KR20080113275A - 인간 단백질 타이로신 포스파타아제 베타(ｈｐｔｐ베타)에 결합하는 항체 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간 단백질 타이로신 포스파타아제 베타 (HPTPβ)에 결합하는 항체 및 그의 항원 결합 단편과, 그 용도에 관한 것이다.
인간, 단백질, 타이로신, 포스파타아제, 항체, 항원, 단편

Description

인간 단백질 타이로신 포스파타아제 베타(ＨＰＴＰ베타)에 결합하는 항체 및 그의 용도 {ANTIBODIES THAT BIND HUMAN PROTEIN TYROSINE PHOSPHATASE BETA (HPTPBETA) AND USES THEREOF}
본 발명은 인간 단백질 타이로신 포스파타아제 베타 (HPTP베타)에 결합하는 항체 및 그의 항원 결합 단편과, 그 용도에 관한 것이다.
기존의 혈관계(vasculature)로부터의 새로운 혈관의 발아(sprouting)인 혈관 형성(angiogenesis)은 광범위한 생리학적 및 병리학적 과정에서 중요한 역할을 한다 (문헌[Nguyen, L.L. et al, Int. Rev. Cytol., 204, 1-48, (2001)]). 혈관 형성은 혈관 내피 세포(endothelial cells that line blood vessels)와, 그 주변 환경 사이의 통신에 의해 매개되는 복잡한 과정이다. 혈관 형성의 초기 단계에서, 조직 또는 종양 세포는 저산소혈증과 같은 환경적 자극에 응답하여 전-혈관 형성 성장 인자(pro-angiogenic growth factor)를 생성 및 분비한다. 이들 인자는 내피 세포 근처에 확산되어 수용체를 자극하며, 이는 주변의 세포외 매트릭스를 분해시키는 프로테아제의 생성 및 분비에 이르게 된다. 활성화된 내피 세포는 이들 성장 인자 공급원을 향하여 주변 조직 내로 이동 및 증식하기 시작한다 (문헌[Bussolino, F., Trends Biochem. Sci, 22, 251-256, (1997)]). 이어서, 내피 세포는 증식을 중지하고, 관상 구조로 분화되는데, 이는 안정한 성숙 혈관의 형성에서 제1 단계이다. 후속적으로, 내피 주변 세포(periendothelial cell), 예를 들어 주피 세포(pericyte) 및 평활근 세포가 혈관 성숙을 향한 추가의 단계에서 새롭게 형성되는 혈관으로 동원된다.
혈관 형성은 자연 발생 전-혈관 형성 인자 및 항-혈관 형성 인자의 균형에 의해 조절된다. 혈관 내피 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, 및 안지오포이에틴(angiopoietin)은 많은 잠재적인 전-혈관 형성 성장 인자(pro-angiogenic growth factor) 중 약간을 대표한다. 이들 리간드는 내피 세포 표면 상의 그의 각각의 수용체 타이로신 키나아제에 결합하여 신호를 전달하며, 상기 신호는 세포 이동 및 증식을 촉진한다. 많은 조절 인자가 동정된 반면, 이 과정을 구동시키는 분자 기작은 여전히 완전하게 이해되지 못하고 있다.
지속적으로 비조절되거나 부적절하게 조절된 혈관 형성에 의해 유도되는 많은 질환 상태가 있다. 그러한 질환 상태에서, 비조절되거나 부적절하게 조절된 혈관 형성은 특정 질환을 야기하거나 기존의 병리학적 상태를 악화시킬 수 있다. 예를 들어 안내 신생 혈관 생성(ocular neovascularization)이 실명의 가장 일반적인 원인으로서 연루되었으며, 대략 20가지의 안질환의 병리(pathology)의 기초가 된다. 이전에 존재한 소정의 병, 예를 들어 관절염에서, 새롭게 형성된 모세 혈관은 관절에 침습하여 연골을 파괴한다. 당뇨병에서, 망막에서 형성된 새로운 모세 혈관은 유리체액에 침습하여 출혈 및 실명을 야기한다.
고형 종양의 성장 및 전이 둘 모두가 또한 혈관 형성 의존성일 수도 있다 (문헌[Folkman et al., "Tumor Angiogenesis," Chapter 10, 206-32, The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn et al., eds., W. B. Saunders, (1995)]). 직경이 2 ㎜ 초과로 증대되는 종양은 그 자신의 혈액 공급물을 얻어야 하며 새로운 모세 혈관의 성장을 유도함으로써 그렇게 한다는 것이 밝혀졌다. 이들 새로운 혈관이 종양 내에 매립되게 된 후, 상기 혈관은 종양 성장에 필수적인 영양소 및 성장 인자와, 종양 세포가 순환혈에 들어가 멀리 있는 부위, 예를 들어 간, 폐 또는 뼈를 전이시키는 수단을 제공한다 (문헌[Weidner, New Eng. J. Med., 324, 1, 1-8 (1991)]). 종양을 갖고 있는(tumor-bearing) 동물에서 약물로서 사용될 때, 혈관 형성의 천연 저해제는 작은 종양의 성장을 방지할 수도 있다 (문헌[O'Reilly et al., Cell, 79, 315-28 (1994)]). 몇몇 프로토콜에서, 그러한 저해제의 투여에 의해 심지어 치료의 중단 후에도 종양이 퇴행하고 휴면하게 된다 (문헌[O'Reilly et al., Cell, 88, 277-85 (1997)]). 게다가, 혈관 형성 저해제를 소정의 종양에 공급하면 다른 치료 요법에의 종양의 응답을 강화시킬 수도 있다 (예를 들어, 문헌[Teischer et al., Int. J. Cancer, 57, 920-25 (1994)] 참조).
많은 질환 상태가 지속적인, 비조절되거나 부적절하게 조절된 혈관 형성에 의해 구동되지만, 몇몇 질환 상태는 혈관 형성의 향상에 의해 치료될 수도 있다. 조직의 성장 및 복구(repair)는 세포 증식 및 혈관 형성이 일어나는 생물학적 사건(event)이다. 그와 같이, 창상 복구의 중요한 측면은 혈관 형성에 의한 손상된 조직의 혈관 재신생(revascularization)이다.
만성 비치유성 창상은 노령의 인구 집단에서 장기간 이환(prolonged morbidity)의 주요 원인이다. 이는 중증 비치유성 피부 궤양이 발병된 와상 또는 당뇨병 환자에서 특히 그러하다. 이러한 경우 중 많은 경우에서, 치유 지연은 계속적인 압력 또는 혈관 차단의 결과로서의 부적절한 혈액 공급의 결과이다. 소동맥 아테롬성 동맥 경화증 또는 정맥 울혈로 인한 불량한 모세 혈관 순환은 손상된 조직의 복구 실패에 기여한다. 그러한 조직은 병원성 유기체를 효과적으로 제거하기 위하여 혈관 신생이 잘 일어난 조직을 필요로 하는 고유한 신체 방어 시스템에 의해 챌린지되지 않는(unchallenged), 증식하는 미생물로 흔히 감염된다. 그 결과, 대부분의 치료적 처치(therapeutic intervention)는 허혈성 조직에의 혈액 유동 복원에 집중되며, 그럼으로써 영양소 및 면역학적 인자가 창상 부위에 접근하는 것을 허용한다.
대혈관에서의 아테롬성 동맥 경화 병변은 조직 허혈을 야기할 수도 있으며, 상기 허혈은 영향을 받은 조직에 대한 혈관 성장의 조정에 의해 개선될 수 있다. 예를 들어, 관상 동맥에서의 아테롬성 동맥 경화 병변은 협심증 및 심근 경색을 야기할 수도 있는데, 상기 협심증 및 심근 경색은 측부 동맥의 성장의 촉진에 의해 혈액 유동을 복원할 수 있을 경우 예방될 수 있다. 이와 유사하게, 하지에 공급되는 대동맥에서의 아테롬성 동맥 경화 병변은 골격근에서 허혈을 야기할 수도 있는데, 상기 허혈은 이동을 제한하고 몇몇 경우 절단을 필요로 하며, 이는 또한 혈관 형성 치료법으로 혈액 유동을 향상시킴으로써 예방될 수도 있다.
당뇨병 및 고혈압과 같은 다른 질환은 세동맥 및 모세 혈관과 같은 소혈관의 개수 및 밀도의 감소를 특징으로 한다. 이들 소혈관은 산소 및 영양소의 전달에 중요하다. 이들 혈관의 개수 및 밀도의 감소는 파행, 허혈성 궤양, 가속성 고혈압, 및 신부전을 비롯한 고혈압 및 당뇨병의 불리한 결과에 기여한다. 이들 일반적인 질병 및 많은 다른 덜 일반적인 병, 예를 들어 버거스병(Burgers disease)은 혈관 형성 치료법을 사용하여 소혈관의 개수 및 밀도를 증가시킴으로써 개선될 수 있다.
그와 같이, 혈관 형성의 조절자를 동정하는 것이 계속적으로 필요하다.
전술한 내용에 비추어 보면, 혈관 형성 매개된 질병의 치료에서 생화학적 표적을 동정하는 것이 필요하다. 그러나, 혈관 형성은 다수의 성장 인자 및 그의 동족(cognate) 수용체 타이로신 키나아제(receptor tyrosine kinase, RTK)의 작용을 포함한다 (문헌[Yancopoulos et al., Nature, 407,242-248, 2000]). 예를 들어, 혈관 내피 성장 인자(VEGF)는 배아 혈관계에서 내피 세포가 발생기 혈관(nascent blood vessel)으로 분화하는 데 중요하다. 또한, VEGF는 성체 혈관계에서 혈관 발달을 향상시킨다. 외인성 VEGF의 투여는 측부 혈관계의 발달을 향상시키며, 허혈성 조직으로의 혈액 유동을 개선시킨다.
현재까지, 3가지의 VEGF RTK, VEGFR1 (FLT-1), VEGFR2 (KDR), 및 VEGFR3 (FLT-4)이 동정되었다. 이들 수용체는 생화학적 특성화 및 생물학적 활성에 기초하면 고도로 보존되어 있지만, 각각은 특이적인 그리고 중복되지 않는 기능을 갖는다. 3가지의 상기 수용체 중, VEGFR2는 발달 중인 혈관계에서 그리고 성체에서의 혈관 형성 동안 VEGF 작용의 매개에서 주된 역할을 하는 것으로 여겨진다. 그러나, VEGFR1 및 VEGFR3 둘 모두는 배아 혈관계의 정상적인 발달에 필요하며, 또한, 성체 조직에서 혈관 형성에 중요할 수 있다. VEGF 결합 및 이량체화시에, VEGFR2 키나아제 도메인의 구조 변화(conformational change)는 그의 키나아제 활성을 향상시키며, 이는 특정한 타이로신 잔기 상에서의 상기 쌍의 다른 구성원의 "자가인산화"로 이어진다. 이들 자가인산화 사건은 키나아제 활성을 추가로 향상시키는 역할을 하며, 세포내 신호 전달 분자들(signaling molecules)의 회합을 위한 고정점(anchor point)을 제공한다.
그러나, 단일한 혈관 형성 경로의 활성화는 적당한 관류를 허혈성 조직에 제공하는 지속성 및 기능성 혈관을 생성하기에 충분하지 않을 수도 있다. 이러한 발견은, 다수의 RTK가 배아 혈관계의 어셈블리에 연루되어 있다는 사실과 함께, 다수의 혈관 형성 경로를 조정하는 생화학적 표적이 단일한 성장 인자의 투여에 비하여 이점을 가질 것임을 나타내는 것이다.
단백질 타이로신 포스파타아제(PTP)는 포스포타이로신 잔기를 포함하는 단백질을 탈인산화시키는 밀접하게 관련된 효소들의 큰 패밀리를 포함한다. 최근의 증거는, PTP의 한 가지 기능이 RTK의 인산화 및 활성화를 제한하는 것임을 시사하고 있다. 예를 들어, 저분자량 단백질 타이로신 포스파타아제인 HCPTPA는 VEGFR2와 회합하여, 배양된 내피 세포에서 그의 활성화 그리고 혈관 형성 분석에서 그의 생물학적 활성을 부정적으로 조절함이 밝혀졌다 (문헌[Huang et al., Journal of Biological Chemistry, 274, 38183-38185, 1999]).
VEGFR2 외에, 다른 RTK로부터의 신호 입력체(signaling input)인, 안지오포이에틴(Ang1 및 Ang2)의 수용체, Tie-2도 중요하다. 생쥐에서 Ang1 또는 Tie-2 유 전자 중 어느 하나를 결실시키면 발달 중인 혈관계에서의 이상에 대하여 이차적인 배아 치사로 이어질 수도 있다 (문헌[Yancopoulos et al., Nature, 407, 242-248, 2000]). 더욱이, 피부에서의 Ang1의 과다 발현은 피부 혈관계를 증가시키며, 외인성 Ang1의 투여는 허혈성 골격근으로의 혈액 유동을 증가시킨다 (문헌[Suri et al., Science, 282, 468-471, 1998]). 게다가, 암의 동물 모델에서 Tie-2의 활성화의 저해는 혈관 형성을 저해하며, 종양 진행을 제한한다 (문헌[Lin et al., J Clin. Invest., 100, 2072-2078, 1997]). Ang1의 외인성 투여에 의한 Tie-2의 활성화는, 그의 혈관 형성 활성 외에, VEGF 매개된 혈관 누출 및 전-염증 효과를 차단하지만, 그의 혈관 형성 효과는 향상시킨다 (문헌[Thurston et al., Nature Medicine, 6, 460-463, 2000]). 따라서, 둘 모두의 VEGFR2 및 Tie-2의 신호 전달을 조정하는 생물학적 표적은 탁월한 전-혈관 형성 또는 항-혈관 형성 치료법을 생성할 수 있다.
HPTP베타 (처음에 문헌[Kruegar et al., EMBO J., 9, (1990)]에 개시됨)는 안지오포이에틴 수용체형 타이로신 키나아제 Tie-2의 활성을 조정하는 것에 대하여 제안되었다 (예를 들어, 국제특허 공개 WO 00/65088호). HPTP베타는 또한 VEGFR2의 활성을 조절하는 것에 대하여 제안되었다 (예를 들어, 미국 특허 공개 제2004/0077065호).
HPTP베타의 활성을 선택적으로 조절하고 그럼으로써 혈관 형성 신호 전달을 향상시키고/시키거나, 혈관 성장 (혈관 형성)을 촉진하고/하거나, 허혈성 조직에서 혈액 유동을 증가시키거나, 또는 혈관 형성 신호 전달을 감소시키고/시키거나, 혈 관 성장을 감소시키고/시키거나 영향을 받은 조직으로의 혈액 유동을 감소시키는 항체, 예를 들어, 인간화 단일 클론 항체를 개발하는 것이 바람직하다. 본 발명에서는 HPTP베타에 결합하여 혈관 형성 세포 신호 전달을 조절하고, 이는 다시 혈관 형성을 조절하는 항체 및 그 단편이 개시된다.
