrin.5：1806(1991)。″人VEGF″也包括天然存在的人VEGF-A等位基因变体和通过翻译后修饰中的变异导致的变体。表2并非全部或限制性的。除非另外指出，表2中的血管生长因子是人血管生长因子。

表2VEGF家族血管生长因子举例

参考文献

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人VEGF-A以多种同种型存在，它们是由定位于染色体6上组织成8个外显子的单基因的mRNA选择性剪切产生的(例如参见，Ferrara N，Davis Smyth T.Endocr Rev 18：1-22(1997)，以及Henry和Abraham，Review of Preclinical and Clinical Results with Vascular Endothelial GrowthFactors for Therapeutic Angiogenesis，Current Interventional CardiologyReports，2：228-241(2000))。也参见，美国专利5,332,671和6,899,882。在一个实施方式中，将VEGF₁₆₅使用本发明的方法给药(例如，重组人VEGF₁₆₅)。含量最高的同种型VEGF₁₆₅是一种碱性的、肝素结合的、分子量大约为45,000道尔顿(Id)的二聚共价糖蛋白。VEGF₁₆₅同型二聚体由两个165个氨基酸的链组成。该蛋白质具有两个不同的域：一个受体结合域(残基1-110)和一个肝素结合域(残基110-165)。这两个域被七个分子内二硫键稳定，并且单体通过两个链间二硫键连接形成天然的同型二聚体。VEGF₁₂₁缺少肝素结合域(例如参见，美国专利5,194,596)，而VEGF₁₈₉(例如参见，美国专利5,008,196；5,036,003；和5,240,848)和VEGF₂₀₆被隔离在细胞外基质中。

术语“血管生长因子”还包括以下表3中的那些。表3中的列表并非全部或限制性的。

表3

参考文献

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“天然的”多肽(例如，天然的血管生成因子)是与来自于天然来源的多肽具有相同氨基酸序列的多肽。因此，天然多肽可具有来自于任何哺乳动物如人的天然存在的多肽的氨基酸序列。该天然多肽可从自然中分离或通过重组或合成方法产生。术语天然多肽包括该多肽的天然存在的截短的或分泌形式(例如，胞外域序列)、指定为野生型的等位基因型、天然存在的变异型(例如，选择性剪接的同种型)和该多肽的天然存在的等位基因变体。

“多肽变体”(例如，血管生成因子的多肽变体)意指与天然多肽具有至少大约80％的氨基酸序列同一性的生物活性多肽。例如，该“多肽变体”包括其中与天然多肽相比，在多肽的N-端或C-端添加或删除了一个或多个氨基酸残基的多肽。一般地，多肽变体与天然多肽具有至少大约80％的氨基酸序列同一性，或至少大约90％的氨基酸序列同一性，或至少大约95％或更高的氨基酸序列同一性。多肽变体包括含有一个或多个氨基酸置换、添加或缺失或任何这些与天然多肽的差异的组合的多肽。与天然多肽相比，多肽变体可具有，例如，几个，诸如5至10，1至5，或4、3、2或1个氨基酸的置换、缺失或添加的任意组合。在一个实施方式中，与天然多肽相比，变体具有静默的置换、添加和/或缺失，这些并不明显改变该多肽的性质和活性。多肽变体亦可为修饰的多肽，其中一个或多个氨基酸残基被修饰。多肽变体可通过本领域周知的多种方法来制备。与天然多肽的氨基酸序列不同的多肽变体可通过编码DNA的突变来制备。多肽变体也包括与天然多肽在糖基化或其他翻译后修饰方面不同的多肽。

例如，多肽变体的制备可以是通过编码天然多肽的DNA中核苷酸的定点诱变或通过噬菌体展示技术，由此产生编码变体的DNA，并且其后在重组细胞培养物中表达DNA。

氨基酸缺失一般为大约1至30个残基，任选地1至10个残基，任选地1至5个或更少，并且通常地是接续的。

氨基酸序列添加包括从一个残基到基本上无限制长度的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。序列内添加(即，在天然多肽序列内添加)一般地可在约1个至10个残基范围内，任选地1至5个，或任选地1至3个。末端插入的实例包括信号序列(相对于宿主细胞无论是异源性的还是同源性的)与N-端的融合，以利于从重组宿主中分泌。

其他的多肽变体是那些天然多肽中的至少一个氨基酸残基被移除并将不同的氨基酸残基插入到该位置(置换)的多肽。血管生长因子多肽变体中的保守性置换可以按照表4中显示的那样来获得，其中示例性的和优选的置换都是血管生长因子多肽变体中的保守性置换。多肽变体也可包含此处描述的非天然氨基酸。

氨基酸可以按照其侧链性质的相似程度分组(A.L.Lehninger，Biochemistry，second ed.，pp.73-75，Worth Publishers，New York(1975))：

(1)非极性的：Ala(A)，Val(V)，Leu(L)，Ile(I)，Pro(P)，Phe(F)，Trp(W)，Met(M)

(2)极性不带电的：Gly(G)，Ser(S)，Thr(T)，Cys(C)，Tyr(Y)，Asn(N)，Gln(Q)

(3)酸性的：Asp(D)，Glu(E)

(4)碱性的：Lys(K)，Arg(R)，His(H)

或者，天然存在的氨基酸基于共同的侧链性质可分成下面几组：

(1)疏水性的：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；

(2)中性亲水性的：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；

(3)酸性的：Asp，Glu；

(4)碱性的：His，Lys，Arg；

(5)影响链定向的残基：Gly，Pro；

(6)芳香族的：Trp，Tyr，Phe。

表4

″天然存在的氨基酸残基″(即由遗传密码编码的氨基酸残基)可选自：丙氨酸(Ala)；精氨酸(Arg)；天冬酰胺(Asn)；天冬氨酸(Asp)；半胱氨酸(Cys)；谷氨酰胺(Gln)；谷氨酸(Glu)；甘氨酸(Gly)；组氨酸(His)；异亮氨酸(Ile)：亮氨酸(Leu)；赖氨酸(Lys)；甲硫氨酸(Met)；苯丙氨酸(Phe)；脯氨酸(Pro)；丝氨酸(Ser)；苏氨酸(Thr)；色氨酸(Trp)；酪氨酸(Tyr)；和缬氨酸(Val)。″非天然存在的氨基酸残基″指与上述列出的那些天然存在的氨基酸残基不同，可通过肽键与多肽链中的相邻氨基酸残基结合的氨基酸残基。非天然存在的氨基酸残基的实例包括，例如，正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸和其他氨基酸残基类似物，如Ellman等Meth.Enzym.202：301-336(1991)和美国专利申请公开文本20030108885和20030082575中描述的那些。

此处的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为，在排比序列和引入缺口后，如果需要，为了获得最大百分比序列同一性，不将任何保守性置换视为序列同一性的一部分，血管生长因子的候选序列中与所选序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定百分比氨基酸序列同一性的排比可利用本领域中不同的方法来实现，例如使用可以公开获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于测量排比的适当的参数，包括在所比较的序列全长上取得最大排比所需的任何算法。

为了此处的目的，指定的氨基酸序列A与或相对于指定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性按如下方法计算(或者可以描述为指定氨基酸序列A与或相对于指定氨基酸序列B具有或含有一定的％氨基酸序列同一性)：100乘以分数X/Y，其中X是通过A和B排比后评分为相同匹配的氨基酸残基数，其中Y是B中的氨基酸残基总数。应当注意氨基酸序列A的长度不同于氨基酸序列B的长度，A与B的％氨基酸序列同一性和B与A的％氨基酸序列同一性将会不同。

血管生长因子的部分包括比相应天然多肽短，并且包含相应天然多肽的至少20个相邻氨基酸残基，与天然多肽有75％至100％氨基酸序列同一性的多肽。在特定的实施方式中，该部分和天然多肽有至少90％或95％的氨基酸序列同一性。血管生长因子的部分可以是合成的，并且当存在于从天然来源分离的蛋白质中时可具有N-末端氨基和C-末端羧基，或可具有修饰的N-端(例如，酰化的)和/或修饰的C-端(例如，酰胺化的)。血管生长因子的部分可通过表达为产生该部分而构建的基因来产生。该部分可以是环状的或线性的。在所有情况中，血管生长因子的部分具有相应天然多肽的至少50％的生物学活性，正如通过测定相应天然多肽的血管生成活性的适当试验方法所测定的。

