MXPA01006741A - Metodos para reducir efectos secundarios adversos asociados con transplante celular. - Google Patents

Abstract

Los metodos de la presente invencion se basan en el descubrimiento de que los efectos secundarios adversos (tales como hemorragia) pueden ocurrir en la infusion de celulas que expresan factor de tejido. De acuerdo con lo anterior, los metodos de la invencion se proponen para reducir la actividad biologica del factor de tejido (TF) en un paciente, y pueden llevarse a cabo al, por ejemplo, inducir pocas celulas (o infundir el mismo numero de BMSCs durante un periodo de tiempo mas largo); reducir la expresion o actividad de TF (dentro de las celulas infundidas especificamente) (por ejemplo, al contactar las celulas con un antagonista de TF in vitro) o dentro del paciente generalmente (por ejemplo, al administrar un antagonista de TF al paciente); dificultar la interaccion del TF con el factor Vll(a); inhibir la actividad del complejo de TF-factor Vll(a) una vez que se haya formado; o inhibir la cascada de coagulacion en cualquier punto corriente debajo desde la formacion del complejo (incluyendo la inhibicion de la activacion de trombocitos).

Description

MÉTODOS PARA REDUCIR EFECTOS SECUNDARIOS ADVERSOS ASOCIADOS CON TRANSPLANTE CELULAR Campo de la Invención La invención se refiere al transplante de células tales como células de la médula ósea.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los esfuerzos para desarrollar terapias seguras y eficaces al transplantar varios tipos de células biológicas han estado sobresaliendo desde los 60's. Por ejemplo, los científicos comenzaron a considerar el transplante de órganos, transplante de médula ósea, y complementación de enzimas para tratar desordenes genéticos raros tan pronto se descubren los defectos enzimáticos en la enfermedad de Gaucher y Niemman-Pick (ver, por ejemplo, Brady, New Engl. J. Medí. 275:312, 1966). En la actualidad, ciertos órganos (por ejemplo, el riñon) se transplanta con gran éxito y el transplante de médula ósea se realiza con elevada frecuencia, particularmente en el contexto de tratamiento de cáncer. Típicamente, los pacientes con cáncer experimentar transplante de médula ósea derivado de sí mismo, las células de la médula ósea se remueven del paciente, mantienen en un cultivo ex vivo mientras que el paciente se trata con radiación o quimioterapia, y después se transplantan de nuevo al paciente en donde restauran la médula ósea. Para efectuar terapias genéticas, varios tipos de células incluyendo fas células estromales de médula ósea (BMSCs) pueden modificarse genéticamente y transplantarse en un paciente para tratar una amplia variedad de desordenes (ver, por ejemplo, Patente de E.U. No. 5,849,287).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los métodos de la presente invención se basan en el descubrimiento de que ciertos efectos secundarios adversos (tales como coagulación y/o hemorragia) causados por la infusión de células transplantadas, tales como BMSCs, se deben a la expresión del factor de tejido (TF) por las células infundidas. BMSCs, que se describen más adelante, también se describen como células germinales mesenquimatosas (ver, por ejemplo., Prockop, Science, 276:71 . 1997). De acuerdo con lo anterior, los métodos de la invención se proponen reducir la actividad biológica de TF en un paciente, y pueden llevarse a cabo en una variedad de maneras. Por ejemplo, se puede: infundir pocas células, por ejemplo, BMSCs (o infundir el mismo número de células, por ejemplo, al contactar las células con un antagonista de TF in vitro o dentro del paciente, por ejemplo, al administrar un antagonista de TF al paciente, impedir la interacción de TF con el factor Vll(a); inhibir la actividad del complejo de TF-factor Vll(a) una vez que se ha formado; o inhibir la cascada de coagulación en cualquier puntos corriente abajo desde la formación del complejo (incluyendo la inhibición de la activación de trombocito). Como se implica por lo anterior, el término "antagonista" comprende compuestos (es decir, moléculas biológicas, medicamentos, u otros agentes terapéuticos) que interactúan con (e inhiben) TF directa o indirectamente (al interactuar con e inhibir moléculas que específicamente unen TF (tal como factor Vil) o que yacen aguas abajo desde la formación del complejo de TF-factor Vil. Estos medios para reducir la actividad biológica o nivel de TF se describen en detalle abajo. 5 Los métodos de la invención pueden practicarse cada vez que los pacientes se tratan con terapias de gen o celulares que emplean - - ' células transplantadas, por ejemplo, células de médula ósea que expresan TF. Por ejemplo, pueden practicarse con terapias de gen o celulares que emplean células de médula ósea tales como BMSCs. 10 Los métodos de la invención emplean antagonistas de TF, los antagonistas adecuados incluyen moléculas pequeñas (es decir, moléculas con un peso molecular por debajo de aproximadamente 500), moléculas grandes (es decir, moléculas con peso molecular arriba de aproximadamente 500), anticuerpos que se unen específicamente a y "neutralizan" TF, y moléculas de ácido nucleico que interfieren con la transcripción o translación de TF (por ejemplo, moléculas de ácido nucleico antisensibles y ribozimas). Los antagonistas de TF también incluyen compuestos que interfieren con la habilidad de TF para activar la coagulación sanguínea y/o coagulación. Preferentemente, un anticuerpo de neutralización utilizado en los métodos presentes (o cualquiera de los otros tipos de antagonistas de TF descritos en la presente) neutralizará al menos 50%, más preferentemente al menos 70% y más preferentemente al menos 80% (por ejemplo, 85%, 90% o 95%) de la actividad de TF en una muestra (por ejemplo, una muestra de BMSCs) que contiene TF. Los anticuerpos y otros tipos de antagonistas se tratan en detalle abajo.

En una modalidad, los nuevos métodos inhiben efectos vasculares adversos causados por la introducción de células que expresan TF en un paciente al reducir la carga total de TF biológicamente activo con las células a menos de aproximadamente 25,000 ng/kg del peso del paciente (por ejemplo, menos de aproximadamente 10,000, menos de aproximadamente 5,000 o menos de aproximadamente 2,000 ng/kg del peso del paciente). Los efectos adversos que pueden inhibirse incluyen hemorragia, trombosis, coagulación intravascular, agregación de trombocito, un conteo de trombocitos reducido, niveles reducido de los factores de coagulación V, VIII y IX, un nivel incrementado de trombina-antitrombina (TAT), un nivel incrementado de monómeros de fibrina, y un nivel incrementado de D-dímeros. Preferentemente, estos efectos adversos se evitan completamente o inhiben suficientemente para prevenir los síntomas adversos. De esta manera, los métodos nuevos descritos en la presente pueden conferir un beneficio al paciente aún si solamente atenúan los efectos adversos. En algunos casos, las células que expresan TF se cultivarán antes de la implantación en el paciente. Las células pueden cultivarse bajo las condiciones descritas en la presente o bajo condiciones conocidas y utilizadas en la materia. Las células que expresan TF pueden introducirse en el paciente (por ejemplo, mediante infusión o inyección en un vaso sanguíneo tal como un arteria o una vena, o por inyección en un músculo, la dermis, o la cavidad peritoneal) de manera que residen en una ubicación deseada. Las cavidades de la médula ósea y espacios intrarticulares son ubicaciones útiles. Las células que expresan TF pueden introducirse en una solución fisiológicamente compatible, o pueden implantarse en un aglomerante (tal como un gel, colágeno, o aglomerante que forma hueso, o un aglomerante compuesto de cerámica (por ejemplo, una cerámica de fosfato de calcio), vidrio o hidroxiapatita) antes de que se introduzcan al paciente. Además, las células pueden ser células que expresan TF de tipo silvestre o células que expresan TF genéticamente modificadas. Por ejemplo, las células pueden contener una construcción de ADN que codifica un factor de coagulación tal como factor VIII o factor IX o cualquiera de una amplia variedad de otros polipéptidos biológicamente activos conocidos por aquellos de experiencia en la materia. Ver, por ejemplo, Patente de E.U. No. 5,849,287. Los pacientes que tienen numerosos tipos de enfermedades o desordenes pueden beneficiase de los métodos descritos en la presente. Estos métodos pueden adecuarse particularmente bien para tratar pacientes con hemofilia, cáncer (tal como cáncer de pecho), o osteogénesis imperfecta. Como se describe más abajo, los efectos secundarios vasculares adversos pueden inhibirse al contactar las células que expresan TF (in vivo o ex vivo) con un oligonucleótido que inhibe la transcripción de un gen de facto de tejido, la estabilidad del ARN de factor de tejido, o la habilidad del ARN de factor de tejido para trasladarse en la proteína. El oligonucleótido puede ser una molécula de ácido deoxiribonucléico o ácido ribonucleico. Alternativamente, las células que expresan TF pueden contactarse con una ribozima que divide el ARN de factor de tejido. Cuando el antagonista de TF es un anticuerpo, el anticuerpo puede ser uno que inhibe: la actividad de factor de tejido; un polipéptido que se unen específicamente al factor de tejido; o un polipéptido que es activo en la cascada bioquímica que se inicia por la formación de un complejo entre el factor de tejido y el factor Vil. Más específicamente, el anticuerpo puede ser TF1 -E2, TF1 -F7, HTF1 -7B8, TF8-5G9, TF8-1 1 D12, TF9-9C3, TF8-5G9, AP-1 , 5G9, PW-4, 231 -7, 12D10, hVII-B101 /B1 , hVII-DC2/D4 o hVII-DC6/3D8 (cada uno de los cuales se describe más abajo). Los anticuerpos útiles en los métodos de la presente invención pueden ser anticuerpos monoclonales, policlonales o realizados que se unen específicamente a TF (como se describe de manera más completa abajo). Un anticuerpo que "se une específicamente" a un antígeno particular, por ejemplo, a TF o a un polipéptido que interactúa con (por ejemplo, une a) TF en el curso de coagulación sanguínea, no reconocerá substancialmente o se unirá a otras moléculas en una muestra (es decir, una muestra de material biológico) que contiene TF. Dado que el objeto de la presente invención es alterar la expresión o actividad de TF in vivo (por ejemplo, en BMSCs infundido en el curso de la terapia de gen o célula), una composición farmacéutica que contiene, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico aislada que es antisensible a TF (es decir, que tiene una secuencia que es la inversa y complemento de una porción del filamento de codificación de un gen TF), o un anticuerpo, molécula pequeña, u otro compuesto que se une específicamente a TF, también es una característica de la invención. Un "paciente" puede ser cualquier animal que incluye mamíferos tales como humanos y mamíferos domesticados, por ejemplo, perros, gatos, caballos, vacas, ovejas y puercos. Al menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por alguien de experiencia ordinaria en la materia a la cual esta invención pertenece. Aunque los métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente pueden utilizarse en la práctica o prueba de la presente invención, los métodos preferidos y materiales se describen abajo. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes, y otras referencias mencionadas en la presente se incorporan por referencia en su totalidad. Los métodos y materiales preferidos se describen abajo en términos que pretenden ilustrar, no limitar, la invención. Alguien de experiencia ordinaria en la materia reconocerá los métodos y materiales que son similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente, y que pueden utilizarse en la práctica o prueba de la presente invención. Otras características y ventajas de la invención serán aparentes a partir de la descripción detallada, y de las reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una gráfica que representa la correlación entre el declive en el conteo de trombocitos (%) y la cantidad de TF (mg) en BMSCs autólogos infundidos. La cantidad de TF se normaliza para considerar el peso del animal (los números junto con el eje X representan el peso corporal de TF (mg)/kg). La Figura 2 es una gráfica de líneas que representan los conteos de trombocitos (x103/µl) en diez perros (cada uno representado por un símbolo distinto) antes y en varios tiempos después de la infusión de BMSCs autólogos. El número de células infundidas en cada animal se muestra en el recuadro debajo de la gráfica. La Figura 3 es una gráfica de líneas que representa la concentración de trombina-antitrombina (TAT; ng/ml) en el plasma de siete perros (6 animales experimentales y uno de control (•# 8)), después de la infusión de BMSCs autólogos. Cada uno de los siete símbolos representa los datos obtenidos de un animal, y el número de células infundidas en cada animal se muestra en el recuadro abajo del gráfica. La Figura 4 es una representación de la secuencia de cADN de secuencia de aminoácido predicha de TF de canino (SEQ ID NOs: 1 y 2, respectivamente). Las Figuras 5A a 5C son una representación de la secuencia de cADN y secuencia de aminoácido predicha de TF de humano (SEQ ID NOs: 3 y 4, respectivamente). La Figura 6 es una alineación de la secuencia de proteína de TF de canino (SEQ ID NO:2) y la secuencia de proteína de TF de humano (SEQ ID NO:4).

