ES2293096T3 - Nuevos genes de la fosfotransferasa de neomicina y procedimiento para la seleccion de celulas recombinantes de produccion elevada. - Google Patents

Abstract

Gen modificado de la fosfotransferasa de neomicina, caracterizado porque el gen modificado de la fosfotransferasa de neomicina en la posición del aminoácido 91, 198 y/o 240, referida al gen de tipo silvestre, codifica un aminoácido distinto al que codifica el gen de la fosfotransferasa de neomicina de tipo silvestre.

Description

Nuevos genes de la fosfotransferasa de neomicina y procedimiento para la selección de células recombinantes de producción elevada.

Campo de la invención

La invención se refiere a nuevos genes modificados de la fosfotransferasa de neomicina así como a su uso en procedimientos de selección de células recombinantes de producción elevada. Por consiguiente, la presente invención se refiere también a nuevos vectores de expresión que comprenden un gen modificado de la fosfotransferasa de neomicina de acuerdo con la invención, preferentemente en combinación con un gen de interés ligado funcionalmente a un promotor heterólogo. La invención se refiere, además, a un procedimiento para la preparación de productos génicos heterólogos con ayuda de las células recombinantes correspondientes de producción elevada.

Antecedentes de la invención

Las células de mamífero son las células hospedadoras más preferidas para producir proteínas complejas biofarmacéuticas, porque las modificaciones post-traduccionales realizadas tanto en el sentido funcional como farmacéutico son compatibles con el ser humano. Los tipos celulares principales son los hibridomas, los mielomas, las células CHO (Chinese Hamster Ovary) y las células BHK (Baby Hamster Kidney). El cultivo de las células hospedadoras tiene lugar progresivamente bajo condiciones de producción exentas de suero y de proteínas. Las razones de ello son la reducción de costes asociada, la menor interferencia en la purificación de la proteína recombinante, así como la reducción del potencial de entrada de patógenos (p. ej., priones, virus). El uso de células CHO como células hospedadoras se extiende cada vez más porque estas células se pueden adaptar al crecimiento en suspensión en un medio exento de suero y de proteínas y, por tanto, están consideradas y aceptadas por las autoridades reguladoras como células de producción seguras.

Para obtener una línea de células de mamífero estable, que exprese un gen heterólogo de interés (GOI), se introduce por regla general el gen heterólogo junto con un gen de un marcador seleccionable, tal como p. ej., fosfotransferasa de neomicina (NPT), mediante transfección en la línea celular deseada. El gen heterólogo y el gen del marcador seleccionable se pueden expresar en una célula hospedadora, partiendo de un vector aislado o de vectores separados co-transfectados. Dos o tres días después de la transfección, las células transfectadas se trasladan a un medio que contiene un agente selectivo, p. ej., G418, empleando el gen de la fosfotransferasa de neomicina (gen-NPT), y se cultivan durante varias semanas con dichas condiciones selectivas. Las células resistentes de crecimiento elevado, en las que se ha integrado el ADN exógeno, se pueden aislar y estudiar en relación con la expresión del producto génico deseado (del GOI).

Un gran problema al establecer líneas celulares con expresión elevada de la proteína deseada es debido a la integración espontánea y no dirigida del vector recombinante en los loci activos o inactivos para la transcripción del genoma de la célula hospedadora. De este modo, se obtiene una población de células que muestran tasas de expresión totalmente distintas del gen heterólogo, obedeciendo la productividad de las células por norma general una distribución normal. Para identificar los clones celulares que muestran una expresión elevada del gen heterólogo de interés, se deben comprobar y someter a ensayo para ello una gran cantidad de clones, dando como resultado un gasto elevado de tiempo, de trabajo y de costes. La optimización del sistema de vectores empleado para la transfección tiene como fin por ello, aumentar de este modo la proporción de grandes productores en la población celular transfectada, mediante estrategias de selección adecuadas y de este modo reducir el gasto en la identificación de clones. El desarrollo de un sistema de expresión tal es objeto de la presente invención.

La enzima 3'-fosfotransferasa II de aminoglicósido (fosfotransferasa de neomicina) (EC 2.7.1.95) cuyo gen está asociado al transposón 5 en Escherichia coli, se emplea como marcador de selección en una variedad de organismos (p. ej., bacterias, levaduras, plantas y células de mamífero). Esta enzima proporciona resistencia frente a distintos antibióticos aminoglicosídicos tales como la neomicina, kanamicina y G418, al inactivar los antibióticos mediante la transferencia del fosfato terminal del ATP al grupo 3' hidroxilo del anillo I de aminohexosa.

Además de la fosfotransferasa de neomicina de tipo silvestre (NPTwt), se conocen algunos mutantes que muestran una actividad fosfotransferasa reducida y con ello una menor resistencia a antibióticos aminoglicosídicos en bacterias (Blázquez y col., 1991; Kocabiyik y col., 1992; Yenofsky y col., 1990) y en hojas de tabaco (Yenofsky y col., 1990).

Uno de esos mutantes (Glu182Asp) se empleó como marcador para la selección de células madre embrionales de la rata, integrándose el gen de la fosfotransferasa de neomicina, mediante recombinación homóloga dirigida (gene targeting), en el gen c-myc (Hanson y col., 1995). Los autores se limitan al uso de la enzima modificada para dirigirse al gen.

En el documento de solicitud de patente WO 99/53046 se describe la expresión de un gen modificado de la fosfotransferasa de neomicina (Asp261Asn) en células de mamífero de producción importante. Los autores describen en el mismo un método sin clonación para la expresión de un gen de interés en células de mamífero. Mediante la cotransfección de las células con tres fragmentos de ADN individuales que codifican un elemento promotor, un gen de interés y un marcador de selección acoplado a un elemento IRES ("internal ribosomal entry site"), se pueden extraer células mediante presión de selección dirigida, en las que se podían combinar los tres fragmentos de ADN como una unidad de transcripción bicistrónica funcional (promotor-gen de interés-IRES-gen de fosfotransferasa de neomicina). La disposición de los elementos tiene lugar ante todo en la célula transfectada, de modo que sólo una pocas células muestran la colocación adecuada de los elementos. Además, después de una amplificación génica empleando un marcador seleccionable y amplificable, no se pueden generar clones de producción elevada. Las células generadas mostraban después de múltiples selecciones y amplificaciones génicas, como máximo 6 pg de proteína por célula y día (6 pg/célula/día).

Ninguna de las publicaciones da a conocer genes de la fosfotransferasa de neomicina modificados con especial capacidad para poner a disposición un sistema de vectores de expresión elevada para células de mamífero que facilite el desarrollo de células con producción elevada para la preparación de proteínas recombinantes biofarmacéuticas que contengan varias unidades transcripcionales funcionales completas, tanto para uno o varios genes de interés como para un gen modificado de la fosfotransferasa de neomicina, con resistencia reducida a antibióticos. La estructura artificial de ADN descrita en el documento WO 99/53046 contiene únicamente un gen de la neomicina sin promotor, ligado funcionalmente con el gen de la reductasa de dihidrofolato (DHFR).

Existe, por tanto, una necesidad de poner a disposición genes modificados adecuados de la fosfotransferasa de neomicina, en especial para el desarrollo de sistemas correspondientes de vectores con expresión elevada para procesos biofarmacéuticos. Por ello, un objeto de la presente invención era poner a disposición nuevos genes modificados correspondientes de la fosfotransferasa de neomicina, vectores de expresión que contuvieran un gen modificado de la fosfotransferasa de neomicina y un gen de interés ligado funcionalmente con un promotor heterólogo, un procedimiento de selección para células recombinantes de producción elevada, preferentemente para células de mamífero y un procedimiento para la preparación de productos génicos heterólogos.

De forma sorprendente, en el marco de la presente invención se pudieron producir e identificar nuevos genes modificados de alta selectividad de la fosfotransferasa de neomicina que se caracterizaban por su especial idoneidad para la selección de células de producción elevada.

Sumario de la invención

La presente invención pone a disposición nuevos genes modificados de la fosfotransferasa de neomicina. De forma sorprendente se encontró que con el uso de los genes modificados de la fosfotransferasa de neomicina descritos ampliamente como marcadores de selección, se podía conseguir un enriquecimiento de las células de mamífero transfectadas con tasas de expresión elevadas del gen co-integrado de interés. En comparación con el uso de la fosfotransferasa de neomicina de tipo silvestre como marcador de la selección, las células mostraron después de la transfección con uno de los nuevos genes de la fosfotransferasa de neomicina de acuerdo con la invención, una productividad de una proteína (un anticuerpo) aumentada de 1,4 a 14,6 veces.

En los genes modificados de la fosfotransferasa de neomicina de acuerdo con la invención se trata de mutantes que en la posición de los aminoácidos 91, 198 o 240 codifican un aminoácido distinto al que codifica el gen de tipo silvestre, o en la posición del aminoácido 182, referido al gen de tipo silvestre codifican glicina, en la posición del aminoácido 227 codifican alanina o valina y/o en la posición del aminoácido 261 codifican glicina. En una forma de realización preferida se trata, en el caso del gen de la fosfotransferasa de neomicina de acuerdo con la invención, de los mutantes Glu182Gly, Trp91Ala, Val198Gly, Asp227Ala, Asp227Val, Asp261Gly o Phe240Ile. Como especialmente adecuados para la selección de células de mamífero de producción elevada, resultó en este caso el uso de los mutantes Trp91Ala, Asp227Val, Asp261Gly y Phe240Ile, conduciendo a su vez los mutantes Asp227Val y Asp261Gly a los clones celulares con la mayor productividad y por lo que se prefieren especialmente.

La preparación de células de producción elevada se consiguió mediante el uso de un vector de expresión eucariótico que contiene un gen heterólogo de interés ligado funcionalmente a un promotor heterólogo y un gen modificado de la fosfotransferasa de neomicina de acuerdo con la invención. El vector de expresión contiene preferentemente otros elementos reguladores, por ejemplo uno o varios potenciadores ligados funcionalmente con el promotor o los promotores. Además, se prefieren los vectores de expresión que contienen adicionalmente un gen de una proteína fluorescente que está ligada funcionalmente con el gen de interés y el promotor heterólogo, preferentemente a través de un sitio de unión al ribosoma interno (IRES), el cual facilita una expresión bicistrónica del gen que codifica una proteína fluorescente y del gen que codifica una proteína/producto de interés, bajo el control del promotor heterólogo. Son especialmente adecuados los vectores de expresión en los que el gen heterólogo de interés está bajo control del promotor ubiquitina/S27a.

La invención se refiere también a vectores de expresión que en lugar del gen de interés, muestran un lugar de clonación múltiple para incorporar dicho gen, es decir, una región de la secuencia con múltiples secuencias de reconocimiento para endonucleasas de restricción.

Otro aspecto de la invención se refiere a células de mamífero recombinantes que contienen uno de los genes modificados, descritos anteriormente de acuerdo con la invención, de la fosfotransferasa de neomicina. Además, la presente invención se refiere a células de mamífero recombinantes que se han transfectado con uno de los vectores de expresión de acuerdo con la invención. En este caso, se trata preferentemente de células de roedor recombinantes, siendo especialmente preferidas las células recombinantes de hámster, como p. ej., células CHO o células BHK. En otra realización preferida, las mencionadas células recombinantes se transfectan adicionalmente con el gen de un marcador de selección amplificable, p. ej., con el gen de la reductasa de dihidrofolato (DHFR).

Adicionalmente, la invención se refiere a un procedimiento para el enriquecimiento de células recombinantes de mamífero que expresan un gen modificado de acuerdo con la invención de la fosfotransferasa de neomicina, caracterizado porque (i) un grupo de células de mamífero se transfecta con un gen de una fosfotransferasa de neomicina modificada de acuerdo con la invención que, en comparación con la fosfotransferasa de neomicina de tipo silvestre, muestra únicamente 1 a 80%, preferentemente sólo 1 a 60%, más preferentemente sólo 1,5 a 30%, aún más preferentemente sólo 1,5 a 26% de la actividad y/o muestra una de las modificaciones descritas anteriormente; (ii) las células de mamífero se cultivan bajo condiciones que permiten una expresión del gen modificado de acuerdo con la invención de la fosfotransferasa de neomicina; y (iii) las células de mamífero se cultivan en presencia de al menos un medio de selección que tiene un efecto selectivo sobre el crecimiento de las células de mamífero y favorece el crecimiento de las células que expresan el gen de la fosfotransferasa de neomicina.

Asimismo, también está de acuerdo con la invención un procedimiento para la expresión de por lo menos un gen de interés en células recombinantes de mamífero, caracterizado porque (i) un grupo de células de mamífero se transfecta por lo menos con un gen de interés y un gen de una fosfotransferasa de neomicina modificada de acuerdo con la invención que, en comparación con la fosfotransferasa de neomicina de tipo silvestre, sólo muestra 1 a 80%, preferentemente sólo 1 a 60%, más preferentemente sólo 1,5 a 30%, aún más preferentemente sólo 1,5 a 26% de la actividad y/o muestra una de las modificaciones descritas anteriormente; (ii) las células se cultivan bajo condiciones que permiten una expresión del(de los) gen(es) de interés y del gen modificado de acuerdo con la invención de la fosfotransferasa de neomicina; (iii) las células de mamífero se cultivan en presencia de por lo menos un medio de selección que tiene un efecto selectivo sobre el crecimiento de las células de mamífero y favorece el crecimiento de las células que expresan el gen de la fosfotransferasa de neomicina; y (iv) la(s) proteína(s) de interés se obtiene(n) a partir de las células de mamífero o a partir del material sobrenadante del cultivo.