此前许多方法已经应用于测定血管生成活性并且已经描述。血管生长因子不论是天然多肽、多肽变体、血管生长因子的部分、还是血管生长因子的融合蛋白，都可以使用一个或多个此处描述的试验，或其他合适的试验，如本领域普通技术人员周知的试验，通过体内或体外试验来检测，以评估它的活性。并不是所有试验都适合测定给定血管生长因子的血管生成活性。

已经描述了一个兔角膜试验，其中植入角膜内的血管生长因子刺激新毛细血管的生长。参见Ziche等，Lab.Invest.61：629-634(1989)。一个体外血管生成试验系统允许我们观察由血管生长因子刺激的内皮细胞的形态改变。参见Montesano等，J.Cell Biol.97：1648-1652(1983)。血管生长活性也可通过细胞响应血管生长因子生长的试验来测定[Marconcini等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：9671-9676(1999)]，或通过实施例6和7中描述的趋化试验来测定。

血管生长因子的融合蛋白包含生物活性天然多肽或其生物活性部分(如上所述)作为第一部分，该部分连接至在天然多肽中不存在的第二部分。因此，第二部分可以是一个氨基酸或多肽。第一部分可以位于融合蛋白的N-末端位置、C-末端位置或中间。在一个实施方式中，融合蛋白包含由天然存在的血管生长因子的氨基酸序列或其生物活性部分组成的生物活性多肽作为第一部分，以及包含连接序列和亲和配体的第二部分。

血管生长因子的融合蛋白可通过多种方法产生。例如，融合蛋白可以如下产生：通过将编码血管生长因子或其部分的基因插入到适当的表达载体中。将产生的构建体引入到适当的宿主细胞中进行表达。表达后，例如，可通过适当的亲和基质从细胞裂解物中纯化融合蛋白(例如参见，Current Protocols in Molecular Biology.Ausubel，F.M.等，eds.，pp.16.4.1-16.7.8，containing supplements up through Supplement 28，1994)。VEGF融合(嵌合)蛋白的例子参见Zheng等，Arterioscler.Thromb.Vas.Biol.2006；26：2019-2026 and Inoue等，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.2007；27：99-105。

血管生长因子可以是人源的或非人源的(优选地来自于哺乳动物)。人血管生长因子以及非人物种同源物都是血管生长因子并且可在本发明的组合治疗中使用。一种同源物和人血管生长因子优选地具有至少70％的氨基酸序列同一性，更优选地，至少80％的序列同一性，更加优选地，至少90％的序列同一性。

根据本发明，“血管生长因子”包括上述天然血管生长因子、血管生长因子的部分、血管生长因子的多肽变体和血管生长因子的融合蛋白。

使用NPAR激动剂的治疗方法

本发明涉及在需要治疗的受试者的某一部位治疗内皮功能障碍的方法，包括给受试者经血管施用治疗性有效量的NPAR激动剂，其中所述部位不是被血管成形术损伤的动脉、慢性皮肤溃疡、需要成骨诱导的部位或需要心血管再形成的部位。所述受试者可能患有一种或多种疾病或状况，逆转或抑制内皮功能障碍将有益于该疾病或状况。这些疾病或状况可包括，但并不局限于，高血压、充血性心力衰竭、冠状动脉疾病、中风、脑血管疾病、外周血管疾病、糖尿病、勃起功能障碍、动脉粥样硬化、哮喘、类风湿性关节炎、肺动脉高压、急性肺损伤、慢性阻塞性肺病(COPD)、囊性纤维化、炎性肺病、高同型半胱氨酸血症、镰状细胞病、先兆子痫、慢性肾衰竭、慢性肾功能障碍、肾微血管疾病、肝再灌注损伤、神经病、阿尔茨海默氏症、甲状腺疾病、脓毒症、血栓症、多器官功能衰竭、炎性肠病和辐射损伤等。在一个具体的实施方式中，该疾病是高血压。在另一个具体的实施方式中，该疾病是动脉粥样硬化。在另一个具体的实施方式中，该疾病是外周血管疾病。在另一个具体的实施方式中，该疾病是哮喘。

“受试者”优选地是需要用此处公开的NPAR激动剂治疗的人，但也可以是动物，例如，宠物(例如，狗、猫等)、农畜(例如，牛、猪、马等)和实验室动物(例如，大鼠、小鼠、豚鼠等)。

“需要用NPAR激动剂治疗”的受试者是指患有疾病和/或状况的受试者，该疾病和/或状况可用NPAR激动剂治疗从而达到有益的治疗效果和/或预防效果。有益的结果包括症状严重程度的降低或症状发作延缓、寿命延长和/或更快或更完全地缓解疾病或症状。

“有效量”是指与未经治疗相比，应用NPAR激动剂治疗状况得到改善的临床结果的NPAR激动剂使用量。NPAR激动剂给药量取决于疾病或状况的程度、严重性和类型、治疗需要的量、以及药物制剂的释放特性等。它还取决于受试者的健康情况、外形、体重、年龄、性别和耐药性。一般地，为达到理想的治疗效果，激动剂给药要持续足够长的一段时间。一般地，给需要治疗的受试者施用大约每天1μg至大约每天1mg的NPAR激动剂(优选地大约每天5μg至大约每天100μg)，特别是对于局部给药方法。NPAR激动剂也可以以大约0.1mg/kg/天至大约10mg/kg/天的剂量给药，优选大约0.2mg/kg/天至大约1mg/kg/天，特别是对于系统给药方法。本发明NPAR激动剂的典型剂量也是5-500mg/天，优选25-250mg/天，特别是对于系统给药方法。对于给受试者施用NPAR激动剂和血管生长因子组合的方法，血管生长因子(例如，VEGF-A)的给药剂量可由本领域普通技术人员按照疾病或紊乱的性质、治疗部位、受试者的年龄、性别、体重和其他状况来确定。血管生长因子的适当剂量是1μg/kg至50mg/kg(例如，0.1-20mg/kg)。

“治疗”意指经过一段时间的NPAR激动剂或含有NPAR激动剂的组合物给药后，根据观察部位或对特定疾病或紊乱测定的参数，达到了有益的治疗效果和/或预防效果，其可包括症状严重程度的降低或症状发作延缓或抑制、寿命延长和/或更快或更完全地缓解疾病或症状，或其他改善的临床结果。在受试者中-其中该受试者是，例如，正处于疾病、紊乱或状况发展风险的受试者，“治疗”也包括抑制或延缓了疾病、紊乱或医学状况的发作，也意味着降低了该疾病、紊乱或医学状况发展的可能性。

公开的NPAR激动剂可以通过任何合适途径给药，局部(例如，局部)或系统地，包括，例如，通过肠胃外给药。肠胃外给药可包括，例如，肌肉内、静脉内、皮下、或腹膜内注射或血管给药，也可包括透皮贴剂和植入的缓释装置，如泵。局部给药可包括，例如，霜剂、凝胶、软膏或气雾剂等。呼吸系统给药可包括，例如，吸入或鼻内滴注。对于特定适应症，直接向治疗部位注射或植入NPAR激动剂是十分有利的。NPAR激动剂有利地可以在缓释制剂中给药。NPAR激动剂可以长期给药，其中激动剂在一段长期的时间里(至少60天，一般至少一年)间隔性地或通过连续给药方法给药，以治疗慢性或复发性疾病或状况。

包含治疗剂的组合的给药包括在一段治疗时间内以任何顺序同时(共同)给药以及连续给药。治疗剂可以在一种组合物中一起给药，或可以在分开的组合物中给药。NPAR激动剂可通过与血管生长因子相同的给药途径给药。NPAR激动剂也可通过与血管生长因子不同的给药途径给药。NPAR激动剂和血管生长因子可具有相同或不同的给药日程。

