KR102086061B1 - 알파-시누클레인을 인식하는 인간화된 항체 - Google Patents
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Abstract
본 출원에는 인간화된 1H7 항체가 개시된다. 상기 항체는 인간 알파 시누클레인에 결합되며 루이소체 질환의 치료 및 진단에 사용될 수 있다.
Description
관련 출원의 상호 참조
본원은 2012년 1월 27일자로 출원된 미국 가특허출원 제61/591,835호 및 2012년 10월 8일자로 출원된 미국 가특허출원 제61/711,207호에 대한 우선권을 주장하며, 사실상 이들의 전문이 참고 인용된다.
루이소체 질환(LBD: Lewy body disease)을 포함하는 시누클레인병증은 도파민작용성 시스템의 퇴화, 운동 변경, 인지 손상, 및 루이소체(LB) 및/또는 루이 신경돌기의 형성을 특징으로 한다(McKeith et al., Neurology (1996) 47:1113-24). 시누클레인병증은 (특발성 파킨슨병을 비롯한) 파킨슨병, 루이소체를 갖는 치매(DLB)로서도 공지된 확산성 루이소체 질환(DLBD), 알쯔하이머병의 루이소체 변이체(LBV), 조합된 알쯔하이머 및 파킨슨병, 순수 자율신경 기능부전 및 다발성 시스템 위축증(MSA; 예를 들면, 올리브다리뇌소뇌 위축증, 줄무늬체흑색질 퇴화 및 샤이-드래거 증후군)을 포함한다. 여러 비-운동 징후 및 증상이 상기 질환들의 전구기(즉, 증상발현전, 무증상, 임상전 또는 운동전 기간)에서 시누클레인병증에 대한 전조인 것으로 생각된다. 이러한 초기 징후는 예를 들면, REM 수명 행동 장애(RBD), 냄새의 상실 및 변비를 포함한다(Mahowald et al., Neurology (2010) 75:488-489). 루이소체 질환은 노령화 인구에서 운동 장애 및 인지 저하에 대한 지속적인 주원인이다(Galasko et al., Arch. Neurol. (1994) 51:888-95).
알파-시누클레인은 베타- 및 감마-시누클레인 및 시노레틴(synoretin)을 비롯한 큰 단백질 패밀리의 일부이다. 알파-시누클레인은 시냅스와 관련된 정상 상태에서 발현되고 신경 가소성, 학습 및 기억에 있어서 일정한 역할을 수행하는 것으로 생각된다. 여러 연구들이 알파-시누클레인이 PD 발병에 있어서 중추적인 역할을 수행한다는 것을 시사하였다. 상기 단백질은 병리학적 조건에서 응집하여 불용성 피브릴을 형성할 수 있다. 예를 들면, 시누클레인은 LB에서 축적된다(Spillantini et al., Nature (1997) 388:839-40; Takeda et al., J. Pathol. (1998) 152:367-72; Wakabayashi et al., Neurosci. Lett. (1997) 239:45-8). 알파-시누클레인 유전자 내의 돌연변이는 희귀한 가족성 형태의 파킨슨증과 함께 공-분리된다(Kruger et al., Nature Gen. (1998) 18:106-8; Polymeropoulos, et al., Science (1997) 276:2045-7). 형질전환 마우스(Masliah et al., Science (2000) 287:1265-9) 및 초파리(Feany et al., Nature (2000) 404:394-8)에서의 알파 시누클레인의 과다발현은 루이소체 질환의 여러 병리학적 양태를 모방한다. 또한, 시누클레인의 가용성 올리고머는 신경독성 물질일 수 있다는 것이 암시되었다(Conway et al., Proc Natl Acad Sci USA (2000) 97:571-576; Volles et al., J. Biochemistry (2003) 42:7871-7878). 인간, 마우스 및 파리와 같은 다양한 종 및 동물 모델에서 유사한 형태학적 및 신경학적 변경과 함께 알파-시누클레인의 축적은 이 분자가 루이소체 질환의 발달에 기여한다는 것을 암시한다.
본 발명은 서열 번호 44의 3개 카바트 CDR을 포함하고 서열 번호 44와 90% 이상 동일한 성숙 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 45의 3개 카바트 CDR을 포함하고 서열 번호 45와 90% 이상 동일한 경쇄를 포함하는 항체를 제공한다. 일부 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 44와 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 동일하고 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 45와 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 동일하다. 일부 항체에서, 위치 L46(카바트 넘버링)이 F에 의해 점유될 수 있고; 위치 L49(카바트 넘버링)가 C에 의해 점유될 수 있고; 위치 L83(카바트 넘버링)이 A에 의해 점유될 수 있고; 위치 H11(카바트 넘버링)이 L에 의해 점유될 수 있고; 위치 H28(카바트 넘버링)이 S에 의해 점유될 수 있고; 위치 H38(카바트 넘버링)이 K에 의해 점유될 수 있고; 위치 H48(카바트 넘버링)이 I에 의해 점유될 수 있고; 위치 H67(카바트 넘버링)이 A에 의해 점유될 수 있고; 위치 H69(카바트 넘버링)가 L에 의해 점유될 수 있고; 위치 H71(카바트 넘버링)이 A에 의해 점유될 수 있고/있거나; 위치 H91(카바트 넘버링)이 F에 의해 점유될 수 있다. 상기 항체 중 일부에서, 위치 H97(카바트 넘버링)이 S에 의해 점유될 수 있다. 상기 항체 중 일부에서, 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호 44이고 성숙 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호 45이되, 위치 L46(카바트 넘버링)이 L 또는 F에 의해 점유될 수 있고/있거나 위치 L49(카바트 넘버링)가 Y 또는 C에 의해 점유될 수 있고/있거나 위치 L83(카바트 넘버링)이 F 또는 A에 의해 점유될 수 있고/있거나, 위치 H11(카바트 넘버링)이 V 또는 L에 의해 점유될 수 있고/있거나, 위치 H28(카바트 넘버링)이 T 또는 S에 의해 점유될 수 있고/있거나, 위치 H38(카바트 넘버링)이 R 또는 K에 의해 점유될 수 있고/있거나, 위치 H48(카바트 넘버링)이 M 또는 I에 의해 점유될 수 있고/있거나, 위치 H67(카바트 넘버링)이 V 또는 A에 의해 점유될 수 있고/있거나, 위치 H69(카바트 넘버링)가 M 또는 L에 의해 점유될 수 있고/있거나, 위치 H71(카바트 넘버링)이 T 또는 A에 의해 점유될 수 있고/있거나, 위치 H91(카바트 넘버링)이 Y 또는 F에 의해 점유될 수 있고/있거나, H97(카바트 넘버링)이 C 또는 S에 의해 점유될 수 있다. 상기 항체 중 일부에서, 위치 H71(카바트 넘버링)이 A에 의해 점유된다. 상기 항체 중 일부에서, 위치 H67(카바트 넘버링)이 A에 의해 점유되고, 위치 H71(카바트 넘버링)이 A에 의해 점유된다. 상기 항체 중 일부에서, 위치 L46(카바트 넘버링)이 F에 의해 점유된다. 상기 항체 중 일부에서, 위치 L46(카바트 넘버링)이 F에 의해 점유되고, 위치 L49(카바트 넘버링)가 C에 의해 점유된다. 상기 항체 중 일부에서, 위치 L46(카바트 넘버링)이 F에 의해 점유되고, 위치 L49(카바트 넘버링)가 Y에 의해 점유된다. 상기 항체 중 일부에서, 위치 H67(카바트 넘버링)이 A에 의해 점유되고, 위치 H71(카바트 넘버링)이 A에 의해 점유되고, L46(카바트 넘버링)이 F에 의해 점유되고, 위치 L49(카바트 넘버링)가 C에 의해 점유된다. 상기 항체 중 일부에서, 위치 H11(카바트 넘버링)이 L에 의해 점유되고 위치 H38(카바트 넘버링)이 K에 의해 점유된다. 상기 항체 중 일부에서, 위치 H11(카바트 넘버링)이 V에 의해 점유되고 위치 H38(카바트 넘버링)이 R에 의해 점유된다. 상기 항체 중 일부에서, 위치 H28(카바트 넘버링)이 S에 의해 점유되고, 위치 H48(카바트 넘버링)이 I에 의해 점유되고, 위치 H69(카바트 넘버링)가 L에 의해 점유되고, 위치 H91(카바트 넘버링)이 F에 의해 점유된다. 상기 항체 중 일부에서, 위치 H28(카바트 넘버링)이 T에 의해 점유되고, 위치 H48(카바트 넘버링)이 M에 의해 점유되고, 위치 H69(카바트 넘버링)가 M에 의해 점유되고, 위치 H91(카바트 넘버링)이 Y에 의해 점유된다. 상기 항체 중 일부에서, 위치 L83(카바트 넘버링)이 A에 의해 점유된다. 상기 항체 중 일부에서, 위치 L83(카바트 넘버링)이 F에 의해 점유된다. 상기 항체 중 일부에서, 위치 H97(카바트 넘버링)이 S에 의해 점유된다. 상기 항체 중 일부에서, 위치 H97(카바트 넘버링)이 C에 의해 점유된다. 상기 항체 중 일부에서, 위치 L46(카바트 넘버링)이 F에 의해 점유되고, 위치 L49(카바트 넘버링)가 C에 의해 점유되고 위치 L83(카바트 넘버링)이 A에 의해 점유된다. 상기 항체 중 일부에서, 위치 L46(카바트 넘버링)이 F에 의해 점유되고, 위치 L49(카바트 넘버링)가 Y에 의해 점유되고 위치 L83(카바트 넘버링)이 A에 의해 점유된다. 상기 항체 중 일부에서, 위치 L46(카바트 넘버링)이 F에 의해 점유되고, 위치 L49(카바트 넘버링)가 C에 의해 점유되고 위치 L83(카바트 넘버링)이 F에 의해 점유된다. 상기 항체 중 일부에서, 위치 L46(카바트 넘버링)이 F에 의해 점유되고, 위치 L49(카바트 넘버링)가 Y에 의해 점유되고 위치 L83(카바트 넘버링)이 F에 의해 점유된다. 상기 항체 중 일부에서, 위치 H11(카바트 넘버링)이 L에 의해 점유되고, 위치 H28(카바트 넘버링)이 S에 의해 점유되고, 위치 H38(카바트 넘버링)이 K에 의해 점유되고, 위치 H48(카바트 넘버링)이 I에 의해 점유되고, 위치 H67(카바트 넘버링)이 A에 의해 점유되고, 위치 H69(카바트 넘버링)가 L에 의해 점유되고, 위치 H71(카바트 넘버링)이 A에 의해 점유되고, 위치 H91(카바트 넘버링)이 F에 의해 점유되고 위치 H97(카바트 넘버링)이 C에 의해 점유된다. 상기 항체 중 일부에서, 위치 H11(카바트 넘버링)이 V에 의해 점유되고, 위치 H28(카바트 넘버링)이 S에 의해 점유되고, 위치 H38(카바트 넘버링)이 R에 의해 점유되고, 위치 H48(카바트 넘버링)이 I에 의해 점유되고, 위치 H67(카바트 넘버링)이 A에 의해 점유되고, 위치 H69(카바트 넘버링)가 L에 의해 점유되고, 위치 H71(카바트 넘버링)이 A에 의해 점유되고, 위치 H91(카바트 넘버링)이 F에 의해 점유되고 위치 H97(카바트 넘버링)이 C에 의해 점유된다. 상기 항체 중 일부에서, 위치 H11(카바트 넘버링)이 V에 의해 점유되고, 위치 H28(카바트 넘버링)이 T에 의해 점유되고, 위치 H38(카바트 넘버링)이 R에 의해 점유되고, 위치 H48(카바트 넘버링)이 M에 의해 점유되고, 위치 H67(카바트 넘버링)이 A에 의해 점유되고, 위치 H69(카바트 넘버링)가 M에 의해 점유되고, 위치 H71(카바트 넘버링)이 A에 의해 점유되고, 위치 H91(카바트 넘버링)이 Y에 의해 점유되고 위치 H97(카바트 넘버링)이 C에 의해 점유된다. 상기 항체 중 일부에서, 위치 H11(카바트 넘버링)이 V에 의해 점유되고, 위치 H28(카바트 넘버링)이 S에 의해 점유되고, 위치 H38(카바트 넘버링)이 R에 의해 점유되고, 위치 H48(카바트 넘버링)이 I에 의해 점유되고, 위치 H67(카바트 넘버링)이 A에 의해 점유되고, 위치 H69(카바트 넘버링)가 L에 의해 점유되고, 위치 H71(카바트 넘버링)이 A에 의해 점유되고, 위치 H91(카바트 넘버링)이 F에 의해 점유되고 위치 H97(카바트 넘버링)이 S에 의해 점유된다. 상기 항체 중 일부에서, 위치 H11(카바트 넘버링)이 V에 의해 점유되고, 위치 H28(카바트 넘버링)이 T에 의해 점유되고, 위치 H38(카바트 넘버링)이 R에 의해 점유되고, 위치 H48(카바트 넘버링)이 M에 의해 점유되고, 위치 H67(카바트 넘버링)이 A에 의해 점유되고, 위치 H69(카바트 넘버링)가 M에 의해 점유되고, 위치 H71(카바트 넘버링)이 A에 의해 점유되고, 위치 H91(카바트 넘버링)이 Y에 의해 점유되고 위치 H97(카바트 넘버링)이 S에 의해 점유된다. 상기 항체 중 일부에서, 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 다른 방식으로 서열 번호 44의 아미노산 서열이고 성숙 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 다른 방식으로 서열 번호 45의 아미노산 서열이다.
본 발명은 서열 번호 44의 3개 카바트 CDR을 포함하는 인간화된 중쇄 및 서열 번호 45의 3개 CDR을 포함하는 인간화된 경쇄를 포함하되, 위치 L46(카바트 넘버링)이 F에 의해 점유되고/되거나 위치 L49(카바트 넘버링)가 C에 의해 점유되고/되거나 위치 L83(카바트 넘버링)이 F에 의해 점유되고/되거나, 위치 H11(카바트 넘버링)이 V에 의해 점유되고/되거나, 위치 H28(카바트 넘버링)이 T에 의해 점유되고/되거나, 위치 H38(카바트 넘버링)이 R에 의해 점유되고/되거나, 위치 H48(카바트 넘버링)이 M에 의해 점유되고/되거나, 위치 H67(카바트 넘버링)이 A에 의해 점유되고/되거나, 위치 H69(카바트 넘버링)가 M에 의해 점유되고/되거나, 위치 H71(카바트 넘버링)이 A에 의해 점유되고/되거나, 위치 H91(카바트 넘버링)이 Y에 의해 점유되고/되거나, 위치 H97(카바트 넘버링)이 C에 의해 점유되는 것인 항체를 추가로 제공한다. 상기 항체 중 일부에서, 위치 L46(카바트 넘버링)이 F에 의해 점유되고, 위치 L49(카바트 넘버링)가 C에 의해 점유된다. 상기 항체 중 일부에서, 위치 H67(카바트 넘버링)이 A에 의해 점유되고, 위치 H71(카바트 넘버링)이 A에 의해 점유된다. 상기 항체 중 일부에서, 위치 L46(카바트 넘버링)이 F에 의해 점유되고, 위치 H67(카바트 넘버링)이 A에 의해 점유되고, 위치 H71(카바트 넘버링)이 A에 의해 점유되고, 위치 L49(카바트 넘버링)가 C에 의해 점유된다. 상기 항체 중 일부에서, 위치 H11(카바트 넘버링)이 V에 의해 점유되고 위치 H38(카바트 넘버링)이 R에 의해 점유된다. 상기 항체 중 일부에서, 위치 H28(카바트 넘버링)이 T에 의해 점유되고, 위치 H48(카바트 넘버링)이 M에 의해 점유되고, 위치 H69(카바트 넘버링)가 M에 의해 점유되고, 위치 H91(카바트 넘버링)이 Y에 의해 점유된다. 상기 항체 중 일부에서, 위치 L49(카바트 넘버링)가 C에 의해 점유되고 위치 L83(카바트 넘버링)이 F에 의해 점유된다. 상기 항체 중 일부에서, 위치 H28(카바트 넘버링)이 T에 의해 점유되고, 위치 H48(카바트 넘버링)이 M에 의해 점유되고, 위치 H69(카바트 넘버링)가 M에 의해 점유되고, 위치 H91(카바트 넘버링)이 Y에 의해 점유되고, 위치 L49(카바트 넘버링)가 C에 의해 점유되고, 위치 L83(카바트 넘버링)이 F에 의해 점유된다. 상기 항체 중 일부에서, 위치 H97(카바트 넘버링)이 C에 의해 점유된다. 상기 항체 중 일부에서, 위치 L46(카바트 넘버링)이 F에 의해 점유되고, 위치 L49(카바트 넘버링)가 C에 의해 점유되고, 위치 L83(카바트 넘버링)이 F에 의해 점유되고, 위치 H11(카바트 넘버링)이 V에 의해 점유되고, H28(카바트 넘버링)이 T에 의해 점유되고, 위치 H38(카바트 넘버링)이 R에 의해 점유되고, 위치 H48(카바트 넘버링)이 M에 의해 점유되고, 위치 H67(카바트 넘버링)이 A에 의해 점유되고, 위치 H69(카바트 넘버링)가 M에 의해 점유되고, 위치 H71(카바트 넘버링)이 A에 의해 점유되고, 위치 H91(카바트 넘버링)이 Y에 의해 점유되고, H97(카바트 넘버링)이 C에 의해 점유된다.