Además, la presente invención se refiere a un procedimiento para obtener y seleccionar células de mamífero recombinantes que expresan por lo menos un gen heterólogo de interés, caracterizado porque (i) las células recombinantes de mamífero se transfectan con un vector de expresión de acuerdo con la invención que además del gen de interés y el gen modificado de acuerdo con la invención de la fosfotransferasa de neomicina, codifica una proteína fluorescente; (ii) las células de mamífero se cultivan bajo condiciones que permiten una expresión del(de los) gen(es) de interés, del gen modificado de acuerdo con la invención de la fosfotransferasa de neomicina y del gen que codifica una proteína fluorescente; (iii) las células de mamífero se cultivan en presencia de al menos un medio de selección que tiene un efecto selectivo sobre el crecimiento de las células de mamífero y favorece el crecimiento de las células que expresan el gen de la fosfotransferasa de neomicina; y (iv) las células de mamífero se clasifican mediante un análisis de la citometría de flujo.

En cuanto las células de mamífero fueron transfectadas adicionalmente con un gen de un marcador de selección amplificable, p. ej., el gen DHFR, es posible cultivar las células de mamífero bajo condiciones en las que también se expresa el gen del marcador de selección amplificable y añadir al medio de cultivo un medio de selección que tiene como consecuencia la amplificación del gen del marcador de selección amplificable.

Preferentemente, los procedimientos de acuerdo con la invención se realizan con células de mamífero que están adaptadas al crecimiento en suspensión, ósea con células de mamífero, que se cultivan en suspensión. Otras formas de realización se refieren a procedimientos en los que las células de mamífero, preferentemente las que están adaptadas al crecimiento en suspensión, se cultivan en condiciones exentas de suero.

Descripción de las figuras

La Figura 1 muestra una presentación esquemática de los vectores base que se emplearon para la expresión de las proteínas recombinantes en las células CHO-DG44. "P/E" se refiere a una combinación de un potenciador de CMV y un promotor ubiquitina/S27a de hámster, "P" se refiere sólo a un elemento de promotor y "T" a una señal de terminación para la transcripción que es necesaria para la poliadenilación del ARNm transcrito. La posición y la dirección de la iniciación de la transcripción dentro de cada unidad de transcripción, se señala con una flecha. Para la clonación del gen heterólogo se introduce detrás del elemento promotor una región de secuencia con múltiples puntos de corte para endonucleasas de restricción (multiple cloning sites - mcs). El marcador de selección amplificable, reductasa de dihidrofolato, se abrevia con "dhfr" y el marcador de selección, fosfotransferasa de neomicina, con "npt" (npt-de tipo silvestre o npt-mutante). El elemento IRES procedente del virus de la encefalomiocarditis, sirve como sitio de unión al ribosoma interno dentro de la unidad de transcripción bicistrónica y hace posible la traducción de la proteína fluorescente verde siguiente "GFP".

La Figura 2 muestra una presentación esquemática de los vectores de expresión eucarióticos que codifican una proteína monocatenaria (Figura 2A) o en cada caso, codifican una subunidad de un anticuerpo monoclonal (Figura 2B) y que se emplearon para la transfección de células CHO-DG44. "P/E" significa una combinación de potenciador de CMV y promotor ubiquitina/S27a de hámster, "P" significa sólo un elemento de promotor y "T" una señal de terminación para la transcripción, que es necesaria para la poliadenilación del ARNm transcrito. La posición y la dirección de la iniciación de la transcripción dentro de cada unidad de transcripción se muestran con una flecha. El marcador de selección amplificable, reductasa de dihidrofolato, se abrevia con "dhfr" y el marcador de selección de la fosfotransferasa de neomicina con "npt". Los mutantes de npt E182G (SEQ ID NO:3), E182D (SEQ ID NO:19), W91A (SEQ ID NO:5), D190G (SEQ ID NO:23), V198G (SEQ ID NO:7), D208G (SEQ ID NO:25), D227A (SEQ ID NO:9), D227V (SEQ ID NO:11), D227G (SEQ ID NO:21), D261G (SEQ ID NO:13), D261N (SEQ ID NO:15) y F240I (SEQ ID NO:17) contienen en este caso una mutación puntual que en la posición indicada dan como resultado un aminoácido alterado. El elemento "IRES" procedente del virus de la encefalomiocarditis sirve como sitio interno de unión al ribosoma dentro de la unidad de transcripción bicistrónica y hace posible la traducción de la siguiente proteína verde fluorescente "GFP", "MCP-1" codifica la proteína-1 quimiotáctica de monocitos, mientras que "HC" y "LC" codifican la cadena pesada o ligera de un anticuerpo monoclonal IgG2 humanizado.

La Figura 3 muestra un detalle de la secuencia del gen de la fosfotransferasa de neomicina (npt), en la que se han introducido mediante PCR con cebadores mutágenos, las mutaciones puntuales. Las letras mayúsculas señalan en este caso la secuencia de nucleótidos de la región codificadora de NPT, las letras minúsculas a su vez las secuencias de nucleótidos flanqueantes no codificadoras. La secuencia de aminoácidos prevista a partir de la secuencia de nucleótidos (código de 3 letras) se indica por encima de la secuencia de nucleótidos codificadores. Las flechas indican la dirección, longitud y posición del cebador empleado, señalando la flecha con trazo continuo el cebador mutágeno de avance "forward", con línea quebrada el cebador mutágeno inverso "reverse", con línea punteada el cebador Neofor5 (SEQ ID NO:27) o Neofor2 (SEQ ID NO:29), situados aguas arriba del gen npt o del sitio de la mutación y con puntos y guiones el cebador Neorev5 (SEQ ID NO:28) o IC49 (SEQ ID NO:30) situados aguas abajo del gen npt o del sitio de la mutación. Los nucleótidos intercambiados en comparación con la secuencia de tipo silvestre se destacan por encima o por debajo de las flechas.

En la Figura 4 se presentan los dominios conservados y la posición de las mutaciones de NPT introducidas, dentro de la secuencia de aminoácidos de NPT. Basándose en las homologías de las secuencias entre distintas enzimas que modifican aminoglicósidos, se identificaron distintos dominios conservados dentro de la secuencia de proteínas de NPT (con fondo gris). Los tres motivos en la región C-terminal de la enzima tienen evidentemente funciones especiales. Los motivos 1 y 2 están probablemente implicados en la transferencia catalítica del fosfato terminal durante la catálisis del ATP o en la unión a nucleótidos, mientras que al motivo 3 se le atribuye una función en la hidrólisis del ATP y/o los cambios conformacionales en el complejo enzima-aminoglicósido. Los aminoácidos que aparecen en por lo menos 70% de las enzimas que modifican aminoglicósidos, se destacan con negrita. Los aminoácidos subrayados una vez se ordenan en base a la similitud de los grupos iguales y aparecen en por lo menos el 70% de las enzimas que modifican aminoglicósidos. Los aminoácidos marcados con una estrella reproducen la posición de los sitios de mutación.

La Figura 5 muestra la influencia de las mutaciones de NPT sobre la selección de células transfectadas de forma estable que expresan MCP-1. Para ello, células CHO-DG44 se transfectaron con los vectores pBIN-MCP1, pKD-N5-MCP1 o pKS-N8-MCP1 (Fig. 2A) que contenían como marcador de selección NPT de tipo silvestre (WT) o los mutantes de NPT Glu182Asp o Asp227Gly. Para la selección de las células transfectadas de forma estable se añadió al medio 400 \mug/ml o también 800 \mug/ml de G418 como agente selectivo. La concentración de la proteína recombinante producida MCP-1 en el material sobrenadante del cultivo celular, se determinó mediante ELISA y se calculó la productividad específica por célula y día. Cada columna representa de este modo el valor medio de la productividad específica o del título de cada uno de los 18 grupos a través de cuatro pases por cultivos en placas de 6 pocillos.

En la Figura 6 se estudió la influencia de las mutaciones de NPT sobre la selección de células que expresan mAk transfectadas de forma estable. Para ello se transfectaron células CHO-DG44 con las combinaciones de plásmidos pBIDG-HC/pBIN-LC (NPT de tipo silvestre), pBIDG-HC/pKS-N5-LC (mutante de NPT Glu182Asp) o pBIDG-HC/pKS-N8-LC (mutante de NPT Asp227Gly) (Fig. 6A) o con las combinaciones pBIDG-HC/pBIN-LC (NPT de tipo silvestre), pBIDG-HC/pBIN1-LC (mutante de NPT Glu182Gly), pBIDG-HC/pBIN2-LC (mutante de NPT Trp91Ala), pBIDG-HC/pBIN3-LC (mutante de NPT Val198G), pBIDG-HC/pBIN4-LC (mutante de NPT Asp227Ala), pBIDG-HC/pBIN5-LC (mutante de NPT Asp227Val), pBIDG-HC/pBIN6-LC (mutante de NPT Asp261Gly), pBIDG-HC/
pBIN7-LC (mutante de NPT Asp261Asn) o pBIDG-HC/pBIN8-LC (mutante de NPT Phe240Ile) (Fig. 6B), que sólo se diferenciaban entre sí en el gen NPT (de tipo silvestre o mutante) empleado como marcador de selección. La concentración del anticuerpo monoclonal producido IgG2 recombinante en el material sobrenadante del cultivo celular, se determinó mediante ELISA y se calculó la productividad específica por célula y por día. En total se prepararon 5 a 9 grupos para cada combinación de vectores. Las columnas representan el valor medio de la productividad específica o el título de todos los grupos en el ensayo, a partir de 6 pases por cultivos en frascos de 75 cm^{2}. Para calcular el título relativo o las productividades específicas relativas, se fijaron en 1 los valores medios de los grupos seleccionados con el gen de NPT de tipo silvestre.

La Figura 7 muestra el enriquecimiento de células con expresión de GFP más elevada en grupos de células transfectadas, mediante el uso de los mutantes de NPT de acuerdo con la invención, como marcadores de selección. Para ello, las células CHO-DG44 se transfectaron con las combinaciones de plásmidos pBIDG-HC/pBIN-LC (NPT de tipo silvestre), pBIDG-HC/pKS-N5-LC (mutante de NPT Glu182Asp), pBIDG-HC/pKS-N8-LC (mutante de NPT Asp227Gly), pBIDG-HC/pBIN1-LC (mutante de NPT Glu182Gly), pBIDG-HC/pBIN2-LC (mutante de NPT Trp91Ala), pBIDG-HC/pBIN3-LC (mutante de NPT Val198G), pBIDG-HC/pBIN-4-LC (mutante de NPT Asp227Ala), pBIDG-HC/pBIN5-LC (mutante de NPT Asp227Val), pBIDG-HC/pBIN6-LC (mutante de NPT
Asp261Gly), pBIDG-HC/pBIN7-LC (mutante de NPT Asp261Asn) o pBIDG-HC/pBIN8-LC (mutante de NPT
Phe240Ile) (5 a 9 grupos respectivamente), que sólo se diferenciaban entre sí por el gen de NPT (de tipo silvestre o mutante) empleado como marcador de selección. Además, los vectores pBIDG contenían también GFP como gen del marcador. Después de una selección durante dos a tres semanas de los grupos de células transfectadas en medio exento de HT con adición de G418, se midió la fluorescencia de GFP mediante análisis con FACS. Cada gráfica, exceptuando las células CHO-DG44 no transfectadas que sirven como testigo negativo, muestra el valor medio de la fluorescencia de GFP de los grupos que se habían transfectado con la misma combinación de plásmidos.

En la Figura 8 se muestra el aumento de la productividad de mAk mediante amplificación génica proporcionada por dhfr, en el ejemplo de cada grupo celular, que se obtuvo a partir de la transfección de CHO-DG44 con la combinación de vectores pBIDG-HC/pBIN-LC (NPT de tipo silvestre) o pBIDG-HC/pBIN5-LC (mutante de NPT D227V). Después de la primera selección en medio CHO-S-SFMII exento de hipoxantina/timidina, en presencia de G418, se realizó una amplificación génica proporcionada por dhfr, mediante adición al medio de cultivo de MTX 100 nM, y a continuación MTX 500 nM. La concentración del mAk en el material sobrenadante del cultivo celular de los grupos, se determinó mediante ELISA y se calculó la productividad específica por célula y día (pg/célula*día). Cada punto de recogida de datos representa la media a partir de 6 pases por cultivos en frascos de 75 cm^{2}.

La Figura 9 muestra la actividad enzimática de los mutantes de NPT de acuerdo con la invención en comparación con NPT de tipo silvestre en un ensayo de punto (del inglés, "dot"). Para ello, se prepararon extractos celulares a partir de dos grupos celulares distintos que expresaban mAk (grupo 1 y 2), que se habían transfectado y seleccionado con el gen de tipo silvestre de NPT (SEQ ID NO:1) o con los mutantes de NPT E182G (SEQ ID NO:3), E182D (SEQ ID NO:19), W91A (SEQ ID NO:5), V198G (SEQ ID NO:7), D227A (SEQ ID NO:9), D227V (SEQ ID NO:11), D227G (SEQ ID NO:21), D261G (SEQ ID NO:13), D261N (SEQ ID NO:15) y F240I (SEQ ID NO:17). Las células CHO-DG44 no transfectadas servían como testigo negativo. En el ensayo de fosforilación se empleó como sustrato G418. Los extractos se filtraron en un colector a vacío de 96 pocillos a través de un sándwich con una membrana de fosfocelulosa y nitrocelulosa P81. Las proteínas fosforiladas y las proteínas no fosforiladas se unen a la nitrocelulosa a través de quinasas de proteínas, mientras que la G418 fosforilada y no fosforilada pasa a través de la nitrocelulosa y se une a la fosfocelulosa (Fig. 9A). La detección y la cuantificación de las señales radiactivas tuvieron lugar mediante un Phospho Imager. Para calcular la actividad enzimática porcentual se recurrió a las señales que se habían obtenido con 5 \mug de extracto. Las actividades enzimáticas porcentuales muestran en este caso el valor medio de los mutantes de NPT a partir de 2 grupos celulares que expresan mAk respectivamente, estableciéndose en 100% la actividad enzimática de NPT de tipo silvestre (Fig. 9B).