DESCRIPCIÓN DETALLADA El Factor de Tejido (TF; también conocido como tromboplastina) es una glicoproteína unida a la membrana que se une con el factor de circulación libre Vil y factor Vlla para formar un complejo. La formación de este compiejo se cree que activa una cascada de reacciones bioquímicas que da como resultado coagulación sanguínea o coagulación. Más específicamente, la formación de un complejo que incluye TF y factor Vlla activa los factores X y IX mediante proteólisis. Esto induce la cascada de coagulación y conduce a la generación de trombina. La trombina divide el fibrinógeno a fibrina, que conduce a la formación de un coágulo. La trombina también se convierte, y activa así, el factor XI a factor Xla, factor VIII a factor Villa y factor V a factor Va. Estos factores, cuando se activan, aumentan la cascada de coagulación. Además, la trombina activa los trombocitos, que inician una serie de eventos que condicen a la generación de trombina a gran escala. La regulación de la trombina es, a su vez, influenciada por las actividades de antitrombina lll (ATIII), inhibidor de trayectoria de TF (TFPI), trombomodulina, proteína C activada (APC), y proteína S. De esta manera, los animales normalmente saludables, tales como humanos y mamíferos domesticados, tienen niveles muy bajos de TF en sus corrientes sanguíneas. Numerosos tipos de células que pueden transplantarse expresan TF. Además de las células de la médula ósea tales como BMSCs, fibroblastos, mioblastos, células mesoteliales, querationocitos, células neuronales, condorcitos, osteoblastos, adipositos, músculo liso vascular y células endoteliales vasculares, y ciertas células germinales, así como también células de tumor autólogas que se remueven de un paciente, manipulan y después se reinfunden, todos expresan TF a algún grado. Los métodos nuevos pueden utilizarse en conjunto con el transplante de cualquier célula que expresa TF el TF en el cuerpo del paciente, por ejemplo, en la corriente sanguínea. En general, las células que expresan TF pueden tratarse antes de o después de la implantación, el paciente puede tratarse con un antagonista de TF, por ejemplo, mediante infusión de larga duración o de liberación sostenida, o ambos tratamientos pueden utilizarse en conjunto, es decir, las células y el paciente se tratan utilizando las mismas o diferentes metodologías. A. Reducción de la Actividad Biológica del Factor de Tejido al Alterar la Infusión de Células Una de las maneras más directas para practicar la presente invención es limitar el número de células que expresan TF, tales como BMSCs, infundidas en (o de otra manera administradas a) un paciente. El número total de células puede limitarse o, alternativamente, el número de células administradas en un momento dado pueden limitarse. Un método para determinar cuantas células pueden transplantarse sin riesgo substancial de un efecto secundario adversos se basa en la observación que, después de la reinfusión de BMSCs en perros, sus conteos de trombocitos puede descender por debajo del nivel normal. Sin embargo, los análisis descritos abajo (ver, Ejemplo 1 ) revelaron una correlación entre el por ciento de declive en el conteo de trombocitos y el nivel de TF dentro de los BMSCs autólogos. Como se muestra en la Figura 1 , mientras mayor sea el nivel de TF en células infundidas (expresado como TF mg/kg de peso corporal), mayor será el descenso en el conteo de trombocitos (expresado como descenso porcentual). Este descenso en el conteo de trombocitos se causa cuando los trombocitos se incluyen en la coagulación sanguínea. De esta manera, una vez que un número suficiente de trombocitos se encuentran en efecto removidos de la circulación, puede ocurrir la hemorragia. La medición representada a lo largo del eje X (niveles de TF en células infundidas/kg de peso corporal) se obtuvo al llevar a cabo un análisis de actividad de TF en una alícuota de las células infundidas (como se describe abajo en el Ejemplo 4), extrapolando de la actividad dentro de esa alícuota a la cantidad de TF dentro de la población celular total infundida, y dividiendo por el peso del animal. Se examinaron diez animales, y cada uno se representa por uno de ios puntos de datos mostrados en la Figura 1 (y marcados con un identificador, por ejemplo, #6, #13, #20A). La medición representada a lo largo del eje Y (descenso en conteo de trombocitos) se obtuvo al calcular el descenso porcentual una hora después de la infusión (excepto para el perro #20A, que se probó 20 minutos después de la infusión). Un descenso significativo en el conteo de trombocitos se observó cuando las células infundidas poseyeron 500 mg de actividad de TF por kg de peso corporal (#13). Los descensos moderados en los conteos de trombocitos se observaron cuando las células infundidas poseyeron 1 ,000-5,000 ng de actividad de TF por kg de peso corporal (#18, #17 y #20). Los descenso más elevados en el conteo de trombocitos se observaron cuando las células infundidas poseyeron 5,000- 25,000 ng de actividad de TF por kg de peso corporal (#22, #25, #24, #8 y #6). Un descenso catastrófico en el conteo de trombocitos se observó cuando las células infundidas contuvieron más de 25,000 ng de actividad de TF por kg de peso corporal. De acuerdo con lo anterior, alguien de experiencia en la materia podría evitar los efectos secundarios adversos asociados con el transplante de BMSCs al limitar el número de células infundidas (o de otra manera administradas) a un número que muestra menos de 5,000 ng de actividad de TF por kg de peso corporal (por ejemplo, 4000, 3000, 2000, 1500, 1250 o 1000 ng de actividad de TF por kg de peso corporal). Más preferentemente, uno podría limitar el número de células infundidas a un número que muestra menos de 1 ,000 ng de actividad de TF por kg de peso corporal (por ejemplo, 800, 700, 500, 400 o 200 ng de actividad de TF por kg de peso corporal). La cantidad de factor de tejido en un lisato de célula se determinó al compara el tiempo de coagulación inducido en el plasma de canino por un lisato de célula con el tiempo de coagulación inducida en el plasma de canino por una cantidad conocida (en nanogramos por mililitro) de TF estándar (TF humano lipidado recombinante: American Diagnostica, Inc., Greenwich, CT). B. Reducción de la Actividad Biológica del Factor de Tejido al Reducir la Expresión Génica Los métodos de la invención pueden llevarse a cabo al administrar oligonucleótidos de TF antisensibles o ribozimas que inhiben la transcripción del gen de TF (e inhiben así la actividad biológica de TF). Preferentemente, las células que expresan TF se contactarán con estos oligonucleótidos o ribozimas in vitro o ex vivo, antes de que se transplanten en un paciente. Alternativamente, los oligonucleótidos o ribozimas pueden administrarse a un paciente de manera que la expresión de TF se reduce en todas las células dentro del paciente que expresan TF, incluyendo las células de médula ósea transplantadas. Preferentemente, un oligonucleótido o ribozima utilizando en los presente métodos inhibirán al menos 50% (por ejemplo, 70%, 80%, 85%, 90% o 95%) de la expresión de TF en una muestra (por ejemplo, una muestra de BMSCS) que contiene TF. Más específicamente, uno puede utilizar un vector de expresión que codifica cADN antisensible de TF (Zhang et al., J. Clin. Invest. 97:2213, 1996; Bohrer et al., J. Clin. Invest. 100:972, 1997) o el cADN antisensible que codifica el motivo de tripéptido raro de Trp-Lys-Ser (WKS) (Stephens y Rivers, Thromb. Res. 85: 387, 1997). Alternativamente, uno puede utilizar un vector de expresión o un oligonucleótido que codifica una ribozima que dirige ARN de TF. Moléculas de Ácido Nucleico Antisensibles Los regímenes de tratamiento en base al planteamiento "antisensible" incluye el diseño de oligonucleótidos (ya sea ADN o ARN) que son complementarios a una porción de un mARN seleccionado. Estos oligonucleótidos se unen a transcripciones de mARN complementarias y evitan su translación. La complementación absoluta, aunque preferida, no se requiere. Una secuencia "complementaria" a una porción de una molécula de ARN, como se refiere en la presente, es una secuencia que tiene suficiente complementación para hibridizarse con el ARN, formando un dúplex estable, en el caso de ácidos nucleicos antisensibles de doble filamento, puede probarse un solo filamento del ADN dúplex o puede analizarse la formación de triples. La habilidad para hibridizarse dependerá tanto del grado de complementación como de la longitud del ácido nucleico antisensible. Generalmente, mientras mayor sea el ácido nucleico de hibridización, más desigualdades base con un ARN pueden contener y aún formar un dúplex estable (o triple, como sea el caso). Alguien de experiencia ordinaria en la materia puede acertar un grado tolerable de desigualdad mediante el uso de procedimientos estándar para determinar el punto de fusión del complejo hibridizado. Los oligonucleótidos que son complementarios al extremo 5' del mensaje, por ejemplo, la secuencia sin trasladar 5' hacia arriba e incluyendo el codón de inicio AUG, debería trabajar de manera más eficiente en la inhibición de al translación. Sin embargo, las secuencias complementarias a las secuencias sin trasladar 3' de mARNs recientemente han mostrado ser eficaces para inhibir la translación de mARNs también (Wagner, Nature 372:333. 1984). De esta manera, los oligonucleótidos complementarios a ya sea las regiones sin codificación, no trasladas 5' o 3' de un gen de TF, por ejemplo, un gen humano como se muestra en la Figura 5, podrían utilizarse en un planteamiento antisensible para inhibir la translación de mARN de TF endógeno. Los oligonucleótidos complementarios a la región no trasladada 5' del mARN debería incluir el complemento del codón de inicio AUG.