본 발명은 서열 번호 23과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 성숙 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 37과 90% 이상 동일한 성숙 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 추가로 제공한다. 상기 항체 중 일부에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 23의 3개 카바트 CDR을 포함하고 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 37의 3개 카바트 CDR을 포함하며, 위치 H67(카바트 넘버링)이 A에 의해 점유되고, H71(카바트 넘버링)이 A에 의해 점유되고, 위치 L46(카바트 넘버링)이 F에 의해 점유되고, 위치 L49(카바트 넘버링)가 C에 의해 점유된다. 상기 항체 중 일부에서, 위치 L83(카바트 넘버링)이 F에 의해 점유된다. 상기 항체 중 일부에서, 위치 H97(카바트 넘버링)이 C에 의해 점유된다. 상기 항체 중 일부에서, 성숙 중쇄는 서열 번호 23과 95% 이상 서열 동일성을 갖고 성숙 경쇄는 서열 번호 37과 95% 이상 서열 동일성을 갖는다. 상기 항체 중 일부에서, 각각 서열 번호 52 및 60으로부터의 성숙 중쇄 가변 영역 및 성숙 경쇄 가변 영역의 CDR에서의 임의의 차이는 위치 H60-H65에 있다. 상기 항체 중 일부에서, 항체의 알파-시누클레인에 대한 KD는 뮤린 또는 키메라 1H7 항체의 알파-시누클레인에 대한 KD의 약 0.5∼2이다. 상기 항체 중 일부에서, 위치 L83(카바트 넘버링)이 F 또는 A에 의해 점유되고, 위치 H11(카바트 넘버링)이 V에 의해 점유되고, H28(카바트 넘버링)이 T에 의해 점유되고, 위치 H38(카바트 넘버링)이 R에 의해 점유되고, 위치 H48(카바트 넘버링)이 M에 의해 점유되고, 위치 H67(카바트 넘버링)이 A에 의해 점유되고, 위치 H69(카바트 넘버링)가 M에 의해 점유되고, 위치 H71(카바트 넘버링)이 A에 의해 점유되고, 위치 H91(카바트 넘버링)이 Y에 의해 점유되고, H97(카바트 넘버링)이 C에 의해 점유된다. 상기 항체 중 일부에서, 위치 L83(카바트 넘버링)이 F에 의해 점유된다. 상기 항체 중 일부에서, 위치 H97(카바트 넘버링)이 C에 의해 점유된다. 상기 항체 중 일부에서, 성숙 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 23의 가변 영역 골격에서의 임의의 차이는 V에 의해 점유되는 위치 H11(카바트 넘버링), T에 의해 점유되는 H28(카바트 넘버링), R에 의해 점유되는 위치 H38(카바트 넘버링), M에 의해 점유되는 위치 H48(카바트 넘버링), M에 의해 점유되는 위치 H69(카바트 넘버링), 및 Y에 의해 점유되는 위치 H91(카바트 넘버링)이 중 하나 이상이다. 상기 항체 중 일부에서, 성숙 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 37의 가변 영역 골격에서의 임의의 차이는 F 또는 A에 의해 점유되는 위치 L83(카바트 넘버링)이다. 상기 항체 중 일부에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 23으로 표기된 아미노산 서열을 갖고 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 37로 표기된 아미노산 서열을 갖는다.
일부 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 44로 표기된 아미노산 서열을 갖고 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 45, 33, 35, 37, 또는 39로 표기된 아미노산 서열을 갖는다. 일부 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 19로 표기된 아미노산 서열을 갖고 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 45, 33, 35, 37, 또는 39로 표기된 아미노산 서열을 갖는다. 일부 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 21로 표기된 아미노산 서열을 갖고 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 45, 33, 35, 37, 또는 39로 표기된 아미노산 서열을 갖는다. 일부 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 23으로 표기된 아미노산 서열을 갖고 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 45, 33, 35, 37, 또는 39로 표기된 아미노산 서열을 갖는다. 일부 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 25로 표기된 아미노산 서열을 갖고 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 45, 33, 35, 37, 또는 39로 표기된 아미노산 서열을 갖는다. 일부 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 27로 표기된 아미노산 서열을 갖고 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 45, 33, 35, 37, 또는 39로 표기된 아미노산 서열을 갖는다.
상기 항체 중 임의의 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 중쇄 불변 영역에 융합될 수 있고, 성숙 경쇄 불변 영역은 경쇄 불변 영역에 융합될 수 있다.
상기 항체 중 임의의 항체에서, 중쇄 불변 영역은 천연 인간 불변 영역에 비해 Fcγ 수용체와의 결합이 감소되는 천연 인간 불변 영역의 돌연변이체 형태일 수 있다.
상기 항체 중 임의의 항체에서, 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1 동종형(isotype)의 중쇄 불변 영역일 수 있다. 일부 항체에서, 동종이형(allotype)은 G1m3이다. 일부 항체에서, 동종이형은 G1m1이다.
일부 항체에서, 중쇄 불변 영역은 서열 번호 52로 표기된 아미노산 서열을 갖되, C-말단 리신 잔기가 누락될 수 있다. 일부 항체에서, 경쇄 불변 영역은 서열 번호 49로 표기된 아미노산 서열을 갖는다. 일부 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 52로 표기된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 불변 영역에 융합하되, C-말단 리신 잔기가 누락될 수 있고 성숙 경쇄 불변 영역은 서열 번호 49로 표기된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 불변 영역에 융합된다. 일부 항체에서, 성숙 경쇄는 서열 번호 53을 포함하고 성숙 중쇄는 서열 번호 56을 포함한다.
본 발명은 임의의 전술된 성숙 중쇄 가변 영역 및/또는 임의의 전술된 성숙 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산, 예컨대 서열 번호 18, 20, 22, 24, 26, 32, 34, 36, 또는 38을 추가로 제공한다.
본 발명은 상기 기술된 임의의 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 추가로 제공한다.
본 발명은 임의의 전술된 항체를 포함하는 약학 조성물을 추가로 제공한다.
본 발명은 루이소체 질환을 갖거나 가질 위험에 있는 환자를 치료하는 방법으로서, 임의의 전술된 항체의 유효 요법(regime)을 상기 환자에게 실시하는 단계를 포함하는 방법을 추가로 제공한다. 일부 방법에서, 질환은 파킨슨병이다. 일부 방법에서, 환자에서 인지 기능의 감퇴가 억제된다. 일부 방법에서, 신경(neuritic) 및/또는 축삭 알파 시누클레인 응집체가 감소된다. 일부 방법에서, 환자에서 신경성 위축(neuritic dystrophy)이 감소된다. 일부 방법에서, 시냅스 및/또는 수상돌기 밀도가 보존된다. 일부 방법에서, 방법은 환자에서 시냅토파이신(synaptophysin) 및/또는 MAP2를 보존한다.
본 발명은 루이소체 질환을 갖거나 가질 위험에 있는 환자에서 루이소체 형성을 감소시키는 방법으로서, 임의의 전술된 항체의 유효량을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 추가로 제공한다. 일부 방법에서, 질환은 파킨슨병이다. 일부 방법에서, 환자에서 인지 기능의 감퇴가 억제된다. 일부 방법에서, 신경 및/또는 축삭 알파 시누클레인 응집체가 감소된다. 일부 방법에서, 환자에서 신경성 위축이 감소된다. 일부 방법에서, 시냅스 및/또는 수상돌기 밀도가 보존된다. 일부 방법에서, 방법은 환자에서 시냅토파이신 및/또는 MAP2를 보존한다.
본 발명은 루이소체 질환을 갖거나 가질 위험에 있는 환자에서 시누클레인 응집을 억제하거나 또는 루이소체 또는 시누클레인 응집체를 제거하는 방법으로서, 임의의 전술된 항체의 유효량을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 추가로 제공한다. 일부 방법에서, 질환은 파킨슨병이다. 일부 방법에서, 환자에서 인지 기능의 감퇴가 억제된다. 일부 방법에서, 신경 및/또는 축삭 알파 시누클레인 응집체는 감소된다. 일부 방법에서, 환자에서 신경성 위축이 감소된다. 일부 방법에서, 시냅스 및/또는 수상돌기 밀도가 보존된다. 일부 방법에서, 방법은 환자에서 시냅토파이신 및/또는 MAP2를 보존한다.
본 발명은 루이소체 질환을 갖거나 가질 위험에 있는 환자에서 루이소체를 검출하는 방법으로서, 임의의 전술된 항체의 유효량을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 추가로 제공하고, 이때 항체는 루이소체에 결합하고, 결합된 항체가 검출된다. 일부 방법에서, 질환은 파킨슨병이다. 일부 방법에서, 항체는 표지된다.
본 발명은 항체의 제조 방법으로서, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산으로 형질전환된 세포를 배양하여, 세포가 항체를 분비하도록 하는 단계; 및 세포 배양 배지로부터 항체를 정제하는 단계를 포함하고, 이때 상기 항체가 임의의 전술된 항체인 방법을 추가로 제공한다.
본 발명은 항체를 생성하는 세포주를 제조하는 방법으로서, 선택 마커 및 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 벡터를 세포 내로 도입하는 단계; 증가된 카피 수의 벡터를 갖는 세포를 선택하는 조건 하에서 세포를 증식시키는 단계; 선택된 세포로부터 단일 세포를 단리하는 단계; 및 항체의 수율에 기초하여 선택된 단일 세포로부터 클로닝된 세포를 모으는 단계를 포함하는 방법을 추가로 제공하고, 이때 상기 항체는 임의의 전술된 항체이다. 몇몇 이러한 방법들은 선택 조건 하에서 세포를 증식시키고 100 mg/ℓ/106개 세포/24시간 이상을 천연적으로 발현하고 분비하는 세포주에 대해 스크리닝하는 단계를 추가로 포함한다.
도 1에는 인간화된 1H7 중쇄 성숙 가변 영역의 4가지 버전과 m1H7의 아미노산 서열의 정렬이 도시된다. BAC02037(서열 번호 42)은 인간 수용자 VH 서열이다. 카바트 정의에 따른 CDR 영역은 밑줄 및 굵은 글자체로 표시되어 있다.
도 2에는 인간화된 1H7 경쇄 성숙 가변 영역의 4가지 버전과 m1H7의 아미노산 서열의 정렬이 도시된다. AAY33358(서열 번호 43)은 인간 수용자 VL 서열이다. 카바트 정의에 따른 CDR 영역은 밑줄 및 굵은 글자체로 표시되어 있다.
도 3a 내지 도 3c에는 각각 뮤린 1H7(a), 키메라 1H7(b) 및 인간화된 1H7 Hu1H7VHv3-Hu1H7VLv3의 비아코어 결합 운동 분석이 도시된다.
도 4a 내지 도4c에는 결합 운동 매개변수(ForteBio) 인간화된 1H7(Hu1H7VHv2-Hu1H7VLv4, Hu1H7VHv3-Hu1H7VLv1, Hu1H7VHv3-Hu1H7VLv2, Hu1H7VHv3-Hu1H7VLv3, Hu1H7VHv3-Hu1H7VLv4, Hu1H7VHv4-Hu1H7VLv1) 및 키메라 1H7이 도시된다.
도 5에는 모리스(Morris) 물 미로 검사의 기억 성능에 대한 1H7을 사용한 수동 면역치료의 결과가 도시된다.
도 6에는 둥근 광선 검사에서 속도 및 오류에 대한 1H7을 사용한 수동 면역치료의 결과가 도시된다.
서열의 간단한 설명
서열 번호 1은 천연 인간 야생형 알파-시누클레인 아미노산 서열이다.
서열 번호 2는 Jensen 등(Biochem. J. 310 (Pt 1): 91-94, 1995; GenBank 수탁 번호 S56746)에 의해 보고된 알파-시누클레인의 비-아밀로이드 성분(NAC) 도메인이다.
서열 번호 3은 Ueda 등(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:11282-6, 1993)에 의해 보고된 알파-시누클레인의 비-아밀로이드 성분 (NAC) 도메인이다.
서열 번호 4는 뮤린 1H7 항체(m1H7) 중쇄 가변 뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 5는 m1H7 중쇄 가변 아미노산 서열이다.
서열 번호 6은 m1H7 경쇄 가변 뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 7은 m1H7 경쇄 가변 아미노산 서열이다.
서열 번호 8은 성숙 m1H7 중쇄 가변 뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 9는 성숙 m1H7 중쇄 가변 아미노산 서열이다.
서열 번호 10은 성숙 m1H7 경쇄 가변 뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 11은 성숙 m1H7 경쇄 가변 아미노산 서열이다.
서열 번호 12는 m1H7 중쇄 CDR1(카바트 정의)이다.
서열 번호 13은 m1H7 중쇄 CDR2(카바트 정의)이다.
서열 번호 14는 m1H7 중쇄 CDR3(카바트 정의)이다.
서열 번호 15는 m1H7 경쇄 CDR1(카바트 정의)이다.
서열 번호 16은 m1H7 경쇄 CDR2(카바트 정의)이다.
서열 번호 17은 m1H7 경쇄 CDR3(카바트 정의)이다.
서열 번호 18은 Hu1H7VHv1 핵산 서열이다.
서열 번호 19는 Hu1H7VHv1 아미노산 서열이다.
서열 번호 20은 Hu1H7VHv2 핵산 서열이다.
서열 번호 21은 Hu1H7VHv2 아미노산 서열이다.
서열 번호 22는 Hu1H7VHv3 핵산 서열이다.
서열 번호 23은 Hu1H7VHv3 아미노산 서열이다.
서열 번호 24는 Hu1H7VHv4 핵산 서열이다.
서열 번호 25는 Hu1H7VHv4 아미노산 서열이다.
서열 번호 26은 Hu1H7VHv5 핵산 서열이다.
서열 번호 27은 Hu1H7VHv5 아미노산 서열이다.
서열 번호 28은 Hu1H7VH 신호 펩티드 핵산 서열이다.
서열 번호 29는 Hu1H7VH 신호 펩티드 아미노산 서열이다.
서열 번호 30은 Hu1H7VH 신호 펩티드 핵산 서열이다.
서열 번호 31은 Hu1H7VH 신호 펩티드 아미노산 서열이다.
서열 번호 32는 Hu1H7VLv1 핵산 서열이다.
서열 번호 33은 Hu1H7VLv1 아미노산 서열이다.
서열 번호 34는 Hu1H7VLv2 핵산 서열이다.
서열 번호 35는 Hu1H7VLv2 아미노산 서열이다.
서열 번호 36은 Hu1H7VLv3 핵산 서열이다.
서열 번호 37은 Hu1H7VLv3 아미노산 서열이다.
서열 번호 39는 Hu1H7VLv4 아미노산 서열이다.
서열 번호 40은 Hu1H7VL 신호 펩티드 핵산 서열이다.
서열 번호 41은 Hu1H7VL 신호 펩티드 아미노산 서열이다.
서열 번호 42는 중쇄 골격 아미노산 서열에 사용된 BAC02037(GI-21670055) 인간 수용자이다.
서열 번호 43은 경쇄 골격 아미노산 서열에 사용된 AAY33358(GI-63102905) 인간 수용자이다.
서열 번호 44는 복귀돌연변이 또는 CDR 돌연변이가 없는 Hu1H7VH이다.
서열 번호 45는 복귀돌연변이 또는 CDR 돌연변이가 없는 Hu1H7VL이다.
서열 번호 46은 Hu1H7VH 대체물에 대한 서열이다.
서열 번호 47은 Hu1H7VL 대체물에 대한 서열이다.
서열 번호 48은 Hu1H7VH CDR3 대체물에 대한 서열이다.
서열 번호 49는 Hu1H7 경쇄 불변 영역(아르기닌 포함)(v1-v4에 공통임)이다.
서열 번호 50은 Hu1H7 중쇄 불변 영역(IgG1; v1-v5에 공통임)이다.
서열 번호 51은 Hu1H7 경쇄 불변 영역(아르기닌 불포함)(v1-v4에 공통임)이다.
서열 번호 52는 Hu1H7 중쇄 불변 영역(G1m3 동종이형)이다.
서열 번호 53은 Hu1H7 경쇄 버전 3(아르기닌 포함 가변 영역 + 불변 영역)이다.
서열 번호 54는 Hu1H7 경쇄 버전 3(아르기닌 불포함 가변 영역 + 불변 영역)이다.
서열 번호 54는 Hu1H7 중쇄 버전 3(가변 영역 + 불변 영역)이다.
서열 번호 56은 Hu1H7 중쇄 버전 3(가변 영역 + 불변 영역; G1m3 동종이형)이다.
서열 번호 57은 Hu1H7 중쇄 불변 영역(IgG2)이다.
서열 번호 58은 Hu1H7 중쇄 불변 영역(G1m1 동종이형)이다.
도 2에는 인간화된 1H7 경쇄 성숙 가변 영역의 4가지 버전과 m1H7의 아미노산 서열의 정렬이 도시된다. AAY33358(서열 번호 43)은 인간 수용자 VL 서열이다. 카바트 정의에 따른 CDR 영역은 밑줄 및 굵은 글자체로 표시되어 있다.
도 3a 내지 도 3c에는 각각 뮤린 1H7(a), 키메라 1H7(b) 및 인간화된 1H7 Hu1H7VHv3-Hu1H7VLv3의 비아코어 결합 운동 분석이 도시된다.
도 4a 내지 도4c에는 결합 운동 매개변수(ForteBio) 인간화된 1H7(Hu1H7VHv2-Hu1H7VLv4, Hu1H7VHv3-Hu1H7VLv1, Hu1H7VHv3-Hu1H7VLv2, Hu1H7VHv3-Hu1H7VLv3, Hu1H7VHv3-Hu1H7VLv4, Hu1H7VHv4-Hu1H7VLv1) 및 키메라 1H7이 도시된다.
도 5에는 모리스(Morris) 물 미로 검사의 기억 성능에 대한 1H7을 사용한 수동 면역치료의 결과가 도시된다.
도 6에는 둥근 광선 검사에서 속도 및 오류에 대한 1H7을 사용한 수동 면역치료의 결과가 도시된다.
서열의 간단한 설명
서열 번호 1은 천연 인간 야생형 알파-시누클레인 아미노산 서열이다.
서열 번호 2는 Jensen 등(Biochem. J. 310 (Pt 1): 91-94, 1995; GenBank 수탁 번호 S56746)에 의해 보고된 알파-시누클레인의 비-아밀로이드 성분(NAC) 도메인이다.
서열 번호 3은 Ueda 등(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:11282-6, 1993)에 의해 보고된 알파-시누클레인의 비-아밀로이드 성분 (NAC) 도메인이다.
서열 번호 4는 뮤린 1H7 항체(m1H7) 중쇄 가변 뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 5는 m1H7 중쇄 가변 아미노산 서열이다.
서열 번호 6은 m1H7 경쇄 가변 뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 7은 m1H7 경쇄 가변 아미노산 서열이다.
서열 번호 8은 성숙 m1H7 중쇄 가변 뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 9는 성숙 m1H7 중쇄 가변 아미노산 서열이다.
서열 번호 10은 성숙 m1H7 경쇄 가변 뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 11은 성숙 m1H7 경쇄 가변 아미노산 서열이다.
