CN104870011A - 选择性抑制t细胞应答的抗体和方法 - Google Patents

选择性抑制t细胞应答的抗体和方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了利用抗-αβTCR抗体和抗体片段治疗炎性和/或自身免疫性疾病和/或移植组织排斥的组合物、方法和分析。抗-αβTCR抗体是结合αβTCR的抗体。还提供了由杂交瘤TOL101MCB产生的抗-αβTCR抗体。还提供了利用抗-αβTCR抗体和抗体片段的治疗给药服用法治疗炎性疾病、自身免疫性疾病和组织移植物排斥的方法，以及上调Treg T细胞的数量的方法。

Description

选择性抑制T细胞应答的抗体和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求美国临时专利申请No:61/555,335(2011年11月3日提交)；61/555,344(2011年11月3日提交)；61/589,715(2012年1月23日提交)；61/610,348(2012年3月13日提交)和61/654,631(2012年6月1日提交)的优先权，每篇的全部内容通过提及完整并入本文。
电子提交的文本文件的描述
随此一起电子提交的文本文件的内容通过提及完整并入本文：序列表的计算机可读形式的副本(文件名：TLRA_001_01WO_SeqList_ST25.txt，记录日期：2012年11月5日，文件大小20千字节)。
发明领域
本发明涉及选择性抑制(TCR+)T细胞免疫应答的抗体和方法。特别是，本发明涉及使用抗-αβTCR抗体和抗体片段治疗移植物排斥、自身免疫疾病和炎性疾病。还描述了鉴定(TCR+)T细胞免疫应答的调节物的方法和分析。在某些实施方式中，所述抗-αβTCR抗体是TOL101单克隆抗体、TOL101嵌合抗体、TOL101人源化抗体或其变体。
发明背景
此部分中的语句仅仅提供与当前公开内容相关的背景信息，不能构成现有技术。
T细胞受体(TCR)由至少7种整合膜蛋白组成。在大部分外周T细胞上，TCR含有克隆性分布的、二硫化物连接的异二聚体，所述异二聚体由αTCR链和αβTCR链组成。这些克隆型的链细分为α链的可变(V)、连接(J)和恒定(C)片段，以及β链的多样性(D)片段。与αβTCR相连的是形成CD3复合物的三条不变链。αβTCR对于抗原/MHC识别是关键的，而CD3蛋白在信号转导中起到重要作用。
αβTCR链的结构与抗体的结构类似，具有源自遗传重组的可变区，产生了TCR全集的大多样性。另一方面，αβTCR的恒定区和跨膜区是保守的。这些保守的区域是非常重要的，因为它们在α链和β链的结合中起作用，与CD3蛋白相互作用，并在TCR部件从内质网向细胞表面的转运中起到作用。在恒定区内有突变的患者可能具有功能不良的αβTCR，但更常见的是完全不能表达TCR。生理学上，带有这些突变的患者遭遇严重的免疫缺陷。在Journal of Clinical Investigation(临床研究杂志)中一项近期的研究显示，在多个患者中αTCR亚基恒定基因中紧接翻译终止密码子之后的外显子3的最后一个碱基上的遗传损伤引起婴儿的严重免疫缺陷，需要终身的抗病毒和抗生素预防(Morgan,et al.,“Mutation in the TCRαsubunit constant gene(TRAC)leads to a human immunodeficiency disorder characterized by a lack of TCRαβ+T-cells”.J.Clin.Invest.,Feb 2011)。
在同种异体的实体器官移植之后，在没有免疫抑制介入的情况下，供体和接受者抗原呈递细胞向同种反应性(alloreactive)alpha-beta(αβ)T细胞呈递移植物抗原，这些T细胞在被活化时引起炎性反应和同种异体移植物的快速排斥。这些T细胞，包括T辅助(CD4)和细胞毒性(CD8)T细胞，在急性器官移植物排斥反应中是关键的，因为它们将同种异体抗原，包括主要组织相容性复合体(MHC)抗原识别为外源的。gamma-delta(γδ)T细胞表达γδT细胞受体(TCR)，一般不识别MHC环境中的蛋白抗原，而是识别非常规的非蛋白抗原。γδT细胞在几个方面上对于肾脏移植患者可以是有益的，包括提供针对多种微生物感染的保护，对于这些微生物感染，免疫抑制的移植患者是特别脆弱的。这样的感染包括巨细胞病毒(CMV)，移植患者中一种常见的病毒感染，通过它的免疫抑制性质，可以引起其他机会致病性感染以及移植后的淋巴增殖性病症。
在小鼠中和在人类中，供体γδT细胞的存在在骨髓移植模型中与更好的结局相关，部分是通过防止移植物抗宿主疾病(GVHD)，然而机制还未完全了解。γδT细胞的一个子集是正常人和大部分肝脏移植患者的外周血中的稀有群体，但是与“操作上耐受的(operationally tolerant)”肝移植患者的外周血中的其他γδT细胞子集相比扩大到更高的频率。这些患者被认为是“操作上耐受的”，因为他们达到了对同种异体移植物的耐受水平，其容许免疫抑制的总体消除。γδT细胞的这种扩展的子集与怀孕个体中半-同种异体抗原的耐受性相关的子集是同一个，表明这些细胞在针对同种异体抗原的耐受性的产生和/或维持中起到重要作用。此外，外周γδT细胞的降低与急性和慢性肾脏同种异体移植物排斥相关，而平均起来，稳定的非排斥的肾脏移植患者具有更高百分比的γδT细胞。结合起来，这些研究表明，不引起γδT细胞的消减或灭活的免疫抑制剂可能与更好的结局相关。
对于如下的试剂存在着未被满足的医学需求，所述试剂能以非促有丝分裂方式选择性灭活特定的αβT细胞，而不使患者非必要性地暴露于非特异性、长期或开放的免疫抑制，该免疫抑制可能加重感染和恶性肿瘤的风险。gamma-delta T细胞是对抗传染原的保护中重要的介体，与αβT细胞共有几种共同的特征，包括CD25、CD52和CD3的表达。因而，当前使用的诱导疗法，包括抗胸腺细胞球蛋白(ATG)、阿伦单抗(alemtuzumab)、巴利昔单抗(basiliximab)和赛尼哌(daclizumab)，不仅靶向同种反应性T细胞，而且还靶向γδT细胞和NK细胞。通过单独靶向αβTCR、忽略γδT细胞，一种预防急性器官排斥或治疗炎性或自身免疫疾病的更为特异性的方法可以提供比当前使用的T细胞靶向抗体相似的或更好的效力，同时就发生机会致病感染和恶性肿瘤方面带有更少的风险。虽然已经尝试开发某些αβTCR特异性抗体，还没有同时展现出足够的临床效力以及可接受的安全性分布。因而需要αβTCR特异性抗体，其在包括炎性疾病、自身免疫疾病和同种异体移植物排斥的疾病和状况中展现效力，同时展现最小的副作用。
发明概述
除非另外定义，此处使用的所有技术和科学术语具有本技术所属技术领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。虽然类似于或等同于在此描述的那些的方法和材料可以被用于本技术的实践和测试，以下描述了适合的方法和材料。此外，材料、方法和实施例仅是说明性的，而不意图是限制性的。在此提及的所有公开物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用将它们完整地合并。在冲突的情况下，以当前的说明书(包括定义)为准。
本发明提供了利用抗-αβTCR抗体和抗体片段用于治疗炎性和/或自身免疫性疾病和/或移植组织排斥的组合物、方法和分析。在某些实施方式中，本发明提供了使用每天仅单次剂量的抗-αβTCR抗体来治疗自身免疫性疾病的方法。在某些实施方式中，本发明的抗-αβTCR抗体是TOL101单克隆抗体、TOL101嵌合抗体、TOL101人源化抗体或其变体。TOL101单克隆抗体是小鼠单克隆IgM抗体，其结合人类αβTCR，由称为TOL101主细胞库(MCB)的杂交瘤产生。产生TOL101的TOL101 MCB杂交瘤于2012年11月2日根据国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约的规定保藏在美国典型培养物保藏所(ATCC)，10801 University Boulevard,Manassas,Va.20110-2209,分配的ATCC登记号码______________。
在一个方面，本发明提供了分离的杂交瘤细胞系，其产生结合αβTCR的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，所述杂交瘤细胞系是TOL101MCB。在其他方面，本发明提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其结合αβTCR，并且在与杂交瘤TOL101 MCB产生的抗体相当或相应的氨基酸残基处是糖基化的。在本发明的另一个实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合片段是TOL101或其片段，其由杂交瘤TOL101 MCB产生。
在一个实施方式中，本发明的分离的抗体或其片段在与T细胞上的αβTCR结合时不诱导细胞因子的产生。在进一步的实施方式中，本发明的分离的抗体或其片段在与T细胞上的αβTCR结合时不诱导肿瘤坏死因子-alpha(TNF-α)、干扰素-gamma(IFN-γ)、白细胞介素-2和/或白细胞介素-6的产生。在另一个实施方式中，本发明的分离的抗体或其片段在与T细胞上的αβTCR结合时不产生与细胞因子释放综合征相关的细胞因子的水平。在进一步的实施方式中，与细胞因子释放综合征相关的细胞因子是TNF-α、IFN-γ、白细胞介素-2和/或白细胞介素-6。在另一个实施方式中，本发明的分离的抗体或其片段在与T细胞上的αβTCR结合时诱导小于500pg/mL TNF-α的产生。在另一个实施方式中，本发明的分离的抗体或其片段在与T细胞上的αβTCR结合时诱导小于500pg/mL IFN-γ的产生。在另一个实施方式中，本发明的分离的抗体或其片段在与T细胞上的αβTCR结合时诱导小于500pg/mL白细胞介素-2的产生。在另一个实施方式中，本发明的分离的抗体或其片段在与T细胞上的αβTCR结合时诱导小于500pg/mL白细胞介素-6的产生。在另一个实施方式中，本发明的分离的抗体或其片段结合T细胞上的αβTCR，其中所述抗体结合αβTCR并降低T细胞上αβTCR和CD3的表面表达，其中所述抗体不消减T细胞。在另一个实施方式中，本发明的分离的抗体或其片段在结合αβTCR时诱导AKT或ERK的磷酸化。在另一个实施方式中，本发明的分离的抗体或其片段在小于60％的αβTCR+T细胞中诱导钙流量(calcium flux)。在进一步的实施方式中，所述抗体或其片段在小于50％的αβTCR+T细胞中诱导钙流量。在进一步的实施方式中，所述抗体或其片段在小于40％的αβTCR+T细胞中诱导钙流量。在进一步的实施方式中，所述抗体或其片段在小于30％的αβTCR+T细胞中诱导钙流量。在进一步的实施方式中，所述抗体或其片段在小于20％的αβTCR+T细胞中诱导钙流量。在进一步的实施方式中，所述抗体或其片段在小于15％的αβTCR+T细胞中诱导钙流量。在更进一步的实施方式中，所述抗体或其片段在小于10％的αβTCR+T细胞中诱导钙流量。在另一个实施方式中，本发明的分离的抗体或其片段降低特异于αβTCR的其他抗体，包括IP26、3a8和T10B9的结合。在一个实施方式中，所述抗体或其片段降低单克隆抗体T10B9、3a8或IP26对αβTCR的结合约10％到约100％。在进一步的实施方式中，所述抗体或其片段降低单克隆抗体T10B9、3a8或IP26对αβTCR的结合约40％到约90％。在更进一步的实施方式中，所述抗体或其片段降低单克隆抗体T10B9、3a8或IP26对αβTCR的结合约60％到约80％。在又进一步的实施方式中，所述抗体或其片段降低单克隆抗体T10B9、3a8或IP26对αβTCR的结合至少80％。在另一个实施方式中，所述分离的抗体或其片段结合T细胞上的αβTCR，其中所述抗体或其片段的交联不诱导T细胞的增殖。如在此使用的，术语“交联”是指抗体固定在例如固相塑性表面上。
在一个实施方式中，本发明提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其中三个轻链互补决定区(CDRL1、CDRL2和CDRL3)以及三个重链互补决定区(CDRH1、CDRH2和CDRH3)是杂交瘤TOL101 MCB产生的抗体的轻链和重链互补决定区。在另一个实施方式中，所述抗体或其片段由包含SEQID NOs:3、4和5的多核苷酸序列编码。在另一个实施方式中，所述抗体或其片段包含根据SEQ ID NOs：6、7和8的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本发明提供了结合αβTCR的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体、scFv、Fab片段、Fab’片段和F(ab)’片段。
在一个实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合片段结合αβTCR并与可检测标记物偶联，所述可检测标记包括但不限于放射性同位素、酶、荧光标记物、发光标记物、生物发光标记物、生物素或毒素。
在一个实施方式中，本发明的分离的抗体或其抗原结合片段结合T细胞上的αβTCR，并且在所述抗体或抗原结合片段的交联之后不诱导T细胞的增殖。
在一个方面，本发明提供了治疗炎性疾病、自身免疫性疾病或移植组织排斥，预防炎性疾病、自身免疫性疾病或移植组织排斥的发作，改善或降低炎性疾病、自身免疫性疾病或移植组织排斥的症状的方法，包括向有此需要的人类患者施用治疗有效量的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或片段结合αβTCR。在另一个方面，本发明提供了抑制T细胞免疫应答的方法，以治疗炎性疾病、自身免疫性疾病或对移植组织的应答，预防炎性疾病、自身免疫性疾病或对移植组织的应答的发作，改善或降低炎性疾病、自身免疫性疾病或对移植组织的应答的症状，包括向有此需要的人类患者施用治疗有效量的抗-αβTCR抗体或其抗原结合片段。可以被本发明的抗体或其片段检测、诊断、治疗、预后、改善或监视的炎性疾病、自身免疫疾病或移植组织排斥包括但不限于：哮喘、变态反应、变应性气道炎症、变应性脑脊髓炎、自身免疫性关节炎、类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、反应性关节炎、银屑病关节炎、骶髂关节炎、孤立性急性前葡萄膜炎、未分化脊椎关节病、1型糖尿病、多发性硬化、系统性红斑狼疮、肾小球肾炎、桥本甲状腺炎、格雷夫斯氏病、硬皮症、乳糜泻、克罗恩氏病、炎性肠病、溃疡性结肠炎、强直性脊柱炎、斯耶格伦氏综合征、银屑病、接触性皮炎、古德帕斯彻氏综合征、阿狄森氏病、韦格纳氏肉芽肿病、原发性胆汁性肝硬化、硬化性胆管炎、自身免疫性肝炎、风湿性多肌痛、白塞氏病、格-巴二氏综合征、各种血管炎、葡萄膜视网膜炎、甲状腺炎、重症肌无力、免疫球蛋白肾病、心肌炎、进行性系统性硬化病、器官移植物排斥、混合性结缔组织排斥和移植物抗宿主疾病(asthma,allergy,allergic airway inflammation,allergicencephalomyelitis,autoimmune arthritis,rheumatoid arthritis,Juvenilerheumatoid arthritis,reactive arthritis,psoriatic arthritis,sacroilitis,isolated acuteanterior uveitis,undifferentiated spondyloarthropathy,Type 1 Diabetes Mellitus,Multiple Sclerosis,Systemic Lupus Erythematosus,glomerulonephritis,Hashimoto's thyroiditis,Graves'disease,Scleroderma,Celiac disease,Crohn'sdisease,inflammatory bowel disease,ulcerative colitis,ankylosing spondylitis,Sjogren's syndrome,psoriasis,contact dermatitis,Goodpasture's syndrome,Addison's disease,Wegener's granulomatosis,Primary biliary cirrhosis,Sclerosing cholangitis,Autoimmune hepatitis,Polymyalgia Rheumatica,Bechet'sdisease,Guillain-Barre syndrome,various vasculitides,uveoretinitis,thyroditis,myasthenia gravis,immunoglobulin nephropathies,myocarditis,progressivesystemic sclerosis,organ graft rejection,mixed connective tissue rejection,andgraft-versus-host disease)。
在一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段结合αβTCR，以及如通过酶联免疫吸附测定(ELISA)所测量的，在低于20％的施用所述抗体或其片段的人类患者中诱导人类抗小鼠抗体(HAMA)应答。在进一步的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段结合αβTCR，以及如通过ELISA测量的，在低于10％或5％的施用所述抗体或其片段的人类患者中诱导HAMA应答。
在一个实施方式中，本发明还提供了生产分离的抗体或其片段的方法，包括用编码抗体或其片段的多核苷酸序列转染哺乳动物宿主细胞，所述抗体或其片段包含杂交瘤TOL101 MCB产生的抗体的轻链和重链的六个互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)；培养所述宿主细胞；以及分离所述宿主细胞产生的、结合αβTCR的所述抗体或其片段。在一个实施方式中，通过这种方法产生的抗体或其片段降低T细胞上αβTCR和CD3的表面表达，并且不消减T细胞。在另一个实施方式中，通过这种方法产生的分离的抗体或其片段是由包含SEQ ID NO:3和4的多核苷酸序列编码的。在进一步的实施方式中，所述多核苷酸序列进一步包含SEQ ID NO：5。在更进一步的实施方式中，通过这种方法产生的分离的抗体是TOL101。
在另一个方面，本发明提供了鉴定抑制TCR+T细胞活化的治疗性化合物的方法。在进一步的实施方式中，所述方法包括步骤：(a)在可操作以形成TCR-抗αβTCR复合物的条件下，用抗-αβTCR抗体或其抗体片段接触αβT细胞受体(αβTCR)或其片段；(b)用候选化合物接触所述TCR-抗αβTCR复合物；(c)测定所述候选化合物调节所述抗-αβTCR抗体或其抗体片段与TCR或其片段的结合的能力，以及(d)测定在存在抗-CD3抗体的情况下所述候选化合物是否活化静息T细胞，其中所述抗αβTCR抗体或其抗体片段与所述TCR或其片段的结合的调节以及不能活化静息T细胞表明所述候选化合物是治疗性化合物。在进一步的方面中，本发明包括治疗炎性疾病、自身免疫性疾病或移植组织排斥的方法，所述方法包括步骤：以约14mg/天到约52mg/天的量向有此需要的受试者施用抗-αβTCR抗体或其抗体片段，其中所述抗体是由杂交瘤TOL101 MCB产生的。
在一个实施方式中，本发明提供了治疗自身免疫性疾病、炎性疾病或移植组织排斥的方法，包括以约7mg/天到约58mg/天的量向有此需要的受试者施用αβTCR抗体或其抗原结合片段。在进一步的实施方式中，所述抗-αβTCR抗体或其抗原结合片段是由杂交瘤TOL101 MCB产生的。在进一步的实施方式中，所述抗-αβTCR抗体或其片段以7mg/天、14mg/天、21mg/天、28mg/天、30mg/天、32mg/天、34mg/天、35mg/天、36mg/天、38mg/天、40mg/天、42mg/天、44mg/天、46mg/天、48mg/天、50mg/天、52mg/天、54mg/天、56mg/天或58mg/天或其组合的量施用。
在一个实施方式中，本发明提供了治疗自身免疫性疾病、炎性疾病或移植组织排斥的方法，包括按以下给药日程施用αβTCR抗体或其抗原结合片段，所述给药日程包含第1天14mg，第2天21mg，第3天28mg，第4天42mg和第5天42mg。在进一步的实施方式中，所述抗体或其片段按以下给药日程施用，所述给药日程包含第1天14mg，第2天21mg，第3天28mg，第4天42mg，第5天42mg和第6天42mg。在一个实施方式中，所述αβTCR抗体或其抗原结合片段每天施用一次。
在一个方面，本发明提供了在有此需要的受试者中诱导调节性T细胞(Tregs)的方法，包括按以下给药日程施用αβTCR抗体或其抗原结合片段，所述给药日程包含第1天14mg，第2天21mg，第3天28mg，第4天42mg和第5天42mg。在进一步的实施方式中，所述抗体或其片段按以下给药日程施用，所述给药日程包含第1天14mg，第2天21mg，第3天28mg，第4天42mg，第5天42mg和第6天42mg。在一个实施方式中，在开始给药日程之前测定受试者中存在的每毫升全血的Tregs浓度，来获得受试者中每毫升全血的Tregs基线水平。在某些实施方式中，Tregs表型上是CD2+CD4+CD25+FOXP3+CD127lo Tregs。在某些实施方式中，使用特定的细胞表面标志物和流式细胞术来测定Tregs的数目。在某些实施方式中，提供了诱导Tregs的方法，其中受试者需要抑制同种反应性T细胞，或抑制细胞毒性T细胞(CTL)活性，或免疫抑制同种应答(alloresponse)，或抑制自身免疫应答，或在组织移植之前、期间或之后抑制、阻止或阻断同种应答或自身免疫应答，或抑制、阻抑或阻断移植物抗宿主疾病，或预防、治疗或抑制炎性疾病或自身免疫性疾病中的自身免疫应答。
在以下附随的附图和说明中将阐述本发明的一个或多个实施方式的细节。根据在此提供的描述，可用性的进一步范围将变得明显。要理解的是，所述说明和具体实施例仅仅是为了例举的目的，而不是意图限制当前的公开内容的范围。
附图简述
在此描述的附图仅是举例的目的，而无论如何不是意图限制当前的公开内容的范围。
图1描绘了柱形图，说明TOL101在单向混合淋巴细胞反应(MLR)(one-way mixed lymphocyte reaction)中抑制增殖。
图2描绘了在存在变化浓度的TOL101的情况下在单向MLR中T细胞增殖的时间过程线形图。
图3描绘了在存在变化浓度的、游离形式对比交联的TOL101的情况下T细胞增殖的柱形图。
图4描绘了柱形图，其描绘了抗-CD3介导的T细胞增殖的TOL101介导的抑制。
图5描绘了流动细胞术象形图，其说明TOL101对带有活化和未活化(naive)表型的αβTCR+T细胞的特异性。
图6描绘了流式细胞术象形图，其说明了在单向混合淋巴细胞反应中TOL101对活化的αβTCR+T细胞子集的特异性。
图7描绘了流式细胞术象形图，其说明了TOL101对来自新分离的外周血单核细胞的记忆子集αβTCR+T细胞的特异性。
图8描绘了流式细胞术象形图，其说明了TOL101对在单向混合淋巴细胞反应中刺激之后新分离的外周血单核细胞的记忆子集αβTCR+T细胞的特异性。
图9描绘了流式细胞术象形图，其说明在新分离的外周血单核细胞的抗-CD3活化之后TOL101的结合降低。
图10描绘了T细胞中ZAP70磷酸化以及TOL101降低抗-CD3介导的ZAP70磷酸化的能力的柱形图。
图11A描绘了在变化的条件下T细胞中ERK/p38磷酸化以及TOL101在抗-CD3处理的T细胞中诱导磷酸化的ERK的能力的柱形图。图11B显示了在每个条件下ERK/p38磷酸化的原始数值。
图12A描绘了在存在和不存在抗-CD3和/或TOL101的情况下T细胞中STAT1磷酸化的柱形图。图12B显示了在每种条件下ERK/p38磷酸化的原始数值。
图13A描绘了在存在和不存在抗-CD3和/或TOL101的情况下T细胞中STAT3磷酸化的柱形图。图13B显示了在每种条件下ERK/p38磷酸化的原始数值。
图14A描绘了在存在和不存在抗-CD3和/或TOL101的情况下T细胞中STAT5磷酸化的柱形图。图14B显示了在每种条件下ERK/p38磷酸化的原始数值。
图15A描绘了在存在和不存在抗-CD3和/或TOL101的情况下T细胞中STAT6磷酸化的柱形图。图15B显示了在每种条件下ERK/p38磷酸化的原始数值。
图16描绘了使用TOL101治疗肾脏移植接受者的方案和相应的临床终点。
图17描绘了图16的治疗方案的给药日程的示意图。
图18描绘了在存在变化浓度的TOL101的情况下人类患者CD3计数的时间过程线形图。
图19描绘了线形图，其表现了在两周期间28mg TOL101疗法的T细胞应答，显示了在给药期期间存在缺乏TCR复合物的T细胞。
图20描绘了在存在TOL101的情况下体外抗-异型抗原(alloantigen)应答的抑制的柱形图。
图21描绘了当在多个时间点与历史rATG数据相比较时，使用获自输注了TOL101的患者的样品的细胞因子释放分析的线形图。
图22描绘了在一定时间内在0.28和1.4mg剂量下TOL101的生物利用率的时间过程的线形图；结果以TOL101的血浆水平来显示。
图23描绘了在一定时间内在7和14mg剂量下TOL101的生物利用率的时间过程的线形图；结果以TOL101的血浆水平来显示。
图24描绘了在一定时间内在28mg剂量下TOL101的生物利用率的时间过程的线形图；结果以TOL101的血浆水平来显示。
图25描绘了利用Beckman Coulter Flow-Count Flourospheres操作获自全血的T细胞计数的流式细胞术结果。门选结果是在与TOL101孵育之后CD2、CD3和CD45表达的指示。
图26描绘了线形图，其说明在暴露于TOL101之后一定时间T细胞表型表达标志物CD3、CD4和CD8变化了。
图27是TOL101对于αβTCR+T细胞的作用机制的示意图。示意图显示了，TOL101引起TCR复合物从细胞表面脱除而不消减细胞。
图28是线形图，展现了接受TOL101的剂量逐步升高服用法(regimen)的临床研究患者中的Treg诱导。
图29是TOL101结合并诱导Tregs的起始步骤的示意图。
图30是图29后续的示意图，显示了当以剂量逐步升高的服用法给予时，TOL101诱导Tregs的潜在途径。
图31A-E是线形图，展现了TOL101治疗的人类临床试验受试者中的TNF(画面A)、IFN-γ(画面B)、IL6(画面C)、IL1β(画面D)和IL2(画面E)水平。图31F是柱形图，展现了在TOL101的2期临床试验中人类抗小鼠抗体(HAMA)诱导的水平。
图32是TOL101的2期临床研究中登记的患者的CD3计数的列表。
图33A-C描绘了来自2期TOL101临床研究的效力测量值。画面A是线形图，描绘了活检证实的急性排斥率以及患者和移植物存活(通常称为移植三终点)。画面B是显示估计的肾小球滤过率的线形图。画面C是聚簇图，显示了来自TOL101的2期研究的患者的测量的肾小球滤过率。
图34描绘了一组流式细胞术点图和柱形图，显示了TOL101对αβTCR的特异性，表明该抗体结合α链。
图35描绘了一组柱形图，说明了在单向MLR中TOL101对IFN-gamma的抑制。
图36显示了TOL101不调节CD28诱导的增殖。
图37描绘了用伊屋诺霉素(ionomycin)、抗-CD3或TOL101刺激的CD4T细胞中的钙流量。
图38描绘了与抗-CD3处理和培养基对照相比，在TOL101处理之后热激蛋白27、p38a MAPK蛋白活化激酶和AKT2的蛋白质磷酸化。ND＝未检出。
图39描绘了在双向MLR中的门选策略和TOL101对FoxP3的诱导。
图40显示了衍生自TOL101氨基酸序列的scFV的示意性结构和氨基酸序列(SEQ ID NO：9)(画面A)；在还原和非还原条件下scFV的SDS Page；以及显示scFV结合CD8和CD4 T细胞的能力的流式细胞术(画面C)。
发明详述
在一项或多项本发明的主题、制造和使用的性质上，以下的技术描述仅仅是示范性的，不意图限制本申请或可要求本申请优先权而提交的这类其他申请或其公告的专利中要求保护的任何特别提出的技术的范围、应用或用途。在评述此处阐述的技术的描述时，必须考虑以下的定义和非限制性指导。
如在此使用的，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子，其包含四条多肽链，即由二硫键互连的两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链由重链可变区(在此缩写为HCVR或VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域，即CH1、CH2和CH3构成。每条轻链由轻链可变区(在此缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区可以进一步细分成高变性的区域，称为互补决定区(CDR)，与更为保守的称为框架区(FR)的区域间隔。每个可变区(VH或VL)含有3个CDR，称为CDR1、CDR2和CDR3。每个可变区还含有4个框架子区域，称为FR1、FR2、FR3和FR4。术语抗体包括所有类型的抗体，包括例如IgG和IgM。在某些实施方式中，抗体是IgM，在某些实施方式中，IgM形成聚合的五聚体。
如在此使用的，对于抗体，术语“抗体片段”和“抗原结合片段”是指完整抗体中能够与完整抗体结合相同抗原的一部分。抗体片段的实例包括但不限于线性抗体、单链抗体分子(scFv)、Fv、Fab和F(ab')2片段，以及由抗体片段形成的多特异性抗体。优选地，抗体片段保留至少部分的重链和/或轻链可变区。
术语“抗-αβTCR抗体或抗体片段”是指结合人类T细胞受体的alpha链，人类T细胞受体的beta链，或人类T细胞受体的alpha和beta链两者的抗体或抗体片段。
如在此使用的，用语“TOL101抗体”是指结合人类αβTCR，且由杂交瘤TOL101主细胞库(MCB)产生的鼠抗-αβTCR单克隆IgM抗体。如在此使用的，术语“主细胞库”是指一起经受处理以确保均一性和稳定性的完全表征的细胞的培养物。一般地，MCB是杂交瘤细胞系，其被测试和确定提供特定单克隆抗体的稳定和均一的来源。TOL101 MCB于2012年11月2日保藏在ATCC，指定的ATCC登记号________________。
TOL101具有由SEQ ID NO：3的多核苷酸序列编码的轻链：
ATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATATCCAGAGGACAAA
TTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGC
CAGCTCAAGTGTAAGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTAT
GACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTC
TCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTAACCCATT
CACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCA
CCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAG
ACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCA
GGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACAT
AACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATG
AGTGTTAG.
TOL101具有由SEQ ID NO:4的多核苷酸序列编码的重链：
ATGGAAAGGCACTGGATCTTTCTACTCCTGTTGTCAGTAACTGCAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAGCTG
CAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGCAAGACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTAC
ACCTTTACTAGCTACACGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATAC
ATTAATCCTAGCAGTGGTTATACTAATTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGCAGAC
AAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGT
GCAAGATGGAGGGACGCGTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
GAGAGTCAGTCCTTCCCAAATGTCTTCCCCCTCGTCTCCTGCGAGAGCCCCCTGTCTGATAAGAATCTG
GTGGCCATGGGCTGCCTGGCCCGGGACTTCCTGCCCAGCACCATTTCCTTCACCTGGAACTACCAGAAC
AACACTGAAGTCATCCAGGGTATCAGAACCTTCCCAACACTGAGGACAGGGGGCAAGTACCTAGCCACC
TCGCAGGTGTTGCTGTCTCCCAAGAGCATCCTTGAAGGTTCAGATGAATACCTGGTATGCAAAATCCAC
TACGGAGGCAAAAACAGAGATCTGCATGTGCCCATTCCAGCTGTCGCAGAGATGAACCCCAATGTAAAT
GTGTTCGTCCCACCACGGGATGGCTTCTCTGGCCCTGCACCACGCAAGTCTAAACTCATCTGCGAGGCC
ACGAACTTCACTCCAAAACCGATCACAGTATCCTGGCTAAAGGATGGGAAGCTCGTGGAATCTGGCTTC
ACCACAGATCCGGTGACCATCGAGAACAAAGGATCCACACCCCAAACCTACAAGGTCATAAGCACACTT
ACCATCTCTGAAATCGACTGGCTGAACCTGAATGTGTACACCTGCCGTGTGGATCACAGGGGTCTCACC
TTCTTGAAGAACGTGTCCTCCACATGTGCTGCCAGTCCCTCCACAGACATCCTAACCTTCACCATCCCC
CCCTCCTTTGCCGACATCTTCCTCAGCAAGTCCGCTAACCTGACCTGTCTGGTCTCAAACCTGGCAACC
TATGAAACCCTGAATATCTCCTGGGCTTCTCAAAGTGGTGAACCACTGGAAACCAAAATTAAAATCATG
GAAAGCCATCCCAATGGCACCTTCAGTGCTAAGGGTGTGGCTAGTGTTTGTGTGGAAGACTGGAATAAC
AGGAAGGAATTTGTGTGTACTGTGACTCACAGGGATCTGCCTTCACCACAGAAGAAATTCATCTCAAAA
CCCAATGAGGTGCACAAACATCCACCTGCTGTGTACCTGCTGCCACCAGCTCGTGAGCAACTGAACCTG
AGGGAGTCAGCCACAGTCACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTCTCCTGCAGACATCAGTGTGCAGTGGCTT
CAGAGAGGGCAACTCTTGCCCCAAGAGAAGTATGTGACCAGTGCCCCGATGCCAGAGCCTGGGGCCCCA
GGCTTCTACTTTACCCACAGCATCCTGACTGTGACAGAGGAGGAATGGAACTCCGGAGAGACCTATACC
TGTGTTGTAGGCCACGAGGCCCTGCCACACCTGGTGACCGAGAGGACCGTGGACAAGTCCACTGGTAAA
CCCACACTGTACAATGTCTCCCTGATCATGTCTGACACAGGCGGCACCTGCTATTGA.