발명의 개요
본 발명은 인간 단백질 타이로신 포스파타아제 베타 HPTP베타에 결합하며, 그럼으로써 혈관 형성 세포 신호 전달을 조절하고, 이는 다시 혈관 형성을 조절하는 항체에 관한 것이다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 인간 단백질 타이로신 포스파타아제 베타에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이며, 여기서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 혈관 형성 세포 신호 전달을 조절하고, 이는 다시 혈관 형성을 조절한다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 인간 단백질 타이로신 포스파타아제 베타의 N-말단 부분에 결합하는 항체에 관한 것이다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 인간 단백질 타이로신 포스파타아제 베타의 제1 FN3 반복체에 결합하는 항체에 관한 것이다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 서열 번호 11에 나타낸 서열 또는 그의 일부분을 갖는, 인간 단백질 타이로신 포스파타아제 베타의 제1 FN3 반복체에 결합하는 항체에 관한 것이다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 단일 클론 항체인 항체에 관한 것이다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 단일 클론 항체 R15E6 (미국 20108 버지니아주 마나사스 피.오. 박스 1549 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection, ATCC)에 2006년 5월 4일자로 기탁되고 ATCC 수탁 번호 PTA-7580이 할당된, 생쥐 하이브리도마(hybridoma), Balbc 비장 세포 (B 세포))인 항체에 관한 것이다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 R15E6과 동일하거나 사실상 동일한 생물학적 특징을 갖는 항체에 관한 것이다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 항체 또는 항원 결합 단편이 인간화된 항체에 관한 것이다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 단일 클론 항체 R15E6 유래의 항원 결합 영역 잔기를 포함하며 인간화된 항체에 관한 것이다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 항체의 항원 결합 단편에 관한 것이며, 여기서, 상기 단편은 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함한다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 Fv 단편, Fab 단편, Fab' 단편 및 F(ab')2 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체의 항원 결합 단편에 관한 것이다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 대상에서 혈관 형성 조절된 질병을 치료하는 방법에 관한 것이며, 이는 혈관 형성의 조절이 필요한 대상을 확인하는 단계; 및 HPTP베타에 결합하여 혈관 형성을 조절하는 유효량의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 대상에게 투여하는 단계를 포함한다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 혈관 형성 상승된 질병이며 당뇨병성 망막증, 황반 변성, 암, 겸상 적혈구 빈혈증, 사르코이드, 매독, 탄성섬유 가황색종, 파제트병(Paget's disease), 정맥 폐쇄, 동맥 폐쇄, 경동맥 폐색성 질환, 만성 포도막염/유리체염, 미코박테리아 감염(mycobacterial infection), 라임병(Lyme's disease), 전신성 홍반성 루푸스, 미숙아 망막증, 일스병(Eales' disease), 베체트병(Behcet's disease), 망막염 또는 맥락막염을 야기하는 감염, 추정 눈 히스토플라스마증(presumed ocular histoplasmosis), 베스트병(Best's disease), 근시, 시신경 유두소와(optic pits), 스타르가르트병(Stargardt's disease), 평면부염, 만성 망막 박리, 고점도 증후군, 톡소플라스마증, 외상 및 레이저 후 합병증, 루베오시스(rubeosis)와 관련된 질환, 및 증식성 유리체 망막증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈관 형성 조절된 질병을 대상에서 치료하는 방법에 관한 것이다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 혈관 형성 상승된 질병이며, 당뇨병성 망막증, 황반 변성, 암, 류마티스 관절염, 혈관종, 오슬러-웨버-렌두병(Osler-Weber-Rendu disease), 또는 유전성 출혈성 모세혈관 확장증, 및 고형 또는 혈인성(blood borne) 종양을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 군으로부터 선택되는 혈관 형성 조절된 질병을 대상에서 치료하는 방법에 관한 것이다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 혈관 형성 상승된 질병이며, 염증성 장질환, 예를 들어 크론병 및 궤양성 대장염, 건선, 사르코이드증, 류마티스 관절염, 혈관종, 오슬러-웨버-렌두병, 또는 유전성 출혈성 모세 혈관 확장증, 고형 또는 혈인성 종양 및 후천성 면역 결핍 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈관 형성 조 절된 질병을 대상에서 치료하는 방법에 관한 것이다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 혈관 형성 감소된 질병이며, 골격근 또는 심근 허혈, 뇌졸중, 관상 동맥 질환, 말초 혈관 질환, 관상 동맥 질환, 뇌혈관 질환, 당뇨병성 신경병증 및 창상 치유를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 군으로부터 선택되는 혈관 형성 조절된 질병을 대상에서 치료하는 방법에 관한 것이다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 혈관 형성 감소된 질병이며, 골격근 및 심근 허혈, 뇌졸중, 관상 동맥 질환, 말초 혈관 질환, 관상 동맥 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈관 형성 조절된 질병을 대상에서 치료하는 방법에 관한 것이다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 말초 혈관 질환인 혈관 형성 감소된 질병을 대상에서 치료하는 방법에 관한 것이다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 관상 동맥 질환인 혈관 형성 감소된 질병을 대상에서 치료하는 방법에 관한 것이다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 인간 단백질 타이로신 포스파타아제 베타에 결합하는 항체 또는 그 단편; 및 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 인간 단백질 타이로신 포스파타아제 베타에 결합하며, 단일 클론 항체 R15E6인 항체 또는 그 단편; 및 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 인간 단백질 타이로신 포스파타아제 베타에 결합하며, R15E6과 동일하거나 사실상 동일한 생물학적 특징을 갖는 단일 클론 항체인 항체 또는 그 단편; 및 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 인간 단백질 타이로신 포스파타아제 베타에 결합하며, 인간화된 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 및 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 인간 단백질 타이로신 포스파타아제 베타에 결합하며, 단일 클론 항체 R15E6 유래의 항원 결합 영역 잔기를 포함하고, 인간화된 항체 또는 그 단편; 및 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다.
도 1. HPTPβ ECD 단백질의 디자인 및 생성. (패널 A) 전장 HPTPβ 및 HPTPβ 세포외 도메인-6His 융합 단백질의 개략도. (패널 B) βECD-6His의 발현을 유도하는 벡터로 트랜스펙션된 HEK293 세포 유래의 상청액을 로딩한 Ni-NTA 컬럼으로부터의 이미다졸 용출물의 은 염색. HPTPβ 세포외 도메인-6His 단백질과 일치하는 단일한 고분자량 밴드가 검출된다.
도 2. R15E6은 내피 세포 상의 내인성 HPTPβ를 인식한다. (패널 A) 내피 세포 용해물은 대조 항체(레인 1), R15E6 (레인 2), 또는 항-Tie2 및 항-VEGFR2 항체의 혼합물(레인 3)을 이용하여 면역침전시킨다. 면역침전물을 SDS-PAGE로 분리하고, PVD 막으로 옮기고, R15E6, 항-Tie2 및 항-VEGFR2 항체의 혼합물을 이용하여 웨스턴 블롯(western blot)으로 프로빙한다. HPTPβ와 일치하는 단일한 고분자량 주 밴드가 R15E6 (레인 2)에서 보이지만, 대조 항체 (레인 1), 또는 항-Tie2 및 항-VEGFR2의 혼합물 (레인 3)에서는 보이지 않는다. (패널 B) 내피 세포는 R15E6 (백색 피크)을 이용하거나 일차 항체 대조가 없는 것(흑색 피크)을 이용하여 FACS 분석한다. 형광에서의 활발한 이동은, R15E6이 온전한 내피 세포의 표면 상의 HPTPβ에 결합함을 나타낸다.
도 3. R15E6은 HUVEC에서 Tie2 수용체 활성화를 향상시킨다. Tie2 활성화는 실시예 4에 설명된 바와 같이 인간 내피 세포에서 측정한다. R15E6은 기본 및 Ang1-유도된 Tie2 활성화 둘 모두를 용량 의존적으로 향상시킨다.
도 4. R15E6은 HUVEC 생존률을 향상시킨다. 혈청 기아 처리된(serum starved) 인간 내피 세포의 생존률을 실시예 4에 설명된 바와 같이 측정한다. R15E6은, Tie2 활성화에 대한 그의 영향과 일치하게, 기본 및 Ang1-유도된 내피 세포의 생존률 둘 모두를 용량 의존적으로 향상시킨다 (패널 A). 더욱이, R15E6은 VEGF 및 FGF-매개된 내피 세포의 생존률도 용량 의존적으로 향상시킨다 (패널 B 및 C). 대조 항체는 내피 세포 생존률을 향상시키지 못한다 (패널 D).
도 5. R15E6은 HUVEC 이동을 향상시킨다. 인간 내피 세포의 이동은 실시예 4에 설명된 바와 같이 측정된다. R15E6은 기본 및 VEGF-유도된 내피 세포 이동 둘 모두를 용량 의존적으로 향상시킨다.
도 6. R15E6은 HUVEC/비드 발아 분석에서 모세 혈관 형태 형성(capillary morphogenesis)을 향상시킨다. 인간 내피 세포의 모세 혈관 형태 형성은 실시예 4 에 설명된 바와 같이 비드 발아 분석에서 측정된다. R15E6은 기본 및 VEGF-유도된 내피 세포 모세 혈관 형태 형성 둘 모두를 향상시킨다.
도 7. 웨스턴 블롯 분석에 의하면 R15E6 결합 에피토프는 HPTPβ 세포외 도메인의 N-말단 FN3 반복체에 국소화된다. (패널 A) 웨스턴 분석에 의하면, R15E6은 C-말단 절단(truncation) 돌연변이체들 모두에 결합하는데, 이는 상기 결합 에피토프가 N-말단의 2개의 FN3 반복체 내에 위치함을 입증하는 것이다. (패널 B) 생쥐/인간 키메라 단백질의 분석에 의하면, R15E6 결합 에피토프는 HPTPβ N-말단 FN3 반복체에 추가로 국소화된다.
도 8. MSD 분석에 의해 HPTPβ 세포외 도메인의 N-말단 FN3 반복체에 대한 R15E6 결합 에피토프의 국소화가 확인된다. (패널 A) MSD 분석에 의하면, R15E6은 C-말단 절단 돌연변이체들 모두에 결합하는데, 이는 상기 결합 에피토프가 N-말단의 2개의 FN3 반복체 내에 위치함을 확인하는 것이다. (패널 B) 생쥐/인간 키메라 단백질의 분석에 의하면, HPTPβ N-말단 FN3 반복체에 대한 R15E6 결합 에피토프의 국소화가 추가로 확인된다.
도 9. MSD 분석에 의하면, 1가 R15E6 Fab 단편이 또한 HPTPβ의 N-말단 FN3 반복체에 결합함이 입증된다. (패널 A) 온전한 R15E6 항체와 유사하게, R15E6 Fab 단편은 C-말단 절단 돌연변이체들 모두에 결합하며, 이는 상기 결합 에피토프가 N-말단의 2개의 FN3 반복체 내에 위치함을 확인하는 것이다. (패널 B) 생쥐/인간 키메라 단백질의 분석에 의하면, R15E6 Fab 단편의 결합 에피토프는 HPTPβ N-말단 FN3 반복체에 추가로 국소화된다.
도 10. 1가 R15E6 Fab 단편은 Tie2 활성화를 향상시키지 못하며, 온전한 R15E6에 의한 Tie2 활성화를 차단시킨다.
도 11. R15E6 Fab 단편은 내피 세포 생존을 강력하게 저해한다. (패널 A) 대조 Fab 단편과 비교하여, R15E6 Fab 단편은 내피 세포 생존을 강력하게 저해한다. (패널 B) R15E6 Fab 단편의 저해 효과는 온전한 R15E6과의 경쟁에 의해 구제된다(rescued).
도 12. R15E6 Fab 단편은 VEGF 매개된 내피 세포 이동을 저해한다.
서열 목록 설명
서열 목록의 뉴클레오티드 및 단백질 서열 각각은, 적용가능할 경우 상응하는 젠뱅크(Genbank) 또는 더웬트(Derwent) 등록 번호(들)와, 그가 유래하는 종과 함께 표 I에 예시되어 있다.
Figure 112008076210682-PCT00001
본 발명은 HPTP베타에 결합하는 항체 및 그 용도에 관한 것이다.
표준 기술이 재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성, 및 조직 배양 및 형질전환에 사용될 수 있다 (예를 들어, 전기천공, 리포펙션(lipofection)). 효소 반응 및 정제 기술은 제조업자의 명세 사항에 따라 또는 당업계에서 일반적으로 성취되는 바와 같이 또는 본 명세서에 설명된 바와 같이 수행될 수 있다. 상기 기술 및 절차는 일반적으로 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 그리고 본 명세서 전체에 걸쳐 인용되고 논의되는 다양한 일반적인 그리고 보다 구체적인 참고 문헌에 설명된 바와 같이 수행된다. 특정한 정의가 제공되지 않는 한, 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 본 명세서에 기재된 의약품 화학(medicinal and pharmaceutical chemistry)과 관련하여 이용되는 명명법 및 그의 실험 절차 및 기술은 당업계에서 공지되고 일반적으로 사용되는 것이다. 표준 기술이 화학 합성, 화학 분석, 약학 제제, 제형, 및 전달과, 환자의 치료에 사용될 수 있다.
달리 나타내지 않는 한, 하기 용어는 하기의 의미를 갖는 것으로 이해된다:
본 명세서에서 "단백질"은 펩티드 및 폴리펩티드와 서로 바꾸어서 사용될 수 있다. HPTP베타는 서열 목록에 정의된 바와 같이 인간 단백질 타이로신 포스파타아제이다. 몇몇 실시 형태에서, HPTP베타의 다양한 단편이 사용된다. 하기에 설명되는 바와 같이, HPTP베타 단백질 및 유전자의 동족체, 오르토로그(ortholog), 단편, 변이체 및 돌연변이체는 용어 "HPTP베타"의 범주 이내인 것으로 간주된다.
"단편"은 뉴클레오티드 또는 단백질 서열의 일부분을 의도한다. 단편은 천연 단백질의 생물학적 활성을 보유할 수도 있다. 뉴클레오티드 서열의 단편은 혼성화 프로브 및 프라이머로서, 또는 유전자, 예를 들어 안티센스(antisense), siRNA, 또는 마이크로 RNA의 발현을 조절하는 데 또한 유용하다. 생물학적 활성 부분은 본 발명의 뉴클레오티드 서열들 중 하나의 일부분을 단리하는 단계, 코딩된 부분을 (예를 들어 시험관내에서의 재조합 발현에 의해) 발현시키는 단계, 및 코딩된 단백질의 활성을 평가하는 단계에 의해 제조될 수 있다.
당업자는, 서열 목록에 열거된 것 이외의 종, 특히 척추 동물 종 유래의 유전자 및 단백질이 유용할 수 있음을 또한 인지할 것이다. 그러한 종은 생쥐, 쥐, 기니아 피그(guinea pig), 토끼, 개, 돼지, 염소, 소, 원숭이, 침팬지, 양, 햄스터, 및 제브라피시를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 당업자는, 공지된 종의 서열로부터의 프로브를 사용함으로써, 공지된 서열에 상동성인 cDNA 또는 게놈 서열이 공지된 클로닝 방법에 의해 동일하거나 또 다른 종으로부터 수득될 수 있음을 또한 인지할 것이다. 그러한 동족체 및 오르토로그는 본 발명의 실시에 유용한 것으로 고려된다.