서열 번호 12는 m1H7 중쇄 CDR1(카바트 정의)이다.
서열 번호 13은 m1H7 중쇄 CDR2(카바트 정의)이다.
서열 번호 14는 m1H7 중쇄 CDR3(카바트 정의)이다.
서열 번호 15는 m1H7 경쇄 CDR1(카바트 정의)이다.
서열 번호 16은 m1H7 경쇄 CDR2(카바트 정의)이다.
서열 번호 17은 m1H7 경쇄 CDR3(카바트 정의)이다.
서열 번호 18은 Hu1H7VHv1 핵산 서열이다.
서열 번호 19는 Hu1H7VHv1 아미노산 서열이다.
서열 번호 20은 Hu1H7VHv2 핵산 서열이다.
서열 번호 21은 Hu1H7VHv2 아미노산 서열이다.
서열 번호 22는 Hu1H7VHv3 핵산 서열이다.
서열 번호 23은 Hu1H7VHv3 아미노산 서열이다.
서열 번호 24는 Hu1H7VHv4 핵산 서열이다.
서열 번호 25는 Hu1H7VHv4 아미노산 서열이다.
서열 번호 26은 Hu1H7VHv5 핵산 서열이다.
서열 번호 27은 Hu1H7VHv5 아미노산 서열이다.
서열 번호 28은 Hu1H7VH 신호 펩티드 핵산 서열이다.
서열 번호 29는 Hu1H7VH 신호 펩티드 아미노산 서열이다.
서열 번호 30은 Hu1H7VH 신호 펩티드 핵산 서열이다.
서열 번호 31은 Hu1H7VH 신호 펩티드 아미노산 서열이다.
서열 번호 32는 Hu1H7VLv1 핵산 서열이다.
서열 번호 33은 Hu1H7VLv1 아미노산 서열이다.
서열 번호 34는 Hu1H7VLv2 핵산 서열이다.
서열 번호 35는 Hu1H7VLv2 아미노산 서열이다.
서열 번호 36은 Hu1H7VLv3 핵산 서열이다.
서열 번호 37은 Hu1H7VLv3 아미노산 서열이다.
서열 번호 39는 Hu1H7VLv4 아미노산 서열이다.
서열 번호 40은 Hu1H7VL 신호 펩티드 핵산 서열이다.
서열 번호 41은 Hu1H7VL 신호 펩티드 아미노산 서열이다.
서열 번호 42는 중쇄 골격 아미노산 서열에 사용된 BAC02037(GI-21670055) 인간 수용자이다.
서열 번호 43은 경쇄 골격 아미노산 서열에 사용된 AAY33358(GI-63102905) 인간 수용자이다.
서열 번호 44는 복귀돌연변이 또는 CDR 돌연변이가 없는 Hu1H7VH이다.
서열 번호 45는 복귀돌연변이 또는 CDR 돌연변이가 없는 Hu1H7VL이다.
서열 번호 46은 Hu1H7VH 대체물에 대한 서열이다.
서열 번호 47은 Hu1H7VL 대체물에 대한 서열이다.
서열 번호 48은 Hu1H7VH CDR3 대체물에 대한 서열이다.
서열 번호 49는 Hu1H7 경쇄 불변 영역(아르기닌 포함)(v1-v4에 공통임)이다.
서열 번호 50은 Hu1H7 중쇄 불변 영역(IgG1; v1-v5에 공통임)이다.
서열 번호 51은 Hu1H7 경쇄 불변 영역(아르기닌 불포함)(v1-v4에 공통임)이다.
서열 번호 52는 Hu1H7 중쇄 불변 영역(G1m3 동종이형)이다.
서열 번호 53은 Hu1H7 경쇄 버전 3(아르기닌 포함 가변 영역 + 불변 영역)이다.
서열 번호 54는 Hu1H7 경쇄 버전 3(아르기닌 불포함 가변 영역 + 불변 영역)이다.
서열 번호 54는 Hu1H7 중쇄 버전 3(가변 영역 + 불변 영역)이다.
서열 번호 56은 Hu1H7 중쇄 버전 3(가변 영역 + 불변 영역; G1m3 동종이형)이다.
서열 번호 57은 Hu1H7 중쇄 불변 영역(IgG2)이다.
서열 번호 58은 Hu1H7 중쇄 불변 영역(G1m1 동종이형)이다.
정의
단일클론 항체는 전형적으로 단리 형태로 제공된다. 이것은 항체가 전형적으로 그의 제조 또는 정제로부터 비롯된 50% (중량/중량) 이상의 순수한 단백질 및 다른 거대분자라는 것을 의미하지만, 단일클론 항체가 그의 사용을 용이하게 하기 위한 과량의 약학적으로 허용가능한 담체(들) 또는 다른 비히클과 조합되는 가능성을 배제하지 않는다. 종종 단일클론항체는 제조 또는 정제로부터 비롯된 60%, 70%, 80%, 90%, 95 또는 99% (중량/중량) 이상 순수한 단백질 및 다른 거대분자이다.
단일클론 항체의 이의 표적에 대한 특이적 결합은 106, 107, 108, 109, 또는 1010 M-1 이상의 친화성을 의미한다. 특이적 결합은 하나 이상의 무관한 표적에 대해 일어나는 비-특이적 결합보다 크기 면에서 검출가능하게 더 높고 이러한 비-특이적 결합으로부터 구별될 수 있다. 특이적 결합은 특정 작용기들 또는 특정 공간적 피트(fit)(예를 들면, 자물쇠와 열쇠 유형) 사이의 결합의 형성 결과일 수 있는 반면, 비-특이적 결합은 통상적으로 반데르발스 힘의 결과이다. 그러나, 특이적 결합은 반드시 단일클론 항체가 오직 1개의 표적에만 결합한다는 것을 내포하지는 않는다.
기본 항체 구조 유닛은 서브유닛의 사량체이다. 각각의 사량체는 각각 1개의 "경쇄"(약 25 kDa) 및 1개의 "중쇄"(약 50 내지 70 kDa)를 갖는 동일한 2쌍의 폴리펩티드 쇄들을 포함한다. 각 쇄의 아미노 말단 부분은 주로 항원 인식을 담당하는 약 100개 내지 110개, 또는 그 이상의 아미노산으로 구성된 가변 영역을 포함한다. 이 가변 영역은 초기에 절단가능한 신호 펩티드에 연결된 상태로 발현된다. 신호 펩티드를 갖지 않는 가변 영역은 종종 성숙 가변 영역으로서 지칭된다. 따라서, 예를 들면, 경쇄 성숙 가변 영역은 경쇄 신호 펩티드를 갖지 않는 경쇄 가변 영역을 의미한다. 각 쇄의 카복시 말단 부분은 주로 이펙터 기능을 담당하는 불변 영역을 정의한다.
경쇄는 카파 또는 람다로서 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로서 분류되고, 항체의 동종형을 각각 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE로서 정의한다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 영역과 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산으로 구성된 "J" 영역에 의해 연결되고, 이때 중쇄는 약 10개 이상의 아미노산으로 구성된 "D" 영역도 포함한다(일반적으로, 모든 목적을 위해 전체적으로 참고로 도입되는 문헌(Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y., 1989, Ch. 7)) 참조).
각각의 경쇄/중쇄 쌍의 성숙 가변 영역들은 항체 결합 부위를 형성한다. 따라서, 온전한 항체는 2개의 결합 부위를 갖는다. 이작용성 또는 이중특이적 항체를 제외하고, 2개의 결합 부위는 동일하다. 쇄들은 모두 상보성 결정 영역 또는 CDR로도 지칭되는 3개의 초가변 영역들에 의해 연결된 상대적으로 보존된 골격 영역(FR)이라는 동일한 일반 구조를 나타낸다. 각 쌍의 2개 쇄들의 CDR들은 특이적 에피토프에 결합할 수 있도록 골격 영역에 의해 정렬된다. 경쇄 및 중쇄 둘 모두가 N 말단부터 C 말단까지 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각각의 도메인으로의 아미노산의 배정은 카바트(Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991)) 또는 초티아(Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989))의 정의에 따른다. 카바트는 상이한 중쇄들 사이 또는 상이한 경쇄들 사이의 상응하는 잔기들이 동일한 번호를 배정받는 널리 사용되는 넘버링 약정(카바트 넘버링)도 제공한다(예를 들면, H83은 성숙 중쇄 가변 영역에서 카바트 넘버링에 의한 위치 83을 의미하고; 마찬가지로, 위치 L36은 성숙 경쇄 가변 영역에서 카바트 넘버링에 의한 위치 36을 의미한다). 카바트 넘버링은, 달리 분명하게 명시되지 않은 한, 항체의 가변 영역에서의 위치를 지칭하도록 전체에서 사용된다.
용어 "항체"는 온전한 항체 및 이의 결합 단편을 포함한다. 전형적으로, 단편은 분리된 중쇄, 경쇄 Fab, Fab', F(ab')2, F(ab)c, 디아바디, Dab, 나노바디 및 Fv를 비롯한 표적과의 특이적 결합에 대해 온전한 항체(상기 단편들은 이 온전한 항체로부터 유래됨)와 경쟁한다. 단편은 재조합 DNA 기법에 의해, 또는 온전한 면역글로불린의 효소적 또는 화학적 분리에 의해 제조될 수 있다. 용어 "항체"는 이중특이적 항체 및/또는 인간화된 항체도 포함한다. 이중특이적 또는 이작용성 항체는 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍 및 및 2개의 상이한 결합 부위를 갖는 인공 하이브리드 항체이다(예를 들면, 문헌(Songsivilai and Lachmann, Clin. Exp. Immunol., 79:315-321 (1990)) 및 문헌(Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-53 (1992)) 참조). 몇몇 이중특이적 항체에서, 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍은 인간화된 1H7 중쇄/경쇄 쌍, 및 1H7에 의해 결합된 에피토프와 상이한 알파 시누클레인 상의 에피토프에 대해 특이적인 중쇄/경쇄 쌍을 포함한다.
몇몇 이중특이적 항체에서, 1개의 중쇄 경쇄 쌍은 하기 추가 개시된 바와 같은 인간화된 1H7 항체이고 중경쇄 쌍은 혈액뇌 장벽 상에서 발현된 수용체, 예컨대, 인슐린 수용체, 인슐린 유사 성장 인자(IGF) 수용체, 렙틴 수용체 또는 지단백질 수용체, 또는 트랜스페린 수용체에 결합하는 항체로부터 유래된다(Friden et al., PNAS 88:4771-4775, 1991; Friden et al., Science 259:373-377, 1993). 이러한 이중특이적 항체는 수용체 매개 트랜스사이토시스(transcytosis)에 의해 혈액뇌 장벽을 가로질러 전달될 수 있다. 이중특이적 항체의 뇌 흡수는 혈액뇌 장벽 수용체에 대한 그의 친화성을 감소시키도록 이중특이적 항체를 조작함으로써 더 향상될 수 있다. 수용체에 대한 감소된 친화성은 뇌에서의 보다 넓은 분포를 야기한다(예를 들면, 문헌(Atwal. et al. Sci. Trans. Med. 3, 84ra43, 2011) 및 문헌(Yu et al. Sci. Trans. Med. 3, 84ra44, 2011) 참조).
예시적인 이중특이적 항체는 (1) 각각의 경쇄 및 중쇄가 짧은 펩티드 연결을 통해 직렬로 2개의 가변 도메인들을 함유하는 이중 가변 도메인 항체(DVD-Ig)(Wu et al., Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-Ig™) Molecule, In: Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg (2010)); (2) 표적 항원들 각각에 대한 2개의 결합 부위를 갖는 4가 이중특이적 항체를 발생시키는 2개의 단일 쇄 디아바디의 융합체인 Tandab; (3) 다가 분자를 발생시키는, scFv와 디아바디의 조합물인 플렉시바디(flexibody); (4) Fab에 적용될 때 상이한 Fab 단편에 연결된 2개의 동일한 Fab 단편으로 구성된 3가 이중특이적 결합 단백질을 발생시킬 수 있는, 단백질 인산화효소 A 내의 "이량체화 및 도킹(docking) 도메인"에 기초한, 소위 "독 앤드 락(dock and lock)" 분자; 또는 (5) 예를 들면, 인간 Fc 영역의 양 말단에 융합된 2개의 scFv를 포함하는 소위 스코피온(Scorpion) 분자일 수도 있다. 이중특이적 항체의 제조에 유용한 플랫폼의 예로는 BiTE(마이크로멧(Micromet)), DART(마크로게닉스(MacroGenics)), Fcab 및 Mab2(F-star), Fc-조작된 IgG1(젠코르(Xencor)) 또는 듀오바디(DuoBody)(Fab 아암 교환에 기초함, 젠맙(Genmab))가 있으나 이들로 한정되지 않는다.
용어 "에피토프"는 항체가 결합하는 항원 상의 부위를 지칭한다. 에피토프는 하나 이상의 단백질의 3차 폴딩에 의해 병치된 인접 아미노산들 또는 비-인접 아미노산들로부터 형성될 수 있다. 인접 아미노산들로부터 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매에의 노출 시 보유되지만, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매를 사용한 처리 시 상실된다. 에피토프는 전형적으로 독특한 공간적 입체구조에서 3개 이상, 보다 통상적으로 5개 이상 또는 8개 내지 10개의 아미노산을 포함한다. 에피토프의 공간적 입체구조를 확인하는 방법은 예를 들면, x-선 결정학 및 2차원적 핵 자기 공명을 포함한다. 예를 들면, 문헌(Epitope Mapping Protocols, in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996))을 참조한다.
동일한 또는 중첩되는 에피토프를 인식하는 항체는 또 다른 항체와 표적 항원의 결합과 경쟁하는 한 항체의 능력을 보여주는 단순한 면역분석에서 확인될 수 있다. 항체의 에피토프는 그의 항원에 결합된 항체의 x-선 결정학으로 접촉 잔기를 확인함으로써 정의될 수도 있다. 대안적으로, 2개의 항체들은 한 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 항원 내의 모든 아미노산 돌연변이들이 다른 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우 동일한 에피토프를 갖는다. 2개의 항체들은 한 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 몇몇 아미노산 돌연변이들이 다른 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우 중첩되는 에피토프를 갖는다.
항체들 사이의 경쟁은 시험되는 항체가 기준 항체와 공통된 항원의 특이적 결합을 억제하는 분석에 의해 측정된다(예를 들면, 문헌(Junghans et al., Cancer Res. 50:1495, 1990) 참조). 과량(예를 들면, 2배, 5배, 10배, 20배 또는 100배 이상)의 시험 항체가 경쟁 결합 분석에서 측정되었을 때 기준 항체의 결합을 50% 이상, 예를 들면 75%, 90% 또는 99% 이상 억제하는 경우 시험 항체는 기준 항체와 경쟁한다. 경쟁 분석에 의해 확인된 항체(경쟁하는 항체)는 기준 항체에 의해 결합되는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 입체장애가 일어날 정도로 기준 항체에 의해 결합된 에피토프에 충분히 가까이 위치하는 인접 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다.
"환자"는 예방적 또는 치유적 치료를 제공받는 인간 또는 다른 포유동물 대상체를 포함한다.
아미노산 치환을 보존적 또는 비-보존적 치환으로서 분류하기 위해, 아미노산은 다음과 같이 나누어진다: 군 I(소수성 측쇄): met, ala, val, leu, ile; 군 II(중성 친수성 측쇄): cys, ser, thr; 군 III(산성 측쇄): asp, glu; 군 IV(염기성 측쇄): asn, gln, his, lys, arg; 군 V(쇄 배향에 영향을 미치는 잔기): gly, pro; 및 군 VI(방향족 측쇄): trp, tyr, phe. 보존적 치환은 동일한 클래스 내의 아미노산들 사이의 치환을 포함한다. 비-보존적 치환은 이들 클래스들 중 한 클래스의 구성원을 또 다른 클래스의 구성원으로 교환하는 것을 구성한다.
백분율 서열 동일성은 카바트 넘버링 약정에 의해 최대로 정렬된 항체 서열들에 의해 측정된다. 정렬 후, 대상 항체 영역(예를 들면, 중쇄 또는 경쇄의 전체 성숙 가변 영역)이 기준 항체의 동일한 영역과 비교되는 경우, 대상 항체 영역과 기준 항체 영역 사이의 백분율 서열 동일성은 대상 항체 영역 및 기준 항체 영역 둘다에서 동일한 아미노산에 의해 점유된 위치의 수를 상기 2개의 영역들의 정렬된 위치의 총 수(갭(gap)의 수는 포함되지 않음)로 나누고 백분율로 전환하기 위해 100을 곱하여 얻은 값이다.
하나 이상의 언급된 요소를 "포함하는" 조성물 또는 방법은 구체적으로 언급되지 않은 다른 요소를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체를 포함하는 조성물은 항체를 단독으로 또는 다른 성분과 함께 함유할 수 있다.
값의 범위의 표기는 상기 범위 내에 있거나 상기 범위를 한정하는 모든 정수, 및 상기 범위 내의 정수에 의해 한정된 모든 하위범위를 포함한다.
문맥으로부터 달리 자명하지 않은 한, 용어 "약"은 언급된 값의 SEM(standard margin of error of measurement) 내의 값을 포괄한다.
대상체가 하나 이상의 공지된 위험 인자(예를 들면, 유전적, 생화학적, 가족력, 상황적 노출)를 갖고, 이 위험 인자를 갖는 개체가 상기 위험 인자를 갖지 않는 개체보다 질환을 발달시킬 통계적으로 유의한 보다 큰 위험에 놓이게 되는 경우, 개체는 질환의 증가된 위험에 있다.
용어 "증상"은 환자에 의해 감지되는 질환의 주관적 증거, 예컨대, 변경된 보행을 지칭한다. "징후"는 의사에 의해 관찰된 질환의 객관적인 증거를 지칭한다.
통계학적 유의성은 p≤0.05를 의미한다.
"인지 기능"은 정신적 과정, 예컨대, 임의의 또는 모든 주의, 기억, 생산 및 언어 이해, 문제 해결, 및 자신의 주변 및 자기 관리에 관심을 갖는 것을 지칭한다.
"향상된 인지 기능" 또는 "개선된 인지 기능"은 기준, 예를 들면, 진단 또는 치료의 개시에 비해 상대적인 개선을 지칭한다. "인지 기능의 감퇴"는 이러한 기준에 비해 상대적인 기능의 감소를 지칭한다.