TOL101具有由SEQ ID NO：5的多核苷酸序列编码的J链：
ATGAAGACCCACCTGCTTCTCTGGGGAGTCCTGGCCATTTTTGTTAAGGCTGTCCTTGTAACAGGTGACG
ACGAAGCGACCATTCTTGCTGACAACAAATGCATGTGTACCCGAGTTACCTCTAGGATCATCCCTTCCAC
CGAGGATCCTAATGAGGACATTGTGGAGAGAAATATCCGAATTGTTGTCCCTTTGAACAACAGGGAGAAT
ATCTGTGATCCCACCTCCCCACTGAGAAGGAACTTTGTATACCATTTGTCAGACGTCTGTAAGAAATGCG
ATCCTGTGGAAGTGGAGCTGGAAGATCAGGTTGTTACTGCCACCCAGAGCAACATCTGCAATGAAGACGA
TGGTGTTCCTGAGACCTGCTACATGTATGACAGAAACAAGTGCTATACCACTATGGTCCCACTTAGGTAT
CATGGTGAGACCAAAATGGTGCAAGCAGCCTTGACCCCCGATTCTTGCTACCCTGACTAG.
TOL101轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO：6：
MDFQVQIFSFLLISASVIISRGQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTS
KLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQL
TSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCE
ATHKTSTSPIVKSFNRNEC
TOL101重链的氨基酸序列为SEQ ID NO：7：
MERHWIFLLLLSVTAGVHSQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTSYTMHWVKQRPGQGLEW
IGYINPSSGYTNYNQKFKDKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARWRDAYYAMDYWGQGTS
VTVSSESQSFPNVFPLVSCESPLSDKNLVAMGCLARDFLPSTISFTWNYQNNTEVIQGIRTFPTLRTGGK
YLATSQVLLSPKSILEGSDEYLVCKIHYGGKNRDLHVPIPAVAEMNPNVNVFVPPRDGFSGPAPRKSKLI
CEATNFTPKPITVSWLKDGKLVESGFTTDPVTIENKGSTPQTYKVISTLTISEIDWLNLNVYTCRVDHRG
LTFLKNVSSTCAASPSTDILTFTIPPSFADIFLSKSANLTCLVSNLATYETLNISWASQSGEPLETKIKIMES
HPNGTFSAKGVASVCVEDWNNRKEFVCTVTHRDLPSPQKKFISKPNEVHKHPPAVYLLPPAREQLNLR
ESATVTCLVKGFSPADISVQWLQRGQLLPQEKYVTSAPMPEPGAPGFYFTHSILTVTEEEWNSGETYTC
VVGHEALPHLVTERTVDKSTGKPTLYNVSLIMSDTGGTCY
TOL101J链的氨基酸序列为SEQ ID NO：8：
MKTHLLLWGVLAIFVKAVLVTGDDEATILADNKCMCTRVTSRIIPSTEDPNEDIVERNIRIVVPLNNRENISD
PTSPLRRNFVYHLSDVCKKCDPVEVELEDQVVTATQSNICNEDDGVPETCYMYDRNKCYTTMVPLRYHGE
TKMVQAALTPDSCYPD
如在此使用的“αβTCR”可以包括哺乳动物TCR的哺乳动物α-亚基和哺乳动物β-亚基的异二聚体。在某些实施方式中，哺乳动物α-亚基可以包含人类α-亚基的氨基酸序列，例如，SEQ ID NO：1的氨基酸序列：
MAKTTQPNSMESNEEEPVHLPCNHSTISGTDYIHWYRQLPSQGPEYVIHGLTSNVNNRMASLAIAEDRKSSTLILHRATL
RDAAVYYCILPLAGGTSYGKLTFGQGTILTVHPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDK
TVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESS.
在某些实施方式中，哺乳动物β-亚基可以包含人类β-亚基的氨基酸序列，例如SEQ ID NO：2的氨基酸序列：
MAGSHMGVSQSPRYKVAKRGQDVALRCDPISGHVSLFWYQQALGQGPEFLTYFQNEAQLDKSGLPSDRFFAERPEGSV
STLKIQRTQQEDSAVYLCASSLGQAYEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHV
ELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVT
QIVSAEAWGRADCTSGD DDDK.
在某些实施方式中，示例性的人类αβTCR可以是包含SEQ ID NO：1和2的亚基αβ的异二聚体。在某些实施方式中，人类αβTCR或其片段包含SEQ ID NOs：1和2的至少一部分。在某些实施方式中，人类αβTCR可以包括一部分或片段，其包括SEQ ID NO：1或2的至少一部分。
如在此使用的，术语“互补决定区”和“CDR”是指主要对抗原结合负责的区域。轻链可变区中存在三个CDR(CDRL1、CDRL2和CDRL3)，重链可变区中存在三个CDR(CDRH1、CDRH2和CDRH3)。构成这六个CDR的残基已经由Kabat和Chothia表征如下：轻链可变区中的残基24-34(CDRL1)、50-56(CDRL2)和89-97(CDRL3)，以及重链可变区中的31-35(CDRH1)、50-65(CDRH2)和95-102(CDRH3)；Kabat et al.,(1991)Sequencesof Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD.，通过引用合并在此；以及轻链可变区中的残基26-32(CDRL1)、50-52(CDRL2)和91-96(CDRL3)，以及重链可变区中的26-32(CDRH1)、53-55(CDRH2)和96-101(CDRH3)；Chothia andLesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917，通过引用合并在此。在某些实施方式中，在此使用的术语“互补决定区”和“CDR”包括都涵盖了Kabat和Chothia的定义的残基(即，轻链可变区中的残基24-34(CDRL1)、50-56(CDRL2)和89-97(CDRL3)；以及26-35(CDRH1)、50-65(CDRH2)和95-102(CDRH3))。并且，除非指明了，如在此使用的，CDR残基的编号是根据Kabat。在某些实施方式中，本发明提供了在人类框架中由来自TOL101的六个CDR组成的人源化抗体(例如，保藏的杂交瘤进行测序，根据本领域已知的技术重组地组装人源化抗体)。
如在此使用的，术语“框架”是指除在此定义的CDR残基之外的可变区的残基。存在着构成框架的四个独立的框架子区域：FR1、FR2、FR3和FR4。为了表明框架子区域是否处于轻链或重链可变区中，“L”或“H”可以添加到子区域缩写中(例如，“FRL1”表示轻链可变区的框架子区域1)。除非规定，框架残基的编号是根据Kabat。要注意的是，在某些实施方式中，抗-αβTCR抗体或其片段可以具有少于完整的框架(例如，它们可以具有框架中仅含有四个子区域的一个或多个的一部分)。
如在此使用的，术语“完全人类框架”是指具有人类中天然地存在的氨基酸序列的框架。完全人类框架的实例包括但不限于KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY和POM(参见例如Kabat et al.,(1991)Sequences of Proteinsof Immunological Interest,US Department of Health and Human Services,NIH,USA；及Wu et al.,(1970)J.Exp.Med.132,211-250，两篇文献都通过引用合并在此)。在某些实施方式中，本发明的人源化抗体具有完全人类框架，或带有一个或多个经过改变以容纳TOL101的鼠CDR的一个或多个氨基酸的框架。
如在此使用的，“人源化”抗体是指具有衍生自来自非人类物种的免疫球蛋白的抗原结合位点和基于人免疫球蛋白的结构和/或序列的分子的其余免疫球蛋白结构的嵌合分子，一般使用重组技术制备。抗原结合位点可以包含融合到恒定区上的完整可变域，或仅包含嫁接于可变域中适当的框架区上的互补决定区(CDR)。抗原结合位点可以是野生型的，或是通过一个或多个氨基酸取代修饰的。这一般消除了作为人类个体中的免疫原的恒定区，但一般保留了对外源可变区的免疫应答的可能性。另一种方法不仅聚焦于提供人类衍生的恒定区，而且还修饰可变区以便尽可能接近人类形式地重塑它们。已知的是，重链和轻链二者的可变区都含有响应于讨论的抗原而变化并决定结合能力的三个互补性决定区(CDR)及其侧翼的四个框架区(FR)，其在给定的物种中是相对保守的，且推定提供了CDR的支架。当针对特定抗原制备非人类抗体时，通过将源自非人类抗体的CDR移植到要修饰的人抗体中存在的FR上，可变区可以被“重塑(reshape)”或“人源化”。Sato,K.,et al.,(1993)Cancer Res 53:851-856.Riechmann,L.,et al.,(1988)Nature332:323-327；Verhoeyen,M.,et al.,(1988)Science 239:1534-1536；Kettleborough,C.A.,et al.,(1991)Protein Engineering 4:773-3783；Maeda,H.,et al.,(1991)Human Antibodies Hybridoma 2:124-134；Gorman,S.D.,et al.,(1991)Proc Natl Acad Sci USA 88:4181-4185；Tempest,P.R.,et al.,(1991)Bio/Technology 9:266-271；Co,M.S.,et al.,(1991)Proc Natl Acad Sci USA88:2869-2873；Carter,P.,et al.,(1992)Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-4289；以及Co,M.S.et al.,(1992)J Immunol 148:1149-1154报道了对各种抗体应用这种方法，所有这些文献通过引用合并在此。在某些实施方式中，人源化的抗体保留了所有CDR序列(例如，人源化的小鼠抗体，其含有来自保藏的TOL101抗体的全部六个CDR)。在其他实施方式中，人源化抗体具有一个或多个CDR(一个、两个、三个、四个、五个、六个)，它们相对原始抗体(例如，原始的TOL101抗体)被改变，这也被称为“衍生自”来自原始抗体的一个或多个CDR的一个或多个CDR。
如在此使用的，术语“受试者”和“患者”是指任何动物，例如，哺乳动物。如在此使用的，术语“哺乳动物”是指被分类为哺乳动物的任何哺乳动物，包括人类、非人灵长类、猿、猪、牛、山羊、绵羊、马、狗、猫，以及本领域公知的科学研究中采用的那些哺乳动物，例如，小鼠、大鼠、仓鼠、兔、豚鼠和雪貂。在本发明的优选的实施方式中，所述哺乳动物是人类。
如在此使用的，术语“纯化的”或“纯化”是指从样品中去除污染物。例如，αβTCR特异性抗体可以通过去除污染性非免疫球蛋白蛋白质来纯化；它们还通过去除不结合相同抗原的免疫球蛋白来纯化。去除非免疫球蛋白蛋白质和/或去除不结合特定抗原的免疫球蛋白引起样品中抗原特异性免疫球蛋白的百分比的提高。在另一个实例中，重组抗原特异性多肽在细菌宿主细胞、真核宿主细胞或哺乳动物宿主细胞中表达，通过去除宿主细胞蛋白质来纯化所述多肽；从而样品中重组抗原特异性多肽的百分比提高。
如在此使用的，术语“Fc区”是指免疫球蛋白重链的C端区域。“Fc区”可以是天然序列Fc区或变体Fc区(例如，具有提高的或降低的效应器功能)。
如在此使用的，Fc区可以具有“效应器功能”，其对活化或降低生物学活性负责(例如，在受试者中)。效应器功能的实例包括但不限于：C1q结合；补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体；BCR)的下调下调等。这样的效应器功能可能需要Fc区与结合结构域(例如，抗体可变域)组合，可以使用各种分析(例如，Fc结合分析，ADCC分析，CDC分析等)来评估。
如在此使用的，“分离的”抗体或抗体片段是已经经过鉴定和与其天然环境的成分分离和/或回收的抗体或抗体片段。其天然环境的污染性成分是一般干扰所述抗体或其片段的诊断或治疗用途的材料，可包括酶、激素和其它蛋白质性或非蛋白质性溶质。在某些实施方式中，分离的抗体被纯化至(1)根据Lowry方法测量，按多肽的重量计算大于95％，优选是按重量计算超过99％，(2)通过使用旋转杯测序仪，达到足以获得N端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)通过使用考马斯蓝或银染色在还原或非还原条件下SDS-PAGE，达到同质性。分离的抗体包括重组细胞内原位的抗体，因为不存在多肽的天然环境的至少一种成分。然而，通常，分离的抗体将通过至少一个纯化步骤来制备。
如在此使用的，术语“治疗/处理”是指治疗性处理以及预防性或防止性的措施二者。需要治疗的对象包括那些已经具有病症以及那些要防止病症的对象。
用语“在使症状减少的条件下”是指任何可由αβTCR抗体治疗的疾病的可检测症状中任何程度的定性或定量的降低，包括但不限于，对疾病恢复率的可检测的影响(例如，体重增加的速率)，或通常与特定疾病相关的至少一种症状的减少(例如，移植物排斥的症状)。在某些实施方式中，本发明的αβTCR抗体在使移植物排斥或GVHD的症状减少(例如，与未用αβTCR抗体治疗相比较)的条件下施用给受试者。
在此使用的标题(例如，“背景”和“概述”)和副标题仅是用于本技术内的主题的一般性结构，而不意图限制本技术的公开内容或其任何方面。特别地，在“背景”中公开的主题可以包括新的技术，可以不构成对先有技术的叙述。在“概述”中公开的主题不是技术或其任何实施方式的全部范围的穷尽的或完全的公开。本说明书的章节中材料分类或讨论为具有特定的功用是为方便起见而进行的，不能推定为所述材料在用于任何给定的组合物时必需根据其在本文中的分类而必然地或单独地起作用。
本文中对参考文献的引证不构成承认那些参考文献是先有技术或与在此公开的技术的可专利性具有任何关联。对当前公开内容中引证的参考文献的内容的任何讨论仅仅意图提供由参考文献作者作出的断言的一般性概述，不构成对这些参考内容的准确性的认可。本说明书中“说明”部分中引证的所有参考文献通过引用完整合并在本文中。
在表示本技术的实施方式时，说明和具体实例仅是为了举例的目的，而不意图限制本技术的范围。此外，具有声明的特征的多个实施方式的叙述不意图排除具有额外特征的其他实施方式，或包括所述声明的特征的不同组合的其他实施方式。为了说明如何制造和使用本技术的组合物和方法的目的提供具体实例，除非另外明确地指出，不意味着是已经被或未被进行或测试的本技术的给定实施方式的呈现。
如在此使用的，词语“优选的”或“优选地”是指在某种情况下提供某种益处的技术的实施方式。然而，在相同的或其他的情况下，其他实施方式也可以是优选的。此外，一个或多个优选的实施方式的叙述不是暗示其他实施方式不可用，不意味着从本技术的范围中排除其他实施方式。
如在此所提及的，除非另作说明，所有的组成百分比是按照总组成的重量计。如在此使用的，词语“包括/包含”及其变体意图是非限制性的，因而对列表中各项的叙述不是排除在本技术的材料、组合物、设备和方法中也可能有用的其他类似项。类似地，术语“能”和“可以”及其变体意图是非限制性的，因而对一个实施方式能或可以包含某些要素或特征的叙述不是排除不含有那些元素或特征的本技术的其他实施方式。
虽然在此使用作为术语如包括、含有或具有的同义词的开放性术语“包含”来描述并要求保护本发明，当前的技术或其实施方式或者可以使用更为限制性的术语例如“由”所叙述的成分“组成”或“基本上由”所叙述的成分“组成”来描述。
除非另外定义，此处使用的所有技术和科学术语具有本技术所属技术领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。虽然与在此描述的方法和材料类似或等同的方法和材料可以用于本技术的实践或测试，以下描述了适合的方法和材料。此外，材料、方法和实施例仅是说明性的，而不意图是限制性的。在此提及的所有公开物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用将它们完整地合并。在冲突的情况下，以当前的说明书(包括定义)为准。
针对αβTCR的分离的抗体和抗体片段
术语“抗体”按广义来使用，具体涵盖了单独的抗-αβTCR抗体(包括激动剂、拮抗剂，和中和性或阻断性抗体)，以及具有多表位特异性的抗-αβTCR抗体组合物。如在此使用的“抗体”包括完整的免疫球蛋白或抗体分子、多克隆抗体、多特异性抗体(即，由至少两个完整抗体形成的双特异性抗体)以及免疫球蛋白片段(例如scfv、Fab、F(ab’)2或Fv)，只要它们展现了在此描述的任何期望的激动性或拮抗性或功能或临床性质。
抗体一般是展现了对特定抗原的结合特异性的蛋白质或多肽。天然抗体通常是杂四聚的糖蛋白，由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成。一般地，每条轻链通过一个共价的二硫键连接到重链，而在不同的免疫球蛋白同种型的重链之间二硫键的数目是可变的。每条重链和轻链也具有规律间隔的链内二硫键。每条重链在一个末端具有可变域(VH)，之后是多个恒定域。每条轻链在一个末端具有可变域(VL)，在其另一个末端具有恒定域；轻链的恒定域与重链的第一恒定域并排，轻链可变域与重链的可变域并排。特定的氨基酸残基被认为形成了轻链和重链可变域之间的接口[Chothia et al.,J.Mol.Biol.,186:651-663(1985)；Novotny and Haber,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:4592-4596(1985)]。来自任何脊椎动物物种的抗体的轻链可以根据它们的恒定域的氨基酸序列被分成称为kappa和lambda的两种明显不同的类型之一。取决于它们的重链恒定域的氨基酸序列，免疫球蛋白可以被分为不同的种类。
存在着五种主要的免疫球蛋白类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，这些中的几种可以进一步分为子类(同种型)，例如，IgG-1、IgG-2、IgG-3和IgG-4；IgA-1和IgA-2。符合免疫球蛋白的不同类别的重链恒定域分别被称为alpha、delta、epsilon、gamma和mu。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，一般地包含完整抗体的抗原结合域或可变域。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段，和由抗体片段形成的双抗体和多特异性抗体。
在此使用的术语“可变的”是描述可变域的某些部分，其在抗体间在序列上是不同的，在每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性中使用。然而，可变性在抗体的整个可变域上通常不是均匀分布的。它一般集中于处在轻链可变域和重链可变域中称为互补决定区(CDR)或高变区的三个片段中。可变域的更高保守的部分被称为框架(FR)。天然重链和轻链的可变域每个都包含四个FR区，主要采取β－片层结构，通过三个CDR连接，CDR形成环形连接，在某些情况下形成beta－片层结构的部分。每条链中的CDR通过FR区域紧密地保持在一起，来自另一条链的CDR促进了抗体的抗原结合位点的形成[参见Kabat,E.A.et al.,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987)]。恒定域没有直接涉及抗体与抗原的结合，但是显示出各种效应器功能，例如在抗体依赖性细胞毒性中抗体的参与。
此处使用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，即，除了可以少量存在的可能自然发生的突变之外，构成所述群体的单独的抗体是同一的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个的抗原性位点。此外，与常规的(多克隆的)抗体制品相比，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定因子，常规的抗体制品一般地包括针对不同决定因子(表位)的不同抗体。
单克隆抗体在此包括嵌合的、杂合的和重组的抗体，通过剪接抗-αβTCR抗体的可变(包括高变)域与恒定域(例如，“人源化”抗体)，或轻链与重链，或来自一个物种的链与来自另一个物种的链，或与异源蛋白质的融合物，不考虑来源物种或免疫球蛋白类型或子类名称，以及抗体片段(例如，Fab、F(ab')2和Fv)来产生，只要它们展现了期望的生物学活性或性质。参见，例如，美国专利No.4,816,567，以及Mage et al.,Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications,pp.79-97(Marcel Dekker,Inc.:NewYork,1987)。
因而，修饰语“单克隆的”表明抗体是获自基本上同质的抗体群体的特性，不被看作是需要通过任何特定的方法生产抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过由Kohler and Milstein,Nature,256:495(1975)首先描述的杂交瘤方法制备，或可以通过例如美国专利No.4,816,567中描述的重组DNA方法制备。“单克隆抗体”还可以分离自利用例如McCafferty et al.,Nature,348:552-554(1990)中描述的技术产生的噬菌体文库。
非人类(例如，鼠)抗体的“人源化”形式是特定的嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如，Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗体的其他抗原结合子序列)，其含有来自非人类免疫球蛋白的最小序列。在很大程度上，人源化的抗体是人免疫球蛋白(受者抗体)，在其中来自受者的互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(供体抗体)例如小鼠、大鼠或兔的、具有期望的特异性、亲合性和接受力的CDR的残基替代。在有些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体可以包含既不在接受者抗体中、又不在引入的CDR或框架序列中存在的残基。进行这些修改以进一步改善和优化抗体性能。一般地，人源化抗体包括基本上所有至少一个，一般地是两个可变域，其中，所有的或基本上所有的CDR区相应于非人类免疫球蛋白的CDR区，所有的或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些区域。人源化抗体最理想地还将包含免疫球蛋白恒定区或恒定域(Fc)的至少一部分，一般地是人免疫球蛋白的。
“人类抗体”是一种具有一氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列相应于人类产生的抗体的氨基酸序列，和/或是利用本领域已知的或在此公开的生产人类抗体的任何技术产生的。人类抗体的这种定义包括包含了至少一个人类重链多肽或至少一个人类轻链多肽的抗体，例如，包含鼠轻链和人类重链多肽的抗体。人类抗体可以使用本领域已知的各种技术来产生。在一个实施方式中，人类抗体是从噬菌体文库选择的，其中所述噬菌体文库表达人类抗体(Vaughan et al.Nature Biotechnology,14:309-314(1996):Sheets et al.PNAS,(USA)95:6157-6162(1998))；Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks et al.,J.Mol.Biol.,222:581(1991))。也可以通过将人免疫球蛋白基因座导入转基因动物，例如小鼠来制造人类抗体，在所述转基因动物中内源性免疫球蛋白基因已经被部分地或完全地灭活。在攻击时，观察人类抗体的产生，在各个方面其都与在人类中所见的类似，包括基因重排，装配和抗体所有组成部分。例如，在美国专利No.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016和在以下科技出版物中描述了这种方法：Marks et al.,Bio/Technology,10:779-783(1992)；Lonberg et al.,Nature,368:856-859(1994)；Morrison,Nature,368:812-13(1994)；Fishwildet al.,Nature Biotechnology,14:845-51(1996)；Neuberger,NatureBiotechnology,14:826(1996)；Lonberg and Huszar,Intern.Rev.Immunol.,13:65-93(1995)。做为选择，人类抗体可以通过产生针对目标抗原的人类B淋巴细胞的永生化来制备(这样的B淋巴细胞可以从个体中恢复，或可以在体外被免疫)。参见，例如，Cole et al.,Monoclonal Antibodies and CancerTherapy,Alan R.Liss,p.77(1985)；Boerner et al.,J.Immunol.,147(1):86-95(1991)；和美国专利No.5,750,373。
本发明的抗-αβTCR抗体或抗体片段可变区和/或CDR，以及其变体，可以采用任何类型的适合的人类恒定区(例如，对于嵌合抗体)，或人类框架(例如，对于人源化的抗体)。在某些实施方式中，所述恒定区是IgM类别的。优选地，CDR用于完全人类框架或框架子区域。例如，NCBI网站含有某些人类框架区域的序列。人类VH序列的实例包括，但不限于，VH1-18、VH1-2、VH1-24、VH1-3、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69、VH1-8、VH2-26、VH2-5、VH2-70、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-7、VH3-72、VH3-73、VH3-74、VH3-9、VH4-28、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-4、VH4-59、VH4-61、VH5-51、VH6-1和VH7-81，它们在Matsuda et al.,J Exp.Med.1998 Dec 7；188(11):2151-62中提供，其包括人免疫球蛋白链可变区座位的完整核苷酸序列，通过引用合并在此。人类VK序列的实例包括，但不限于，A1、A10、A11、A14、A17、A18、A19、A2、A20、A23、A26、A27、A3、A30、A5、A7、B2、B3、L1、L10、L11、L12、L14、L15、L16、L18、L19、L2、L20、L22、L23、L24、L25、L4/18a、L5、L6、L8、L9、O1、O11、O12、O14、O18、O2、O4和O8，它们在Kawasaki et al.,Eur J Immunol 2001 Apr；31(4):1017-28；Schable and Zachau,Biol Chem Hoppe Seyler 1993 Nov；374(11):1001-22；以及Brensing-Kuppers et al.,Gene 1997 Jun 3；191(2):173-81中提供，所有这些文献通过引用合并在此。人类VL序列的实例包括，但不限于，V1-11、V1-13、V1-16、V1-17、V1-18、V1-19、V1-2、V1-20、V1-22、V1-3、V1-4、V1-5、V1-7、V1-9、V2-1、V2-11、V2-13、V2-14、V2-15、V2-17、V2-19、V2-6、V2-7、V2-8、V3-2、V3-3、V3-4、V4-1、V4-2、V4-3、V4-4、V4-6、V5-1、V5-2、V5-4和V5-6，它们在中提供，通过引用合并在此。完全人类框架可以选自任何这些功能性种系基因。一般地，这些框架相互不同在于有限数量的氨基酸改变。这些框架可以与来自TOL101或其变体的CDR一起使用。可以与本发明的CDR一起使用的人类框架的其他实例包括，但不限于，KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY和POM(参见，例如，Kabat et al.,1987 Sequences of Proteins of Immunological Interest,USDepartment of Health and Human Services,NIH,USA；以及Wu et al.,1970,J.Exp.Med.132,211-250这两篇文献通过引用合并在此)。
术语“Fc区”被用于限定免疫球蛋白重链的C-末端区域，其可以通过完整抗体的木瓜蛋白酶消化来产生。Fc区可以是天然序列Fc区，或变体Fc区。虽然免疫球蛋白重链的Fc区的边界可以改变，人类IgG重链Fc区通常被定义为从大约位置Cys226的氨基酸残基，或从位置Pro230，延伸到Fc区的羧基末端(在此使用根据上文的Kabat等的编号系统)。免疫球蛋白的Fc区一般包含两个恒定域，CH2结构域和CH3结构域，任选地包含CH4结构域。
“Fc区链”在此是指Fc区的两条多肽链之一。人类IgG Fc区的“CH2结构域”(也称为“Cγ2”结构域)通常从大约位置231的氨基酸残基延伸到大约位置340的氨基酸残基。CH2结构域是独特的，因为它不与另一个结构域紧密配对。更确切地，两个N－连接的分支碳水化合物链被插入到完整的天然IgG分子的两个CH2结构域之间。已经推测，碳水化合物可以提供对结构域-结构域配对的替代，并帮助稳定CH2结构域。Burton,Molec.Immunol.22:161-206(1985)。CH2结构域在此可以是天然序列CH2结构域或变体CH2结构域。
“CH3结构域”包含Fc区中残基C-末端到CH2结构域的延伸(即从IgG的约位置341的氨基酸残基到约位置447的氨基酸残基)。CH3结构域在此可以是天然序列CH3结构域或变体CH3结构域(例如，在其一条链中具有引入的“突起(protroberance)”，以及在其另一条链中相应引入的“腔”的CH3结构域；参见美国专利No.5,821,333)。这种变体CH3结构域可以用于产生如在此描述的多特异性(例如，双特异性)抗体。
“绞链区”一般被定义为从人类IgG1的约Glu216或约Cys226到约Pro230的延伸(Burton,Molec.Immunol.22:161-206(1985))。通过将形成重链内S-S键的第一个和最后一个半胱氨酸残基放在相同位置，其他IgG同种型的绞链区可以与IgG1序列对齐。绞链区在此可以是天然序列绞链区或变体绞链区。变体绞链区的两条多肽链一般保留了每条多肽链至少一个半胱氨酸残基，从而变体绞链区的两条多肽链可以形成两条链之间的二硫键。优选的绞链区在此是天然序列人类绞链区，例如，天然序列人类IgG1绞链区。