"변이체"는 유사한 서열을 의도한다. 예를 들어, 보존적 변이체(conservative variant)는, 유전 암호의 축퇴성(degeneracy) 때문에 본 발명의 폴리펩티드들 중 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 서열을 포함할 수도 있다. 자연 발생 대립 형질 변이체, 및 스플라이스(splice) 변이체는 공지된 기술을 사용하여, 예를 들어 폴리머라아제 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR), 단일 뉴클레오티드 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 분석, 및 혼성화 기술을 이용하여 동정할 수 있다. 오르토로그 및 동족체의 단리를 위해서는, 특정 서열, 서열 길이, 구아닌 + 시토신 (GC) 함량 및 기타 파라미터에 의해 지시되는 일반적으로 엄격한 혼성화 조건이 이용된다. 또한, 변이체의 뉴클레오티드 서열은 예를 들어 특정 부위 돌연변이 유발(site-directed mutagenesis)의 이용에 의해 유래되는, 합성에 의해 유래되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 변이체는 단독의 또는 다른 서열과 조합된, 게놈 유전자좌 유래의 추가의 서열을 포함할 수도 있다.
본 발명의 분자는 리간드 결합 또는 신호 전달에 필요하지 않은 단백질의 영역들이 결실되거나 변형된 절단 및/또는 돌연변이된 단백질도 포함한다. 이와 유사하게, 본 발명의 분자는 그의 리간드 결합 또는 신호 전달 활성이 변경되도록 돌연변이될 수도 있다. 그러한 돌연변이는 아미노산 또는 단백질 도메인의 비-보존적 돌연변이, 결실 또는 부가를 포함할 수도 있다. 변이 단백질은 생물학적 활성을 보유할 수도 있고 보유하지 않을 수도 있다. 그러한 변이체는, 예를 들어 유전자 다형성 또는 인간의 조작에서 생길 수도 있다.
융합 단백질도 본 발명에서 고려된다. 공지된 방법을 이용하여, 당업자는 본 발명의 단백질의 융합 단백질을 제조할 수 있으며, 이는 천연 형태와는 상이하지만 유용할 수 있다. 예를 들어, 융합 파트너는 번역과 동시에 또는 번역 후 단백질을 이의 합성 부위로부터 또 다른 부위로 전달시키는 신호(또는 리더(leader)) 폴리펩티드 서열(예를 들어, 효모 α-인자 리더)일 수도 있다. 대안적으로, 융합 파트너는 본 발명의 단백질의 정제 또는 동정을 돕기 위하여 부가될 수도 있다 (예를 들어, 폴리-His, Flag 펩티드 또는 형광 단백질).
용어 "항원"은 선택적 결합 에이전트(agent), 예를 들어 항체가 결합할 수 있는 분자 또는 분자의 일부분을 말하며, 추가적으로 동물에서 사용되어 상기 항원의 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 생성할 수 있다. 항원은 하나 이상의 에피토프를 가질 수도 있다.
용어 "에피토프"는 면역글로불린 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 항원 결정부위(antigenic determinant), 바람직하게는 폴리펩티드 결정부위를 포함한다. 소정의 실시 형태에서, 에피토프 결정부위는 화학적 활성 표면 단(grouping), 예를 들어 아미노산, 당, 지질, 포스포릴 또는 설포닐을 포함하며, 소정의 실시 형태에서는 특정한 3차원 구조 특징 및/또는 특정한 전하 특징을 가질 수도 있다. 에피토프는 항체가 결합하는 항원 영역이다. 소정의 실시 형태에서, 항체는 단백질 및/또는 거대분자의 복합 혼합물에서 그의 표적 항원을 우선적으로 인식할 때 항원에 특이적으로 결합한다고 한다. 또한, 항체는 항원에 대하여 다른 관련 및/또는 비관련 분자보다 더 큰 친화성을 나타낼 때 항원에 특이적으로 결합한다고 한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "항체" (Ab)는, 원하는 생물학적 활성, 예를 들어 항원-결합 활성을 나타내기만 한다면, 단일 클론 항체, 다클론 항체, 다중-특이성 항체 (예를 들어, 2특이성 항체), 단쇄 항체, 예를 들어 라마 및 낙타 유래의 항체, 항체 단편, 예를 들어 가변 영역 및/또는 불변 영역 단편을 포함한다. 용어 "면역글로불린"(Ig)은 본 명세서에서 "항체"와 서로 바꾸어서 사용될 수 있다.
"단리된 항체"는 그의 천연 환경으로부터 동정 및/또는 분리 및/또는 회수된 것이다.
기본적인 4개-사슬(four-chain) 항체 단위는 2개의 동일한 경쇄(L chain) 및 2개의 동일한 중쇄(H chain)로 구성된 헤테로사량체형(heterotetrameric) 당단백질이다 (IgM 항체는 5개의, J 사슬로 불리는 추가의 폴리펩티드와 함께인 기본적인 헤테로사량체 단위로 이루어지며, 따라서, 10개의 항원 결합 부위를 포함하는 반면, 분비형 IgA 항체는 2-5개의, J 사슬과 함께인 기본적인 4개-사슬 단위를 포함하는 다가 조립체를 형성하도록 중합될 수 있음). IgG의 경우, 4개-사슬 단위는 일반적으로 약 150 킬로달톤(kDa)이다. 각각의 L 사슬은 1개의 다이설파이드 공유 결합에 의해 H 사슬에 결합되는 반면, 2개의 H 사슬은 H 사슬 아이소타입(isotype)에 따라 하나 이상의 다이설파이드 결합에 의해 서로에게 결합된다. 각각의 H 및 L 사슬은 또한 규칙적으로 이격된 사슬내 다이설파이드 가교(bridge)를 갖는다. 각각의 H 사슬은 N-말단에 가변 도메인(VH), 이어서 α 및 γ 사슬 각각에 있어서 3개의 불변 도메인(CH)과, μ 및 ε 아이소타입에 있어서 4개의 CH 도메인을 갖는다. 각각의 L 사슬은 N-말단에 가변 도메인(VL), 이어서 그의 다른 말단에 불변 도메인(CL)을 갖는다. VL은 VH와 일직선으로 정렬되며 CL은 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)과 일직선으로 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이에서 인터페이스(interface)를 형성하는 것으로 여겨진다. VH 및 VL이 함께 쌍을 형성하는 것에 의해 단일 항원-결합 부위가 형성된다. 상이한 클래스의 항체의 구조 및 특성에 대해서는, 예를 들어 문헌[Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, 1994, page 71 and Chapter 6]을 참조하라.
임의의 척추 동물 종 유래의 L 사슬은 그의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파 및 람다로 불리는 2가지의 명확하게 특유한 타입들 중 하나에 할당될 수도 있다. 면역글로불린은, 그의 중쇄의 불변 도메인(CH)의 아미노산 서열에 따라, 상이한 클래스 또는 아이소타입에 할당될 수도 있다. 5가지의 면역글로불린 클래스, IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 있으며, 이는 각각 α, δ, ε , γ 및 μ로 표기되는 중쇄를 갖는다. γ 및 α 클래스는 CH의 서열 및 기능의 상대적으로 중요하지 않은 차이를 기초로 하여 서브클래스로 추가로 나뉘어지며, 예를 들어, 인간은 하기의 서브클래스: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2를 발현한다.
낙타과(Camelidae family)의 구성원, 예를 들어, 라마, 낙타, 및 단봉 낙타(dromedary)는 경쇄가 없고, CH1 도메인이 추가로 결여된 독특한 타입의 항체를 포함한다 (문헌[Muyldermans, S., Rev. Mol. Biotechnol., 74, 277-302 (2001)]). 이들 중쇄 가변 영역의 항체는 VHH 또는 VHH로 칭하며, 기능성 면역글로불린으로부터 유래되는 최소의 이용가능한 온전한 항원 결합 단편 (15 kDa)을 구성한다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 소정 절편이 항체들 중에서 서열이 광범위하게 상이한 사실을 말한다. V 도메인은 항원 결합을 매개하며, 특정 항체의 그의 항원에 대한 특이성을 한정한다. 그러나, 가변성은 가변 도메인의 110개-아미노산 스팬(span)을 가로질러 고르게 분포하지 않는다. 대신, V 영역은 15-30개 아미노산의 프레임워크 영역(framework region, FR)으로 불리는 상대적으로 불변성의(invariant) 스트레치로 이루어지며, 이는 각각의 길이가 9-12개 아미노산인 "초가변 영역(hypervariable region)"으로 불리는 극도로 가변성인 보다 짧은 영역에 의해 분리된다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 각각은 4개의 FR을 포함하며, 상기 FR은 주로 β-시트 형상(configuration)을 채용하고, 3개의 초가변 영역에 의해 연결되는데, 상기 초가변 영역은 β-시트 구조를 연결하고 몇몇 경우 상기 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각각의 사슬에서의 초가변 영역은 FR에 의해 근접하게 결합되며, 다른 사슬 유래의 초가변 영역에서는, 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다. 불변 도메인은 항체의 항원에의 결합에 직접 연루되지 않지만, 항체 의존성 세포 독성(antibody dependent cellular cytotoxicity, ADCC)에의 항체의 참여와 같은 다양한 이펙터(effector) 기능을 나타낸다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "초가변 영역"은 항원 결합에 책임이 있는 항체의 아미노산 잔기를 말한다. 초가변 영역은 일반적으로 "상보성 결정 영역(complementarity determining region)" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 (예를 들어, VL 중의 대략 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3)쯤, 그리고 VH 중의 대략 1-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3)쯤; 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]) 및/또는 "초가변 루프"로부터의 잔기를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "단일 클론 항체"는 사실상 균일한 항체의 집단으로부터 얻어지는 항체를 말하며, 즉, 상기 집단에 포함되는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수도 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 상이한 에피토프에 대하여 유도된 상이한 항체를 포함하는 다클론 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 단일 클론 항체는 단일 에피토프, 즉, 단일 항원 결정부위에 대하여 유도된다. 단일 클론 항체는, 그의 특이성 외에, 다른 항체로 오염되지 않게 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 수식어 "단일 클론"은 임의의 특정한 방법에 의한 항체 제조를 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 유용한 단일 클론 항체는 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 박테리아, 진핵 동물 또는 식물 세포에서 재조합 DNA 방법을 이용하여 제조될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 참조). "단일 클론 항체"는 또한 이용가능한 기술, 예를 들어 문헌[Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)]의 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
본 발명의 단일 클론 항체는, 원하는 생물학적 활성을 나타내기만 한다면, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상기 서열에 대하여 상동성인 반면, 당해 사슬(들)의 나머지는 다른 종으로부터 유래되거나 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상기 서열에 대하여 상동성인 "키메라" 항체와, 그러한 항체의 단편을 포함한다 (미국 특허 제4,816,567호 및 문헌[Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851-6855 (1984)] 참조).
"항체 단편"은 다량체형 항체의 일부분, 바람직하게는 온전한 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, Fab 콘쥬게이트의 이량체 및 삼량체, Fv, scFv, 미니항체(minibody); 다이아바디(diabody), 트라이아바디(triabody) 및 테트라바디; 선형 항체(linear antibody)를 포함한다 (문헌[Hudson et al, Nature Med. 9, 129-134 (2003)] 참조).
"Fv"는 완전한 항원 결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편이다. 이 단편은 타이트한 비-공유 회합 상태로 있는 하나의 중쇄 가변 영역 도메인 및 하나의 경쇄 가변 영역 도메인의 이량체로 이루어진다. 이들의 폴딩(folding)으로부터, 두 도메인에서 6개의 초가변 루프 (각각 H 및 L 사슬로부터 3개의 루프)가 나오며, 상기 루프는 항원 결합을 위한 아미노산 잔기들을 주고 항원 결합 특이성을 항체에 부여한다. 그러나, 심지어 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 단지 3개의 CDR을 포함하는 Fv의 절반)은 항원을 인식하여 그에 결합하는 능력을 가지며, 따라서, Fv의 정의 내에 포함된다.
"sFv" 또는 "scFv"로도 약칭되는 "단쇄 Fv"는 단일한 폴리펩티드 사슬로 연결된 VH 및 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편이다. 바람직하게는, sFv 폴리펩티드는 VH 및 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함하며, 상기 링커는 sFv가 항원 결합에 있어서 원하는 구조를 형성하는 것을 가능하게 한다.
용어 "다이아바디, 트라이아바디 및 테트라바디"는, V 도메인들의 사슬내 쌍 형성이 아닌 사슬간 쌍 형성이 달성되어 다가 단편을 생성하도록 VH 및 VL 도메인 사이에 짧은 링커 (약 5-10개의 잔기)를 포함하는 sFv 단편을 제작함으로써 제조되는 작은 항체 단편을 말한다.
용어 "인간화 항체" 또는 "인간 항체"는 비-인간 종 (예를 들어, 생쥐) 유래의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하지만, VH 및/또는 VL 서열 중 적어도 일부분은 보다 "인간과 유사"해지도록, 즉, 인간 생식세포 계열(germline) 가변 서열과 보다 유사하도록 변경된 항체를 말한다. 인간화 항체의 한 가지 타입은 CDR-그래프팅된(grafted) 항체이며, 여기서, 인간 CDR 서열은 비-인간 VH 및 VL 서열 내로 도입되어 상응하는 비-인간 CDR 서열을 대체한다. 키메라형의 CDR-그래프팅된 그리고 인간화된 항체의 제조 수단은 당업자에게 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 및 미국 특허 제5,225,539호 참조). 인간 항체의 한 가지 제조 방법에서는 트랜스제닉(transgenic) 동물, 예를 들어 트랜스제닉 생쥐의 사용이 이용된다. 이들 트랜스제닉 동물은 상당한 부분의 인간 항체 생성 게놈이 그 자신의 게놈 내로 삽입된 것을 포함하며, 이 동물 자신의 내인성 항체 생성은 항체의 생성에서 부족해지게 된다. 그러한 트랜스제닉 동물의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 그러한 트랜스제닉 동물은 제노마우스(XenoMouse)RTM 기술을 이용하여 또는 "미니로커스(minilocus)" 접근법을 이용하여 제조될 수 있다. 제노마우스RTM의 제조 방법은 미국 특허 제6,162,963호, 미국 특허 제6,150,584호, 미국 특허 제6,114,598호 및 미국 특허 제6,075,181호에 개시되어 있다. "미니로커스" 접근법을 이용한 트랜스제닉 동물의 제조 방법은 미국 특허 제5,545,807호, 미국 특허 제5,545,806호 및 미국 특허 제5,625,825호와 국제특허 공개 WO 93/12227호에 개시되어 있다.