Los oligonucleótidos complementarios a regiones de codificación de mARN son inhibidores menos eficientes de la translación pero podrían utilizarse de acuerdo con la invención. Si se designa para hibidrizarse a la región de codificación, 5' o 3' de mARN de TF, los ácidos nucleicos antisensibles deberían ser al menos seis nucleótidos en longitud, y son preferentemente oligonucleótidos que varían de 6 a aproximadamente 50 nucleótidos en longitud (por ejemplo, 8, 20, 30 o 40 nucleótidos en longitud). En aspectos específicos, los oligonucleótidos contienen al menos 10 nucleótidos, al menos 17 nucleótidos, al menos 25 nucleótidos, o al menos 50 nucleótidos. Por ejemplo, los siguientes oligonucleótidos antisensibles pueden utilizarse cuando se tratan perros. 5'-GGGTCTTCATGGCCC-3' (SEQ ID NO:5), 5'-TACGACTACATCTG-3' (SEQ ID NO:6). Los siguientes oligonucleótidos antisensibles pueden utilizarse cuando se tratan humanos. 5'-GGTCTCCATGTCTA-3' (SEQ ID NO: 7), 5'- AAGACCCAGCCGAGCAGGA-3' (SEQ ID NO: 8), y 5'-ACAGTATTTGTAGT-3' (SEQ ID NO:9). Sin considerar la elección de la secuencia objetivo de mARN, como con otras estrategias terapéuticas dirigidas a TF, se prefiere que los estudios in vitro se realicen primero para valorar la habilidad de un oligonucleótido antisensible para inhibir la expresión génica. Si se desea, la valoración puede ser cuantitativa. Se prefiere que estos estudios utilicen controles que distinguen entre inhibición de gen antisensible y cualquier efecto biológico en que un oligonucleótido puede incurrir. Preferentemente, el oligonucleótido de control será aproximadamente de la misma longitud que el oligonucleótido de prueba, y la secuencia de nucleótidos del oligonucleótido de control diferirá de aquel de la secuencia antisensible de prueba no más de lo necesario para prevenir la hibridización específica entre el oligonucleótido de control y la secuencia de ARN objetivo. Preferentemente, estos estudios también compararán los niveles del ARN objetivo o proteína con aquellos de un ARN de control interno o proteína. Los oligonucleótidos pueden contener ADN o ARN, o pueden contener mezclas quiméricas, derivados o versiones modificadas de las mismas que son ya sea de doble filamento o un solo filamento. El oligonucleótido puede modificarse en la parte base, parte de azúcar, o estructura de fosfato, por ejemplo, para mejorar la estabilidad de la molécula, la hibridización, etc. Las partes de azúcar modificadas pueden seleccionarse del grupo que incluye, pero no se limita a, arabinosa, 2-fluoroarabinosa, xilulosa, y hexosa. Una estructura de fosfato modificada puede seleccionarse del grupo que consiste de un fosforotioato, un fosforoditioato, un fosforamidotioato, un fosforamidato, o fosfordiamidato, un metilfosfonato, un fosfotriéster de alquilo, y un formacetal, o un análogo de cualquiera de estas estructuras. Los oligonucleótidos pueden incluir otros grupos anexos tales como péptidos (por ejemplo, para interrumpir las propiedades de transporte de la molécula en células), o agentes que facilitan el transporte a través de la membrana celular (como se describe por ejemplo en Letsinger er al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:6553, 1989; Lemaitre er al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:648, 1987; Publicación de PCT No. WO 88/09810 o la barrera de sangre-cerebro (ver, por ejemplo, Publicación de PCT No. WO 98/10134), o los agentes de división activados por hibridización (ver, por ejemplo, Krol et al., BioTechniques 6: 958, 1988), o agentes de intercalación (ver, por ejemplo, Zon, Pharm. Res. 5^539, 1988). Para este fin, el oligonucleótido puede conjugarse con otra molécula, por ejemplo, un péptido, un agente de degradación activado por hibridización, un agente de transporte, o un agente de división activado por hibridización. Los oligonucleótidos antisensibles de la invención pueden sintetizarse mediante métodos estándar conocidos en la materia, por ejemplo, mediante el uso de un sintetizador de ADN automático (tal como se encuentra comercialmente disponibles de Biosearch, Applied Biosystems, etc.). En otra aplicación, las moléculas antisensibles pueden suministrarse in vivo a las células que expresan TF transplantadas después de que se han infundido en un paciente. Un número de métodos se ha desarrollado para suministrar ADN antisensible o ARN a las células; por ejemplo, las moléculas antisensibles pueden inyectarse directamente en el sitio de tejido. De acuerdo con lo anterior, en el presente caso, si las células de médula ósea se transplantan en una cavidad de médula ósea, las moléculas antisensibles podrían inyectarse en ese sitio también. Si las células de médula ósea se transplantan en un espacio intraarticular, las moléculas antisensibles se aplicarían a ese espacio, y así sucesivamente. Alternativamente, las moléculas antisensibles modificadas, que se designan a células objetivo que expresan TF (por ejemplo, moléculas antisensibles enlazadas a péptidos o anticuerpos que se unen específicamente a receptores o antígenos expresados en la superficie de la célula objetivo) pueden administrarse sistémicamente. Alternativamente, o en adición para tratar células que expresan TF después de que se han infundido en un paciente, las células que expresan TF pueden tratarse in vitro antes del transplante. De esta manera el paciente recibe inicialmente las células que no expresan más TF. Este método es efectivo y más simple que administra los oligonucleótidos al paciente. Debido a que con frecuencia es difícil lograr concentraciones intracelulares de moléculas antisensibies que son suficientes para suprimir la translación de mARNs endógenos, un planteamiento útil es utilizar una construcción de ADN recombinante en la cual el oligonucleótido antisensible se coloca bajo el control de un promotor fuerte pol lll o pol II. El uso de tal construcción para transfectar células objetivo (es decir, células que expresan TF, ya sea antes o después del transplante) dará como resultado la transcripción de suficientes cantidades de ARNs de un solo filamento para formar pares base complentarios con transcripciones de TF endógenas y evitar así la translación de mARN de TF. Por ejemplo, un vector puede introducirse en tal manera que se toma por una célula y después dirige la transcripción de un ARN antisensible. Tal vector puede permanecer episomal o integrarse cromosómicamente, siempre que pueda transcribirse para producir el ARN antisensible deseado. Los vectores que codifican una secuencia antisensible de TF pueden construirse por métodos de tecnología de ADN recombinante que son de práctica estándar en la materia. Los vectores adecuados incluyen vectores de plásmido, vectores virales, u otros tipos de vectores conocidos o recientemente descubiertos en la materia. El criterio para utilizarse es solamente que el vector sea capaz de replicar y expresar la molécula antisensible de TF en células mamíferas. La expresión de la secuencia que codifica el ARN antisensible puede dirigirse por un promotor conocido en la materia para actuar en células de mamífero, y preferentemente de humanos. Tales promotores puede ser inducibles o activarse constitutivamente e incluir, pero no limitarse a: la región promotora anterior SV40 (Bernoist ef al, Nature 290:304. 1981 ); el promotor contuvo la repetición terminal larga 3' del virus de sarcoma Rous (Yamamoto et al. , Cell 22:787-1988); el promotor de quinasa de timidina de herpes (Wagner et al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78: 1441 , 1981 ); o las secuencias reguiadoras del gen de metalotioneina (Brinster et al., Nature 296:39. 1988). Ribozimas Las moléculas de ribozima designadas para dividir catalíticamente las transcripciones de mARN de TF también pueden utilizarse para prevenir la translación de mARN de TF y la expresión de polipéptidos de TF (ver, por ejemplo, Publicación de PCT No. WO 90/1 1364; Sarver et al., Science 247: 1222, 1990). Aunque varios ribozimas que dividen mARN en secuencias de reconocimiento específicas de sitio pueden utilizarse para destruir mARNs de TF, se prefiere el uso de ribozimas de cabeza de martillo. Las ribozimas de cabeza de martillo dividen los mARNs en ubicaciones dictadas por regiones de flanqueo que forman pares base complementarios con el mARN objetivo. El único requerimiento es que el mARN objetivo tenga la siguiente secuencias de dos bases: 5'-UG-3'. La construcción y producción de ribozimas de cabeza de martillo se conoce bien en la materia (Haseloff ef al., Nature 334:585, 1988). Existen numerosos ejemplos de sitios de división de ribozima de cabeza de martillo potenciales dentro de la secuencia de nucleótidos de cADN de TF humano (ver, Figura 5A, por ejemplo en 181 -182, 376-377, y 336-837). Preferentemente, la ribozima se diseña de manera que el sitio de reconocimiento de división se ubica cerca del extremo 5' del mARN de TF, es decir, para incrementar la eficiencia y minimizar la acumulación intracelular de transcripciones de mARN no funcionales. Las ribozimas de la presente invención también incluyen endoribonucleasas de ARN (de aquí en adelante "ribozimas tipo Cech"), tal como aquella que ocurre de manera natural en Tetrahymena Thermophila (conocida como ARN IVS L-19 o IVS) y que se ha descrito extensamente pro Cech y sus colaboradores (Zaug et al., Science 224:574. 1984; Zaug et al., Science 231 :470. 1986; Zug ef al., Nature 324:429. 1986; Solicitud de PCT No. WO 88/04300; Y Been et al., Cell 47:207, 1986). Los ribozimas de tipo Cech tienen una secuencia de ocho pares bases que hibridiza la secuencia de ARN objetivo, después de lo cual tiene ligar la separación del ARN objetivo. La invención incluye aquellas ribozimas tipo Cech que tienen como objetivo ocho secuencias de sitio activo de par base presentes en TF. Como en el planteamiento antisensible, las ribozimas pueden componerse de oligonucleótidos modificados (por ejemplo, para estabilidad mejorada, objetivo, etc.,) y pueden suministrarse a las células que expresan TF ya sea antes o después de que transplantan a un paciente. Un método preferido de suministro incluye utilizar una construcción de ADN "que codifica" la ribozima bajo el control de un promotor pol lll o pol II constitutivo fuerte, de manera que las células transfectadas producirán suficientes cantidades de la ribozima para destruir los mensajes TF e inhibir la translación. Debido a las ribozimas, las moléculas antisensibles diferentes, son catalíticas, una concentración intracelular inferior se requiere para eficiencia. C. Reducción de la Actividad Biológica del Factor de Tejido al Administrar Anticuerpos del Factor Anti-Tejido Los nuevos métodos pueden llevarse a cabo al administrar anticuerpos que inhiben la actividad biológica de TF directamente (es decir, al unir específicamente TF) o indirectamente (por ejemplo, al bloquear (en su totalidad o en parte) la asociación entre TF y el factor Vll(a), o al reducir la actividad del complejo de TF-factor Vlla). Estos anticuerpos se refieren en la presente como anticuerpos "neutralizantes". Las células que expresan TF pueden contactarse con un anticuerpo neutralizante in vitro o ex vivo, antes de que se transplanten en un paciente para neutralizar cualquier TF en la superficie de las células. De aquí en adelante, el anticuerpo puede administrarse al paciente, por ejemplo, por infusión a largo plazo o inyecciones de bolus repetidas, de manera que la actividad de TF se reduce dentro de la corriente sanguínea del paciente.