“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的至少一个“效应器功能”。“效应器功能”的实例包括：C1q结合；补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞-介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体；BCR)的下调，等等。这样的效应器功能一般需要Fc区与结合结构域(例如，抗体可变域)组合并且能使用各种本领域已知的评估这样的抗体效应器功能的方法来评估。
“天然序列Fc区”包含与自然中存在的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。“变体Fc区”包含通过至少一个氨基酸修饰而与天然序列Fc区不同的氨基酸序列。优选地，与天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区相比，变体Fc区具有至少1个氨基酸取代，例如约1个至约10个氨基酸取代，优选地，天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区中有约1至约5个氨基酸取代。此处的变体Fc区将优选与天然序列Fc区和/或与亲本多肽的Fc区具有至少约80％的序列同一性，最优选至少约90％的序列同一性，更优选至少约95％的序列同一性。
“抗体依赖性T细胞-介导的细胞毒性”和“ADCC”是指细胞-介导的反应，在此反应中，表达Fc受体(FcRs)的非特异性细胞毒细胞(例如，天然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)识别目标T细胞上的结合抗体并且继而引起目标T细胞的溶胞作用。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，仅表达FcγRIII，而单核细胞则表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。FcR在造血细胞上的表达情况总结于Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)第464页的表3中。为评估相关分子的ADCC活性，可进行体外ADCC分析，如描述于美国专利No.5,500,362或5,821,337中的分析方法。用于这类分析的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。作为选择或另外地，在体内，例如，在Clynes等PNAS(USA)95：652-656(1998)公开的动物模型中，测定有关分子的ADCC活性。
“人类效应细胞”是表达一种或多种FcR并发挥效应器功能的白细胞。优选地，所述细胞至少表达FcγRIII且发挥ADCC效应器功能。介导ADCC的人类白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和中性粒细胞，PBMC和NK细胞是优选的。效应细胞可从其天然来源中分离，如从血液或者在此描述的PBMC分离。
术语“Fc受体”和“FcR”用于描述与抗体Fc区结合的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的FcR(一种γ受体)，并包括FcγRI，FcγRII，和FcγRIII子类，包括这些受体的等位变体和选择性剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(一种“激活性受体”)和FcγRIIB(一种“抑制性受体”)，其具有类似的氨基酸序列，主要不同在于它们胞质结构域。激活性受体FcγRIIA在其胞质结构域中含有基于酪氨酸激活基序(ITAM)的免疫受体。抑制性受体FcγRIIB在其胞质结构域含有基于酪氨酸抑制基序的免疫受体(ITIM)(综述于Daeron，Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997))。对FcR的综述见Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol9：457-92(1991)；Capel等，Immunomethods 4：25-34(1994)；以及de Haas等，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)。其它FcR，包括今后将被鉴定的那些FcR，均涵盖在此处的术语“FcR”之内。该术语也包括新生(neonatal)受体，FcRn，该受体负责将母亲的IgG传递给胎儿(Guyer等，J.Immunol.117：587(1976)；和Kim等，J.Immunol.24：249(1994))。
“补体依赖性细胞毒性”和“CDC”是指补体存在下的靶细胞溶解。补体激活途径是由补体系统的第一个组分(Clq)与已与相关抗原复合的分子(如抗体)相结合而启动的。为了评定补体激活，可进行CDC分析，如Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所描述的方法。
“亲和力成熟的”抗体是指该抗体的一个或多个CDR区中存在一个或多个改变，从而导致该抗体相对于没有这些改变的亲本抗体而言，对抗原的亲和力得到改善。优选的亲和力成熟的抗体对其目标抗原具有纳摩尔甚至皮摩尔的亲和力。通过本领域已知的过程生产亲和力成熟的抗体。Marks等Bio/technology 10：779-783(1992)描述通过VH和VL区改组(shuffling)的亲和力成熟。CDR和/或框架残基的随机诱变描述在下列文献中：Barbas等Proc Nat.Acad.Sci，USA 91：3809-3813(1994)；Schier等Gene 169：147-155(1995)；Yelton等J.Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson等，J.Immunol.154(7)：3310-9(1995)；和Hawkins et al，J.Mol.Biol.226：889-896(1992)。
如在“抗体的免疫特异性结合”中使用的术语“免疫特异性”是指例如在抗体的抗原组合位点与该抗体识别的特定抗原之间发生的抗原特异性结合相互作用。
术语“细胞因子”是对一类细胞群体释放的蛋白质的通用术语，它们作为细胞间的介体作用于其他细胞。这样的细胞因子的实例有淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。包括在细胞因子中的有：生长激素，如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，如卵泡刺激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH和黄体生成素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳激素；胎盘催乳激素(placenta lactogen)；肿瘤坏死因子-α和肿瘤坏死因子-β；苗勒氏-抑制物质；鼠促性腺素-有关的肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，如NGF-α；血小板-生长因子；转化生长因子(TGFs)，如TGF-α和TGF-β；胰岛素-样生长因子-I和胰岛素-样生长因子-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子(osteoinductive factors)；干扰素，如干扰素-α、干扰素-β和-γ集落刺激因子(CSFs)如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(G-CSF)；白介素(IL)如IL-1，IL-1α，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12；肿瘤坏死因子，如TNF-α或TNF-β；以及其他多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。如在此使用的，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质和天然序列细胞因子的生物活性等效物。
如在此使用的，术语“治疗/处理”和“疗法”是指治愈性疗法；降低或改善疾病或状况的症状的疗法；预防性疗法；和防止性疗法。
术语“治疗有效量”是指在哺乳动物中有效治疗疾病或病症的活性试剂(例如，抗体或抗体片段)或药物的数量。在自身免疫性疾病或炎性疾病的情况下，活性试剂或药物的治疗有效量可以降低活化的免疫细胞(例如αβTCR+T细胞)的数量；提高Treg-细胞的数目和/或活性，降低炎性细胞因子或前免疫细胞因子例如IL-2、干扰素-γ或TNF-α自活化的T细胞的产生；抑制(即，一定程度上减缓，优选地停止)活化的T细胞的增殖；降低αβTCR+T细胞的表面上CD3的表达到低于50个/mm3，优选地低于25个/mm3；和/或一定程度上减轻与自身免疫性和/或炎性病症相关的一种或多种症状。在抗体或抗体活性试剂或药物可以阻止αβTCR+T细胞的活化和增殖的程度上，可以有抗炎性和/或自身抗原耐受性诱导。对于自身免疫或炎症治疗，例如，可以通过评估来自活化的T细胞的炎性细胞因子或前免疫细胞因子，例如，IL-2、干扰素-γ或TNF-α的数量，以及αβTCR+T细胞的表面上功能性CD3分子的减少来测量体内效力。对于治疗移植组织排斥，“治疗有效量”是指活性试剂(例如，抗αβTCR抗体或抗体片段)如TOL101，或次级辅助药物有效取消、降低、停止或阻止被移植组织的排斥的数量，通过被移植组织的细胞坏死的取消、降低、停止了阻止，同种反应性抗体的产生，或体内或体外针对被移植组织产生同种反应性T细胞反应性来测量。
术语“人抗小鼠抗体应答”或“HAMA”是指在向人类受试者施用鼠抗体之后振动鼠抗体的免疫应答。一般地，小鼠抗体被人类免疫系统识别为外源的，因而它们激发人抗小鼠抗体或HAMA应答。HAMA应答影响小鼠抗体的效力，并且可能在接受者中引起严重的有害症状。HAMA应答还可以影响其他基于鼠的治疗剂或诊断剂的使用，它们可能随后被施用给患者。测量患者中HAMA和/或诊断HAMA的方法是本领域公知的。参见，例如，HAMA IgG ELISA Test System(Catalog Number 10016；INC.300 American Road,Morris Plains,NJ 07950)或HAMA(human anti-mouse antibodies)ELISA(IgG and IgM HAMA,CatalogNumber 43-HAMHU-E01；ALPCO DIAGNOSTICS,26-G Keewaydin Drive,Salem,NH 03079)或Gruber et.al,Cancer Res.,60:1921-1926(2000)。
多克隆抗体
优选地通过多次皮下的(sc)或腹膜内的(ip)注射相关抗原和佐剂，在动物中引发出多克隆抗体。做为选择，抗原可以直接注射到动物的淋巴结中(参见Kilpatrick et al.,Hybridoma,16:381-389,1997)。通过利用双功能或衍生化试剂，例如，马来酰亚胺苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基结合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐或其他本领域已知的的试剂，将相关抗原结合到在要免疫的物种中为免疫原性的蛋白质上，例如，钥孔血蓝素、血清白蛋白、牛胸腺细胞球蛋白、或大豆胰蛋白酶抑制剂，可以获得改善的抗体应答。
通过组合例如100μg的蛋白质或缀合物(用于小鼠)与3倍体积的弗氏完全佐剂，并在多个位置皮内注射该溶液，针对αβTCR蛋白质、其片段、免疫原性缀合物或其衍生物来免疫动物。一个月后，用1/5到1/10初始数量的肽或缀合物在弗氏不完全佐剂中通过在多个位置皮下注射来对动物进行强化。在强化注射7-14天后，对动物抽血，血清用于分析抗体滴度。对动物进行免疫强化直到滴度处于高稳定水平。优选地，动物可以用相同抗原的、但通过不同交联试剂缀合的缀合物来强化。缀合物也可作为蛋白质融合物在重组细胞培养物中制备。此外，聚集剂例如白矾适合于增强免疫反应。
单克隆抗体
本发明的抗体可以是单克隆抗体。单克隆抗体可以使用杂交瘤方法来制备，例如Kohler and Milstein,Nature,256:495(1975)描述的那些方法。在杂交瘤方法中，小鼠、仓鼠或其他适当的宿主动物一般用免疫剂来免疫以引发淋巴细胞，所述淋巴细胞产生或能够产生将特异性结合所述免疫剂的抗体。做为选择，可以在体外免疫淋巴细胞。
免疫剂一般包括αβTCR或其亚基。在非限制性实例中，αβTCR亚基可以包括alpha链、beta链，或连接的alpha-beta链。在某些实施方式中，αβTCR可以是哺乳动物βTCR。在某些实施方式中，用于免疫动物的αβTCR包括人类αβTCR，其包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，或其片段。免疫剂做为选择可以包含SEQ ID NO：1的片段或部分。在一个实施方式中，免疫剂包含蛋白质，所述蛋白质包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。在一个实施方式中，免疫剂包含蛋白质，所述蛋白质包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或SEQ ID NO：2的片段或部分。在一个实施方式中，免疫剂包含由氨基酸序列SEQ ID NO：1和2提供的两个亚基的蛋白质。做为选择，免疫原可以包含来自期望的物种的αβTCR异二聚体，例如人类αβTCR异二聚体。在一个实施方式中，免疫剂包含人类淡黄层细胞的群体，其中含有外周血单核细胞。
一般地，如果期望的是人类来源的细胞，使用外周血淋巴细胞(“PBL”)，或者如果期望的是非人类哺乳动物来源，使用脾细胞或淋巴结细胞。然后使用适合的融合试剂，例如，聚乙二醇，将淋巴细胞与永生化的细胞系融合，来形成杂交瘤细胞(参见Goding,Monoclonal Antibodies:Principles andPractice,Academic Press,(1986)pp.59-103中公开的产生单克隆抗体的举例方法)。永生化细胞系通常是转变了的哺乳动物细胞，特别是啮齿动物、牛和人类来源的骨髓瘤细胞。通常，使用大鼠或小鼠的骨髓瘤细胞系。杂交瘤细胞可以在适合的培养基中培养，所述培养基优选地含有一种或多种物质，所述物质抑制非融合的永生化细胞的生长或存活。例如，如果亲本细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，杂交瘤的培养基一般包括次黄嘌呤、氨蝶呤、和胸腺嘧啶核苷(“HAT培养基”)，这些物质阻止HGPRT-缺陷T细胞的生长。在某些实施方式中，优选的永生化细胞系是那些有效地融合、支持选定的抗体生产细胞以稳定的高水平表达抗体、和对培养基，例如HAT培养基敏感的细胞。更优选的永生化细胞系是鼠骨髓瘤系，其可以获自例如Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,Calif和美国典型培养物保藏所，Manassas，Va。这样的鼠骨髓瘤细胞系的实例有P3X63Ag8U.1(ATCC CRL 1580)。也已经描述了将人骨髓瘤和小鼠-人异杂交瘤细胞系用于人单克隆抗体的生产(参见，例如Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur et al.,Monoclonal Antibody Production Techniquesand Applications,Marcel Dekker,Inc.,New York,(1987)pp.51-63)。
然后可以分析培养杂交瘤细胞的培养基中针对αβTCR的单克隆抗体的存在。优选地，通过免疫沉淀或通过体外结合分析，例如，放射免疫分析(RIA)或酶联免疫吸附分析(ELISA)来测定杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性，做为选择，通过孵育T细胞群体和单克隆抗体并用抗CD3抗体共染色来测定杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。这样的技术和分析是本领域已知的。例如，单克隆抗体的结合亲和力可以通过Scatchard analysisof Munson and Pollard,Anal.Biochem.107:220(1980)的Scatchard分析来测定。
在鉴定了期望的杂交瘤细胞之后，可以通过限制稀释操作和通过标准方法生长来对克隆进行亚克隆(参见，例如上文的Goding)。用于这个目的的适合的培养基包括，例如Dulbecco改良的Eagle培养基，或RPMI-1640培养基。做为选择，杂交瘤细胞可以在本领域通常使用和常规地生产的哺乳动物中作为腹腔积液在体内生长。
通过常规的免疫球蛋白纯化操作，例如，蛋白A-Sepharose、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，亚克隆分泌的单克隆抗体可以从培养基或腹腔积液中分离或纯化。
抗体的重组生产
感兴趣的免疫球蛋白的氨基酸序列一般可以通过直接蛋白质测序来确定，可以根据通用密码子表来设计适合的编码核苷酸序列。然而，对于IgM抗体来说，从抗体蛋白质直接蛋白质测序是非常难的。IgM抗体TOL101的氨基酸序列特别难以进行标准的蛋白质测序方案。做为选择，编码单克隆抗体包括TOL101的DNA可以从杂交瘤细胞，包括杂交瘤TOL101 MCB中分离并测序，使用常规步骤确定抗体的氨基酸序列(例如，使用能够特异性结合编码单克隆抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。序列测定一般将需要分离感兴趣的基因或cDNA的至少一部分。通常，这需要克隆编码单克隆抗体的DNA或mRNA。克隆使用标准技术进行(参见，例如，Sambrook etal.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Guide,Vols 1-3,Cold Spring HarborPress，通过引用将其合并在此)。例如，通过逆转录polyA+mRNA，优选的膜相关mRNA，可以构建cDNA文库，使用特异于人免疫球蛋白多肽基因序列的探针筛选文库。在优选的实施方式中，聚合酶链式反应(PCR)被用于扩增编码感兴趣的免疫球蛋白基因片段(例如，轻链可变片段)的cDNA(或全长cDNA的部分)。扩增的序列可以容易地克隆到任何适合的载体中，例如，表达载体、迷你基因载体或噬菌体展示载体。要理解的是，使用的具体克隆方法不是关键的，只要有可能测定免疫球蛋白目标多肽的某些部分的序列。
用于克隆和测序的RNA的一个来源是杂交瘤，所述杂交瘤通过从转基因小鼠获得B细胞并将B细胞融合到永生细胞来产生。使用杂交瘤的优点是它们可以容易地筛选，以及产生感兴趣的选定人类单克隆抗体的杂交瘤。做为选择，RNA也可以从免疫的动物的B细胞(或完整脾脏)分离。当使用杂交瘤以外的来源时，可能希望筛选编码具有特定结合特征的免疫球蛋白或免疫球蛋白多肽的序列。这些筛选的一种方法是使用噬菌体展示技术。噬菌体展示在例如Dower et al.,WO 91/17271,McCafferty et al.,WO 92/01047,and Caton and Koprowski,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:6450-6454(1990)中描述，它们每一个通过引用合并在此。在使用噬菌体展示技术的一个实施方式中，来自免疫的转基因小鼠的cDNA(例如，总脾脏cDNA)被分离，使用PCR来扩增编码免疫球蛋白多肽的一部分例如CDR区的cDNA序列，扩增的序列插入到噬菌体载体中。编码感兴趣的肽，例如具有期望的结合特征的可变区肽的cDNA通过标准技术例如淘选(panning)来鉴定。然后测定扩增的或克隆的核酸的序列。一般地，测定编码免疫球蛋白多肽的完整可变区的序列，然而，有时仅需要测序可变区的一部分，例如，CDR编码部分。一般地，测序的部分长度是至少30个碱基，更常见的是测序编码至少约三分之一或至少约二分之一的可变区长度。测序可以对分离自cDNA文库的克隆进行，当使用PCR时，在亚克隆扩增的序列之后，或通过直接PCR测序扩增的片段。测序使用标准技术进行(参见，例如，Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Guide,Vols 1-3,Cold Spring Harbor Press,以及Sanger,F.et al.(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:5463-5467通过引用合并在此)。通过比较克隆的核酸的序列和公开的人免疫球蛋白基因和cDNA的序列，取决于测序的区域，技术人员可以容易地确定(i)杂交瘤免疫球蛋白多肽的种系片段使用(包括重链的同种型)，和(ii)重链和轻链可变区的序列，包括产自N-区添加和体细胞突变过程的序列。免疫球蛋白基因序列信息的一个来源是National Center for Biotechnology Information,NationalLibrary of Medicine,National Institutes of Health,Bethesda,Md。
一旦被分离，DNA可以可操作连接到表达控制序列或置入表达载体，其然后转染到细菌的、真核的和/或哺乳动物宿主细胞中，例如大肠杆菌(E.coli)细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不然就不产生免疫球蛋白蛋白质的骨髓瘤细胞，来指导重组宿主细胞中单克隆抗体的合成。
表达控制序列是在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适合于原核生物的控制序列包括启动子、可选地包括操纵序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号和增强子。在原核的、真核的和/或哺乳动物的宿主细胞中表达抗体的适合的表达控制序列是本领域公知的。
当置于与另一个核酸序列的功能关系中时，核酸序列是可操作连接的。例如，如果被表达为参与多肽分泌的原蛋白，使原序列或分泌前导区的DNA可操作地与DNA连接；如果其影响序列的转录，使启动子或增强子可操作地与编码序列连接；或如果将其放置以便于翻译，使核糖体结合位点可操作地与编码序列连接。一般地，可操作地连接意思指被连接的DNA序列是连续的，和对分泌前导区而言，在阅读相位中是连续的。然而，增强子不必是连续的。连接可以伴随有在方便的限制性位点的连接。如果这种位点不存在，按照通常的做法使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
“细胞系”和“细胞培养物”经常可互换地使用，所有这类名称都包括子代。转化体和转化的细胞包括主要目标细胞和由此衍生的培养物，不考虑传递的数目。还应理解的是，由于有意的或无意的突变，所有子代在DNA内容方面可能不是精确相同的。根据最初转化的细胞筛选的具有相同功能或生物学活性的突变子代也包括在内。
还提供了分离的核酸，其编码特定抗体，任选的与宿主细胞识别的控制序列可操作连接，包含核酸的载体和宿主细胞，以及用于生产抗体的重组技术，其可以包括培养宿主细胞，从而表达核酸，以及任选的从宿主细胞培养物或培养基回收抗体。
各种载体是本领域已知的。载体部件可以包括一种或多种以下的：信号序列(例如，其可以指导抗体的分泌)、复制起点、一个或多个选择性标记物基因(例如，其可以赋予抗生素或其他药物抗性、补足营养缺陷的缺损，或提供培养基中不可获得的关键营养物)、增强子元件、启动子和转录终止序列，所有这些都是本领域公知的。
适合的宿主细胞包括原核生物、酵母或高等真核生物细胞。适合的原核生物包括真细菌，例如，革兰氏阴性或格兰氏阳性生物，例如，肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的埃希菌属，例如大肠杆菌、肠杆菌属、欧文菌属、克氏杆菌属、变形菌杆属、沙门菌属，例如鼠伤寒沙门氏菌，沙雷菌属，例如粘质沙雷菌和志贺菌属，以及芽孢杆菌属，例如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，假单胞菌属和链球菌属。除了原核生物之外，真核微生物例如丝状真菌或酵母对于抗体编码载体是适合的克隆或表达宿主。酿酒酵母，或常见的面包酵母，在低等真核宿主微生物中是最常使用的。然而，许多其他属、种和株系是通常可获得的，例如，毕赤氏酵母属，例如巴斯德毕赤氏酵母，粟酒裂殖酵母；克卢费氏酵母属，耶氏酵母属；念珠菌属，李氏木霉；粗糙链孢霉；许旺酵母属，例如西方许旺酵母；和丝状真菌，例如脉孢菌属、青霉菌属、弯颈霉属和曲霉属宿主，如构巢曲霉和黑曲霉。
用于表达糖基化抗体的适合的宿主细胞来源于多细胞生物。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多的杆状病毒柱和变体，以及相应可感染的昆虫宿主细胞，来自宿主例如草地夜蛾(毛虫)、埃及伊蚊(蚊子)、白纹伊蚊(蚊子)、果蝇(果蝇)和家蚕。用于转染这类细胞的多种病毒毒株是公众可获得的，例如，苜蓿银纹夜蛾NPV的L-I变体，和家蚕NPV的Bm-5毒株。
然而，最感兴趣的是脊椎动物细胞，在培养物中脊椎动物细胞的增殖(组织培养)已经变得常规。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例有中国仓鼠卵巢细胞，包括CHOKI细胞(ATCC CCL61)和中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(DXB-11,DG-44；Urlaub et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；SV40转化的猴肾脏CV1系(COS-7,ATCC CRL 1651)；人类胚肾系(293或亚克隆用于在悬浮培养物中生长的293细胞，[Graham et al.,J.Gen Virol.36:59(1977)]；婴儿仓鼠肾脏细胞(BHK，ATCC CCL 10)；小鼠足细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))，猴肾脏细胞(CV1 ATCCCCL 70)；非洲绿猴肾脏细胞(VERO-76,ATCC CRL-1587)；人类宫颈癌细胞(HELA,ATCC CCL 2)；犬肾脏细胞(MDCK,ATCC CCL 34)；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442)；人类肺细胞(WI38,ATCC CCL75)；人类肝细胞瘤细胞(Hep G2,HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562,ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather et al.,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC 5细胞和FS4细胞。
宿主细胞可以在多种培养基中培养。商业上可获得的培养基例如Ham'sF10(Sigma)、最低必需培养基((MEM),(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco改良的Eagle培养基((DMEM)，Sigma)适合于培养宿主细胞。此外，中描述的任何培养基可以用作宿主细胞的培养基。优选地，培养基没有动物产物。更优选地，培养基没有蛋白质。示范性的培养基Gibco CDHybridoma；SAFC EX CELL SP/20；SAFC EX CELL 620-HSF；Cell GrowTurboDoma；和Hyclone HyQ CDM4Mab包括。这些培养基可以根据需要补充激素和/或其他生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如，氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲物(例如，HEPES)、核苷酸(例如，腺嘌呤核苷和胸腺嘧啶核苷)、抗生素(例如，庆大霉素，药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)以及葡萄糖或相当的能量来源。优选地，培养基可以补充L谷氨酰胺或L丙氨酰-L谷氨酰胺。任何其他必要的增补剂也可以以合适的浓度包括，这是本领域技术人员已知的。培养条件，例如温度、pH等等，是对选定的宿主细胞早先使用的那些，对于技术人员是显而易见的。
在某些实施方式中，细胞培养和收获过程包括以下步骤：
1.解冻和扩增
2.摇瓶扩增
3.WAVE扩增
4.300L生物反应器生产
5.收获/澄清
抗体组合物可以使用例如羟磷灰石层析、阳离子或阴离子交换层析、或优选的亲和层析，利用感兴趣的抗原或蛋白A或蛋白G作为亲和配体来纯化。蛋白A可以用于纯化基于人类γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark et al.,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。蛋白G被推荐用于所有小鼠同种型和用于人类γ3(Guss et al.,20 EMBO J.5:15671575(1986))。亲和配体附着的基质最常见的是琼脂糖，但其他基质也是可用的。与琼脂糖可以实现的相比，机械稳定矩阵，例如受控的孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯容许更快的流速和更短的处理时间。当抗体包含CH3结构域时，Bakerbond ABX.TM.树脂(J.T.Baker,Phillipsburg,25 NJ.)对于纯化是有用的。取决于要回收的特异结合试剂或抗体，蛋白质纯化的其他技术，例如，乙醇沉淀、反相HPLC、层析聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀也是可能的。
在某些实施方式中，纯化过程包括以下6个步骤：
1.pH值调节和Toypearl SP-650M层析
2.Toyopearl Super Q-650M层析
3.Toyopearl CM-650M层析
4.Planova 35N纳滤
5.Toypearl phenyl-650M层析
6.最终的切向流动过滤(TFF)
术语“表位”或“抗原决定簇”在此可互换地使用，是指抗原能够被特定抗体识别和特异性结合的部分。当抗原是多肽时，表位可以从连续的氨基酸以及从通过蛋白质的三级折叠而并列的非连续氨基酸上形成。从连续氨基酸形成的表位一般在蛋白质变性时保持，而从三级折叠形成的表位在蛋白质变性时丧失。表位一般包括处于独特的空间构象中的至少3-5个，更通常地至少5个或8-10个氨基酸。
也可以在体外利用已知的合成蛋白化学方法，包括那些利用交联剂的方法来制备嵌合的或杂交抗体。例如，可以利用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。用于这个目的的适合的试剂的实例包括亚氨基硫醇和甲基-4-巯基丁酰亚胺酯。
人源化抗体