La Figura 10 muestra el análisis con transferencia de tipo Northern de la expresión de NPT así como el número de copias génicas de NPT en los grupos de células transfectadas. Para ello se preparó el ARN total a partir de respectivamente dos grupos celulares distintos que expresaban mAk, que se habían transfectado y seleccionado con el gen de tipo silvestre de NPT (SEQ ID NO:1) o con los mutantes de NPT E182G (SEQ ID NO:3), E182D (SEQ ID NO:19), W91A (SEQ ID NO:5), V198G (SEQ ID NO:7), D227A (SEQ ID NO:9), D227V (SEQ ID NO:11), D227G (SEQ ID NO:21), D261G (SEQ ID NO:13), D261N (SEQ ID NO:15) y F240I (SEQ ID NO:17). Las células CHO-DG44 no transfectadas servían como testigo negativo. Se hidridaron respectivamente 30 \mug de ARN con un producto de PCR marcado con FITC-dUTP que comprendía la región codificadora del gen de NTP. En todas las células transfectadas se detectó un transcrito de NPT singular específico de aproximadamente 1,3 kb. Para determinar el número de copias génicas de npt se aisló en un análisis por transferencia de punto, el ADN genómico a partir de los grupos de células que expresaban mAk, mencionadas anteriormente. Se hibridaron respectivamente 10 \mug, 5 \mug, 2,5 \mug, 1,25 \mug, 0,63 \mug o 0,32 \mug del ADN genómico con un producto de la PCR marcado con FITC-dUTP, que comprendía la región codificadora del gen de NPT. Las células CHO-DG44 no transfectadas servían como testigo negativo. Como patrón se empleó el plásmido pBIN-LC (320 pg, 160 pg, 80 pg, 40 pg, 20 pg, 10 pg, 5 pg, 2,5 pg). El número de copias de los genes de NPT en cada grupo de células, se calculó con ayuda de la serie patrón que se había preparado a partir de las intensidades de señal determinadas del ADN plamídico titulado.

La Figura 11 muestra el aislamiento de grupos de células que expresan de forma elevada mAk mediante una selección basada en GFP, por medio de FACS, en el ejemplo de dos grupos de células (grupo de células 5 y grupo 8). Estos grupos de células, obtenidos a partir de la cotransfección con los vectores pBID-HC y pBING-LC se sometieron a una clasificación secuencial con FACS en base a GFP. La concentración del anticuerpo IgG2 en el material sobrenadante del cultivo celular del grupo se determinó mediante ELISA después de cada etapa de clasificación y se calculó la productividad específica por célula y por día (pg/célula*día). En total se realizaron 6 clasificaciones, separando por clasificación de cada una el 5% de las células con la mayor fluorescencia de GFP. Cada punto de recogida de datos representa en cada caso la media a partir de seis pases por cultivos en frascos de 75 cm^{2}.

La Figura 12 muestra los incrementos de la productividad de mAk conseguidos mediante la combinación de una selección basada en GFP con una etapa de amplificación con MTX, en el ejemplo del grupo de células 5 y 8 (compárese con la Fig. 11). Dos semanas después de la cotransfección de CHO-DG44 con los vectores pBID-HC y pBING-LC se separaron por clasificación de los grupos 5 y 8, el 5% de las células con la mayor fluorescencia de GFP. A continuación se realizó una amplificación génica mediada por dhfr, añadiendo metotrexato 100 nM (MTX) al medio de cultivo. La concentración del mAk en el material sobrenadante del cultivo celular del grupo se determinó con ELISA y se calculó la productividad específica por célula y por día (pg/célula*día). Cada punto de recogida de datos representa en cada caso la media a partir de al menos 6 pases por cultivos en frascos de 75 cm^{2}.

La Figura 13 muestra la correlación entre la productividad del anticuerpo y la fluorescencia de GFP en el ejemplo de los grupos celulares 5 y 8 (compárese con la Fig. 11). Estos grupos celulares se obtuvieron a partir de la transfección de CHO-DG44 con la combinación de vectores pBID-HC y pBING-LC. Se sometieron a una clasificación con FACS secuencial en base a GFP, separando por clasificación en cada caso el 5% de células con la mayor fluorescencia de GFP. Después de cada etapa de clasificación, se determinó la concentración del anticuerpo IgG2 en el material sobrenadante del cultivo celular del grupo, mediante ELISA y se calculó la productividad específica por célula y día (pg/c*d). Cada punto de recogida de datos representa en cada caso la media a partir de al menos seis pases por cultivos en frascos de 75 cm^{2}.

Descripción detallada de la invención y formas de realización preferidas

Los datos siguientes de las posiciones de aminoácidos se refieren en cada caso a la posición del aminoácido, tal y como se codifica desde el gen de la fosfotransferasa de neomicina de tipo silvestre, con la SEQ ID NO:1. Con la expresión "gen de la fosfotransferasa de neomicina modificado" se entiende un ácido nucleico que codifica un polipéptido con actividad fosfotransferasa de neomicina, presentando el polipéptido, por lo menos en una de las posiciones de aminoácido indicadas con más detalle en la descripción, que son homólogos a la proteína de tipo silvestre con las SEQ ID NO:2, un aminoácido distinto al de la proteína de tipo silvestre. En este contexto, se entiende por "homóloga" que la región de la secuencia portadora de la mutación, con ayuda del denominado algoritmo "de alineación" convencional, como por ejemplo "BLAST" (Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J: (1990) "Basic local alignment search tool" J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. & States, D.J. (1993) "Identification of protein coding regions by database similarity search" Nature Genet. 3:266-272; Madden, T.L., Tatusov, R.L. & Zhang, J. (1996) "Applications of network BLAST server" Meth. Enzymol. 266:131-141; Zhang, J. & Madden, T.L. (1997) "PowerBLAST: A new network BLAST application for interactive or automated sequence analyse and annotation" Genome Res. 7:649-656; Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schäffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402), pueda coincidir con una secuencia de referencia, presente con la secuencia de la fosfotransferasa de neomicina de tipo silvestre, según SEQ ID NO:2. Las secuencias se pueden hacer coincidentes entonces cuando se corresponden en su sucesión de secuencias y se pueden identificar con ayuda del algoritmo de alineación convencional.

La presente invención pone a disposición nuevos genes modificados de la fosfotransferasa de neomicina, así como procedimientos para la preparación y selección de líneas celulares de mamífero que facilitan una elevada expresión de productos génicos heterólogos, preferentemente polipéptidos o proteínas biofarmacéuticamente relevantes. Los procedimientos de acuerdo con la invención se refieren en primer lugar a la selección de células que, además del gen de interés, expresan un gen de la fosfotransferasa de neomicina de acuerdo con la invención que proporcionan a las células transfectadas una ventaja selectiva frente a las células no transfectadas. De forma sorprendente se ha demostrado que el uso de los genes modificados descritos en esta memoria de acuerdo con la invención, de la fosfotransferasa de neomicina (genes mNPT) muestran, frente al gen de la fosfotransferasa de neomicina de tipo silvestre (gen NPTwt) una gran ventaja selectiva. Esto se refiere en particular al uso de mutantes que muestran una actividad enzimática menor en comparación con NPTwt.

Genes de la fosfotransferasa de neomicina modificados de acuerdo con la invención

Se ha mostrado como especialmente adecuado el uso de genes de NPT modificados que codifican una NPT que sólo muestran 1 a 80%, preferentemente 1 a 60% de la actividad enzimática de NPTwt. Más preferidos son en este caso los mutantes de NPT que sólo muestran 1% a 30% de la actividad enzimática de NPTwt, son especialmente preferidos los que sólo muestran 1,5% a 26% de la actividad enzimática de NPTwt. La actividad enzimática de una NPT se puede determinar por ejemplo en un "Dot Assay" como el descrito en el ejemplo 4 y como el indicado en el método 5.

Como "fosfotransferasa de neomicina de tipo silvestre" se designa un gen de la fosfotransferasa de neomicina que codifica la enzima 3'-fosfotransferasa II de aminoglicósido (EC 2.7.1.95), cuyo gen está asociado de forma natural con el transposón 5 en Escherichia coli y contiene, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos mencionada en SEQ ID NO:2 o está codificada por la secuencia de nucleótidos indicada en SEQ ID NO:1. Esta enzima proporciona resistencia frente a distintos antibióticos aminoglicosídicos tales como neomicina, kanamicina y G418, al inactivar los antibióticos, mediante la transferencia del fosfato terminal desde ATP al grupo 3' hidroxilo del anillo I de aminohexosa. Bajo NPTwt se entienden, además, todas las NPT que muestran una actividad enzimática comparable como la de NPT codificada por SEQ ID NO:1. Esto incluye especialmente las NPT en las que el centro activo enzimático, que cataliza la transferencia de un fosfato terminal desde el ATP a un sustrato, está presente con una conformación idéntica o casi idéntica (Shaw y col., 1993; Hon y col., 1997; Burk y col., 2001) y de este modo muestra una actividad enzimática comparable como la de una enzima que contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2. Una NPTwt tiene en el presente caso, una actividad enzimática comparable cuando ésta muestra aproximadamente 81 a 150%, preferentemente 90 a 120% de la actividad enzimática que presenta una NPT definida por SEQ ID NO:2, pudiéndose determinar la actividad con el "Dot-Assay" descrito en el ejemplo 4 y como método 5.

Se prefieren principalmente los mutantes en los que la disminución de la actividad enzimática en comparación con NPTwt se base en una modificación de la secuencia de aminoácidos, p. ej., por sustitución, inserción o deleción de por lo menos uno o varios aminoácidos. Los mutantes por deleción, inserción o sustitución se pueden obtener mediante "mutagénesis específica del sitio" y/o "técnicas de mutagénesis específica del sitio". Los métodos correspondientes están descritos, por ejemplo, por Lottspeich y Zorbas (1998) (capítulo 36.1 con sucesivas referencias).

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De forma sorprendente se mostró que con el uso de mutantes de la fosfotransferasa de neomicina como marcadores de selección, en los que se alteró por lo menos el aminoácido triptófano en la posición del aminoácido 91, el aminoácido valina en la posición del aminoácido 198 o el aminoácido fenilalanina en la posición del aminoácido 240, en comparación con NPTwt, o en los que el gen modificado de la fosfotransferasa de neomicina, en comparación con el gen de tipo silvestre, en la posición del aminoácido 182 codifica glicina, en la posición del aminoácido 227 codifica alanina o valina y/o en la posición del aminoácido 261 codifica glicina, se puede conseguir un enriquecimiento especialmente eficaz de las células de mamífero transfectadas con tasas elevadas de expresión del gen co-integrado de interés. De acuerdo con la invención, se prefieren mutantes que afectan a los aminoácidos en la posición 91, 198 y/o 240, en los que el gen modificado de la fosfotransferasa de neomicina, en comparación con el gen de tipo silvestre, en la posición del aminoácido 182 codifica glicina, en la posición del aminoácido 227 codifica alanina o valina y/o en la posición del aminoácido 261 codifica glicina. Son especialmente ventajosos los mutantes por sustitución, es decir, mutantes en los que los aminoácidos correspondientes que se encontraban en ese lugar en el tipo silvestre, fueron intercambiados por otro aminoácido. Aún más preferidos son los correspondientes mutantes por sustitución en los que una modificación del aminoácido correspondiente conduce a una reducción de la actividad enzimática de 1 a 80%, preferentemente de 1 a 60%, más preferido de 1,5 a 30%, aún más preferido de 1,5 a 26%, en comparación con NPTwt. Son especialmente preferidos los genes de NPT modificados de acuerdo con la invención, en los que los aminoácidos 91, 227, 261 y/o 240 se modificaron de forma correspondiente, de modo que la actividad enzimática en comparación con NPTwt es de sólo 1 a 80%, preferentemente sólo de 1 a 60%, más preferentemente sólo 1,5 a 30%, aún más preferido sólo 1,5% a 26%. Lo más preferido es un mutante por sustitución en el que los aminoácidos en la posición del aminoácido 227 se modificaron de modo que la actividad enzimática de la NPT modificada es menor de 26%, preferentemente entre 1 y 20%, aún más preferido entre 1 y 16% en comparación con NPTwt.