비-인간 항체의 인간화는 최근 몇 년 동안 일상적으로 되었으며, 현재 당업자의 지식 이내이다. 여러 회사, 예를 들어 조마(Xoma), 아리에스(Aries), 메다렉스(Medarex), 피디엘(PDL) 및 캠브리지 안티바디 테크놀로지스(Cambridge Antibody Technologies)가 인간화 항체 제조 서비스를 제공한다. 인간화 프로토콜은 기술 문헌, 예를 들어, 문헌[Kipriyanov and Le Gall, Molecular Biotechnol, Vol. 26, pp 39-60 (2004), Humana Press, Totowa, NJ]; 문헌[Lo, Methods Mol. Biol., Vol. 248, pp 135-159 (2004), Humana Press, Totowa, NJ]; 문헌[Wu et al, J. Mol. Biol. 294, 151-162 (1999)]에 광범위하게 기재되어 있다.
소정 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 하이브리도마 세포주 이외의 세포주에서 발현될 수 있다. 미국 특허 제4,399, 216호, 미국 특허 제4,912,040호, 미국 특허 제4,740,461호 및 미국 특허 제4,959,455호에 예시된 바와 같이, 특정 항체를 코딩하는 서열은, 예를 들어 바이러스 내에 (또는 바이러스 벡터 내로) 폴리뉴클레오티드를 패키징하고, 이 바이러스 (또는 벡터)를 이용하여 숙주 세포를 형질도입시키는 것을 포함하는, 숙주 세포 내로 폴리뉴클레오티드를 도입하는 공지된 방법에 의해, 또는 당업계에 공지된 트랜스펙션 절차에 의해 적합한 포유류 숙주 세포를 형질전환하는 데에 사용될 수 있다. 사용되는 형질전환 절차는 형질전환시킬 숙주에 따라 달라질 수도 있다. 이종 폴리뉴클레오티드의 포유류 세포 내로의 도입 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 덱스트란-매개된 트랜스펙션, 인산칼슘 침전, 폴리브렌 매개된 트랜스펙션, 원형질체 융합(protoplast fusion), 전기천공, 리포좀에 폴리뉴클레오티드(들)를 캡슐화하는 것, 핵산과, 양으로 하전된 지질과의 혼합, 및 DNA의 핵 내로의 직접적 미세주입을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
항체의 중쇄 불변 영역, 중쇄 가변 영역, 경쇄 불변 영역, 또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 분자 또는 그 단편 - 원할 경우 적합하게 조합됨 - 은 표준 라이게이션 기술을 이용하여 적절한 발현 벡터 내로 삽입된다. 항체의 중쇄 또는 경쇄 불변 영역은 적절한 가변 영역의 C 말단에 부가될 수 있으며, 발현 벡터 내로 라이게이션된다. 전형적으로, 상기 벡터는 이용되는 특정 숙주 세포에서 기능성이도록 선택된다 (즉, 벡터는 유전자의 증폭 및/또는 유전자의 발현이 일어날 수 있도록 숙주 세포 기구(host cell machinery)와 양립가능함). 발현 벡터의 개관에 대해서는, 문헌[Methods Enzymol. Vol. 185 (Goeddel, ed.), l990, Academic Press]을 참조하라.
본 발명의 항체 및 그 단편은 HPTP베타에 결합하여 혈관 형성을 조절한다. 상기에 정의된 바와 같이, 용어 항체는 항원 결합 단편을 나타내기 위한 것으로서 사용된다. 그러한 항체 및 항원 결합 단편의 사용은 하기에 추가로 설명되어 있다.
혈관 형성의 시험관내 및 생체내 모델을 이용한 스크리닝 분석
본 발명의 항체는 당업게에 공지된 혈관 형성 분석법으로 스크리닝될 수 있다. 그러한 분석법은 배양된 세포에서의 대리 혈관의 성장 또는 조직 외식체로부터의 혈관 구조의 형성을 측정하는 시험관내 분석법과, 혈관 성장을 직접적으로 또는 간접적으로 측정하는 생체내 분석법을 포함한다 (문헌[Auerbach,R., et al. (2003). Clin Chem 49, 32-40, Vailhe,B., et al. (2001). Lab Invest 81, 439-452]).
혈관 형성의 시험관내 모델
대부분의 이들 분석에서는 배양된 내피 세포 또는 조직 외식체가 이용되며, "혈관 형성" 세포의 응답에 대한 또는 모세 혈관-유사 구조의 형성에 대한 에이전트의 영향이 측정된다. 시험관내 혈관 형성 분석의 예는 내피 세포 이동 및 증식, 모세관 형성, 내피 발아, 대동맥윤(aortic ring) 외식체 분석, 및 병아리 대동맥궁 분석을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
혈관 형성의 생체내 모델
이 분석에서, 에이전트 또는 항체는 성장 인자 (즉, VEGF 또는 안지오포이에틴 1)의 존재 또는 부재 하에 국소적으로 또는 전신적으로 투여되며, 새로운 혈관 성장은 직접적 관찰에 의해 또는 대리 마커, 예를 들어 헤모글로빈 함량 또는 형광 지시자의 측정에 의해 측정된다. 혈관 형성의 예는 병아리 장뇨막(chorioallantoic membrane) 분석, 각막 혈관 형성 분석, 및 매트리젤(Matrigel)™ 플러그 분석을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
혈관 형성 조절된 질병의 치료
용어 "조절하는"은 그의 용인되는 사전적 의미의 경우에서와 같이 정의된다. 그와 같이, 용어 "조절하는"의 의미는 다양한 수단에 의한 상향 조절 또는 하향 조절, 고정, 명령 또는 균일성의 전달, 지배, 또는 유도를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 일 태양에서, 항체는 "혈관 형성 상승된 질병" 또는 "혈관 형성 감소된 질병"의 치료 방법에서 사용될 수도 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "혈관 형성 상승된 질병"은 질환, 질병 및/또는 병의 생물학적 징후에서; 질병에 이르게 되는 생물학적 캐스케이드(cascade)에서; 또는 질병의 증상으로서 원하지 않거나 상승된 혈관 형성을 포함하는 것이다. 이와 유사하게, "혈관 형성 감소된 질병"은 생물학적 징후에서 원하는 또는 감소된 혈관 형성을 포함하는 것이다. 혈관 형성 상승된/감소된 질병에서 혈관 형성의 이러한 "포함"은 하기를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다:
(1) 감염에 의해, 자가면역, 외상, 생역학적 원인, 생활 양식에 의해, 또는 몇몇 기타 원인에 의해, 혈관 형성 수준이 유전적으로 상승되든지 감소되든지 간에, 질병 또는 생물학적 징후의 "원인"으로서의 혈관 형성.
(2) 질환 또는 질병의 관찰가능한 징후의 일부로서의 혈관 형성. 즉, 질환 또는 질병은 증가된 또는 감소된 혈관 형성 견지에서 측정가능하다. 임상 관점에서는, 혈관 형성은 질환을 나타내지만, 혈관 형성은 질환 또는 질병의 "특질"일 필요는 없다.
(3) 혈관 형성은 질환 또는 질병으로 이어지는 생화학 또는 세포 캐스케이드의 일부분이다. 이 점에 있어서, 혈관 형성의 조절은 상기 캐스케이드를 방해할 수 있으며, 질환을 제어할 수 있다. 본 발명에 의해 치료될 수도 있는 혈관 형성 조절된 질병의 비제한적 예가 본 명세서에 하기에 기재되어 있다.
본 발명의 항체는 당뇨병성 망막증, 황반 변성, 암, 겸상 적혈구 빈혈증, 사르코이드, 매독, 탄성섬유 가황색종, 파제트병, 정맥 폐쇄, 동맥 폐쇄, 경동맥 폐색성 질환, 만성 포도막염/유리체염, 미코박테리아 감염, 라임병, 전신성 홍반성 루푸스, 미숙아 망막증, 일스병, 베체트병, 망막염 또는 맥락막염을 야기하는 감염, 추정 눈 히스토플라스마증, 베스트병, 근시, 시신경 유두소와, 스타르가르트병, 평면부염, 만성 망막 박리, 고점도 증후군, 톡소플라스마증, 외상 및 레이저 후 합병증을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 망막/맥락막 신생 혈관 생성과 관련된 질환의 치료에 사용될 수 있다. 다른 질환은 당뇨병과 관련되었든지 관련되지 않았든지 간에, 루베오시스와 관련된 질환(홍채의 신생 혈관 생성)과, 모든 형태의 증식성 유리체 망막증을 포함하는 섬유혈관 또는 섬유 조직의 비정상적인 증식에 의해 야기되는 질환을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 항체는 만성 염증과 관련된 질환의 치료에 사용될 수 있다. 만성 염증의 증상을 갖는 질환은 염증성 장질환, 예를 들어 크론병 및 궤양성 대장염, 건선, 사르코이드증 및 류마티스 관절염을 포함한다. 혈관 형성은 이들 만성 염증성 질환이 공통적으로 갖는 주요 요소이다. 만성 염증은 모세 혈관 발아체의 계속적인 형성에 의존하여 염증 세포의 유입을 유지한다. 염증 세포의 유입 및 존재는 육아종을 생성하며, 따라서 만성 염증 상태를 유지한다. 본 발명의 조성물 및 방법에 의한 혈관 형성의 저해는 육아종의 형성을 예방하여 이 질환을 경감시킨다.
크론병 및 궤양성 대장염은 위장관의 다양한 부위에서의 만성 염증 및 혈관 형성을 특징으로 한다. 크론병은 염증 세포의 실린더로 둘러싸인 새로운 모세 혈관 발아체로 이루어진 위장관 전체에 걸친 만성 육아종성 염증을 특징으로 한다. 혈관 형성의 예방은 상기 발아체의 형성을 저해하여 육아종의 형성을 예방한다. 크론병은 원위 회장 및 결장에 가장 일반적으로 영향을 주는 만성 경벽성 염증성 질환으로서 발생하지만, 구강으로부터 항문 및 항문주위 부위까지의 위장관의 임의의 부분에서 또한 발생할 수 있다. 크론병 환자는 일반적으로 복통과 관련된 만성 설사, 열, 식욕 부진, 체중 감소 및 복부 팽만을 갖는다. 궤양성 대장염이 또한 결장 점막에서 발생하는 만성, 비특이성, 염증성 궤양성 질환이며, 이는 출혈성 설사의 존재를 특징으로 한다.
염증성 장질환은 피부 병변과 같은 장관외 징후를 또한 나타낸다. 그러한 병변은 염증 및 혈관 형성을 특징으로 하며, 위장관 이외의 많은 부위에서 나타날 수 있다. 본 발명의 항체는 혈관 형성을 방지하고, 그에 따라 염증 세포의 유입 및 병변 형성을 감소시킴으로써 이들 병변의 치료가 가능할 수도 있다.
사르코이드증은 다장기(multisystem) 육아종성 질병으로 특성화되는 다른 만성 염증성 질환이다. 이 질환의 육아종은 체내의 어디든지 형성될 수 있으며, 따라서 그 증상은 육아종 부위에 따라 그리고 이 질환이 활성인지에 따라 달라진다. 육아종은 혈관 형성 모세 혈관 발아체에 의해 생성되어, 염증 세포를 일정하게 공급하게 된다.
본 발명의 항체는 건선과 관련된 만성 염증성 병을 또한 치료할 수도 있다. 피부 질환인 건선은 다양한 크기의 구진 및 플라크를 특징으로 하는 다른 만성 재발성 질환이다. 특징적인 병변의 유지에 필요한 새로운 혈관의 형성의 방지에 의해 증상이 완화된다.
류마티스 관절염은 말초 관절의 비특이성 염증을 특징으로 하는 만성 염증성 질환이다. 상기 관절의 활막(synovial lining)의 혈관은 혈관 형성을 겪는 것으로 여겨진다. 새로운 혈관망을 형성하는 것 외에, 내피 세포는 파누스(pannus) 성장 및 연골 파괴에 이르게 되는 인자 및 반응성 산소 화학종을 방출한다. 혈관 형성에 연루된 인자는 류마티스 관절염의 만성 염증 상태에 능동적으로 기여하여 그의 유지를 도울 수 있다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 기타 질환으로는 혈관종, 오슬러-웨버-렌두병, 또는 유전성 출혈성 모세 혈관 확장증, 고형 또는 혈인성 종양 및 후천성 면역 결핍 증후군이 있다.
본 발명의 항체는 "혈관 형성 감소된 질병"의 치료에 또한 사용될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "혈관 형성 감소된 질병"은 혈관 형성이 질환, 질병 및/또는 병의 치료에 유익한 것으로 간주되는 것이다. 당해 질병은 허혈성 손상, 감염, 및/또는 열등한 치유로 고통을 받고 있거나 고통을 받을 위험이 있는 조직을 특징으로 하는 것이며, 이는 부적절한 순환으로 인하여 조직에 산소화된 혈액(oxygenated blood)의 적당한 공급이 박탈될 때 생긴다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "조직"은 하기를 포함하지만 이에 한정되지는 않도록 가장 광범한 의미로 사용된다: 심장 조직, 예를 들어 심근 및 심실; 발기 조직; 골격근; 소뇌 유래의 것과 같은 신경 조직; 내장 기관, 예를 들어, 뇌, 심장, 췌장, 간, 비장 및 폐; 또는 신체의 일반화된 부위, 예를 들어 전체 사지, 발, 또는 원위 부속기, 예를 들어 손가락 또는 발가락.
허혈성 조직의 혈관 신생 방법
일 태양에서, 항체가 허혈성 조직의 혈관 신생 방법에 사용될 수도 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "허혈성 조직"은 적당한 혈액 유동이 박탈된 조직을 의미한다. 허혈성 조직의 예는 심근 및 뇌 경색, 장간막 또는 사지 허혈, 또는 혈관 폐쇄 또는 협착의 결과에서 생기는, 적당한 혈액 공급이 결여된 조직을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 일례에서, 산소화된 혈액의 공급 중단이 혈관 폐쇄에 의해 야기될 수도 있다. 그러한 혈관 폐쇄는 동맥경화, 외상, 외과적 처치, 질환 및/또는 기타 병인에 의해 야기될 수도 있다. 조직이 바람직하지 못한 혈관 폐쇄로부터의 허혈성 손상으로 고통받을 위험이 있는지의 결정을 위하여 일상적인 표준 기술을 이용할 수 있다. 예를 들어, 심근 질환에서, 이들 방법은 다양한 이미지 형성 기술 (예를 들어, 방사성 추적 방법(radiotracer methodology), x-선 및 MRI) 및 생리학적 시험을 포함한다. 따라서, 혈관 형성의 유도는 혈관 폐쇄에 의해 영향을 받거나 그에 의해 영향을 받을 위험이 있는 조직에서 허혈을 예방하거나 약화시키는 효과적인 수단이다. 또한, 골격근 및 심근 허혈, 뇌졸중, 관상 동맥 질환, 말초 혈관 질환, 관상 동맥 질환의 치료가 충분히 고려된다.