동물 모델 시스템, 예컨대, 래트 또는 마우스에서, 인지 기능은 대상체가 공간적 정보를 이용하는 미로(예를 들면, 모리스 물 미로, 바네스(Barnes) 원형 미로, 상승된 방사형 아암 미로, T 미로 등), 공포 조건화, 능동적 회피, 조명된 개방 필드, 암시야 활동 미터, 상승된 플러스-미로, 2-구획 탐사 검사 또는 강요된 수영 검사를 이용하는 것을 포함하는 방법으로 측정될 수 있다.
인간에서, 인지 기능은 여러 표준화된 검사들 중 하나 이상의 표준화된 검사에 의해 측정될 수 있다. 인지 기능에 대한 검사 또는 분석의 예는 문헌(Ruoppila, l. and Suutama, T. Scand. J. Soc. Med. Suppl. 53,44-65, 1997)에 기재되었고, 표준화된 심리 검사(예를 들면, 웩슬러(Wechsler) 기억 스케일, 웩슬러 성인 지능 스케일, 레이븐 표준 누진 행렬, 샤이에-써스톤(Schaie-Thurstone) 성인 정신 능력 검사), 신경심리 검사(예를 들면, 루리아-네브라스카(Luria-Nebraska)), 초인지 자가 평가(예를 들면, 초기억 설문지), 시각-공간 스크리닝 검사(예를 들면, 포펠레우터(Poppelreuter) 숫자, 시계 인식, 벌집 도형 및 약분), 인지 스크리닝 검사(예를 들면, 폴스테인 간이 정신 상태 검사) 및 반응 시간 검사를 포함한다. 인지 성능에 대한 다른 표준 검사는 알쯔하이머병 평가 스케일-인지 서브스케일(ADAS-cog); 변화 스케일의 전반적인 임상 인상(CIBIC-플러스 스케일); 일상 생활 스케일의 알쯔하이머병 상호협력 연구 활동(ADCS-ADL); 간이 정신 상태 검사(MMSE); 신경행동정신검사(NPI); 임상 치매 등급화 스케일(CDR); 캠브리지 신경정신 검사 자동화된 배터리(CANTAB) 또는 산도즈(Sandoz) 임상 평가-노인병(SCAG), 스트룹(Stroop) 검사, 선로 잇기, 웩슬러 숫자 외우기 및 코그스테이트(CogState) 전산화 인지 검사를 포함한다. 추가로, 인지 기능은 영상화 기법, 예컨대, 양전자 방출 단층촬영(PET), 기능성 자기 공명 영상화(fMRI), 단일 광자 방출 전산화 단층촬영(SPECT), 또는 뇌 기능을 측정할 수 있게 하는 임의의 다른 영상화 기법을 이용함으로써 측정될 수 있다.
본 발명의 상세한 설명
I. 일반적 설명
본 발명은 인간화된 1H7 항체(Hu1H7 항체)를 제공한다. 상기 항체는 루이소체 질환의 치료 및 진단에 유용하다.
II. 표적 분자
천연 인간 야생형 알파-시누클레인은 하기 아미노산 서열을 갖는, 140개 아미노산으로 구성된 펩티드이다:
(Uda et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:11282-6, 1993; 진뱅크(GenBank) 수탁번호: P37840). 상기 단백질은 3개의 인식된 도메인, 즉 아미노산 1 내지 61을 커버하는 KTKE 반복부 도메인, 약 아미노산 60부터 95까지 걸쳐 있는 NAC(비-아밀로이드 성분) 도메인, 및 약 아미노산 98부터 140까지 걸쳐 있는 C 말단 산성 도메인을 갖는다. 옌센(Jensen) 등은 하기 아미노산 서열을 갖는 NAC를 보고하였다:
(Jensen et al., Biochem. J. 310 (Pt 1): 91-94, 1995; 진뱅크 수탁 번호 S56746). 우에다(Uda) 등은 하기 아미노산 서열을 갖는 NAC를 보고하였다:
문맥으로부터 달리 자명하지 않은 한, 알파-시누클레인 또는 이의 단편의 언급은 상기 표시된 천연 인간 야생형 아미노산 서열, 및 이의 인간 대립형질 변이체, 특히 루이소체 질환과 관련된 인간 대립형질 변이체(예를 들면, E46K, A30P 및 A53T, 이때 제1 문자는 서열번호 1의 아미노산을 표시하고, 숫자는 서열번호 1의 코돈 위치이고, 제2 문자는 대립형질 변이체의 아미노산임)를 포함한다. 이러한 변이체는 임의적으로 개별적으로 또는 임의의 조합으로 존재할 수 있다. 알파 시누클레인 응집을 향상시키는 유도된 돌연변이 E83Q, A90V 및 A76T도 개별적으로, 또는 서로 및/또는 인간 대립형질 변이체 E46K, A30P 및 A53T와 함께 존재할 수 있다.
III. 루이소체 질환
루이소체 질환(LBD)은 도파민작용성 시스템의 퇴화, 운동 변경, 인지 손상, 및 루이소체(LB)의 형성을 특징으로 한다(McKeith et al., Neurology (1996) 47:1113-24). 루이소체는 신경 세포에서 발견된 구형 단백질 침착물이다. 뇌에서 이들의 존재는 아세틸콜린 및 도파민을 포함하는 화학적 메신저의 작용을 중단시키는 뇌의 정상 기능을 파괴한다. 루이소체 질환은 (특발성 파킨슨병을 비롯한) 파킨슨병, 루이소체를 갖는 치매(DLB)로서도 공지된 확산성 루이소체 질환(DLBD), 알쯔하이머병의 루이소체 변이체, 조합된 알쯔하이머 및 파킨슨병, 및 다발성 시스템 위축증(MSA; 예를 들면, 올리브다리뇌소뇌 위축증, 줄무늬체흑색질 퇴화 및 샤이-드래거 증후군)을 포함한다. DLBD는 알쯔하이머병 및 파킨슨병 둘다의 증상을 공유한다. DLBD는 주로 루이소체의 위치에서 파킨슨병과 구별된다. DLBD에서 루이소체는 주로 피질에서 형성된다. 파킨슨병에서, 루이소체는 주로 흑질에서 형성된다. 다른 루이소체 질환은 순수 자율신경 부전, 루이소체 연하곤란, 우발적 LBD, 및 유전된 LBD(예를 들면, 알파-시누클레인 유전자, PARK3 및 PARK4의 돌연변이)를 포함한다.
IV. 본 발명의 항체
A. 결합 특이성 및 기능적 성질
본 발명의 인간화된 항체는 인간 알파 시누클레인에 특이적으로 결합한다. 몇몇 인간화된 항체의 친화성(즉, Ka)은, 예를 들면 마우스 항체(m1H7)의 친화성의 5배 또는 2배 이내일 수 있다. 몇몇 인간화된 항체는, SEM 내에서, m1H7과 동일한 친화성을 가질 수 있다. 몇몇 인간화된 항체는 마우스 1H7 항체의 친화성보다 더 큰 친화성을 갖는다. 바람직한 인간화된 항체는 동일한 에피토프에 결합하고/하거나 인간 알파 시누클레인과의 결합에 대해 m1H7 과 경쟁한다.
B. 인간화된 항체
인간화된 항체는 비-인간 "공여자"의 CDR들이 인간 "수용자" 항체 서열 내로 이식되어 있는 유전적으로 조작된 항체이다(예를 들면, 미국 특허 제5,530,101호 및 5,585,089호(Queen et al.); 미국 특허 제5,225,539호(Winter et al.); 미국 특허 제6,407,213호(Carter); 미국 특허 제5,859,205호 및 제6,881,557호(Adair); 및 미국 특허 제6,881,557호(Foote) 참조). 수용자 항체 서열은 예를 들면, 성숙 인간 항체 가변 영역 서열, 이러한 서열의 합성물, 인간 항체 가변 영역 서열의 컨센서스 서열(예를 들면, 상기 카바트(Kabat, 1991)의 경쇄 및 중쇄 가변 영역 컨센서스 서열), 또는 생식세포주 가변 영역 서열일 수 있다.
중쇄에 대한 수용자 서열의 예는 NCBI 수탁코드가 BAC02037 (GI: 21670055)인 인간 성숙 중쇄 가변 영역이다. 이 수용자 서열은 마우스 1H7 중쇄와 동일한 정규 형태를 갖는 2개의 CDR을 포함하고 중쇄 가변 영역 골격에서 65.8%의 서열 동일성을 가진다. 상이한 수용자 서열을 사용하는 경우, 이러한 수용자는, 예를 들면, 생식세포주 VH1-18로부터 유래된 또 다른 성숙 중쇄 가변 영역 또는 이 생식세포주 서열들 중 하나를 포함하는 성숙 중쇄 가변 영역 서열일 수 있다.
경쇄의 경우, 수용자 서열의 예는 NCBI 수탁코드가 AAY33358 (GI:63102905)인 경쇄 성숙 가변 영역이다. 이 수용자 서열은 마우스 1H7 경쇄와 동일한 정규 형태를 갖는 2개의 CDR을 포함하고 경쇄 가변 영역 골격에서 65.4%의 서열 동일성을 가진다. 상이한 수용자 서열을 사용하는 경우, 이러한 수용자는 바람직하게는 생식세포주 A30로부터 유래된 또 다른 성숙 경쇄 서열 또는 이 생식세포주 서열들 중 하나를 포함하는 경쇄 성숙 가변 영역 서열이다.
본 발명의 인간화된 항체는 전체적으로 또는 실질적으로 공여자 마우스 1H7 항체로부터 유래된 3개 경쇄 및 3개 중쇄 CDR들(카바트에 의해 정의됨), 및 존재하는 경우 전체적으로 또는 실질적으로 인간 항체 서열로부터 유래된 성숙 가변 영역 골격 서열 및 불변 영역을 갖는 항체이다. 마찬가지로, 인간화된 중쇄는 전체적으로 또는 실질적으로 마우스 1H7 항체의 중쇄로부터 유래된 3개의 중쇄 CDR들(카바트에 의해 정의됨), 및 존재하는 경우 전체적으로 또는 실질적으로 인간 항체 중쇄 서열로부터 유래된 성숙 중쇄 가변 서열 및 중쇄 불변 영역 서열을 갖는 중쇄이다. 마찬가지로, 인간화된 경쇄는 전체적으로 또는 실질적으로 m1H7 항체의 경쇄로부터 유래된 3개의 경쇄 CDR들(카바트에 의해 정의됨), 및 존재하는 경우 전체적으로 또는 실질적으로 인간 항체 경쇄 서열로부터 유래된 성숙 경쇄 가변 서열 및 경쇄 불변 영역 서열을 갖는 경쇄이다. CDR은 잔기들 중 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 잔기들이 m1H7의 상응하는 CDR에서 상응한 잔기들과 동일할 때 m1H7 로부터 실질적으로 유래된다. 항체 쇄의 성숙 가변 영역 골격 서열 또는 항체 쇄의 불변 영역 서열은 카바트에 의해 정의된 상응하는 잔기들 중 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 상응하는 잔기들이 동일할 때 각각 인간 성숙 가변 영역 골격 서열 또는 인간 불변 영역 서열로부터 실질적으로 유래된다.
인간 성숙 가변 영역 골격 잔기의 일부 아미노산들은 특히, CDR 입체구조 및/또는 항원과의 결합, 중쇄와 경쇄 사이의 상호작용 매개, 불변 영역과의 상호작용, 원하거나 원하지 않는 번역 후 변형에 대한 부위가 되는 것, 인간 가변 영역 서열에서 이의 위치에 대한 비통상적인 잔기가 됨에 따라 잠재적인 면역성이 되는 것에 있어 가능한 영향에 기초하여 치환을 위해 선택될 수 있다. 하기 11개의 가변 영역 골격 위치는 하기 실시예에서 추기 기술된 바와 같은 이유들 중 하나 이상을 위한 치환을 위한 후보로서 고려되어왔다(L46F, Y49C, F83A, V11L, T28S, R38K, M48I, V67A, M69L, T71A, Y91F).
다른 경우와 마찬가지로, 제1 언급된 잔기는 인간 수용자 골격 내로 카바트 CDR을 이식함으로써 형성된 인간화된 항체의 잔기이고, 제2 언급된 잔기는 이러한 잔기를 치환하는 것에 고려되는 잔기이다. 따라서 가변 골격 내에서, 제1 언급된 잔기는 인간이고 CDR 내에서 제1 언급된 잔기는 마우스(예를 들면, C97S)이다.
아미노산 치환은 CDR에서 수행될 수 있다. 한 가능한 변이는 마우스 1H7 항체의 CDR에서 특정 잔기를, 인간 CDR 서열로부터 유래한, 전형적인 예가 되는 인간화된 항체를 디자인하는 데 사용된 인간 수용자 서열의 CDR로부터 유래한 상응하는 잔기로 치환하는 것이다. 몇몇 항체에서, SDR로 지칭되는, CDR의 단지 일부인, 주로 결합에 필요한 CDR 잔기의 하위집합은, 인간화된 항체에서 결합을 보유할 필요가 있다. 항원에 접촉하지 않고 SDR 내에 존재하지 않는 CDR 잔기는 선행 연구들에 기초하여(예를 들면, CDR H2에서 잔기 H60-H65가 종종 필요하지 않음), 초티아 초가변 루프 외에 위치하는 카바트 CDR의 영역으로부터, 분자 모델링에 의해 및/또는 실험적으로, 또는 문헌(Gonzales et al., Mol. Immunol. 41:863 (2004))에 기술된 바와 같이 확인될 수 있다. 이러한 인간화된 항체에서, 공여자 CDR 잔기들 중 하나 이상이 부재하거나 전체 공여자 CDR이 누락된 위치에서, 그 위치를 점유하는 아미노산이 수용자 항체 서열에서 상응하는 위치(카바트 넘버링에 의함)를 점유하는 아미노산일 수 있다. 포함되어야 할 CDR에서 공여자 아미노산에 대한 수용자의 이러한 치환의 수는 경쟁 고려의 균형을 반영한다. 이러한 치환은 인간화된 항체에서 마우스 아미노산의 수를 감소시키고 그 결과 잠재적 면역원성을 감소시키는 잠재적 이점을 가진다. 그러나, 치환은 또한 친화성의 변화를 일으킬 수 있고, 친화성에서의 유의한 감소는 회피되는 것이 바람직하다. 치환을 위한 CDR 및 아미노산의 치환 위치는 또한 실험적으로 선택될 수 있다.
CDR 내에서 치환을 수행하는 한 이유는 마우스 잔기가 항체의 발현 또는 조립을 방해할 수 있는 번역후 수식의 부위이기 때문이다. 여기서, 마우스 1H7에서 C에 의해 점유되는 CDRH3 내의 위치 H97는, 치환 부위로서 확인된다.
상기 명시된 11개의 가변 영역 골격 복귀돌연변이 및 1개의 CDR 치환은 다수의 순열로 인간화된 1H7 항체 내로 도입될 수 있다. 이러한 항체의 중쇄 가변 영역은 하기를 포함하는 서열에 의해 나타내질 수 있다:
상기 서열에서 -X1-은 V 또는 L이고; -X2-은 S 또는 T이며; -X3-은 R 또는 K이고; -X4-은 M 또는 I이며; -X5-은 V 또는 A이고; -X6-은 M 또는 L이며; -X7-은 T 또는 A이고; -X8-은 Y 또는 F이고; -X9-은 C, M, S, 또는 T이다(서열 번호 46). 몇몇 중쇄 가변 영역에서, -X9-는 C이다. 몇몇 경쇄 가변 영역은 하기를 포함하는 서열에 의해 나타내질 수 있다:
상기 서열에서 -Z1-은 L 또는 F이고; -Z2-은 Y 또는 C이며; -Z3-은 F 또는 A 이다(서열 번호 47). 몇몇 항체에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호 46을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열 번호 47을 포함한다. 예를 들면, 서열 번호 48의 잔기, X1 및 X3은 각각 V 및 R이다. 예를 들면, 서열 번호 46의 잔기, X5-및 X7은 A이고 서열 번호 47의 잔기 Z1는 F이다. 예를 들면, 서열 번호 46의 잔기, -X4, X6, 및 X8는 각각 M, M, 및 Y이고, 서열 번호 47의 잔기 Z2 및 Z3은 각각 C 및 F이다. 예를 들면, 서열 번호 48의 잔기, X2 및 X9는 각각 T 및 C이다.
몇몇 항체들은 2개의 중쇄 치환 및 2개의 경쇄 치환을 함유한다. 예를 들면, 위치 H67은 A에 의해 점유되고, H71은 A에 의해 점유되고, 위치 L46은 F에 의해 점유되고, 위치 L49는 C에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, 중쇄 성숙 가변 영역은 서열 번호 23으로 표기된 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 경쇄 성숙 가변 영역은 서열 번호 37로 표기된 아미노산 서열을 갖는다. 예를 들면, H3L3 (Hu1H7VHv3 (서열 번호 23-Hu1H7VLv3 (서열 번호 37))에서, 중쇄 성숙 가변 영역은 서열 번호 23으로 표기된 아미노산 서열을 갖고, 경쇄 성숙 가변 영역은 서열 번호 37로 표기된 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명은, 인간화된 중쇄 성숙 가변 영역이 서열 번호 23과 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일함을 보이고 인간화된 경쇄 성숙 가변 영역이 서열 번호 37과 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 서열 동일성을 보이는 H3L3 인간화된 항체의 변이체를 제공한다. 몇몇 이러한 인간화된 항체는 H3L3의 CDR 영역에 전체적으로 또는 실질적으로 동일한 3개 중쇄 및 3개 경쇄 CDR을 포함하고, 이는 마우스 공여자 항체의 것과 동일하다. 상기 CDR 영역은 임의 기존 정의(예를 들면, 초티아)에 의해 정의될 수 있지만 바람직하게는 카바트에 의해 정의된 바와 같다.
H3L3 인간화된 항체의 몇몇 변이체는 H3L3에서 일부 또는 모든 복귀돌연변이를 보유한다. 다시 말해, 하기 사항들 중 적어도 1가지, 2가지, 3가지 또는 바람직하게는 4가지가 모두 존재한다: H67이 A에 의해 점유되는 것, 및 H71이 A에 의해 점유되는 것, L46이 F에 의해 점유되는 것, 및 위치 L49가 C에 의해 점유되는 것.