一般地，人源化抗体具有被导入其中的、来自非人类来源的一个或多个氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基通常被称为“输入”残基，其通常取自“输入”可变区。可以实质上遵循Winter和同事[Jones et al.,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen et al.,Science,239:1534-1536(1988)]的方法，或用啮齿动物CDRs或CDR序列取代人类抗体的相应序列，来进行人源化。
因此，这种“人源化”抗体是嵌合的抗体，其中实质上少于完整的人类可变域已经被来自非人物种的相应序列代替。实际上，人源化抗体一般地是人类抗体，在其中一些CDR残基，和或者是一些FR残基被来自啮齿动物抗体中类似位置的残基代替。
重要的是，抗体保持着对抗原的高亲合性及其他有利的生物学性质而被人源化。为了实现这个目标，根据优选的方法，通过利用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念上的人源化产物的过程，来制备人源化抗体。三维的免疫球蛋白模型通常是可获得的，为本领域技术人员所熟知。图解和显示选定候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序是可获得的。对这些显示结果的检查，可以分析在候选免疫球蛋白序列的功能中残基可能起的作用，即，即分析影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基。这样，可以从共有和输入序列中选择和组合FR残基，从而获得期望的抗体特性，例如对目标抗原的增加的亲合性。一般地，CDR残基直接地且最实质上涉及到对抗原结合的影响。
人类抗体
人类单克隆抗体可以通过杂交瘤方法制备。已经描述了用于生产人类单克隆抗体的人类骨髓瘤和小鼠-人类异杂交瘤细胞系，例如Kozbor,J.Immunol.133,3001(1984)和Brodeur,et al.,Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)。
在某些实施方式中，可以采用转基因动物(例如小鼠)，其能够在用αβTCR或其片段免疫时产生人类抗体的全集，而没有内源免疫球蛋白产生。例如，已经描述了在嵌合的和种系突变小鼠中对抗体重链连接区(JH)基因的纯合删除导致了对内源性抗体生产的完全抑制。将人类种系免疫球蛋白基因转移到这种种系突变小鼠中将导致在抗原激发时产生人类抗体。参见，例如，Jakobovits et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,2551-255(1993)；Jakobovits etal.,Nature 362,255-258(1993)。Mendez等人(Nature Genetics 15:146-156[1997))进一步改善了该技术，产生了称为“Xenomouse II”的转基因小鼠系，当用抗原攻击时，其产生高亲和力完全人类抗体。通过megabase人类重链和轻链基因座种系整合到如上所述具有内源(JH)片段删除的小鼠中来实现。Xenomouse II携带1,020 kb人类重链基因座，含有大约66个VH基因，完整的DH和JH区域，以及三种不同的恒定区(μ、δ、χ)，还携带800 kb的人类κ基因座，含有32个Vκ.基因、Jκ片段和Cκ基因。这些小鼠中产生的抗体在各个方面其都与在人类中所见的紧密地类似，包括基因重排，装配和抗体所有组成部分。由于内源JH片段的删除阻止了鼠基因座中的基因重排，相对于内源抗体，人类抗体被优先地表达。
作为选择，噬菌体展示技术(McCafferty et al.,Nature 348,552-553[1990])可以用于在体外从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)域基因全集产生人类抗体和抗体片段。依据这种技术，抗体V结构域基因按照框架被克隆到丝状噬菌体的主要和次要外壳蛋白基因中，例如M13或fd，在噬菌体颗粒的表面上被呈现为功能性抗体片段。由于丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链的DNA拷贝，根据抗体功能性质的选择也产生了对编码显示出那些性质的抗体的基因的选择。因而，噬菌体模拟了B细胞的一些性质。可以以各种形式进行噬菌体展示，综述参见，例如，Johnson,Kevin S.and Chiswell,David J.,Current Opinion in Structural Biology 3,564-571(1993)。V基因片段的几个来源可被用于噬菌体展示。Clackson等，Nature 352,624-628(1991)从来源于免疫的小鼠的脾的V基因的小随机组合文库中分离了各种抗恶唑酮抗体系列。基本上根据Marks et al.,J.Mol.Biol.222,581-597(1991)或Griffith et al.,EMBO J.12,725-734(1993)所描述的技术，可以构建来自未免疫的人类供体的V基因的全集，以及可以分离针对多样系列抗原(包括自体抗原)的抗体。在天然的免疫应答中，抗体基因以高速度(体细胞的超突变)积累突变。引入的一些改变将赋予更高的亲和性，在随后的抗原攻击期间，展示高亲和力表面免疫球蛋白的B细胞被优先地复制和分化。这种自然过程可以通过采用被称为“链改组(chain shuffling)”的技术来模拟(Marks etal.,Bio/Technol.10,779-783[1992])。在这种方法中，通过用获自未免疫供体的V结构域基因的天然发生的变体的全集(全集)来连续地替换重链和轻链V区基因，可以改进通过噬菌体展示获得的“原始”人类抗体的亲和力。这种技术容许产生具有nM范围的亲和力的抗体和抗体片段。Waterhouse et al.,Nucl.Acids Res.21,2265-2266(1993)描述了产生非常大的噬菌体抗体全集的策略。基因改组也可以用于从啮齿动物抗体衍生人类抗体，其中人类抗体具有与起始的啮齿动物抗体相似的亲和力和特异性。根据这种方法，其也被称为“表位印记”，通过噬菌体展示技术获得的啮齿动物抗体的重链或轻链V结构域基因被人类V结构域基因的全集替换，产生啮齿动物-人类嵌合体。对抗原的选择引起了能够恢复功能性抗原结合位点的人类可变区的分离，即，表位支配(印记)了配偶体的选择。当重复该过程以置换其余啮齿动物V结构域时，获得了人类抗体(参见1993年4月1日公开的PCT专利申请WO 93/06213)。不同于通过CDR移植的啮齿动物抗体的传统人源化，这种技术提供了完全人类抗体，其没有啮齿动物来源的框架或CDR残基。
如下文详细讨论的，本发明的抗体任选地可以包含单体抗体、二聚抗体，以及抗体的多价形式。通过本领域已知的技术和利用在此公开的抗-αβTCR抗体，本领域技术人员可以构建这类二聚体或多价形式。制备单价抗体的方法也是本领域公知的。例如，一种方法涉及免疫球蛋白轻链和修改的重链的重组表达。一般地重链在Fc区域的任一点被截短以阻止重链交联。做为选择，相关的半胱氨酸残基可以用另一个氨基酸残基代替，或被删除，以阻止交联。
异缀合抗体
异缀合抗体也在本发明的范围内。异缀合抗体由两个共价连接的抗体组成。这种抗体已经，例如，用于将免疫系统细胞靶向不需要的细胞(美国专利No.4,676,980)，用于治疗HIV感染(PCT申请公开号No.WO 91/00360和WO 92/200373；EP 03089)。可以利用任何方便的交联方法来制造异缀合抗体。适合的交联剂是本领域公知的，在美国专利No.4,676,980中随同许多交联技术一起被公开。
抗体片段
在某些实施方式中，本发明的抗-αβTCR抗体(包括鼠、人和人源化抗体以及抗体变体)是抗体片段。已经开发出各种技术用于产生抗体片段。传统上，通过对完整抗体进行蛋白水解消化来衍生出这些片段(参见，例如Morimoto et al.,J.Biochem.Biophys.Methods 24:107-117(1992)and Brennanet al.,Science 229:81(1985))。然而，现在可以直接通过重组宿主细胞生产这些片段。例如，可以直接从大肠杆菌回收Fab'-SH片段，化学地连接形成F(ab')2片段(Carter et al.,Bio/Technology 10:163-167(1992))。在一个实施方式中，利用本领域已知的技术从大肠杆菌产生单链可变片段(scFv)。在另一个实施方式中，使用亮氨酸拉链结构GCN4以促进F(ab')2分子的组装，来形成F(ab')2。根据另一种方法，可以直接从重组宿主细胞培养物中分离Fv、Fab或F(ab')2片段。生产抗体片段的多种技术对熟练技术人员是显而易见的。例如，可以使用木瓜蛋白酶进行消化。木瓜蛋白酶消化的实例在1994年12月22日公开的WO 94/29348和美国专利No.4,342,566中描述。抗体的木瓜蛋白酶消化一般产生两个相同的抗原结合片段，称为Fab片段，各自带有单个抗原结合位点，以及残余的Fc片段。胃蛋白酶处理产生F(ab')2片段，其具有两个抗原结合部位并且仍然能够交联抗原。
抗体消化中产生的Fab片段还含有轻链的恒定域以及重链的第一恒定域(CH1)。Fab'片段不同于Fab片段，在重链CH1结构域的羧基末端具有几个额外的残基，包括一个或多个来自抗体绞链区的半胱氨酸。Fab'-SH在此是指在恒定区的半胱氨酸残基携带有游离硫醇基的Fab'。F(ab')2抗体片段最初作为Fab'片段的配对而产生，其具有Fab'片段之间的铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
利用常规程序容易地分离编码单克隆抗体的DNA并测序(例如，利用能与编码所述单克隆抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞充当了这种DNA的优选的来源。一旦被分离出来，DNA可以被放入表达载体中，然后将表达载体转染入宿主细胞，例如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或那些不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，以在所述重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。
在某些实施方式中，抗体或抗体片段分离自利用例如McCafferty et al.,Nature,348:552554(1990)中描述的技术产生的抗体噬菌体文库。Clacksonet al.,Nature,352:624-628(1991)和Marks et al.,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)分别描述了使用噬菌体文库分离鼠和人类抗体。随后的出版物描述了通过链改组(Marks et al,BioTechnology,10:779-783(1992))及组合感染和体内重组作为构建庞大的噬菌体文库的策略(例如，Waterhouse et al.,Nuc.Acids.Res.,21:2265-2266(1993))，来生产高亲合性(nM范围)人类抗体。因而，这些技术和类似的技术是对分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行性替换。
同时，例如，通过用同源的鼠序列取代人类重链和轻链恒定域的编码序列(例如，美国专利No.4,816,567和Morrison,et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,81：6851(1984))，这两篇文献通过引用合并在此，或将非免疫球蛋白多肽的编码序列的全部或部分共价地连接到免疫球蛋白编码序列，可以修饰DNA。
一般地这种非免疫球蛋白多肽被抗体的恒定域代替，或被抗体的抗原结合位点的可变域代替，以产生嵌合的二价抗体，所述二价抗体包含具有对一个抗原的特异性的抗原结合位点和具有对不同的抗原的特异性的另一个抗原结合位点。
抗体的氨基酸序列变体
抗-αβTCR抗体的氨基酸序列变体通过向抗-αβTCR抗体DNA内引入适当的核苷酸变化或通过肽合成来制备。这样的变体包括，例如，删除和/或插入和/或取代本文的实施例的抗-αβTCR抗体的氨基酸序列内的残基。进行删除、插入和取代的任何组合来得到最终的构建体，条件是最终的构建体具有期望的特性。氨基酸变化也可能改变人源化的或变体抗-αβTCR抗体的翻译后过程，例如，改变糖基化位点的数目或位置。
用于鉴定作为优选的突变位置的、抗-αβTCR抗体的某些残基或区域的有用方法，称为“丙氨酸扫描诱变”，由Cunningham and Wells,Science 244:1081-1085(1989)所描述。在此，鉴定残基或一组目标残基(例如，带电残基如arg、asp、his、lys和glu)，并用中性的或带负电的氨基酸(最优选的丙氨酸或聚丙氨酸)替换来影响氨基酸与DR4抗原的相互作用。然后通过在取代的位点导入进一步的或其他的变体来改进表现出对取代有功能敏感性的那些氨基酸位置。因而，当确定了导入氨基酸序列变化的位点时，不必预先确定突变本身的性质。例如，为了分析在给定位点的突变的性能，在目标密码子或区域进行ala扫描或随机诱变，并根据期望的活性筛选表达的抗-αβTCR抗体的变体。
氨基酸序列插入包括长度为一个残基到含有一百个或更多残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合物，以及单个或多个氨基酸残基的序列内的插入物。末端插入物的实例包括具有N-末端甲硫氨酰残基的抗-αβTCR抗体或与表位标签融合的抗体。抗-αβTCR抗体分子的其他插入变体包括提高抗体的血清半衰期的酶或多肽与抗-αβTCR抗体的N-或C-末端的融合。
另一种类型的变体是氨基酸取代变体。这些变体使在抗-αβTCR抗体分子中的至少一个氨基酸残基被除去和在它的位置上插入的不同的残基。取代诱变的最感兴趣的位点包括高变区，但FR改变也是期待的。以下标明了保守性取代。如果这样的取代引起生物学活性的改变，则可以导入更为实质性的改变并筛选产物。
抗体的生物学性质的实质性修饰伴随着选择在它们维持以下的效力上差异显著的取代，(a)在取代区域中多肽主干的结构，例如，片层或螺旋构象，(b)目标位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积(bulk)。天然发生的残基根据共同的侧链性质被分组。
以下八个组各自含有被认为是相互的保守性取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)和甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)和赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)和苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)和甲硫氨酸(M)(参见，例如Creighton,Proteins,W.H.Freeman and Co.,New York(1984))。
在某些实施方式中，提供了功能上相似的氨基酸的保守性取代表是本领域公知的。例如，选择保守性取代的一个示范性的指导包括(原始的残基随后是示范性的取代)：ala/gly或ser；arg/lys；asn/gln或his；asp/glu；cys/ser；gln/asn；gly/asp；gly/ala或pro；his/asn或gln；ile/leu或val；leu/ile或val；lys/arg或gln或glu；met/leu或tyr或ile；phe/met或leu或tyr；ser/thr；thr/ser；trp/tyr；tyr/trp或phe；val/ile或leu。可选择的示范性的指导使用以下六个组，各自含有相互为保守性取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(I)、组氨酸(H)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；(也参见，例如Creighton,Proteins,W.H.Freeman andCompany(1984)；Schultz and Schimer,Principles of Protein Structure,Springer-Verlag(1979))。本领域技术人员将理解，上述鉴定的取代不是唯一可能的保守性取代。例如，对于某些目的，人们可以考虑所有的带电氨基酸作为彼此的保守性取代，无论它们是正电还是负电的。此外，在编码序列中改变、添加、删除单个氨基酸或小百分比氨基酸的单独的取代、删除或添加也可以认为是“保守性修饰的变体”。
非保守性取代需要交换这些类别或其他类别之一的成员。不涉及维持人源化或变体抗-αβTCR抗体的适当构象的任何半胱氨酸残基也可以被取代，一般使用丝氨酸，来改善分子的氧化稳定性和阻止异常的交联。反之，半胱氨酸键可以添加到抗体中来改善它的稳定性(特别是抗体为抗体片段例如Fv片段时)。
取代变体的特别优选的类型涉及亲本抗体(例如，人源化或人类抗体)的一个或多个高变区残基的取代。一般地，相对于产生变体的亲本抗体，被选择用于进一步开发的产生的变体将具有改善的生物学性质。产生这种取代变体的方便的方法是利用噬菌体展示的亲和力成熟。简要地，突变几个高变区位点(例如，6-7个位点)来在每个位点产生所有可能的氨基酸取代。由此产生的抗体变体以单价形式在丝状噬菌体颗粒上展示，作为与封装在每个颗粒中的M13的基因III产物的融合物。如在此公开的，然后筛选噬菌体展示的变体的生物学活性(例如，结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可以进行丙氨酸扫描诱变来鉴定对于抗原结合显著有贡献的高变区。做为选择，或此外地，可能有益的是分析抗原抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体和人类DR4之间的接触点。这种接触残基和邻居残基是根据在此描述的技术的取代候选物。一旦产生了这种变体，变体的系列经历在此描述的筛选，在一个或多个相关的分析中具有更优性质的抗体可以被选择用于进一步的开发。
抗体的糖基化变体
抗体在它们的恒定区中保守的位置被糖基化(Jefferis and Lund,Chem.Immunol.65:111-128[1997)；Wright and Morrison,TibTECH 15:26-32[1997])。免疫球蛋白的寡聚糖侧链影响蛋白质的功能(Boyd et al.,Mol.Immunol.32:1311-1318[1996)；Wittwe and Howard,Biochem.29:4175-4180[1990])以及糖蛋白的各部分之间的分子内相互作用，所述相互作用可能影响糖蛋白的构象和呈现的三维表面(Hefferis and Lund,supra；Wyss andWagner,Current Opin.Biotech.7:409-416[1996])。基于特异性识别结构，寡聚糖还可以用来将给定的糖蛋白靶向某些分子。例如，已经报道了在无半乳糖基化(agalactosylated)的IgG中，寡糖部分“翻转”出内部-CH2间隙，末端N-乙酰葡萄糖胺残基变为对于结合甘露糖结合蛋白是可获得的(Malhotra etal.,Nature Med.1:237-243(1995])。从在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生的CAMPATH-1H(一种识别人类淋巴细胞的CDw52抗原的重组人源化鼠单克隆IgG1抗体)通过糖肽酶去除寡聚糖，引起了补体介导的裂解(CMCL)的完全降低(Boyd et al.,Mol.Immunol.32:1311-1318[1996])，而使用神经氨酸酶对唾液酸残基的选择性去除不引起DMCL的损失。还报道了抗体的糖基化影响抗体依赖性T细胞的细胞毒性(ADCC)。特别地，报道了带有一种催化二等分GlcNAc形成的糖基转移酶.beta.(1,4)-N-乙酰葡糖氨基转移酶III(GnTIII)的四环素调节表达的CHO细胞具有改善的ADCC活性(Umanaet al.,Mature Biotech.17:176-180[1999])。
抗体的糖基化变体是抗体的糖基化模式被改变的变体。改变意味着删除抗体中存在的一个或多个碳水化合物部分，向抗体添加一个或多个碳水化合物部分，改变糖基化的组成(糖基化模式)、糖基化的程度，等等。例如，可以通过去除、改变和/或添加编码抗体的核酸序列中的一个或多个糖基化位点，在原核细胞表达系统中表达和翻译该核酸来制备糖基化变体。
抗体的糖基化一般是N-连接的或O-连接的。N-连接的是指碳水化合物部分附着到天冬酰胺残基的侧链上。三肽序列天冬酰胺－X－丝氨酸和天冬酰胺－X－苏氨酸，其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸，是碳水化合物部分酶促附着到天冬酰胺侧链的识别序列。因而，在多肽中这些三肽序列的任何一个的存在都产生潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化是指糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附着到羟基氨基酸上，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，而5-羟脯氨酸或5-羟基赖氨酸也可以使用。
可以通过改变氨基酸序列使其含有上述三肽序列的一个或多个(用于N－连接的糖基化位点)来方便地实现给抗体添加糖基化位点。也可以通过向原始抗体的序列中添加或取代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基(用于O－连接的糖基化位点)来进行改变。
通过本领域已知的各种方法来制备编码抗-αβTCR抗体的氨基酸序列变体的核酸分子。这些方法包括但不限于从天然来源分离(对于天然发生的氨基酸序列变体)，或通过寡核苷酸介导的(或定点)诱变来制备，PCR诱变，和较早制备的抗-αβTCR抗体的变体或非变体型式的盒式诱变。
也可以改变抗体的糖基化(包括糖基化模式)而不改变基础的核苷酸序列。糖基化很大程度上取决于用于表达抗体的宿主细胞。因为用于表达作为潜在治疗剂的重组糖蛋白例如抗体的细胞类型很少是天然细胞，抗体的糖基化模式的显著改变是预期的(参见，例如Hse et al.,J.Biol.Chem.272:9062-9070[1997])。已经提出了各种方法来改变特定宿主生物体中实现的糖基化模式，包括引入或过量表达涉及寡聚糖生产的某些酶(美国专利No.5,047,335；5,510,261和5.278,299)。糖基化或某些类型的糖基化可以利用例如内切糖苷酶H(Endo H)来从糖蛋白上酶性去除。此外，重组宿主细胞可以被遗传工程化，例如在处理某种类型的多糖方面制造缺陷。这些和类似的技术是本领域公知的。抗体的糖基化结构可以通过碳水化合物分析的常规技术来容易地分析，包括凝集素层析、NMR、质谱分析、HPLC、GPC、单糖组成分析、连续酶消化和HPAEC-PAD，其利用高pH值阴离子交换层析来根据电荷分离寡聚糖。用于分析目的释放寡聚糖的方法也是已知的，不限于包括，酶处理(通常使用肽-N-糖苷酶F/内-α-半乳糖苷酶进行)、利用严格的碱性环境释放主要为O-连接的结果来消除，以及使用无水肼来释放N-和O-连接的寡聚糖的化学方法。在某些实施方式中，可以将本发明的抗-αβTCR抗体糖基化。在本发明的某些实施方式中，可以将本发明的抗-αβTCR抗体脱糖基化。在某些实施方式中，本发明的抗体或抗原结合片段包括结合人类αβTCR的抗体或抗体片段，其具有或被工程化以具有与杂交瘤TOL101MCB产生的抗体(TOL101)相同的糖基化模式。“相同的糖基化模式”或“相当的糖基化模式”意味着本发明的抗体与产自杂交瘤TOL101 MCB的抗体(TOL101)具有相同数量和/或类型的糖基化位点，从而本发明的抗体的总体糖基化特征或N-与O-连接的寡聚糖组成类似于产自杂交瘤TOL101 MCB的抗体(TOL101)的糖基化标志或N-与O-连接的寡聚糖组成，使用在此公开的常规技术来测量，使得本发明的抗体具有在此描述的TOL101的至少一种改进的功能或临床性质。此外，本发明的抗体或抗原结合片段可以与产自杂交瘤TOL101 MCB的抗体(TOL101)在相当或相应的残基处被糖基化。对于“相当或相应的残基”，涵盖的是，当利用公众可获得的计算机软件比对两种抗体序列，以及根据Kabat鉴定糖基化残基的残基编号时，本发明的抗体或抗原结合片段在产自杂交瘤TOL101 MCB的抗体(TOL101)的糖基化残基的35个、30个、25个、20个、15个、10个或5个氨基酸残基之内的残基处被糖基化，从而相对于在此描述的先有技术，本发明的抗体或抗原结合片段具有TOL101的至少一种改进的功能或临床性质。适合的计算机软件的实例包括一些程序，包括“Staden Package”、“DNA Star”、“MacVector”、GCG“Wisconsin Package”(Genetics Computer Group,Madison,Wis.)和“NCBI工具箱”(National Center for Biotechnology Information)。如在此讨论的，鉴定、比较、改变和/或工程化抗体的糖基化的方法也是本领域公知的。
示范性的抗体
在此公开的发明具有许多示范性的实施方式。下文描述了本发明的多种典型的实施方式。以下实施方式仅为了说明的目的而提供，无论如何不意味着限制本发明的范围。在本发明的方法、分析和组合物的某些实施方式中，抗-αβTCR抗体或其抗体片段包含TOL101抗体或其抗体片段，它是结合αβTCR，且由杂交瘤TOL101 MCB产生的分离的小鼠IgM单克隆抗体。
抗-αβTCR单克隆抗体性质
在各种实施方式中，本发明的抗-αβTCR抗体特异性结合哺乳动物αβTCR，例如，人类αβTCR。在某些实施方式中，本发明的抗-αβTCR抗体结合没有γδTCR的CD3+T细胞。此外，本发明的抗-αβTCR抗体不结合表达标志物如CD14、CD16、B220和CD19的细胞，进一步突出了它们对αβT细胞的特异性。例如，在超过130名临床患者和20名健康志愿者中以及对常见的永生化T细胞系，已经观察到TOL101的同质的、强力的和可重复的抗-αβTCR抗体结合。由于本发明的抗-αβTCR抗体以同质的方式结合αβT细胞的完整群体，相信的是本发明的抗-αβTCR抗体结合αβTCR的恒定区。
本领域已知的其他抗-αβTCR抗体，例如，T10B9.1A-31(T10B9)和MEDI-500，是针对T-淋巴细胞受体复合物的alpha-beta(αβ)异二聚体的免疫球蛋白M kappa鼠单克隆抗体(mAb)。T10B9可从BD PharminigenTM(SanDiego,CA,USA)以目录编号561674、555548、5555547、561673商业上可获得。T10B9具有相对短的作用持续时间，消减T细胞达10到14天，不同于用胸腺细胞球蛋白和Campath-1H所见的延长的消减。抗-αβTCR抗体例如T10B9和MEDI-500在低浓度下的可溶形式中是非促有丝分裂的(即，不诱导细胞增殖)；然而高浓度的可溶形式抗体，或低浓度或高浓度的平板结合的抗体(即，交联的抗体)诱导细胞增殖(Brown et al.ClinicalTransplantation 10；607-613[1996])。相比之下，本发明的抗-αβTCR单克隆抗体或其抗体片段(其不包括MEDI-500或T10B9或其片段)在高浓度和低浓度下，以及在可溶形式和平板结合形式中是非促有丝分裂的。T10B9和MEDI-500有时在文献中可互换地使用，早先各自作为对适应症的治疗抗体，例如治疗同种异体移植物排斥和血液恶性肿瘤被测试。然而，这些抗体的临床使用与有害事件和显著的人-抗-小鼠抗体反应(HAMA)相关(Waid et al.Transplantation 64；274-281[1997])。因而，本领域需要提供了效力同时最小化有害事件的抗-αβTCR抗体。令人惊讶地，作为鼠抗体并特异于αβTCR的TOL101展现了强力的T细胞抑制，具有最小的有害事件和最小的HAMA反应。不希望受到理论的限制，认为的是，TOL101的翻译后修饰，包括例如抗体的糖基化和/或构象，至少部分地对本发明的抗体相对于现有技术抗体的优越临床效力和安全性负责。此外，当以0到42mg/ml每天的剂量全身性施用1到5天时，本发明的抗-αβTCR抗体(包括TOL101)不会显著地(例如，当与载体对照相比时，大于10％的数量)消减循环CD3+T细胞的数量。反之，不希望受到理论的限制，认为的是，本发明的抗-αβTCR抗体(包括TOL101)下调αβTCR+T细胞上的CD3复合物，包括αβTCR本身，因而使得T细胞不会响应抗原。如在此使用的，术语“T细胞消减”和“T细胞删除”是指T细胞数量降低(例如，受试者中的循环T细胞)。T细胞消减或删除可以通过在T细胞中诱导细胞死亡来实现。
抗-αβTCR抗体和其抗体片段的用途
本发明的抗-αβTCR抗体或其抗体片段具有各种用途，特别是与αβTCR+T细胞的负调节相关的用途。例如，抗-αβTCR抗体可以应用于哺乳动物，例如，人类、灵长类和实验动物中治疗病理学状况的方法。在此期待的是，抗-αβTCR抗体可以在自身免疫疾病、炎性疾病和移植物抗宿主或移植组织排斥相关状况和疾病的治疗和/或预防中采用。在本发明的方法中，抗-αβTCR抗体或其抗体片段可以单独地或与其他次级附加的治疗试剂或技术组合地施用给有需要的哺乳动物，例如，人类受试者。
仅仅为了举例，用抗-αβTCR抗体或抗体片段治疗可以提供效力的自身免疫性和炎性疾病可以包括：哮喘(例如：变应性哮喘、非变应性哮喘、运动诱发哮喘(exercised-induced asthma)、职业性哮喘(occupational asthma)和夜间哮喘(nocturnal asthma))、变态反应、变应性气道炎症、变应性脑脊髓炎、自身免疫性关节炎、类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、反应性关节炎、银屑病性关节炎、骶髂关节炎、孤立性急性前葡萄膜炎、未分化脊椎关节病、1型糖尿病、多发性硬化、系统性红斑狼疮、肾小球肾炎、桥本甲状腺炎、格雷夫斯氏病、硬皮症、乳糜泻、克罗恩氏病、炎性肠病、溃疡性结肠炎、强直性脊柱炎、斯耶格伦氏综合征、银屑病、接触性皮炎、古德帕斯彻氏综合征、阿狄森氏病、韦格纳氏肉芽肿病、原发性胆汁性肝硬化、硬化性胆管炎、自身免疫性肝炎、风湿性多肌痛、白塞氏病、传染性神经元炎、各种血管炎、葡萄膜视网膜炎、甲状腺炎、重症肌无力、免疫球蛋白肾病、心肌炎和进行性系统性硬化病。在某些实施方式中，炎性疾病可以包括炎症状况或疾病，例如，慢性阻塞性肺病(COPD)、支气管炎、肺气肿或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。在另一个方面，炎症状况或疾病可以包括与提高的炎性细胞因子水平相关的疾病、状况或病症。在各个方面，炎性细胞因子是IL-2、IL-4或IL-5，或者炎性细胞因子是IFN-γ；或者炎性细胞因子是TNF-α。在特定的实施方式中，自身免疫性疾病是I型糖尿病或多发性硬化。
本发明的实施方式提供了治疗已经或需要移植的受试者的方法。根据这些实施方式，受试者可以用组合物治疗，来降低受试者中移植物排斥或移植物排斥的副作用的风险。根据这种方法，受试者可以施用包含能降低T细胞活化的抗-αβTCR抗体或其抗体片段的组合物。所述组合物可以在移植之前、移植期间、移植之后或其组合来施用。在某些实施方式中，本发明的抗-αβTCR抗体或其抗体片段被施用以阻止或降低移植物排斥的严重度。在其他实施方式中，本发明的抗-αβTCR抗体或其抗体片段被施用以治疗将发生或已发生的移植物排斥。此外，组合物可以进一步包括一种或多种抗移植物排斥试剂、抗炎症试剂、免疫抑制试剂、免疫调节试剂、抗微生物试剂，或其组合。
在本发明的某些实施方式中，包含抗-αβTCR抗体或其抗体片段的组合物能够显著地降低与T细胞活化相关的细胞因子活化。本发明的组织移植可以包括器官移植和/或非器官移植。例如，肺、肾脏、心脏、肝脏、角膜、皮肤、干细胞、软组织(例如，面部的成分移植)、肠移植、骨髓、胰岛、胰腺移植或其组合是期待的。