Según otra forma de realización de la presente invención, son ventajosos los mutantes que en comparación con NPTwt en la posición del aminoácido 91 codifican glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina o tirosina, o en la posición del aminoácido 182 codifican glicina o en la posición del aminoácido 227 codifican alanina o valina. Adicionalmente, se prefieren los genes de NPT modificados que en la posición del aminoácido 198 en comparación con NPTwt, codifican glicina, alanina, leucina, isoleucina, fenilalanina, tirosina o triptófano. Además de ello, se prefieren los genes de NPT modificados que en la posición del aminoácido 240, en comparación con NPTwt, codifican glicina, alanina, valina, isoleucina, tirosina o triptófano. Además, se prefieren los genes de NPT modificados que en la posición del aminoácido 261, en comparación con NPTwt, codifican glicina. En especial se mostró que con los mutantes Glu182Gly, Trp91Ala, Val198Gly, Asp227Ala, Asp227Val, Asp261Gly y Phe240Ile como marcadores de selección, se conseguía un enriquecimiento de las células de mamífero transfectadas con tasas de expresión elevadas del gen co-integrado de interés, de modo que esos mutantes son especialmente preferidos. Aún más preferidos son los mutantes Asp227Val, Asp261Gly, Phe240Ile y Trp91Ala, con cuyo uso se podían conseguir las mejores tasas de enriquecimiento. Especialmente preferido es el mutante Asp227Val.

Por el contrario, los mutantes Asp190Gly y Asp208Gly se demostró que eran marcadores no adecuados para la selección de células CHO-DG44 transfectadas bajo condiciones de cultivo exento de suero. Debido a la función enzimática, probablemente muy reducida, de estos mutantes (Asp190Gly, Asp208Gly), después de la fase de selección se obtuvieron sólo pocas células que, además, estaban muy limitadas en vitalidad y crecimiento.

En el caso de los aminoácidos en la posición 182 y 227 en relación con el tipo silvestre, se trata de aminoácidos no conservados que están localizados fuera de los tres motivos conservados en la región C-terminal de la 3'-fosfotransferasas de aminoglicósido. El aminoácido en la posición 91 pertenece a su vez a los aminoácidos no conservados y está fuera de uno de los motivos conservados en la región N-terminal de las 3'-fosfotransferasas de aminoglicósido. En el caso de los aminoácidos en la posición 198 y 240, se trata por el contrario de aminoácidos conservados en la región C-terminal de la NPT, pero que se encuentran fuera de los motivos conservados. Por el contrario a ésto, el aminoácido en la posición 261, es un aminoácido conservado en el tercer motivo conservado de la región C-terminal (Shaw y col., 1993; Hon y col., 1997; Burk y col., 2001).

Comparando con el uso de NPTwt como marcador de selección, las células en el caso de los mutantes Glu182Gly, ción, en el caso de Glu182Gly las células muestran una productividad elevada multiplicada por el factor 1,4-2,4, en el caso de los mutantes Asp227Ala o Trp91Ala multiplicada por un factor 2,2 o 4, en el caso del mutante Phe240Ile multiplicada por un factor 5,7 o 7,3 y en el caso de los mutantes Asp261Gly o Asp227Val multiplicada hasta por un factor 9,3 o 14,6. Para la expresión de la proteína (de un anticuerpo) de cadenas múltiples se realizó para ello una cotransfección. Las dos cadenas proteicas se expresaban en cada caso, a partir de un vector propio, codificando uno de los vectores
adicionalmente el gen de NPT y el otro vector el gen amplificable y seleccionable de la reductasa de dihidrofolato.

La presente invención se refiere de este modo a un procedimiento para enriquecer células de mamífero recombinantes que expresan un gen modificado, de acuerdo con la invención, de la fosfotransferasa de neomicina, caracterizado porque (i) un grupo de células de mamífero se transfecta con un gen de una fosfotransferasa de neomicina modificada de acuerdo con la invención que, en comparación con la fosfotransferasa de neomicina de tipo silvestre, muestra únicamente 1 a 80% de la actividad, preferentemente sólo 1 a 60%, más preferentemente sólo 1,5 a 30%, aún más preferentemente sólo 1,5 a 26% y/o muestra una de las modificaciones descritas en esta memoria; (ii) las células de mamífero se cultivan bajo condiciones que permiten una expresión del gen modificado de la fosfotransferasa de neomicina; y (iii) las células de mamífero se cultivan en presencia de al menos un medio de selección que tiene un efecto selectivo sobre el crecimiento de las células de mamífero y favorece el crecimiento de las células que expresan el gen de la fosfotransferasa de neomicina.

Se prefiere especialmente un procedimiento correspondiente cuando se emplea un gen de NPT modificado, descrito con más detalle en esta solicitud, en especial cuando el gen de NPT modificado empleado codifica una NPT modificada que, en comparación con el gen de tipo silvestre, en la posición del aminoácido 91 codifica alanina, en la posición del aminoácido 182 glicina, en la posición del aminoácido 198 glicina, en la posición del aminoácido 227 alanina o valina, en la posición del aminoácido 261 glicina o en la posición del aminoácido 240 isoleucina. Aún más se prefieren los genes de NPT que, en comparación con el gen de tipo silvestre, en la posición del aminoácido 227 codifican valina y/o en la posición del aminoácido 261 glicina. Se prefieren especialmente los genes de NPT que en la posición del aminoácido 240, en comparación con el gen de tipo silvestre, codifican una isoleucina o en la posición del aminoácido 227 codifican una valina, prefiriéndose especialmente a su vez un gen de NPT que en la posición del aminoácido 227, en comparación con el gen de tipo silvestre, codifica valina. Naturalmente, la presente invención comprende también genes de NPT modificados así como el uso de acuerdo con la invención de genes de NPT modificados, que muestran una combinación de los intercambios de aminoácidos correspondientes.

La presente invención se refiere, además, a vectores de expresión eucarióticos que contienen (i) un gen heterólogo de interés ligado funcionalmente a un promotor heterólogo y (ii) un gen modificado de la fosfotransferasa de neomicina descrito en esta memoria de acuerdo con la invención que codifica una fosfotransferasa de neomicina que, en comparación con la fosfotransferasa de neomicina de tipo silvestre, muestra menos actividad enzimática. Por actividad enzimática "menor" o "menos" actividad enzimática se entiende, en el contexto-sentido de la invención, una actividad enzimática que se corresponde como máximo con 80%, preferentemente 1 a 80%, aún más preferido sólo 1 a 60% de la actividad enzimática de la NPTwt. Según otra forma de realización de la presente invención, "actividad enzimática menor" significa una actividad enzimática de 1 a 30%, preferentemente 1,5 a 26% en comparación con la fosfotransferasa de neomicina de tipo silvestre.

Un vector de expresión preferido contiene un gen NPT modificado que codifica una NPT modificada que sólo muestra 1 a 80%, preferentemente sólo 1 a 60% de la actividad enzimática de la NPTwt. También se prefieren vectores de expresión con genes de NPT modificados que codifican mutantes, que sólo muestran 1 a 30% de la actividad enzimática de NPTwt. Especialmente se prefieren los vectores de expresión que contienen un gen de NPT modificado que codifica mutantes que sólo muestran 1,5 a 26% de la actividad enzimática de NPTwt, determinándose la actividad en el "Dot-Assay" del ejemplo 4 y descrito como método 5.

En otra forma de realización de la invención, los vectores de expresión contienen genes de NPT modificada que, en comparación con NPTwt, están modificados en la posición de los aminoácidos Trp91, Val198, Phe240 o en la posición Glu182 con glicina, en la posición Asp227 con alanina o valina y/o en la posición Asp261 con glicina. En este contexto se prefieren los mutantes de NPT que disponen sólo de 1 a 80%, preferentemente sólo 1 a 60%, más preferido sólo 1,5 a 30% y especialmente preferido sólo 1,5 a 26% de la actividad enzimática de NPTwt. Preferentemente, para ello se puede sustituir el aminoácido Tryp91 por glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina o tirosina. Más aún se prefieren los genes de NPT modificados que en la posición del aminoácido 198, en comparación con NPTwt, codifican glicina, alanina, leucina, isoleucina, fenilalanina, tirosina o triptófano. Por consiguiente, se prefieren genes de NPT modificados que en la posición del aminoácido 240, en comparación con NPTwt, codifican glicina, alanina, valina, isoleucina, tirosina o triptófano. Adicionalmente, se prefieren genes de NPT modificados que en la posición del aminoácido 261, en comparación con NPTwt, codifican glicina. Se prefiere especialmente el uso de un mutante en el que el ácido aspártico en la posición 227 se sustituye por alanina o valina, el ácido aspártico en la posición 261 por glicina.

Se prefieren especialmente vectores de expresión que contienen genes de NPT modificados, que codifican un mutante Glu182Gly, Trp91Ala, Val198Gly, Asp227Ala, Asp227Val, Asp261Gly o Phe240Ile, que en el caso del mutante Glu182Gly contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4, en el caso del mutante Trp91Ala contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6, en el caso del mutante Val198Gly contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8, en el caso del mutante Asp227Ala contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10, en el caso del mutante Asp227Val contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:12, en el caso del mutante Asp261Gly contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:14 y en el caso del mutante Phe240Ile contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:18. Lo más preferido es un vector de expresión con el uso de un mutante Asp227Val, Asp261Gly, Phe240Ile o Trp91Ala,, especialmente si muestra la secuencia de aminoácidos mencionada en SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:18 o SEQ ID NO:6 o, por consiguiente, cuando codifica o contiene la secuencia de ácidos nucleicos mencionada en SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:17 o SEQ ID NO:5.

Por tanto, la presente invención pone a disposición por primera vez genes de la fosfotransferasa de neomicina modificados así como sus productos génicos que, en comparación con NPTwt, en la posición de los aminoácidos Trp91, Val198 o Phe240 codifican un aminoácido distinto al aminoácido de tipo silvestre. Por ello, la presente invención pone a disposición primero especialmente los mutantes Trp91, Val198 o Phe240 que, en comparación con NPTwt, muestran una actividad enzimática menor. Las NPT modificadas, descritas en esta memoria y a disposición en el marco de la invención, codifican preferentemente en la posición del aminoácido 91 alanina, en la posición 198 glicina y en la posición 240 isoleucina. Adicionalmente, la presente invención pone a disposición por primera vez mutantes de NPT que, en comparación con NPTwt, en la posición 182 codifican glicina, en la posición 227 alanina o valina y en la posición 261 glicina. En este caso, se ponen a disposición primero tanto los genes como los productos génicos (enzimas) en el marco de la presente invención. En este contexto, la presente invención pone a disposición primero NPT modificadas con las secuencias de aminoácidos según SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14 y SEQ ID NO:18. Adicionalmente, la presente invención pone a disposición genes de NPT modificados con las secuencias de ADN según SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13 y SEQ ID NO:17.

Genes de interés

El gen de interés contenido en el vector de expresión de acuerdo con la invención comprende una secuencia de nucleótidos de longitud arbitraria que codifica un producto de interés. El producto génico o también "producto de interés" es generalmente una proteína, un polipéptido, un péptido o un fragmento o derivado de los mismos. También puede ser ARN o ARN de hebra complementaria. El gen de interés puede estar presente con la longitud completa, en forma reducida, como gen de fusión o como gen marcado. Se puede tratar de ADN genómico o preferentemente de ADNc o de fragmentos o fusiones correspondientes. El gen de interés puede presentar la secuencia génica natural, estar mutado o modificado de alguna forma. Tales modificaciones incluyen la optimización de codones para adaptarse a una célula hospedadora determinada y una humanización. El gen de interés puede codificar, p. ej., un polipéptido secretor, citoplasmático, localizado en el núcleo, unido a la membrana o unido a la superficie celular.

La expresión "secuencia de nucleótidos" o "secuencia de ácidos nucleicos" se refiere a un oligonucleótido, un nucleótido, un polinucleótido y sus fragmentos, así como a ADN o ARN de origen genómico o sintético, que están presentes de forma mono o bicatenaria y pueden representar la cadena codificadora o la no codificadora de un gen. Para la modificación de las secuencias de ácidos nucleicos se pueden emplear técnicas convencionales, como p. ej., mutagénesis específica del sitio o mutagénesis mediada por PCR (p. ej., descritas por Sambrook y col., 1989 o Ausubel y col., 1994).

Por "codificar" se entiende la propiedad o la capacidad de una secuencia específica de nucleótidos en un ácido nucleico, por ejemplo, un gen en un cromosoma o un ARNm, de servir como matriz para la síntesis de otros polímeros y macromoléculas como p. ej., ARNr, ARNt, ARNm, otras moléculas de ARN, ADNc o polipéptidos, en un proceso biológico. Por consiguiente, un gen codifica una proteína cuando mediante la transcripción y posterior traducción del ARNm, se produce la proteína deseada en una célula o en otro sistema biológico. Tanto la cadena codificadora, cuya secuencia de nucleótidos es idéntica a la secuencia del ARNm y generalmente también se menciona en bancos de datos de secuencias, p. ej., EMBL o GenBank, como la cadena no codificadora de un gen o de ADNc que sirve como matriz para la transcripción, se pueden denominar como codificadoras de un producto o proteína. Un ácido nucleico que codifica una proteína también incluye ácidos nucleicos que presentan otra sucesión de la secuencia de nucleótidos, debido al códigos genético degenerado, pero que dan como resultado la misma secuencia de aminoácidos de la proteína. Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican proteínas también pueden contener intrones.

Con el término "ADNc" se designan ácidos desoxirribonucleicos que se producen mediante la transcripción inversa y la síntesis de la segunda cadena de ADN, a partir de un ARNm producido por un gen u otro ARN. Si el ADNc está presente como una molécula de ADN bicatenaria, entonces contiene tanto una cadena codificadora como una cadena no codificadora.