표준 기술을 사용하는 당업자는 조직의 혈관 신생을 측정할 수 있다. 대상에서 혈관 신생을 측정하는 비제한적 예는, 치료 전후의 조직으로의 혈액 유동을 측정함에 의한, SPECT(single photon emission computed tomography, 단광자 방출 컴퓨터 단층 촬영); PET(positron emission tomography, 양전자 방출 단층 촬영); MRI(magnetic resonance imaging, 자기 공명 영상); 및 그 조합을 포함한다. 혈관 조영을 거시적 혈관계의 평가로서 이용할 수도 있다. 조직학적 평가를 이용하여 소혈관 수준에서 혈관계를 정량화할 수도 있다. 이들 및 기타 기술은 문헌[Simons, et al., "Clinical trials in coronary angiogenesis, " Circulation, 102, 73-86 (2000)]에 논의되어 있다.
조직의 복구 방법
일 태양에서, 항체가 조직의 복구 방법에 사용될 수도 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "조직을 복구하는"이라는 것은 조직의 복구, 재생, 성장, 및/또는 유지의 촉진을 의미하며, 이는 창상 복구 또는 조직 엔지니어링(tissue engineering)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 당업자라면 새로운 혈관 형성이 조직 복구에 필요함을 이해한다. 다음, 조직은 외상성 상해 또는 관절염, 골다공증 및 기타 골격 질병을 포함하는 병, 및 화상을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 것에 의해 손상될 수도 있다. 또한, 조직은 외과적 처치, 방사선 조사, 열상, 유독성 화학물질, 바이러스 감염 또는 박테리아 감염, 또는 화상으로 인한 상해에 의해 손상될 수도 있다. 복구가 필요한 조직은 또한 비-치유성 창상을 포함한다. 비-치유성 창상의 예는 당뇨병 병상에서 생기는 비-치유성 피부 궤양; 또는 쉽게 치유되지 않는 골절을 포함한다.
또한, 항체는 조직 재생 유도(guided tissue regeneration, GTR) 처치 맥락에서 조직 복구에 사용될 수 있다. 그러한 처치는 침습적인 외과적 처치 이후 창상 치유를 촉진하기 위하여 당업자에 의해 현재 사용된다.
항체는 조직 엔지니어링 과정 동안 향상된 조직 성장을 특징으로 하는 조직 복구의 촉진 방법에서 사용될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "조직 엔지니어링"은, 신체의 조직 및 기관의 증대 또는 대체를 위한, 합성 또는 천연 재료와 조합된 생물학적 보형 장치(prosthetic device)의 생성, 디자인 및 제작으로서 정의된다. 그와 같이, 본 발명의 방법은, 질환에 걸린 조직의 복구 또는 대체에서 이후의 이식을 위하여 체외에서 인간 조직의 디자인 및 성장을 증대시키기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체는 화상 치료에서 치료법으로서 사용되는 피부 이식 대체물의 성장의 촉진에 유용할 수 있다.
조직 엔지니어링의 다른 태양에서, 본 발명의 항체는 재생을 필요로 하는 부위에 이식될 때 기능성 인간 조직의 재생을 유도하는 세포 함유 장치 또는 무세포 장치 내에 포함될 수도 있다. 이전에 논의된 바와 같이, 생물질 유도된 조직 재생을 이용하여, 예를 들어 치주 질환에서 뼈 재성장을 촉진할 수도 있다. 그와 같이, 항체는 그러한 복구가 필요한 창상 부위 또는 기타 조직에서 3차원 형상으로 어셈블링되는 재구성된 조직의 성장을 촉진하기 위하여 사용될 수도 있다.
조직 엔지니어링의 다른 태양에서, 항체는 질환에 걸린 내장 조직의 기능을 대체하도록 디자인된 인간 조직을 포함하는 외부 또는 내부 장치 내에 포함될 수도 있다. 이러한 접근법은 세포를 신체로부터 단리하는 단계, 상기 세포를 구조적 매트릭스에 두는 단계, 및 상기 새로운 시스템을 체내에 이식하거나 상기 시스템을 체외에서 사용하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 항체는 세포주형(cell-lined) 혈관 이식편에 포함되어 상기 이식편에 포함된 세포의 성장을 촉진할 수도 있다. 본 발명의 방법은 연골 및 뼈, 중추 신경계 조직, 근육, 간 및 췌도 (인슐린-생성) 세포와 같은 생성물에서 조직의 복구, 재생 및 엔지니어링을 증대시키기 위하여 사용될 수 있음이 고려된다.
약학 제형 및 사용 방법
본 발명의 항체를 개체에게 투여하여 본 발명의 유전자 및 단백질에 의해 조절되는 질환 또는 질병을 치료 또는 예방할 수 있다. 본 명세서에서, 용어 "치료"는 본 발명의 화합물의 투여에 의해 숙주에서 질환 또는 질병이 경감됨을 의미하기 위하여 사용된다. 그와 같이, 용어 "치료"는, 특히 숙주가 질환에 걸리기 쉽지만, 그 질환으로 아직 진단되지는 않았을 때, 숙주에서 질병이 발병하는 것의 방지; 질병의 저해; 및/또는 질병의 완화 또는 역전을 포함한다. 본 발명의 방법이 질병의 예방에 관한 것인 한, "예방하는"이라는 용어는 질환 상태가 완전히 방지될(thwardted) 것을 요구하지는 않는다는 것을 알아야 한다 (문헌[Webster's Ninth Collegiate Dictionary] 참조). 오히려, 본 명세서에 사용되는 바와 같이 예방하는이라는 용어는 본 발명의 화합물의 투여가 질환 발병 이전에 일어날 수 있도록 질병에 민감한 집단을 확인하는 숙련자의 능력을 나타낸다. 이 용어는 질병 상태가 완전히 회피되는 것을 의미하지 않는다. 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 동정되는 화합물은 다른 화합물과 함께 투여될 수도 있다.
동정된 화합물의 안전성 및 치료 효능은 시험관내 또는 생체내 기술을 이용하여 표준 절차에 의해 결정될 수 있다. 부작용의 수준이 허용가능하다면 치료 지수가 보다 낮은 화합물이 유용할 수도 있지만, 큰 치료 지수를 나타내는 화합물이 바람직할 수 있다. 시험관내 및 생체내 독물학적 및 약리학적 기술로부터 수득되는 데이터를 이용하여 용량 범위를 제형화할 수 있다.
화합물의 유효성은 비조절되거나 부적절하게 조절된 혈관 형성을 갖는 환자의 임상 시험에서 또는 동물 모델에서 추가로 평가될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "약학적으로 허용가능한 담체"는 약품 투여와 양립가능한 모든 용제, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함하고자 한다. 약학적 활성 물질을 위한 그러한 매질 및 에이전트의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 에이전트가 활성 화합물과 양립가능하지 않는 경우를 제외하고는, 그러한 매질은 본 발명의 조성물에서 사용될 수 있다. 보충 활성 화합물도 조성물 내로 혼입될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 그의 의도되는 투여 경로와 양립가능하도록 제형화된다. 투여 경로의 예에는 비경구, 예를 들어, 정맥내, 피내, 피하, 경구 (예를 들어, 흡입), 경피 (국소), 경점막, 및 직장 투여가 포함된다. 비경구, 피내 또는 피하 투여에 사용되는 용액 또는 현탁액은 하기 성분들을 포함할 수 있다: 살균 희석제, 예를 들어, 주사용 물, 식염액, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 합성 용매; 항균제, 예를 들어 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 산화방지제, 예를 들어 아스코르브산 또는 중아황산나트륨; 킬레이팅제, 예를 들어 에틸렌다이아민테트라아세트산; 완충제, 예를 들어 아세트산염, 시트르산염 또는 인산염, 및 장성 조정용 에이전트, 예를 들어 염화나트륨 또는 덱스트로스. pH는 산 또는 염기, 예를 들어 염산 또는 수산화나트륨을 이용하여 조정될 수 있다. 비경구 제제는 앰풀, 일회용 주사기 또는 다용량 바이알 - 유리 또는 플라스틱으로 만들어짐 - 에 봉입될 수 있다.
주사물질 용도에 적합한 약학 조성물은 살균 주사가능 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 살균 파우더(powder)와 살균 수성 용액 (수용성일 경우) 또는 분산액을 포함한다. 정맥내 투여에 있어서, 적합한 담체는 생리식염수, 정균성 물, 크레모포어(Cremophor) EL™ (바스프(BASF), 미국 뉴저지주 파시파니 소재) 또는 인산염 완충 식염수(PBS)를 포함한다. 모든 경우, 조성물은 살균되어야 하며, 용이한 주사가능성(syringability)이 존재할 정도로 유체여야 한다. 이것은 제조 및 보관 조건 하에서 안정하여야 하며, 박테리아 및 진균류와 같은 미생물의 오염 작용에 대항하여 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 그의 적합한 혼합물을 포함하는 용제 또는 분산 매질일 수 있다. 적당한 유동성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우, 등장제, 예를 들어 당, 폴리알코올, 예를 들어 만니톨, 소르비톨, 및 염화나트륨을 조성물 중에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사가능 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 에이전트, 예를 들어 모노스테아르산알루미늄 및 젤라틴을 조성물 중에 포함시킴으로써 초래할 수 있다.
살균 주사가능 용액은, 필요량의 활성 화합물을 적절한 용매에, 필요할 경우 상기에 열거된 성분들 중 하나 또는 그 조합과 함께 혼입시키고, 이어서 여과 살균함으로써 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본적인 분산 매질 및 필요한 다른 성분들을 포함하는 살균 비히클 내로 활성 화합물을 혼입함으로써 제조된다. 살균 주사가능 용액의 제조를 위한 살균 파우더의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조이며, 이는 이전에 살균 여과된 용액으로부터의 임의의 추가의 원하는 성분에 더해진 활성 성분의 파우더를 생성한다.
전신 투여는 또한 경점막 또는 경피 수단에 의한 것일 수도 있다. 경점막 또는 경피 투여에 있어서, 투과될 장벽에 적절한 침투제가 제형에서 사용된다. 그러한 침투제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 경점막 투여의 경우, 세제, 담즙염, 및 푸시딕산 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 비강 스프레이 또는 좌약을 이용하여 성취될 수 있다. 당업계에 일반적으로 공지된 바와 같이, 경피 투여에 있어서, 활성 화합물은 연고, 고약, 젤 또는 크림으로 제형화된다.
화합물은 또한 직장 전달을 위하여 (예를 들어, 코코아 버터 및 기타 글리세라이드와 같은 통상적인 좌약 베이스를 이용하여) 좌약 또는 정류 관장제(retention enema)의 형태로 제조될 수 있다.
일 실시 형태에서, 활성 화합물은, 이식편 및 미세캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 방출 제어 제형과 같이, 이 화합물의 신체로부터의 급속 제거에 대하여 보호하는 담체와 함께 준비된다. 생분해성, 생체 적합성 중합체, 예를 들어 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리언하이드라이드(polyanhydride), 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산이 사용될 수도 있다. 그러한 제형의 제조 방법은 당업자에게 명백할 것이다. 또한, 재료들은 알자 코포레이션(Alza Corporation) 및 노바 파마슈티칼스, 인크.(Nova Pharmaceuticals, Inc.)로부터 상업적으로 입수될 수도 있다. 리포좀 현탁액 (바이러스 항원에 대한 단일 클론 항체를 포함하는 감염된 세포에 표적화된 리포좀을 포함함)이 약학적으로 허용가능한 담체로서 또한 사용될 수도 있다. 이는 예를 들어 미국 특허 제4,522,811호에 설명된 바와 같이, 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다.
투여의 용이함 및 투여량의 균일성을 위하여 경구 또는 비경구 조성물을 단위 투여 형태로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "단위 투여 형태"는 치료될 대상에 있어서 단위 투여량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위들을 말하며, 각각의 단위는 필요한 약학적 담체와 회합된, 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 소정량의 활성 화합물을 포함한다. 단위 투여 형태에 대한 명세 사항은 활성 화합물의 독특한 특징 및 달성될 특정 치료 효과와, 개체의 치료를 위하여 그러한 활성 화합물을 섞는 것에 대한 당업계에 고유한 제한 사항으로 서술되며, 그에 직접적으로 의존한다.
실시예 1. HPTP β 세포외 도메인 단백질의 생성.
방법: 제조업자(오리진(Origene))의 설명서에 따라 인간 태반 라이브러리로부터 전장 HPTPβ를 클로닝한다. 이 클론은 FNIII 반복체 # 5가 상실된 것을 제외하고는 이전에 보고된 cDNA 클론(젠뱅크 등록 번호 X54131)과 동일하다. HPTPβ의 전체 용해성 세포외 도메인(ECD)을 코딩하는 cDNA는 부가된 c-말단의 His-His-His-His-His-His-Gly (6His-Gly)을 가진 AA 1-1534(서열 번호 1)를 코딩하는 전장 cDNA(하기 서열 참조)로부터 PCR에 의해 클로닝한다. HEK293 세포에서의 일시적(pShuttle-CMV) 또는 안정한(pcDNA3.1(-)) 발현을 위해 포유류 발현 벡터 내로 생성된 cDNA를 클로닝한다. 정제된 HPTPβ ECD (βECD)를 얻기 위하여, βECD 발현 벡터로 트랜스펙션시킨 HEK293 세포를 정상 성장 조건 하에서 24시간 동안 옵티멤(OptiMEM)-무혈청(깁코(Gibco))에서 인큐베이션한다. 이어서 조절된 배지를 회수하고, 원심분리하여 잔해를 제거하고(1000 rpm x 5 분), 1 ㎖의 세척된 Ni-NTA 아가로스(퀴아젠(Qiagen)) (500 ㎕의 포장된 재료)를 청징된 배지 각 10 ㎖에 μ로 첨가하고 4℃에서 하룻밤 교반시킨다. 다음날, 혼합물을 컬럼에 로딩하고 20 충전 부피의 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM 이미다졸 - pH 8 - 로 세척한다. 이어서 정제된 HPTPβ 세포외 도메인 단백질(서열 번호 2)을 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM 이미다졸 - pH 8 - 로 용출 당 200 ㎕로 6개의 분획으로 용출시킨다. 환원-변성 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동을 이용하여 분획을 단백질 함량에 대해 분석하고 은 염색(인비트로젠(Invitrogen))으로 검출하고 질량분석법(mass spectrometry)에 의해 확인한다.
결과: HPTPβ 의 세포외 도메인에 대한 항체를 개발하기 위하여, 6-His 태그 화 HPTPβ 세포외 도메인 단백질의 발현을 유도하는 발현 벡터(도 1, 패널 A)를 개발한다. 그 후, 발현 벡터로 트랜스펙션시킨 HEK293 세포의 조절된 배지로부터 6-His 태그화 HPTPβ 세포외 도메인 단백질을 거의 균질하게 정제한다(도 1, 패널 B).
실시예 2. HPTP β 세포외 도메인에 대한 단일 클론 항체의 생성.