Los anticuerpos neutralizantes incluyen anticuerpos anti-TF, anticuerpos anti-factor Vil, o fragmentos Fab de tales anticuerpos. Aquellos de experiencia ordinaria en la materia reconocerán las ventajas de administrar formas humanizadas de estos anticuerpos. Los anticuerpos útiles en esta modalidad de la invención incluyen, pero no se limitan a: (1 ) los anticuerpos anti-TF policlonales descritos abajo en el Ejemplo 2; (2) Iso anticuerpos anti-TF piliclonales descritos por Warr ef al., (Blood 75: 1481 , 1990); (3) los anticuerpos anti-TF policlonales descritos por Dackiw ef al. (Arch. Surg. 131 : 1273, 1996); los anticuerpos anti-TF monoclonales, HTF1 -7B8 (Carson ef al., Blood 70:490, 1997); (6) el anticuerpo anti-TF monoclonal descrito por Taylor ef al. (Circ. Shock 33: 127, 1991 ); (8) los anticuerpos anti-TF monoclonales TF8-1 1 D12 y TF9-9C3 (Fiore et al., Blood 80:3127, 1992); (9) el anticuerpo anti-TF monoclonal, TF8-5G9 (Levi et al., J. Clin. Invest. 93: 1 14, 1994); (10) el anticuerpo anti-TF monoclonal, AP-1 (Himber ef al. Thromb. Haemost. 78: 1 142, 1997); (1 1 ) el anticuerpo anti-TF monoclonal, 5G9 (Huang ef al., J. Mol. Biol. 275:873. 1998); (12) el anticuerpo anti-Factor Vil monoclonal, PW-4 (Wildgoose ef al., Thromb. Haemost. 67:679, 1992); (13) el anticuerpo anti-factor Vil monoclonal, 231 -7 (Clarke ef al., FEBS Lett. 298:206. 1992); (14) el anticuerpo anti-factor Vil monoclonal, 12D10 (Biemodn ef al., Thromb. Haemost. 73:223, 1995) y; (15) los anticuerpos anti-factor Vil monoclonales, hVII-B101 /B1 , hVII-DC2/D4 y hVII-DC6/3D8 (Takamiya, Thromb. Haemost. 79: 104, 1 998). Alternativamente, los anticuerpos pueden elevarse contra TF o factor Vil (o fragmentos inmunogénicos o análogos de los mismos mediante técnicas bien conocidas en la materia. los polipéptidos antigénicos pueden producirse mediante técnicas recombinantes o sintetizarse y, una vez obtenidos en forma substancialmente pura, mezclarse con un adyuvante e inyectarse en un mamífero huésped (tal como conejo, ratón, conejillo de Indias, o rata). El adyuvante utilizado para incrementar la respuesta inmunológica dependerá del mamífero huésped. Los adyuvantes pueden seleccionarse de adyuvante de Freund (completo o incompleto), geles minerales (por ejemplo, hidróxido de alumino), substancias activas de superficie (por ejemplo, lisolecitina), polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianoina de lapa de agujero y dinitrofenol. Los adyuvantes humanos potencialmente útiles incluyen BCG (Calmette-Guerin bacilo) y Corynebacterium parvum. Las moléculas de anticuerpo heterogéneas contenidas en el suero de los animales inmunizados (es decir, los anticuerpos policlonales) pueden entonces purificarse por cromatografía de afinidad de antígeno de péptido. Además de los anticuerpos policlonales descritos arriba, los anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanizados o quiméricos, anticuerpos de cadena única, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, y moléculas producidas utilizando una biblioteca de expresión Fab pueden utilizarse en los nuevos métodos descritos en la presente. Los anticuerpos monoclonales, que son poblaciones homogéneas de anticuerpos para un antígeno particular, pueden prepararse utilizando polipéptidos TF o factor Vil y tecnología de hibridoma estándar (ver, por ejemplo, Kohier ef al., Nature 256:495. 1975; Kohier ef al., Eur. J. Immunol. 6:51 1 , 1976; Kohier ef al., Eur. J. Immunol. 6:292, 1976; Hammerling et al., "Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas", Elsevier, NY, 1981 ): En particular, los anticuerpos monoclonales pueden obtenerse mediante cualquier técnica que proporciona la producción de moléculas de anticuerpo mediante líneas celulares continuas en cultivo tales como se describen en Kohier ef al., Nature 256:495, 1975 y la Patente de E.U. No. 4,376, 1 10; la técnica de hibridoma de célula B de humano (Kosbor ef al., Immunology Today 4:72, 1983; Colé ef al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80:2026, 1983) y la técnica de híbridoma EBV (Colé ef al., Inc., pp. 77-96, 1983). Tales anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y cualquier subclase de los mismos. El hibridoma que produce el mAb de esta invención puede cultivarse in vitro o in vivo. La habilidad para producir las concentraciones elevadsa de mAbs in vivo hace a este un método particularmente útil de producción. Una vez producidos, los anticuerpos policlonales o monoclonales se prueban para reconocimiento del factor Vil o TF específico mediante Western blot o análisis de inmunoprecipitación mediante métodos estándar, por ejemplo, como se describe en Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1987, 1989. Además, uno puede utilizar las técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" al unir un gen que codifica una molécula de anticuerpo de especificidad de antígeno apropiada de una especie animal (por ejemplo, un ratón) junto con los genes de una molécula de anticuerpo de humano de actividad biológica apropiada (Morrison ef al., Proc. Nati. Acad. Sel. USA 81:6851 , 1 984; Neuberger ef al., Nature 312:604, 1984; Takeda ef al., Nature 314:452, 1984). De esta manera, un anticuerpo quimérico tendría una región variable derivada de una región constante de inminoglobulina de humano y mAb. Alternativamente, uno podría utilizar técnicas para producir anticuerpos de una sola cadena (por ejemplo, como se describe en las Patentes de E.U. Nos. 4,946,778, 4,946,778 y 4,704,692) para producir anticuerpos de una sola cadena contra un polipéptido de TF, un polipéptido de factor Vil o fragmentos de los mismos. Los anticuerpos de una sola cadena se forman al enlazar los fragmentos de cadena ligeros y pesados de la región Fv a través de un puente de aminoácido, dando como resultado un polipéptido de una sola cadena. Además, los anticuerpos pueden humanizarse por métodos conocidos en la materia, por ejemplo, los anticuerpos monoclonales con una especificidad de unión deseada pueden humanizarse mediante proveedores de servicio comerciales tales como Scotgene (Escocia) y Oxford Molecular (Palo Alto, CA). Los anticuerpos completamente humanos también pueden expresarse en animales transgénicos de acuerdo a los métodos descritos pro Green ef al. (Nature Genetics 7:13-21 , 1994; ver también Patentes de E.U. Nos. 5,545,806 y 5,569,825). D. Reducción de la Actividad Biológica del Factor de Tejido al Administrar Péptidos Los nuevos métodos pueden también llevarse a cabo al administra al paciente péptidos (que ocurren naturalmente o sintéticos) que inhiben la actividad del TF, su asociación con el factor Vll(a) o la actividad del complejo TF-factor Vlla. Como se describe arriba en relación al uso de oligonucleótidos antisensibles, ribozimas y anticuerpos neutralizantes, las células que expresan TF pueden contactarse con un antagonista de péptido in vitro o ex vivo, antes de que se transplante a un paciente. Sin embargo, los antagonistas de péptido también pueden administrarse al paciente de manera que la actividad de TF se reduce en la corriente sanguínea. De manera más general, cualquier molécula que antagoniza directa o indirectamente TF (es decir, cualquier molécula que antagoniza la expresión o actividad de TF o aquella antagoniza la expresión o actividad de cualquier factor, tal como factor Vil, que interactúa con TF) puede ya sea aplicarse a las células utilizadas en los métodos presentes (por ejemplo, BMSCs) ex vivo, antes del transplante, o administrarse al paciente. Los péptidos útiles en esta modalidad de la invención incluyen, pero no se limitan a: (1 ) el péptido Gla de factor Vil, FBI-GP (Wildoose ef al., Thromb. Haemost. 67:679, 1992); (2) el análogo de péptido de TF, TF154-167 (Ronning ef al., Thromb. Res. 84:73, 1996); (3) el análogo de péptido de factor VIII, FVII300-305 167 (Ronning ef al., Thromb. Res. 84:73, 1996); (4) péptidos que poseen los análogos de motivo tripéptido Trp-Lys-Ser (Ronning ef al., Thromb. Res. 84:73, 1996); (5) los análogos de péptido del factor de crecimiento epidérmico como dominios del factor Vil, incluyendo la secuencia Cys-Val-Asn-Glu-Asn-Gly-Gly-Cys-Glu-Gln-Tyr-Cys (SEQ ID NO: 10) y; (6) péptidos que comparten el motivo tripéptido Glu-GIn-Tyr (Orning ef al., Thromb. Res. 86:57, 1997). E. Reducción de la Actividad Biológica del Factor de Tejido al Administrar Factores de Coagulación Modificados En otra modalidad, los nuevos métodos pueden llevarse a cabo al administrar al paciente factores de coagulación modificados o anormales (que ocurren naturalmente o recombinantes) que inhiben la actividad de TF, su asociación con el factor Vll(a) o la actividad del complejo de TF-Factor Vlla. Estos factores incluyen, pero no se restringen a: factor Vlla recombinante inactivado por sitio activo, FVIlai (Harker et al., Haemostasis 26 Suppl. 1 :76, 1996); factor Vlla recombinante modificado; FVIIa dansil-glutamil-glicil-arginil-recombinante (DEGR-rFVIIa) (Orvim ef al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17:3049, 1997); factor Vlla modificado inactivado por sitio activo; Factor FVIIa tratado con acetona D- Phe-L-Phe-L-Arg-clorometil (FFR-FVIIa) (Kjalke ef al., Thromb. Haemost. 78:1202, 1997); factor anormal purificado IX, factor IXBm (Osterud ef al., Thromb. Haemost. 45:55, 1981 ) y; inhibidor de trayectoria de TF modificado o nativo (TFP1 ). TFP1 parece ser el inhibidor fisiológico principal de coagulación inducida por TF (Bajaj y Bajaj, Thromb. Haemost. 78:471 , 1997). TFP1 se ha referenciado como anti-convertina, inhibidor de trayectoria externo (LACI) (Merstraete y Zoldhelyi, Drugs 49:856, 1995). Las formas recombinantes de TFP1 truncado, tales como TFP11 16? se han descrito (Petersen ef al., J. Biol. Chem. 268: 13344. 1993). Un segundo inhibidor de trayectoria de TF (TFPI-2), que tiene homología de secuencia de aminoácido considerable a TFP1 , y que es idéntica a la proteína placental 5 (PP5) (Petersen et al., Biochemistry 35:266, 1996), también es útil en los nuevos métodos descritos en la presente. F\ Reducción de la Actividad Biológica deí Factor de Tejido al Administrar Lipocortinas Los nuevos métodos pueden llevarse a cabo al administrar miembros nativos o modificados de la familia de lipocortin al paciente antes, durante o después de que se implantan las células que expresan TF. Por ejemplo, uno puede administra: Annexin V (que se aisló previamente e identificó como proteína anticoagulante placental (PAP)); anticoagulante-alfa vascular (VAC), endonexin II; lipocortin V; proteína placental 4; y ancorin Cll (Tait ef al., Cytogenet. Cßil Genet. 57: 187. 1991 ), PAP se ha mostrado que inhibe la actividad del factor Vlla-TF, más probablemente al enlazar a la porción fosfolípida de la lipoproteína de TF (Kondo ef al., Thromb. Res. 48:449, 1987). Anexin V también se refiere como proteína-1 de unión de fosfolípido dependiente de calcio (CPB I). Los péptidos que corresponden a los residuos PAP 204-209 (SHLRKV; SEQ ID NO: 1 1 ) y 266-271 (DHTLIR; SEQ ID NO:12) que se incluyen en el sitio funcional PAP, muestran actividad anticoagulante (Funkoshi ef al., Biochem. Int. 24: 173, 1991 ). La Calfobindina II (CPB-II) y Calfobindina lll (CPB-lll) también muestran actividad anticoagulante (Yoshizaki ef al., Chem. Pharm. Bull (Tokio) 40: 1860, 1992; Sato, J. Exp. Med. 168:561 , 1992). G. Reducción de la Actividad Biológica del Factor de Tejido al Administrar Lípidos Modificados. Apolipoproteínas. o Fosfolipasa Los nuevos métodos pueden llevarse a cabo al administrar lípidos nativos o modificados, apolipoproteínas o fosfolipasa (natural o recombinante). Por ejemplo, la esfingosina inhibe la coagulación iniciada por TF (Conkling ef al., J. Biol. Chem. 264: 18440, 1989). La apolipoproteína A-ll inhibe la participación de TF en la activación del factor X de coagulación por el factor Vlla al evitar la asociación apropiada de TF con el factor Vlla (Carson, J. Biol. Chem. 262:718, 1987).