本发明的实施方式提供了改善已经或需要移植的受试者所经历的症状或病征的方法。根据这些实施方式，症状或病征可以包括与移植物抗宿主疾病(GVHD)或移植物排斥相关的状况。在一个实例中，在此公开方法可以用于治疗经历肾移植的受试者。在另一个实施方式中，症状或病征可以包括但不限于一种或多种下列一种或多种：肾衰竭、肺衰竭、心力衰竭、不适、发烧、干咳、食欲缺乏、体重减轻、肌肉痛、和胸痛、供氧损伤、出汗、恶心、呕吐、发烧、腹痛、血性腹泻、粘膜溃疡、降低的肾脏功能(提高的肌酸酐、降低的尿液输出)、降低的肺机能(提高的呼吸急促、发烧、咳嗽、痰液、低氧血)、降低的心脏功能(呼吸急促、胸痛、疲劳、肺部或外周水肿、心瓣病)、降低的胰岛功能(提高的葡萄糖、糖尿病)、移植物抗宿主疾病(胃肠(GI)溃疡、肺衰竭、皮肤溃疡、凝血病、CNS功能障碍(精神状态改变、昏迷)CMV(巨细胞病毒感染、病毒性、真菌性寄生性感染))(kidneyfailure,lung failure,heart failure,malaise,fever,dry cough,anorexia,weight loss,myalgias,and chest pains,ventilatory compromise,sweating,nausea,vomiting,fever,abdominal pain,bloody diarrhea,mucosal ulcerations,reduced renalfunction(increased creatinine,decreased urine output),reduced pulmonaryfunction(increased shortness of breath,fever,cough,sputum,hypoxemia),reduced cardiac function(shortness of breath,chest pain,fatigue,pulmonary orperipheral edema,valvulopathy),reduced islet function(increased glucose,diabetes melitus),graft versus host disease(gastrointestinal(GI)ulceration,pulmonary failure,skin ulceration,coagulopothy,CNS dysfunction(mental statuschanges,coma)CMV(cytomeglovirus infection,viral,fungal parasiticinfection)))。
本发明的实施方式提供了在受试者中促进延长的移植物存活和功能的方法，包括向需要的受试者施用治疗有效量的包括抗-αβTCR抗体或其抗体片段的组合物。本发明的实施方式提供了治疗需要免疫耐受疗法的受试者的方法。根据这些实施方式，受试者可以用组合物治疗，来降低功能障碍性免疫应答或功能障碍性免疫应答的副作用的风险。在另一个实施方式中，此处的方法提供了诱导特异于移植物的免疫耐受，和/或降低免疫抑制疗法的需要。根据这种实施方式，移植接受者的免疫系统可能已经降低或丧失了攻击移植物的特异性能力，同时维持了进行任何其他类型的免疫攻击的能力。根据这种方法，移植接受者可以施用包含抗-αβTCR抗体或其抗体片段例如TOL101的组合物。根据这些实施方式，免疫耐受疗法可以包括使用抗-αβTCR抗体或其抗体片段来抑制细胞因子生产。
本发明的实施方式提供了降低受试者中TNF-α(肿瘤坏死因子alpha)水平的方法，包括向需要这种治疗的受试者施用包括抗-αβTCR抗体或其抗体片段的组合物。本发明的实施方式提供了治疗需要免疫耐受疗法的受试者的方法。根据这些实施方式，提供了方法，用于降低NO产生和/或降低细胞凋亡和/或抑制巨细胞病毒(感染和重激活)，包括使用包括抗-αβTCR抗体或其抗体片段的组合物。在本发明的某些实施方式中，组合物能够在体内和体外显著地降低T细胞活化。
在本发明的某些实施方式中，次级的活性试剂可以与本发明的抗-αβTCR抗体或其抗体片段一起使用。在示范性的实施方式中，抗炎性化合物或免疫调节药物可以包括但不限于一种或多种干扰素、干扰素衍生物，包括betaseron、beta-干扰素、prostane衍生物，包括伊洛前列素、西卡前列素；糖皮质激素，包括皮质醇、泼尼松龙、甲基-泼尼松龙、地塞米松；免疫抑制剂，包括环孢霉素A、FK-506、methoxsalene、沙利度胺、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤；脂氧合酶抑制物，包含zileutone、MK-886、WY-50295、SC-45662、SC-41661A、BI-L-357；白细胞三烯拮抗剂；肽衍生物,包括ACTH和其类似物；可溶的TNF-受体；TNF-抗体；白细胞介素的可溶受体、其他细胞因子、T细胞-蛋白；针对白细胞介素的受体、其他细胞因子、T细胞-蛋白的抗体；以及卡泊三醇；霉酚酸酯(mycophenolate mofetil)和其类似物，单独或组合地服用。
本发明的抗-αβTCR抗体或其抗体片段可以进一步在N-末端或C-末端重组融合或连接到异源多肽，或与多肽或其他组合物化学结合(包括共价和非共价的结合)。例如，本发明的抗体可以重组地融合或结合到有用的分子，如检测分析中的标记物(例如放射性核素、放射性同位素、荧光标记物、发光标记物、生物发光标记物或生物素)以及效应分子，例如异源多肽、药物、酶或毒素。参见，例如，PCT公开WO 92/08495；WO 91/14438。
本发明的实施方式提供了降低受试者中的移植物排斥的方法。根据这些实施方式，受试者可以用治疗有效量的抗-αβTCR抗体或其抗体片段治疗，用于降低受试者中移植物排斥反应或移植物排斥反应的副作用的风险。根据这种方法，受试者可以施用包括抗-αβTCR抗体或其抗体片段的组合物。在一个实例中，降低移植物排斥可以包括降低有器官移植，例如肾脏移植或肠移植，或非器官移植，例如，骨髓移植、软组织移植的受试者中与移植物排斥相关的症状。
在各种实施方式中，在此描述的各种病理学的状况在哺乳动物中的诊断可以由熟练的医师来进行。诊断技术是本领域可获得的，其容许例如诊断或检测哺乳动物中自身免疫性和炎症相关的疾病。例如，自身免疫性和炎症相关的疾病可以通过以下技术来鉴定，包括但不限于，鉴定某些淋巴细胞的类型和群体，自身抗体的存在，疾病特异性细胞因子的存在和数量，发烧的存在，等等。例如，在系统性红斑狼疮中，疾病的中枢性介体是针对自身蛋白/组织的自体反应性抗体的产生，以及随后免疫介导的炎症的产生。多个器官和系统在临床上受到影响，包括肾脏、肺、肌骨胳系统、粘膜皮肤、眼睛、中枢神经系统、心血管系统、胃肠道、骨髓和血液。SLE可以使用多种风湿病学和血液学的测试来诊断，例如，某些自身抗体的存在和数量，如，阳性抗核抗体(ANA)测试，抗nRNP A、抗nRNP C、抗Sm、抗Ro、抗La和抗dsDNA抗体的存在。
类风湿性关节炎(RA)是慢性的全身性自身免疫炎性疾病，主要涉及多个关节的滑膜，产生对关节软骨的损伤。病理是T淋巴细胞依赖性，以及与类风湿因子的产生相关，类风湿因子是一种针对自身IgG的自体抗体，结果形成在关节液和血液中达到高水平的免疫复合物。关节中的这些复合物可以诱导淋巴细胞和单核细胞显著浸润进入滑膜，以及诱导随后显著的滑液改变；如果被加入了许多嗜中性细胞的类似细胞浸润，关节间隙/液。受影响的组织主要是关节，通常是对称型的。然而，关节外的疾病也以两种主要的形式出现。一种形式是伴随着进行中的渐进性关节病而发生关节外的病变，以及肺纤维化、脉管炎和皮肤溃疡的典型病变。第二种形式的关节外疾病是所谓的费尔蒂综合征，其在RA病程的晚期发生，有时在关节病变为静息之后，涉及中性白细胞减少、血小板减少和脾肿大的发生。这可以伴随着多个器官中的脉管炎，伴有梗塞形成、皮肤溃疡和坏疽。患者经常还显现覆盖受影响关节的皮下组织中的类风湿结节；结节晚期具有由混合的炎性细胞浸润围绕的坏死中心。在RA中可能发生的其他现象包括：心包炎、胸膜炎、冠状动脉炎、伴肺纤维化的间质肺炎、干性角膜结膜炎和类风湿结节。
少年慢性关节炎是一种慢性特发性炎性疾病，其常常在小于16岁时开始。它的表型与RA具有一定相似性；类风湿因子阳性的某些患者被分类为幼年型类风湿性关节炎。该疾病被进一步分类为三个主要类别：少关节的、多关节的和全身性的。关节炎可以是严重的，一般是破坏性的，引起关节僵硬和生长阻滞。其他表现可以包括慢性前葡萄膜炎和系统性淀粉样变性。
脊柱关节病是一组病症，伴有某些常见的临床特征，通常与HLA-B27基因产物的表达相关。这些病症包括：强直性脊柱炎、莱特尔氏综合征(反应性关节炎)、与炎性肠病相关的关节炎、与银屑病相关的脊椎炎、少年发作的脊柱关节病和未分化脊椎关节病。区别性特征包括有或者没有脊椎炎的骶髂关节炎；炎性的不对称关节炎；与HLA-B27相关(I类MHC的HLA-B基因座的血清学确定的等位基因)；眼部炎症和缺乏与其他类风湿病相关的自身抗体。最被暗指为诱导该疾病的关键细胞是CD8+T淋巴细胞，一种靶向由I类MHC分子呈递的抗原的细胞。CD8+T细胞可以针对I类MHC等位基因HLA-B27反应，如同它是由MHC I类分子表达的外源肽。猜测的是，HLA-B27的表位可能模拟了细菌或其他微生物抗原表位，因而诱导CD8+T细胞应答。
全身性硬化(硬皮症)具有未知的病因。该疾病的标志是皮肤的硬化；这可能是由活动的炎症过程诱导的。硬皮症可以是局部的或全身的；血管的病变是常见的，微脉管系统中的内皮细胞损伤是全身性硬化的发展中的早期和重要事件；脉管的损伤可以是免疫介导的。免疫学基础是在皮肤病变中存在单核细胞浸润，以及在许多患者中存在抗核抗体。ICAM-1经常在皮肤损害中成纤维细胞的细胞表面上上调，表明与这些细胞的T细胞相互作用可能在疾病的病理中有作用。涉及的其他器官包括：胃肠道：平滑肌萎缩和纤维化，引起异常的蠕动/运动；肾脏：同中心的内皮下内膜增殖，影响小弓形和小叶间动脉，产生降低的肾脏皮层血流，引起蛋白尿、氮血症和高血压；骨骼肌：萎缩、间质性纤维化；炎症；肺部：间质肺炎和间质性纤维化；以及心脏：收缩带坏死、瘢痕/纤维化。
包括皮肌炎、多肌炎和其他的自发性炎性肌病是引起肌肉衰弱的不明病因的慢性肌肉炎症的病症。肌肉损伤/炎症经常是对称的和渐进性的。自身抗体与大多数形式相关。这些肌炎特异性自身抗体针对并抑制涉及蛋白质合成的成分、蛋白质和RNA的功能。
斯耶格伦氏综合征是由于免疫介导的炎症以及随后泪腺和唾液腺的功能破坏。疾病可能与炎性结缔组织疾病相关或伴随。疾病与针对Ro和La抗原的自身抗体产生相关，这两者都是小的RNA-蛋白质复合物。病变引起干性角膜结膜炎、口腔干燥，伴有其他表现或关联，包括胆汁肝硬化、外周的或感官的神经病，以及明显的紫癜。
全身性脉管炎是一类疾病，其中初级病变是炎症，随后损害血管，其引起对受影响血管供应的组织的缺血/坏死/退化，以及在某些情况下最终的器官功能障碍。脉管炎也可以作用其他免疫-炎症介导的疾病例如类风湿性关节炎、全身性硬化等的继发病变或后遗症，特别是在也与免疫复合物形成相关的疾病中。原发全身性脉管炎组中的疾病包括：全身性坏死性脉管炎：多发性结节性动脉炎、变应性脉管炎和肉芽肿病、多血管炎；韦格纳氏肉芽肿病；淋巴瘤样的肉芽肿病；和巨大细胞动脉炎。混杂的脉管炎包括：川崎氏病(MLNS或川崎(Kawasaki)氏病)、分离的CNS脉管炎、贝塞(Behet)氏病、闭塞性血栓血管炎(伯格(Buerger)氏病)和皮肤坏死性小静脉炎。所列的大多数脉管炎类型的发病机理被认为主要由于血管壁中免疫球蛋白复合物的沉积，随后通过ADCC、补体激活或两者诱导炎性反应。
结节病是病因不明的状况，其特征在于在身体几乎任何组织中存在上皮状肉芽肿；肺的牵连是最常见的。病理涉及在疾病部位活化的巨噬细胞和淋巴样细胞的存留，伴有随后由这些细胞类型释放的局部或全身性活性产物释放产生的后遗症。
自身免疫性溶血性贫血包括自身免疫性溶血性贫血、免疫全血细胞减少和突发性的血红蛋白尿，是与红血细胞(以及在某些情况下也包括血小板的其他血细胞)的表面表达的抗原反应的抗体的产生的结果，是这些抗体包被的细胞经由补体介导的裂解和/或ADCC/Fc受体介导机制被去除的反映。
自身免疫性血小板减少包括血小板减少性紫癜和在其他临床环境下免疫介导的血小板减少，在自身免疫性血小板减少中，血小板破坏/去除作为附着到血小板的抗体或补体随后通过补体裂解、ADCC或Fc受体介导的机制去除的结果。
甲状腺炎包括格雷夫氏病、桥本甲状腺炎、少年淋巴细胞性甲状腺炎和萎缩性甲状腺炎，是针对甲状腺抗原的自身免疫应答的结果，伴有与甲状腺中存在以及经常特异于甲状腺的蛋白质反应的抗体产生。现有的实验模型包括自发的模型：大鼠(BUF和BB大鼠)以及雏鸡(肥胖的雏鸡系)；可诱导的模型：用甲状球蛋白、甲状腺微粒体抗原(甲状腺过氧化物酶)免疫动物。
I型糖尿病或胰岛素依赖性糖尿病是胰岛β细胞的自身免疫性破坏。这种破坏由自身抗体和自体反应性T细胞介导。对胰岛素或胰岛素受体的抗体也可以产生胰岛素不应答的表型。
免疫介导的肾脏疾病包括肾小球肾炎、小管间质性肾炎，是抗体或T淋巴细胞介导的肾脏组织损伤的结果，直接地作为针对肾脏抗原的自体反应性抗体或T细胞的产生的结合，或是间接地作为针对其他非肾脏抗原为反应性的抗体和/或免疫复合物在肾脏中沉积的结果。因而引起免疫复合物形成的其他免疫介导的疾病也可能诱导免疫介导的肾病，作为间接的后遗症。直接和间接的免疫机制都引起炎性反应，其产生/诱导肾脏组织中的病变发育，伴随结果的器官功能损伤，在某些情况下发展成肾衰竭。体液的和细胞的免疫机制都可能涉及病变的病理。
中枢和外周神经系统的脱髓鞘疾病，包括多发性硬化；自发性脱髓鞘多发性神经病或格-巴二氏综合征；以及慢性炎性脱髓鞘多发性神经病，被认为具有自身免疫性基础，作为对少突胶质细胞或直接对髓鞘质引起的破坏的结果，引起神经脱髓鞘。在多发性硬化中，有证据表明，疾病诱导和发展取决于T淋巴细胞。多发性硬化一般具有复发-减轻性病程或慢性渐进性病程。病因是未知的；然而，病毒感染、遗传倾向性、环境和自身免疫都可能促进疾病的病因和/或病理。病变含有主要为T淋巴细胞介导的浸润，小胶质细胞、浸润性巨噬细胞、CD4+T淋巴细胞是病变位置的优势细胞类型。少突胶质细胞细胞死亡和随后的脱髓鞘的机制是不明的，但可能是T淋巴细胞驱动的。在本发明的各个方面中，施用本发明的抗-αβTCR抗体被认为是防止进一步的髓鞘质破坏和患者发病的理论的第一个步骤。在MS的动物模型，实验性自身免疫性脑脊髓炎中，T细胞拮抗可以完全消除疾病。不限于任何特定的理论，相信的是，在多发性硬化的动物模型，实验性自身免疫性脑脊髓炎中施用本发明的抗-αβTCR抗体，引起T细胞拮抗，其可以完全消除疾病。虽然在降低、消除或逆转疾病症状和病理中起作用的具体机制不是理解本发明所必须的，相信的是，向新近发作的多发性硬化患者施用本发明的抗-αβTCR抗体不仅沉默了自体反应性免疫应答，还防止表位波及至其他髓鞘质表位，抑制疾病的发展。
测定多发性硬化疾病阶段的指标是公知的。例如，与新近发作相关的症状可以包括一种或多种下列一项或多项：疲劳、视力障碍、麻木头晕/眩晕、膀胱和肠功能障碍、虚弱、震颤、受损的活动性、性功能障碍、言语不清、痉挛状态(腿僵硬)、吞咽病症、慢性酸痛、抑郁、轻微认知和记忆困难(fatigue,visual disorders,numbness dizziness/vertigo,bladder and bowel dysfunction,weakness,tremor,impaired mobility,sexual dysfunction,slurred speech,spasticity(leg stiffness),swallowing disorders,chronic aching pain,depression,mild cognitive and memory difficulties)。虽然不是所有这些症状都在新近发作的多发性硬化中存在，通常检测到这些的某些组合。多发性硬化的其他阶段或类型可包括：良性的多发性硬化、复发/减轻性多发性硬化、继发/渐进性的多发性硬化、原发/渐进性的多发性硬化，以及渐进性/复发性多发性硬化。多发性硬化的这些阶段是本领域公知的，可以使用本领域已知的神经学可接受的测试和诊断方法来验证。例如，对比增强性病变(CEL)的数量可以根据磁共振成象(MRI)研究来确定。另外，多发性硬化患者的功能评估是本领域已知的，包括，例如，平均Scripps神经病学等级量表(mean ScrippsNeurological Rating Scale)；平均扩展的失能状况量表(mean ExpandedDisability Status Scale,EDSS)；以及平均多发性硬化功能组成(mean MultipleSclerosis Functional Composite,MSFC)。
如在此使用的，治疗被诊断患有或怀疑患有多发性硬化的哺乳动物，例如人类，可以包括向被诊断患有或怀疑患有一种或多种下列一项或多项的哺乳动物受试者施用治疗有效剂量的本发明的抗-αβTCR抗体或其片段：新近发作的多发性硬化、良性多发性硬化、复发/减轻性多发性硬化、继发/渐进性多发性硬化、原发/渐进性多发性硬化，以及渐进性/复发性多发性硬化。在某些实施方式中，治疗患有多发性硬化的哺乳动物的方法可以进一步包括以递增剂量服用法、递减剂量服用法或其组合来施用治疗有效剂量的本发明的抗-αβTCR抗体或其片段。
临床上，包括阿伦单抗(alemtuzumab)和赛尼哌(daclizumab)的试剂在MS中被测试。然而，这些疗法具有不可靠的效力和安全分布。在动物研究中，靶向αβT细胞受体对疾病的临床和病理的病征显示了显著的治疗效力。它不仅沉默了自体反应性免疫应答，还阻止了表位波及到其他髓鞘质表位，抑制疾病的发展。在某些实施方式中，本发明的抗-αβTCR抗体或其片段将降低每月的对比增强性病变的平均数量达50％或更高。在某些实施方式中，与基线MRI(例如，在治疗前2个月期间采集的3个MRI期间CEL的平均总量)期间CEL的平均总数相比，本发明的抗αβTCR抗体或其片段将在用本发明的抗-αβTCR抗体或其片段治疗之后3-6个月期间降低比对增强性病变(CEL)的平均数量。在其他实施方式中，用本发明的抗-αβTCR抗体或其片段治疗改善或防止了多发性硬化症状的恶化，如通过平均Scripps神经病学等级量表(SNRS)来测量的，与SNRS、扩展的失能状况量表(EDSS)和/或多发性硬化功能组合(MSFC)相比的。
在某些实施方式中，本发明的抗-αβTCR抗体或其片段将降低髓鞘质特异性T细胞的数量。在某些实施方式中，本发明的抗-αβTCR抗体或其片段将改变髓鞘质特异性T细胞的表型，从促炎性-TH1/17变为抗炎性TH2样T细胞，和/或使得引发疾病的T细胞为非应答性的。
如在此使用的，新近发作的多发性硬化可以包括具有第一次脱髓鞘事件(临床上分离的综合征(CID))的受试者。检测和/或诊断新近发作的多发性硬化的方法在神经病学领域是公知的。某些说明性的例子可包括，磁共振成象，用于病变检测，例如，利用钆增强的和T2病变(即，在T2加权图像上所见的病变)的病变体积和计数，T1加权的低强度病变(Black Holes)以及中枢神经系统(CNS)萎缩测量能够捕获由炎症、脱髓鞘、轴突损失和神经变性引起的组织改变范围的更全局性的图片。在某些实施方式中，在新近发作的多发性硬化患者中一种病变(临床上分离的综合征)的客观临床证据可以用由与多发性硬化加阳性CSF一致的两个或更多个MRI病变所展现的空间传播，以及MRI或第二次临床攻击展现的时间传播来确定。阳性CSF一般被定义为与在血清或产生的免疫球蛋白G指数中不同的寡克隆条带。在一个实例中，如果以下指标的至少三个被满足，通过空间与时间传播确定的脑异常的MRI指标，以及空间上传播的MRI病变可以被确定：1)在脑或脊柱中一个钆增强的病变或九个T2高强度病变；2)至少一个慕下的或脊柱病变；3)至少一个近皮质的病变；或4)至少三个室周的病变。为了确定时间上传播的MRI病变的存在，必须满足至少一个指标：1)在起初的呈现之后≥3个月钆增强的病变，但是在与起始事件不同的位置，和2)与起始的事件发作后≥30天进行的参考MRI相比，新的T2病变。改编自Polman CH,Reingold SC,Edan G,et al:Diagnostic Criteria for Multiple Sclerosis:2005Revisions to the“McDonald Criteria.”Ann Neurol 2005；58:840-846，其公开内容完全合并在本文中。
炎性和纤维化肺病，包括嗜酸细胞性肺炎、特发性肺纤维化和变应性肺炎，可能涉及失调的免疫-炎性应答。对这种应答的抑制将有治疗效益。
自身免疫性或免疫介导的皮肤病包括大疱性皮肤病、多形性红斑和接触性皮炎，是由自体抗体介导的，其产生是T淋巴细胞依赖性的。
银屑病是T淋巴细胞介导的炎性疾病。病变含有T淋巴细胞、巨噬细胞和抗原呈递细胞以及某些嗜中性细胞的浸润。
炎性疾病可以包括过敏型疾病，其包括IgE介导和非IgE介导的那些。例如，变应性鼻炎、特异反应性皮炎、食品超敏反应和荨麻疹是T淋巴细胞依赖性的。这些疾病主要由T淋巴细胞诱导的炎症、IgE介导的炎症或两者的组合所介导。在某些实施方式中，本发明的抗-αβTCR抗体可以在治疗变应性疾病、过敏相关疾病或与气道炎症相关的呼吸道疾病如哮喘中找到用途。在某些实施方式中，本发明的组合物在预防、治疗或减轻与变应性反应、皮肤过敏、湿疹、变应性鼻炎、荨麻疹、特异反应性皮炎、干眼病、变应性接触过敏、食品超敏反应、变应性结膜炎、昆虫毒变态反应、支气管哮喘、变应性哮喘、内因性哮喘、职业性哮喘、特异性哮喘、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和慢性阻塞性肺病(COPD)(anaphylaxis,skin allergy,eczema,allergic rhinitis,urticaria,atopic dermatitis,dry eye disease,allergic contactallergy,food hypersensitivity,allergic conjunctivitis,insect venom allergy,bronchial asthma,allergic asthma,intrinsic asthma,occupational asthma,atopicasthma,acute respiratory distress syndrome(ARDS)and chronic obstructivepulmonary disease(COPD))相关的一种或多种症状方面是有效的。
可以由本发明的方法治疗的超敏相关疾病或病症包括但不限于，变态反应、药物反应、皮肤过敏、湿疹、变应性鼻炎、荨麻疹、特异反应性皮炎、干眼症(或称为干性角膜结膜炎(KCS)，也称为干性角膜炎、眼球干燥症)、变应性接触过敏、食物过敏、变应性结膜炎、昆虫毒变态反应和与气道炎症相关的呼吸疾病，例如IgE介导的哮喘和非IgE介导的哮喘。
与气道炎症相关的呼吸疾病可以包括，但不限于，鼻炎、变应性鼻炎、支气管哮喘、变应性(外在性)哮喘、非变应性(内在性)哮喘、职业性哮喘、特异性哮喘、运动诱发的哮喘、咳嗽诱发的哮喘、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和慢性阻塞性肺病(COPD)。
移植相关的疾病包括移植物排斥和移植物抗宿主疾病(GVHD)，是T淋巴细胞依赖性的；抑制T淋巴细胞功能是起改善作用的。上文描述的抗-αβTCR抗体和抗体片段对于治疗、防止或延迟同种异体移植物排斥是有用的。
本发明不限于所采用的同种异体移植物的类型。例如，在某些实施方式中，同种异体移植物是实体器官或组织，选自由以下构成的组：心脏、肺、肾脏、肝脏、胰腺、肠、胃、睾丸、手、角膜、皮肤，包括面部再植，郎格罕氏岛(islets of Langerhans)(胰岛细胞)、骨髓/成年人干细胞、输血/血液成分输血、血管、心瓣膜、骨，以及细胞或组织移植接受者(例如，干细胞或骨髓细胞接受者)。
施用
抗体优选地在载体中，优选地药学上可接受的载体中施用给哺乳动物。在Remington's Pharmaceutical Sciences,16th ed.,1980,Mack Publishing Co.,edited by Oslo et al.中描述了适合的载体和它们的制剂。一般地，适当数量的药学上可接受的盐在制剂中使用，来使制剂等渗。载体的实例包括盐水、林格(Ringer)氏溶液和葡萄糖溶液。溶液的pH值优选地从约5到约8，更优选地从约7到约7.5。进一步的载体包括持续释放制剂，例如，含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基质处于有形物的形式，例如，薄膜、脂质体或微粒。对本领域技术人员显而易见的是，取决于例如要施用的抗体的施用途径和浓度，某些载体可能是更优选的。
抗-αβTCR抗体或其抗体片段可以通过注射(例如，静脉内的、腹膜内的、皮下的、肌肉内的、门静脉内的)，或通过确保其以有效形式递送到血流的其他方法，例如输注来施用给受试者。抗体还可以通过分离的灌注技术，例如，分离的组织灌注来施用，以发挥局部治疗效果。局部的或静脉内注射是优选的。
为抗体选择适当剂量的指导存在于关于抗体的治疗使用的文献中，例如Handbook of Monoclonal Antibodies,Ferrone et al.,eds.,Noges Publications,Park Ridge,N.J.,(1985)ch.22 and pp.303-357；Smith et al.,Antibodies inHuman Diagnosis and Therapy,Haber et al.,eds.,Raven Press,New York(1977)pp.365-389。单独使用的抗体的典型的每日剂量的范围可以为每天约0.01mg/kg-达到100mg/kg体重或更多，更优选，每天约0.1mg/kg-达到约10mg/kg，甚至更优选从约0.2mg/kg-约0.7mg/kg体重或更多，取决于上述因素。
在某些实施方式中，治疗自身免疫性疾病、炎性疾病或移植组织排斥(例如，肾移植排异反应)的方法可以包括以从约1mg/天到约200mg/天、或从约7mg/天到约58mg/天、或从约14mg/天到约45mg/天、或从约28mg/天到约42mg/天的数量，或7mg/天、14mg/天、21mg/天、28mg/天、30mg/天、32mg/天、34mg/天、35mg/天、36mg/天、38mg/天、40mg/天、42mg/天、44mg/天、46mg/天、48mg/天、50mg/天、52mg/天、54mg/天、56mg/天或58mg/天或更多、或其组合的数量，向需要的受试者施用抗-αβTCR抗体或其抗体片段或抗-αβTCR IgM抗体或其抗体片段。如在此使用的，整数1到200涵盖或包括，在整数1和200之间的任何整数或其分数。例如，约7mg/天到约58mg/天的日剂量将天然地包括这个范围内的所有整数，例如，8、10、13、27、28、29、30、45、53和57mg/天，以及其任何分数，例如，3.5、4.7、5.25、11.6、22.1、46.3和51.125mg/天，仅是整数7和58之间期待的分数的实例。在某些实施方式中，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天给药日程，可以包括递增和/或递减的给药日程，其涵盖可以相同和/或可以不同的连续每日剂量。在本发明的方法、分析和组合物的某些实施方式中，抗-αβTCR抗体或其抗体片段包含结合αβTCR的TOL101抗体或其抗体片段。在本发明的方法的某些实施方式中，自身免疫性疾病、炎症疾病或移植组织排斥是肾脏移植组织排斥/移植物抗宿主疾病或多发性硬化。
在某些实施方式中，本发明的方法，例如，治疗自身免疫性疾病、炎性疾病或移植组织排斥的方法，可以包括以以下数量向需要的受试者施用抗-αβTCR抗体或其抗体片段，所述数量是约1mg/天到约200mg/天，或约7mg到约58mg每日剂量，或加起来包含日剂量的分数单位剂量，例如，28mg的日剂量包含在24小时期间的不同时间施用的两个14mg剂量，例如，每天两次，或每12小时。在某些实施方式中，给药服用法可以包括以每天基本上不变的日剂量向需要的患者或受试者用组合物，例如药物组合物给药。在某些实施方式中，在三到五到六天期间，受试者用从0天最高日剂量开始的滴定日剂量，例如，58mg每天，或56mg/天或42mg/天，滴定到最低日剂量，例如7mg每天或14mg/天来治疗。表1-4中显示了示范性的给药日程。
表1.示范性的3日递减给药日程
表2.示范性的3日递增给药日程
表3.示范性的6日递减给药日程
表4.示范性的5日递减给药日程
在某些实施方式中，给药服用法可以包括递增给药日程，其中在第0天，日剂量是施用给受试者的最低日剂量。在最后一天或治疗间隔的某天，日剂量逐步升高到最高日剂量。在一个实施方式中，对受试者施用抗-αβTCR抗体或其抗体片段，直到受试者的他克莫司(tacrolimus)水平达到目标水平。在一个实施方式中，对受试者每天施用抗-αβTCR抗体或其抗体片段至少3天或直到受试者的他克莫司水平达到目标水平。在一个实施方式中，对受试者每天施用抗-αβTCR抗体或其抗体片段至少4天或直到受试者的他克莫司水平达到目标水平。在一个实施方式中，对受试者每天施用抗-αβTCR抗体或其抗体片段至少5天或直到受试者的他克莫司水平达到目标水平。在一个实施方式中，对受试者每天施用抗-αβTCR抗体或其抗体片段至少6天或直到受试者的他克莫司水平达到目标水平。在一个实施方式中，对受试者每天施用抗-αβTCR抗体或其抗体片段最大10天。在某些实施方式中，他克莫司的目标水平是8-15ng/ml。在一个实施方式中，所述递增给药服用法可以包括表5和6中举例的以下给药日程：
表5.示范性的6日递增给药日程
表6.示范性的5日递增给药日程
在某些实施方式中，所述日剂量是总日剂量，在一个单位剂量或多个剂量中施用，例如，2、3或4个单位剂量组合以达到陈述的总日剂量。
在某些实施方式中，治疗自身免疫性疾病、炎性疾病或移植组织排斥的方法可以包括向自身免疫性疾病、炎性疾病、器官同种异体移植物移植接受者的受试者施用至少三个独立剂量的抗-αβTCR抗体(例如，IgG或IgM)或其抗-αβTCR抗体片段，其中在连续三天里施用所述至少三个独立的剂量，以及其中无两剂在同一天施用。在其他实施方式中，至少三个独立剂量包括四个独立剂量或由四个独立剂量组成，其中至少四个独立剂量连续四天施用，其中无两剂在同一天施用。在特定的实施方式中，至少三个独立剂量包括五个独立剂量或由五个独立剂量组成，其中至少五个独立剂量连续五天施用，其中无两剂在同一天施用。在其他实施方式中，至少三个独立剂量包括6到14个独立剂量或由6到14个独立剂量组成，其中至少6到14个独立剂量连续6到14天施用，且其中无两剂在同一天施用。
在某些实施方式中，治疗患有自身免疫性疾病、炎性疾病或移植组织排斥的受试者可以包括向受试者施用至少第一剂量的抗-αβTCR抗体(例如，IgG或IgM)、或抗-αβTCR抗体片段，其中所述第一剂量在至少50分钟或至少70分钟内(例如，50-100分钟；70-200分钟；70-180分钟；70-140分钟；或70...140...180...200分钟)静脉内施用。在某些实施方式中，本发明提供了延迟或阻止同种异体移植物排斥的方法，包括向同种异体移植物移植接受者施用至少第一剂量的抗-αβTCR抗体(例如，IgG或IgM)或抗-αβTCR抗体片段，其中所述第一剂量以0.05mg/分钟到0.35mg/分钟(例如，0.05...0.1...0.2...0.3...0.35mg/分钟)的速率静脉内施用。
在其他实施方式中，所述至少第一剂量包含至少三个独立的剂量，其中所述三个独立的剂量连续三天施用，其中三个独立剂量的每一个在至少50分钟...60分钟...或至少70分钟内静脉内施用。在进一步的实施方式中，所述第一剂量以基本上恒定的速率(例如，0.05mg/分钟和0.35mg/分钟之间的速率)静脉内施用。在某些实施方式中，所述第一剂量在高流速静脉中施用。
抗-αβTCR抗体和抗体片段可以通过任何合适的方法施用，包括胃肠外的、非胃肠外的、皮下的、表面的、腹膜内的、肺内的、鼻内的和病灶内的施用(例如，对于局部免疫抑制性治疗)。胃肠外的输注包括但不限于,肌肉内的、静脉内的、动脉内的、腹膜内的或皮下的施用。此外，抗-αβTCR抗体和抗体片段可以通过脉冲输注，特别是以减低的剂量施用。