1개, 2개, 3개 이상 또는 바람직하게는 모든 4개의 H3L3의 복귀돌연변이를 보유하는 것 외에도, 인간화된 1H7 항체는 또한 가변 영역 골격에 추가 복귀돌연변이를 함유할 수 있다. 이러한 복귀돌연변이의 예는 L에 의해 점유된 H11, S에 의해 점유된 H28, K에 의해 점유된 H38, I에 의해 점유된 H48, L에 의해 점유된 H69, F에 의해 점유된 H91, 및/또는 A에 의해 점유된 L83을 포함한다. 치료제 또는 진단제를 위한 복귀돌연변이의 선택에 대하여, 일반적으로 친화성을 개선하지 않는 정도와 마우스 잔기를 더 도입하는 것이 면역원성의 위험을 증가시키는 정도를 고려해야 한다. 예를 들면, H3L1은 서열 번호 23의 중쇄 성숙 가변 영역, 및 서열 번호 33의 경쇄를 포함한다. 예를 들면, H4L1은 서열 번호 25의 중쇄 성숙 가변 영역, 및 서열 번호 33의 경쇄를 포함한다.
변이에 대한 또 다른 가능성은 상기 논의된 바와 같은 상이한 인간 수용자 서열을 사용하는 것이다. CDR 영역에서의 치환은 전술된 바와 같이, 예를 들면 위치 H97에서 가능하지만, 치료제 또는 진단제를 위한 이러한 치환을 선택하기 전에, 친화성 및 항체 발현에 대한 잠재적 효과가 고려되어야 한다.
마우스 CDRH3 내의 위치 H97이 시스테인이 아닌 경우, M, S, 또는 T에 의해 점유되는 것이 바람직하다. 몇몇 항체는 서열 번호 12의 카바트 CDR1: SYYIH; 서열 번호 13의 카바트 CDR2: WIYPGSGNTKYSEKFKG; 서열 번호 48의 카바트 CDR3: DG-X9-YGFAY(여기서 -X9-는 C, M, S, 또는 T, 보다 바람직하게는 C임)을 포함하는 인간화된 중쇄를 포함한다. 몇몇 항체는 서열 번호 15의 카바트 CDR1: KASQSVDYDGDSYMN; 서열 번호 16의 카바트 CDR2: AASNLES; 서열 번호 17의 카바트 CDR3: QQSNEDPFT를 포함하는 인간화된 경쇄를 포함한다. 몇몇 항체는 서열 번호 12, 13, 및 48의 3개 카바트 CDR를 포함하는 인간화된 중쇄 및 서열 번호 15-17의 3개 카바트 CDR를 포함하는 인간화된 경쇄를 포함한다. 몇몇 이러한 항체들에서, 인간화된 중쇄는 서열 번호 12-14의 3개의 카바트 CDR들을 포함하고 인간화된 경쇄는 서열 번호 15-17의 3개의 카바트 CDR을 포함한다.
본 발명은 추가로, 인간화된 중쇄 성숙 가변 영역이 서열 번호 19, 21, 23, 25, 및 27과 90%, 95%, 96%, 97%, 98% , 또는 99% 이상 동일하거나 100% 동일함을 보이고 인간화된 경쇄 성숙 가변 영역이 서열 번호 33, 35, 37, 및 39 중 임의 하나와 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 서열 동일성 또는 100% 동일함을 보이는 인간화된 1H7 항체를 제공한다.
전술된 다양한 순열의 11개의 가변 영역 골격 복귀돌연변이 및 1개의 CDR 돌연변이는 인간화된 1H7 항체 내로 도입될 수 있다. 몇몇 이러한 항체들에서, 위치 L46은 L 또는 F(바람직하게는 F)에 의해 점유되고/점유되거나 위치 L49는 Y 또는 C(바람직하게는 C)에 의해 점유되고/점유되거나 위치 L83은 F 또는 A에 의해 점유되고/점유되거나, 위치 H11은 V 또는 L에 의해 점유되고/점유되거나, 위치 H28은 T 또는 S에 의해 점유되고/점유되거나, 위치 H38은 R 또는 K에 의해 점유되고/점유되거나, 위치 H48은 M 또는 I에 의해 점유되고/점유되거나, 위치 H67은 V 또는 A(바람직하게는 A)에 의해 점유되고/점유되거나, 위치 H69는 M 또는 L에 의해 점유되고/점유되거나, 위치 H71은 T 또는 A(바람직하게는 A)에 의해 점유되고/점유되거나, 위치 H91은 Y 또는 F에 의해 점유되고/점유되거나, 위치 H28은 S 또는 T에 의해 점유되고/점유되거나, 위치 H97은 C 또는 M 또는 S 또는 T(바람직하게는 C)에 의해 점유된다.
몇몇 이러한 항체들에서, Hu1H7VLv1-v4 및 Hu1H7VHv1-v5 내의 일부 또는 모든 복귀돌연변이는 보유된다. 바람직하게는, 위치 L46, H67, 및 H71에서의 복귀돌연변이는 보유된다. 다시 말해, 위치 L46은 F에 의해 점유되고, 위치 H67은 A에 의해 점유되고, 위치 H71은 A에 의해 점유된다. 보다 바람직하게는, 위치 L46, L49, H67, 및 H71에서의 복귀돌연변이는 보유된다. 다시 말해, 위치 L46은 F에 의해 점유되고, 위치 L49는 C에 의해 점유되고, 위치 H67은 A에 의해 점유되고, 위치 H71은 A에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, 일부 또는 모든 중쇄 위치 H11, H28, H38, H48, H67, H69, H71, 및/또는 H91은 각각 L, S, K, I, A, L, A, 및 F에 의해 점유된다. 마찬가지로 몇몇 항체에서, 일부 또는 모든 경쇄 위치 L46, L49 및/또는 L83은 각각 F, C 및 A에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, 위치 H11, H28, H38, H48, H67, H69, H71, H91, L46, L49 및 L83 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 모든 10개 위치는 각각 L, S, K, I, A, L, A, F, F, C 및 A에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, 중쇄 성숙 가변 영역 골격 내에서 0개, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 또는 7개의 위치가 서열 번호 44에 비해 상대적으로 변화되고, 경쇄 성숙 가변 영역 골격 내에서 0개, 1개, 2개, 또는 3개의 위치가 서열 번호 45에 비해 상대적으로 변화된다. 몇몇 이러한 항체들에서, 위치 H97은 C에 의해 점유된다. 바람직하게는, 인간화된 항체는 뮤린 또는 키메라 1H7 항체의 알파-시누클레인에 대한 KD의 약 0.5 내지 2인 알파-시누클레인에 대한 KD를 갖는다.
몇몇 항체들에서, 위치 L46은 F에 의해 점유될 수 있고, 위치 H67은 A에 의해 점유될 수 있고, 위치 H71은 A에 의해 점유될 수 있고, 위치 H11은 V에 의해 점유될 수 있고, 위치 H38은 R에 의해 점유될 수 있다. 몇몇 이러한 항체들에서, 위치 L49는 Y에 의해 점유된다. 보다 바람직하게는, 몇몇 이러한 항체들에서, 위치 L49는 C에 의해 점유된다. 몇몇 이러한 항체들에서, 위치 L83은 F에 의해 점유된다. 몇몇 이러한 항체들에서, 위치 L83은 A에 의해 점유된다. 몇몇 이러한 항체들에서, 위치 H97는 C에 의해 점유된다. 몇몇 이러한 항체들에서, 위치 H28은 T 또는 S에 의해 점유되고, 위치 H48은 M에 의해 점유되고, 위치 H69는 M에 의해 점유되고, 위치 H91은 Y에 의해 점유된다. 몇몇 이러한 항체들에서, 위치 H28은 T 또는 S에 의해 점유되고, 위치 H48은 M에 의해 점유되고, 위치 H69는 M에 의해 점유되고, 위치 H91는 F에 의해 점유된다. 몇몇 이러한 항체들에서, 위치 H28은 T 또는 S에 의해 점유되고, 위치 H48은 M에 의해 점유되고, 위치 H69는 L에 의해 점유되고, 위치 H91은 Y에 의해 점유된다. 몇몇 이러한 항체들에서, 위치 H28은 T 또는 S에 의해 점유되고, 위치 H48은 M에 의해 점유되고, 위치 H69는 L에 의해 점유되고, 위치 H91은 F에 의해 점유된다. 몇몇 이러한 항체들에서, 위치 H28은 T 또는 S에 의해 점유되고, 위치 H48은 I에 의해 점유되고, 위치 H69는 M에 의해 점유되고, 위치 H91은 Y에 의해 점유된다. 몇몇 이러한 항체들에서, 위치 H28은 T 또는 S에 의해 점유되고, 위치 H48은 I에 의해 점유되고, 위치 H69는 M에 의해 점유되고, 위치 H91은 F에 의해 점유된다. 몇몇 이러한 항체들에서, 위치 H28은 T 또는 S에 의해 점유되고, 위치 H48은 I에 의해 점유되고, 위치 H69는 L에 의해 점유되고, 위치 H91은 Y에 의해 점유된다. 몇몇 이러한 항체들에서, 위치 H28은 T 또는 S에 의해 점유되고, 위치 H48은 I에 의해 점유되고, 위치 H69은 L에 의해 점유되고, 위치 H91은 F에 의해 점유된다. 몇몇 이러한 항체들에서, 위치 H11은 L에 의해 점유되고/점유되거나, 위치 H38은 K에 의해 점유되고/점유되거나, 위치 H97은 S에 의해 점유된다.
상기 항체들 중 임의에서, 다른 아미노산 치환이 성숙 가변 영역 골격에서, 예를 들면 CDR과 접촉하지 않는 잔기에서 만들어질 수 있다. 종종 변이체 인간화된 서열에서 만들어진 치환은 치환된 아미노산에 대하여 보존적이다. 몇몇 항체에서, (보존적 치환이든 아니면 보존적 치환이 아니든) Hu1H7VLv1-v4 및 Hu1H7VHv1-v5에 대한 치환은 Hu1H7VLv1-v4 및 Hu1H7VHv1-v5에 대한 발생된 항체의 결합 친화성 또는 효능, 즉 인간 알파 시누클레인에 결합하는 그의 능력에 실질적인 영향을 미치지 않는다.
변이체는 전형적으로 소수(예를 들면, 전형적으로 경쇄 또는 중쇄 성숙 가변 영역 골격, 또는 이들 둘다에서 1개, 2개, 3개, 5개 또는 10개 이하)의 치환, 결실 또는 삽입에 의해 Hu1H7VLv1-v4 및 Hu1H7VHv1-v5의 중쇄 및 경쇄 성숙 가변 영역 서열과 상이하다.
C. 불변 영역의 선택
인간화된 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 인간 불변 영역의 적어도 일부에 연결될 수 있다. 불변 영역의 선택은 부분적으로 항체 의존적 세포 매개 세포독성, 항체 의존적 세포 식균작용 및/또는 보체 의존적 세포독성이 요구되는지에 의해 좌우된다. 예를 들면, 인간 동종형 IgG1 및 IgG3은 보체 의존적 세포독성을 갖고, 인간 동종형 IgG2 및 IgG4는 이러한 세포독성을 갖지 않는다. 또한, 인간 IgG1 및 IgG3은 인간 IgG2 및 IgG4보다 더 강한 세포 매개 이펙터 기능을 유도한다. 경쇄 불변 영역은 람다 또는 카파일 수 있다. 예시적인 인간 경쇄 카파 불변 영역은 서열번호 49의 아미노산 서열을 갖는다. 서열번호 49의 N 말단 아르기닌은 누락될 수 있고, 이 경우 경쇄 카파 불변 영역은 서열번호 51의 아미노산 서열을 갖는다. 예시적인 인간 IgG1 중쇄 불변 영역은 서열번호 50의 아미노산 서열을 갖는다. 예시적인 인간 IgG2 중쇄 불변 영역은 서열번호 57의 아미노산 서열을 갖는다. 항체는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 함유하는 사량체로서, 분리된 중쇄 및 경쇄로서, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv로서, 또는 중쇄 성숙 가변 도메인과 경쇄 성숙 가변 도메인이 스페이서를 통해 연결되어 있는 단일 쇄 항체로서 발현될 수 있다.
인간 불변 영역은 상이한 개체들 사이에 동종이형(allotypic) 변이 및 이소동종이형(isoallotypic) 변이를 보인다(즉, 상기 불변 영역은 하나 이상의 다형성 위치에서 상이한 개체들에 대해 상이할 수 있다). 이소동종이형은 이소동종이형을 인식하는 혈청이 하나 이상의 다른 동종형의 비-다형성 영역에 결합한다는 점에서 동종이형과 상이하다. 따라서, 예를 들면, 중쇄 불변 영역은 IgG1 G1m1 또는 IgG1 G1m3 동종이형의 중쇄 불변 영역이고 서열 번호 52 또는 서열 번호 55의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또 다른 중쇄 불변 영역은 C 말단 리신을 결여한다는 점을 제외하고 서열 번호 52 또는 서열 번호 55의 아미노산 서열을 갖는다.
경쇄 및/또는 중쇄의 아미노 또는 카복시 말단에서 1개 또는 여러 개의 아미노산, 예컨대, 중쇄의 C 말단 리신이 분자의 일부 또는 전부에서 결실될 수 있거나 유도체화될 수 있다. 이펙터 기능, 예컨대, 보체 매개 세포독성 또는 ADCC를 감소시키거나 증가시키기 위해(예를 들면, 미국 특허 제5,624,821호(Winter et al.); 미국 특허 제5,834,597호(Tso et al.); 및 문헌(Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005, 2006) 참조), 또는 인간에서 반감기를 연장시키기 위해(예를 들면, 문헌(Hinton et al., J. Biol. Chem. 279:6213, 2004) 참조) 불변 영역에서 치환을 실시할 수 있다. 예시적인 치환은 항체의 반감기를 증가시키기 위해 위치 250에서 Gln 및/또는 위치 428에서 Leu을 포함한다(EU 넘버링이 불변 영역을 위해 이 단락에서 사용됨). 위치 234, 235, 236 및/또는 237 중 임의의 또는 모든 위치에서의 치환은 Fcγ 수용체, 특히 FcγRI 수용체에 대한 친화성을 감소시킨다(예를 들면, 미국 특허 제6,624,821호 참조). 몇몇 항체들은 이펙터 기능을 감소시키기 위해 인간 IgG1의 위치 234, 235 및 237에서 알라닌 치환을 갖는다. 임의적으로, 인간 IgG2에서 위치 234, 236 및/또는 237은 알라닌으로 치환되고 위치 235는 글루타민으로 치환된다(예를 들면, 미국 특허 제5,624,821호 참조).
몇몇 항체에서, 경쇄 불변 영역은 서열 번호 49로 표기된 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 중쇄 불변 영역은 서열 번호 52로 표기된 아미노산 서열을 갖는다. 예시적인 Hu1H7 경쇄는 서열 번호 53 또는 서열 번호 54를 갖는다. 예시적인 Hu1H7 중쇄는 서열 번호 55 또는 서열 번호 56의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 경쇄는 서열 번호 53이다. 몇몇 항체에서, 중쇄는 서열 번호 56이다.
D. 재조합 항체의 발현
항체는 재조합 발현에 의해 제조될 수 있다. 항체를 코딩하는 핵산은 원하는 유형의 세포(예를 들면, CHO 또는 Sp2/0)에서 발현되도록 코돈-최적화될 수 있다. 재조합 핵산 구축물은 전형적으로 천연적으로 관련된 또는 이종 프로모터 영역을 비롯한, 항체 쇄의 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 발현 조절 서열을 포함한다. 발현 조절 서열은 진핵 숙주 세포를 형질전환시킬 수 있거나 형질감염시킬 수 있는 벡터 내의 진핵 프로모터 시스템일 수 있다. 일단 벡터가 적절한 숙주 내로 도입되면, 상기 숙주는 뉴클레오티드 서열의 고도 발현, 및 교차반응하는 항체의 수집 및 정제에 적합한 조건 하에서 유지된다. 항체 쇄를 코딩하는 벡터 또는 벡터들은 상기 항체 쇄를 코딩하는 핵산의 카피 수의 증폭을 가능하게 하기 위해 선택 유전자, 예컨대, 디하이드로폴레이트 환원효소도 함유할 수 있다.
이. 콜라이(E. coli)는 항체, 특히 항체 단편을 발현시키기에 특히 유용한 원핵 숙주이다. 미생물, 예컨대, 효모도 발현에 유용하다. 사카로마이세스는 원하는 바의 발현 조절 서열, 복제기점, 종결 서열 등을 갖는 적합한 벡터를 갖는 효모 숙주의 한 예이다. 전형적인 프로모터는 3-포스포글리세레이트 인산화효소 및 다른 해당효소를 포함한다. 유도성 효모 프로모터는 특히, 알코올 탈수소효소, 이소사이토크롬 C, 및 말토스 및 갈락토스 이용을 담당하는 효소를 포함한다.
포유동물 세포는 면역글로불린 또는 이의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 절편을 발현시키는 데에 사용될 수 있다. 문헌(Winnacker, From Genes to Clones, (VCH Publishers, NY, 1987))을 참조한다. 온전한 이종 단백질을 분비할 수 있는 다수의 적합한 숙주 세포주들이 당분야에서 개발되었고, CHO 세포주, 다양한 COS 세포주, HeLa 세포, HEK293 세포, L 세포, 및 Sp2/0 및 NS0를 비롯한 항체 비-생성 골수종을 포함한다. 비-인간 세포를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 이들 세포들을 위한 발현 벡터는 발현 조절 서열, 예컨대, 복제기점, 프로모터, 인핸서(Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)) 및 필요한 프로세싱 정보 부위, 예컨대, 리보좀 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위 및 전사 종결서열을 포함할 수 있다. 적합한 발현 조절 서열은 내생성 유전자, 사이토메갈로바이러스, SV40, 아데노바이러스, 소 유두종바이러스 등으로부터 유래된 프로모터이다. 문헌(Co et al., J. Immunol. 148:1149 (1992))을 참조한다.