Apolipoproteína B-100 inhibe la actividad de TF (Ettelaie ef al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16:639, 1996). Los péptidos recombinantes que representan regions ricas en lisina de apolipoproteína B-100 (KRAD-98 y KRAD-14) inhiben la actividad procoagulante de TF al evitar la activación del factor Vil (Ettelaie ef al., Biochem. J. 333 (Pt. 2):433, 1998). La fosfolipasa C inhibe la coagulación inducida por TF (Jansson et al., J. Trauma 28 (1 Compl):S222, 1988). H. Reducción de la Actividad Biológica del Factor de Tejido al Administrar Polisacáridos Modificados Los métodos de la invención pueden llevarse a cabo al administrar polisacáridos nativos o modificados que actúan como inhibidores de enlace de TF a otros factores de coagulación. Por ejemplo, el pentasacárido sintético es homólogo a las secuencias de heparina que se unen a la antitrombina. El pentasacárido se une a la antitrombina, estimulando así la inhibición de la antitrombina del complejo de TF-Factor Vlla. De esta manera, un pentasacárido sintético que representa el sitio de unión mínimo de heparina a antitrombina es un inhibidor dependiente de antirombina eficiente de la actividad coagulante del complejo de TF-factor Vlla (Lormeau ef al., Thromb. Haemost. 76.:5, 1996). . Reducción de la Actividad Biológica del Factor de Tejido al Administrar Agentes gue Actúan Corriente Abajo desde el Complejo de Factor de Tejido-Factor Vil En otra modalidad, los métodos pueden llevarse a cabo al administrar al paciente agentes anticoagulantes, antitrombóticos, que actúan en los factores de coagulación corriente debajo de la actividad del complejo de TF-factor Vil antes de, durante, o después de la infusión (u otra administración) de células que expresan TF. Estos agentes actúan al inhibir los factores de coagulación o al inhibir la activación de trombocitos.

Los siguientes agentes se tratan en las revisiones por Verstraete y Zoldhelyi, Drugs 49:856, 1995) y Carye y Rodgers (Am. J. Hematol. 59:65. 1998) al menos que se haga referencia de otra manera. Los polipéptidos nativos o modificados que se incluyen en la regulación de anticoagulación: antitrombina lll (antitrombina lll de tipo silvestre, antirombina lll que contiene residuos mutados en el ciclo de centro reactivo, antitrombina lll que contiene mutaciones en el sitio de unión de heparina; trombomodulina; Proteína C activada (con o sin proteína S); a1 -antitripsina recombinante Pittsburg, un inhibidor de trombina de proteasa mutante; fosfolipasa A2, o péptidos sintéticos que comprende residuos 51 -71 y 51 -62 de fosfolipasa S2 (Mounier ef al., J.

Biol. Chem. 273:23764. 1998), polipéptidos de disintegrina de veneno de víbora (por ejemplo, Cristina, bitistasina, aplagina, equistatina, trigamina, barbourina); polipéptidos de antitrombina producidos por las glándulas salivales de sanguijuela (por ejemplo, hirudina, desulfatohirudina, hirulogo, hirugeno, hirudisinas, rHV2, rHV2-Lys47, rHV2-Arg47, antistasina); péptido anticoagulante grueso (TAP), péptidos anticoagulantes de lombriz intestinal (formas de AcAP); péptidos Arg-Gly-Asp (RGD) o Arg-Gly-Asp-Ser (RGDS: SEQ ID NO.13), o polipéptidos que comparten estas secuencias de péptido y evitan la activación de trombocitos; el tripéptido de boroarginina DUP714, o un decapéptido bi-O-Tyr-sulfatado (NF-6505) (Sasaki ef al., Thromb. Res. 86:453, 1997), que se unen a trombina; anticuerpos (o fragmentos Fab, o anticuerpos humanizados) para trombocitos GPIIb/llla (por ejemplo, c7E3 Fab, abciximab), trombocito GPIb, factor multimérico von Willebrando, o factor X (alfa BFX-2b) (Church et al., Blood 72:1911. 1988). Los agentes sin péptido que tienen anticoagulación, antitrombóticos, o actividades de activación de trombocitos: Los derivados de tienopiridina (por ejemplo, ticlopidina, clopidogrel) que inhiben la agregación de trombocitos; agente antitrombocito triflusal y su metabolito de ácido 3-hidroxi-4-trifluor-metilbenzóico (McNeely y Goa, Drugs 55:823, 1998); antagonistas del factor de activación de trombocitos (por ejemplo, SM-12502 (Murakami ef al., Thromb. Haemost. 75:965, 1996); inhibidores sin péptido de GPIIb/llla (por ejemplo, tirofiban (MK-383), SC-5468A); atangonistas del receptor de fibrinogeno (por ejemplo, fradafibran (BIBU 104XX), BIBI 52ZW); inhibidores de sintasa de tromboxano, antagonistas del receptor de tromboxano (por ejemplo, deltroban, ifetroban) y compuestos con actividad dual (por ejemplo, ridogrel, picotamida) análogos de prostaciclina (por ejemplo, iloprost, epoprostenol); sulodéxido antitrombótico; argatroban de antitrombinas; RWJ-27755; efegatran; o BCH-2763 (Finkle ef al., Thromb. Haemost. 79:431 , 1 998); o inogatran (Gustafsson ef al., Blood Coagul. Fibrinolysis 7.69, 1996); inhibidores del factor Xa tal como los pentasacáridos Org 31 540/SR 90107A y SANORG 32701 , y un bis-amidinoderivado DX-9065a (Yamasaki et al., Semin. Thromb. Haemost. 22: 255, 1996), o APAP (Yokoyama ef al., Circulation 92:485, 1995); heparina, heparinas de bajo peso molecular, heparinoides o heparinoides de bajo peso molecular (Gibaldi y Wittkowsky, J. Clin. Pharmacol. 35: 1031 , 1995); aspirina (Schror, Semin. Thromb. Hemost. 23:349, 1997) mesilato de gabexato (Umeki ef al., Arch. Intern. Med. 148: 1409, 1988), aprotoina del inhibidor de proteasa (Svartholm ef al., Acta. Chir. Scand. 155:7, 1989) y derivados de 4C2, 7L22, 5L15, 5L15-PEG, 6L15 y 5L84 (Stassen ef al., Thromb. Haemost. 74:655. 1995). La expresión de TF en células tales como BMSCs puede también reducirse al cultivar, o incubar, las células en agentes específicos tales como inhibidores de transmetilación (por ejemplo, DZA, DZAri, EHNA; Dalaker y Prydz, Biochem. Pharmacol. 35:3433, 1986), antagonistas de calcio (por ejemplo, TMB-8, verapamil, nifedipina, felodipina, Dalajer y Prydz, supra); prostaglandina E2 (PGE2: Dalaker y Prydz, supra); inhibidor de fosfodiesterasa (por ejemplo, MIX (Dalajer y Prydz, supra), pentoxifilina y trequinsina (Leclerc ef al., J. Cardiovasc. Pharmacol. 25 Suppl. 2:S88, 1995); monensina (Dalaker y Prydz, supra); prostaciclina y análogos de prostacilcina (por ejemplo, iloprost, ciprosteno, carbaciclina, Crustachley ef al., Arterioscler. Thromb. 12:664, 1992); inhibidores de trayectoria B kappa NF (por ejemplo, ditiocarbamatos, Orthner ef al., Blood 86:436. 1995); curcumina (Bierhaus ef al., Thromb. Haemost. 77:772, 1997); e ipterleukinas (por ejemplo, IL-4, IL-10, IL-13, TGF-ß; Ernofsson ef al., Br. J. Haematol. 95:249, 1996). J. Dosis Eficaz Como se describe arriba, los antagonistas de TF pueden administrarse a un paciente para reducir o inhibir la expresión o actividad de TF. Las dosis estándar y cantidades terapéuticamente eficaces conocidas (por ejemplo, una cantidad eficaz para reducir los efectos vasculares adversos causados por TF) de los antagonistas descritos en la presente pueden utilizarse. La toxicidad y eficacia terapéutica de estos antagonistas puede determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar, utilizando ya sea células en cultivo o animales experimentales para determinar la LD50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la ED50 (la dosis terapéuticamente eficaz en 50% de la población). La proporción de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la proporción LD50/ED5o. Los polipéptidos u otros compuestos que muestran grandes índices terapéuticos se prefieren. Aunque los compuestos que muestran efectos secundarios tóxicos pueden utilizarse, debe tenerse cuidado para diseñar un sistema de suministro que tienen como objetivo tales compuestos para el sitio de tejido afectado (por ejemplo, la cavidad de médula ósea en las cuales las células se han infundado) para minimizar el daño potencial a células no infectadas y, así, reducir los efectos secundarios. Los datos obtenidos de los análisis del cultivo celular y estudios animales pueden utilizarse en la formulación de un rango de dosis para uso en humanos. La dosis de tales compuestos yace preferentemente dentro de un rango de concentraciones de circulación que incluyen la ED50 con poco o nada de toxicidad. La dosis puede variar dentro de este rango dependiendo de la forma de dosis empleada y la vía de administración utilizada. Para cualquier compuesto utilizado en el método de la invención, la dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente de los análisis de cultivo celular. Una dosis puede formularse en los modelos animales para lograr un rango de concentración de plasma de circulación que incluye la IC50 (es decir, la concentración del compuesto de prueba que logra una inhibición máxima a la mitad de síntomas) como se determina en el cultivo celular. Tal información puede utilizarse para determinar de manera más exacta las dosis útiles en humanos. Los niveles en plasma pueden medirse, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de desempeño elevado. K. Formulaciones v Uso Los antagonistas de TF descritos arribas pueden formularse para su administración a un paciente en una manera convencional utilizando uno o más excipientes o vehículos fisiológicamente aceptables. De esta manera, los antagonistas (es decir, los ácidos nucleicos, polipéptidos, anticuerpos u otros compuestos moduladores de TF de la invención) o sus solvatos y sales fisiológicamente aceptables pueden formularse para su administración mediante cualquier vía estándar de administración. Por ejemplo, la administración puede ser parenteral, intravenosa, subcutánea, intramuscular, intracraneal, intraorbital, oftálmica, intraventricular, intracapsular. intraespinal, intracisternal, intraperitoneal, transmucosal u oral. El compuesto modulador puede formularse en varias maneras, de acuerdo a la vía de administración correspondiente. Por ejemplo, las soluciones líquidas pueden hacerse para ingestión o inyección, los geles o polvos pueden hacerse para ingestión, inhalación o aplicación local. Los métodos para hacer tales formulaciones se conocen bien y pueden encontrarse en, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences". Se espera que la vía de administración preferida sea intravenosa. Ejemplos Eiemplo 1 :lnfusión de Células Estromales de Médula Ósea Canina se Asocia con Trombosis Intravascular Las células estromales de médula ósea canina (BMSCs) se cultivaron como se describe por Emami ef al. (In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal 33:503, 1997) y Hurwitz ef al. (Human Gene Therapy 8: 137, 1997). Estos cultivos carecen de células progenitoras hematopoiéticas (Hurwitz ef al., supra). Las BMSCs cultivadas pueden modificarse genéticamente e infundirse en animales. Por ejemplo, BMSCs pueden modificarse genéticamente para expresar la hormona de crecimiento humana, factor IX humano, factor IX canino, o factor VIII humano (Ver, Patente de E.U. No. 5,849,287). Cuando BMSCs se recolectan de un animal, cultivan, e infunden en el mismo animal, el procedimiento se refiere como re-infusión autóloga. La re-infusión exitosa con 1.9 x 107-5.6 x 108 BMSCs se ha llevado a cabo en perros (que pesan 20-27.4 kg) en al menos 17 ocasiones separadas, incluyendo aquellas descritas por Hurwitz et al., (supra); y Cherington ef al., (Human Gene Therapy 9:1397, 1998). Sin embargo, en una ocasión, cuando un perro (designado #2) que pesa 26.3 kg recibió 2.6x109 BMSCs, los efectos secundarios adversos se observaron (Hurwitz et al., supra). El perro tuvo dificultad en respirar y algo de sangre apareció en su cepa. En una segunda ocasión, utilizando los métodos descritos por Cherington et al., (supra), un perro (designado #20A) que pesa 23.6 kg recibieron 8.8x108 BMSCs mediante re-infusión autóloga (las células se modificaron para expresan factor IX humano) y experimentaron varios efectos secundarios. En consecuencia, el perro se mató. Una autopsia reveló la trombosis capilar intersticial extensiva y la hemorragia resultante debido a una coagulación intravascular. Las reaccione adversas descritas arriba fueron inesperadas debido a que las preparaciones de médula ósea que se utilizan comúnmente en los procedimientos de transplante de médula ósea contienen células estromales de médula ósea, y no hubo razón de esperar que las poblaciones puras de infusión de las células estromales podrían causar reacciones adversas. Para evaluar los efectos adversos, los conteos de trombocitos se obtuvieron antes y en varios momentos después de que los perros (n=10) recibieron infusiones de BMSC autóloga (Figura 2). Dentro de 20 minutos después de la infusión de células, la mayoría de los perros experimentaron una caída en el conteo de trombocitos. Además, existe una correlación evidente entre el número de células infudidas y el descenso en el conteo de trombocitos; mientras mayor sea el número de células, mayor será el descenso en trombocitos. El nivel de trombocitos sanguíneos se restauró niveles normales o casi normales dentro de 7-12 días después de la infusión de BMSCs (con la excepción del perro #20a, que se mató). Además, los niveles de plasma de trombib-antitrombin (TAT) se determinaron mediante los Consultores de Coagulación de Colorado (Aurora, C) después de la infusión de BMSCs en seis animales (ver Figura 3). Los niveles de TAT comenzaron a elevarse en seis animales (ver Figura 3). Los niveles de TAT comenzaron a elevarse en el momento de la infusión, con valor máximo a aproximadamente 20 minutos post-infusión, y después descienden. Los niveles TAT regresaron a normales dentro de un día de infusión de BMSCs. Estos datos revelaron una correlación evidente entre el número de células infundido y los niveles de TAT, mientras mayor sea el número de células, mayor será el nivel de TAT. Estos estudios (analizando los niveles de TAT y trombocitos) indicaron que los efectos secundarios adversos observados siguiendo la infusión de BMSC pueden haber sido debido a la infusión de números elevados de BMSCs. Para determinar la causa de las reacciones adversas, BMSCs se analizaron en un número de maneras. Después se encuentra un descripción de estudios que demuestran la expresión de TF en BMSCs. Aunque no se desea unirse por ningún mecanismo subyacente, esta expresión podría considerar las reacciones adversas que ocurrieron cuando grandes números de BMSCs se re-infundieron en dos ocasiones descritas arriba.