抗-αβTCR抗体和抗体片段可以掺入适合于向受试者施用的药物组合物中。例如，所述药物组合物可以包含抗-αβTCR抗体和抗体片段以及药学上可接受的载体。如在此使用的，“药学上可接受的载体”包括生理学上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟试剂，等等。药学上可接受的载体的实例包括一种或多种以下的：水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等等，以及其组合。在很多情况下，优选的是在组合物中包括等渗试剂，例如，糖类、多元醇如甘露醇、山梨醇、或氯化钠。药学上可接受的载体可以进一步包含微量的辅助物质，例如，湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液，它们增强抗-αβTCR抗体和抗体片段的货架寿命或有效性。
本发明的组合物可以处于各种形式。这些包括，例如，液体、半固体和固体剂型，例如，液体溶液(例如，可注射的和可输注的溶液)、分散体或悬浮液、片剂、丸剂、粉末、脂质体和栓剂。优选的形式取决于施用和治疗应用的预期方式。典型的优选组合物是可注射或可输注溶液，例如，与使用其他抗体用于人类被动免疫的那些类似的组合物。
治疗组合物在制造和保存条件下一般是无菌的和稳定的。组合物可以被配制为溶液、微乳剂、分散体、脂质体或适合高药物浓度的其他有序结构。通过将活性化合物(即，抗体或抗体片段)以所需的数量掺入到具有以上列举成分的一种或组合成分的适合的溶剂中，根据需要，继之以过滤除菌，来制备无菌可注射溶液。一般地，通过将活性化合物掺入到含有基础分散介质以及来自以上列举那些的其他所需成分的无菌运载体中，来制备分散体。对于用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂来说，优选的制备方法是真空干燥和冻干技术，其产生活性成分加上来自其早先无菌过滤溶液的任何其他期望成分的粉剂。例如，通过使用包被例如卵磷脂、在分散体的情况下通过维持所需的粒子大小、以及通过使用表面活性剂，可以维持溶液的适当流动性。通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸盐和明胶，可以实现可注射组合物的延长的吸收。
在某些实施方式中，可以使用载体制备活性化合物，所述载体将保护所述化合物对抗快速释放，例如控释制剂，穿表皮的贴片和微密封的递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚羟基乙酸、胶原、聚原磷酯(polyorthoesters)、聚乳酸。制备这样的制剂的许多方法是专利，或一般是本领域技术人员公知的(参见，例如，Sustainedand Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson.ed.,MarcelDekker,Inc.,New York,1978)。
本发明的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明的抗体或抗体片段。“治疗有效量”是指为实现期望的治疗结果(例如，阻止或降低同种异体移植物排斥，治疗、减轻或防止自身免疫性和炎性症状和状况的复发或发生)在剂量和持续必要的时间方面有效的数量。抗体或抗体片段的治疗有效量可以根据一些因素变化，例如，个体的疾病状况、年龄、性别和体重，抗体或抗体片段在个体中引发期望的应答的能力。治疗有效量也是一种量，其中治疗有益的效果胜过抗-αβTCR抗体或抗体片段的任何毒性或不利影响。“预防有效量”是指在必需的剂量和时间段下实现期望的预防结果的有效数量。一般地，由于在疾病之前或较早阶段在受试者中使用预防剂量，预防有效量将低于治疗有效量。
在某些实施方式中，本发明提供了包含分离的抗体的组合物，所述分离的抗体包含SEQ ID NO：3、4和5的多核苷酸序列，以及其中所述分离的抗体结合αβTCR。在某些实施方式中，本发明提供了包含结合αβTCR并竞争性抑制单克隆抗体T10B9.1A-31与αβTCR的结合的抗体的组合物，用于治疗自身免疫疾病和病症、炎性疾病或病症，以及移植组织排斥或GVHD，如在此描述的。
在某些实施方式中，本发明提供了组合物，其包含：分离的人源化单克隆抗体或其片段，其包含：i)来自TOL101抗体的轻链可变区的三个互补决定区(CDR)的至少一个，ii)来自TOL101抗体的重链可变区的三个互补决定区(CDR)的至少一个，和iii)来自人类抗体的恒定区。在进一步的实施方式中，所述分离的人源化单克隆抗体或其片段包含：i)来自TOL101抗体的轻链可变区的三个互补决定区(CDR)的至少一个、或至少两个或全部三个，和ii)来自TOL101抗体的重链可变区的三个互补决定区(CDR)的至少一个、至少两个或全部三个。
在某些实施方式中，本发明提供了组合物，其包含：分离的人源化单克隆抗体或其片段，包含：i)来自TOL101抗体的轻链可变区的三个互补决定区(CDR)，ii)来自TOL101抗体的重链可变区的三个互补决定区(CDR)，和iii)来自人类抗体的恒定区。在进一步的实施方式中，所述人源化单克隆抗体或其片段是冻干的。在其他实施方式中，所述组合物进一步包含生理学可耐受的缓冲液。在特定的实施方式中，所述组合物进一步包含或由以下的至少一个、两个或三个组成：i)无菌水；ii)L－精氨酸(例如，约100mML－精氨酸或10-900mM)；iii)柠檬酸盐(例如，约5mM柠檬酸盐，或约1-25mM柠檬酸盐)；iv)甘露醇(例如，约4％甘露醇(w/v)或约1到30％w/v甘露醇)；和v)TWEEN或其他非离子型洗涤剂(例如，约0.01％TWEEN80，pH7.0)。在进一步的实施方式中，人源化单克隆TOL101抗体或其片段以14mg到52mg之间，优选的28mg到52mg之间存在于组合物中，或以28mg、30mg、32mg、34mg、35mg、36mg、38mg、40mg、42mg、44mg、46mg、48mg或50mg存在于组合物中。
抗-αβTCR抗体的其他用途
本发明的抗-αβTCR抗体的治疗效果可以在体外分析中以及使用体内动物模型来检查。各种公知的动物模型可以用于进一步了解在此鉴定的抗-αβTCR抗体在例如免疫相关疾病或癌症的发生和病理中的作用，以及测试候选治疗试剂的效力。这些模型的体内性质使得它们对于人类患者中的反应是特别预示性的。免疫相关疾病的动物模型包括非重组的和重组的(转基因的)动物。非重组动物模型包括，例如，啮齿动物，如鼠模型。这种模型可以通过使用标准技术将细胞导入同系基因小鼠来产生，例如，皮下注射、尾部静脉注射、脾脏植入、腹膜内植入、在副肾下植入。
动物模型，例如，移植物抗宿主疾病是已知的。当免疫活性细胞被移植到免疫抑制的或耐受的患者中时，移植物抗宿主疾病发生。供体细胞识别并响应宿主抗原。反应可以从危急生命的严重炎症到腹泻和失重的轻微病情。移植物抗宿主疾病模型提供了评估针对MHC抗原和较小的移植抗原的T细胞反应性的手段。适合的操作在中Current Protocols in Immunology,Unit 4.3详细描述，所述操作通过完全引用合并在此。
皮肤同种移植物排斥的动物模型是测试T细胞介导体内组织破坏的能力的手段，其是它们在抗病毒和肿瘤免疫中的作用的指示和度量。大多数常见的和公认的模型使用鼠尾部皮肤移植物。重复的实验已经显示了皮肤同种移植物排斥由T细胞、辅助T细胞和杀伤T效应细胞而不是抗体来介导。(Auchincloss,H.Jr.and Sachs,D.H.,Fundamental Immunology,2nd ed.,W.E.Paul ed.,Raven Press,NY,1989,889-992)。在Current Protocols in Immunology,Unit 4.4中详细描述了适合的操作。可以用于测试本发明的组合物的其他移植物排斥模型是Tanabe,M.et al.,Transplantation,(1994)58:23 and Tinubu,S.A.et al.,J.Immunol.,(1994)4330-4338描述的同种异体心脏移植模型。
用于延迟型超敏反应的动物模型也提供了对细胞介导的免疫功能的分析。延迟型超敏性反应是T细胞介导的体内免疫应答，特征在于在用抗原攻击过去一段时间后才达到峰值的炎症。这些反应还在组织特异性自身免疫疾病，例如多发性硬化(MS)和实验的自身免疫性脑脊髓炎(EAE，MS的模型)中出现。在Current Protocols in Immunology,unit 4.5中详细描述了适合的操作。
关节炎的动物模型是胶原蛋白诱发的关节炎。这种模型共有人类自身免疫性类风湿性关节炎的临床、组织学和免疫学的特征，是人类自身免疫性关节炎的可接受的模型。小鼠和大鼠模型的特征在于滑膜炎、软骨侵蚀和软骨下的骨。本发明的抗-αβTCR抗体可以利用Current Protocols in Immunology,above,units 15.5中描述的方案测试针对自身免疫性关节炎的活性。也参见Issekutz,A.C.et al.,Immunology,(1996)88:569中描述的使用针对CD18和VLA-4整联蛋白的单克隆抗体的模型。
已经描述了哮喘的模型，其中抗原诱发的气道超反应性、肺部嗜曙红细胞增多和炎症是通过用卵清蛋白敏化动物，然后用通过气雾剂递送的相同蛋白质攻击动物来诱发的。几种动物模型(豚鼠、大鼠、非人灵长类)在用气雾剂抗原攻击时显示了类似于人类中变应性哮喘的症状。鼠模型具有人类哮喘的许多特征。测试本发明的组合物在治疗哮喘中的活性和有效性的适合的操作由Wolyniec,W.W.et al.,Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.,(1998)18:777以及其中引用的文献所描述。
另外，本发明的抗-αβTCR抗体可以在银屑病样疾病的动物模型上测试。例如，本发明的抗-αβTCR抗体可以在Schon,M.P.et al.,Nat.Med.,(1997)3:183描述的scid/scid小鼠模型中测试，其中小鼠展现了相似于银屑病的组织病理性皮肤损害。另一种适合的模型是如Nickoloff,B.J.et al.,Am.J.Path.,(1995)146:580所描述制备的人类皮肤/scid小鼠嵌合体。
选择性抑制(TCR+)T细胞免疫应答的方法
在某些实施方式中，本发明提供了抑制或选择性抑制(αβTCR+)T细胞免疫应答的方法。如在此使用的，术语“选择性抑制”或“抑制”一般是指在将αβTCR+T细胞暴露于本发明的抗-αβTCR抗体或其抗体片段之后αβTCR+T细胞的至少一个活化途径的抑制。“选择性抑制”或“抑制”可以指T细胞活化的下游效应例如增殖和细胞因子生产的抑制作用。
如上所述，(TCR+)T细胞免疫应答的选择性抑制涉及αβTCR+T细胞中信号转导部分的降低或抑制(例如，人类CD4+T辅助细胞或记忆细胞或CD8+T效应细胞)，其可以引起促炎性细胞因子，例如肿瘤坏死因子-alpha(TNF-α)；干扰素-gamma(IFN-γ)；或与STAT活化相关的白细胞介素，例如IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9和/或IL-13的增殖和/或生产的降低或完全停止。在此处采用的各种治疗方法中，在MHC环境中不存在抗-αβTCR抗体或其抗体片段的相关抗原的情况下本领域相关抗原的TCR+T细胞的活化相比较时，施用治疗有效量的抗-αβTCR抗体或其抗体片段引起促炎性细胞因子从所述TCR+T细胞表达或释放降低。此外，选择性抑制使得αβTCR+T细胞不被消减，而仅仅失去CD3的表达(例如，至少3剂的抗-αβTCR抗体，或抗-αβTCR抗体片段足以降低同种异体移植物移植接受者中cd3+计数至小于25个细胞每mm3)并继续表达CD2。因而，本发明的抗-αβTCR抗体或其片段抑制T细胞活化，包括促炎性细胞因子的增殖和产生，而不诱发T细胞消减，这与其他抗T细胞抗体例如OKT3不同，它们从循环中消减T细胞，可能导致受试者严重地免疫受损。
分析
在某些实施方式中，抗-αβTCR抗体和其抗体片段可被用于筛选分析，来鉴定模拟了抗-αβTCR抗体并结合抗-αβTCR、导致TCR功能失活的治疗性化合物。
在一个实施方式中，方法包括鉴定阻抑、抑制或灭活/失活TCR+T细胞活化的治疗性化合物的步骤。所述方法包括步骤：在可操作以形成TCR-抗αβTCR复合物的条件下用抗-αβTCR抗体或其抗体片段接触αβT细胞受体(αβTCR)或其片段。所述分析可以在任何分析反应容器、反应孔、试管或在固体基质上中进行，只要分析条件有助于形成TCR-抗-αβTCR抗体复合物。在某些实施方式中，试剂以液体形式悬浮添加到适当的缓冲液中。αβT细胞受体可以分离或纯化自借助流式细胞术细胞分选仪分选的人类αβT细胞。
一般而言，第二个步骤包括用候选化合物接触TCR-抗αβTCR复合物。候选化合物可以包括但不限于：核酸、肽、蛋白质(包括在此描述的抗体)、糖类、多糖、糖蛋白、脂质和有机小分子。“候选化合物”是在筛选分析中被测试的化合物。在一个实施方式中，候选化合物可以包括抗体或其抗体片段。如果与不存在候选化合物或阴性对照蛋白或抗体(例如牛血清白蛋白或抗BSA抗体)相比，候选化合物特异性地结合αβT细胞受体，该候选化合物可以被称为“先导化合物”，其可以利用能展现αβT细胞受体失活，包括所鉴定化合物的细胞因子生产的降低或停止来证实，或可以被用作具有适合于治疗自身免疫性、炎性、或组织排斥疾病或状况，例如，I型糖尿病和自身免疫性或炎性的神经变性疾病，例如多发性硬化、帕金森氏病或肌萎缩性侧索硬化的αβT细胞受体失活活性的潜在或实际的活性试剂。术语“有机小分子”一般是指大小可以与一般用于药物的那些有机分子相比的分子。有机小分子一般排除了生物学大分子(例如，蛋白质，核酸，等等)。优选的有机小分子大小范围在约5,000Da，更优选的，达到2,000Da，最优选的达到约1,000Da。
通常，通过鉴定具有某些期望的性质或活性的候选化合物、产生候选化合物的变体、评估这些变体化合物的性质和活性，来产生具有有用性质的新的化学实体。然而，当前的趋势是缩短药物开放的所有方面的时间进程。由于快速和有效地测试大数量的能力，高流量筛选(HTS)方法正在替代常规的先导化合物鉴别方法。
在某些实施方式中，高通量筛选方法涉及提供含有大量潜在治疗性化合物(候选化合物)的文库。然后在一种或多种分析中筛选这种“组合化学文库”，如在此描述的，来鉴定显示了期望的特征活性的库成员(特别是化学种类或子类)。
组合化学文库或化学文库可以是通过组合多种化学物质“构件(buildingblock)”例如试剂，通过化学合成或生物合成产生的多种化合物的集合。例如，线性组合化学文库例如多肽(例如，突变蛋白)文库是通过以各种可能的方式组合称为氨基酸的化学构件的组达到给定的化合物长度(即，多肽化合物中的氨基酸数量)来形成的。通过这种化学构件的组合混合，可以合成数百万的化合物。例如，100种可互换化学构件的系统性的组合混合理论上引起1亿种四聚化合物或100亿种五聚化合物的合成。
组合化学物文库的制备和筛选是本领域技术人员公知的。这类组合化学文库包括，但不限于，肽文库(参见，例如，美国专利No.5,010,175。肽合成决不是预想和设计用于本发明的唯一方法。也可以使用用于产生化学多样性文库的其他化学作用。这类化学作用包括但不限于：类肽(PCT公开No.WO91/19735，1991年12月26日)、编码的肽(PCT公开WO 93/20242，1993年10月14日)、随机生物寡聚物(PCT公开WO92/00091，1992年1月9日)、苯二氮类(美国专利No.5,288,514)、驱动体(diversomers)例如乙内酰脲类、苯二氮类和二肽类，乙烯类似物多肽类，具有β-D-葡萄糖支架的非肽模拟物，小的化合物文库的类似的有机合成、寡聚氨基甲酸酯类、和/或肽基膦酸酯。一般地，参见，核酸文库(参见，例如，Strategene,Corp.)、肽核酸文库(参见，例如，美国专利No.5,539,083)、抗体文库(参见，例如，PCT/US96/10287)、碳水化合物文库(参见，例如美国专利No.5,593,853)和有机小分子文库(参见，例如，苯二氮类、异戊二烯类，美国专利No.5,569,588，噻唑烷酮类和间噻嗪酮类，美国专利No.5,549,974，吡咯烷类，美国专利No.5,525,735和5,519,134，吗啉化合物，美国专利No.5,506,337，苯二氮类，5,288,514，等等)。
制备组合文库的设备是商业上可获得的(参见，例如357 MPS,390 MPS,Advanced Chem Tech,Louisville Ky.,Symphony,Rainin,Woburn,Mass.,433AApplied Biosystems,Foster City,Calif.,9050 Plus,Millipore,Bedford,Mass.)。对于液相化学作用也已经开发了许多公知的机器系统。这些系统包括但不限于自动化的工作站，如Takeda Chemical Industries LTD.(Osaka,Japan)开发的自动化合成设备，和许多利用机器人臂的机器人系统(Zymate II,ZymarkCorporation,Hopkinton,Mass.；Orca,Hewlett-Packard,Palo Alto,Calif.)其模拟由化学家进行的人工操作，以及VentureTM平台，一种超高通量合成仪，其可以从开始到结束运行576个和9,600个之间的平行反应(参见，AdvancedChemTech,Inc.Louisville,KY,USA)。任何上述装置都适合于本发明使用。对这些装置进行性质和实施的修改(如果需要的话)使得它们可以如在此讨论的操作，对于相关领域技术人员是显而易见的。此外，许多组合文库本身是商业上可获得的(参见，例如ComGenex,Princeton,N.J.,Asinex,Moscow,Ru,Tripos,Inc.,St.Louis,Mo.,ChemStar,Ltd,Moscow,RU,3D Pharmaceuticals,Exton,Pa.,Martek Biosciences,Columbia,Md.,等)。
在某些实施方式中，分析方法的第三个步骤包括测定所述候选化合物调节抗-αβTCR抗体或其抗体片段与所述TCR或其片段结合的能力，其中所述抗-αβTCR抗体或其抗体片段与所述TCR或其片段的结合的调节，以及未能活化静息T细胞表明所述候选化合物是治疗性化合物。测定候选化合物是否可以调节抗-αβTCR抗体或其抗体片段与TCR或其片段的结合可以通过许多方法实现。抗-αβTCR抗体或其抗体片段与TCR或其片段之间结合的调节可以通过竞争性结合分析来实现。在这样的分析中，TCR可以附着于固体基底，例如，96孔ELISA平板的表面上。数量变化的抗-αβTCR抗体或其抗体片段可以添加到抗-αβTCR抗体或其抗体片段的反应孔中。在测试样品中，进行与对照反应相同的条件，只是在添加抗-αβTCR抗体或其抗体片段同时或之后添加数量变化的候选化合物。然后洗涤测试和对照反应孔，来除去未结合的抗-αβTCR抗体或其抗体片段。可以测量结合的抗-αβTCR抗体或其抗体片段的数量并与相应的对照样品比较。如果候选化合物竞争地抑制抗-αβTCR抗体或其抗体片段与TCR的结合，然后进一步测试候选化合物，来确定候选化合物是否可以在存在抗CD3抗体的情况下活化静息的αβT细胞。可以通过使一种或多种αβTCR+T细胞与可操作以结合一种或多种αβTCR+T细胞上的CD3或超级抗原的抗-CD3抗体接触；添加调节抗-αβTCR抗体或其抗体片段与αβTCR或其片段结合的候选化合物；以及比较在存在或缺乏测试的候选化合物的情况下αβTCR+T细胞活化的程度或比率。如果与缺乏候选化合物的情况下αβTCR+T细胞活化的程度或比率相比，候选化合物在存在抗-CD3抗体的情况下不提高αβTCR+T细胞活化的程度或比率，则候选化合物是治疗性化合物。
实施例
呈现以下实施例以提供本发明的某些示范性的实施方式，而不意图限制本发明的范围。
实施例1.用TOL101或嵌合的TOL101治疗的人类的治疗和评估
TOL101是杂交瘤TOL101 MCB产生的，是结合人类αβTCR的鼠IgM单克隆抗体(具体的是IgMκ)。
示范性的TOL101和TOL101嵌合抗体配制剂
TOL101和嵌合的TOL101可以作为冻干制品产生，其在IV施用之前在无菌注射用水(SWFI)中重构，随后在盐水中稀释来配制。小瓶产品可以在3mL SWFI中重构，来提供50-150mM L-精氨酸(例如50mM...75mM...100mM...125mM...150mM)，1-10mM柠檬酸盐(例如，1.0mM...2.0mM...3.0mM...4.0mM...5.0mM...6.0mM...7.0mM...8.0mM...9.0mM...10mM)，2-8％甘露糖醇(w/v)(例如，2％...3％...4％...5％...6％...7％...或8％)，0.005-0.05％Tween80,pH7.0(例如0.005％...0.01％...0.02％...0.03％...或0.05％)的最终配制剂。
TOL101和嵌合TOL101的制备
可以将TOL101和嵌合TOL101重构和稀释用于静脉内(IV)施用。TOL101/嵌合TOL101小瓶(例如，带有14mg冻干抗体)可以在真空下密封。TOL101和嵌合TOL101可以根据以下步骤重构：
1.计算需要的小瓶数量(例如，对于0.28mg、1.4mg、7mg或14mg剂量为1个小瓶，对于28mg剂量为2个小瓶，等等)；
2.容许每个小瓶在重构之前达到室温；
3.在无菌条件下除去帽，暴露橡皮塞；
4.用杀菌剂或酒精拭清洁塞子；
5.将皮下用针插入小瓶中以减轻小瓶的内压力；
6.使用第二个针用3mL SWFI在无菌条件下重构，然后除去这两个针；
7.在手中以45度角轻轻滚动小瓶60秒。确保小瓶的顶部不接触材料。优选地，在重构期间不摇动或翻转小瓶。避免材料起泡。
8.容许小瓶静置3分钟直到消除任何气泡；以及
9.第二次在手中轻轻滚动小瓶60秒，或直到内容物匀质。
应当检查重构溶液的颗粒物质。如果颗粒物质没有完全消失，小瓶应该隔离并不进行使用。重构的TOL101或嵌合TOL101可以用生理盐水(NS)在IV输注袋(聚氯乙烯、PVC袋)中稀释到50mL每小瓶(参见下文表7)。如果使用部分小瓶(即，0.28mg、1.4mg或7mg)，全部小瓶应当如上所述用3mL SWFI重构，适当体积(即，分别0.06mL(60μl)、0.3mL或1.5mL)的重构的TOL101/嵌合TOL101应转移到IV输注袋中。在通过校准输注泵输注前，IV袋应当轻轻地翻转来混合溶液。
示范性的输注速率
特定剂量的TOL101或嵌合TOL101可以通过恒定速率缓慢的静脉内输注来施用，对0.28mg剂量0.004mg/分钟，1.4mg剂量0.02mg/分钟，7和14mg剂量0.1mg/分钟，28mg剂量0.2mg/分钟，42mg或更高的剂量0.3mg/分钟(参见下文表7)。因此，在这个实施例中，TOL101或嵌合TOL101在任何剂量下不会在低于70分钟内施用。如果测试了任何中间剂量，可以使用更慢的速率(例如，如果0.2mg/分钟的速率用于28mg剂量，0.3mg/分钟的速率用于42mg的剂量，以及要测试中间剂量，则35分钟的剂量可以以0.2mg/分钟的速率施用)。TOL101或嵌合TOL101优选地施用到高流速静脉中。IV线在输注结束应当用大约25mL的NS慢慢地冲洗。
表7.在每个剂量水平下输注TOL101和嵌合TOL101的速率和总持续时间
实施例2.人类移植患者的治疗
这个实施例描述了用TOL101单克隆抗体治疗人类肾脏移植患者，在各个时间点测试这些患者的CD3计数。T细胞的消减和/或调节(通过CD3生物标记物测定的)在器官移植的初始阶段是重要的，因为它阻止急性排斥反应。此外，它还容许维持免疫抑制剂的延迟应用，已知所述维持免疫抑制剂对移植的器官，特别是在肾脏移植物的情况下是有毒的。已经经由医生的经验确定了，50(CD3+计数/mm3)代表了需要降低T细胞以提供更好的长期结局的上阈值。在这个实施例中，肾脏移植患者根据以下的表8中的日程在至少6天内输注。测试了三个不同的组，每组两名患者。测试的剂量是0.28mg、1.4mg、7.0mg的TOL101抗体。在70分钟内静脉内给与剂量。每个患者在总计5天里每天给与一剂，第一剂在移植手术之时。在将受试者麻醉之后和松开(同种异体移植物的重灌注)之前，在手术室开始给与第一剂量。
苯海拉明(diphenhydramine)(50mg IV)在前两剂TOL101之前施用，静脉内的类固醇在前三剂TOL101之前施用。随后的TOL101剂量在口服类固醇施用之后输注。还在移植后前6天内开始施用他克莫司(tacrolimus)，持续整个研究期间。在设计为达到和维持移植后第一个月8-15ng/ml的治疗范围，此后维持6-12ng/mL的治疗范围的剂量下施用他克莫司。在移植当天、或移植后一天，以及在研究的期间以1000mg BID的最大剂量施用霉酚酸酯(Mycophenolate mofetil)。
表8.用TOL101治疗的肾脏移植患者中的CD3计数
研究的结果显示，施用TOL101以剂量依赖性方式降低了肾脏移植患者中的CD3+T细胞计数。
实施例3.TOL101选择性抑制T细胞
为了确定抗-αβTCR抗体TOL101是否在体外抑制T细胞增殖，进行了实验来测定单向MRL反应中TOL101的增殖效应。PMBC分离自三位健康供体的淡黄层(buffy coat)。淡黄层在Ficol梯度上分层来富集淋巴细胞。刺激细胞然后用3000拉德(rad)照射。刺激细胞和应答细胞以2:1((4x105个)刺激细胞比2x105个应答细胞)的比例共培养6天。细胞的组合如下：一单位来自受试者No.1的血液+一单位来自受试者No.2的照射的血液，一单位来自受试者No.1的血液+一单位来自受试者No.3的照射的血液，一单位来自受试者No.2的血液+一单位来自受试者No.1的照射的血液，一单位来自受试者No.2的血液+一单位来自受试者No.3的照射的血液，一单位来自受试者No.3的血液+一单位来自受试者No.1的照射的血液，一单位来自受试者No.3的血液+一单位来自受试者No.2的照射的血液。在培养时以9μg/mL的浓度添加TOL101。将氚化胸苷H3向培养物添加5天，在第6天收获平板并计数。图1显示了2个独立实验的代表性数据。***＝p>.001。如图1所示，当与对照相比时，TOL101显著地抑制T细胞的增殖，直接表明对自身免疫应答的抑制。
在另一个实验中，TOL101显示了在体外MLR反应的前24个小时期间是特别有效的。PMBC分离自三位健康供体的淡黄层。淡黄层在Ficol梯度上分层来富集淋巴细胞。刺激物细胞然后用3000拉德照射。刺激细胞和应答细胞以2:1的比例((4x105个)刺激细胞比2x105个应答细胞)共培养6天。细胞的组合如下：一单位来自受试者No.1的血液+一单位来自受试者No.2的照射的血液，一单位来自受试者No.1的血液+一单位来自受试者No.3的照射的血液，一单位来自受试者No.2的血液+一单位来自受试者No.1的照射的血液，一单位来自受试者No.2的血液+一单位来自受试者No.3的照射的血液，一单位来自受试者No.3的血液+一单位来自受试者No.1的照射的血液，一单位来自受试者No.3的血液+一单位来自受试者No.2的照射的血液。在0小时、24小时、48小时和72小时添加TOL101。添加的TOL101的浓度为.9μg/mL、9μg/mL和90μg/mL。将氚化胸苷H3向培养物添加5天，在第6天收获平板并计数。如图2中说明的，实线代表添加了9μg/mL CD3抗体(OKT3)的培养物的阳性对照增殖。虚线代表没有添加TOL101的培养物的增殖。**＝p>.05。从图2可以看出的是，在0小时到24小时的时间段之间观察到最大的增殖抑制。
在另一个实验中，TOL101添加到液体溶液中，或平铺在表面上，来测量与对照活化抗体抗-CD3(OKT3)相比TOL101的交联对T细胞增殖的影响。PMBC分离自三位健康供体的淡黄层。淡黄层在Ficol梯度上分层来富集淋巴细胞。以2x105个细胞/孔的密度培养淋巴细胞。用可溶的TOL101(9、.9μg/mL)或平板结合的TOL101(90、9、.9μg/mL)培养细胞，而其他细胞与CD3抗体(OKT3，9μg/mL)或PMA/伊屋诺霉素培养作为阳性对照。将氚化胸苷H3向培养物添加5天，在第6天收获平板并计数。如图3所示，实线表示背景增殖。**＝p>.05,***＝p>.001。不同于抗-CD3、T10B9和其他抗-TCR抗体(Brown et al.Clinical Transplantation 10；607-613[1996])，TOL101的交联，甚至在90μg/mL的最高浓度下，没有使其变为促有丝分裂的(即，诱导T细胞的增殖)。这是令人惊讶的和临床上相关的，因为它反映了在临床受试者中安全利用TOL101的可能性。
在另一个实验中，测定了TOL101针对用抗-CD3刺激的T细胞的抑制活性。T细胞受体(TCR)的识别机制是α和β链，它们衔接肽与MHC的复合物。涉及的遗传学和细胞学机制导致产生数百万种不同的α和β链，提供较宽的病原体覆盖。TCR的非多态性成分，即，CD3、γ、δ和ε，以及TCRζ链二聚体，与α和β链识别成分相互作用。还没有已知的对TCR的α和β链的胞内信号转导成分。然而相信的是，CD3含有TCR活化T细胞的信号转导机制使用。例如，CD3分子是整合的TCR成分，不仅是适当的TCR表达需要的，而且在这些非多态性分子的其胞内/胞质成分中还含有独特的基序ITAM(基于免疫受体的酪氨酸活化基序)。CD3中含有的这些ITAM，是由TCR使用来活化T细胞的信号转导机制。αβTCR的活化引起CD3介导的信号转导的过程是未知的。然而，早先相信的是αβTCR信号必须通过CD3发生。因而，使用抗-CD3抗体绕过了对αβTCR激活信号的需要。在这个实施例中，PBMC分离自三位健康供体的淡黄层。淡黄层在Ficol梯度上分层来富集淋巴细胞。以2e5个细胞/孔的密度培养淋巴细胞。细胞用可溶的TOL101(9、.9μg/mL)培养，或用抗-CD3(OKT39、0.9、.09μg/mL)或PMA/伊屋诺霉素培养作为阳性对照。在24小时时，TOL101(9μg/mL)添加到一组OKT3刺激的细胞中。将氚化胸苷H3向培养物添加5天，在第6天收获平板并计数。如图4所示，令人惊讶地，TOL101不仅不诱导增殖，还改善或逆转了体外的抗-CD3诱导的T细胞增殖。*＝p>.01,**＝p>.05,***＝p>.001。
在另一个实验中，在混合性淋巴细胞群体中测量了TOL101的结合特异性。PMBC分离自三位健康供体的淡黄层。淡黄层在Ficol梯度上分层来富集淋巴细胞。细胞在4℃用人类AB血清封闭30分钟。细胞然后在4℃用下列抗体染色30分钟：TOL101+抗小鼠IgM，CD3、CD4、CD8、CD2、CD69和CD44。洗涤细胞，在BD FACS Canto II上运行。通过Flow Jo分析数据。图5中显示的数据代表6名患者。如图5所示，染色分布不仅显示了TOL101对T细胞的特异性，而且还说明了TOL101不考虑T细胞的活化状态与T细胞结合(例如，结合CD62L高表达和低表达者，分别指示活化的和未活化的T细胞)。
在另一个实验中，TOL101显示了结合活化的T细胞，如图6所示。简要地，PMBC分离自三位健康供体的淡黄层。淡黄层在Ficol梯度上分层来富集淋巴细胞。刺激细胞然后用3000拉德照射。刺激细胞和应答细胞以2:1的比例(4x105个刺激细胞比2x105个应答细胞)共培养6天。细胞的组合如下：一单位来自受试者No.1的血液+一单位来自受试者No.2的照射的血液；一单位来自受试者No.1的血液+一单位来自受试者No.3的照射的血液；一单位来自受试者No.2的血液+一单位来自受试者No.1的照射的血液；一单位来自受试者No.2的血液+一单位来自受试者No.3的照射的血液；一单位来自受试者No.3的血液+一单位来自受试者No.1的照射的血液；以及一单位来自受试者No.3的血液+一单位来自受试者No.2的照射的血液。在培养的第6天分析细胞。细胞在4℃用人类AB血清封闭30分钟，然后在4℃用以下抗体染色30分钟：TOL101+抗小鼠IgM、CD3、CD4、CD8、CD2、CD69和CD44。洗涤细胞，在BD FACS Canto II上运行。通过Flow Jo分析数据。研究的结果进一步确认了TOL101对T细胞的特异性。令人惊讶地，TOL101结合活化的T细胞，尽管实际上TCR被认为在T细胞活化后被下调。因而，不同于其他T细胞抗体，TOL101具有不论T细胞活化状态如何对其结合的能力。