항체 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 벡터(들)가 세포 배양물 내로 도입되면, 세포 풀은 무혈청 배지에서의 생장 생산성 및 생성물 질에 대해 스크리닝될 수 있다. 그 다음, 상위 생산 세포 풀을 FACS-기초 단일 세포 클로닝으로 클로닝하여 단일클론 세포주를 발생시킬 수 있다. 배양물 ℓ 당 7.5 g 초과의 생성물 역가에 상응하는, 1일 당 세포 당 50 pg 또는 100 pg 초과의 비생산성이 유리할 수 있다. 단일 세포 클론에 의해 생성된 항체를 혼탁도, 여과 성질, PAGE, IEF, UV 스캔, HP-SEC, 탄수화물-올리고사카라이드 맵핑, 질량 분광측정 및 결합 분석, 예컨대, ELISA 또는 비아코어에 대해 시험할 수도 있다. 그 다음, 선택된 클론을 다수의 바이알 내에서 모아 후속 사용을 위해 동결된 상태로 저장할 수 있다.
일단 발현되면, 단백질 A 포획, 컬럼 크로마토그래피(예를 들면, 소수성 상호작용 또는 이온 교환), 바이러스 불활성화를 위한 낮은 pH 등을 비롯한 당분야의 표준 절차에 따라 항체를 정제할 수 있다(일반적으로, 문헌(Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982)) 참조).
항체의 상업적 생산을 위한 방법론은 코돈 최적화, 프로모터, 전사 요소 및 종결서열의 선택, 무혈청 단일 세포 클로닝, 세포 뱅킹, 카피 수의 증폭을 위한 선택 마커의 사용, CHO 종결서열, 무혈청 단일 세포 클로닝, 단백질 역가의 개선을 포함한다(예를 들면, 미국 특허 제5,786,464호, 미국 특허 제5,888,809호, 미국 특허 제6,063,598호, 미국 특허 제6,114,148호, 미국 특허 제7,569,339호, 국제 특허출원 공보 제WO2004/050884호, 국제 특허출원 공보 제WO2005/019442호, 국제 특허출원 공보 제WO2008/012142호, 국제 특허출원 공보 제WO2008/012142호, 국제 특허출원 공보 제WO2008/107388호, 및 국제 특허출원 공보 제WO2009/027471호, 및).
E. 핵산
본 발명은 전술된 임의의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산을 추가로 제공한다. 전형적으로, 상기 핵산은 성숙 중쇄 및 경쇄에 융합된 신호 펩티드(예를 들면, 서열번호 28, 30 및 40에 의해 코딩될 수 있는 서열번호 29, 31 및 41의 아미노산 서열을 갖는 신호 펩티드)도 코딩한다. 핵산 상의 코딩 서열은 코딩 서열의 발현을 보장하기 위한 조절 서열, 예컨대, 프로모터, 인핸서, 리보좀 결합 부위, 전사 종결 신호 등과 작동가능하게 연결될 수 있다. 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산은 단리된 형태로 존재할 수 있거나 하나 이상의 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 핵산은 예를 들면, 중첩되는 올리고뉴클레오티드의 고상 합성 또는 PCR에 의해 합성될 수 있다. 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산들은 예를 들면, 발현 벡터 내의 한 인접 핵산으로서 연결될 수 있거나, 별도로 존재할 수 있다(예를 들면, 그 자신의 발현 벡터 내로 각각 클로닝될 수 있다).
V. 치료 적용
본 발명은 루이소체 질환을 앓고 있거나 앓을 위험에 있는 환자에서 이러한 질환을 치료하거나 예방하는 여러 방법들을 제공한다. 치료를 받을 수 있는 환자는 현재 시누클레인병증의 증상 또는 초기 경고 징후, 예를 들면, EEG 지연, 신경심리학적 소견(우울증, 치매, 환각, 불안, 무관심, 무쾌감증), 자율신경 변화(기립 저혈압, 방광 장애, 변비, 대변 실금, 타액과다, 연하곤란, 성 기능장애, 뇌혈류의 변화), 감각 변화(후각, 통증, 색 구별 비정상적 감작), 수면 장애(REM 수면 행동 장애(RBD), 하지 불안 증후군/주기적 사지 움직임, 과다수면증, 불면증) 및 다양한 다른 징후 및 증상(피로, 복시, 흐린 시력, 지루, 체중 상실/획득)을 보이는 환자뿐만 아니라 LBD 질환을 앓을 위험에 있으나 증상을 보이지 않는 개체도 포함한다. 따라서, 본 발명의 방법은 LBD의 공지된 유전적 위험을 갖는 개체에게 예방적으로 투여될 수 있다. 이러한 개체는 이 질환을 경험한 친족을 갖는 개체, 및 유전적 또는 생화학적 마커의 분석에 의해 확인된 위험을 갖는 개체를 포함한다. PD에 대한 위험의 유전적 마커는 알파-시누클레인 또는 파킨(Parkin), UCHLI 및 CYP2D6 유전자 내의 돌연변이, 특히 알파-시누클레인 유전자의 위치 30 및 53에 존재하는 돌연변이를 포함한다. 현재 파킨슨병을 앓고 있는 개체는 안정 떨림, 근육 경직, 운동느림증 및 자세 불안정을 비롯한 그의 임상 소견으로부터 인식될 수 있다.
무증상 환자에서, 치료는 임의의 연령(예를 들면, 10대, 20대, 30대)에서 시작될 수 있다. 그러나, 통상적으로 환자가 40대, 50대, 60대 또는 70대에 도달할 때까지 치료를 시작할 필요가 없다. 치료는 전형적으로 일정한 기간에 걸친 다회 투약을 수반한다. 치료는 치료제(예를 들면, 절두된 형태의 알파-시누클레인 펩티드)에 대한 항체, 또는 활성화된 T 세포 또는 B 세포 반응을 시간의 경과에 따라 분석함으로써 모니터링될 수 있다. 반응이 실패하는 경우, 부스터 투약이 처방된다.
항체는 환자에서 유리한 치료 반응(예를 들면, 신경 및/또는 축삭 알파 시누클레인 응집체의 감소, 신경성 위축의 감소, 인지 기능의 개선, 및/또는 인지 감퇴의 복구, 치료 또는 예방)을 발생시키는 조건 하에서 투여에 의해 환자에서 루이소체 질환을 치료하거나 예방하는 데에 사용될 수 있다. 몇몇 방법들에서, 신피질 및/또는 기저핵의 신경막에서 신경성 위축의 영역이 대조군 집단에 비해 치료된 환자에서 평균 10%, 20%, 30% 또는 40% 이상 감소될 수 있다.
인지 손상, 인지 기능의 점진적인 감퇴, 뇌 형상의 변화, 및 뇌혈관 기능의 변화는 루이소체 질환을 앓고 있거나 앓을 위험에 있는 환자에서 공통적으로 관찰된다. 본 발명의 항체의 투여는 이러한 환자에서 인지 기능의 감퇴를 억제할 수 있거나 지연시킬 수 있다.
본 발명은 시냅스 밀도 및/또는 수상돌기 밀도를 보존하거나 증가시키는 방법도 제공한다. 시냅스 또는 수상돌기 밀도의 변화의 지수는 시냅스 형성(시냅토파이신) 및/또는 수상돌기(MAP2)의 마커에 의해 측정될 수 있다. 몇몇 방법들에서, 시냅스 또는 수상돌기 밀도는 건강한 대상체의 시냅스 또는 수상돌기 밀도의 수준으로 회복될 수 있다. 몇몇 방법들에서, 치료된 환자에서 시냅스 또는 수상돌기 밀도의 평균 수준은 비-치료된 대조군 환자의 집단에 비해 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30% 또는 그 이상까지 상승될 수 있다.
VI. 약학 조성물 및 치료 방법
예방적 적용에서, 항체 또는 항체를 유도하는 물질, 또는 이를 포함하는 약학 조성물이 질환의 위험을 감소시키거나 질환의 중증도를 경감시키거나, 질환의 하나 이상의 징후 또는 증상의 발병을 지연시키기에 효과적인 요법(투여의 용량, 빈도 및 경로)으로 상기 질환에 민감한 또는 다른 방식으로 상기 질환의 위험에 있는 환자에게 실시된다. 몇몇 예방적 적용에 있어서, 상기 요법은 뇌에서 알파 시누클레인 및 절두된 단편의 축적을 억제하거나 지연시키는 데에 효과적이고/이거나, 그의 독성 효과를 억제하거나 지연시키고/시키거나 행동 결핍의 발달을 억제하고/하거나 지연시키는 데에 효과적이다. 치료적 적용에 있어서, 항체 또는 항체를 유도하는 물질은 루이소체 질환의 하나 이상의 징후 또는 증상을 호전시키거나 적어도 이러한 징후 또는 증상의 추가 악화를 억제하기에 효과적인 요법(투여의 용량, 빈도 및 경로)으로 루이소체 질환을 앓는 것으로 의심되거나 이미 앓고 있는 환자에게 실시된다. 몇몇 치료적 적용에 있어서, 상기 요법은 알파 시누클레인 및 절두된 단편의 수준, 관련된 독성 및/또는 행동 결핍을 감소시키거나 적어도 이들의 추가 증가를 억제하기에 효과적이다.
요법은 치료된 개별 환자가 본 발명의 방법에 의해 치료되지 않은 필적할만한 대조군 환자 집단에서의 평균 결과보다 더 유리한 결과를 달성하는 경우 또는 보다 유리한 결과가 p < 0.05 또는 0.01, 또는 심지어 0.001 수준에서 조절된 임상 시험(예를 들면, II 기, II/III 기 또는 III 기 시험)에서 대조군 환자에 비해 치료된 환자에서 입증되는 경우 치료적으로 또는 예방적으로 효과적인 것으로 간주된다.
유효 용량은 투여 수단, 표적 부위, 루이소체 질환의 유형을 비롯한 환자의 생리학적 상태, 환자가 ApoE 보균자인지 여부, 환자가 인간인지 아니면 동물인지 여부, 투여되는 다른 약물, 및 치료가 예방적 치료인지 아니면 치유적 치료인지 여부를 비롯한 많은 상이한 인자들에 따라 달라진다.
항체에 대한 예시적인 용량 범위는 환자 체중 kg 당 약 0.01 내지 5 mg, 보다 통상적으로 0.1 내지 3 mg, 0.15 내지 2 mg, 또는 0.15 내지 1.5 mg이다. 항체는 매일, 격일마다, 주마다, 격주마다, 월마다, 분기마다, 또는 실험적 분석에 의해 결정된 임의의 다른 일정에 따라 이러한 용량으로 투여될 수 있다. 예시적인 치료는 연장된 기간, 예를 들면, 6개월 이상의 기간에 걸친 다회 투약으로의 투여를 수반한다. 추가 예시적인 치료 요법은 2주마다 1회, 월마다 1회 또는 3 내지 6개월마다 1회의 실시를 수반한다.
항체는 비경구 경로(즉, 투여된 또는 유도된 항체가 뇌 내의 의도된 부위에 도달하기 위해 혈액뇌 장벽을 횡단하는 경로)를 통해 투여될 수 있다. 투여 경로는 국소, 정맥내, 경구, 피하, 동맥내, 두개내, 경막내, 복강내, 비내 또는 근육내를 포함한다. 항체의 투여를 위한 몇몇 경로는 정맥내 및 피하이다. 이러한 유형의 주사는 가장 전형적으로 팔 또는 다리 근육에서 수행된다. 몇몇 방법들에서, 약제는 침착물이 축적되는 특정 조직 내로 직접적으로 주사된다(예를 들면, 두개내 주사).
비경구 투여를 위한 약학 조성물은 멸균 상태일 수 있고 실질적으로 등장성을 나타낼 수 있고 GMP 조건 하에서 제작될 수 있다. 약학 조성물은 유닛 투약 제형(즉, 단회 투여를 위한 투약 제형)으로 제공될 수 있다. 약학 조성물은 하나 이상의 생리학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 사용함으로써 제제화될 수 있다. 제제화는 선택된 투여 경로에 의해 좌우된다. 주사의 경우, 항체는 수용액, 바람직하게는 (주사 부위에서의 불쾌감을 감소시키기 위해) 생리학적으로 상용가능한 완충제, 예컨대, 행크 용액, 링거 용액, 또는 생리학적 식염수 또는 아세테이트 완충제 중에 제제화될 수 있다. 상기 용액은 제제화제, 예컨대, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 항체는 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들면, 멸균 발열원 무함유 물로 재구성될 동결건조된 형태로 존재할 수 있다.
본 요법은 치료되는 질환의 치료 또는 예방에 효과적인 또 다른 약제와 함께 실시될 수 있다. 예를 들면, 파킨스병의 경우, 알파 시누클레인에 대한 면역치료(국제 특허출원 공보 제WO/2008/103472호), 레보도파, 도파민 작용제, COMT 억제제, MAO-B 억제제, 아만타딘 또는 항콜린작용제가 본 요법과 함께 사용될 수 있다.
VII. 다른 적용
전술된 항체는 임상 진단 또는 치료의 상황에서, 또는 연구에서 알파-시누클레인을 검출하는 데에 사용될 수 있다. 상기 항체는 알파-시누클레인을 보유하는 세포 또는 다양한 자극에 대한 그들의 반응을 검출하는 데에 있어서 실험 연구용 연구 시약으로서 시판될 수도 있다. 이러한 용도에서, 단일클론 항체는 형광 분자, 스핀-표지된 분자, 효소 또는 방사성 동위원소로 표지될 수 있고, 알파-시누클레인에 대한 분석을 수행하는 데에 필요한 모든 시약들을 갖는 키트의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 상기 항체는 예를 들면, 친화성 크로마토그래피로 알파-시누클레인을 정제하는 데에 사용될 수도 있다.
상기 항체는 환자에서 LB를 검출하는 데에 사용될 수 있다. 이러한 방법들은 PD, 또는 뇌 내의 LB의 존재 또는 이에 대한 민감성과 관련된 다른 질환을 진단하거나 이러한 진단을 확인하는 데에 유용하다. 예를 들면, 상기 방법들은 치매의 증상을 제시하는 환자를 위해 사용될 수 있다. 상기 환자가 LB를 갖는 경우, 상기 환자는 루이소체 질환, 예컨대, 파킨슨병을 앓을 가능성이 있다. 상기 방법들은 무증상 환자를 위해 사용될 수도 있다. 루이소체, 또는 알파-시누클레인의 다른 비정상적인 침착물의 존재는 향후 증상을 보이는 질환에 대한 민감성을 표시한다. 상기 방법들은 루이소체 질환으로 이미 진단된 환자에서 질환 진행 및/또는 치료에 대한 반응을 모니터링하는 데에도 유용하다.
상기 방법들은 항체를 투여한 다음 상기 항체가 결합된 후 상기 항체를 검출함으로써 수행될 수 있다. 원하는 경우, 전장 불변 영역을 결여하는 항체 단편, 예컨대, Fab를 사용함으로써 제거 반응을 피할 수 있다. 몇몇 방법들에서, 동일한 항체가 치료 시약 및 진단 시약 둘다로서 사용될 수 있다.
진단(예를 들면, 생체내 영상화)의 경우, 항체는 정맥내 주사에 의해 환자의 체내로 투여될 수 있거나, 두개내 주사에 의해 또는 두개골을 통한 천공에 의해 뇌 내로 직접적으로 투여될 수 있다. 시약의 용량은 치료 방법의 경우의 시약 용량 범위와 동일한 범위 내에 있어야 한다. 몇몇 방법들에서 항체가 표지되지 않고 이차 표지제가 항체에 결합하는 데에 사용되지만, 전형적으로 항체는 표지된다. 표지의 선택은 검출 수단에 의해 좌우된다. 예를 들면, 형광 표지는 광학 검출에 적합하다. 상자성 표지의 사용은 수술적 중재 없는 단층촬영 검출에 적합하다. 방사성 표지는 PET 또는 SPECT의 사용을 통해 검출될 수도 있다.
진단은 표지된 좌위의 수, 크기 및/또는 강도를 상응하는 기준 값과 비교함으로써 수행된다. 기준 값은 질환을 갖지 않는 개체의 집단에서의 평균 수준을 나타낼 수 있다. 기준 값은 동일한 환자에서 측정된 이전 수준을 나타낼 수도 있다. 예를 들면, 기준 값은 치료 시작 전에 환자에서 측정된 후, 측정된 값이 기준 값과 비교될 수 있다. 기준에 비해 상대적인 값의 감소는 치료에 대한 양성 반응을 표시한다.
항체는 항-이디오타입(idiotype) 항체를 발생시키는 데에 사용될 수 있다(예를 들면, 문헌(Greenspan & Bona, FASEB J. 7(5):437-444, 1989) 및 문헌(Nissinoff, J. Immunol. 147:2429-2438, 1991) 참조). 이러한 항-이디오타입 항체는 항체로 치료된 개체에서 임상 인간-항-인간 항체(HAHA) 반응의 연구뿐만 아니라 약동학, 약력학 및 생체분포 연구에서도 사용될 수 있다. 예를 들면, 항-이디오타입 항체는 인간화된 1H7 항체의 가변 영역에 특이적으로 결합하여 약동학 연구에서 인간화된 1H7 항체를 검출하는 데에 사용될 수 있고 치료된 개체에서 인간-항-인간 항체(HAHA) 반응을 정량하는 것을 보조할 수 있다.
상기 또는 하기 인용된 모든 특허출원, 웹사이트, 다른 공개문헌, 수탁 번호 등은 각각의 개별 항목이 참고로 도입되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 표시되는 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 전체적으로 참고로 도입된다. 한 서열의 상이한 버전들이 상이한 시간에서 한 수탁 번호와 관련되어 있는 경우, 본원의 유효 출원일에 상기 수탁 번호와 관련된 버전을 의미한다. 유효 출원일은 적용가능한 경우 실제 출원일 또는 상기 수탁 번호를 언급하는 우선권 출원의 출원일 중 빠른 날을 의미한다. 마찬가지로, 한 공개문헌, 웹사이트 등의 상이한 버전들이 상이한 시간에서 공개되는 경우, 달리 표시되어 있지 않은 한, 출원의 유효 출원일에 가장 최근에 공개된 버전을 의미한다. 구체적으로 달리 표시되어 있지 않은 한, 본 발명의 임의의 특징, 단계, 요소, 실시양태 또는 양태는 임의의 다른 특징, 단계, 요소, 실시양태 또는 양태와 함께 사용될 수 있다. 본 발명이 간결성 및 이해를 목적으로 예증 및 예시에 의해 다소 상세히 기재되어 있지만, 일부 변화 및 변경이 첨부된 특허청구범위 내에서 실시될 수 있다는 것이 자명할 것이다.