Eiemplo #2: Células Estromales de Médula Ósea Canina Expresan el ARN del Factor de Tejido El ARN se aisló de BMSCs de canino, que se establecieron en cultivo de tejido, por el sistema Tri Reagent™ (Sigma Chemical Company, St. Louis. MO). Para remover cualquier rastro de ADN contaminante, el ARN aislado se digirió por 3 horas con ADNasa libre de ARNasa (Promega Corporation, Madison, Wl) como sigue: 10 µl de 100 mM MgCI2, 10 mM DTT, 0.2 µl de 2.5 mg/ml ADNasa libre de ARNasa, 0.1 µl ARNsin (50 U/µl) y 39.7 µl de TE (pH 7.2) se agregaron a 50 µl de ARN. La muestra se extrajo con fenol/cloroformo y el ARN se precipitó con etanol y resuspendió en TE (pH 7.2). La concentración de ARN recuperada se determinó entonces al medir el OD a 260 nm. Para generar cADN, RT-PCR se llevó a cabo utilizando 1 µg de ARN y el Sistema de Transcriptasa Inversa Promega (Promega Corporation) de acuerdo al procedimiento del fabricante). cADN de TF se amplificó entonces por el PCR. El cADN se desnaturalizó inicialmente a 94°C (por 5 minutos) y se amplificó por 35 ciclos de desnaturalización (94°C por 30 segundos), ablandamiento (58°C durante 50 segundos) y alargamiento (72°C durante 90 segundos), seguido por una etapa de alargamiento final (72°C durante 5 minutos). Los primarios PCR fueron primarios de secuencia TF en regiones que codifican la proteína de cADN de TF que son homólogos entre humano (Spicer ef al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:5148, 1987) y secuencias de cADN de TF de ratón (Ranganathan ef al., J. Biol. Chem. 266:496. 1991 ). Las secuencias de los primarios 5' y 3' fueron 5'-ATTCAAGACAATTTTGGAGTGG-3' (SEQ ID NO: 14, y 5'-AGTTTTCTCCTTTATCCACATC-3' (SEQ ID NO: 15), respectivamente. El primario 5' es homólogo al par base 260-280 (bp) y las posiciones 165-187 bp de las secuencias de cADN de TF humano y de ratón, respectivamente. El primario 3' es homólogo a las posiciones 683-662 bp y 760-739 de las secuencias de cADN de TF de humano y ratón, respectivamente. El tamaño de la banda RT-PCR específica de TF utilizando ARN de ratón o humano como templados sería 424 bp o 596 bp, respectivamente. Los productos PCR se resolvieron en 1 % de geles de agarosa y visualizaron por coloración de bromuro de etilio. El RT-PCR llevado a cabo en ARN aislado de BMSCs caninas produjo una banda del tamaño esperado de -424-596 bp. Fue ligeramente más pequeño que una banda marcadora de 603 bp (marcadores de ADN Hind lll-digerido ? y Hae lll-digerido 0X174) y el mismo tamaño que las bandas generadas utilizando ARN aislado de células MDCK caninas o cerebrales de canino, ambas de las cuales se sabe que expresan TF). Una banda generada utilizando un plásmido de cADN de TF humano como templado fue de alguna manera más pequeño, como se espera). Una muestra de control negativo, que se generó al llevar a cabo una reacción sin el ADN templado, no produjo una banda de tamaño apropiado. Este estudio demostró que BMSCs de canino expresan ARN de TF. Eiemplo 3: Experimentos de Clonación y Secuenciación Confirman la Expresión del ARN de Factor de Tejido en BMSCs de canino El producto RT-PCR generado como se describe arriba (de ARN aislado de BMSCs de canino), se clonó en el vector TA (InVitrogen Corporation, San Diego, CA) de acuerdo a las instrucciones del fabricante, y se secuenciaron. La secuencia fue homologa a las regiones de las secuencias de TF de ratón y humano que son homologas con otra (además, en regiones en donde las secuencias de ratón y humano no fueron homologas, la homología de la secuencia canina también difirió). La secuencia de longitud completa de ARN de TF canino se obtuvo ai utilizar ei Equipo de Amplificación de cADN Marathón™ (Clonetech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA). La primer síntesis de cADN de filamento se llevó a cabo utilizando un primario oligo de amarre (dT) y la segunda síntesis de cADN de filamento se llevo a cabo utilizando polimerasa I de ADN E. coli y ligación con un adaptador de doble filamento extendido 5, de acuerdo a las instrucciones del fabricante. El extremo 5' del cADN de TF (aproximadamente 1/3 del cADN completo) se amplificó por 5'-RACE PCR utilizando el Equipo de Amplificación de cADN Marathón™ en combinación con el Equipo de PCR de cADN Advantage-GC™ (Clonetech). La reacción incluyó un 5'-primario AP1 y un 3'-primario específico de TF canino (5'-ATCTTGTACGATCACATTC-3' SEQ ID NO: 16) en fundición 1X GC y regulador de PCR 1X Advantage. Después de la desnaturalización (94°C por 5 minutos), la amplificación se logró por 35 ciclos de desnaturalización (94°C por 30 segundos), ablandamiento (5jß°C por 50 segundos) y alargamiento (72°C por 90 segundos) seguido por una etapa de alargamiento final (72°C por 5 minutos). El extremo 3' del cADN de TF (aproximadamente 2/3 del cADN completo) se amplificó por 3'-RACE PCR utilizando el Equipo de Amplificación de cADN Marathón™ en combinación el Equipo PCR de cADN Advantage™ (Clonetech) utilizando un 5'-primario específico de TF (5'-ATTTCAAGACAATTTTGGAGTGG-3' SEQ ID NO: 17) y un primario 3?P1 en regulador PCR 1 X Advantage™. Las condiciones de amplificación fueron las mismas como aquellas descritas inmediatamente arriba. Ambos fragmentos amplificados se clonaron en el vector TA™ (Invitrogen) de acuerdo a las instrucciones del fabricante, y se secuenciaron por procedimientos estándar. El cADN y las secuencias de aminoácido predichas se muestran en la Figura 4. La secuencia de cADN completa consiste de un estructura de lectura abierta de 879 bp flanqueada por 110 bp de 5'-UTR y 850 bp de 3'-UTR. La estructura de lectura abierta, que es claramente homologa al TF humano, codifica TF canino. Estos estudios confirman que las células estromales de médula ósea de canino expresan ARN de TF, y revelan la secuencia de ese factor. Eiemplo 4: BMSCs de Canino Poseen Actividad del Factor de Tejido Las BMSCs de canino se desarrollaron en cultivo y probaron para la actividad precoagulante de TF. Las células que se han tranductado para expresar los productos de transgen así como también aquellos en cultivos candidos se probaron. Para analizar la actividad de TF total en cultivos BMSC, las BMSCs se recolectaron por tripsinización, enjuagaron dos veces en salina regulada por fosfato (PBS), y aglomeraron por centrifugación. La aglomeración celular se resuspendió en PBS a aproximadamente 1 x106 células/ml. Las suspensiones se congelaron rápido en nitrógeno líquido (aproximadamente 40 segundos) y ya se almacenaron a -80°C o probaron inmediatamente. En cualquier caso, las células se usaron por tres ciclos de congelamiento-deshielo y se determinó la actividad de TF en el lisato por el procedimiento de análisis de coagulación de Camerer ef al., (Blood 88:1339, 1996). El plasma mancomunado normal de canino, el aparato del Laboratorio de Coagulación Automática (ACL)-3000 plus (Intrumentation Laboratories Lexington, MA; programa aPTT) y TF humano recombinante lipidado (American Diagnostica, Greenwich, CT) se utilizaron para generar una curva estándar de actividad de TF. Como se muestra en la Tabla 1 , los cultivos BMSC establecidos de varios perros poseen actividad de TF, sin considerar si consisten de células que se han transducido para expresar los productos de transgen (factor IX humano o factor IX canino) o células que son candidas a la modificación genética. Los cultivos BMSC utilizados para generar los datos mostrados en la Tabla 1 se establecieron y desarrollaron en cultivos como se describe por Hurwitz et al (Human Gene Therapy 8:137, 1997). Los métodos de transducción de BMSC y los vectores utilizados fueron aquellos descritos en Cherington ef al., (Human Gene Therapy 9:1397, 1998). Brevemente, el vector MGF-hFIX codifica el factor IX humano y el vector MFG-cFIX codifica el factor IX canino. Y la actividad de TF se determinó en el lisato celular por el procedimiento de análisis de coagulación de Camerer ef al., (Blood 88: 1339, 1996) utilizando plasma mancomunado normal canino, el aparato del Laboratorio de Coagulación Automática (ACL)-3000 plus (Intrumentation Laboratories Lexington, MA), utilizando el programa aPTT y TF humano recombinante lipidado (American Diagnostica, Greenwich, CT) para generar una curva estándar de actividad de TF.