除了显示TOL101结合活化的T细胞之外，进行了进一步的实验来确定TOL101是否可以结合T细胞的特化记忆子集。PMBC分离自三位健康供体的淡黄层。淡黄层在Ficol梯度上分层来富集淋巴细胞。细胞在4℃用人类AB血清封闭30分钟。细胞然后在4℃用以下抗体染色30分钟：TOL101+抗小鼠IgM、CD3、CD4、CD8、CD2、CD62L、CD45RA、CD45RO。洗涤细胞，在BD FACS Canto II上运行。数据通过Flow Jo分析，代表来自2个独立实验的6名患者。如图7所示，抗-αβTCR抗体TOL101结合CD4和CD8T细胞记忆子集二者。
为了进一步检查TOL101与记忆子集的结合，在另一个实验中，PBMC分离自三名健康供体的淡黄层。淡黄层在Ficol梯度上分层来富集淋巴细胞。刺激细胞然后用3000拉德照射。刺激细胞和应答细胞以2:1的比例(4x105个刺激细胞比2x105个应答细胞)共培养6天。细胞的组合如下：一单位来自受试者No.1的血液+一单位来自受试者No.2的照射的血液；一单位来自受试者No.1的血液+一单位来自受试者No.3的照射的血液；一单位来自受试者No.2的血液+一单位来自受试者No.1的照射的血液；一单位来自受试者No.2的血液+一单位来自受试者No.3的照射的血液；一单位来自受试者No.3的血液+一单位来自受试者No.1的照射的血液；以及一单位来自受试者No.3的血液+一单位来自受试者No.2的照射的血液。在培养的第6天分析细胞。细胞在4℃用人类AB血清封闭30分钟。细胞然后在4℃用以下抗体染色30分钟：TOL101+抗小鼠IgM、CD3、CD4、CD8、CD2、CD62L、CD45RA、CD45RO。洗涤细胞，在BD FACS Canto II上运行。通过Flow Jo分析数据。如图8所示，在单向MLR反应后，TOL101结合PBMC的记忆的和活化的T细胞子集。
在另一个实验中，在早先用抗-CD3抗体活化的细胞中测量TOL101的结合特征。PMBC分离自三位健康供体的淡黄层。淡黄层在Ficol梯度上分层来富集淋巴细胞。在培养时向来自每个供体的细胞添加抗-CD3(9μg/mL)或PMI/伊屋诺霉素。在培养的第6天分析细胞。细胞在4℃用人类AB血清封闭30分钟，用TOL101染色。洗涤细胞，在BD FACS Canto II上运行，通过Flow Jo分析数据。如图9所示，TOL101结合CD3活化的细胞及(在更大程度上)PMA/伊屋诺霉素活化的细胞二者。
在另一个实验中，测试TOL101以确定它对关键的激活和信号转导成分ZAP70的磷酸化的作用。刺激从三名健康供体抽取的新鲜血液，根据以下条件，来分析活化之后的磷酸化。未刺激的：37℃15分钟；抗-CD3→TOL101：4℃抗-CD315分钟，37℃aIG 15分钟，4℃TOL101 15分钟，37℃aIgM 15分钟；抗-CD3交联：4℃抗-CD315分钟，37℃aIG 15分钟；抗-CD3：37℃抗-CD315分钟；TOL101交联：4℃TOL101 15分钟，37℃aIgM 15分钟；以及TOL101：37℃TOL101 15分钟。以9μg/mL的浓度添加抗体。在刺激之后，固定细胞，透化，用T细胞抗体混合物和抗-pZap70(BD PhosflowT cell Activation Kit-Human)染色。在染色的4小时内在BD FACS Canto II上分析细胞。在图10中显示了Zap70磷酸化和原始荧光强度值的直方图。在暴露于抗-CD3，接着在24小时后暴露于TOL101的T细胞中ZAP70磷酸化降低。在图10中还显示了ZAP70磷酸化的原始值。如上所述，TCR介导的T细胞活化是ITAM介导的下游信号转导的结果。ZAP-70(一种蛋白质酪氨酸激酶)含有SRC同源2域(SH2)，其结合CD3 ITAM域。ZAP70的初始活化继之以衔接蛋白和酶的磷酸化，最终达到转录因子的活化，例如活化细胞核因子(NFAT)、FOS、JUN和核转录因子kB(NFKB)。不希望受到理论的限制，TOL101降低抗-CD3诱导的磷酸化的ZAP-70的能力表明，TOL101与其表位的结合特异性引起T细胞下调，潜在地通过蛋白酪氨酸磷酸酶，诸如例如PTPN22、CD45、CD148、SHP-1和SIT，或通过以不需要CD3的方式连接αβTCR与细胞信号转导级联的未知衔接蛋白进行。不希望受到任何特定理论的限制，这种蛋白质在B细胞受体信号转导中类似地作用于CD81和CD19。
在另一个实验中，测试TOL101以确定它对关键的信号转导成分ERK的磷酸化的作用。刺激从三名健康供体抽取的新鲜血液，在以下条件下活化后分析磷酸化。未刺激的：37℃15分钟；抗-CD3→TOL101：4℃抗-CD315分钟，37℃aIG 15分钟，4℃TOL101 15分钟，37℃aIgM 15分钟；抗-CD3交联：4℃抗-CD315分钟，37℃aIG 15分钟；抗-CD3：37℃抗-CD315分钟；TOL101交联：4℃TOL101 15分钟，37℃aIgM 15分钟；以及TOL101：37℃TOL101 15分钟。以9μg/mL的浓度添加抗体。在刺激之后，固定细胞，透化，用T细胞抗体混合物和抗-pERK/p38(BD Phosflow T cell ActivationKit-Human)染色。在染色的4小时内在BD FACS Canto II上分析细胞。显示了pERK/p38磷酸化的直方图(图11A)和平均荧光强度值(图11B)。如图11中所见，在抗-CD3刺激后24小时暴露于TOL101的经抗-CD3处理的T细胞中，ERK/p38磷酸化升高。pERK/p38的磷酸化的原始数值在图11B中显示。促细胞分裂剂(mitogen)活化的蛋白激酶，包括ERK，协调地调节细胞增殖、分化、运动性和存活。没有共同刺激的TCR刺激(例如以CD28刺激的形式)通常引起T细胞无反应性和凋亡。因而，TOL101诱导的信号转导触发存活途径的发现是令人惊讶的。不希望受到理论的限制，这些数据进一步支持了存在由TOL101与人类αβTCR的结合所诱导的新信号转导途径。
在另一个实验中，测试TOL101以确定它对关键的信号转导成分STAT1的磷酸化的作用。刺激从三名健康供体抽取的新鲜血液，在以下条件下活化后分析磷酸化。未刺激的：37℃15分钟；抗-CD3→TOL101：4℃抗-CD315分钟，37℃aIG 15分钟，4℃TOL101 15分钟，37℃aIgM 15分钟；抗-CD3交联：4℃抗-CD315分钟，37℃aIG 15分钟；抗-CD3：37℃抗-CD315分钟；TOL101交联：4℃TOL101 15分钟，37℃aIgM 15分钟；以及TOL101：37℃TOL101 15分钟。抗体以9μg/mL的浓度添加。在刺激之后，固定细胞，透化，用T细胞抗体混合物和抗-STAT1(BD Phosflow T cell ActivationKit-Human)染色。在染色的4小时内在BD FACS Canto II上分析细胞。显示了STAT1磷酸化的直方图(图12A)和平均荧光强度值(图12B)。如图12所见的，当T细胞暴露于TOL101时STAT1磷酸化提高。由于STAT1结合性细胞因子(例如，II型干扰素)与T细胞增殖和活化相关，在结合TOL101后磷酸化的STAT1的提高是出乎意料的。不希望受到理论的限制，数据表明对STAT1的作用超出早先描述的STAT1在T细胞活化中的作用。STAT1的磷酸化的原始数值在图12B中显示。
在另一个实验中，测试TOL101以确定它对关键的信号转导成分STAT3的磷酸化的作用。刺激从三名健康供体抽取的新鲜血液，在以下条件下活化后分析磷酸化。未刺激的：37℃15分钟；抗-CD3→TOL101：4℃抗-CD315分钟，37℃aIG 15分钟，4℃TOL101 15分钟，37℃aIgM 15分钟；抗-CD3交联：4℃抗-CD315分钟，37℃aIG 15分钟；抗-CD3：37℃抗-CD315分钟；TOL101交联：4℃TOL101 15分钟，37℃aIgM 15分钟；以及TOL101：37℃TOL101 15分钟。以9μg/mL的浓度添加抗体。在刺激之后，固定细胞，透化，用T细胞抗体混合物和抗-STAT3(BD Phosflow T cell ActivationKit-Human)染色。在染色的4小时内在BD FACS Canto II上分析细胞。显示了STAT3磷酸化的直方图(图13A)和平均荧光强度值(图13B)。如图13中所见，在抗-CD3和TOL101处理的细胞中，STAT3磷酸化可比较地提高。STAT3的磷酸化的原始数值在图13B中显示。
在另一个实验中，测试TOL101以确定它对关键的信号转导成分STAT5的磷酸化的作用。刺激从三名健康供体抽取的新鲜血液，在以下条件下活化后分析磷酸化。未刺激的：37℃15分钟；抗-CD3→TOL101：4℃抗-CD315分钟，37℃aIG 15分钟，4℃TOL101 15分钟，37℃aIgM 15分钟；抗-CD3交联：4℃抗-CD315分钟，37℃aIG 15分钟；抗-CD3：37℃抗-CD315分钟；TOL101交联：4℃TOL101 15分钟，37℃aIgM 15分钟；以及TOL101：37℃TOL101 15分钟。以9μg/mL的浓度添加抗体。在刺激之后，固定细胞，透化，用T细胞抗体混合物和抗-STAT5(BD Phosflow T cell ActivationKit-Human)染色。在染色的4小时内在BD FACS Canto II上分析细胞。显示了STAT5磷酸化的直方图(图14A)和平均荧光强度值(图14B)。如图14所见的，当T细胞暴露于TOL101和/或抗-CD3时，STAT5磷酸化提高。STAT5的磷酸化的原始数值在图14B中显示。
在另一个实验中，测试TOL101以确定它对关键的信号转导成分STAT6的磷酸化的作用。刺激从三名健康供体抽取的新鲜血液，在以下条件下活化后分析磷酸化。未刺激的：37℃15分钟；抗-CD3→TOL101：4℃抗-CD315分钟，37℃aIG 15分钟，4℃TOL101 15分钟，37℃aIgM 15分钟；抗-CD3交联：4℃抗-CD315分钟，37℃aIG 15分钟；抗-CD3：37℃抗-CD315分钟；TOL101交联：4℃TOL101 15分钟，37℃aIgM 15分钟；以及TOL101：37℃TOL101 15分钟。以9μg/mL的浓度添加抗体。在刺激之后，固定细胞，透化，用T细胞抗体混合物和抗-STAT6(BD Phosflow T cell ActivationKit-Human)染色。在染色的4小时内在BD FACS Canto II上分析细胞。显示了STAT6磷酸化的直方图(图15A)和平均荧光强度值(图15B)。如图15中所见，在抗-CD3处理的T细胞中当它们随后暴露于TOL101时STAT6磷酸化降低。STAT6的磷酸化的原始数值在图15B中显示。
实施例4.肾脏移植患者中TOL101递增(escalation)试验
在施用给首次肾脏移植接受者的TOL101的第二项研究中，测量了安全性和给药的标准度量。第二项研究有修改的适应性设计，包括初始的剂量递增部分，随后是随机化的主动控制部分(active control component)。研究的第一部分(部分A)计划在连续更高的剂量水平的4-14个组间(每组2-6名受试者)登记，目标是鉴定两种潜在的治疗剂量水平(PTD-A和PTD-B)。部分B(如果需要的话)设计为在更大数量的肾脏移植受试者中评估TOL101，其使用随机化的、平行分支的设计进行，用胸腺细胞球蛋白(thymoglobulin)作为护理比较物的标准品，在目标群体肾脏移植患者中获取安全性和某些效力数据。选择胸腺细胞球蛋白作为活性比较物，因为它是美国用于急性肾脏同种异体移植物排斥的最常用的诱导试剂，在参与这项研究的许多中心是护理标准。TOL101给药限定于波谷(trough)他克莫司水平。试验概述在图16中提供。
表9.在用TOL101给药后的安全性和副作用TOL101剂量
评估了0.28、1.4、7、14、28、32和42mg每天持续5-8天TOL101的测试，以及从14mg或21mg开始到28和42mg每天的递增策略。第一组在图17中概述。从安全性角度看，TOL101是良好耐受的。迄今为止报告的输注反应是轻度且容易管理的(表9)。重要地，在T细胞调节表现为处于或接近治疗水平的剂量水平尚未报告急性排斥反应。血液学参数也支持了TOL101的强安全性分布(表9)。在这些患者中TOL101的药效学作用的检查显示了强CD3调节，其随TOL101剂量提高(图18)。在28mg组中实现了<50个T细胞/mm3的药效学目标。不同于阿伦单抗和胸腺细胞球蛋白，用TOL101治疗的患者显示了记忆T细胞和未处理T细胞的调节，相对于当前使用的试剂，其可以提高TOL101的效力。此外，不同于其他TCR靶向药物，TOL101不降低总体白细胞计数(表明TOL101通过非消减机制起作用)，它也的确不影响血小板水平(胸腺细胞球蛋白的一种常见副作用)。除了较宽的T细胞灭活之外，28mg组数据显示了，TOL101降低CD3表达而不消减T细胞，通过CD3-CD2+T细胞的存在所测定。(图19)。虽然TOL101可能是非消减性的，强烈地，它能够抑制混合淋巴细胞反应中的同种反应性应答。这种作用机制产生体外的抗异型抗原应答的较强阻止(参见图20)。TOL101的输注不触发任何显著的细胞因子释放综合征症状，或TNF-α或IL-6的强生成，进一步支持了上文表9所列的临床安全性分布。TNF-α和IL-6的水平(图21中显示)以及IL-1β、IFNγ和IL-2(未显示)在输注后的多个时间点测定。在TOL101治疗的受试者中检测了这些细胞因子的最小量。TNF-α和IL-6在极低水平测出，特别是在与历史的rATG数据比较时。尚未报告细胞因子释放综合征。此外，在用TOL101输注时，抗炎性细胞因子IL-10提高。
在此呈现的数据支持了TOL101的安全性和效力。与上文呈现的体外数据一起，研究结果显示了TOL101抑制T细胞的活化，包括炎性细胞因子的增殖和产生，而不诱导T细胞消减。此外，重要的元素，例如TOL101调节αβTCR+T细胞的全部子集(包括具有记忆表型的那些子集)的能力，以及其非消减性作用机制可以组合以提供更好的抗排斥治疗，以及降低移植后淋巴增殖性病症(PTLD，一种恶性肿瘤形式)的风险。总之，用TOL101治疗受试者产生了治疗效力，根据降低到低于25mm3的CD3+细胞计数测定的，CD2+T细胞在没有αβTCR/CD3的情况下出现，因而引起αβ–TCR+T细胞的灭活而不消减这些细胞。缺少TCR等同于无功能的T细胞。
如图22-24中所示，TOL101的剂量递增显示了提高的生物利用率(伴随AUC的提高)，延长血清半衰期，在治疗的受试者中没有明显的抗小鼠抗体反应。已经发生具有有前景的安全性分布的TOL101剂量递增。TOL101诱导了剂量依赖性T细胞调节，而不诱导重要的细胞因子释放或其他严重有害事件(serious adverse events,SAE)。免疫监视显示了特异性靶向和作用机制是功能性灭活而非消减的。数据支持了相比当前使用的诱导试剂，TOL101提供提高的特异性和长期安全指数的潜能。
在使用图17中显示的给药日程施用TOL101后，使用Beckman CoulterFlow-Count Flourospheres操作，使用流式细胞术来测定来自全血的T细胞计数。对Ficoll分离的样品进行T细胞表型分析。在当前的研究中，如图25-27所示，在本实施例中提供了CD3、CD4、CD8、CD45RA和CD45RO的表达分布。所有操作在中心实验室进行。除了这些蛋白之外，还测量了以下参数：CD3计数和免疫表型测定(immunophenotyping)，细胞因子生成(IL-2、IL-10、IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ)分析，HAMA分析和标准血液学分析。
如图25所示，在TOL101治疗后进行流式细胞术分析，并在图25A-25C中显示。选择CD3计数的门选策略，显示了珠标准品(25A)、淋巴细胞门选(25B)和CD2对CD3门选(25C)。注意CD3计数由实线方框给出。TOL101显示了以剂量依赖性方式降低CD3计数。在此呈现的数据支持了细胞表面的TCR复合物去除，而不消减细胞，如图26所示。类似于图19中显示的CD2+数据，虽然表达CD3的细胞的百分比在用TOL101处理后显著降低了，CD4+和CD8+细胞的数目保持在正常水平，如图26所示。.在图27中示意性地呈现了在施用TOL101后CD3消减的机制。
实施例5.TOL101递增研究
设计临床实验来测试增加给药方案的效力。递增给药可以用于阻止或改善潜在的副作用，如用TCR下调剂例如TOL101抗体给药的患者中的皮疹。例如，皮疹可能是αβTCR刺激及随后释放预先形成的贮备物(例如粒酶或穿孔素(perforin)，等等)的结果。虽然不必了解本发明，认为基本原理包括使用低剂量的TOL101抗体来在低于将触发任何临床明显症状的阈值的水平触发T细胞释放预先形成的贮备物，接着在预先形成的贮备物被耗尽之后，使用更高剂量的TOL101抗体完成TCR下调，从而阻止临床症状如皮疹。为了测试这种假说，使用以下给药策略施用TOL101抗体：
表10.给药策略
天 剂量
0 14mg
1 21mg
2 28mg
3 42mg
4 42mg
5 42mg
起初，将2名患者登记到这种给药策略中。两名患者都展现了极好的T细胞调节，然而，给药的患者都没有发生任何形式的皮疹或其他可能的严重有害事件。这些数据共同显示了一种新的方式来给药生物产品，以图降低皮疹发生和其他严重有害事件。此外，表10中显示的给药策略在患有一大批疾病，包括但不限于自身免疫性疾病、炎性疾病或移植组织排斥(例如，肾移植排异反应)的患者中施用生物制剂或抗体(包括抗-αβTCR抗体如TOL101)可以是有用的。
实施例6.在递增TOL101给药后Treg细胞的诱导和/或上调
在组织移植和施用TOL101之后测定临床血液学结局的实验中，以恒定给药服用法(即，在给药服用法的每一天对患者施用相同剂量的TOL101mAb，例如，0.28mg/天、1.4mg/天、7mg/天、14mg/天、28mg/天或32mg/天)，或包括第1天14mg、第2天21mg、第3天28mg、第4天42mg、第5天42mg和第6天42mg的递增给药服用法，患者用TOL101给药。分析T细胞、生命体征和其他生化参数。除了TOL101抗体之外，还施用的背景治疗，其包括：
1.静脉内的甲泼尼龙(Methylprednisolone)，TOL101剂量1之前500mg，剂量2和3之前125-250mg。
2.口服泼尼松(Prednisone)，剂量4之前100mg，之后到第14天，类固醇渐小至20-30mg
3.在前2个剂量之前静脉内的苯海拉明(Benadryl)(50mg)
4.不早于移植后6小时以及不迟于移植后6天开始的他克莫司每日剂量
5.在移植当天或之后一天开始的霉酚酸酯的每日剂量
在将受试者麻醉之后且松开(同种异体移植物的重灌注)之前，在手术室中开始给与第一剂TOL101。
在这项研究中，药效目标是T细胞计数低于25个细胞/mm3。这个药效目标被认为足以提供需要的T细胞调节来防止移植物排斥。从基线开始，递增给药服用法显著降低了CD3计数(表11)。
表11.例示性患者T细胞计数(ID 07-006和07-007)
在移植后每一天直到第14天，对来自每个患者的Treg T细胞(CD2+CD4+CD25+FOXP3+CD127lo)进行测量。结果在图28中显示。令人惊讶地，Treg在接受递增给药服用法的患者中被诱导，但是在治疗的每一天接受相同剂量的患者中，甚至在接受高达32mg/天的剂量的那些患者中没有被诱导。
在适应性免疫应答期间，一般地，抗原递呈细胞(APC)上的MHC/肽复合物与T效应细胞的T细胞受体(TCR)之间的相互作用和通信引起促炎性细胞因子，如IL-4和IFN-γ的活化和分泌。另一方面，天然T调节T细胞(Treg T细胞)的活化引起免疫抑制性细胞因子IL-10和TGF-β等的表达。这些细胞因子直接作用于附近的T效应细胞，在某些情况下引起无反应性或凋亡。在其它情况下，调节性细胞因子和趋化因子将T效应细胞转变为T调节性表型；这种过程在此被称为“诱导性”或“适应性”耐受性。能够结合MHC分子以及衔接并活化循环Treg T细胞的T细胞表位被称为Treg表位。如在此使用的，用于处理和用于上调Treg T细胞的细胞数目的各种方法，一般是指功能性Treg T细胞，例如，表达表面标志物CD2+CD4+CD25+FOXP3+和CD127lo的那些Treg T细胞。
初始的自身/非自身分辨在新生儿发育期间在胸腺中发生，其中髓质上皮细胞表达对于未成熟的T细胞而言特异性的自身蛋白质表位。以高亲和力识别自体抗原的T细胞被删除，但是具有中度亲和力的自体反应性T细胞有时避免删除，可能被转化为所谓的天然Treg-T细胞。这些天然Treg T细胞被输出到外周，提供了自身免疫的持续抑制。天然Treg T细胞是免疫调节和自身耐受性的关键成分。
自身耐受性由T细胞、B细胞、细胞因子和表面受体之间复杂的相互作用来调节。T调节性免疫应答抵消对蛋白质抗原(无论是自身的还是外源的)的T效应器免疫应答。通过提高自体反应性T效应细胞的数量或功能，或通过降低Treg T细胞的数量或功能，平衡向自体反应侧倾斜，表现为自身免疫。
耐受性的第二种形式在外周中发生，在那里在存在通常由旁观者Treg T细胞供应的IL-10和TGF-β的情况下通过它们的T细胞受体活化后，成熟的T细胞被转变为“适应性”Treg T细胞表型。这些“适应性”Treg T细胞的可能的作用包括在成功清除侵入性病原体之后阻抑免疫应答，作为控制可能由变应性反应或低水平慢性感染引起的过度炎症的手段，或可能促成与有益共生细菌和病毒的共存。“适应性”Treg T细胞还可在管理经历过体细胞超突变的人类抗体的生命周期方面起作用。
Treg T细胞也有助于B细胞耐受性。B细胞在它们的细胞表面上表达单一低亲和力Fc受体FcyRIIB。这种受体在其胞质域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序序列(ITIM)。FCyRIIB和BCR通过免疫复合物共连接作用为触发ITIM的酪氨酸磷酸化，引起肌醇磷酸酶SHIP的募集，其通过干扰MAP激酶的活化抑制BCR触发的增殖并通过从细胞膜解离Burton酪氨酸激酶(Btk)阻断吞噬作用，这抑制钙流入细胞。FcyRIIB也可以不依赖于ITIM诱导凋亡。在FcRIIB通过IC同型聚集后，Btk与细胞膜的结合得到增强，这触发凋亡应答。FcyRIIB的表达是高度可变且细胞因子依赖性的。已经显示了由活化的Th2和Treg T细胞表达的IL-4和IL-10协同地起作用来增强FcyRIIB表达，因而帮助对体液应答的抑制。
在患者中利用特定的递增剂量服用法，在施用抗-αβTCR抗体TOL101的患者中，本发明提供了Treg T细胞的出乎意料且令人惊讶的治疗性上调。不希望受到任何特定理论的限制，相信的是，在经历或将经历某种同种或自体反应性应答的患者中使用低剂量的TOL101抗体将引发新的信号转导级联事件(涉及ZAP70下调，AKT和ERK调节，以及潜在的钙流量)以及低水平的IL2的产生。这种看法得到了在患有由丙型肝炎病毒诱导的血管炎的患者中的研究的支持，所述患者具有降低的Treg T细胞水平(Saadoun,D.et al.N.Engl.J.Med,365(22)2067-2077)。如在Saadoun等中所示的，低水平IL2刺激Treg T细胞诱导。在几天内，Treg基因是功能性的，伴有原位的Treg表型。不希望受到理论的限制，相信的是，随着TOL101mAb剂量提高，如在当前公开内容中例举的，不仅有IL2的局部提高，而且一组独特的转录因子被启动，这支持了体内的Treg T细胞的扩增。值得注意的是，响应于施用TOL101mAb产生的IL2的水平低于通常认为经典的T细胞活化和增殖所需的水平。因而，虽然产生了IL2并支持Treg T细胞扩增，IL-2的水平低于诱导细胞因子释放综合征所需的水平。在这点上可能的是，利用特异性Treg细胞来抑制不需要的免疫应答，以及诱导适应性Treg T细胞来抑制同种反应性和自体抗原攻击的自身免疫性应答。在图29和30中显示了示意图。这项发现暗示了设计治疗服用法和抗原特异性疗法，用于移植、蛋白质治疗剂、变态反应、慢性感染、自身免疫和疫苗设计。以在此描述的具体递增给药服用法施用TOL101mAb可以用于增强和提高Treg T细胞的细胞数目，其继而可以用于抑制效应器免疫应答。在某些实施方式中，在自身免疫性疾病的症状发作之前、之时或之后，或在组织移植之前、之时或之后向患者施用TOL101mAb。在某些实施方式中，在移植之时，即，在同一天，在移植操作中开始TOL101mAb的施用，因此给药日程的第1天是移植当天。在其他实施方式中，TOL101可以施用给早先接受组织移植的受试者。在某些实施方式中，递增给药服用法包括第1天14mg、第2天21mg、第3天28mg、第4天42mg和第5天42mg向受试者施用TOL101。在其他实施方式中，递增给药服用法包括第1天14mg、第2天21mg、第3天28mg、第4天42mg、第5天42mg和第6天42mg向受试者施用TOL101。在某些实施方式中，在5或6天时段里在此描述的TOL101的递增给药仅进行一次，因为相信的是，TOL101mAb的一次递增给药是诱导给药的例子。
利用在此描述的递增给药服用法施用抗-αβTCR抗体TOL101在Treg T细胞的选择性接合和活化中是有用的。在此展现的是，在全身性的和有限的疾病特异性环境中，某些预先存在的Treg T细胞群体可以被接合、活化和应用于不需要的免疫应答的抑制。利用在此描述的递增服用法，可以受益于症状前给药、同时给药或症状后给药的具体疾病可以包括但不限于：哮喘、变态反应、变应性气道炎症、变应性脑脊髓炎、自身免疫性关节炎、类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、反应性关节炎、银屑病关节炎、骶髂关节炎、孤立性急性前葡萄膜炎、未分化脊椎关节病、1型糖尿病、多发性硬化、系统性红斑狼疮、肾小球肾炎、桥本甲状腺炎、格雷夫斯氏病、硬皮症、免疫失调多内分泌腺病肠病X-连锁综合征(Immune DysregulationPolyendocrinopathy Enteropathy X-linked syndrome,IPEX综合征)、乳糜泻、库姆斯阳性溶血性贫血(Coombs-positive hemolytic anemia)、自体免疫性血小板减少(autoimmune thrombocytopenia)、自体免疫性中性粒细胞减少(autoimmune neutropenia)、克罗恩氏病、炎性肠病、溃疡性结肠炎、强直性脊柱炎、斯耶格伦氏综合征、银屑病、接触性皮炎、古德帕斯彻氏综合征、阿狄森氏病、韦格纳氏肉芽肿病、管状肾病(tubular nephropathy)、原发性胆汁性肝硬化、硬化性胆管炎、自身免疫性肝炎、风湿性多肌痛、白塞氏病、格-巴二氏综合征、各种血管炎、葡萄膜视网膜炎、甲状腺炎、重症肌无力、免疫球蛋白肾病、心肌炎、和进行性系统性硬化病。
在某些实施方式中，在此提供的用于上调Treg T细胞水平的治疗方法为有需要的受试者提供了治疗益处。在某些实施方式中，Treg T细胞的方法和/或上调提供了高于受试者的所述Treg T细胞的基线水平的Treg T细胞上调。基线水平可以在施用治疗性mAb TOL101之前测定。在某些实施方式中，TregT细胞的上调一般是指，对于具体的受试者，提高的局部或系统循环的CD2+CD4+CD25+FOXP3+CD127lo Treg细胞的数目高于TOL101的递增给药之前CD2+CD4+CD25+FOXP3+CD127lo Treg T细胞的基线水平的5％，或高于10％、或高于15％、或高于20％、或高于25％、或高于30％、或高于50％。尽管如此，Treg T细胞的上调在阻断、预防、治疗或抑制与同种反应性T细胞相关的任何一种或多种状况方面，或用于抑制细胞毒性T细胞(CTL)活性，或免疫抑制同种应答，或抑制自身免疫应答，或在组织移植之前、期间或之后抑制、阻止或阻断同种应答或自身免疫应答，或抑制、阻抑阻抑或阻断移植物抗宿主疾病，或预防、治疗或抑制炎性疾病或自身免疫性疾病中的自身免疫应答方面是治疗有效的。在某些实施方式中，受试者例如人类或其他哺乳动物受试者可以在治疗之前评估，来确定它们的一般医学状况，以建立关于自体或同种组织排斥的先前存在的自身免疫性疾病或偏向(predilection)。在这种实施方式中，从受试者抽取血液，进行T细胞和其他白细胞计数。这些还可以包括治疗前Treg T细胞的浓度，以及与同种反应或组织排斥以及要进行的预后和医学处理相关的自身免疫性疾病的其他标志物。在某些实施方式中，在开始给药日程之前测定受试者中存在的每毫升全血的Treg T细胞浓度，来获得受试者中每毫升全血的CD2+CD4+CD25+FOXP3+CD127lo Treg T细胞基线水平。在完成TOL101mAB的递增给药期间和之时，可以进行常规抽血来测定受试者中每毫升全血的CD2+CD4+CD25+FOXP3+CD127lo Treg T细胞的数量，以确认Treg T细胞的增量调节，使用标准的免疫学技术，例如，利用1、2或3种颜色的免疫荧光染色的流式细胞术，所述染色特异于表型上表达CD2+CD4+CD25+FOXP3+CD127lo细胞表面标志物的Treg T细胞的细胞表面标志物。
实施例7.TOL101安全性和效力
肾脏移植患者中的TOL101临床研究如上文实施例6描述的进行。
安全性参数。监视了多个安全性参数，包括一般的临床安全性测量，包括异常的生命体征、身体体征和症状，以及血清化学或血液学。事件使用良好临床实践指南(Good Clinical Practice guidelines)根据器官系统分类为有害事件(AE)或严重有害事件(SAE)。有害事件编码使用Medra词典进行。遭遇同一事件超过一次的受试者被记录为遭遇一个事件。在系统器官分类中有超过一个有害事件的受试者在该系统器官分类中仅计数一次。监视了包括可表明细胞因子释放综合征的症状的免疫安全性参数。此外，TNF、干扰素-γ、白细胞介素6(IL6)、白细胞介素1B(IL1)和白细胞介素2(IL2)的血清水平在第一剂之后0、2、8和24小时测定。使用luminex技术测量细胞因子。还在第一剂之后0、2、8和24小时以及在第4天使用比色分析测定了一氧化氮水平。利用夹心式ELISA，在基线、第14天和第28天测定人类抗小鼠抗体。TOL101用作一抗。
采集了包括淋巴增殖性病症的恶性肿瘤的发生率。此外，使用PCR检测进行了CMV(第28、90和180天)、BKV(第90和180天)和EBV(第28、90和180天)的病毒血症。还采集了其他严重或机会致病性感染的发生率。
效力参数。通过TOL101对CD3+T淋巴细胞计数的药效作用测定了临床效力。成功的T细胞调节被认为在具有低于25个CD3+计数每mm3的维持CD3+T细胞数量的患者中存在，尽管对于连续的给药间隔时间，CD3计数从基线降低90％被认为是足够的。此外，测定了在6个月时包括患者存活、移植物存活和活检证明的急性排斥反应(BPAR)的传统三重终点。延迟的移植物功能定义为在移植后第一周内需要透析。通过在每次研究就诊时估计的肾小球滤过率(GFR)(MDRD方法)，以及在180天时通过碘酞酸盐清除测定的测得GFR，测定了肾脏功能。尿液蛋白质与肌酸酐比例，以及供体特异性抗体(DSA)在第90天和第180天测量。
维持免疫抑制。由口服或IV霉酚酸酯(MMF；每天两次最小750mg)组成的维持免疫抑制在移植当天启动。根据受试者的状况，在研究第1天和研究第6天之间启动他克莫司。他克莫司的起始剂量是0.1-0.2mg/kg。随后的他克莫司剂量进行个体化以维持全血C0水平在8-15ng/mL的范围内持续移植后第一个月。在TOL101施用期间每天，第一个月每周，以及在第90和180天，进行最小值他克莫司C0水平测量。
皮质类固醇的初始剂量是移植时500mg，第2天250mg，第3天125mg，第4天起0.5mg/kg，到第1个月渐减至5–10mg/天，第45天直到第6个月≥5mg/天。