Con el término "intrón" se designan secuencias de nucleótidos no codificadores de longitud arbitraria. Están presentes de forma natural en muchos genes eucarióticos y se eliminan de un precursor del ARNm, transcrito anteriormente mediante un proceso denominado corte y empalme. Para ello es necesario una eliminación exacta por corte del intrón en el extremo 5' y el extremo 3' y una unión correcta de los extremos formados del ARNm, para que producir un ARNm maduro procesado con el marco de lectura adecuado para una síntesis de proteínas con éxito. Muchos de los sitios del donante del corte y empalme y de los sitios del aceptor del corte y empalme, implicados en el proceso de corte y empalme ya están caracterizados directamente en los extremos exón-intrón o intrón-exón de las secuencias presentes. Para un resumen, véase Ohshima y col., 1987.

Proteína/producto de interés

Las proteínas/polipéptidos biofarmacéuticamente importantes comprenden, p. ej., anticuerpos, enzimas, citoquinas, linfoquinas, moléculas de adhesión, receptores, así como sus derivados o fragmentos, pero no están limitados a los mismos. En general, son importantes todos los polipéptidos que actúan como agonistas o antagonistas y/o que pueden tener utilidad terapéutica o diagnóstica.

El término "polipéptido" se emplea para secuencias de aminoácidos o proteínas y significa polímeros de aminoácidos de longitud arbitraria. Este término también incluye proteínas que se pueden modificar después de la traducción mediante reacciones como por ejemplo, glicosilación, fosforilación, acetilación o procesamiento proteico. La estructura del polipéptido se puede modificar, por ejemplo, mediante sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos, fusión con otras proteínas, manteniendo su actividad biológica. El término polipéptido incluye de este modo, por ejemplo, también proteínas de fusión compuestas por un componente de inmunoglobulina, p. ej., el componente Fc y un factor de crecimiento, p. ej., una interleuquina.

Ejemplos de proteínas terapéuticas son insulina, factor de crecimiento similar a insulina, hormona de crecimiento humana (hGH) y otros factores de crecimiento, activador del plasminógeno tisular (tPA), eritropoyetina (EPO), citoquinas, por ejemplo interleuquinas (IL), tales como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, interferón (IFN)-alfa, beta, gamma, omega o tau, factor de necrosis tumoral (TNF), como por ej., TNF-alfa, beta o gamma, TRAIL, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1 y VEGF. Otros ejemplos son anticuerpos monoclonales, policlonales, multiespecíficos y monocatenarios (single chain) y fragmentos de los mismos como, p. ej., Fab, Fab', F(ab')_{2}, Fc y fragmentos Fc', cadenas de inmunoglobulinas ligeras (L) y pesadas (H) y sus regiones constantes, variables o hipervariables, así como fragmentos Fv y Fd (Chamov y col., 1999). Los anticuerpos pueden tener origen humano o no humano. También se toman en consideración anticuerpos humanizados y quimeras.

Los fragmentos Fab (Fragment antigen-binding = Fab) se componen de las regiones variables de ambas cadenas que se mantienen unidas por las regiones constantes vecinas. Se pueden producir, p. ej., mediante tratamiento con una proteasa, como por ejemplo papaína, a partir de anticuerpos convencionales o también mediante clonación del ADN. Otros fragmentos de anticuerpos son fragmentos F(ab')_{2} que se pueden preparar mediante digestión proteolítica con pepsina.

Mediante la clonación génica también se pueden preparar fragmentos de anticuerpos reducidos que están compuestos sólo por la región variable de la cadena pesada (VH) y de la cadena ligera (VL). Estos se denominan fragmentos Fv (fragmento variable = fragmento de la parte variable). Ya que en estos fragmentos Fv no es posible la unión covalente a través de los restos de cisteína de las cadenas constantes, estos fragmentos Fv se estabilizan frecuentemente de otro modo. Para ello, la región variable de la cadena pesada y de la ligera se unen entre sí frecuentemente mediante un fragmento peptídico corto de aproximadamente 10-30 aminoácidos, especialmente preferido 15 aminoácidos. De este modo se forma una sola cadena polipeptídica en la que VH y VL están unidas entre sí mediante un enlace peptídico. Tales fragmentos de anticuerpos se denominan también fragmento-Fv single-chain (scFv). Ejemplos de anticuerpos scFv son conocidos y están descritos, véase, p. ej., Huston y col. (1988).

En los últimos años se han desarrollado estrategias para preparar derivados de scFv multímeros. La intención es producir anticuerpos recombinantes con propiedades farmacocinéticas mejoradas y mayor avidez por la unión. Para conseguir la multimerización de los fragmentos scFv, éstos se preparan como proteínas de fusión con dominios de multimerización. Como dominios de multimerización pueden utilizarse en este caso, p. ej., la región CH3 de una IgG o estructuras helicoidales ("coiled coil estructure") como los dominios de cremallera de la leucina. En otras estrategias, la interacción entre las regiones VH y VL del fragmento scFV se utiliza para una multimerización (p. ej., diacuerpos, tricuerpos y pentacuerpos).

Por "diacuerpo", un experto en la técnica designa un derivado de scFV homodímero y bivalente. La disminución del enlace peptídico en la molécula scFv a 5-10 aminoácidos, da como resultado la formación de homodímeros mediante recubrimiento de las cadenas VH/VL. Los diacuerpos se pueden estabilizar adicionalmente mediante puentes disulfuro introducidos. Ejemplos de diacuerpos se encuentran en la bibliografía, p. ej., en Perisic y col. (1994).

Por "minicuerpo" un experto en la técnica designa un derivado de scFv bivalente y homodímero. Está compuesto de una proteína de fusión que contiene la región CH3 de una inmunoglobulina, preferentemente IgG, especialmente preferida IgG1, como región de dimerización. Esta se une al fragmento scFv a través de una región bisagra, a su vez de IgG, y una región enlazadora. Ejemplos de tales minicuerpos están descritos por Hu y col. (1996).

Por "triacuerpo" un experto en la técnica designa un derivado de scFv trivalente y homotrímero (Kortt y col., 1997). La fusión directa de VH-VL sin uso de una secuencia enlazadora conduce a la formación de trímeros.

En el caso de los fragmentos designados por los experto en la técnicas como mini-anticuerpos, que tienen una estructura bivalente, trivalente o tetravalente, se trata a su vez de derivados de fragmentos scFv. La multimerización se consigue en ese caso mediante estructuras "coiled coil" de dímeros, trímeros o tetrámeros (Pack y col., 1993 y 1995; Lovejoy y col., 1993).

Gen que codifica una proteína fluorescente

En otra forma de realización, el vector de expresión de acuerdo con la invención contiene un gen que codifica una proteína fluorescente, preferentemente ligado funcionalmente con el gen de interés. Preferentemente, la transcripción de ambos genes tiene lugar bajo el control de un único promotor heterólogo, de modo que la proteína/producto de interés y la proteína fluorescente están codificadas por un ARNm bicistrónico. Esto facilita la identificación de células que producen en gran cantidad la proteína/producto de interés, a través de la tasa de expresión de la proteína
fluorescente.

En el caso de la proteína fluorescente, se puede tratar de, p. ej., de una proteína fluorescente verde, verde azulada, azul, amarilla o de otro color. Un ejemplo especial es la proteína fluorescente verde (GFP) de Aequorea victoria o Renilla reniformis y los mutantes desarrollados a partir de las mismas; véanse, p. ej., Bennet y col. (1998); Chalfie y col., (1994); el documento WO 01/04306 y la bibliografía citada en el mismo.

Otras proteínas fluorescentes y los genes que las codifican, se describen en los documentos WO 00/34318, WO 00/34326, WO 00/34526 y WO 01/27150, que se incorporan a esta memoria como referencia. En el caso de estas proteínas fluorescentes se trata de fluoróforos de organismos no bioluminiscentes de la especie antozoos, como por ejemplo, Anemonia majano, Clavularia sp., Zoanthus sp. I, Zoanthus sp. II, Discosoma striata, Discosoma sp. "red", Discosoma sp. "green", Discosoma sp. "Magenta", Anemonia sulcata.

Las proteínas fluorescentes utilizadas de acuerdo con la invención, contienen además de las proteínas de tipo silvestre, también mutantes naturales o preparados por tecnología genética y variantes de mutantes, sus fragmentos, derivados o variantes fusionadas con, p. ej., otras proteínas o péptidos. Las mutaciones incorporadas pueden cambiar, por tanto, por ejemplo, el espectro de excitación o de emisión, la formación de cromóforos, los coeficientes de extinción o la estabilidad de la proteína. Mediante la optimización del codón se puede mejorar, además, la expresión en células de mamífero o en otras especies. De acuerdo con la invención, la proteína fluorescente también se puede utilizar en fusión con un marcador de selección, preferentemente con un marcador de selección amplificable como, por ejemplo, la reductasa de dihidrofolato (DHFR).

La fluorescencia emitida por las proteínas fluorescentes facilita la detección de proteínas, p. ej., mediante citometría de flujo activada por fluorescencia (FACS) o mediante microscopía fluorescente.

Otros elementos reguladores

El vector de expresión contiene por lo menos un promotor heterólogo que facilita la expresión del gen de interés y preferentemente también la de la proteína fluorescente.

Por "promotor" se denomina una secuencia de polinucleótidos que facilita y controla la transcripción de los genes o secuencias ligados funcionalmente con ella. Un promotor contiene secuencias de reconocimiento para la unión de la polimerasa de ARN y el sitio de iniciación de la transcripción. Para la expresión de una secuencia deseada en un tipo celular determinado o en una célula hospedadora, se tiene que elegir en cada caso un promotor funcional adecuado. El experto en la técnica conoce una variedad de promotores procedentes de diversas fuentes, incluidos los promotores constitutivos, inducibles y reprimibles. Están depositados en bancos de datos, p. ej., GenBank y se pueden adquirir como elementos clonados individuales o dentro de una secuencia de polinucleótidos, a partir de fuentes comerciales o individuales. En los promotores inducibles, la actividad del promotor se puede reducir o aumentar como reacción a una señal. Un ejemplo de un promotor inducible lo presenta el promotor de la tetraciclina (tet). Este contiene secuencias del operador de la tetraciclina (tetO) que se pueden inducir mediante una proteína transactivadora regulada por la tetraciclina (tTA). En presencia de tetraciclina se inhibe la unión de tTA a tetO. Ejemplos de otros promotores inducibles son el promotor jun, fos , de metalotionina y de choque térmico (véase también Sambrook y col., 1989; Gossen y col., 1994).

Entre los promotores que son especialmente adecuados para una expresión elevada en eucariontes, se encuentran a modo de ejemplo el promotor ubiquitina/S27a del hámster (documento WO 97/15664), el promotor temprano de SV40, el promotor tardío principal de adenovirus, el promotor de metalotionina-I de ratón, la larga región repetitiva terminal del virus del sarcoma de Rous, el promotor temprano de citomegalovirus. Ejemplos de otros promotores heterólogos de mamíferos son el(los) promotor(es) de actina, inmunoglobulina o choque térmico.

Con un promotor heterólogo correspondiente se puede conseguir el aumento/regulación de la actividad transcripcional en una casete de expresión, en vinculación funcional con otras secuencias reguladoras.

A modo de ejemplo, el promotor puede estar relacionado con secuencias potenciadoras para aumentar la actividad transcripcional. Para ello se pueden utilizar uno o varios potenciadores y/o varias copias de una secuencia de potenciador, por ejemplo un potenciador de CMV o de SV40. Según lo cual, un vector de expresión de acuerdo con la invención, contiene en otra forma de realización, uno o varios potenciador/secuencias de potenciador, preferentemente un potenciador de CMV o de SV40.

Con el término "potenciador" se designa una secuencia de polinucleótidos que actúa sobre la actividad de un promotor en posición cis y de este modo estimula la transcripción de un gen ligado funcionalmente a ese promotor. En contraposición con los promotores, el efecto de los potenciadores es dependiente de la posición y de la orientación y pueden estar situados por ello delante o detrás de una unidad de transcripción, dentro de un intrón o hasta dentro de la región codificadora. El potenciador puede estar localizado, por tanto, muy cerca de la unidad de transcripción o también a cierta distancia del promotor. También es posible un solapamiento físico y funcional con el promotor. El experto en la técnica conoce una variedad de potenciadores procedentes de distintas fuentes (y depositados en bancos de datos, tales como GenBank, p. ej., el potenciador de SV40, el potenciador de CMV, el potenciador de polioma, el potenciador de adenovirus) y disponibles de forma aislada o dentro de secuencias de polinucleótidos de elementos clonados (p. ej., depositados en la ATCC o procedentes de fuentes comerciales e individuales). Una cantidad de secuencias de promotores contienen también secuencias de potenciadores, como p. ej., el promotor de CMV empleado frecuentemente. El potenciador de CMV humano pertenece por ello a los potenciadores más potentes identificados hasta la fecha. Un ejemplo de un potenciador inducible es el potenciador de metalotioneína, que se puede estimular mediante glucocorticoides o metales pesados.

Otra modificación posible es, p. ej., la introducción de sitios de unión múltiples Sp1. Las secuencias del promotor pueden estar combinadas adicionalmente con secuencias reguladoras que permiten un control/regulación de la actividad transcripcional. De este modo, el promotor se puede volver reprimible/inducible. Esto puede tener lugar, por ejemplo, mediante la asociación con secuencias que presentan sitios de unión para factores de transcripción con regulación positiva o negativa. El factor de transcripción SP-1 mencionado anteriormente, tiene una influencia positiva sobre la actividad transcripcional. Otro ejemplo es el sitio de unión de la proteína activadora AP-1, que influye sobre la transcripción tanto de forma positiva como negativa. La actividad de AP-1 puede estar controlada mediante los más distintos factores, como p. ej., factores de crecimiento, citoquina y suero (Faisst y col., 1992, y sus referencias). La eficacia de la transcripción también se puede aumentar alterando la secuencia del promotor mediante mutación (sustitución, inserción o deleción) de una, dos, tres o varias bases y determinando a continuación, en un ensayo de información génica, si de este modo se aumenta la actividad del promotor.