La conclusión de que la actividad procoagulante encontrada en BMSCs de canino se debe a la expresión de TF canino, se refuerza considerablemente por dos descubrimientos: (1) anticuerpos que inhiben específicamente la actividad de TF humano inhiben la actividad de TF en lisatos BMSC de canino (ver Tabla 2) y anticuerpos que inhiben específicamente la actividad del factor Vil inhiben la actividad precoagulante de TF de lisato BMSC (Tabla 3). Los reactivos utilizados para generar los datos mostrados en la Tabla 2 incluyeron TF recombinante humano (American Diagnostica, Greenwich, CT); inmunoglobulina de conejo no específica (DAKO A/S, Glostrup, Dinamarca, utilizada como en una concentración de 125 µg/250 µg); e IgG de TF anti-humano de conejo específico (American Diagnostica, Greenwich, CT; utilizado en una concentración de 125 µg/250 µl). El TF recombinante humano (250 µl) o lisato de célula estromal canino (250 µl), cada uno en una concentración de aproximadamente 40 ng/ml de actividad de TF, se preincubaron con 250 µl del reactivo indicado (ver la columna a mano izquierda de la Tabla 2) por 30 minutos a 37°C antes del análisis de la actividad de TF. La actividad de TF final esperada sería de 20 ng/ml si no se inhibió. La actividad de TF se determinó como se describe arriba (Camerer ef al.).

Los reactivos utilizados para generar los datos mostrados en la Tabla 3 incluyeron agrupamiento normal humano (HNP) y plasma deficiente de factor Vil (George King Bio-Medical Inc. Overland Park, KS), CaCI2 (Intrumentation Laboratories Lexington, MA), kappa lgG1 de ratón (PharMingen, San Diego, CA, a 0.5 mg/ml en PBS), y factor Vll/Vlla antihumano de ratón que es un isotipo kappa IgG de ratón (American Diagnostica, Inc., Greenwich, CT, en 0.5 mg/ml en PBS). Las concentraciones indicadas de PBS, lgG1 de ratón, o factor Vil anti-humano de ratón se preincubaron con HNP por 30 minutos a temperatura ambiente con agitación. El rango de concentración de PBS corresponde al rango de IgG de ratón o preparaciones de anticuerpos agregados a HNP. Los análisis para la actividad precoagulante se llevaron a cabo en un sistema de análisis de coagulación ACL-3000 plus utilizando el programa APTT (descrito arriba). El lisato de BMSC canino reemplazó el reactivo Cephalin en la posición #2.

Eiemplo 5: Expresión del Factor de Tejido en BMSCs de Canino Cultivadas Las poblaciones homogéneas de BMSCs de canino se cultivaron como se describe previamente (Emami et al., In Vitro Cellular & Developmenta Biology-Animal 33:503, 1997 y Hurwitz ef al., supra) y se somete a análisis de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos específicos para TF. Las BMSCs adherentes de cultivo de tejido se enjuagaron dos veces con PBS, fijaron en 4% de paraformaldehído (10 minutos) y enjuagaron de nuevo con PBS. Las células se permebilizaron entonces con 90% de etanol (10 minutos a temperatura ambiente) y los sitios de unión de anticuerpo no específico se bloquearon con 1 % de suero de cabra normal (Vector Labs, Burlingame, CA) (30 minutos a temperatura ambiente). Las células se enjuagaron con PBS e incubaron con ya sea anticuerpo de igG de TF anti-humano monoclonal de ratón (American Diagnostica; #4509) o, como un control negativo, un anticuerpo de IgG monoclonal de ratón (PharMigen, San Diego, CA; #03171 D), en 15 µg/ml (1 hora a temperatura ambiente). Después de la incubación con los anticuerpos primarios, las células se enjuagaron 3 veces con PBS y después se incubaron con un anticuerpo IgG de anti-ratón de cabra conjugado Rdoamine Red-X (Molecular Probes, Eugene, OR) en 10 µg/ml (45 minutos a temperatura ambiente, en la obscuridad). Después de la incubación con los anticuerpos secundarios, las células se enjuagaron tres veces con PBS, y los núcleos se contra-colorearon azules con DAPI (Molecular Probes) en 1 ug/ml (5 minutos). Después de la contra- coloración, las células se enjuagaron dos veces con PBS, secaron con aire, y montaron con Fluoromount-G™ (Southern Biotechnology Associated Inc. , Birmingham, AL) bajo una tira de cubierta. Loo deslizamientos se observaron utilizando un microscopio de fluorescencia de contraste de fase Leica Microstar IV (Leica AG, Heerbrugg, Suiza) equipado con filtro de color Tri rojo DAPI/FITC/Texas (ChromaTechnology, Brattleboro, VT). Todas las BMSCs de canino expuestas al anticuerpo anti-TF específico se colorearon positivamente para TF, pero ninguna de las células se colorearon después de la aplicación del anticuerpo no específico (control negativo). De esta manera, esencialmente todas las BMSCs cultivadas por los métodos arriba descritos expresan TF. Eiemplo 6: La Expresión del Factor de Tejido es también Evidente en Cultivos a Largo Plazo de BMSCs de canino Aunque los cultivos descritos en los Ejemplos 1-5 consisten de poblaciones homogéneas de células estromales derivadas de células progenitoras hematopoiéticas (Hurwitz et al., supra), BMSCs también se han definido de manera clásica como las células adherentes en cultivos celulares de médula ósea a largo plazo. Las células adherentes soportan el mantenimiento, proliferación y diferenciación de las células germinales hematopoiéticas en estos cultivos de médula ósea a largo plazo (LTBMCs) (Dexter ef ai., J. Cell. Physiol. 91:335, 1977; Gartner y Kaplan, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4756, 1980) Los LTBMCs de canino se establecieron como sigue. Las células mononucleares de médula ósea canina (obtenida por aspiración por aguja de la cresta iliaca de perros anestesiados) se prepararon como se describe previamente (Hurwitz et al., supra). Las células mononucleares (2x107) se suspendieron en 10 ml de medio completo y se cultivaron en matraces de 25 cm2 a 33°C con 5% de CO2. El medio completo contiene medio MyeloCult H5100 (StemCell Technologies, Inc. Vancouver, Canadá) complementado con 1 µM de hidrocortisona (Sigma Chemical Company), antibióticos (25 µg/ml de gentamicina, 100 unidades/ml de penicilina, 100 µg/ml de sulfato de estreptomicina (Life Technologies, Grand Island, NY)) y anti-micótico (0.25 µg/ml de anfotericina B, Life Technologies). El medio MyeloCult H5100 consiste de alfa-MEM, 12.5% de suero de bovino fetal (FBS), 12.5% de suero de caballo, 0.2 mM de i-inositol, 20 µM de ácido fólico, 0.1 mM de 2-mercaptoetanol y 2 mM de L-glutamina. Los cultivos se alimentaron cada semana con 50% de medio fresco y 50% de medio acondicionado. Aunque los LTBMCs consisten tanto de BMSCs adherentes como de células hematopoiéticas, los cultivos puros de células estromales pueden desarrollarse de estos LTBMCs "mezclados" (Chuah et al., Human Gene Therapy 9:353, 1998). Las células en LTBMCs se sometieron a análisis de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos específicos para TF como se describe en el Ejemplo 5 excepto que las células se permeabilizaron en 0.5% Tritón X-100 en lugar de 90% de etanol, se utilizó anticuerpo IgG de anti-ratón de cabra conjugado por FITC como el anticuerpo secundario, los núcleos no se contra-colorearon, y las células se visualizaron con un filtro FITC (ChromaTechnology). Las BMSCs adherentes en los LTBMCs de canino se colorearon positivamente para TF después de la exposición al anticuerpo anti-TF específico, pero no se colorearon después de la exposición al anticuerpo no específico (control negativo). Estos resultados demostraron que BMSCs expresan TF, ya se cultivan dentro de LTBMCs o como poblaciones puras (homogéneas) de BMSCs. Eiemplo 7: BMSCs de Canino Expresan el Factor de Tejido Activo cuando se Cultivan en la Misma Manera gue las Células Referidas como Células Germinales Mesenquimales. Las BMSCs también se refieren como células germinales mesenquimales (células progenitoras mesenquimales) debido a su habilidad para diferenciarse en una variedad de tipos de célula mesenquimal (Prockop, Science 273:71. 1997). Las poblaciones homogéneas de células germinales mesenquimales de humano y de canino se han estabecido explicado en cultivo de acuerdo a los métodos descritos por Kadiyala et al., (Cell Transplant 6:125, 1997) y Majumdar ef al., (J. Cell. Phvsiol 176:57. 1998) Para demostrar que las células crecieron como se describe en las publicaciones que hacen referencia a "células germinales mesenquimales" (en lugar de BMSCs) que expresan TF y que muestran actividad procoagulante de TF, las células utilizadas en los Ejemplos anteriores (y referidas como BMSCs) se establecieron en cultivo utilizando los métodos de Kadiyala ef al., y Majumdar ef al., y se sometieron a análisis de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos se unen específicamente a TF. El procedimiento se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 6. Las células se colorearon positivamente para TF después de la exposición al anticuerpo anti-TF específico, pero no se colorearon después de la exposición al anticuerpo no específico (control negativo). Las células caninas utilizadas aquí, ya sea referenciadas como BMSCs o células germinales mesenquimales, se establecieron en cultivo como se describe arriba, recolectaron y analizaron para actividad procoagulante de TF como se describe en el Ejemplo 4. La actividad procoagulante de TF fue 632.7 + 150 ng por 106 células (promedio + S.D.; n=3). De esta manera, las células crecieron como se describe en publicaciones que hacen referencia a "células germinales mesenquimales" (preferentemente BMSCs) que expresan TF y muestran actividad procoagulante de TF. Eiemplo 8: Expresión del Factor de Tejido en BMSCs de Humano Cultivadas es Evidente después del Inmunoanálisis La médula ósea humana se obtuvo por aspiración desde las crestas iliacas de donadores voluntarios saludables, utilizando técnicas estándar y anestésicas locales. Las poblaciones homogéneas de BMSCs de humano se cultivaron como se describe previamente por Emami ef al. (supra) y Hurwitz ef al., (supra), y las células cultivadas se sometieron a análisis de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos específicos para TF, como se describe en el Ejemplo 5. Todas las BMSCs de humano obtenidas se colorearon positivamente para TF después de la exposición al anticuerpo anti-TF específico, pero ninguna de las células se coloreó después de la exposición al anticuerpo no específico (control negativo). De esta manera, esencialmente todas las BMSCs humanas se cultivaron por los métodos descritos arriba que expresan TF. Eiemplo 9: Expresión del Factor, de Tejido es Evidente en Cultivos A Largo Plazo de BMSCs de Humano Los LTBMCs de humano se establecieron de los aspirados de la médula ósea de los donadores voluntarios como se describe en el Ejemplo 6, y los cultivos se analizaron por inmunofluorescencia utilizando anticuerpos específicos para TF, como se describe en el Ejemplo 5. Las BMSCs adherentes en los LTBMCs de humano se colorearon positivamente para TF después de la exposición al anticuerpo anti-TF específico, pero no colorearon después de la exposición al anticuerpo no específico (control negativo). Estos resultados demuestran que las BMSCs de humando dentro de los LTBMCs expresan TF, como lo hacen las poblaciones de células estromales de humano. Eiemplo 10: BMSCs de Humano Expresan Factor de Tejido Activo Cuando Se Cultivan De La Misma Manera Que Las Células Referidas Como Células Germinales Mesenquimales Como se describe arriba, BMSCs también referidas como células germinales mesenquimales (o células progenitoras mesenquimales) (Prockop, Science 276:71. 1997), que se han establecido y expandido en cultivo de acuerdo a los métodos descritos por Majumdar ef al., (J. Cell.