실시예
실시예 I. 인간화된 1H7 항체의 설계
인간화를 위한 출발점 또는 공여자 항체는 ATCC 수탁 번호 PTA-8220를 갖는 하이브리도마에 의해 생산되는 마우스 항체 1H7이며, US2009/0208487로 공개된 미국 특허 출원 제11/710,248호에 기술되어 있다. m1H7의 완전한 중쇄 가변 아미노산 및 핵산 서열은 각각 서열 번호 4 및 5로 제공된다. m1H7의 완전한 경쇄 가변 아미노산 및 핵산 서열은 각각 서열 번호 6 및 7로 제공된다. 성숙 m1H7의 중쇄 가변 아미노산 및 핵산 서열은 각각 서열 번호 8 및 9로 제공된다. 성숙 m1H7의 경쇄 가변 아미노산 및 핵산 서열은 각각 서열 번호 10 및 11로 제공된다. 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열은 각각 서열 번호 12, 13 및 14로 제공된다. 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열은 각각 서열 번호 15, 16 및 17로 제공된다. 카바트 넘버링이 이 실시예에서 내내 사용되었다.
m1H7의 가변 카파(Vk)는 인간 카바트 하위군 1에 상응하는 마우스 카바트 하위군 3에 속한다. 1H7의 가변 중쇄(Vh)는 인간 카바트 하위군 1에 상응하는 마우스 카바트 하위군 5a에 속한다(Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition. NIH Publication No. 91-3242, 1991). Vk에서, 15 잔기 CDR-L1은 표준 클래스 5(이 클래스에서 위치 33의 메티오닌은 일반적으로 류신임을 주지하라)에 속하고, 7 잔기 CDR-L2는 표준 클래스 1에 속하며, 9 잔기 CDR-L3는 표준 클래스 1에 속한다(Martin & Thornton, J Mol Biol. 263:800-15, 1996). 5 잔기 CDR-H1은 표준 클래스 1에 속하고, 17 잔기 CDR-H2는 표준 클래스 2에 속한다(Martin & Thornton, J Mol Biol. 263:800-15, 1996). CDR-H3는 표준 클래스를 갖지 않으나, 8 잔기 루프는 문헌[Shirai et al., FEBS Lett. 455:188-97 (1999)]의 규칙에 따라 구부러진(kinked) 염기를 가질 것이다.
카파 사슬 중 F46이 일반적으로 류신이라는 것을 제외하고는, Vk와 Vh 도메인 사이의 계면에서의 잔기는 통상적으로 발견되는 것이다. 이는 이 위치를 복귀돌연변이가 일어날 가능성이 있는 위치이게 한다. 1H7의 대략적인 구조적 모델을 제공할 구조를 발견하기 위해, PDB 데이터베이스에서 단백질 서열에 대해 검색을 행하였다(Deshpande et al., Nucleic Acids Res. 33: D233-7, 2005). 0.5B 항HIV 항체는 1H7 Vk에 대해 양호한 전반적 서열 유사성을 가지면서, 루프에 있어 동일한 표준 구조를 보유한다. 0.5B 항HIV 항체의 NMR 구조(pdb code 1QNZ; Tugarinov et al., Structure 8:385-95, 2000)를 모델링에서 Vk 구조에 사용하였다. 항-알파-(2→8)-폴리시알산 항체는 1H7 Vh 구조에 대해 양호한 전반적 서열 유사성을 갖는다. 이것은 또한, 구부러진 염기와 유사한 길이의 CDR-H3를 갖는다. 항-알파-(2→8)-폴리시알산 항체의 구조(1PLG; Evans et al., Biochemistry 34:6737-44, 1995)는 적당한 해상도(2.8A)를 가지며, 모델링에서 Vh 구조에 사용하였다. 또한, 항-알파-(2→8)-폴리시알산 항체의 CDR-H1 및 H2는 1H7 Vh와 동일한 표준 구조를 갖는다. DeepView/Swiss-PdvViewer 3.7(SP5)(Guex & Peitsch, Electrophoresis 18: 2714-2723, 1997)를 사용하여 1H7fv의 대략적 구조를 모델링하였다.
NCBI로부터 비중복 단백질 서열 데이터베이스를 검색함으로써, 뮤린 CDR이 이식될 적합한 인간 골격을 선택할 수 있다. Vk에 있어서는, NCBI 수탁 코드 AAY33358(GI:63102905; 서열 번호 43)을 갖는 인간 카파 경쇄(Kramer et al., Eur J Immunol. 35:2131-45, 2005)를 선택하였다. 이것은 CDR-L2 및 L3에 대해 동일한 표준 클래스를 가지며, 인간 카파 생식세포주 A30에 속하고, 카바트 인간 카파 하위군 1의 일원이다. AAY33358은 뮤린 1H7 경쇄에 대해 경쇄 가변 영역 골격에서 65.4%의 서열 동일성을 갖는다. Vh에 있어서는, 인간 중질 생식세포주 VH1-18에 속하는, 인간 Ig 중쇄 BAC02037(GI:21670055; 서열 번호 42)을 선택하였다. 이것은 카바트 인간 중질 하위군 1의 일원이다. 이것은 1H7 CDR-H1 및 H2의 표준형을 공유하며, H3은 예상되는 구부러진 염기와 함께 8 잔기 길이이다. BAC02037은 뮤린 1H7 중쇄에 대해 가변 영역 골격에서 65.8%의 서열 동일성을 갖는다. 복귀돌연변이 또는 CDR 돌연변이를 갖지 않는 인간화된 1H7 중쇄 및 경쇄 가변 서열이 서열 번호 44∼45로서 제공된다.
상이한 순열의 상기 치환들(각각 Hu1H7VLv1-v4; 서열 번호 32∼39, 및 Hu1H7VHv1-v5; 서열 번호 18∼27)(도 1∼2 및 표 1)을 함유하는 4개의 인간화된 경쇄 가변 영역 변이체 및 5개의 인간화된 중쇄 가변 영역 변이체를 작제하였다. 서열 번호 19, 21, 23, 25, 27, 33, 35, 37 및 39는 표 1에 나타낸 바와 같은 복귀돌연변이를 포함한다. 또한, 두 인간화된 중쇄(서열 번호 25, 27)는 중쇄 CDR3의 위치 H97(카바트 넘버링)에 C→S 돌연변이를 포함한다(도 1∼2 및 표 1). Hu1H7VLv1-v4 및 Hu1H7VHv1-v5 중 L46, L49, L83, H11, H28, H38, H48, H67, H69, H71, H91 및 H97에서의 아미노산을 표 2에 나열한다.
H3L3 변이체[u1H7VHv3(서열 번호 23)-Hu1H7VLv3(서열 번호 37)]는, SEM 내에서 마우스 1H7과 동일하게, 가장 낮은 해리 상수(가장 높은 회합 상수)를 나타내는 것을 발견하였다.
치환의 대상으로서 상기 위치를 선택하는 이유는 다음과 같다.
L46F(다른 경우에서와 같이 여기서도 골격 복귀돌연변이를 위한 것, 첫째로 언급된 잔기는 인간 잔기이며, 둘째는 마우스 잔기임): 이 위치는 Vk/Vh 계면 잔기이다.
Y49C: 이 위치의 시스테인은 마우스 또는 인간 서열에서 흔치 않다. 항원 결합 부위의 중심에 위치를 가지면서, 이 잔기는 항원을 결합하거나, 루프의 형태를 유지할 수 있다.
F83A: 인간 골격에서, 이 위치는 보다 큰 아미노산인 페닐알라닌에 의해 점유된다. 따라서, A83은 인간 골격에서 흔치 않을 수 있다. 인간화된 항체에서, 불변 도메인은 마우스가 아닌 인간일 것이므로, 인간 F83는 흔치 않을 것이다. 그러나, Vk 중 이 위치는 불변 도메인에 아주 근접하며, 불변 영역에 대한 팩킹을 저해할 수 있다. 따라서, 이것을 A로 복귀돌연변이시켜서 차이가 있는지 확인하는 것이 흥미로울 수 있다.
V11L: 이 위치는 불변 도메인과 접촉하며, 따라서 결합 부위의 토포그래피를 바꿀 수 있다.
T28S: 이 위치는 CDR-H1 형태에 기여하나, 항원을 결합할 수도 있다. T→S 돌연변이는 보존적 돌연변이이다.
R38K: 이 위치는 CDR-H2 아래에 있으며, 모델에서 F63과 상호작용한다. R→K 돌연변이는 보존적 돌연변이이다.
M48I: 이 위치는 모델에서 CDR-H2 중 F63 아래에 있다. M→I 돌연변이는 보존적 돌연변이이다.
V67A: 이 위치는 CDR-H2 아래에 있다. V→A 돌연변이는 보존적 돌연변이가 아니다.
M69L: 이 위치는 CDR-H2 아래에 있다. M→L 돌연변이는 보존적 돌연변이이다.
T71A: 이 위치는 CDR-H2에 있어 표준 잔기이다. T→A 돌연변이는 보존적 돌연변이가 아니다.
Y91F: 이 위치는 경쇄에서 P44와 상호작용하는 계면 잔기이다. Y→F 돌연변이는 보존적 돌연변이이다.
C97S: CDRH3 중 이 CDR 돌연변이는 시스테인의 번역후 변형을 방지한다.
>Hu1H7Vκ 버전 1
>Hu1H7Vκ 버전 2
>Hu1H7Vκ 버전 3
>Hu1H7Vκ 버전 4
>Hu1H7vh 버전 1
>Hu1H7vh 버전 2
>Hu1H7vh 버전 3
>Hu1H7vh 버전 4
>Hu1H7vh 버전 5
실시예 II. 뮤린, 키메라 및 인간화된 1H7 항체의 결합 역학 분석
Hu1H7VHv1-5로부터 선택된 중쇄 및 Hu1H7VLv1-4로부터 선택된 경쇄를 포함하는 인간화된 1H7 항체의 결합 역학을 특징지었다.
비아코어(Biacore)를 이용하여 항체의 비아코어 완전 결합 역학 분석을 실시하였다. 상세한 결합 역학 파라미터[회합 속도(ka), 해리 속도(kd) 및 친화 상수(KD)]를 뮤린 1H7(도 3a), 키메라 1H7(도 3b) 및 인간화된 1H7(Hu1H7VHv3-Hu1H7VLv3, Hu1H7VHv3-Hu1H7VLv1, Hu1H7VHv4-Hu1H7VLv1) 항체(도 3c)에 대해 구하였다. 인간화된 1H7, 특히 Hu1H7VHv3-Hu1H7VLv3의 결합 역학 파라미터는 뮤린 1H7의 그것과 유사하다.
* 다른 인간화된 1H7 항체 또는 뮤린/키메라 1H7에 대한 분석에서 사용된 것들과 유사한 농도에서는 Hu1H7VHv4-Hu1H7VLv4에 대해 결합 역학 파라미터를 구할 수 없었다.
인간화된 1H7 항체의 결합 역학 또한, ForteBio Octet QK 계기(미국 캘리포니아주 멘로 파크 소재의 ForteBio)를 사용하여 바이오층 간섭법(bio-layer interferometry: BLI)으로 측정하였다. 상세한 결합 역학 파라미터[회합 속도(겉보기 ka), 해리 속도(겉보기 kd) 및 친화 상수(겉보기 KD)]를 키메라 1H7 및 다양한 인간화된 1H7 항체에 대하여 구하였다(표 6∼7, 도 4a∼4c). 겉보기 ka, 겉보기 kd 및 겉보기 KD는 ForteBio 분석 방식을 이용하여 얻은 결합 역학 파라미터이다. 이들 파라미터는, 예컨대 ForteBio 분석 방식과 연관된 결합활성 효과로 인해, 비아코어 분석법을 이용하여 측정한 ka, kd 및 KD와는 상이하다.
인간화된 1H7 항체, 특히 Hu1H7VHv3-Hu1H7VLv3 및 Hu1H7VHv3-Hu1H7VLv1은, 뮤린 1H7의 염색 패턴과 유사한, 형질전환 또는 비형질전환 마우스 뇌의 다양항 영역(예를 들어, 선조체, 추상 세포층, 피질, 흑질)의 염색 패턴을 나타냈다.
실시예 II. α-시누클레인 항체를 사용한 수동 면역화
이 실험의 목적은 시험관내 및 생체내 연구뿐만 아니라 행동 분석에서 α-시누클레인 항체의 효능을 측정하는 것이다. 본 발명자들은 연구 시작 시 3 내지 4개월령의 α-시누클레인 형질전환(라인 61) 암컷 마우스, α-시누클레인 넉아웃 암컷 마우스 및 야생형 암컷 마우스(n=14/군)를 사용하였다. 시험된 항체는 9E4(IgG1, 에피토프: 알파 시누클레인의 아미노산 118 내지 126), 5C1(IgG1, 에피토프: 알파 시누클레인의 아미노산 118 내지 126, c-연결제), 5D12, IgG2(SN118-126), 1H7, IgG1(SN 91-99) 및 IgG1 대조군 항체 27-1을 포함하였다. 마우스는 총 21회의 주사 동안 5개월의 기간에 걸쳐 10 mg/kg의 용량을 제공받았다. 추가로, 시상하부 내로의 인간 α-시누클레인(wt)의 일측 도입으로 인간 α-시누클레인(wt)을 발현하는 렌티바이러스(LV)를 동물에게 주사하였다.
판독 항체는 케미콘(Chemicon)으로부터의 항체(에피토프: 전장 알파 시누클레인), 밀리포어(Millipore)로부터의 항체(에피토프: 전장 알파 시누클레인), 및 네오토프(Neotope), ELADW 105(에피토프: 전장 알파 시누클레인의 아미노산 121 내지 124)로부터의 항체를 포함한다.
종점: 생존 기간 동안 항체 역가를 측정하였다. 행동 분석은 모리스 물 미로 검사(MWW) 및 수평 광선 검사를 포함한다. 둥근 광선 검사는 다양한 직경의 2개 광선을 사용하여 수행한 운동 균형, 협동 및 보행의 검사이다. 광선 A는 보다 큰 직경(보다 용이함, 훈련 광선으로서 간주됨)이고, 광선 D는 보다 작은 직경(보다 어려움, 시험 광선으로서 간주됨)이다. 데이터는 "오류"(미끄러짐의 수/10 cm) 및 "속도"(10 cm/초로 이동하는 데에 소요되는 시간)로서 제공된다. 물 미로 수행을 10주 및 말기에 실시하였다. 하기 신경병리학 측정치를 수득하였다: 알파 시누클레인 응집, 시냅토파이신 및 MAP2. 하기 생화학 측정치를 수득하였다: 알파 시누클레인, PSD95, 및 시냅토파이신. 시냅스, 신경 및 아교 마커를 사용하여 선택된 다중표지 및 공초점 표지를 수행하였다.
결과는 5D12를 제외한 모든 항체들이 MWM 수행에서의 양성 결과뿐만 아니라 α-시누클레인 축적의 유의한 감소, 및 시냅스 및 수상돌기 밀도의 보존이라는 효과를 생성하였다는 것을 보여주었다. 9E4 항체는 시험관내 및 생체내 연구뿐만 아니라 행동 분석에서도 효과적이다. 판독은 항체가 신경/축삭 알파 시누클레인 응집체를 감소시킬 수 있다는 것을 암시한다.
행동 결과: 1H7 항체(또한, 9E4 및 5C1 항체)는 α-시누클레인 형질전환 마우스에서 물 미로 수행을 개선한 반면, 5D12는 그러하지 못하였다. 9E4 및 1H7 항체는 속도 및 오류 둘다에 의해 측정되었을 때 광선 검사에 대한 수행을 개선한 반면, 5D12 및 5C1 항체는 그러하지 못하였다(도 6).
신경병리학 결과: 9E4, 1H7 및 5C1 항체는 ELADW-105 양성 신경성 위축을 감소시킨 반면, 5D12 항체는 그러하지 못하였다. 알파 시누클레인 형질전환 마우스에서, 9E4 항체는 대조군에 비해 신경망 영역을 신피질에서 43%까지 감소시켰고 기저핵에서 40%까지 감소시켰다. 9E4 항체는 신피질 및 기저핵에서 시냅토파이신 및 MAP2도 보존하였다.
기탁
하기의 단일클론 항체 생산 세포주는 부다페스트 조약에 의거하여, 명시한 날짜에 미국 배양 세포 계통 보존 기관(American Type Culture Collection: ATCC, 미국 20108 버지니아주 머내서스 P.O. Box 1549 소재)에 기탁하였다:
첨부의 청구 범위의 개념 또는 범위를 벗어나지 않고, 그에 다수의 변화 및 변형이 이루어질 수 있음이 당업자에게 명백해질 것이다. 맥락으로부터 달리 명백하지 않은 한, 임의의 단계, 특성, 실시양태 또는 양태가 임의의 다른 하나와 병용될 수 있다. 이 명세서에 언급된 모든 공개 공보 및 특허 출원은, 각 개개의 공개 공보 또는 특허 출원이 구체적 및 개별적으로 참고로 인용된 것으로 명시된 경우와 동일한 정도로 본원에 참고로 인용되어 있다.