방법: HPTPβ 세포외 도메인 면역원의 생성을 위하여, EDC 커플링 화학(문헌[Hockfield, S. et al, (1993) Cold Spring Habor Laboratory Press. Volume 1 pp. 111-201, Immunocytochemistry])을 이용하여 돼지 타이로글로불린(시그마(Sigma))에 정제된 HPTPβ 세포외 도메인-6His 단백질을 콘쥬게이션시킨다. 생성된 HPTPβ 세포외 도메인-타이로글로불린 콘쥬게이트를 PBS - pH 7.4 - 에 대해 투석시킨다. 이어서 성체 Balb/c 생쥐를 콘쥬게이트(100-200 ㎍)와 완전 프로인트 아쥬반트(Freund's adjuvant)의 1:1 혼합물을 이용하여 피하 주사로 면역시킨다. 2-3주 후, 불완전 프로인트 아쥬반트와 상기 콘쥬게이트의 1:1 혼합물을 생쥐에 복강내 또는 피하 주사한다. 주사는 4-6주에 반복한다. 세 번째 주사 후 7일에 생쥐로부터 혈청을 수집하고, ELISA 및 웨스턴 블로팅에 의해 HPTPβ 세포외 도메인 항원에 대한 면역반응성에 대하여 분석한다. 항원에 대해 양호한 응답을 나타내는 생쥐를 31 게이지 초장 바늘을 이용하여 명반 수산화물과 1:1로 혼합된 정제된 HPTPβ 세포외 도메인 단백질 50 ㎕를 한 번의 비장내 주사로 면역증강(boost)시킨다(문헌[Goding, J. W., (1996) Monoclonal Antibodies: Principles and Practices. Third Edition, Academic Press Limited. p.145]). 요약하면, 생쥐를 2.5% 아버틴으로 마취시키고, 피부를 1 센티미터 절개하여 갈라진 체벽을 남겨둔다. 항원 혼합물을 비장의 후방부로부터 전방부로 바늘을 삽입하여 종방향 주사로 투여한다. 체벽을 봉합하고 두 개의 작은 금속 클립으로 피부를 밀봉한다. 안전한 회복에 대하여 생쥐를 모니터한다. 수술 후 4일에 생쥐 비장을 꺼내고, 하이브리도마 세포주의 생성을 위하여 생쥐 골수종 세포와 융합시키기 위한 단일 세포 현탁액을 제조한다(문헌[Spitz, M., (1986) Methods In Enzymology, Volume 121. Eds. John J, Lagone and Helen Van Vunakis. PP.33-41 (Academic Press, New York, NY)]). 생성된 하이브리도마를 15% 송아지 태아 혈청(하이클론(Hyclone)) 및 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘이 보충된 둘베코 변형 배지(Dulbeccos modified media)(깁코)에서 배양한다.
양성 하이브리도마에 대한 스크리닝은 융합 후 8일에 시작하여 15일동안 계속한다. 항-HPTPβ 세포외 도메인 항체를 생성하는 하이브리도마는 두 세트의 96-웰 플레이트에서의 ELISA에 의해 확인하는데, 하나는 히스티딘 태그화 HPTPβ 세포외 도메인으로 코팅하고, 다른 하나는 음성 대조로서 히스티딘 태그화 박테리아 MurA 단백질로 코팅한다. 2차 항체는 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)(잭슨 이뮤노리서치(Jackson Immunoresearch))로 표지된 당나귀 항-생쥐 IgG이다. TBS 완충액(pH 7.5)에 용해된 ABTS 정제에 의해 개시되는 발색을 이용하여 웰에서 면역반응성을 모니터한다. 1% SDS 100 마이크로리터를 첨가하여 개개의 HRP 반응 혼합물을 종결하고 분광광도계로 405 ㎚에서 흡광도를 판독한다. HPTPβ 세포외 도메인-6His와 상호작용하지만 murA-6His 단백질과는 상호작용하지 않는 항체를 생성하는 하이브리도마를 추가 분석에 이용한다. 96 웰 플레이트에서 양성 클론에 대해 제한 희석(0.8개의 세포/웰)을 2회 실시하며, 클론성은 웰의 99% 초과가 양성 반응성을 갖는 것으로 정의한다. 항체의 아이소타입은 아이소-스트립(iso-strip) 기술(로쉐(Roche))을 이용하여 결정한다. 추가 평가를 위한 정제 항체를 얻기 위하여, 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼을 이용하여 조직 배양 상청액을 친화성 정제한다.
결과: HPTPβ 세포외 도메인 단백질에 대해 면역반응성인 5개의 단일 클론 항체를 단리하여 하기 명칭, R15E6, R12A7, R3A2, R11C3, R15G2 및 R5A8을 부여한다.
단일 클론 항체 R15E6를 2006년 5월 4일자로 미국 20108 버지니아주 마나사스 피.오.박스 1549 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)에 기탁하였다.
실시예 3. R15E6은 인간 내피 세포 상의 내인성 HPTP β에 결합한다.
A. R15E6은 면역침전 및 웨스턴 블롯에 의해 입증되는 바와 같이 내인성 HPTPβ에 결합한다.
재료: 캠브렉스(Cambrex)로부터의 인간 제대 정맥 내피 세포(Human umbilical vein endothelial cell, HUVEC), EGM 배지, 및 트립신 중화 용액; 옵티멤(OPTIMEM) I (깁코), 소 혈청 알부민(BSA; 산타 크루즈(Santa Cruz)), 인산염 완충 식염수(PBS; 깁코), 안지오포이에틴 1(Ang 1)을 포함하는 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 섬유아세포 성장 인자 (FGF) (알앤디 시스템스(R&D Systems))를 포함하는 성장 인자, Tie2 단일 클론 항체(듀크 유니버시티(Duke University)/피앤지피(P&GP)), VEGF 수용체 2 (VEGFR2) 다클론 항체(위타커(Whitaker) 등), 단 백질 A/G 아가로스 (산타 크루즈), 트리스-글리신 예비-주조 젤 전기영동/전달 시스템(6-8%) (인비트로겐(Invitrogen)), PVDF 막(인비트로겐), 용해 완충액 (20 ㎜ 트리스-HCl, 137 ㎜ NaCl, 10% 글리세롤, 1% 트리톤-X-100, 2 mM EDTA, 1 mM NaOV, 1 mM NaF, 1 mM PMSF, 1 ㎍/㎖ 류펩틴, 1 ㎍/㎖ 펩스타틴).
방법: HUVEC을 30분 동안 (옵티멤 중의) 항체 또는 옵티멤 I 단독으로 예비 처리한다. 예비 처리를 제거한 후, 6분 동안 PBS + 0.2% BSA 중의 Ang 1(100 ng/㎖)로 세포를 처리하고 용해 완충액에서 용해시킨다. 용해물을 직접 트리스-글리신 젤에서 진행시키거나 또는 2-5 ㎍/㎖의 Tie-2 항체 또는 10 ㎍/㎖의 R15E6 항체 및 단백질 A/G 아가로스로 면역침전시킨다. 면역침전된 샘플을 용해 완충액으로 1회 헹구고 1x 샘플 완충액에서 5분 동안 끓인다. 샘플을 트리스-글리신 젤에서 분리시키고, PVDF 막으로 옮겨, 표시된 항체(pTYR Ab (PY99, 산타 크루즈), Tie-2, VEGFR2 및/또는 R15E6)를 이용하여 웨스턴 블롯에 의해 검출한다.
결과: IP/웨스턴 블로팅에 의해, R15E6은 HPTPβ의 크기와 일치하는 주된 고분자량 밴드를 인식한다(도 2, 패널 A, 레인 2). 덜 강한 저분자량 밴드는 HPTPβ의 덜 글리코실화된 전구체 형태를 나타낼 가능성이 있다. 대조인 비-면역 IgG를 이용한 면역침전(IP)은 HPTPβ의 분자량 범위에서 밴드를 나타내지 않으며(도 2, 패널 A, 레인 1), 조합된 Tie2/VEGFR2 IP는 예상한 분자량의 밴드를 나타낸다(도 2, 패널 A, 레인 3). 이 결과는 R15E6이 HPTPβ를 인식하며 그에 대하여 특이적임을 입증한다.
B. R15E6는 FACS 분석에 의해 입증되는 바와 같이 내인성 HPTPβ에 결합한 다.
재료: 캠브렉스로부터의 HUVEC, EGM 배지, 및 트립신 중화 용액; 몰레큘러 프로브스(Molecular Probes)로부터의 2차 알렉스플루오르(Alexfluor) 488 태그화 항체; 행크스(Hanks) 균형화 염 용액(깁코); 벡톤 딕켄손(Becton Dickenson)으로부터의 팩스캔(FACSCAN) 유세포 분석기 및 셀퀘스트(CellQuest) 소프트웨어.
방법: HUVEC을 트립신처리하고, 트립신 중화 용액으로 처리하고, HBSS로 헹군다. R15E6 항체(0.6 ㎍)를 50 ㎕의 HBSS 중의 250,000개의 세포에 첨가하고 20분 동안 얼음 상에서 인큐베이션한다. 세포를 1 ㎖ HBSS로 헹구고 이어서 2 ㎍의 형광-콘쥬게이션된 2차 항체를 얼음 상에서 20분 동안 첨가한다. 세포를 헹구고 1 ㎖ HBSS에 재현탁시키고 이어서 셀퀘스트 소프트웨어를 이용하여 팩스캔 유세포 분석기로 분석한다. 대조 세포는 형광-콘쥬게이션된 2차 항체만으로 처리한다.
결과: FACS 분석에 의하면, 온전한 HUVEC, R15E6은 2차 항체 단독에 비해 형광 신호의 강한 이동(90% 초과의 세포)을 야기한다(도 2, 패널 B). 이 결과는 R15E6이 온전한 내피 세포의 표면 상에 제시된 내인성 HPTPβ에 결합함을 나타낸다.
실시예 4. R15E6은 Tie2 활성화를 향상시키며, 다수의 혈관 형성 응답(내피 세포의 생존, 이동 및 모세혈관 형태 형성)을 촉진한다.
A. R15E6은 안지오포이에틴 1(Ang 1), Tie2 리간드의 부재 및 존재 하에서 Tie2 인산화를 향상시킨다.
방법: HUVEC를 다양한 농도의 R15E6의 존재 또는 부재 하에서 그리고 Ang1 을 첨가하거나 첨가하지 않고서 상기에 설명한 바와 같이 무혈청 배지에서 배양한다. 용해물을 제조하고, Tie2 항체로 면역침전시키고, 폴리아크릴아미드 젤 전기영동에 의해 분리시키고 PVDF 막으로 옮긴다. 이어서, 막-결합된 면역침전된 단백질을 연속적으로 항포스포타이로신 항체로 웨스턴 블로팅하여 Tie2 인산화를 정량화하고 이어서 Tie2 항체로 웨스턴 블로팅하여 전체 Tie2를 정량화한다. Tie2 인산화는 전체 Tie2 신호에 대한 항포스포타이로신 신호의 비로 표시한다.
결과: R15E6은 Ang1의 부재 및 존재 하에서 Tie2 인산화를 향상시킨다(도 3). 이 결과는 내피 세포 표면 상에서 HPTPβ에의 R15E6의 결합이 그의 생물학적 기능을 조절하여 리간드의 부재 또는 존재 하에서 Tie2의 활성화를 향상시킴을 나타낸다.
B. R15E6는 내피 성장 인자의 부재 및 존재 하에서 내피 세포 생존을 향상시킨다.
재료: 캠브렉스로부터의 HUVEC, EGM 배지, 및 트립신 중화 용액; DMEM (셀 그로(Cell Gro)), 탈지질화 BSA (비디(BD) 팔콘(Falcon)), 셀 타이터 글로(Cell Titer Glo) ATP 분석(프로메가(Promega)), 성장 인자(Ang1 , VEGF 165, 및 FGF) (알앤디 시스템스), 빅토르(Victor) V 멀티라벨(Multilabel) 플레이트 판독기(퍼킨 엘머 월락(Perkin Elmer Wallac)).
방법: HUVEC을 10,000개의 세포/웰로 도말하고, DMEM/0.2% BSA에서 혈청 기아 처리를 하고, 다양한 농도의 R15E6 항체와 함께 또는 상기 항체 없이 성장 인자(Ang1, VEGF, 또는 FGF)의 존재 또는 부재 하에서 72 시간동안 처리한다. 72시 간 후, DMEM으로 세포를 헹구고, 제조업자의 설명서(프로메가)에 따라 셀 타이터 글로 발광 분석을 이용하여 ATP 수준을 측정함으로써 생존 세포를 정량화한다.
결과: Tie2 활성화 분석의 결과와 일치하여, R15E6은 0.5 내지 5 nM 사이의 농도에서 성장 인자 첨가 없이 내피 세포 생존을 향상시킨다(도 4, 패널 A). 이와 유사하게, R15E6은 VEGF 및 FGF에 의해 매개되는 세포 생존(도 4, 패널 B 및 C)뿐만 아니라 Ang1 매개된 내피 세포 생존(도 4, 패널 A)도 향상시킨다. 대조 단일 클론 항체(도 4, 패널 D)에서는 생존 향상이 보이지 않는다. 이들 결과는 내피 세포 표면 상에서 HPTPβ에의 R15E6 결합이 다수의 혈관 형성 경로(Ang1, VEGF, 및 FGF)에 의해 매개되는 세포 생존뿐만 아니라 기본 내피 세포 생존을 향상시킴을 입증한다.
C. R15E6는 VEGF의 부재 및 존재 하에서 내피 세포 이동을 향상시킨다.
재료: 캠브렉스로부터의 HUVEC, EGM 배지, 및 트립신 중화 용액; EBM-무 페놀 레드(PRF-EBM, 캠브렉스), 탈지질화 BSA (비디 팔콘), 비디 팔콘 바이오코트(Biocoat) 내피 세포 이동 시스템(비디 팔콘), 칼세인(Calcein) AM (몰레큘러 프로브스); 성장 인자(VEGF 165) (알앤디 시스템스), 빅토르 V 멀티라벨 플레이트 판독기(퍼킨 엘머 월락).
방법: HUVEC을 PRF-EBM+0.1% BSA에 재현탁시키고 트렌스웰 (비디 바이오사이언스(BD Bioscience), 3 ㎛ 기공 크기) 당 50,000개의 세포로 도말한다. 성장 인자/ R15E6을 트랜스웰 챔버의 기저부 웰에 두고 4-22시간 동안 인큐베이션한다. 90초 동안 4 ㎍/㎖의 칼세인 AM으로 표지시켜 막을 통과해 이동하는 세포를 검출한 다. 형광은 빅토르 V 기기(485/535)를 이용하여 측정한다.
결과: 생존 연구에서의 결과와 일치하여, R15E6은 기본 및 VEGF-매개 내피 세포 이동 둘 모두를 향상시킨다(도 5).
D. R15E6은 내피 성장 인자의 부재 및 존재 하에서 내피 세포 발아 및 모세 혈관 형태 형성을 향상시킨다.
재료: 캠브렉스로부터의 HUVEC 및 EGM 배지; 시그마로부터의 사이토덱스(Cytodex) 비드 및 제I형 콜라겐; 깁코로부터의 둘베코 PBS 및 M199 배지; 알앤디로부터의 VEGF.