Physiol 176:57, 1998) Para demostrar que ias células crecieron como se describe en ias publicaciones que hacen referencia a "células germinales mesenquimales" (en lugar de BMSCs) que expresan TF y que muestran actividad procoagulante de TF, las células de humano utilizadas en los Ejemplos anteriores (y referidas como BMSCs) se establecieron en cultivo utilizando los métodos de Majumdar ef al., y se sometieron a análisis de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos se unen específicamente a TF.

El procedimiento se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 6. Las células se colorearon positivamente para TF después de la exposición al anticuerpo anti-TF específico, pero no se colorearon después de la exposición al anticuerpo no específico (control negativo). De esta manera, las células desarrolladas como en una publicación que hace referencia a "células germinales mesenquimales" (en lugar de BMSCs) expresan TF. Otras Modalidades Debe entenderse que aunque la invención se ha descrito en conjunción con la descripción detallada de la misma, que la descripción anterior se propone para ilustrar y no limitar el alcance de la invención, que se define por ei alcance de las reivindicaciones anexas. Otros aspectos, ventajas y modificaciones se encuentran dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (38)

1. REIVINDICACIONES 1 . Un método para reducir el riesgo, o severidad, de un efecto vascular adverso en un paciente que se encuentra en una terapia en base a células que incluye introducir las células que expresan el Factor de Tejido (TF) en el paciente, el método comprendiendo tratar las células que expresan TF con un antagonista que interactúa directamente con TF o una molécula de ácido nucleico que codifica TF; e introducir las células tratadas en el paciente.
2. 2. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque el efecto vascular adverso es hemorragia, trombosis, coagulación intravascular, coagulación intravascular diseminada, agregación de trombocitos, un conteo de trombocitos reducido, niveles reducidos de los factores V, Vlll y IX de coagulación, un nivel incrementado de trombin-antitrombin, un nivel incrementado de monómeros de fibrina, o un nivel incrementado de dímeros D.
3. 3. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque las células que expresan TF se cultivan antes de la implantación en el paciente.
4. 4. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque las células que expresan TF se introducen en el paciente por infusión en un vaso sanguíneo.
5. 5. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque las células que expresan TF se introducen en el paciente por infusión en una cavidad de la médula ósea.
6. 6. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque las células que expresan TF se introducen en el paciente por infusión en un espacio intrarticular, un músculo, la dermis o la cavidad peritoneal.
7. 7. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque las células que expresan TF se implantan en un aglomerante antes de la introducción en el paciente.
8. 8. El método según la reivindicación 7, caracterizado porque el aglomerante es un gel, colágeno o aglomerante que forma el hueso.
9. 9. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque las células que expresan TF se modifican genéticamente.
10. 10. El método según la reivindicación 9, caracterizado porque las células que expresan TF genéticamente modificas contienen una construcción de ADN que codifica un factor de coagulación.
11. 11. El método según la reivindicación 10, caracterizado porque el factor de coagulación es el factor Vlll o factor IX.
12. 12. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque el paciente tiene hemofilia.
13. 13. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque el paciente tiene cáncer.
14. 14. El método según la reivindicación 13, caracterizado porque el cáncer es cáncer de pecho.
15. 15. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque el paciente tiene osteogénesis imperfecta.
16. 16. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque las células que expresan TF se tratan al contactar las células con un oligonucleotido que inhibe la transcripción de un gen de factor de tejido, la estabilidad del ARN de factor de tejido, o la habilidad del ARN del factor de tejido para trasladarse en la proteína.
17. 17. El método según la reivindicación 16, caracterizado porque el oligonucleótido es una molécula de ácido ribonucleico.
18. 18. El método según la reivindicación 16, caracterizado porque el oligonucleótido codifica el motivo tripéptido Trp-Lys-Ser.
19. 19. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque las células que expresan TF se tratan al contactar las células con una ribozima que divide el ARN del factor de tejido.
20. 20. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque las células que expresan TF se tratan al contactar las célul s con un péptido, una molécula pequeña, un factor de coagulación modificado, una lipocortina, un lípido modificado, una apoliopoproteína, una fosfolipasa, o un polisacárido modificado que antagoniza TF.
21. 21. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque comprende además administrar al paciente un antagonista de TF en una cantidad eficaz para reducir los efectos vasculares adversos causados por TF.
22. 22. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque las células que expresan TF son células estromales de médula ósea.
23. 23. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque las células que expresan TF son células germinales mesenquimales.
24. 24. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque las células que expresan TF se tratan al contactar las células con un anticuerpo.
25. 25. El método según la reivindicación 24, caracterizado porque el anticuerpo se une específicamente al factor de tejido; un polipéptido que se une específicamente al factor de tejido; o un polipéptido que es activo en la cascada bioquímica que se inicia por la formación de un complejo entre el factor de tejido y el factor Vil.
26. 26. El método según la reivindicación 24, caracterizado porque el anticuerpo es TF1 -E2, TF1-F7, HTF1-7B8, TF8-5G9, TF8-11 D12, TF9-9C3, TF8-5G9, AP-1 , 5G9, PW-4, 231-7, hVII-B101/B1 , hVII-DC2/D4 o hVII-DC6/3D8.
27. 27. Un método para reducir el riesgo, o severidad, de un efecto vascular adverso en un paciente que se encuentra en una terapia en base a células que incluye introducir las células que expresan el Factor de Tejido (TF) en el paciente, el método comprendiendo introducir las células que expresan TF en el paciente; y administrar al paciente un antagonista que interactúa directamente con TF o una molécula de ácido nucleico que codifica TF en una cantidad eficaz para reducir efectos vasculares adversos causados por TF.
28. 28. El método según la reivindicación 27, caracterizado porque el antagonista de TF es un anticuerpo, un oligonucleótido antisensible a TF, un péptido, una molécula pequeña, un factor de coagulación modificado, una lipocortina, un lípido modificado, una apoliporoteína, una fosfolipasa, o un polisacárido modificado que antagoniza TF.
29. 29. El método según la reivindicación 27, caracterizado porque las células que expresan TF son células estromales de médula ósea.
30. 30. El método según la reivindicación 27, caracterizado porque las células que expresan TF son células germinales mesenquimales.
31. 31. Un método para inhibir los efectos vasculares adversos causados al introducir células que expresan TF en un paciente, el método comprendiendo reducir la carga total del factor de tejido biológicamente activo asociado con las células a introducirse al menos aproximadamente 25,000 ng/kg del peso del paciente, inhibiendo así los efectos vasculares adversos al introducir las células que expresan TF.
32. 32. El método según la reivindicación 31 , caracterizado porque la carga total del factor de tejido biológicamente activo asociado con las células es menor a aproximadamente 10,000 ng/kg del peso del paciente.
33. 33. El método según la reivindicación 31 , caracterizado porque la carga total del factor de tejido biológicamente activo asociado con las células es menor a aproximadamente 5,000 ng/kg del peso del paciente.
34. 34. El método según la reivindicación 31 , caracterizado porque la carga total del factor de tejido biológicamente activo asociado con las células es menor a aproximadamente 2,000 ng/kg del peso del paciente.
35. 35. El método según la reivindicación 31 , caracterizado porque las células que expresan TF son células estromales de médula ósea.
36. 36. El método según la reivindicación 31 , caracterizado porque las células que expresan TF son células germinales mesenquimales.
37. 37. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque el paciente es un mamífero.
38. 38. El método según ia reivindicación 37, caracterizado porque el mamífero es un humano.