En general, los elementos reguladores adicionales comprenden promotores heterólogos, potenciadores, señales de terminación y de poliadenilación y otros elementos de control de la expresión. Para los distintos tipos celulares se conocen tanto secuencias inducibles como secuencias constitutivas reguladoras.

Los "elementos reguladores de la transcripción" comprenden normalmente un promotor aguas arriba de la secuencia génica a expresar, sitios de iniciación y de terminación de la transcripción, así como una señal de poliadenilación.

La expresión "sitio de iniciación de la transcripción" se refiere a un ácido nucleico en la estructura artificial, que se corresponde con el primer ácido nucleico que se incorpora en el primer transcrito, es decir, el ARNm precursor. El sitio de iniciación de la transcripción se puede solapar con las secuencias del promotor.

La expresión "sitio de terminación de la transcripción" se refiere a una secuencia de nucleótidos que normalmente está presente en el extremo 3' del gen de interés o del fragmento del gen a transcribir y que produce la terminación de la transcripción mediante ARN-polimerasa.

La "señal de poliadenilación" es una secuencia señal que produce la separación en un sitio específico en el extremo 3', del ARNm eucariótico y la formación postranscripcional de una secuencia de aproximadamente 100-200 nucleótidos de adenina (cola poliA) en el extremo 3' separado. La señal de poliadenilación comprende la secuencia AATAAA, aproximadamente 10-30 nucleótidos aguas arriba del sitio de separación, así como una secuencia situada aguas abajo. Se conocen distintos elementos de poliadenilación, p. ej., poliA de tk, poliA tardía y temprana de SV40 o poliA de BGH (descrita p. ej. en el documento US 5.122.458).

En una forma de realización preferida de la presente invención, cada unidad de transcripción dispone de un promotor o un promotor/elemento potenciador, un gen de interés y/o un gen del marcador, así como un elemento de terminación de la transcripción. En una forma de realización aún más preferida, la unidad de transcripción contiene otras unidades reguladoras de la transcripción.

Los "elementos reguladores de la traducción" comprenden un sitio de iniciación de la traducción (AUG) un codón de detención y una señal poli-A para cada polipéptido a expresar. Para una expresión óptima puede ser adecuado, eliminar, añadir o alterar regiones 5' y/o 3' no traducidas de la secuencia de ácidos nucleicos a expresar, para eliminar potenciales codones de iniciación de la traducción adicionales, no adecuados u otras secuencias que pueden influir sobre la expresión a nivel de la transcripción o reducir la expresión. Para mejorar la expresión se pueden insertar alternativamente sitios de unión de consenso al ribosoma en la cercanía aguas arriba del codón de iniciación. Para producir un polipéptido secretor, el gen de interés contiene normalmente una secuencia señal que codifica un prepéptido señal que transporta el polipéptido sintetizado hasta y a través de la membrana ER. La secuencia señal se encuentra frecuentemente, pero no siempre, en el extremo aminoterminal de la proteína secretada y se separa por corte mediante peptidasas señal, después de que la proteína haya atravesado la membrana ER. La secuencia génica contiene frecuentemente, pero no necesariamente, una secuencia señal propia. Cuando la secuencia señal natural no está presente, se puede introducir de forma conocida una secuencia señal heteróloga. El experto en la técnica conoce una variedad de tales secuencias señal y están depositadas en bancos de datos de secuencias, como GenBank y EMBL.

Un elemento regulador de especial importancia, de acuerdo con la invención, es el sitio de unión al ribosoma (IRES). El "elemento IRES" comprende una secuencia que realiza funcionalmente la iniciación de la traducción independientemente de un casquete 5'-terminal de metilguanosinio (estructura CAP) así como del gen situado aguas arriba y facilita en una célula animal, la traducción de dos cistrones (marco de lectura abierto) a partir de un único transcrito. El elemento IRES pone a disposición un sitio de unión al ribosoma independiente, para la traducción del marco de lectura abierto, situado directamente aguas arriba. Al contrario que en el ARNm bacteriano, que puede ser multicistrónico, es decir, que puede codificar varios polipéptidos o productos distintos que se traducen uno detrás de otro a partir del ARNm, la mayoría de los ARNm de células animales son monocistrónicos y codifican sólo una proteína o un producto. En el caso de un transcrito multicistrónico en una célula eucariótica, la traducción se iniciaría en el sitio de iniciación de la traducción situado más próximo aguas arriba y terminaría con el primer codón de detención, después de lo cual se liberaría el transcrito del ribosoma. En la traducción se formaría por ello sólo el primer polipéptido o producto codificado por el ARNm. Por el contrario, un transcrito multicistrónico con un elemento IRES, que está ligado al segundo o a los siguientes marcos de lectura abiertos en el transcrito, facilita la traducción a continuación de los marcos de lectura abiertos situados aguas abajo, de modo que en la célula eucariótica se producen dos o varios polipéptidos o productos codificados por el mismo transcrito.

El elemento IRES puede tener distintas longitudes y distinto origen y, p. ej., proceder del virus de la encefalomiocarditis (EMCV) u otros picornavirus. En la bibliografía se han descrito distintas secuencias IRES y su uso en la construcción de vectores; véase, p. ej., Pelletier y col., 1988; Jang y col., 1989; Davies y col., 1992; Adam y col., 1991; Morgan y col., 1992; Sugimoto y col., 1994; Ramesh y col., 1996, Mosser y col., 1997.

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La secuencia génica situada aguas abajo está ligada funcionalmente con el extremo 3' del elemento IRES, es decir, la distancia se elige de modo que la expresión del gen no esté influida o lo esté sólo de forma marginal o bien muestre una expresión suficiente para la finalidad. La distancia óptima y admisible entre el elemento IRES y el codón de iniciación del gen situado aguas abajo, para una expresión que sea todavía suficiente, se calcula con pruebas sencillas variando la distancia y determinando la tasa de expresión como una función de la distancia con ayuda del ensayo del gen informador.

Con las medidas descritas, se puede obtener una casete de expresión óptima que sea de gran ayuda para la expresión de productos génicos heterólogos. Una casete de expresión obtenida mediante una o varias de dichas medidas es, por tanto, a su vez objeto de la invención.

Promotor Ubiquitina/S27a de hámster

En otra forma de realización el vector de expresión de acuerdo con la invención, contiene el promotor ubiquitina/S27a de hámster, preferentemente ligado funcionalmente con el gen de interés y todavía más preferido ligado funcionalmente con el gen de interés y el gen que codifica una proteína fluorescente.

El promotor ubiquitina/S27a de hámster es un promotor homólogo potente que está descrito en el documento WO 97/15664. Un promotor tal presenta preferentemente por lo menos una de las siguientes características: una región de la secuencia rica en GC, un sitio de unión a Sp1, un elemento de polipirimidina, ausencia de TATA-box. Se prefiere especialmente un promotor que muestra un sitio de unión a Sp1 en ausencia de una TATA-box. Adicionalmente se prefiere un promotor tal que esté activado constitutivamente y que especialmente, en condiciones de cultivo celular con contenido en suero, con poco suero y exento de suero esté activo de igual modo. En otra forma de realización se trata de un promotor inducible, especialmente de un promotor que se activa mediante la retirada de suero.

Una forma de realización especialmente ventajosa es un promotor con una secuencia de nucleótidos, contenida en la Fig. 5 del documento WO 97/15664. Especialmente preferidas son por ello las secuencias de promotor en las que está contenida la secuencia desde la posición -161 hasta -45 de la Fig. 5.

Los promotores empleados en los ejemplos de la presente descripción de patente, contienen cada uno una molécula de ADN con la secuencia desde la posición 1923 hasta 2406 de la SEQ ID NO:55 del protocolo de secuencias adjunto. Esta secuencia se corresponde con el fragmento -372 hasta +111 de la Fig. 5 del documento WO 97/15664 y representa el promotor preferido, es decir, un promotor preferido debería contener esta región de la secuencia. Otro fragmento de promotor adecuado contiene la secuencia desde la posición 2134 hasta 2406 (se corresponde con -161 hasta +111 en la Fig. 5 de WO 97/15664). Un promotor que sólo contiene la secuencia desde la posición 2251 hasta 2406 ya no es capaz de funcionar (se corresponde con la posición -45 hasta +111 de la Fig. 5 de WO 97/15664). Es posible una prolongación de la secuencia del promotor en dirección 5', partiendo de la posición 2134.

También se pueden emplear para ello subfragmentos funcionales de la secuencia completa del promotor ubiquitina/S27a de hámster, así como mutantes/variantes funcionales de la secuencia completa o subfragmentos de los mismos, que p. ej., se pueden modificar por sustitución, inserción o deleción. Los subfragmentos, mutantes o variantes correspondientes se designan a continuación también como "promotor modificado".

Un promotor modificado, combinado eventualmente con otros elementos reguladores, muestra preferentemente una actividad transcripcional que se corresponde con la del fragmento del promotor desde la posición 1923 hasta 2406 de la secuencia de nucleótidos indicada en SEQ ID NO:55 (-372 hasta +111 de la Fig. 5 de WO 97/15664). Un promotor modificado se manifiesta útil en el sentido de la invención, cuando posee una actividad transcripcional que muestra por lo menos 50%, mejor por lo menos 80%, aún mejor por lo menos 90% y todavía más preferentemente por lo menos 100% de la actividad del fragmento desde 1923 a 2406 (fragmento -372 hasta +111) en un ensayo comparativo de gen informador. Se prefieren especialmente los promotores modificados que muestran una homología de secuencia mínima con la secuencia de tipo silvestre SEQ ID NO:55 del promotor ubiquitina/S27a de hámster, de por lo menos 80%, mejor por lo menos 85%, preferentemente por lo menos 90%, aún mas preferido por lo menos 95% y especialmente preferido por lo menos 97% y poseen una actividad del promotor correspondiente en un ensayo comparativo de gen informador.

En un ensayo comparativo con gen informador correspondiente, se clonan los fragmentos de promotor que se van a someter a ensayo, incluida la secuencia de referencia, cada uno delante de un gen informador exento de promotor, que codifica, por ejemplo, luciferasa, fosfatasa alcalina segregada o proteína fluorescente verde (GFP). Estas estructuras artificiales (secuencia de promotor + gen informador) se introducen a continuación en las células del ensayo, p. ej., CHO-DG44, mediante transfección y se averigua la inducción de la expresión del gen informador mediante cada uno de los fragmentos de promotor, determinando el contenido en proteína de gen informador. Un ensayo correspondiente se encuentra también a modo de ejemplo en Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, 1994, actualizado.

La secuencia de promotor del promotor ubiquitina/S27a de hámster, así como los promotores modificados que, p. ej., también pueden comprender la región 5' no traducida o bien fragmentos elegidos de la misma, y la región codificadora, así como la región 3' no traducida del gen ubiquitina/S27a o fragmentos elegidos del mismo, pueden ser obtenidos por un experto en la técnica que conozca la secuencia descrita en WO 97/15664, mediante distintos métodos convencionales, como los descritos, p. ej., en Sambrook y col., 1989; Ausubel y col., 1994. Partiendo de la secuencia descrita en WO 97/15664, se puede elegir, p. ej., un trozo adecuado y sintetizar químicamente una sonda de oligonucleótidos que contenga la secuencia de ese trozo. Con una sonda tal, se puede clonar, p. ej., el gen de ubiquitina/S27a, o bien su región 5' no traducida o cualquier fragmento mediante hibridación a partir de una genoteca genómica de hámster. Mediante el ensayo con gen informador descrito anteriormente, el experto en la técnica puede identificar sin gran dificultad, fragmentos activos de promotor y emplearlos en el sentido de la invención. La región 5' no traducida o fragmentos especiales de la misma, se pueden conseguir fácilmente mediante amplificación con PCR con los cebadores correspondientes de ADN genómico o una genoteca genómica. Los fragmentos de la región 5' no traducida se pueden obtener también mediante digestión limitada con la exonucleasa III a partir de fragmentos de ADN mayores. Tales moléculas de ADN se pueden obtener también por sínstesis química o bien a partir de fragmentos sintetizados químicamente por ligación.

Mutantes por deleción, inserción y sustitución se pueden obtener mediante "mutagénesis específica del sitio" y/o "técnicas de mutagénesis basadas en PCR". Los métodos correspondientes se indican a modo de ejemplo en Lottspeich y Zorbas (1998) (capítulo 36.1) con otras referencias.

También es posible identificar y aislar mediante hibridación cruzada con sondas procedentes de la región 5' no traducida del gen ubiquitina/S27a de hámster o de la parte S27a del gen ubiquitina/S27a del hámster, o de la región 3' no traducida, secuencias de promotor adecuadas de genes homólogos correspondientes de otras especies, preferentemente de mamíferos. Las técnicas correspondientes se describen a modo de ejemplo en Lottspeich y Zorbas (1998) (capítulo 23). "Homólogo" en el sentido de la invención, son genes siempre que su secuencia de nucleótidos muestre una coincidencia de por lo menos 70%, mejor por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, aún más preferido por lo menos 95% y especialmente preferido 97% con la secuencia de nucleótidos del gen del cual es homólogo.