방법: HUVEC 계대(passage) 4 (2x106개의 세포)를 가끔씩 휘저으면서 48시간 동안, 100 ㎜ 비-조직 배양물 처리된 세균용 디쉬 내의 10 ㎖의 EGM 중의 5 ㎎의 사이토덱스 비드와 함께 배양한다. 세포 코팅된 비드를 50 ㎖ 원심관으로 옮기고 380 μLL D-PBS에 재현탁시킨다. 71.4 ㎕의 세포 코팅된 비드를 0.005 N NaOH, 20 mM HEPES, 및 26 mM NaHCO3을 보충한 M199 배지 중의 3 ㎎/㎖의 콜라겐으로 이루어진 매트릭스 용액 2.8 ㎖에 첨가하여 콜라겐 젤을 제조한다. 350 마이크로리터의 비드를 24웰 조직 배양 플레이트의 웰 내로 분배하고, 37℃/5% CO2에서 1시간 동안 매트릭스를 고형화시킨다. VEGF (10 ng/㎖) 또는 R15E6 (7.5 ㎍/㎖)이 있거나 없는 EGM 배지 1 ㎖을 웰마다 첨가하여 인큐베이터로 돌려보낸다. 48 시간 후, 볼 수 없는 입회자(blinded observer)가 위상차 역상 현미경으로 발아체를 가시화하고, 내피 세포 발아체의 존재에 대하여, 삼중 웰에서, 웰 당 50개의 비드를 관찰한 다. 결과는 비드 당 발아체 개수로 표시한다.
결과: 다른 분석에서의 결과와 일치하여, R15E6은 또한 내피 비드 발아 분석에서 기본 및 VEGF 매개 모세 형태 형성을 향상시킨다(도 6).
실시예 5. R15E6을 위한 결합 에피토프는 인간 HPTPβ 세포외 도메인의 N-말단 FN3 반복체 내에 있다.
A. 재조합 C-말단 절단 돌연변이체 및 생쥐/인간 키메라 단백질의 웨스턴 블롯 분석은 R15E6 결합 에피토프가 HPTPβ 세포외 도메인의 N-말단 FN3 반복체 내에 있음을 보여준다.
방법: HEK293 세포를 나타낸 HPTPβ 절단 돌연변이체 또는 생쥐/인간 키메라를 코딩하는 발현 벡터로 트랜스펙션시킨다. 이어서, 트랜스펙션시킨 세포를 추가로 24 시간 동안 옵티멤에서 인큐베이션하고, 그 후 나타낸 HPTPβ 세포외 도메인을 함유한 조절된 배지를 수확하고, 미래에 사용하기 위해 저장하거나 웨스턴 블롯 또는 ECL(하기 참조) 연구를 위해 즉시 사용한다. 웨스턴 블롯 분석을 위해, 나타낸 HPTPβ 단백질을 함유하거나 재조합 단백질을 함유하지 않는(모조체(Mock), 엠티(empty) 벡터로 트랜스펙션됨) 조절된 배지 20 ㎕를 PAGE로 분리하고, PVDF 막으로 옮기고 R15E6으로 프로빙한다.
결과: 웨스턴 블롯 분석에 의하면, R15E6은 모든 HPTPβ C-말단 결실 돌연변이체(도 7A)에 결합하며, 이는 결합 에피토프가 첫 번째의 두 N-말단 FN3 반복체 내에 있음을 나타낸다. R15E6은 쥣과 HPTPβ(서열 번호 7) 세포외 도메인에는 결합하지 못하며, 이는 인간 단백질에 대한 특이성을 입증하는 것이다(도 7B의 레인 6 대 레인 2). 쥣과의 제1 또는 제1 및 제2 N-말단 FN3 반복체를 인간 서열로 대체하면 R15E6 결합이 회복된다(도 7B의 레인 3 및 5). 역으로, 쥣과의 제2 FN3 반복체만을 인간 서열로 대체하면 결합을 회복하지 못한다(도 7B의 레인 4). 이를 함께 고려하면, 이들 발견에 의하면 R15E6의 결합 에피토프는 인간 HPTPβ의 N-말단 FN3 반복체(약 100개의 아미노산)로 국소화된다.
B. 말단 절단 돌연변이체 및 생쥐/인간 키메라 단백질의 ECL (전기화학발광) 분석은 R15E6 결합 에피토프가 HPTPβ 세포외 도메인의 N-말단 FN3 반복체 내에 있음을 확인한다.
방법: 나타낸 HPTPβ 단백질을 함유한 상청액을 96 웰 고 결합 MSD(메조 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery)) 플레이트에 코팅하고, 건조시키고, 1시간 동안 3% BSA로 차단시킨다. 이어서 단백질을 R15E6 단일 클론 항체 또는 R15E6 Fab 단편(10 nM 또는 1.5 ㎍/㎖)과 함께 1시간 동안 인큐베이션하고, 헹구고, MSD-태그 표지를 가진 염소 항-생쥐 항체(10 nM)와 함께 1시간 동안 인큐베이션시킨다. 과량의 항체를 헹구어 제거하고 MSD 판독 완충액을 첨가한다. 섹터(Sector) 2400 판독기(MSD)를 이용하여 광 방출을 측정한다. MSD는 전기화학발광 검출을 이용하여 패턴화된 어레이 상의 결합 사건을 탐지한다. 메조 스케일 디스커버리의 기술은 전극이 플레이트의 기저부 내로 일체화된 독점적인 멀티-어레이(MULTI-ARRAY)™ 및 멀티-스팟(MULTI-SPOT)™ 마이크로플레이트를 이용한다. MSD의 전극은 카본으로 제조되며, 생물학적 시약이 수동 흡착에 의해 간단하게 상기 카본에 부착되어 높은 수준의 생물학적 활성을 보유할 수 있다. MSD 분석은 초고감도 검출을 위해 전기 화학발광 표지를 이용한다. 이들 전기화학발광 표지는 전기화학적으로 자극될 때 광을 방출한다. 검출 과정은 MSD의 마이크로플레이트의 기저부에 위치한 내장 전극에서 개시되며, 전극 근처의 표지만이 여기되어 620 ㎚에서 광이 검출된다.
결과: 웨스턴 블롯 연구와 일치하여, R15E6은 MSD 분석에 의하면 모든 HPTPβ C-말단 절단 단백질에 결합한다(도 8A). 또한 웨스턴 블롯 분석과 일치하여, R15E6은 쥣과 HPTPβ 세포외 도메인에 결합하지 못하지만 쥣과 N-말단 FN3 반복을 인간 N-말단 FN3 도메인으로 대체함으로써 결합이 회복된다(도 8B). 이들 데이터는 R15E6의 결합 에피토프가 인간 HPTPβ의 N-말단 FN3 반복체 내에 있음을 확인한다. 예상한 바와 같이, 1가 R15E6 Fab 단편의 결합 에피토프도 인간 HPTPβ의 가장 말단의 N-말단 FN3 반복체에 지도화될 수 있다(도 9).
실시예 6. 1가 R15E6 Fab 단편은 R15E6 매개된 Tie2 활성화를 차단하며 내피 세포 생존 및 이동을 저해한다.
방법: Tie2 활성화 및 내피 세포 생존 및 이동 분석은 실시예 4에서 상기에 설명한 바와 같이 실시한다. 1가 R15E6 Fab 단편은 이전에 설명한 바와 같이 제조한다. 정제된 R15E6을 2 mM EDTA 및 1 mM 다이티오트레이톨을 함유한 0.1 M 트리스-HCl - pH 8.0 - 에서 투석시킨다. 1-2 ㎎/㎖의 파파인(피어스(Pierce))을 37℃에서 15분 동안 전술한 완충액에서 활성화시킨다. 10 ㎎/㎖의 R15E6을 1:100의 효소:기질 비를 이용하여 동일한 완충액에서 파파인과 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 요오도아세트아미드(최종 농도 20 mM)를 첨가하여 절단을 종결시키고, 1시간 동안 광으로부터 보호한 채 얼음 상에서 유지한다. 파파인 절단된 재료 를 인산염-완충된 식염수에 대해 하룻밤 투석시켜 요오도아세트아미드를 제거한다. 절단 정도는 SDS-PAGE로 모니터하는데, 감마 중쇄(MW: 55,000 kDa)가 사라지고 감마의 Fc 단편(MW: 27,000 kDa) 및 경쇄(MW: 22,000-25,000 kDa)가 나타난다.
결과: 온전한 R15E6 항체와는 달리, Fab 단편은 Tie2 활성화를 향상시키지 못한다(도 10). 더욱이, 과량의 Fab 단편의 존재 하에서는, R15E6-매개된 Tie2 활성화가 차단된다(도 10). 놀랍게도, R15E6 Fab 단편은 대조 Fab에 비하여 내피 세포 생존을 두드러지게 저해하며(도 11A) 이 효과는 온전한 R15E6의 첨가에 의해 구제될 수 있다(도 11B). 내피 생존에 대한 부정적 영향과 일치하여, R15E6 Fab는 또한 VEGF 매개된 내피 세포 이동을 차단한다(도 12). 이들 발견은, 온전한 이량체성 R15E6은 혈관 형성 신호 전달의 향상에 필요하며, 단량체성 R15E6은 이들 작용을 차단하고, 실제로 혈관 형성 내피 세포 응답에 부정적인 영향을 줌을 입증한다.
달리 기재된 경우를 제외하고는, 양, 백분율, 부, 및 비율을 포함한 모든 양은 단어 "약"의 수식을 받는 것으로 이해되며, 양은 유효 숫자를 나타내는 것으로 의도되지 않는다.
달리 기재된 경우를 제외하고는, 단수 명사는 "하나 또는 그 이상"을 의미한다.
인용된 모든 문헌은 본 명세서에서 관련된 부분에서 참고로 포함되며, 어떠한 문헌의 인용도 본 발명에 대한 종래 기술로 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 서면으로 된 본 문헌에서의 용어의 임의의 의미 또는 정의가 참고로 포함된 문헌에서의 용어의 임의의 의미 또는 정의와 상충될 경우, 서면으로 된 본 문헌에서의 용어에 할당된 의미 또는 정의가 지배한다.
본 발명의 특정한 실시 형태가 예시되고 설명되었지만, 본 발명의 사상과 범주로부터 벗어남이 없이 다양한 다른 변경 및 수정이 이루어질 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 범주 내에 있는 이러한 모든 변경과 수정을 첨부된 청구의 범위에 포함하고자 한다.
<110> The Procter & Gamble Company Rotello, Rocco J Peters, Kevin G Davis, Michael G <120> Antibodies That Bind Human ProteinTyrosine Phosphatase beta (HPTPbeta) and Uses Thereof <130> 10365P2 <140> Not Yet Assigned <141> 2006-05-09 <160> 11 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 4623 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(4623) <400> 1 atg ctg agc cat gga gcc ggg ttg gcc ttg tgg atc aca ctg agc ctg 48 Met Leu Ser His Gly Ala Gly Leu Ala Leu Trp Ile Thr Leu Ser Leu 1 5 10 15 ctg cag act gga ctg gcg gag cca gag aga tgt aac ttc acc ctg gcg 96 Leu Gln Thr Gly Leu Ala Glu Pro Glu Arg Cys Asn Phe Thr Leu Ala 20 25 30 gag tcc aag gcc tcc agc cat tct gtg tct atc cag tgg aga att ttg 144 Glu Ser Lys Ala Ser Ser His Ser Val Ser Ile Gln Trp Arg Ile Leu 35 40 45 ggc tca ccc tgt aac ttt agc ctc atc tat agc agt gac acc ctg ggg 192 Gly Ser Pro Cys Asn Phe Ser Leu Ile Tyr Ser Ser Asp Thr Leu Gly 50 55 60 gcc gcg ttg tgc cct acc ttt cgg ata gac aac acc aca tac gga tgt 240 Ala Ala 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Lys Asp Leu Thr 725 730 735 ttg cgc aac agg agc act gag gac ttg cat gtg act tgg tca gga gct 2256 Leu Arg Asn Arg Ser Thr Glu Asp Leu His Val Thr Trp Ser Gly Ala 740 745 750 aat ggg gat gtc gac caa tat gag atc cag ctg ctc ttc aat gac atg 2304 Asn Gly Asp Val Asp Gln Tyr Glu Ile Gln Leu Leu Phe Asn Asp Met 755 760 765 aaa gta ttt cct cct ttt cac ctt gta aat acc gca acc gag tat cga 2352 Lys Val Phe Pro Pro Phe His Leu Val Asn Thr Ala Thr Glu Tyr Arg 770 775 780 ttt act tcc cta aca cca ggc cgc caa tac aaa att ctt gtc ttg acg 2400 Phe Thr Ser Leu Thr Pro Gly Arg Gln Tyr Lys Ile Leu Val Leu Thr 785 790 795 800 att agc ggg gat gta cag cag tca gcc ttc att gag ggc ttc aca gtt 2448 Ile Ser Gly Asp Val Gln Gln Ser Ala Phe Ile Glu Gly Phe Thr Val 805 810 815 cct agt gct gtc aaa aat att cac att tct ccc aat gga gca aca gat 2496 Pro Ser Ala Val Lys Asn Ile His Ile Ser Pro Asn Gly Ala Thr Asp 820 825 830 agc ctg acg gtg aac tgg act cct ggt ggg gga gac gtt gat tcc tac 2544 Ser Leu Thr Val Asn Trp Thr Pro Gly Gly Gly Asp Val Asp Ser Tyr 835 840 845 acg gtg tcg gca ttc agg cac agt caa aag gtt gac tct cag act att 2592 Thr Val Ser Ala Phe Arg His Ser Gln Lys Val Asp Ser Gln Thr Ile 850 855 860 ccc aag cac gtc ttt gag cac acg ttc cac aga ctg gag gcc ggg gag 2640 Pro Lys His Val Phe Glu His Thr Phe His Arg Leu Glu Ala Gly Glu 865 870 875 880 cag tac cag atc atg att gcc tca gtc agc ggg tcc ctg aag aat cag 2688 Gln Tyr Gln Ile Met Ile Ala Ser Val Ser Gly Ser Leu Lys Asn Gln 885 890 895 ata aat gtg gtt ggg cgg aca gtt cca gca tct gtc caa gga gta att 2736 Ile Asn Val Val Gly Arg Thr Val Pro Ala Ser Val Gln Gly Val Ile 900 905 910 gca gac aat gca tac agc agt tat tcc tta ata gta agt tgg caa aaa 2784 Ala Asp Asn Ala Tyr Ser Ser Tyr Ser Leu Ile Val Ser Trp Gln Lys 915 920 925 gct gct ggt gtg gca gaa aga tat gat atc ctg ctt cta act gaa aat 2832 Ala Ala Gly Val Ala Glu Arg Tyr Asp Ile Leu Leu Leu Thr Glu Asn 930 935 940 gga atc ctt ctg cgc aac aca tca gag cca gcc acc act aag caa cac 2880 Gly Ile Leu Leu Arg Asn Thr Ser Glu Pro Ala Thr Thr Lys Gln His 945 950 955 960 aaa ttt gaa gat cta aca cca ggc aag aaa tac aag ata cag atc cta 2928 Lys Phe Glu Asp Leu Thr Pro Gly Lys Lys Tyr Lys Ile Gln Ile Leu 965 970 975 act gtc agt gga ggc ctc ttt agc aag gaa gcc cag act gaa ggc cga 2976 Thr Val Ser Gly Gly Leu Phe Ser Lys Glu Ala Gln Thr Glu Gly Arg 980 985 990 aca gtc cca gca gct gtc acc gac ctg agg atc aca gag aac tcc acc 3024 Thr Val Pro Ala Ala Val Thr Asp Leu Arg Ile Thr Glu Asn Ser Thr 995 1000 1005 agg cac ctg tcc ttc cgc tgg acc gcc tca gag ggg gag ctc agc tgg 3072 Arg His Leu Ser Phe Arg Trp Thr Ala Ser Glu Gly Glu Leu Ser Trp 1010 1015 1020 tac aac atc ttt ttg tac aac cca gat ggg aat ctc cag gag aga gct 3120 Tyr Asn Ile Phe Leu Tyr Asn Pro Asp Gly Asn Leu Gln Glu Arg Ala 1025 1030 1035 1040 caa gtt gac cca cta gtc cag agc ttc tct ttc cag aac ttg cta caa 3168 Gln Val Asp Pro Leu Val Gln Ser Phe Ser Phe Gln Asn Leu Leu Gln 1045 1050 1055 ggc aga atg tac aag atg gtg att gta act cac agt ggg gag