NPAR激动剂可与作为药物组合物一部分的可接受的药物载体一起给药至受试者。依照选择的给药途径，药物组合物的制剂将会作相应变化。合适的药物载体可含有不与化合物相互作用的惰性成分。载体应当是生物相容性的，即非毒性、非炎性、非免疫原性的以及在给药部位不产生其他不希望的反应。药学上可接受的载体的实例包括，例如盐水、气溶胶、可商购的惰性凝胶、或添加有白蛋白、甲基纤维素或胶原基质的液体。可采用标准的药物配剂技术，诸如在Remington’s PharmaceuticalSciences，Mack Publishing Company，Easton，PA中描述的那些技术。

本发明中用于治疗内皮功能障碍的组合物可另外包含一种药物载体，其中凝血酶肽衍生物或NPAR激动剂溶解或悬浮在该载体中。药学上可接受的载体的实例包括，例如盐水、气溶胶、可商购的惰性凝胶、或添加有白蛋白、甲基纤维素或胶原基质的液体。此类制剂中典型的是凝胶。如前所述，凝胶由选自油性基质、水或乳剂-悬浮剂基质的基质组成。在基质中加入一种胶凝剂，从而在该基质中形成基质环境(matrix)，增加其粘度至半固体的稠度。胶凝剂的实例是羟丙基纤维素、丙烯酸聚合物等。在加入胶凝剂之前，将活性成分以希望的浓度加至制剂内，或者可以在胶凝过程后混合。

在一个实施方式中，NPAR激动剂在持续释放制剂中给药。通常利用聚合物形成持续释放制剂。这些聚合物的实例包括聚α-羟酯，诸如聚乳酸/聚乙醇酸均聚物和共聚物、聚磷腈(PPHOS)、聚酐和聚(丙烯延胡索酸酯)。

聚乳酸/聚乙醇酸(PLGA)均聚物和共聚物是在本领域中众所周知的持续释放载体。通过改变聚乳酸与聚乙醇酸的比例和聚合物的分子量，熟练技术人员可以调节释放的速率(参见Anderson等，Adv.Drug Deliv.Rev.28：5(1997)，整个教导在此引入作为参考)。在聚合物中加入聚(乙二醇)作为混合物形成微粒载体可进一步改变活性成分的释放谱(参见Cleek等，J.Control Release 48：259(1997)，整个教导在此引入作为参考)。陶瓷如磷酸钙和羟基磷灰石也可加入至制剂中来改善机械质量。

PPHOS聚合物含有交替的氮和磷，在聚合物骨架中没有碳原子，如以下结构式(II)所示：

聚合物的性质可通过适当改变键合至聚合物骨架上的侧基R和R’而调整。例如，PPHOS的降解和由其引起的药物释放可通过改变水解不稳定的侧基的量来控制。例如，掺入更多咪唑基或乙二醇(ethylglycol)取代的PPHOS，就会观察到降解速率的增加(参见Laurencin等，J BiomedMater.Res.27：963(1993)，整个教导在此引入作为参考)，由此提高了药物释放的速率。

结构式(III)显示的聚酐具有明确的降解和释放特性，可通过引入不同量的疏水性或亲水性单体例如癸二酸和1，3-二(对-羧基苯氧基)丙烷来控制(参见Leong等，J. Biomed.Mater.Res.19：941(1985)，整个教导在此引入作为参考)。为改善机械强度，酐通常与亚胺共聚合形成酐-酰亚胺共聚物。适合于整形外科应用的酐-酰亚胺共聚物的实例为偏苯三酸酰亚氨基-甘氨酸-1，6-二(羧基苯氧基)己烷共聚物(poly(trimellitylimido-glycine-co-1，6-bis(carboxyphenoxy)hexane)和均苯四酸酰亚氨基丙氨酸(pyromellityimidoalanine)：1，6-二(对-羧基苯氧基)己烷共聚物。

注射递送制剂可通过静脉给药或直接在需要治疗的部位给药。注射载体可以是粘性溶液或凝胶。

递送制剂包括生理盐水、细菌抑制盐水(含有大约0.9％mg/mL苯甲醇的盐水)、磷酸盐缓冲盐水、Hank’s液、Ringer’s-乳酸盐、或添加有白蛋白、甲基纤维素或透明质酸的液体。注射基质包括聚环氧乙烷聚合物以及乙烯和环氧丙烷的共聚物(参见Cao等，J.Biomater.Sci 9：475(1998)和Sims等，Plast Reconstr.Surg.98：843(1996)，整个教导在此引入作为参考)。

包封组合物(诸如包封于硬明胶包衣中或环糊精中)的方法在本领域中众所周知(Baker等，“Controlled Release of Biological Active Agents”，John Wiley and Sons，1986)。

一般利用油性基质来制备软膏，例如含有不挥发性油或碳氢化合物，诸如矿脂或矿物油、或吸收基质，例如由一种或多种吸收剂无水物质组成，例如无水羊毛脂。在形成基质后，活性成分以需要的浓度加入。

霜剂通常包含油相(内部相)，油相一般地含有不挥发性油、碳氢化合物等，诸如蜡、矿脂、矿物油等，以及水相(连续相)，其包含水和任何水溶性物质，诸如添加的盐。两相通过使用化剂来稳定，例如，表面活性剂，诸如月桂基硫酸钠；亲水性胶体，诸如阿拉伯树胶胶质粘土、蜂胶等。乳剂形成后，活性成分以需要的浓度加入。

凝胶含有选自油性基质、水、或乳剂-悬浮剂基质的基质，如前所述。在基质中加入胶凝剂，从而在基质中形成一种基质环境(matrix)，提高其粘度至半固体粘度。胶凝剂的实例是羟丙基纤维素、丙烯酸聚合物等。在加入胶凝剂之前将活性成分以希望的浓度加至制剂内。

可用公开的NPAR激动剂治疗的疾病和状况经常伴有诸如疼痛和感染的症状和虚弱。为解决这些问题，在一些情况中，一种或多种额外的药理学活性剂与NPAR激动剂一起共同给药是十分有益的。例如，对抗疼痛和炎症可能需要与止痛药或抗炎药共同给药。对抗感染可能需要与抗微生物药、抗生素或消毒剂共同给药。

NPAR激动剂可单独给药至受试者，或与一种或多种其他治疗剂组合给药，其他治疗剂例如是，降胆固醇剂、抗高血压剂、β-阻断剂、抗凝血剂、溶血栓剂、止痛剂、消炎剂、抗斑剂(anti-plaque agent)、胰岛素、一氧化氮产生剂、抗病毒剂或抗生素。在一种方法中，NPAR激动剂可与精氨酸组合给药至受试者，例如，应用精氨酸作为口服营养添加物。

凝血酶肽衍生物和修饰的凝血酶肽衍生物可通过固相肽合成方法(例如BOC或FMOC)、液相合成、或其他适当技术包括上述方法的组合来合成。BOC和FMOC方法已被建立和广泛应用，在Merrifield，J.Am.Chem.Soc.88：2149(1963)；Meienhofer，Hormonal Proteins and Peptides，C.H.Li，Ed.，Academic Press，1983，pp.48-267；以及Barany和Merrifield，in The Peptides，E.Gross and J.Meienhofer，Eds.，Academic Press，NewYork，1980，pp.3-285中描述。固相肽合成方法在Merrifield，R.B.，Science，232：341(1986)；Carpino，L.A.and Han，G.Y.，J.Org.Chem.，37：3404(1972)和Gauspohl，H.等，Synthesis，5：315(1992)中描述。这六篇文章的教导在此完整引入作为参考。

凝血酶肽衍生物二聚体可通过单体的氧化而制备。凝血酶肽衍生物二聚体可通过凝血酶肽衍生物与过量的氧化剂反应而制备。一种众所周知的合适的氧化剂是碘。

此处使用的“非芳香族杂环基团”是一个非芳香族碳环系统，具有3至10个原子并且包括至少一个杂原子，诸如氮、氧或硫。非芳香族杂环基团的实例包括哌嗪基、哌啶基、吡咯烷基、吗啉基、硫吗啉基。

术语“芳基基团”包括碳环和杂环芳香环系统。芳基基团的实例包括苯基、吲哚基、呋喃基和咪唑基。

“脂肪族基团”是直链的、支链的或环形非芳香族烃。脂肪族基团可以是完全饱和的或含有一个或多个不饱和(例如，双键和/或三键)，但优选地是饱和的，即烷基基团。典型地，一个直链或支链脂肪族基团具有1至大约10个碳原子，优选1至大约4个，一个环状脂肪族基团具有3至大约10个碳原子，优选3至大约8个。例如，脂肪族基团包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、环戊基、己基、环己基、辛基和环辛基等。