Mediante las medidas señaladas se puede obtener una casete de expresión óptima que tiene gran utilidad para la expresión de productos génicos heterólogos. Una casete de expresión obtenida con una o varias de tales medidas es, por tanto, objeto de la invención.

Preparación de vectores de expresión de acuerdo con la invención

La preparación del vector de expresión de acuerdo con la invención puede tener lugar básicamente mediante métodos convencionales, habituales para los expertos en la técnicas, como se describe, por ejemplo, en Sambrook y col., (1989). Ahí se encuentra también una descripción de los componentes funcionales de un vector, p. ej., promotores adecuados (además del promotor ubiquitina/S27a de hámster), potenciadores, señales de terminación y de poliadenilación, genes de resistencia a antibióticos, marcadores de selección, puntos de inicio de la replicación y señales de corte y empalme. Para la preparación se pueden utilizar vectores de clonación convencionales, p. ej., plásmidos, bacteriófagos, fagémidos, cósmidos o vectores víricos como baculovirus, retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados y virus herpes simples, pero también cromosomas/mini-cromosomas artificiales. Los vectores de expresión eucarióticos contienen típicamente también secuencias de procariontes, como p. ej., origen de replicación y genes de resistencia a antibióticos que facilitan la reproducción y la selección del vector en bacterias. Se conoce una variedad de vectores de expresión de eucariontes que contienen sitios de clonación múltiples para introducir una secuencia de polinucleótidos y algunos se pueden obtener comercialmente en distintas firmas como Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU.; Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.; Promega, Madison, WI, EE.UU. o BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA, EE.UU.

De forma habitual para el experto en la técnica, el promotor heterólogo, el gen de interés, así como el gen modificado de la fosfotransferasa de neomicina, como eventualmente el gen que codifica una proteína fluorescente, elementos reguladores adicionales como el sitio interno de unión al ribosoma (IRES), de potenciador o una señal de poliadenilación, se introducen en el vector de expresión. Un vector de expresión de acuerdo con la invención contiene como mínimo un promotor heterólogo, el gen de interés y un gen modificado de la fosfotransferasa de neomicina. Preferentemente, el vector de expresión contiene, además, un gen que codifica una proteína fluorescente. El uso de un promotor ubiquitina/S27a como promotor heterólogo está especialmente preferido de acuerdo con la invención. Se prefiere especialmente un vector de expresión en el que el promotor heterólogo, preferentemente un promotor ubiquitina/S27a, el gen de interés y el gen que codifica una proteína fluorescente, están ligados funcionalmente entre sí o en asociación funcional y el gen de la fosfotransferasa de neomicina está localizado en la misma unidad transcripcional o en una separada.

En el marco de la presente descripción, la expresión "asociación funcional" o "ligado funcionalmente" se refiere a dos o varias secuencias de ácidos nucleicos o partes de secuencias que están situadas de modo que pueden realizar su función prevista. Por ejemplo, un promotor/potenciador está ligado funcionalmente con una secuencia génica codificadora, cuando puede controlar o modular, en posición cis, la transcripción de la secuencia génica asociada. En general, pero no necesariamente, las secuencias de ADN ligadas funcionalmente se encuentran en estrecha proximidad y en el mismo marco de lectura, siempre que dos secuencias génicas codificadoras estén ligadas o en el caso de una secuencia de señal de secreción. Aunque un promotor ligado funcionalmente se encuentra generalmente aguas arriba de la secuencia génica codificadora, no tiene que estar obligatoriamente en estrecha proximidad. Los potenciadores tampoco tienen que estar en estrecha proximidad, mientras que intensifiquen la transcripción de la secuencia génica. Para este fin pueden encontrarse tanto aguas arriba como aguas debajo de la secuencia génica, eventualmente con alguna distancia. Un sitio de poliadenilación está ligado funcionalmente con una secuencia génica, cuando está situado en el extremo 3' de la secuencia génica, de modo que la transcripción avanza por la secuencia codificadora hasta la señal de poliadenilación. La asociación puede realizarse según métodos recombinantes conocidos, p. ej., mediante la técnica de PCR, mediante ligación en sitios adecuados de corte por restricción o mediante corte y empalme. Cuando no están presentes sitios de corte de restricción adecuados, se pueden emplear enlazadores de oligonucleótidos o adaptadores sintéticos, conocidos. La asociación funcional no tiene lugar preferentemente, de acuerdo con la invención, a través de secuencias de intrones.

En una de las formas de realización descritas, el promotor heterólogo, preferentemente un promotor ubiquitina/S27a, el gen de interés y el gen que codifica una proteína fluorescentes, están ligados funcionalmente entre sí. Esto significa, p. ej., que tanto el gen de interés como el gen que codifica una proteína fluorescente se expresan partiendo del mismo promotor heterólogo. En una forma de realización especialmente preferida, la asociación funcional tiene lugar a través de un elemento IRES, de modo que se sintetiza un ARNm bicistrónico a partir de ambos genes. El vector de expresión de acuerdo con la invención puede contener adicionalmente elementos de potenciador, que tienen un efecto funcional sobre uno o varios promotores. Se prefiere especialmente un vector de expresión en el que el promotor heterólogo, preferentemente el promotor ubiquitina/S27a o una forma modificada del mismo, está ligado con un elemento de potenciador, p. ej., un potenciador de SV40 o un elemento de potenciador de CMV.

Básicamente, la expresión del gen dentro de un vector de expresión puede tener lugar a partir de una o varias unidades transcripcionales. Como "unidad transcripcional" se define en este caso una región que contiene uno o varios genes a transcribir. Para ello, los genes dentro de una unidad transcripcional están ligados entre sí funcionalmente de tal modo que todos los genes dentro de dicha unidad están bajo el control transcripcional del mismo promotor o promotor/potenciador. Como resultado de esta asociación transcripcional de los genes, se puede transcribir más de una proteína o producto a partir de una unidad transcripcional y, por tanto, expresar. Cada unidad transcripcional contiene para ello los elementos reguladores que son necesarios para la transcripción y la traducción de las secuencias génicas contenidas en la misma. Cada unidad transcripcional puede, por consiguiente, contener los mismos o distintos elementos reguladores. Para la asociación funcional de los genes dentro de una unidad transcripcional, se pueden utilizar elementos IRES o intrones.

El vector de expresión puede contener una sola unidad transcripcional para la expresión del gen de interés, del gen NPT modificado y, eventualmente, el gen que codifica la proteína fluorescente. Alternativamente, estos genes pueden estar dispuestos también en dos o varias unidades transcripcionales. Para ello son posibles distintas combinaciones de los genes dentro de una unidad transcripcional. En otra forma de realización de la presente invención, se puede introducir más de un vector de expresión, compuesto por uno, dos o varias unidades transcripcionales, en una célula hospedadora mediante co-transfección o mediante transfección consecutiva en el orden deseado. Cada combinación de elementos reguladores y genes en cada vector se puede elegir, en tanto que se garantice una expresión suficiente de las unidades transcripcionales. En caso necesario se pueden situar sobre los vectores de expresión otros elementos reguladores y genes, como p. ej., genes adicionales de interés o marcadores de selección.

Por consiguiente, un vector de expresión de acuerdo con la invención que contiene un gen de interés y un gen que codifica una fosfotransferasa de neomicina modificada, puede contener ambos genes en una o en dos unidades transcripcionales separadas. Cada unidad transcripcional puede transcribir y expresar uno o varios productos génicos. Cuando ambos genes están contenidos en una unidad transcripcional, están bajo el control del mismo promotor o promotor/potenciador, utilizándose preferentemente un elemento IRES para garantizar la asociación funcional de todos los componentes. Cuando el gen que codifica la fosfotransferasa de neomicina modificada y el gen de interés están contenidos en dos unidades transcripcionales separadas, pueden estar bajo el control del mismo o de distintos promotores/potenciador. Preferentemente se emplea, sin embargo, para el gen NPT modificado un promotor heterólogo más débil, p. ej., el promotor temprano de SV40 y preferentemente no se emplea ningún potenciador. Los vectores de expresión con dos unidades transcripcionales separadas se prefieren en el marco de la invención. Para ello, una unidad transcripcional (bicistrónica) contiene el gen de interés y eventualmente un gen que codifica una proteína fluorescente, mientras que la otra unidad transcripcional contiene el gen NPT modificado. Preferentemente, cada unidad transcripcional está limitada en el extremo 3' por una secuencia que codifica una señal poliA, preferentemente poliA de BGH o poliA de SV40.

También están de acuerdo con la invención los vectores de expresión que en lugar del gen de interés sólo muestran un sitio de clonación múltiple, que facilita la clonación del gen de interés a través de secuencias de reconocimiento para endonucleasas de restricción. En el estado de la técnica se conocen numerosas secuencias de reconocimiento para las distintas endonucleasas de restricción, así como las endonucleasas de restricción pertenecientes a las mismas. Preferentemente se emplean secuencias que tienen al menos 6 nucleótidos como secuencia de reconocimiento. Un listado de las secuencias de reconocimiento adecuadas, se encuentra a modo de ejemplo en Sambrook y col.,
(1989).

Células hospedadoras

Para la transfección con el vector de expresión de acuerdo con la invención, se emplean células hospedadoras eucarióticas, preferentemente células de mamífero y especialmente células de roedores, como p. ej., líneas celulares de ratones, de ratas y de hámster. La transfección con éxito de las células correspondientes con un vector de expresión de acuerdo con la invención, da como resultado células transformadas, modificadas genéticamente, recombinantes o transgénicas que a su vez son objeto de la presente invención.

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Las células hospedadoras preferidas en el marco de la invención son células de hámster, tales como p. ej., las células BHK21, BHK TK^{-}, CHO, CHO-K1, CHO-DUKX CHODUKX B1 y CHO-DG44 o derivados/descendientes de estas líneas celulares. Se prefieren especialmente las células CHO-DG44, CHO-DUKX, CHO-K1 y BHK21, especialmente las células CHO-DG44 y CHO-DUKX. También son adecuadas las células de mieloma de ratón, preferentemente las células NSO y Sp2/0, así como derivados/descendientes de estas líneas celulares.

Ejemplos de células de hámster y de ratón que se pueden emplear de acuerdo con la invención, se indican en la Tabla 1 a continuación. Pero también se pueden emplear como células hospedadoras para la producción de proteínas biofarmacéuticas, los derivados y descendientes de estas células, otras células de mamífero, incluidas pero no limitadas a líneas celulares humanas, de ratón, de rata, de mono, de roedores o células eucarióticas, incluidas pero no limitadas a las células de levadura, de insectos y vegetales.

TABLA 1 Líneas celulares para producción de hámster y ratón

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La transfección de las células hospedadoras eucarióticas tiene lugar con un polinucleótido o un vector de expresión de acuerdo con la invención, según métodos convencionales (Sambrook y col., 1989; Ausubel y col., 1994). Métodos de transfección adecuados son, p. ej., la transfección mediada con liposomas, la co-precipitación con fosfato de calcio, la electroporación, la transfección mediada con policationes (p. ej., DEAE-dextrano), la fusión de protoplastos, la microinyección y las infecciones víricas. De acuerdo con la invención se realiza preferentemente una transfección estable, integrando las estructuras artificiales en el genoma de la célula hospedadora o en un cromosoma/minicromosoma artificial o están contenidas de forma episomal estable en la célula hospedadora. El método de transfección que facilita la frecuencia de transfección óptima y la expresión del gen heterólogo en la célula hospedadora correspondiente, se prefiere en este caso. Por definición, cada secuencia o cada gen que se introduce en una célula hospedadora se denomina "secuencia heteróloga" o "gen heterólogo" en relación con la célula hospedadora. Aún cuando la secuencia que se va a introducir o el gen que se va a introducir, sea idéntico a una secuencia endógena o a un gen endógeno de la célula hospedadora. Por ejemplo, un gen de actina de hámster que se va a introducir en una célula hospedadora de hámster, es por definición un gen heterólogo.

Están de acuerdo con la invención especialmente las células de mamífero recombinantes, preferentemente las células de roedores, se prefieren especialmente las células de hámster, como por ejemplo células CHO o BHK, que han sido transfectadas con uno de los vectores de expresión de acuerdo con la invención, descritos en esta memoria.

En la preparación recombinante de proteínas heterómeras, como p. ej., anticuerpos monoclonales (mAk), la transfección de las células hospedadoras adecuadas pueden tener lugar básicamente según dos vías distintas. Tales mAk están formados por varias subunidades de las cadenas pesada y ligera. Los genes que codifican estas subunidades, pueden estar localizados en unidades transcripcionales independientes o multicistrónicas sobre un único plásmido, con el cual se transfecta a continuación la célula hospedadora. Esto debe asegurar la representación estequiométrica de los genes después de la integración en el genoma de la célula hospedadora. Sin embargo, en caso de unidades transcripcionales independientes se tiene que asegurar que los ARNm que codifican las distintas proteínas muestren la misma estabilidad, eficacia en la transcripción y en la traducción. En el segundo caso, la expresión de los genes tiene lugar dentro de una unidad transcripcional multicistrónica con un solo promotor y se forma sólo un transcrito. Con el uso de elementos IRES se facilita una iniciación de la traducción interna de los genes muy eficaz en el segundo cistrón y en los cistrones siguientes. Sin embargo, las tasas de expresión de estos cistrones son menores que la del primer cistrón, cuya iniciación de la traducción a través de un complejo de preiniciación denominado dependiente de "cap" es claramente más eficaz que la iniciación de la traducción dependiente de IRES. Para alcanzar realmente una expresión equimolar del cistrón, se pueden introducir, por ejemplo, elementos intercistrónicos adicionales que tienen una acción conjunta con los elementos IRES para procurar tasas de expresión uniformes (documento WO 94/05785).