ctg tct 3216 Gly Arg Met Tyr Lys Met Val Ile Val Thr His Ser Gly Glu Leu Ser 1060 1065 1070 aat gag tct ttc ata ttt ggt aga aca gtc cca gcc tct gtg agt cat 3264 Asn Glu Ser Phe Ile Phe Gly Arg Thr Val Pro Ala Ser Val Ser His 1075 1080 1085 ctc agg ggg tcc aat cgg aac acg aca gac agc ctt tgg ttc aac tgg 3312 Leu Arg Gly Ser Asn Arg Asn Thr Thr Asp Ser Leu Trp Phe Asn Trp 1090 1095 1100 agt cca gcc tct ggg gac ttt gac ttt tat gag ctg att ctc tat aat 3360 Ser Pro Ala Ser Gly Asp Phe Asp Phe Tyr Glu Leu Ile Leu Tyr Asn 1105 1110 1115 1120 ccc aat ggc aca aag aag gaa aac tgg aaa gac aag gac ctg acg gag 3408 Pro Asn Gly Thr Lys Lys Glu Asn Trp Lys Asp Lys Asp Leu Thr Glu 1125 1130 1135 tgg cgg ttt caa ggc ctt gtt cct gga agg aag tac gtg ctg tgg gtg 3456 Trp Arg Phe Gln Gly Leu Val Pro Gly Arg Lys Tyr Val Leu Trp Val 1140 1145 1150 gta act cac agt gga gat ctc agc aat aaa gtc aca gcg gag agc aga 3504 Val Thr His Ser Gly Asp Leu Ser Asn Lys Val Thr Ala Glu Ser Arg 1155 1160 1165 aca gct cca agt cct ccc agt ctt atg tca ttt gct gac att gca aac 3552 Thr Ala Pro Ser Pro Pro Ser Leu Met Ser Phe Ala Asp Ile Ala Asn 1170 1175 1180 aca tcc ttg gcc atc acg tgg aaa ggg ccc cca gac tgg aca gac tac 3600 Thr Ser Leu Ala Ile Thr Trp Lys Gly Pro Pro Asp Trp Thr Asp Tyr 1185 1190 1195 1200 aac gac ttt gag ctg cag tgg ttg ccc aga gat gca ctt act gtc ttc 3648 Asn Asp Phe Glu Leu Gln Trp Leu Pro Arg Asp Ala Leu Thr Val Phe 1205 1210 1215 aac ccc tac aac aac aga aaa tca gaa gga cgc att gtg tat ggt ctt 3696 Asn Pro Tyr Asn Asn Arg Lys Ser Glu Gly Arg Ile Val Tyr Gly Leu 1220 1225 1230 cgt cca ggg aga tcc tat caa ttc aac gtc aag act gtc agt ggt gat 3744 Arg Pro Gly Arg Ser Tyr Gln Phe Asn Val Lys Thr Val Ser Gly Asp 1235 1240 1245 tcc tgg aaa act tac agc aaa cca att ttt gga tct gtg agg aca aag 3792 Ser Trp Lys Thr Tyr Ser Lys Pro Ile Phe Gly Ser Val Arg Thr Lys 1250 1255 1260 cct gac aag ata caa aac ctg cat tgc cgg cct cag aac tcc acg gcc 3840 Pro Asp Lys Ile Gln Asn Leu His Cys 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ttt aca cag ctc ttt gat gag gac ctg aag gaa 4512 Ile Ser Ile Arg Ala Phe Thr Gln Leu Phe Asp Glu Asp Leu Lys Glu 1490 1495 1500 ttc aca aag cca ctc tat tca gac aca ttt ttt tct tta ccc atc act 4560 Phe Thr Lys Pro Leu Tyr Ser Asp Thr Phe Phe Ser Leu Pro Ile Thr 1505 1510 1515 1520 act gaa tca gag ccc ttg ttt gga gct att gaa cgc ggc cgc cat cat 4608 Thr Glu Ser Glu Pro Leu Phe Gly Ala Ile Glu Arg Gly Arg His His 1525 1530 1535 cat cat cat cac gga 4623 His His His His Gly 1540 <210> 2 <211> 1541 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Leu Ser His Gly Ala Gly Leu Ala Leu Trp Ile Thr Leu Ser Leu 1 5 10 15 Leu Gln Thr Gly Leu Ala Glu Pro Glu Arg Cys Asn Phe Thr Leu Ala 20 25 30 Glu Ser Lys Ala Ser Ser His Ser Val Ser Ile Gln Trp Arg Ile Leu 35 40 45 Gly Ser Pro Cys Asn Phe Ser Leu Ile Tyr Ser Ser Asp Thr Leu Gly 50 55 60 Ala Ala Leu Cys Pro Thr Phe Arg Ile Asp Asn Thr Thr Tyr Gly Cys 65 70 75 80 Asn Leu Gln Asp Leu Gln Ala Gly Thr Ile Tyr Asn Phe Lys Ile Ile 85 90 95 Ser Leu Asp Glu Glu Arg 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1630 <210> 8 <211> 774 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human-mouse chimeric molecule <400> 8 Met Leu Arg His Gly Ala Leu Thr Ala Leu Trp Ile Thr Leu Ser Val 1 5 10 15 Val Gln Thr Gly Val Ala Glu Pro Glu Arg Cys Asn Phe Thr Leu Ala 20 25 30 Glu Ser Lys Ala Ser Ser His Ser Val Ser Ile Gln Trp Arg Ile Leu 35 40 45 Gly Ser Pro Cys Asn Phe Ser Leu Ile Tyr Ser Ser Asp Thr Leu Gly 50 55 60 Ala Ala Leu Cys Pro Thr Phe Arg Ile Asp Asn Thr Thr Tyr Gly Cys 65 70 75 80 Asn Leu Gln Asp Leu Gln Ala Gly Thr Ile Tyr Asn Phe Lys Ile Ile 85 90 95 Ser Leu Asp Glu Glu Arg Thr Val Val Leu Gln Thr Asp Pro Leu Pro 100 105 110 Pro Ala Arg Phe Gly Val Ser Lys Glu Lys Thr Thr Ser Thr Gly Leu 115 120 125 His Val Trp Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Val Thr Ser Tyr Glu Val 130 135 140 Gln Leu Phe Asp Glu Asn Asn Gln Lys Ile Gln Gly Val Gln Ile Gln 145 150 155 160 Glu Ser Thr Ser Trp Asn Glu Tyr Thr Phe Phe Asn Leu Thr Ala Gly 165 170 175 Ser Lys Tyr Asn Ile Ala Ile Thr Ala Val Ser Gly Gly Lys Arg Ser 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Val Ala Glu Gln Val Lys Cys Asn Phe Thr Leu Leu 20 25 30 Glu Ser Arg Val Ser Ser Leu Ser Ala Ser Ile Gln Trp Arg Thr Phe 35 40 45 Ala Ser Pro Cys Asn Phe Ser Leu Ile Tyr Ser Ser Asp Thr Ser Gly 50 55 60 Pro Met Trp Cys His Pro Ile Arg Ile Asp Asn Phe Thr Tyr Gly Cys 65 70 75 80 Asn Pro Lys Asp Leu Gln Ala Gly Thr Val Tyr Asn Phe Arg Ile Val 85 90 95 Ser Leu Asp Gly Glu Glu Ser Thr Leu Val Leu Gln Thr Asp Pro Leu 100 105 110 Pro Pro Ala Arg Phe Gly Val Ser Lys Glu Lys Thr Thr Ser Thr Gly 115 120 125 Leu His Val Trp Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Val Thr Ser Tyr Glu 130 135 140 Val Gln Leu Phe Asp Glu Asn Asn Gln Lys Ile Gln Gly Val Gln Ile 145 150 155 160 Gln Glu Ser Thr Ser Trp Asn Glu Tyr Thr Phe Phe Asn Leu Thr Ala 165 170 175 Gly Ser Lys Tyr Asn Ile Ala Ile Thr Ala Val Ser Gly Gly Lys Arg 180 185 190 Ser Phe Ser Val Tyr Thr Asn Gly Ser Thr Val Pro Ser Pro Val Lys 195 200 205 Asp Leu Gly Ile Ser Pro Asn Pro Asn Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser 210 215 220 Arg Gly Ser Gly Asn Val Glu Gln Tyr 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Val Thr Val Asn Asn Ser Gly 645 650 655 Arg Asn Asp Tyr Leu Ser Val Ser Trp Leu Pro Ala Pro Gly Glu Val 660 665 670 Asp His Tyr Val Val Ser Leu Ser His Glu Gly Lys Val Asp Gln Phe 675 680 685 Leu Ile Ile Ala Lys Ser Val Ser Glu Cys Ser Phe Ser Ser Leu Thr 690 695 700 Pro Gly Arg Leu Tyr Asn Val Thr Val Thr Thr Lys Ser Gly Asn Tyr 705 710 715 720 Ala Ser His Ser Phe Thr Glu Glu Arg Thr Lys Gly Asn Ser Ala Asp 725 730 735 Ile Gln His Ser Gly Gly Arg Ser Ser Leu Glu Gly Pro Arg Phe Glu 740 745 750 Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr Arg Thr 755 760 765 Gly His His His His His His 770 775 <210> 10 <211> 774 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human-mouse chimeric molecule <400> 10 Met Leu Arg His Gly Ala Leu Thr Ala Leu Trp Ile Thr Leu Ser Val 1 5 10 15 Val Gln Thr Gly Val Ala Glu Pro Glu Arg Cys Asn Phe Thr Leu Ala 20 25 30 Glu Ser Lys Ala Ser Ser His Ser Val Ser Ile Gln Trp Arg Ile Leu 35 40 45 Gly Ser Pro Cys Asn Phe Ser Leu Ile Tyr Ser Ser Asp Thr Leu 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Claims (17)

  1. 인간 단백질 타이로신 포스파타아제 베타(human protein tyrosine phosphatase beta, HPTPβ)에 결합하며, 혈관 형성(angiogenesis)을 조절하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, HPTPβ의 N-말단부에 결합하는 항체.
  3. 제2항에 있어서, HPTPβ의 제1 FN3 반복체에 결합하는 항체.
  4. 제3항에 있어서, HPTPβ의 제1 FN3 반복체는 서열 번호 11에 나타낸 서열 또는 그 단편을 갖는 항체.
  5. 제1항에 있어서, 단일 클론 항체인 항체.
  6. 제5항에 있어서, 하이브리도마 세포주 ATCC(American Type Culture Collection) 번호 PTA-7580에 의해 생성된 단일 클론 항체, 또는 하이브리도마 세포주 ATCC 번호 PTA-7580에 의해 생성된 단일 클론 항체의 단편.
  7. 상기 전 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화된 항체 또는 항원 결합 단 편.
  8. 제6항에 있어서, 단일 클론 항체 R15E6 유래의 항원 결합 영역 잔기를 포함하며, 인간화된 항체.
  9. 제7항에 있어서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체의 항원 결합 단편.
  10. 제7항에 있어서, Fv 단편, Fab 단편, Fab' 단편 및 F(ab')2 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체의 항원 결합 단편.
  11. 혈관 형성 조절된 질병의 치료에 사용하기 위한 의약의 제조에 있어서 HPTP베타에 결합하여 혈관 형성을 조절하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 용도.
  12. 제11항에 있어서, 혈관 형성 조절된 질병은 당뇨병성 망막증, 황반 변성, 암, 겸상 적혈구 빈혈증, 사르코이드, 매독, 탄성섬유 가황색종, 파제트병(Paget's disease), 정맥 폐쇄, 동맥 폐쇄, 경동맥 폐색성 질환, 만성 포도막염/유리체염, 미코박테리아 감염(mycobacterial infection), 라임병(Lyme's disease), 전신성 홍반성 루푸스, 미숙아 망막증, 일스병(Eales' disease), 베체트병(Behcet's disease), 망막염 또는 맥락막염을 야기하는 감염, 추정 눈 히스토플라스마증(presumed ocular histoplasmosis), 베스트병(Best's disease), 근시, 시신경 유두소와(optic pits), 스타르가르트병(Stargardt's disease), 평면부염, 만성 망막 박리, 고점도 증후군, 톡소플라스마증, 외상 및 레이저 후 합병증, 루베오시스(rubeosis)와 관련된 질환, 및 증식성 유리체 망막증으로부터 선택되는 혈관 형성 상승된 질병인 용도.
  13. 제11항에 있어서, 혈관 형성 조절된 질병은 크론병 및 궤양성 대장염을 포함하는 염증성 장질환, 건선, 사르코이드증, 류마티스 관절염, 혈관종, 오슬러-웨버-렌두병(Osler-Weber-Rendu disease), 또는 유전성 출혈성 모세 혈관 확장증, 고형 또는 혈인성(blood borne) 종양 및 후천성 면역 결핍 증후군으로부터 선택되는 혈관 형성 상승된 질병인 용도.
  14. 제11항에 있어서, 혈관 형성 조절된 질병은 골격근 및 심근 허혈, 뇌졸중, 관상 동맥 질환, 말초 혈관 질환 및 관상 동맥 질환으로부터 선택되는 혈관 형성 감소된 질병이며, 바람직하게는 혈관 형성 감소된 질병은 말초 혈관 질환 또는 관상 동맥 질환인 용도.
  15. 단일 클론 항체 R15E6.
  16. 단일 클론 항체 R15E6과 동일하거나 사실상 동일한 생물학적 특징을 갖는 항체.
  17. a. 제1항, 제6항, 제7항, 제8항, 제15항 또는 제16항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그 단편; 및
    b. 약학적으로 허용가능한 담체
    를 함유하는 약학 조성물.
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