脂肪族基团、芳基基团或非芳香族杂环基团的合适的取代基是那些不会明显降低NPAR激动剂治疗活性的取代基，例如在天然存在的氨基酸上发现的取代基。实例包括-OH、卤素(-Br、-Cl、-I和-F)、-O(R_e)、-O-CO-(R_e)、-CN、-NO₂、-COOH、＝O、-NH₂-NH(R_e)、-N(R_e)₂、-COO(R_e)、-CONH₂、-CONH(R_e)、-CON(R_e)₂、-SH、-S(R_e)、脂肪族基团、芳基基团和非芳香族杂环基团。每个R_e独立地是烷基基团或芳基基团。取代的脂肪族基团可具有一个以上的取代基。

本发明通过下述的实施例来阐述，这些实施例绝不是限制性的。

实施例1：材料和方法

内皮细胞培养

在37℃和5％CO₂下在内皮细胞生长培养基(EGM)中培养人冠状动脉内皮细胞(HCAE细胞，Cambrex Bio Science Walkersville，Walkersville，MD)于，该培养基中补充有2％胎牛血清和Single Quot添加物(Clonetics，San Diego，CA；含有表皮生长因子、氢化可的松、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素生长因子、抗坏血酸、肝素、庆大霉素，和两性霉素B)。这些研究使用传代在4-6代之间的细胞。将HCAE细胞在12孔板上以每孔50,000个细胞的密度铺板，并且生长3天达到铺满。铺满后两天的细胞用TNFα或TP508处理。然后将细胞在常氧或1％低氧条件下培养指定的时间。在一些实验中，在TNFα刺激之前先用TP508预处理细胞1h。为了提取RNA，HCAE细胞需在6孔板中培养。

RT-PCR

按照厂商描述使用Ambion分离试剂盒分离总RNA。

应用一个两步法方案使用Ready-to-Go RT-PCR Beads(AmershamBiosciences)进行eNOS的RT-PCR反应。首先，将1μg总RNA和作为引物的1μg随机六碱基序列(pdN6)以及M.-MuLV逆转录酶在42℃孵育60min，来进行cDNA的合成。然后，在95℃加热5min后，进行25或30个循环(变性：95℃30s；退火62℃30s；延伸72℃30s)的PCR，最后以一个72℃7min的延伸结束。人eNOS引物序列如下：正义5’-GCA CCG GCA TCA CCA GGA AGA AGA-3’(SEQ ID NO：35)，反义5’-CCG CCG CCA AGA GGA CAC CAG T-3’(SEQ ID NO：36)(Sitges，M.等，Int.J.Cardiol.105(1)：74-79，2005)。18S引物(Ambion)用来扩增18S核糖体RNA，作为内部标准化对照。PCR扩增产物通过1％琼脂糖凝胶电泳来显示。

SYBR Green实时PCR

实时定量PCR用来确定用TP508或TNF处理的内皮细胞中eNOSmRNA的相对表达。将样品编号以进行盲试。1微克总RNA使用Taqman逆转录试剂盒(ABI)按照厂商规定进行逆转录。使用2μl cDNA在25μl的总体积，在SYBR Green PCR Master Mix(ABI)中使用SYBR Green探针，来进行定量PCR扩增。所有PCR实验均在ABI Prism 7000序列检测系统上运行。SYBR Green PCR引物如下：人eNOS正义引物：5’-GCGGCT GCA TGA CAT TGA G-3’(SEQ ID NO：37)，反义引物：5’-GTCGCG GTA GAG ATG GTC AAG T-3’(SEQ ID NO：38)。逆转录的cDNA样品循环阈值由三重复样本确定并对18S“管家”基因标准化。

Western Blot分析

将细胞裂解物在10％聚丙烯酰胺凝胶中进行SDS-PAGE并且转移至硝酸纤维素膜上(0.2-μm，Invitrogen)。用5％牛奶封闭后，在4℃下膜与针对磷酸-eNOS(Ser1177)和eNOS(Cell Signaling Technology，Beverly，MA)、人I型精氨酸酶(克隆9C5)(Cell Sciences，Canton，MA)或GAPDH(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)的第一抗体进行过夜孵育。HRP偶联的抗小鼠抗体或抗兔抗体(Cell Signaling Technology)作为第二抗体使用(HRP，辣根过氧化物酶)。免疫印迹用Immobilon WesternDetection Reagents(Millipore Corporation)来显色。

实施例2：TP508阻断TNF-α诱导的精氨酸酶I上调

如上所述，ED和NO依赖的信号丧失可能是由于NOS活性的降低，或精氨酸酶活性增加导致细胞L-精氨酸水平降低。在缺氧和炎症反应中，据报道TNF-α水平升高且认为此升高会通过影响这一种或两种NO相关活性而导致ED。为评估TP508对ED的潜在效应，我们在正常氧条件下培养早期传代的人冠状动脉内皮细胞(HCAE细胞)，并使用单独的TNF-α或使用TNF-α和TP508之组合来处理细胞。

使用人1型精氨酸酶特异性抗体，HCAE细胞裂解物的Western印迹显示，相对于对照培养物，TNF-α处理导致了精氨酸酶1(ARG1)表达的显著增加(图1)。如图1和图2所示，TP508单独处理对ARG1表达没有影响，但是完全阻断了TNF-α诱导的ARG1表达的增加。TP508对TNF-α刺激的ARG1表达的抑制是剂量依赖性的，半数最大抑制发生在TP508浓度为10μg/ml时(图2)。因此，TP508似乎能够阻断TNF-α诱导的导致ARG1增加的信号。TP508的这种抑制效应似乎对TNF-α效应的一个亚类是特异性的，因为TNF-α刺激的Erk1/2和p70S6激酶的磷酸化并没有被TP508抑制。

实施例3：TP508刺激eNOS表达和eNOS磷酸化

使用特异性针对在S1177位点磷酸化的eNOS的抗体，HCAE细胞裂解物的Western印迹显示，TNF-α处理或将细胞暴露于低氧条件(1％O₂)24h，与正常氧对照相比，eNOS表达分别减少了65％和45％(图3)。正如所显示的，TP508防止了由缺氧造成的eNOS表达的降低，使eNOS表达水平保持在与培养于正常氧条件下的细胞中类似的水平上。与此相反，TP508与TNF-α同时添加不能抑制TNF-α诱导的eNOS表达降低(未显示)。在常氧和低氧条件下，相对于常氧和低氧对照培养物，TP508分别能够增加eNOS磷酸化1.8倍和2.5倍(图3)。尽管这些磷酸化中的一些可能是由于eNOS表达的增加，但是这些磷酸化的增加不能单独用表达的增加来解释。检测TP508对在常氧条件下培养的细胞中eNOS表达和磷酸化的影响的其他实验证实TP508刺激了eNOS的磷酸化，并且显示这种影响是剂量依赖性的，半数最大反应剂量在～10μg/ml时(图4)。

实施例4：TP508上调eNOS mRNA

与蛋白质表达数据相一致，HCAE细胞mRNA的RT-PCR分析显示TP508能上调eNOS mRNA表达(图5)。TP508的这种效应在RT-PCR第25个循环显示出来，此时eNOS mRNA条带在TP508处理的细胞中可见，而在对照细胞中没有。与此相比，在30个循环的RT-PCR之后证明，与对照相比TNF-α处理明显地降低了表达。为定量TP508的该效应，我们使用SYBR Green实时PCR分析逆转录的mRNA样本。如图6所示，在正常氧条件下培养24h后，与对照相比TP508增加eNOS mRNA水平达40％(p＜0.05)。与此相比，TNF-α降低eNOS mRNA水平达～80％。细胞24小时暴露于低氧条件下(1％氧)也降低eNOS mRNA对照水平达～60％。TP508处理这些细胞部分地防止了低氧诱导的降低。正如所显示的，TP508处理的缺氧细胞具有比缺氧对照细胞高～40％的eNOSmRNA水平(p＜0.05)。