抗感染预防。建议在CMV+接受者中以及在来自CMV+供体的肾脏的接受者中口服缬更昔洛韦(valganciclovir)需要口服甲氧苄啶(trimethoprim)/磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole)(TMP/SMX；Septra)6个月，用于预防卡氏肺囊虫性肺炎(Pneumocystis cariniipneumonia,PCP)。
TOL101的施用。在14mg冻干小瓶(Tolera Therapeutics,Inc Kalamazoo,Michigan,USA)中提供TOL101。在第0天在手术室中开始，受试者通过中央的静脉导管接受至少六次TOL101的每日剂量。设计这项研究以测试TOL101的递增剂量，利用CD3 T细胞计数作为效力的原始标志，如表12中列出的。由于TCR靶向性抗体的潜在免疫刺激能力，使用的起始TOL101剂量是计算的最小有害生物学效果水平(Minimum Adverse Biological EffectLevel，MABEL)(其是0.28mg)的1/10。进一步的安全性考虑包括患者之间24小时保持，以及定期数据安全性监测委员会对患者数据的审阅。使用Beckman Coulter CD3流式细胞计试剂盒在中心站(Neogenomics；OrangeCounty,CA)测量CD3计数。如果在整个给药期间CD3计数<25个T细胞每mm3，剂量被认为是有效的。如果他克莫司C0水平是治疗性的(8-15ng/mL)，在最少6剂之后停止TOL101给药。
药物动力学。在施用剂量#1(第0天)、Dose#4、最后一剂之后的几个时间点每天和在第14天测量TOL101的血清浓度。利用针对小鼠IgM的夹心式ELISA(ABS laboratories,Colombia MI)。通过将分区模型(compartmentalmodel)拟合到合并数据集，对TOL101开发群体药物动力学模型，所述合并的数据集包括来自所有观察结果的数据和来自所有受试者的剂量。建模将考虑剂量之内或之间的剂量或输注速率的任何改变。根据适当的清除数量(CL)和分布容积(V)将模型参数化；从拟合的参数估计清除半衰期(t1/2)。群体建模使用NONMEM版本7.0或更高版本进行。基于目标函数和/或拟合质量图形学的改进，将协变量(年龄、体格大小、性别、种族，等等)合并到模型中。使用R版本2.10或更高版本准备观察到的和模型预测的血清浓度的图形学。
统计学。每个组的受试者数量不是基于统计学的考虑，而是意图提供足以递增到下一剂量水平的安全性和PD数据。对所有感染、AE、达到最大严重度的所有AE、药物相关的AE、SAE和引起研究药物中断的AE呈现了频率表。对于定量的实验室测试，在每个时间点呈现了概括统计量。将呈现频率表，其概述了展现细胞因子释放综合征的受试者的计数。测量的和估计的GFR两者将用描述性统计学来概述。延迟的移植物功能和BPAR的事件(episode)将在频率表中概括。对于尿蛋白与肌酸酐比例和DSA评估，对在第90天和第180天/EOS获得的值呈现概括统计学。使用Kaplan-Meier乘积限(product limit)操作分析患者和移植物存活，时序检验(log-rank test)来比较存活曲线。
结果
患者特征。患者登记开始于2010年2月，结束于2012年4月，在美国的6个中心登记。总共28名患者登记到这项2a期研究中，登记到递增TOL101剂量的组的受试者在表12中显示。登记呈现了较宽的患者截面(表13)。平均供体年龄是40岁龄；24名受试者接受来自活供体的肾脏，4名受试者接受来自尸体供体的肾脏。平均接受者年龄是44岁，79％的这些患者是男性。受试者是初次肾脏移植接受者，具有低到中度的排斥风险。重要的是，登记的患者的风险分布随剂量提高。前4个组中的患者一般具有更低的免疫学风险。最后的剂量递增组包括4名死亡供体移植者，和3名非洲裔美国人接受者。末期肾病(ERSD)的最常见的原因是多囊肾疾病(33％)和肾小球性肾炎(33％)。
表12.TOL101给药组
表13.患者人口资料和基线特征
接受者 供体
初次/再次移植 28/0 NA
移植时的年龄，平均值(岁) 44.4 40
性别，n(％)
男性 22(79) 13(46)
女性 6(21) 15(54)
种族，n(％)
白人 21(75) 21(75)
黑人 5(18) 5(18)
亚洲人 1(3.5) 0
其他 1(3.5) 2(7)
肾衰竭的原因，n(％)
高血压性肾硬化 4(14) N/A
多囊肾疾病 7(25)
糖尿病 4(14) N/A
IgA肾病 5(18) N/A
局灶性节段性肾小球肾炎 3(11) N/A
其他 5(18) N/A
供体类型，n(％)
存活，有亲缘关系 NA 13(46)
存活，无亲缘关系 NA 11(39)
死亡 NA 4(15)
HLA错配，n(％)
0 0(0) N/A
1 2(7) N/A
2 1(4) N/A
3 9(32) N/A
4 3(11) N/A
>5 13(46) N/A
基线时的组反应性抗体
平均值(％) 4％ N/A
≥20,n(％) 1(25％) N/A
供体特异性抗体
第3个月 0/28(0) N/A
第6个月 0/28(0) N/A
冷缺血(Cold ischemia)时间
平均值(小时) 3±5 N/A
延迟的移植物功能
死亡的供体，n(％) 0 N/A
活的供体，n(％) 0 N/A
移植前CMV抗体状态，n(％)
阳性 9(33) 12(48)
阴性 19(67) 13(52)
移植前CMV抗体匹配n(％)
供体+/接受者- 2(7) N/A
供体+/接受者+ 7(25) N/A
供体-/接受者- 13(46) N/A
供体-/接受者+ 6(21) N/A
严重有害事件。在11名受试者中报告了35起严重有害事件(SAE)(表14)。没有观察到死亡。除了1起SAE外全部被认为与研究药物“无关”。可能相关的SAE是医源性肺炎。其他SAE与手术和其他非TOL101相关问题有关。
表14.严重有害事件(SAE)
有害事件(AE)。在28名受试者中报告了总共521起AE，包括在18名受试者中被报告为“可能”、“很可能”或“明确”与TOL101相关的29起AE。在≥15％的患者中发生的AE在表15中显示。大部分AE在28、32和42mg剂量组中报告。三名受试者由于AE(荨麻疹性皮疹(urticarial rash)和瘙痒(puritis))中止了药物；他们每一个都在42mg剂量组中。最常报告的相关的AE是皮疹，如表15中所示。观察到的皮疹不定地被描述为荨麻疹性、红、隆起、荨麻疹和/或鞭痕样。皮疹决不确定为坏死性或持久性，并且其从未进展到更严重的表现。
表15.通常发生的有害事件
在经历了皮疹的大多数但非全部患者中，皮疹在第一剂TOL101之后发生(表16)。在所有情况中，皮疹自动或用苯海拉明治疗后小时，一般在数小时内消失。除了42mg组外，皮疹在任何剂量水平下不复发。当它确实复发时，通常，其是不太强烈的，不妨碍继续TOL101给药。不希望受理论的限制，观察到的皮疹的一个可能的原因被认为是从T细胞释放具有血管舒张潜能的预先形成的非经典可溶性介质。由于这些被认为是预先形成的，采用剂量递增策略，目标是耗尽这些T细胞储备物并降低皮疹发生率。如表16中显示，剂量递增方案的使用容许以降低的皮疹发生率的42mg给药。总体上，研究的结果表明，TOL101可以安全施用。特别地，递增给药策略与最小的副作用相关。
表16.皮疹的发生率。浅灰色方形表示在给药后没有观察到皮疹；黑色方形表明在给药后观察到皮疹；空心方形表明在标出的日期没有施用剂量。
感染和恶性肿瘤。在接受TOL101的受试者中迄今为止没有报告恶性肿瘤。表17列出了研究中观察到的所有感染。唯一一个重要的感染被认为是与TOL101潜在地相关(医源性肺炎)，如上文描述的。然而，没有从这名患者采集培养物，因而不能鉴定确定性诊断和病原体。皮肤相关的感染主要是切口伤口细菌性感染，报告一例毛囊炎。检测到三例BK病毒病毒血症，其中两起在遭遇急性排斥事件的患者中在胸腺细胞球蛋白拯救之后不久出现。没有观察到其他重要的感染，例如CMV、EBV或机会致病性卡氏肺囊虫性肺炎。
表17.感染和恶性肿瘤
感染 患者,n(％)
细菌性
UTI 1(3.5)
皮肤 5(17.9)
肺炎 1(3.5)
败血症 1(3.5)
病毒性
CMV 0(0)
BK 3(10.7)
EBV 0(0)
真菌性
念珠菌(candida) 0(0)
其他 0(0)
机会致病性
PCP 0(0)
癌症
PTLD 0(0)
实体器官 0(0)
免疫学安全性参数。如在AE表中注明的，通常没有观察到与细胞因子释放综合征相关的症状。症状的缺乏得到低水平TNF、IFN-γ、IL6、IL1β和IL2的支持(图31A-E)，它们未被检出，或相对于给予rATG的患者中描述的那些以低水平检出。此外，另一种潜在炎性的标志物(作为输注反应的指示)包括一氧化氮(NO)的产生。在任何经TOL101治疗的患者中没有检出NO。由于TOL101是鼠抗体，HAMA的检测是研究的重要部分。在移植后0、14和28天评估样品的HAMA发生。在除了一名患者的所有患者中，没有检测到HAMA(图31F)。具有阳性HAMA样品的一名患者的滴度是1/100。HAMA的低发生率是令人惊讶的结果，因为其他抗TCR抗体或CD3抗体，包括T10B9、OKT3和BMA-031，在大于30％的患者中诱导HAMA，某些研究报道了80％的HAMA发生率(Waid et al.Transplantation 64；274-281[1997])。不希望受到理论的限制，相信的是，HAMA的低发生率是抗体的新的作用机制和/或抗体的翻译后修饰(如糖基化)的反映。
药效性CD3调节。在给药期间每天测量外周血CD3 T细胞计数。TOL1O1的给药每天施用一次持续至少5天(6剂)，或直到达到治疗性他克莫司水平(8-15ng/ml)。在6名患者中，需要超过6剂的TOL101；然而这些人都没有在组中，从而TOL101满足了CD3抑制目标。在所有患者中，白细胞计数(包括CD3表达细胞)的初始降低在移植之后直接观察到。这通常在接受静脉内类固醇输注的患者中观察到。在接受0.28、1.4、7和14mg TOL101的患者中，在48-72小时内，循环CD3计数提高到高于25个/mm3的目标(图32)。在28mg组中，CD3计数保持低于25个/mm3，除了在第3天经历了CD3数量峰值的一名患者外。虽然28mg看起来是有前景的给药服用法，一个潜在的异常值(outlier)触发了TOL101向32mg和42mg的递增。根据这两种给药服用法，实现了强力强力的CD3抑制；然而，在32mg和42mg组中分别在50％和100％的患者中观察到皮疹。不希望受到理论的限制，确定的是皮疹可能是预先形成的T细胞可溶介质释放的结果。因而，实施剂量递增策略，其聚焦于在亚症状水平耗尽这些储备物。在这种给药服用法中，给药在14mg启动，到第四剂快速提高到42mg。这种给药服用法不仅降低了皮疹发生的倾向，而且还产生了强力强力的CD3抑制，满足了药效学目标。
观察到在TOL101给药之后CD3表达的恢复，到第14天在所有患者中出现(图32)。这种恢复指向非消减性作用机制，其也得到了在给药期间没有白细胞计数降低的观察结果的支持。
药物动力学。类似于OKT3和其他抗-TCR疗法，TOL101的清除被认为是主要通过与其目标蛋白质的结合介导。药物动力学的检查显示，在实现强力强力的CD3抑制的那些组中(即，28、32、42mg和剂量递增组；32)，TOL101的半衰期范围为23到29小时(表18)。TOL101的峰值浓度在给药后3天达到，潜在地表明在这个时间点的靶点饱和。
表18.药物动力学概述
药物动力学概述
效力组合三重终点。在研究中没有报告患者或移植物损失(图33A)。三名受试者经历了描述为可能与研究药物相关的活检证实的急性排斥事件。所有排斥事件用类固醇或胸腺细胞球蛋白治疗，在临床上在没有移植物损失的情况下解决。在登记入这项研究的任何患者中尚未检测到供体特异性抗体。
肾脏功能。在研究中没有观察到延迟的移植物功能。在整个研究中肾脏功能改善，在所有患者中观察到估计的GFR的升高(图33B)。此外，在移植后180天利用碘酞酸盐清除计算的GFR显示了所有患者间极好的肌酐清除率，包括遭遇急性排斥事件的那些患者。
实施例8.TOL101特异性
来自6个独立供体的外周血单核细胞(PBMC)用于测定TOL101结合的精确的T细胞子集。TOL101仅仅标记CD3+T细胞，结合CD4+和CD8+T细胞(图34)。重要地，TOL101不结合γδT细胞、表达CD14的细胞(单核细胞谱系/NK细胞)，或B细胞(图34)。因而，TOL101特异于αβT细胞。此外，与TOL101预孵育阻断了另一种αβTCR抗体IP26的结合，进一步证明TOL101对αβT细胞的特异性。特异于TCR的α链的抗体抑制TOL101结合，而β链抗体展现了小得多的对TOL101结合的抑制作用。因而，TOL101表现为优先结合TCR的α链。
实施例9TOL101信号转导和体外Treg诱导
使用1向混合淋巴细胞反应(MLR)进一步检查TOL101介导的T细胞抑制作用。在这个实验中，PBMC分离自三名健康供体的淡黄层。淡黄层在Ficol梯度上分层来富集淋巴细胞。刺激细胞然后用3000拉德照射。刺激细胞和应答细胞以2:1的比例(4e5个刺激细胞比2e5个应答者细胞)共培养7天。细胞的组合如下：单位1+单位2照射(Ab)，单位1+单位3照射(Ac)，单位2+单位1照射(Ba)，单位2+单位3照射(Bc)，单位3+单位1照射(Ca)，单位3+单位2照射(Cb)。在培养时以9ug/mL的浓度添加TOL101。在培养的最后24小时添加布雷菲德菌素A(brefeldin A)。收获细胞，对胞外抗原染色，固定和透化，对胞内细胞因子染色。图35中的图显示了表达IFN-γ的CD4 T细胞的百分比。在获得的临床数据的支持下，在来自许多单独患者的单向MLR中，TOL101抑制来自T细胞的2型干扰素。
如实施例3中描述的，TOL101显示了提高磷酸化的ERK的水平(图11)和降低磷酸化的ZAP70的水平(图10)。T细胞中的ERK磷酸化通常与T细胞共刺激途径相关，包括CD28途径。进行实验来确定TOL101是否可以抑制共刺激诱导的T细胞增殖。PMBC分离自三位健康供体的淡黄层。淡黄层在Ficol梯度上分层来富集淋巴细胞。以2e5个细胞/孔的密度培养淋巴细胞。细胞与TOL101(9μg/mL)、平板结合的CD28(1μg/mL)和平板结合的CD28(1μg/mL)以及TOL101(9μg/mL)培养。向培养物中添加H34天，收获平板，在第5天计数。如图36中所见，TOL101不能抑制CD28介导的增殖。
除了ZAP70和ERK以外，T细胞活化的另一种指征是钙流量。钙的持续增加引起磷酸酶钙依赖磷酸酶(Calcineurin)的活化。钙依赖磷酸酶调节许多转录因子，包括NF-AT。为了检查TOL101是否触发钙释放，PBMC分离自四名健康供体(O、P、Q和R)的淡黄层。在图37中，淡黄层在Ficol梯度上分层来富集淋巴细胞。来自每个供体的5e5个细胞在37℃用抗-CD4染色1小时。洗涤细胞并在Fluo-4直接钙分析试剂溶液(Invitrogen#_F10471)中培养，在37℃孵育30分钟，并在RT孵育30分钟。细胞在LSR上运行600秒。在T＝90秒时，20μL单独的培养基，或各20μL 9μg/mL TOL101和9μg/mL抗-小鼠IgM，或各20μL 9μg/mL CD3和9μg/mL抗-小鼠IgG，或20μL 1μg/mL伊屋诺霉素添加到管中，轻轻地上下吸移，之后继续获取。令人惊讶地，TOL101在仅约15％的CD4 T细胞中诱导钙流量，不同于抗-CD3，其在基本上所有的CD4 T细胞中引起流出钙(图37)。不希望受到理论的限制，相信的是，在TOL101结合后少数流出钙的CD4 T细胞代表了将变为Tregs的T细胞。
除钙流量之外，在TOL101处理的T细胞中检查磷酸化的热激蛋白27(HSP27)、AKT-2和MAPK活化的蛋白激酶(图38)。在这个实验中，PBMC分离自健康供体的淡黄层。淡黄层在Ficol梯度上分层来富集淋巴细胞。细胞在下列一种条件下37℃保持1小时：无处理，抗-CD3(OKT3)9μg/mL+抗-小鼠Ig 10μg/mL，TOL1019μg/mL+抗-小鼠IgM 10μg/mL。在1小时之后，洗涤并裂解细胞。200μg的蛋白/样品使用RD人磷酸-MAPK阵列处理。蛋白质的磷酸化使用链霉抗生物素蛋白-HRP和化学发光检测来检测。在图38中显示了曝光且显现的膜的照片以及利用ImageJ软件的像素强度的量化。如图38中所示，HSP27在处理组之间没有不同。虽然可观察到了P38a的潜在趋势，它不是显著的。最引人注意的是观察到磷酸化的AKT2的水平以显著的数量在TOL101处理的PBMC中存在，但是在抗-CD3或对照PBMC中未检出。这些数据共同进一步突出显示当TOL101结合TCR时由其启动的独特的调节途径。
如上所述，用递增剂量的TOL101治疗的临床患者中Tregs的诱导是出乎意料的(图28)。此外，TOL101诱导的信号转导事件，包括提高的ERK，已经被描述为抑制Treg的扩增。为了进一步探索这些结果，在体外进一步检查了TOL101诱导Tregs的能力。PMBC分离自三位健康供体的淡黄层。淡黄层在Ficol梯度上分层来富集淋巴细胞。双向MLR培养物(代表体内同种异体移植物移植患者)以4e5个细胞/供体按1:1比例设置。细胞与递增浓度的TOL101培养，来反映临床实验给药。将增高浓度的TOL101(9、18、36、72和120μg/mL)、固定浓度的TOL101(9μg/mL)、抗-CD3(1μg/mL)或单独的培养基添加到培养物中。细胞在培养5天后采集，洗涤，封闭，对胞外抗原染色，固定和透化，对胞内Foxp3染色。通过流式细胞术采集细胞，用Flow Jo分析。点线代表3个反应(A+B、A+C、B+C)。具有CD4+CD25+FOXP3+CD127lo表型的Treg早先已经显示了具有体内抑制活性，并门选，如图39所示的。显著地，对用递增剂量的TOL101处理的培养物富集CD4+CD25+FOXP3+CD127lo Treg。抗-CD3处理的培养物具有数字上更多的CD4+CD25+FOXP3+CD127lo，但是还存在显著的CD127hi群体，其被认为是T效应细胞。这些T效应细胞在引起同种异体移植物排斥和自身免疫方面是高度有效的。总之，研究结果表明，出乎意料地，以及与表明在没有信号2(共同刺激)的情况下的信号1(TCR刺激)引起T细胞无反应性和死亡的信条相对比，TOL101提供的独特的信号-1不引起T细胞消减或死亡。不希望受到理论的限制，认为的是，TOL101与αβTCR的结合诱导了蛋白质(包括AKT和ERK)的磷酸化，已知所述蛋白质在T细胞存活中是重要的，以及与钙诱导的信号传导组合的存活信号引起了Treg的诱导。
实施例10 TOL101 ScFV
在这个实验中，表达来自TOL101的修饰的CDR的一系列10种不同的小链可变片段(scFv)在大肠杆菌(E.coli)中表达。10种scFv之一展现了高表达分布(图40)。这种scFv的示意图和氨基酸序列(SEQ ID NO：9)也在图40中显示。scFv在体外结合CD4+和CD8+T细胞二者(图40)，表明可以产生具有T细胞结合能力和高表达水平的TOL101 scFv。
本申请中提及的所有出版物和专利通过引用合并在此。本发明的描述的方法和组合物的各种修改和变体对于本领域的技术人员是显而易见的，而不背离本发明的范围和精神。虽然已经结合具体的优选实施方式描述了本发明，应当理解的是要求权利的发明不应过度局限于这种特定的实施方式。实际上，对于相关领域的技术人员明显的、用于进行本发明的描述的模式的各种修改，预计在所附权利要求书的范围之内。

Claims (49)

1.一种结合αβTCR的分离的抗体或其抗原结合片段；其中所述抗体或其抗原结合片段在与由杂交瘤TOL101MCB产生的抗体相当的氨基酸残基处被糖基化。
2.一种结合T细胞上表达的αβTCR的分离的抗体或其抗原结合片段；其中所述抗体或其抗原结合片段与αβTCR的结合不诱导T细胞中选自由肿瘤坏死因子-alpha(TNF-α)、干扰素-gamma(IFN-γ)、白细胞介素-2和白细胞介素-6组成的组的细胞因子的产生。
3.一种结合T细胞上的αβTCR的分离的抗体或其抗原结合片段；其中所述抗体或其片段与αβTCR的结合降低T细胞上αβTCR和CD3的表面表达，并且不消减T细胞。
4.一种结合T细胞上的αβTCR的分离的抗体或其抗原结合片段；其中所述抗体或其抗原结合片段与αβTCR的结合诱导T细胞中AKT和ERK的磷酸化。
5.一种结合T细胞上的αβTCR的分离的抗体或其抗原结合片段；其中通过流式细胞术的测量，所述抗体或其抗原结合片段与αβTCR的结合在小于20％的αβTCR+T细胞中诱导钙流量。
6.根据权利要求5的分离的抗体或其抗原结合片段，其中钙流量在小于15％的αβTCR+T细胞中被诱导。
7.一种结合T细胞上的αβTCR的分离的抗体或其抗原结合片段；其中所述抗体或抗原结合片段的交联不诱导T细胞的增殖。
8.根据权利要求1到7的任一项的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含由杂交瘤TOL101MCB产生的抗体的轻链CDR1、CDR2和CDR3以及重链CDR1、CDR2和CDR3。
9.根据权利要求1到7的任一项的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段由包含SEQ ID NO：3、4和5的多核苷酸序列编码。
10.根据权利要求1到7的任一项的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段的氨基酸序列包含SEQ ID NO：6、7和8。
11.权利要求1到7的任一项的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段选自由鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体、scFv、Fab片段、Fab’片段和F(ab)’片段组成的组。
12.一种由杂交瘤TOL101MCB产生的分离的抗体，或其抗原结合片段。
13.根据权利要求1到7和12的任一项的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或片段偶联到选自由放射性同位素、酶、荧光标记物、发光标记物、生物发光标记物、生物素或毒素组成的组的可检测标记物。
14.一种治疗炎性疾病、自身免疫性疾病或移植组织排斥的方法，包括向有此需要的人类患者施用治疗有效量的根据权利要求1到7或12中任一项的分离的抗体或其抗原结合片段。
15.根据权利要求14的方法，其中所述炎性疾病、自身免疫性疾病或移植组织排斥选自由下列各项组成的组：哮喘、变态反应、变应性气道炎症、变应性脑脊髓炎、自身免疫性关节炎、类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、反应性关节炎、银屑病关节炎、骶髂关节炎、孤立性急性前葡萄膜炎、未分化脊椎关节病、1型糖尿病、多发性硬化、系统性红斑狼疮、肾小球肾炎、桥本甲状腺炎、格雷夫斯氏病、硬皮症、乳糜泻、克罗恩氏病、炎性肠病、溃疡性结肠炎、强直性脊柱炎、斯耶格伦氏综合征、银屑病、接触性皮炎、古德帕斯彻氏综合征、阿狄森氏病、韦格纳氏肉芽肿病、原发性胆汁性肝硬化、硬化性胆管炎、自身免疫性肝炎、风湿性多肌痛、白塞氏病、格-巴二氏综合征、各种血管炎、葡萄膜视网膜炎、甲状腺炎、重症肌无力、免疫球蛋白肾病、心肌炎、进行性系统性硬化病、器官移植物排斥、混合性结缔组织排斥和移植物抗宿主疾病。
16.根据权利要求14的方法，其中所述自身免疫性疾病是1型糖尿病或多发性硬化。
17.根据权利要求14的方法，其中所述移植组织排斥包括器官移植物排斥或移植物抗宿主疾病。
18.根据权利要求14的方法，其中通过ELISA的测量，所述抗体或其抗原结合片段在少于20％的施用所述抗体或其抗原结合片段的人类患者中诱导HAMA应答。
19.根据权利要求14的方法，其中通过ELISA的测量，所述抗体或其抗原结合片段在少于10％的施用所述抗体或其抗原结合片段的人类患者中诱导HAMA应答。
20.根据权利要求14的方法，其中通过ELISA的测量，所述抗体或其抗原结合片段在少于5％的施用所述抗体或其抗原结合片段的人类患者中诱导HAMA应答。
21.一种抑制炎性疾病、自身免疫性疾病或移植组织排斥中的T细胞免疫应答的方法，所述方法包括向有此需要的人类患者施用治疗有效量的根据权利要求1到7或12的任一项的抗体或其抗原结合片段。
22.根据权利要求21的方法，其中所述炎性疾病、自身免疫性疾病或移植组织排斥选自由下列各项组成的组：哮喘、变态反应、变应性气道炎症、变应性脑脊髓炎、自身免疫性关节炎、类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、反应性关节炎、银屑病关节炎、骶髂关节炎、孤立性急性前葡萄膜炎、未分化脊椎关节病、1型糖尿病、多发性硬化、系统性红斑狼疮、肾小球肾炎、桥本甲状腺炎、格雷夫斯氏病、硬皮症、乳糜泻、克罗恩氏病、炎性肠病、溃疡性结肠炎、强直性脊柱炎、斯耶格伦氏综合征、银屑病、接触性皮炎、古德帕斯彻氏综合征、阿狄森氏病、韦格纳氏肉芽肿病、原发性胆汁性肝硬化、硬化性胆管炎、自身免疫性肝炎、风湿性多肌痛、白塞氏病、格-巴二氏综合征、各种血管炎、葡萄膜视网膜炎、甲状腺炎、重症肌无力、免疫球蛋白肾病、心肌炎、进行性系统性硬化病、器官移植物排斥、混合性结缔组织排斥和移植物抗宿主疾病。
23.根据权利要求21的方法，其中所述自身免疫性疾病是1型糖尿病或多发性硬化。
24.根据权利要求21的方法，其中所述移植组织排斥包括器官移植物排斥或移植物抗宿主疾病。
25.一种生产分离的抗体或其抗原结合片段的方法，包括：
i.用编码包含由杂交瘤TOL101MCB生成的抗体的轻链CDR1、CDR2和CDR3以及重链CDR1、CDR2和CDR3的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸序列转染哺乳动物宿主细胞；
ii.培养所述宿主细胞；以及
iii.分离所述抗体或其抗原结合片段；
其中所述抗体或其抗原结合片段结合T细胞上表达的αβTCR；且其中所述抗体或其抗原结合片段与αβTCR的结合降低T细胞上αβTCR和CD3的表面表达，并且不消减T细胞。
26.权利要求25的方法，其中所述多核苷酸序列包含SEQ ID NO：3和4。
27.权利要求26的方法，其中所述多核苷酸序列进一步包含SEQ IDNO：5。
28.通过权利要求25的方法生产的抗体或其抗原结合片段。
29.根据权利要求27的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是TOL101。
30.一种分离的杂交瘤细胞系，其产生结合αβTCR的抗体或其抗原结合片段，其中所述杂交瘤细胞系是TOL101MCB。
31.一种治疗自身免疫性疾病、炎性疾病或移植组织排斥的方法，所述方法包括：以约7mg/天到约58mg/天的量向有此需要的受试者施用抗-αβTCR抗体或其抗体片段，其中所述抗体是自杂交瘤TOL101MCB产生的。
32.一种治疗自身免疫性疾病、炎性疾病或移植组织排斥的方法，所述方法包括：以约7mg/天到约58mg/天的量向有此需要的受试者施用抗-αβTCR抗体或其抗体片段，其中所述抗体结合αβTCR。
33.根据权利要求32的方法，其中所述抗-αβTCR抗体或其抗体片段以7mg/天、14mg/天、21mg/天、28mg/天、30mg/天、32mg/天、34mg/天、35mg/天、36mg/天、38mg/天、40mg/天、42mg/天、44mg/天、46mg/天、48mg/天、50mg/天、52mg/天、54mg/天、56mg/天或58mg/天，或其组合的量施用。
34.根据权利要求33的方法，其中所述抗-αβTCR抗体或其抗体片段以14mg/天的量施用。
35.根据权利要求33的方法，其中所述抗-αβTCR抗体或其抗体片段以28mg/天的量施用。
36.根据权利要求33的方法，其中所述抗-αβTCR抗体或其抗体片段以32mg/天的量施用。
37.根据权利要求33的方法，其中所述抗-αβTCR抗体或其抗体片段以35mg/天的量施用。
38.根据权利要求33的方法，其中所述抗-αβTCR抗体或其抗体片段以42mg/天的量施用。
39.一种在有此需要的受试者中治疗炎性疾病、自身免疫性疾病或移植组织排斥的方法，所述方法包括：按照包含第1天14mg、第2天21mg、第3天28mg、第4天42mg、第5天42mg和第6天42mg的给药日程施用抗-αβTCR抗体或其抗体片段。
40.一种在有此需要的受试者中治疗炎性疾病、自身免疫性疾病或移植组织排斥的方法，所述方法包括按照包含第1天14mg、第2天21mg、第3天28mg、第4天42mg和第5天42mg的给药日程施用抗-αβTCR抗体或其抗体片段。
41.根据权利要求39或40的方法，其中所述抗-αβTCR抗体或其抗体片段每天施用一次。
42.根据权利要求41的方法，其中所述炎性疾病、自身免疫性疾病或移植组织排斥选自由下列各项组成的组：哮喘、变态反应、变应性气道炎症、变应性脑脊髓炎、自身免疫性关节炎、类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、反应性关节炎、银屑病关节炎、骶髂关节炎、孤立性急性前葡萄膜炎、未分化脊椎关节病、1型糖尿病、多发性硬化、系统性红斑狼疮、肾小球肾炎、桥本甲状腺炎、格雷夫斯氏病、硬皮症、乳糜泻、克罗恩氏病、炎性肠病、溃疡性结肠炎、强直性脊柱炎、斯耶格伦氏综合征、银屑病、接触性皮炎、古德帕斯彻氏综合征、阿狄森氏病、韦格纳氏肉芽肿病、原发性胆汁性肝硬化、硬化性胆管炎、自身免疫性肝炎、风湿性多肌痛、白塞氏病、格-巴二氏综合征、各种血管炎、葡萄膜视网膜炎、甲状腺炎、重症肌无力、免疫球蛋白肾病、心肌炎、进行性系统性硬化病、器官移植物排斥、混合性结缔组织排斥和移植物抗宿主疾病。
43.根据权利要求41的方法，其中所述炎性疾病、自身免疫性疾病或移植组织排斥是1型糖尿病或多发性硬化。
44.根据权利要求41的方法，其中所述移植组织排斥包括器官移植物排斥、混合性结缔组织排斥或移植物抗宿主疾病。
45.一种在有此需要的受试者中上调Treg T细胞的方法，所述方法包括按照包含第1天14mg、第2天21mg、第3天28mg、第4天42mg、第5天42mg和第6天42mg的给药日程施用抗-αβTCR抗体或其抗体片段。
46.一种在有此需要的受试者中诱导Treg T细胞的方法，所述方法包括：按照包含第1天14mg、第2天21mg、第3天28mg、第4天42mg和第5天42mg的给药日程施用抗-αβTCR抗体或其抗体片段。
47.根据权利要求45或46的方法，其中所述Treg T细胞在表型上是CD2+CD4+CD25+FOXP3+CD127lo。
48.根据权利要求47的方法，其中所述受试者需要抑制同种反应性T细胞，或抑制细胞毒性T细胞(CTL)活性，或免疫抑制同种应答，或抑制自身免疫应答，或在组织移植之前、期间或之后抑制、阻止或阻断同种应答或自身免疫应答，或抑制、阻抑或阻断移植物抗宿主疾病，或预防、治疗或抑制炎性疾病、自身免疫性疾病中或在移植组织排斥期间的自身免疫应答。
49.根据权利要求48的方法，其中所述炎性疾病、自身免疫性疾病或移植组织排斥选自由下列各项组成的组：哮喘、变态反应、变应性气道炎症、变应性脑脊髓炎、自身免疫性关节炎、类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、反应性关节炎、银屑病关节炎、骶髂关节炎、孤立性急性前葡萄膜炎、未分化脊椎关节病、1型糖尿病、多发性硬化、系统性红斑狼疮、肾小球肾炎、桥本甲状腺炎、格雷夫斯氏病、硬皮症、乳糜泻、克罗恩氏病、炎性肠病、溃疡性结肠炎、强直性脊柱炎、斯耶格伦氏综合征、银屑病、接触性皮炎、古德帕斯彻氏综合征、阿狄森氏病、韦格纳氏肉芽肿病、原发性胆汁性肝硬化、硬化性胆管炎、自身免疫性肝炎、风湿性多肌痛、白塞氏病、格-巴二氏综合征、各种血管炎、葡萄膜视网膜炎、甲状腺炎、重症肌无力、免疫球蛋白肾病、心肌炎、进行性系统性硬化病、器官移植物排斥、混合性结缔组织排斥和移植物抗宿主疾病。
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