서열 목록
서열 번호 1 천연 인간 야생형 알파-시누클레인
서열 번호 2 Jensen 등에 의해 보고된 바와 같은 알파-시누클레인의 비-아밀로이드 성분(NAC) 도메인
서열 번호 3 Ueda 등에 의해 보고된 바와 같은 알파-시누클레인의 비-아밀로이드 성분(NAC) 도메인
서열 번호 4 m1H7 항체 중쇄 가변 뉴클레오티드 서열(신호 펩티드는 밑줄; CDR은 볼드체와 밑줄로 나타냄)
서열 번호 5 m1H7 항체 중쇄 가변 aa 서열(신호 펩티드는 밑줄; CDR은 볼드체와 밑줄로 나타냄)
서열 번호 6 m1H7 항체 경쇄 가변 뉴클레오티드 서열(신호 펩티드는 밑줄; CDR은 볼드체와 밑줄로 나타냄)
서열 번호 7 m1H7 항체 경쇄 가변 aa 서열(신호 펩티드는 밑줄; CDR은 볼드체와 밑줄로 나타냄)
서열 번호 8 성숙 m1H7 항체 중쇄 가변 뉴클레오티드 서열(CDR은 볼드체와 밑줄로 나타냄)
서열 번호 9 성숙 m1H7 항체 중쇄 가변 aa 서열(CDR은 볼드체와 밑줄로 나타냄)
서열 번호 10 성숙 m1H7 항체 경쇄 가변 뉴클레오티드 서열(CDR은 볼드체와 밑줄로 나타냄)
서열 번호 11 성숙 m1H7 항체 경쇄 가변 aa 서열(CDR은 볼드체와 밑줄로 나타냄)
서열 번호 12 m1H7 항체 중쇄 CDR1(카바트 정의)
SYYIH
서열 번호 13 m1H7 항체 중쇄 CDR2(카바트 정의)
WIYPGSGNTKYSEKFKG
서열 번호 14 m1H7 항체 중쇄 CDR3(카바트 정의)
DGCYGFAY
서열 번호 15 m1H7 항체 경쇄 CDR1(카바트 정의)
KASQSVDYDGDSYMN
서열 번호 16 m1H7 항체 경쇄 CDR2(카바트 정의)
AASNLES
서열 번호 17 m1H7 항체 경쇄 CDR3(카바트 정의)
QQSNEDPFT
서열 번호 18 Hu1H7VHv1 (뉴클레오티드 서열)
서열 번호 19 Hu1H7VHv1(아미노산 서열)(CDR은 볼드체와 밑줄로 나타냄)
서열 번호 20 Hu1H7VHv2(뉴클레오티드 서열)
서열 번호 21 Hu1H7VHv2(아미노산 서열)(CDR은 볼드체와 밑줄로 나타냄)
서열 번호 22 Hu1H7VHv3(뉴클레오티드 서열)
서열 번호 23 Hu1H7VHv3(아미노산 서열)(CDR은 볼드체와 밑줄로 나타냄)
서열 번호 24 Hu1H7VHv4(뉴클레오티드 서열)
서열 번호 25 Hu1H7VHv4 (아미노산 서열) (CDR은 볼드체와 밑줄로 나타냄)
서열 번호 26 Hu1H7VHv5(뉴클레오티드 서열)
서열 번호 27 Hu1H7VHv5(아미노산 서열)(CDR은 볼드체와 밑줄로 나타냄)
서열 번호 28 Hu1H7VH 신호 펩티드(뉴클레오티드 서열)
서열 번호 29 Hu1H7VH 신호 펩티드(아미노산 서열)
서열 번호 30 Hu1H7VH 신호 펩티드(뉴클레오티드 서열)
서열 번호 31 Hu1H7VH 신호 펩티드(아미노산 서열)
서열 번호 32 Hu1H7VLv1(뉴클레오티드 서열)
서열 번호 33 Hu1H7VLv1(아미노산 서열)(CDR은 볼드체와 밑줄로 나타냄)
서열 번호 34 Hu1H7VLv2(뉴클레오티드 서열)
서열 번호 35 Hu1H7VLv2(아미노산 서열)(CDR은 볼드체와 밑줄로 나타냄)
서열 번호 36 Hu1H7VLv3(뉴클레오티드 서열)
서열 번호 37 Hu1H7VLv3(아미노산 서열)(CDR은 볼드체와 밑줄로 나타냄)
서열 번호 38 Hu1H7VLv4(뉴클레오티드 서열)
서열 번호 39 Hu1H7VLv4(아미노산 서열)(CDR은 볼드체와 밑줄로 나타냄)
서열 번호 40 Hu1H7VL 신호 펩티드(뉴클레오티드 서열)
서열 번호 41 Hu1H7VL 신호 펩티드(아미노산 서열)
서열 번호 42 BAC02037(GI-21670055) 중쇄 골격 아미노산 서열에 사용된 인간 수용자
서열 번호 43 AAY33358(GI-63102905) 경쇄 골격 아미노산 서열에 사용된 인간 수용자
서열 번호 44 Hu1H7VH 복귀돌연변이 또는 CDR 돌연변이 없음
서열 번호 45 Hu1H7VL 복귀돌연변이 또는 CDR 돌연변이 없음
서열 번호 46 Hu1H7VH 대체물
여기서, -X1-는 V 또는 L이고; -X2-는 S 또는 T이며; -X3-는 R 또는 K이고; -X4-는 M 또는 I이며; -X5-는 V 또는 A이고; -X6-는 M 또는 L이며; -X7-는 T 또는 A이고; -X8-는 Y 또는 F이며; -X9-는 C 또는 S이다.
서열 번호 47 Hu1H7VL 대체물
여기서, -Z1-는 L 또는 F이고; -Z2-는 Y 또는 C이며; -Z3-는 F 또는 A이다.
서열 번호 48 Hu1H7VH CDR3 대체물
여기서, -X9-는 C 또는 M 또는 S 또는 T, 바람직하게는 C이다.
서열 번호 49 인간화된 1H7 경쇄 불변 영역(R 포함)(v1-v4에 공통적임)
서열 번호 50 인간화된 1H7 중쇄 불변 영역(v1-v5에 공통적임) IgG1
서열 번호 51 인간화된 1H7 경쇄 불변 영역(R 포함)(v1-v4에 공통적임)
서열 번호 52 인간화된 1H7 중쇄 불변 영역(G1m3 동종이형)
서열 번호 53 인간화된 1H7 경쇄 버전 3(가변 영역 + 아르기닌을 갖는 불변 영역)
서열 번호 54 인간화된 1H7 경쇄 버전 3(가변 영역 + 아르기닌을 갖지 않는 불변 영역)
서열 번호 55 인간화된 1H7 중쇄 버전 3(가변 영역 + 불변 영역)
서열 번호 56 인간화된 1H7 중쇄 버전 3(가변 영역 + 불변 영역 G1m3 동종이형)
서열 번호 57 인간화된 1H7 중쇄 불변 영역(IgG2)
서열 번호 58 인간화된 1H7 중쇄 불변 영역(G1m1 동종이형)
SEQUENCE LISTING
<110> Nijjar, Tarlochan S.
Saldanha, Jose
<120> Humanized Antibodies that Recognize
Alpha-Synuclein
<130> 057450/429375
<140> PCT/US2013/023307
<141> 2013-01-25
<150> 61/591,835
<151> 2012-01-27
<150> 61/711,207
<151> 2012-10-08
<160> 58
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 140
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val
1 5 10 15
Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys
20 25 30
Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val
35 40 45
Val His Gly Val Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr
50 55 60
Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys
65 70 75 80
Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys
85 90 95
Lys Asp Gln Leu Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile
100 105 110
Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro
115 120 125
Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala
130 135 140
<210> 2
<211> 35
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Glu Gln Val Thr Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala
1 5 10 15
Val Ala Gln Lys Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr
20 25 30
Gly Phe Val
35
<210> 3
<211> 28
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Lys Glu Gln Val Thr Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr
1 5 10 15
Ala Val Ala Gln Lys Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser
20 25
<210> 4
<211> 405
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 4
atgggatgga gctgggtctt tatcttcctc ctgtcaggaa ctgcaggtgt ccattgccag 60
gtccagctgc agcagtctgg acctgagctg gtgaagcctg ggacttcagt gaagatatcc 120
tgcaaggctt ctggctacag cttcacaagc tactatatac actgggtgaa gcagagtcct 180
ggacagggac ttgagtggat tggatggatt tatcctggaa gtggtaatac taagtacagt 240
gagaagttca agggcaaggc cacactgact gcagacacat cctccagcac agcctacatg 300
cagctcagca gcctgacatc tgaggactct gcagtctatt tctgtgcaag agatggttgc 360
tacgggtttg cttactgggg ccaagggact ctggtcactg tctct 405
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<211> 135
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 5
Met Gly Trp Ser Trp Val Phe Ile Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Cys Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe
35 40 45
Thr Ser Tyr Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Ser
65 70 75 80
Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Gly Cys Tyr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
130 135
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<211> 393
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 6
atggagacag acacactcct gttatgggtg ctgctgctct gggttccagg ctccactggt 60
gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 120
atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg atagttatat gaactggtac 180
caacagaaac caggacagcc acccaaattc ctcatctgtg ctgcatccaa tctagaatct 240
gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 300
cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggatccattc 360
acgttcggct cggggacaaa gttggaaata aaa 393
<210> 7
<211> 131
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 7
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
20 25 30
Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser
35 40 45
Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Pro Pro Lys Phe Leu Ile Cys Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser
65 70 75 80
Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110
Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Ile Lys
130
<210> 8
<211> 345
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 8
gtccagctgc agcagtctgg acctgagctg gtgaagcctg ggacttcagt gaagatatcc 60
tgcaaggctt ctggctacag cttcacaagc tactatatac actgggtgaa gcagagtcct 120
ggacagggac ttgagtggat tggatggatt tatcctggaa gtggtaatac taagtacagt 180
gagaagttca agggcaaggc cacactgact gcagacacat cctccagcac agcctacatg 240
cagctcagca gcctgacatc tgaggactct gcagtctatt tctgtgcaag agatggttgc 300
tacgggtttg cttactgggg ccaagggact ctggtcactg tctct 345
<210> 9
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 9
Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr Ser
1 5 10 15
Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Tyr
20 25 30
Ile His Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Glu Lys Phe Lys
50 55 60
Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met
65 70 75 80
Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Gly Cys Tyr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser
115
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 10
gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60
atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg atagttatat gaactggtac 120
caacagaaac caggacagcc acccaaattc ctcatctgtg ctgcatccaa tctagaatct 180
gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240
cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggatccattc 300
acgttcggct cggggacaaa gttggaaata aaa 333
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<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 11
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Phe Leu Ile Cys Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
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<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 12
Ser Tyr Tyr Ile His
1 5
<210> 13
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 13
Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 14
Asp Gly Cys Tyr Gly Phe Ala Tyr
1 5
<210> 15
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 15
Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn
1 5 10 15
<210> 16
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 16
Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 17
Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Phe Thr
1 5
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<211> 351
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 18
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tccgagaagt tcaagggccg cgccaccctg accgccgaca cctccacctc caccgcctac 240
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 19
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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Ala Arg Asp Gly Cys Tyr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
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<211> 351
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
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caggtgcagc tggtgcagtc cggcgccgag gtgaagaagc ccggcgcctc cgtgaaggtg 60
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 21
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Ala Arg Asp Gly Cys Tyr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
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<211> 351
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 23
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
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Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 24
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 25
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
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85 90 95
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115
<210> 26
<211> 351
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 26
caggtgcagc tggtgcagtc cggcgccgag gtgaagaagc ccggcgcctc cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg cctccggcta caccttcacc tcctactaca tccactgggt gcgccaggcc 120
cccggccagg gcctggagtg gatgggctgg atctaccccg gctccggcaa caccaagtac 180
tccgagaagt tcaagggccg cgccaccatg accgccgaca cctccacctc caccgcctac 240
atggagctgc gctccctgcg ctccgacgac accgccgtgt actactgcgc ccgcgacggc 300
tcctacggct tcgcctactg gggccagggc accctggtga ccgtgtcctc a 351
<210> 27
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 27
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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115
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 28
atggagttcg gcctgtcctg gctgttcctg gtggccatcc tgaagggcgt gcagtgc 57
<210> 29
<211> 19
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 29
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys
<210> 30
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 30
atggactgga cctggagcat ccttttcttg gtggcagcag caacaggtgc ccactcc 57
<210> 31
<211> 19
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<223> Synthesized
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Met Asp Trp Thr Trp Ser Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Ala His Ser
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<220>
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<220>
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<400> 33
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Phe Leu Ile Cys Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
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Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
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Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Phe Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
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Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<220>
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<400> 37
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
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Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
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Lys Phe Leu Ile Cys Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
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Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
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<212> DNA
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<220>
<223> Synthesized
<400> 38
gacatccagc tgacccagtc cccctcctcc ctgtccgcct ccgtgggcga ccgcgtgacc 60
atcacctgca aggcctccca gtccgtggac tacgacggcg actcctacat gaactggtac 120
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<220>
<223> Synthesized
<400> 39
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
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Lys Phe Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
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tccggc 66
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Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp
1 5 10 15
Val Ser Gly Ser Ser Gly
20
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe
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Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Trp Ile Ser Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Asn Leu
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Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
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Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Asp Arg Gly Ser Met Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
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115
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<220>
<223> Synthesized
<400> 43
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 44
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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115
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<223> Synthesized
<400> 45
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
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<220>
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<220>
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<220>
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<222> 72
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<220>
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<222> 95
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<220>
<221> VARIANT
<222> 101
<223> Xaa is Cys or Ser
<400> 46
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1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Xaa Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Xaa Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Xaa
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Xaa Thr Xaa Thr Xaa Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Xaa Cys
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Ala Arg Asp Gly Xaa Tyr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
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115
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<212> PRT
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<220>
<223> Synthesized
<220>
<221> VARIANT
<222> 50
<223> Xaa is Leu or Phe
<220>
<221> VARIANT
<222> 53
<223> Xaa is Tyr or Cys
<220>
<221> VARIANT
<222> 87
<223> Xaa is Phe or Ala
<400> 47
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Xaa Leu Ile Xaa Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Xaa Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
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100 105 110
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<220>
<221> VARIANT
<222> 3
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<400> 48
Asp Gly Xaa Tyr Gly Phe Ala Tyr
1 5
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<211> 107
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 49
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 50
<211> 330
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 50
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Val Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 51
<211> 106
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 51
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1 5 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
35 40 45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65 70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
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Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<210> 52
<211> 330
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 52
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 53
<211> 218
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 53
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
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Lys Phe Leu Ile Cys Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
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Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
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Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 54
<211> 217
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 54
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
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Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Phe Leu Ile Cys Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr
100 105 110
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115 120 125
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
130 135 140
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
145 150 155 160
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
180 185 190
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 55
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Claims (100)
- 서열 번호 23에 제시된 아미노산 서열로 이루어지는 성숙 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 37에 제시된 아미노산 서열로 이루어지는 성숙 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체; 및
서열 번호 23에 제시된 아미노산 서열로 이루어지는 성숙 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 33에 제시된 아미노산 서열로 이루어지는 성숙 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체
로 이루어진 군에서 선택되는 항체로서, 상기 항체는 인간 알파-시누클레인에 특이적으로 결합하는 것인 항체. - 제1항에 있어서, 서열 번호 23에 제시된 아미노산 서열로 이루어지는 성숙 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 37에 제시된 아미노산 서열로 이루어지는 성숙 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체.
- 제1항에 있어서, 서열 번호 23에 제시된 아미노산 서열로 이루어지는 성숙 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 33에 제시된 아미노산 서열로 이루어지는 성숙 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체.
- 제1항에 있어서, 성숙 중쇄 가변 영역이 중쇄 불변 영역에 융합되고, 성숙 경쇄 가변 영역이 경쇄 불변 영역에 융합되는 것인 항체.
- 제4항에 있어서, 중쇄 불변 영역이 서열 번호 52로 표기된 아미노산 서열로 이루어지되, C-말단 리신 잔기가 누락될 수 있는 것인 항체.
- 제4항에 있어서, 경쇄 불변 영역이 서열 번호 49로 표기된 아미노산 서열로 이루어지는 것인 항체.
- 제4항에 있어서, 서열 번호 52로 표기된 아미노산 서열로 이루어지되, C-말단 리신 잔기가 누락될 수 있는 중쇄 불변 영역에 성숙 중쇄 가변 영역이 융합되고, 서열 번호 49로 표기된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 불변 영역에 성숙 경쇄 가변 영역이 융합되는 것인 항체.
- 제1항에 있어서, 성숙 경쇄가 서열 번호 53을 포함하고, 성숙 중쇄가 서열 번호 56을 포함하는 것인 항체.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 불변 영역이, 천연 인간 불변 영역에 비해 Fcγ 수용체에 대한 결합이 감소된 천연 인간 불변 영역의 돌연변이 형태인 항체.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 불변 영역이 인간 IgG1 동종형인 항체.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 정의된 성숙 중쇄 가변 영역 및 성숙 경쇄 가변 영역 중 하나 이상을 코딩하는 핵산.
- 제11항에 있어서, 서열 번호 22, 32 또는 36 중 어느 하나를 포함하는 서열로 이루어지는 핵산.
- 제11항의 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- 루이소체 질환(Lewy body disease)을 갖고 있거나 가질 위험에 있는 환자를 치료하는 방법에 사용하기 위한, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 정의된 항체를 포함하는 약학 조성물로서, 상기 방법은 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 정의된 항체를 유효한 요법(regime)으로 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 약학 조성물.
- 루이소체 질환을 갖고 있거나 가질 위험에 있는 환자에서 루이소체를 검출하는 방법에 사용하기 위한, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 정의된 항체를 포함하는 검출 제제로서, 상기 방법은 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 정의된 항체의 유효량을 상기 환자에게 투여하는 단계로서, 상기 항체가 루이소체에 결합되는 것인 단계; 및 상기 환자에서 그 결합된 항체를 검출하는 단계를 포함하는 것인 검출 제제.
- 제15항에 있어서, 항체가 표지된 것인 검출 제제.
- 제14항에 있어서, 질환이 파킨슨병인 약학 조성물.
- 제15항에 있어서, 질환이 파킨슨병인 검출 제제.
- 항체의 제조 방법으로서, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산에 의해 형질전환된 세포를 배양하여, 세포가 항체를 분비하도록 하는 단계; 및 세포 배양 배지로부터 항체를 정제하는 단계를 포함하고, 상기 항체가 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 정의된 것인 방법.
- 항체를 생성하는 세포주를 제조하는 방법으로서, 선택 마커 및 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 벡터를 세포 내로 도입하는 단계; 증가된 카피 수의 벡터를 갖는 세포를 선택하는 조건 하에서 세포를 증식시키는 단계; 선택된 세포로부터 단일 세포를 단리하는 단계; 및 항체의 수율에 기초하여 선택된 단일 세포로부터 클로닝된 세포를 모으는 단계를 포함하고, 상기 항체가 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 정의된 것인 방법.
- 제14항에 있어서, 환자의 인지 기능의 감퇴가 억제되는 것인 약학 조성물.
- 제14항에 있어서, 신경 및 축삭 알파-시누클레인 응집체 중 하나 이상이 감소되는 것인 약학 조성물.
- 제14항에 있어서, 환자의 신경성 위축(neuritic dystrophy)이 감소되는 것인 약학 조성물.
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