实施例5：TP508加强了VEGF发出eNOS磷酸化信号的能力

人冠状动脉内皮(HCAE)细胞(Lonza Walkersville，Inc.，Walkersville，MD)在常氧和低氧[1％O₂]条件下在有或无TP508[50μg/ml]条件下培养24h，然后用血管生长因子人VEGF[50ng/ml]刺激1或5min。使用能识别激活形式eNOS(在S1177处磷酸化)的抗体(Cell Signaling，Danvers，MA)，通过Western印迹法确定人VEGF诱导的eNOS激活。膜再次用抗GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)抗体探查，来显示相等的蛋白质载量。图8中显示了一个代表在不同处理后激活的eNOS Western印迹的密度分析的条图。

如图8所示，在正常氧细胞中，人VEGF在丝氨酸1177上诱导短暂的eNOS磷酸化来激活该酶，其最大值在1分钟时(2倍)，在5分钟刺激后已经下降。如果细胞在人VEGF刺激前用TP508预处理，则eNOS磷酸化可延长且保持近似最大刺激5min。因此，通过延长最大刺激的时间段，TP508加强了VEGF发出eNOS磷酸化信号的能力。

在缺氧细胞中(培养于1％O₂下24小时)，与正常氧细胞相比，在1min处理时人VEGF刺激的eNOS磷酸化水平降低～4倍。因此，缺氧显著地减少了人VEGF刺激的eNOS激活。但是，用TP508预处理的缺氧细胞显示人VEGF诱导的eNOS激活处于与正常氧细胞相当的水平上。因此，TP508预处理缺氧细胞恢复了人VEGF刺激eNOS激活达到在正常氧细胞中观察到的水平的能力。

实施例6：TP508增强了内皮细胞向VEGF的迁移

待测物质吸引内皮细胞以及刺激它们通过膜上的孔迁移的能力，是确定待测物质的血管生成潜力的几种测试之一。图9A显示了测量内皮细胞向化学引诱剂迁移的实验设计。在迁移试验之前，细胞在有或无TP508条件下培养来确定TP508对内皮细胞迁移的影响。

人冠状动脉内皮(HCAE)细胞(Lonza Walkersville，Inc.，Walkersville，MD)在无(对照)或有TP508[50μg/ml](图9A和图9B中的“TP Pret”)的条件下培养24h。按照厂商说明使用BD FluoroBlok插入物(BD Bioscience，Bedford，MA)进行穿膜细胞迁移试验。将对照或TP508预处理的细胞添加至插入物的顶端。将人VEGF[10ng/ml](V)或单独的培养基(C)添加至插入板的下面的腔室中作为化学引诱剂。内皮迁移在正常氧或1％低氧条件下进行。经过22小时孵育后，细胞用钙黄绿素AM迁移后标记并且通过检测迁移至插入膜下方的细胞的荧光来进行测量。

图9B显示了TP508处理对内皮细胞向血管生成因子人VEGF(人重组VEGF-A 165，R&D System，Minneapolis，MN)迁移的影响。

结果显示，在正常氧条件下(180％)试验，人VEGF刺激正常对照内皮细胞迁移是培养基对照细胞的～2倍，在低氧条件下相对于培养基对照细胞略微降低(～150％)。当在正常氧和低氧条件下测试细胞时，显示TP508预处理的内皮细胞向人VEGF的迁移分别是培养基对照的～5倍和～4倍。因此，相对于未处理的对照细胞，TP508预处理增强了内皮细胞向人VEGF的迁移达2至3倍。由于该细胞迁移试验是细胞血管生成潜力的一项测验，这些结果证明，在正常氧条件下，以及在对人VEGF的血管生成反应减少的低氧条件下，TP508处理将人VEGF对内皮细胞的血管生成能力提高了超过两倍。

实施例7：TP508增强了内皮细胞对人VEGF的血管生成反应

内皮细胞通过Matrigel基质的侵入是用来确定待测物质的血管生成潜力的许多试验中的一个，并且被认为比简单的穿过膜孔的趋化试验更能预测体内的血管生成，因为细胞必须降解而后侵入基质，以移动进入且穿过膜上的孔。图10A显示了测量内皮细胞通过Matrigel向化学引诱剂侵入的实验设计。

人冠状动脉内皮(HCAE)细胞(Lonza Walkersville，Inc.，Walkersville，MD)在无(对照)或有TP508[50μg/ml](TP pret)的条件下培养24h。使用包被有BD Matrigel Matrix(BD Bioscience，Bedford，MA)的FluoroBlok插入物，用BD BioCoat^TM Angiogenesis System(BD Bioscience，Bedford，MA)进行内皮细胞侵入试验。将对照或TP508预处理的细胞添加至插入物顶端。将含人VEGF[10ng/ml人重组VEGF-A 165aa，R&D System，Minneapolis，MN]的培养基(V)或单独的培养基(C)添加至插入板的下面的腔室中，作为化学引诱剂来确定对人VEGF的血管生成反应。内皮细胞侵入在正常氧或低氧(1％O₂)条件下进行。经过22小时孵育后，细胞用钙黄绿素AM迁移后标记并且通过检测迁移至插入膜下方的细胞的荧光来进行测量。

图10B显示了TP508处理对内皮细胞向人VEGF侵入的影响。结果显示在正常氧或低氧条件下检测的对照内皮细胞没有被人VEGF刺激以降解Matrigel并透过膜向人VEGF迁移。相反，相对于那些没有用TP508预处理的对照细胞，与TP508预孵育的内皮细胞显示出增加的侵入特性。另外，这些细胞现在对人VEGF产生反应(比在没有人VEGF下在用TP508预处理的细胞中观察到的高约50％的侵入，以及向VEGF的侵入是对照细胞的接近两倍)。这些结果证明了在非TP508处理的对照细胞对人VEGF处理根本没有反应的条件下，TP508处理增强内皮细胞对人VEGF血管生成反应能力的能力。

实施例8：TP508对正常氧和缺氧的HCMVE细胞中VEGF mRNA表达的影响

人心脏微血管内皮(HCMVE)细胞用VEGF(10ng/ml)(V)或TP508(50μg/ml)(TP)处理，并培养于正常氧或1％低氧条件下24h。实时PCR分析显示出处理后VEGF mRNA稳态水平的变化。来自一个三次重复的试验的数据显示在图11中，以均值±SD表示。在正常氧下与对照(C)细胞相比^*p＜0.01。在低氧下与对照(C)细胞相比^#p＜0.01。

实时PCR分析显示相对于培养于正常氧条件下的对照细胞，VEGF刺激降低了VEGF mRNA表达(2倍)。正如预期的，相对于正常氧对照细胞，低氧增加了VEGF mRNA(2.4倍)。TP508处理对正常氧细胞中VEGF mRNA稳态水平没有影响。但是，相对于对照缺氧或对照正常氧细胞，TP508处理的缺氧细胞分别表达了～4倍和～10倍高水平的VEGFmRNA(图11)。相反，在缺氧细胞中，VEGF刺激没有影响或降低了VEGF mRNA。通过该实验，TP508增强了缺氧上调VEGF表达的效应。

实施例9：TP508预处理对氨甲酰胆碱诱导的松弛的影响

制备大鼠主动脉环(内皮细胞层完整)。用1mM TP508或不用TP508(对照)处理该环1小时。使用500nM去甲肾上腺素收缩该环，紧接着增加氨甲酰胆碱的剂量(0、1、10、100、500、750、1000和5000nM)。显示了均值±SEM；n＝2只动物。

去甲肾上腺素收缩的带有完整内皮的环响应增加剂量的氨甲酰胆碱松弛(Furchgott，R.F.和Zawadzki，J.V.，Nature 288：373-376(1980))。如果TP508是一种平滑肌松弛剂，则与对照相比，在去甲肾上腺素-氨甲酰胆碱给药方案之前的TP508处理将会导致氨甲酰胆碱诱导的松弛增加，即相对于对照曲线，氨甲酰胆碱剂量反应曲线向左位移。

图12证实在增加的氨甲酰胆碱浓度下(大于250nM；长方形框)，TP508预处理的环与对照相比显示松弛增加。此外，TP508预处理导致一个∑形氨甲酰胆碱剂量反应曲线。对照环产生线性氨甲酰胆碱剂量反应曲线。

实施例10：人内皮细胞研究

HMVEC(人微血管内皮细胞)

使用微阵列的实验显示，TP508能防止如对低氧反应所预期的精氨酸酶1(ARG1)表达的增加和内皮一氧化氮合酶(eNOS)表达的降低。例如，HMVEC的研究与外周血管疾病和肾血管疾病相关。

HAE(人主动脉内皮细胞)

HAE细胞用来研究下游调节元件。在常氧条件下孵育30分钟后，TP508降低了细胞内信号调节激酶1和2(ERK1/2)、以及丝氨酸/苏氨酸激酶p70S6的磷酸化，并且提高了粘着斑激酶(FAK)的磷酸化。

HAE细胞用肿瘤坏死因子α(TNF-α)处理，增加了ARG1的表达。用TP508预处理仅抑制了TNF-α诱导的ARG1提高。这提示TP508可逆转细胞因子对一氧化氮(NO)途径的效应。在正常氧条件下，无论是否有TNF-α/低氧处理，TP508都增加了细胞中磷酸化的eNOS(p-eNOS)和eNOS。

例如，HAE细胞研究与高血压、动脉粥样硬化、主动脉狭窄和主动脉瘤相关。

表5：HAE小结

处理	反应
处理	反应			TP508处理的细胞(正常氧)	ERK 1/2激活降低	P70S6激活降低	FAK激活增加
TP508预处理然后用TNFα处理的细胞	抑制TNFα诱导的ARG1增加	对ERK1/2磷酸化没有影响	对P70S6磷酸化没有影响	TP508处理的细胞(正常氧)	ERK 1/2激活降低	P70S6激活降低	FAK激活增加
TP508预处理然后用TNFα处理的细胞	抑制TNFα诱导的ARG1增加	对ERK1/2磷酸化没有影响	对P70S6磷酸化没有影响	TP508处理，有或无TNFα处理	eNOS表达增加	eNOS激活增加

HLME(人肺微血管内皮细胞；或者，HLMVE细胞)

HLME细胞用VEGF、TP508和去血清测试。用VEGF和TP508处理的细胞系都显示出存活率增加。单独的VEGF低水平增加了存活率，单独的TP508几乎没有影响。

在低氧和正常氧条件下观察VEGF、eNOS、VEGFR1和VEGFR2对TP508处理的反应。当在正常氧条件下研究HLME细胞时，仅eNOS被TP508处理正调节。当在低氧条件下研究HLME细胞时，与缺氧未处理对照相比，所有四个基因均在mRNA水平上调节。

表6：HLME小结

处理	反应
处理	反应		细胞去血清，用VEGF和TP508处理	单独TP508处理不增加细胞存活率	VEGF和TP508处理增加存活率，超过单独的VEGF
TP508处理：正常氧	eNOS表达上调	VEGF、VEGFR1和VEGFR2表达：没有影响	细胞去血清，用VEGF和TP508处理	单独TP508处理不增加细胞存活率	VEGF和TP508处理增加存活率，超过单独的VEGF
TP508处理：正常氧	eNOS表达上调	VEGF、VEGFR1和VEGFR2表达：没有影响	TP508处理：低氧	eNOS表达上调	VEGF、VEGFR1和VEGFR2表达上调

例如，HLME细胞研究与哮喘、急性肺损伤、肺动脉高血压、囊性纤维化和炎性肺疾病相关。

实施例11：对分离的冠状小动脉中内皮功能/功能障碍的影响

使用Ameroid缩窄器，使成年Yucatan猪冠状动脉左旋支(LCX)慢性闭塞，第60天从其心脏和从非缺血左前降支动脉(LAD)按照描述的分离冠状微血管(小动脉)。从LAD或LCX上仔细剥离心外膜下小动脉分支(60-100μm内径以及1至1.5mm长度，无分支，原位)。每个小动脉用玻璃微吸管插入且增压至60cm H₂O的管内压，不流动。血管内径在整个实验中都用影像显微镜技术结合MacLab(ADInstruments，Inc)数据采集系统来测量。紧张度(tone)发展后(自发收缩至最大直径的大约70％)，我们确定内皮依赖性NO介导的血管扩张剂腺苷(0.1nM至10μM)和5-羟色胺(0.1nM至1μM)、ATP敏感的钾通道开启剂吡那地尔(0.1μM至3μM)、以及内皮不依赖性血管扩张剂硝普钠(1nM至0.1mM)的浓度和直径的关系。在小动脉腔外孵育之前和之后建立对这些激动剂的血管扩张反应。实验结束后，每个血管用生理平衡的、含有乙二胺甲乙酸(EDTA，1mM)的无钙盐溶液中的100μM硝普钠进行松弛，以在60cmH₂O的腔内压下达到它的最大直径。所有响应激动剂的直径变化都对该扩张进行标准化，且表达为最大扩张的百分比。

为确定该LCX闭塞模型中慢性缺血是否产生了冠状动脉内皮功能障碍，以及TP508处理是否影响了NO信号产生，从TP508和安慰剂处理的心脏的左前降支动脉(LAD)非缺血分支以及闭塞、缺血的LCX分离冠状小动脉。然后用腺苷、5-羟色胺、硝普钠或吡那地尔离体处理分离的小动脉。如果小动脉具有内皮功能障碍且伴有NO产生受损，它们响应腺苷和5-羟色胺(其属于内皮依赖性NO介导的血管扩张剂)的血管扩张降低，但对于硝普钠和吡那地尔则不是这样，这两者分别通过贡献NO来激活环化GMP和打开平滑肌细胞ATP敏感性钾离子通道来松弛平滑肌细胞，不依赖于内皮细胞反应。

相对于非缺血血管，缺血小动脉对腺苷或5-羟色胺显示出明显减小的扩张反应(图13A和13B)。如图所示，缺血在剂量反应曲线中导致右向的位移，即缺血小动脉需要高一个数量级的药物来达到与非缺血小动脉相同的扩张程度。当分离的血管暴露于硝普盐或吡那地尔时并未发现该缺氧效应(图13C和13D)。因此，缺氧小动脉响应于经由NO供体提供的NO和平滑肌松弛药物表现出正常的扩张，但是对于5-羟色胺和腺苷却证明有经典的内皮功能障碍，内皮细胞产生NO的能力降低。

与分离于安慰剂处理的缺血心脏的小动脉的响应相比，TP508能显著地增加小动脉对腺苷和5-羟色胺的响应(图13A和13B)。实际上，分离于TP508处理的缺血心脏的小动脉对腺苷的响应似乎被恢复至非缺血对照小动脉中可见的水平(图13A)。

为证实该TP508对血管扩张的效应表现为这些小动脉中内皮功能障碍的逆转，我们确定了低氧以及TP508对这些小动脉产生NO的能力和eNOS表达水平的影响。如图13E所示，与从LAD分离的非缺血对照小动脉相比，从安慰剂处理的心脏的缺血LCX分离的小动脉的NO产生降低。但是，从TP508处理的心脏的缺血LCX分离的小动脉，具有的NO产生水平超过了非缺血对照的水平。对来自这些有限数量的小动脉的mRNA进行的PCR分析显示，与非缺血对照小动脉相比，从缺血LCX分离的小动脉中eNOS mRNA表达降低(图13F)。与其对NO产生的影响类似，TP508处理使缺血小动脉中eNOS mRNA表达恢复至与非缺血小动脉类似或更高的水平。这些结果提示，通过包括上调eNOS使得更多NO产生的过程，TP508逆转了这些小动脉中的内皮功能障碍。

本发明已经参考实施方式实例进行了具体说明和描述，本领域技术人员应当理解，在没有偏离所附权利要求书涵盖的本发明范围的情况下，可在形式和细节上进行多种改变。

Claims

1.一种在需要治疗的受试者的某一部位治疗内皮功能障碍的方法，其包括给受试者施用治疗有效量的非蛋白水解激活的凝血酶受体的激动剂，其中所述部位不是被血管成形术损伤的动脉、慢性皮肤溃疡、需要成骨诱导的部位或需要心血管再形成的部位。

2.权利要求1的方法，其中所述受试者患有一种或多种疾病或状况，该疾病或状况选自：高血压、充血性心力衰竭、冠状动脉疾病、中风、脑血管疾病、外周血管疾病、糖尿病、勃起功能障碍、动脉粥样硬化、哮喘、类风湿性关节炎、肺动脉高压、高同型半胱氨酸血症、镰状细胞病、先兆子痫、慢性肾衰竭、慢性肾功能障碍、脓毒症、多器官功能衰竭、炎性肠病和辐射损伤。

3.权利要求1的方法，其中所述受试者患有高血压。

4.权利要求1的方法，其中所述受试者患有动脉粥样硬化

5.权利要求1的方法，其中所述受试者患有外周血管疾病。

6.权利要求1的方法，其中所述激动剂是系统给药的。

7.权利要求1的方法，其中所述激动剂是长期给药的。

8.权利要求1的方法，其中该方法阻断与内皮功能障碍相关的精氨酸酶的上调。

9.权利要求1的方法，其中该方法促进内皮一氧化氮合酶的激活或上调。

10.权利要求1的方法，其中该方法增加一氧化氮的产生。

11.权利要求1的方法，其中所述激动剂是一种包含氨基酸序列Asp-Ala-R的凝血酶肽衍生物，其中R是丝氨酸酯酶保守序列。

12.权利要求11的方法，其中所述凝血酶肽衍生物包含大约12个至大约23个氨基酸。

13.权利要求12的方法，其中所述丝氨酸保守序列包含氨基酸序列Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(SEQ ID NO：14)，或其C-末端截短的具有至少六个氨基酸的片段，条件是丝氨酸酯酶保守序列中的零、一、二或三个氨基酸与SEQ ID NO：14的相应位置不同。

14.权利要求12的方法，其中所述丝氨酸酯酶保守序列包含氨基酸序列Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(SEQ ID NO：14)，或其C-末端截短的具有至少九个氨基酸的片段，条件是丝氨酸酯酶保守区中的零、一或二个氨基酸是SEQ ID NO：14中相应氨基酸的保守性置换。

15.权利要求12的方法，其中所述丝氨酸保守序列包含氨基酸序列Cys-X₁-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X₂-Val(SEQ ID NO：15)，或SEQ IDNO：15的C-末端截短的具有至少六个氨基酸的片段，其中X₁是Glu或Gln，X₂是Phe、Met、Leu、His或Val。

16.权利要求15的方法，其中所述凝血酶肽衍生物包含氨基酸序列Arg-Gly-Asp-Ala(SEQ ID NO：16)。

17.权利要求12的方法，其中所述凝血酶肽衍生物包含氨基酸序列Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(SEQ IDNO：17)或其C-末端截短的具有至少六个氨基酸的片段，其中该肽的零、一、二或三个氨基酸与SEQ ID NO：17相应位点不同。

18.权利要求17的方法，其中所述凝血酶肽衍生物包含C-末端酰胺，任选地包含酰化的N-端，其中所述C-末端酰胺由-C(O)NR_aR_b表示，其中R_a和R_b独立地是氢、C₁-C₁₀取代的或非取代的脂肪族基团，或R_a和R_b同与它们键合的氮一起形成一个C₁-C₁₀非芳香族杂环基团，并且所述的N-末端酰基基团由R_cC(O)-表示，其中R_c是氢、C₁-C₁₀取代的或非取代的脂肪族基团，或C₁-C₁₀取代的或非取代的芳香族基团。

19.权利要求17的方法，其中所述凝血酶肽衍生物包含一个未被取代的N-端和一个未被取代的C-端或由-C(O)NH₂表示的C-末端酰胺。

20.权利要求19的方法，其中所述凝血酶肽衍生物包含含有氨基酸序列Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(SEQID NO：17)的多肽，或其C-末端截短的具有至少六个氨基酸的片段，其中该肽中的零、一或二个氨基酸是SEQ ID NO：17中的相应氨基酸的保守性置换。

21.权利要求20的方法，其中所述凝血酶肽衍生物包含具有氨基酸序列Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X₁-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X₂-Val(SEQ IDNO：1)的多肽，其中X₁是Glu或Gln，X₂是Phe、Met、Leu、His或Val。

22.权利要求21的方法，其中X₁是Glu，X₂是Phe。

23.权利要求19的方法，其中所述凝血酶肽衍生物包含氨基酸序列Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(SEQ ID NO：6)，该凝血酶肽衍生物的具有至少十四个氨基酸的N-末端截短的片段，或该凝血酶肽衍生物的具有至少十八个氨基酸的C-末端截短的片段，条件是该凝血酶衍生物中位点1-9和14-23处的零、一、二或三个氨基酸与SEQ ID NO：6的相应位点处的氨基酸不同。

24.权利要求19的方法，其中所述凝血酶肽衍生物包含氨基酸序列Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(SEQ ID NO：6)，该凝血酶肽衍生物的至少具有十四个氨基酸的N-末端截短片段，或该凝血酶肽衍生物的具有至少十八个氨基酸的C-末端截短片段，条件是该凝血酶衍生物中位点1-9和14-23处的零、一或二个氨基酸是SEQ ID NO：6的相应位点处氨基酸的保守性置换。

25.权利要求24的方法，其中所述凝血酶肽衍生物包含氨基酸序列Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X₁-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X₂-Val(SEQ ID NO：2)，该凝血酶肽衍生物的至少具有十四个氨基酸的N-末端截短片段，或该凝血酶肽衍生物的具有至少十八个氨基酸的C-末端截短片段，其中X₁是Glu或Gln，X₂是Phe、Met、Leu、His或Val。

26.权利要求24的方法，其中所述凝血酶肽衍生物是多肽H-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-NH₂(SEQ ID NO：3)。

27.权利要求12的方法，其中所述凝血酶肽衍生物包含氨基酸序列Arg-Gly-Asp-Ala-Xaa-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(SEQ IDNO：39)，或其具有至少六个氨基酸的C-末端截短的片段，其中该肽中零、一、二或三个氨基酸与SEQ ID NO：39的相应位点不同，条件是Xaa是丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸或S-保护的半胱氨酸。

28.权利要求27的方法，其中所述凝血酶肽衍生物包含C-末端酰胺，任选地包含酰化的N-端，其中所述的C-末端酰胺由-C(O)NR_aR_b表示，其中R_a和R_b独立地是氢、C₁-C₁₀取代的或非取代的脂肪族基团，或R_a和R_b同与它们键合的氮一起形成一个C₁-C₁₀非芳香族杂环基团，并且所述的N-末端酰基基团由R_cC(O)-表示，其中R_c是氢、C₁-C₁₀取代的或非取代的脂肪族基团，或C₁-C₁₀取代的或非取代的芳香族基团。

29.权利要求27的方法，其中所述凝血酶肽衍生物包含非取代的N-端，和非取代的C-端或由-C(O)NH₂表示的C-末端酰胺。

30.权利要求29的方法，其中所述凝血酶肽衍生物包含氨基酸序列Arg-Gly-Asp-Ala-Xaa-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(SEQ IDNO：39)，或其C-末端截短的具有至少六个氨基酸的片段，条件是该多肽中的零、一或二个氨基酸是SEQ ID NO：39中相应氨基酸的保守性置换。

31.权利要求30的方法，其中Xaa是丙氨酸。

32.权利要求29的方法，其中所述凝血酶肽衍生物包含氨基酸序列Arg-Gly-Asp-Ala-Xaa-X₁-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X₂-Val(SEQ ID NO：4)，其中X₁是Glu或Gln，X₂是Phe、Met、Leu、His或Val。

33.权利要求29的方法，其中所述凝血酶肽衍生物包含氨基酸序列Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Xaa-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(SEQ ID NO：20)，或其包含SEQ ID NO：20的第10-18位氨基酸的片段，条件是该凝血酶肽衍生物中的零、一或二个氨基酸与SEQ ID NO：20中相应位置的氨基酸不同。

34.权利要求29的方法，其中所述凝血酶肽衍生物包含氨基酸序列Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Xaa-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(SEQ ID NO：20)，或其包含SEQ ID NO：20的第10-18位氨基酸的片段，条件是该凝血酶肽衍生物中的零、一或二个氨基酸是SEQ ID NO：20相应位点的氨基酸的保守性置换。

35.权利要求34的方法，其中所述凝血酶肽衍生物包含氨基酸序列Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Xaa-X₁-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X₂-Val(SEQ ID NO：5)或其包含SEQ ID NO：5的第10-18位氨基酸的片段，其中X₁是Glu或Gln，X₂是Phe、Met、Leu、His或Val。

36.权利要求35的方法，其中Xaa是丙氨酸。

37.权利要求29的方法，其中所述凝血酶肽衍生物包含氨基酸序列Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Xaa-X₁-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X₂-Val(SEQ ID NO：5)，其中X₁是Glu或Gln，X₂是Phe、Met、Leu、His或Val。

38.权利要求37的方法，其中Xaa是丙氨酸。

39.权利要求37的方法，其中X₁是Glu，X₂是Phe。

40.权利要求29的方法，其中所述凝血酶肽衍生物是多肽H-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Ala-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-NH₂(SEQ ID NO：22)。

41.权利要求1的方法，其中所述激动剂是包含两个凝血酶肽衍生物的肽二聚体，该凝血酶肽衍生物独立地包含氨基酸序列SEQ ID NO：17(Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val)或其具有至少六个氨基酸的C-末端截短的片段，条件是该多肽中的零、一、二或三个氨基酸与SEQ ID NO：17的相应位点不同；所述凝血酶肽衍生物任选地包含C-末端酰胺；并且所述凝血酶肽衍生物任选地包含酰化的N-端。

42.权利要求41的方法，其中所述二聚体基本上没有单体。

43.权利要求42的方法，其中所述凝血酶肽衍生物是相同的。

44.权利要求43的方法，其中所述凝血酶肽衍生物是通过二硫键共价连接的。

45.权利要求44的方法，其中所述凝血酶肽衍生物由大约12个至大约23个氨基酸组成。

46.权利要求45的方法，其中所述凝血酶肽衍生物包含C-末端酰胺，任选地包含酰化的N-端，其中所述C-末端酰胺可由-C(O)NR_aR_b表示，其中R_a和R_b独立地是氢、C₁-C₁₀取代的或非取代的脂肪族基团，或R_a和R_b同与它们键合的氮一起形成一个C₁-C₁₀非芳香族杂环基团，并且所述的N-末端酰基基团由R_cC(O)-表示，其中R_c是氢，C₁-C₁₀取代的或非取代的脂肪族基团，或C₁-C₁₀取代的或非取代的芳香族基团。

47.权利要求45的方法，其中所述凝血酶肽衍生物各自包含未被取代的N-端；以及未被取代的C-端或由-C(O)NH₂表示的C-末端酰胺。

48.权利要求47的方法，其中所述凝血酶肽衍生物包含氨基酸序列Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(SEQ IDNO：17)或其具有至少六个氨基酸的C-末端截短的片段，条件是这些凝血酶肽衍生物中的零、一或二个氨基酸是SEQ ID NO：17中相应氨基酸的保守性置换。

49.权利要求47的方法，其中所述凝血酶肽衍生物包含氨基酸序列Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X₁-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X₂-Val(SEQ ID NO：1)，其中X₁是Glu或Gln，X₂是Phe、Met、Leu、His或Val。

50.权利要求47的方法，其中所述凝血酶肽衍生物包含氨基酸序列Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(SEQ ID NO：6)，或其包含SEQ ID NO：6的第10-18位氨基酸的片段，条件是该凝血酶肽衍生物中的零、一、二或三个氨基酸与SEQ ID NO：6中相应位置的氨基酸不同。

51.权利要求47的方法，其中所述凝血酶肽衍生物包含氨基酸序列Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(SEQ ID NO：6)，或其包含SEQ ID NO：6的第10-18位氨基酸的片段，条件是该凝血酶肽衍生物中的零、一或二个氨基酸是SEQ ID NO：6相应位点氨基酸的保守性置换。

52.权利要求47的方法，其中所述凝血酶肽衍生物包含氨基酸序列Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X₁-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X₂-Val(SEQ ID NO：2)，其中X₁是Glu或Gln，X₂是Phe、Met、Leu、His或Val，或其包含SEQ ID NO：2的第10-18位氨基酸的片段。

53.权利要求47的方法，其中所述凝血酶肽衍生物包含氨基酸序列Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X₁-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X₂-Val(SEQ ID NO：2)，其中X₁是Glu或Gln，X₂是Phe、Met、Leu、His或Val。

54.权利要求53的方法，其中X₁是Glu，X₂是Phe。

55.权利要求46的方法，其中所述凝血酶肽衍生物包含氨基酸序列H-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X₁-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X₂-Val-NH₂(SEQ ID NO：40)，其中X₁是Glu或Gln，X₂是Phe、Met、Leu、His或Val。

56.权利要求55的方法，其中X₁是Glu，X₂是Phe。

57.权利要求1的方法，其中所述激动剂是包含两个凝血酶衍生物的肽二聚体，每个凝血酶衍生物具有氨基酸序列Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(SEQ ID NO：6)，其中这些凝血酶肽衍生物通过二硫键共价连接在一起。

58.权利要求1的方法，其中所述激动剂是由下述结构式表示的肽二聚体：

59.权利要求1的方法，其中所述激动剂是一种可与互补肽结合的抗体或其抗原结合片段，其中所述互补肽由编码凝血酶一部分的核苷酸序列的互补序列编码。

60.权利要求59的方法，其中所述凝血酶的部分是哺乳动物凝血酶的一部分。

61.权利要求59的方法，其中所述凝血酶的部分是人凝血酶的一部分。

62.权利要求59的方法，其中所述凝血酶的部分是凝血酶受体结合域或其一部分。

63.权利要求62的方法，其中所述凝血酶受体结合域或其部分是包含氨基酸序列Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(SEQ ID NO：6)的凝血酶受体结合域。

64.权利要求62的方法，其中所述凝血酶受体结合域或其部分是凝血酶受体结合域的一部分。

65.权利要求64的方法，其中所述的凝血酶受体结合域的部分包含氨基酸序列Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly(SEQ ID NO：7)。

66.权利要求59的方法，其中所述互补肽由反义RNA链的5’-3’序列编码。

67.权利要求59的方法，其中所述互补肽由反义RNA链的3’-5’序列编码。

68.权利要求59的方法，其中所述互补肽包含氨基酸序列Lys-Gly-Ser-Pro-Thr-Val-Thr-Phe-Thr-Gly-Ile-Pro-Cys-Phe-Pro-Phe-Ile-Arg-Leu-Val-Thr-Ser(SEQ ID NO：30)。

69.权利要求59的方法，其中所述互补肽包含氨基酸序列Thr-Phe-Thr-Gly-Ile-Pro-Ser-Phe-Pro-Phe(SEQ ID NO：32)。

70.权利要求59的方法，其中所述互补肽包含氨基酸序列Arg-Pro-Met-Phe-Gly-Leu-Leu-Pro-Phe-Ala-Pro-Leu-Arg-Thr-Leu-Pro-Leu-Ser-Pro-Pro-Gly-Lys-Gln(SEQ ID NO：33)。

71.权利要求59的方法，其中所述互补肽包含氨基酸序列Leu-Pro-Phe-Ala-Pro-Leu-Arg-Thr-Leu-Pro(SEQ ID NO：34)。

72.权利要求59的方法，其中所述抗体或抗原结合片段是一种抗体。

73.权利要求59的方法，其中所述抗体是一种多克隆抗体。

74.权利要求59的方法，其中所述抗体或抗原结合片段是一种单克隆抗体或其抗原结合片段。

75.权利要求59的方法，其中所述抗体或抗原结合片段选自人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和前述任一种的抗原结合片段。

76.权利要求59的方法，其中所述抗体或抗原结合片段是一种抗原结合片段。

77.权利要求76的方法，其中所述抗原结合片段选自Fab片段、Fab’片段、F(ab’)₂片段和Fv片段。

78.权利要求1的方法，其中该方法进一步包括给受试者施用治疗有效量的血管生长因子。

79.权利要求78的方法，其中所述血管生长因子是人VEGF-A。

80.权利要求78的方法，其中所述激动剂是由SEQ ID NO：3组成的多肽。

81.权利要求80的方法，其中所述血管生长因子是人VEGF-A。