Otra posibilidad preferida, de acuerdo con la invención, para preparar simultáneamente varias proteínas heterólogas es la co-transfección, en la que los genes se integran en distintos vectores de expresión de forma separada. Esta tiene la ventaja de que se pueden determinar entre sí distintas proporciones de los genes y de los productos génicos, pudiéndose de este modo igualar las diferencias en la estabilidad del ARNm, así como en la eficacia de la trascripción y de la traducción. Además, los vectores de expresión son más estables por su menor tamaño y más fáciles de manejar en la clonación y en la transfección.

En una forma de realización especial de la invención, las células hospedadoras se transfectan, preferentemente se co-transfectan adicionalmente con uno o varios vectores con genes que codifican una o varias proteínas de interés diferentes. Los otros vectores o los empleados para la co-transfección, codifican, p. ej., la proteína de interés u otras proteínas bajo el control de la misma combinación de promotor/potenciador, así como por lo menos otro marcador de selección, p. ej., la reductasa de dihidrofolato.

Las células hospedadoras se establecen, adaptan y cultivan de acuerdo con la invención, bajo condiciones exentas de suero, eventualmente en medios que están exentos de proteínas/péptidos animales. Ejemplos de medios a disposición comercial son Ham F12 (Sigma, Deisenhofen, DE), RPMI-1640 (Sigma), medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM; Sigma), medio mínimo esencial (MEM; Sigma), medio Dulbecco modificado de Iscove (IMDM; Sigma), CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.), CHO-S-SFMII (Invitrogen), medio CHO exento de suero (Sigma) y medio CHO exento de proteínas (Sigma). Cada uno de estos medios puede completarse eventualmente con otros compuestos, p. ej., hormonas y/o otros factores de crecimiento (p. ej., insulina, transferrina, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento similar a la insulina), sales (p. ej., cloruro sódico, calcio, magnesio, fosfato), tampones (p. ej., HEPES), nucleósidos (p. ej., adenosina, timidina), glutamina, glucosa u otras sustancias nutritivas equivalentes, antibióticos y/o elementos traza. Aunque, de acuerdo con la invención, se prefieren los medios exentos de suero, también se pueden utilizar para el cultivo de células hospedadoras y para la posterior producción de proteínas, medios que se hayan mezclado con una cantidad adecuada de suero. Para la selección de células modificadas genéticamente que expresan uno o varios genes de marcadores de selección, se añade al medio uno o varios medios de selección adecuados.

Con "medio de selección" se denomina una sustancia que reduce el crecimiento o la supervivencia de las células hospedadoras con una deficiencia para cada gen del marcador de selección. En el marco de la presente invención, se emplea preferentemente geneticina (G418) como medio añadido para la selección de las células hospedadoras heterólogas que son portadoras de un gen modificado de la fosfotransferasa de neomicina. Preferentemente, se emplean concentraciones de G418 entre 100 y 800 \mug/ml de medio, especialmente preferidas son 300 a 400 \mug/ml de medio. Si las células hospedadoras han sido transfectadas con varios vectores de expresión, p. ej., cuando se tienen que introducir de forma separada varios genes de interés en la célula hospedadora, entonces éstas disponen casi siempre de distintos genes de marcadores de selección.

Un "gen de marcador de la selección" es un gen que facilita la selección específica de células que contienen este gen, añadiendo un medio de selección correspondiente al medio de cultivo. Como aclaración, un gen de resistencia a antibióticos se puede utilizar como marcador de selección positivo. Sólo las células que se han transformado con este gen, pueden crecer en presencia del antibiótico correspondiente y, por tanto, ser seleccionadas de este modo. Por el contrario, las células no transformadas no pueden crecer o sobrevivir con esas condiciones de selección. Existen marcadores de selección positivos, negativos y bifuncionales. Los marcadores de selección positivos facilitan la selección y, de este modo, el enriquecimientos de las células transformadas proporcionando una resistencia frente al medio de selección o compensando un defecto metabólico o catabólico de la célula hospedadora. Por el contrario, mediante un marcador de selección negativo, las células que han obtenido el gen para el marcador de selección, se pueden eliminar selectivamente. Un ejemplo de ello es el gen de la quinasa de timidina del virus Herpes Simplex, cuya expresión en las células conduce a su eliminación, añadiendo simultáneamente aciclovir o ganciclovir. El marcador de selección empleado en esta invención, incluyendo el marcador de selección amplificable, incluye mutantes y variantes alteradas por tecnología genética, fragmentos, equivalentes funcionales, derivados, homólogos y fusiones con otras proteínas o péptidos, en tanto que el marcador de selección mantenga sus propiedades selectivas. Tales derivados muestran una gran homología en la secuencia de aminoácidos en las regiones o los dominios a los que se atribuye la propiedad selectiva. En la bibliografía se describen una diversidad de genes de marcadores de selección, incluyendo marcadores bifuncionales (positivos/negativos) (véase, p. ej., los documentos WO 92/08796 y WO 94/28143). Ejemplos de marcadores de selección que se emplean normalmente en células de eucariontes implican los genes de la fosfotransferasa de aminoglicósido (APH), fosfotransferasa de higromicina (HYG), reductasa de dihidrofolato (DHFR), quinasa de timidina (TK), sintetasa de glutamina, sintetasa de asparragina y genes que proporcionan resistencia frente a neomicina (G418), puromicina, histidinol D, bleomicina, fleomicina y zeomicina.

Una selección de las células transformadas también es posible mediante citometría de flujo activada por fluorescencia (FACS). Para ello se utilizan, por ejemplo, \beta-galactosidasa bacteriana, marcador de la superficie celular o proteínas fluorescentes (p. ej., proteína fluorescente verde (GFP) y sus variantes de Aequorea victoria y Renilla reniformis u otras especies; proteínas fluorescentes rojas y proteínas fluorescentes de otros colores y sus variantes de organismos no bioluminiscentes, como p. ej., Discosoma sp., Anemonia sp., Clavularia sp., Zoanthus sp.) para la selección de células transformadas.

Expresión génica y selección de células hospedadoras de elevada producción

La expresión "expresión génica" se refiere a la transcripción y/o traducción de una secuencia génica heteróloga en una célula hospedadora. La tasa de expresión se puede determinar en general en este caso, bien en base a la cantidad de ARNm correspondiente que está presente en la célula hospedadora, o en base a la cantidad de producto génico producido que ha sido codificado por el gen de interés. La cantidad de ARNm obtenido mediante la transcripción de una secuencia de nucleótidos elegida se puede determinar, por ejemplo, mediante hibridación de la transferencia tipo Northern, protección del ARN de la ribonucleasa, hibridación in situ de ARN celular o por métodos de PCR (Sambrook y col., 1989; Ausubel y col., 1994). Las proteínas que han sido codificadas por una secuencia de nucleótidos elegida, se pueden determinar a su vez por diferentes métodos, como p. ej., ELISA, transferencia tipo Western, radioinmunoensayo, inmunoprecipitación, detección de la actividad biológica de la proteína o mediante inmunotinción de la proteína con análisis posterior con FACS, (Sambrook y col., 1989, Ausubel y col., 1994).

Con las expresiones "nivel (tasa) de expresión elevado", "expresión elevada", "expresión intensificada" o "productividad elevada" se designa la expresión o síntesis elevada y prolongada de una secuencia heteróloga introducida en una célula hospedadora, por ejemplo, un gen que codifica una proteína terapéutica. Una expresión intensificada o elevada o un(a) nivel (tasa) de expresión elevado(a) o una productividad elevada tiene lugar cuando una célula de acuerdo con la invención se cultiva según un procedimiento o amplificación génica descrita en esta memoria, de acuerdo con la invención, y cuando esta célula produce por lo menos más de aproximadamente 0,5 pg del producto génico deseado por día (0,5 pg/célula/día). Una expresión intensificada o elevada o un(a) nivel (tasa) de expresión elevado(a) o una productividad elevada tiene lugar también cuando la célula de acuerdo con la invención, sin amplificación génica anterior, produce por lo menos más de aproximadamente 1,0 pg del producto génico deseado por día (1,0 pg/célula/día). Una expresión intensificada o elevada o un(a) nivel (tasa) de expresión elevado(a) o una productividad elevada se produce especialmente también cuando la célula de acuerdo con la invención, sin amplificación génica anterior, produce por lo menos más de aproximadamente 1,5 pg del producto génico deseado por día (1,5 pg/célula/día). Una expresión intensificada o elevada o un(a) nivel (tasa) de expresión elevado(a) o una productividad elevada se produce especialmente también cuando la célula de acuerdo con la invención, sin amplificación génica anterior, produce por lo menos más de aproximadamente 2,0 pg del producto génico deseado por día (2,0 pg/célula/día). Una expresión especialmente intensificada o elevada o un(a) nivel (tasa) de expresión elevado(a) o una productividad especialmente elevada se produce también cuando la célula de acuerdo con la invención, sin amplificación génica anterior, produce por lo menos más de aproximadamente 3,0 pg del producto génico deseado por día (3,0 pg/célula/día). Mediante una etapa sencilla de amplificación génica, p. ej., con ayuda del sistema de amplificación DHFR/MTX, como se describe a continuación, se pueden aumentar las productividades por lo menos multiplicando por un factor 2 a 10, de modo que en relación con una célula, que se ha sometido a una etapa de amplificación génica, se habla de una "expresión elevada", "expresión intensificada" o "productividad elevada", cuando esta célula produce por lo menos más de aproximadamente 5 pg del producto génico deseado al día (5 pg/célula/día), preferentemente por lo menos más de aproximadamente 10 pg/célula/día, especialmente preferido por lo menos más de aproximadamente 15 pg/célula/día, aún más preferido por lo menos más de aproximadamente 20 pg/célula/día o bien por lo menos más de aproximadamente 30 pg/célula/día.

Una expresión elevada o intensificada, una productividad elevada o un(a) nivel(tasa) de expresión elevado(a), se pueden conseguir tanto con el uso de los vectores de expresión de acuerdo con la invención, como con el uso de un procedimiento de acuerdo con la invención.

Por ejemplo, mediante la co-expresión del gen de interés y un gen NPT modificado de acuerdo con la invención, se pueden seleccionar e identificar células que expresan el gen heterólogo en gran cantidad. La NPT modificada de acuerdo con la invención facilita, en comparación con la NPTwt, una selección eficaz de células hospedadoras transfectadas de forma estable con expresión elevada del gen heterólogo de interés.

Por tanto, también es un objeto de la invención, un procedimiento para la expresión de por lo menos un gen de interés en células de mamífero recombinantes, que está caracterizado porque (i) un grupo de células de mamífero se transfecta por lo menos con un gen de interés y un gen de una fosfotransferasa de neomicina modificada de acuerdo con la invención que, en comparación con la fosfotransferasa de neomicina de tipo silvestre, sólo muestra 1 a 80% de la actividad, preferentemente sólo 1 a 60%, más preferentemente sólo 1,5 a 30%, aún más preferentemente sólo 1,5 a 26%; (ii) las células se cultivan bajo condiciones que permiten una expresión del (de los) gen(es) de interés y del gen modificado de acuerdo con la invención de la fosfotransferasa de neomicina; (iii) las células de mamífero se cultivan en presencia de al menos un medio de selección, preferentemente G418, que tiene un efecto selectivo sobre el crecimiento de las células de mamífero y que favorece el crecimiento de las células que expresan el gen de la fosfotransferasa de neomicina modificado; y (iv) la(s) proteína(s) de interés se obtiene(n) a partir de las células de mamífero o a partir del material sobrenadante del cultivo. Preferentemente, se emplean en este caso células de mamífero recombinantes que han sido transfectadas con un vector de expresión de acuerdo con la invención.

Además, también es objeto de la presente invención un procedimiento para la selección de células de mamífero recombinantes que expresan por lo menos un gen de interés, (i) transfectándose un grupo de células de mamífero por lo menos con un gen de interés y un gen de una fosfotransferasa de neomicina modificada de acuerdo con la invención que, en comparación con la fosfotransferasa de neomicina de tipo silvestre, sólo muestra 1 a 80% de la actividad, preferentemente sólo 1 a 60%, más preferentemente sólo 1,5 a 30%, aún más preferentemente sólo 1,5 a 26%; (ii) cultivándose las células de mamífero bajo condiciones que permiten una expresión del (de los) gen(es) de interés y del gen modificado de acuerdo con la invención de la fosfotransferasa de neomicina; y (iii) cultivándose las células de mamífero en presencia de al menos un medio de selección, preferentemente G418, que tiene un efecto selectivo sobre el crecimiento de las células de mamífero y favorece el crecimiento de las células que expresan el gen modificado de la fosfotransferasa de neomicina.

Se prefieren especialmente los procedimientos para la expresión de por lo menos un gen de interés y para la selección de células recombinantes que expresan el gen de interés correspondiente, cuando se emplea un gen de NPT modificado, descrito con más detalle en esta solicitud, especialmente cuando se emplea un gen de NPT modificado que, en comparación con gen de tipo silvestre, en la posición del aminoácido 182, codifica glicina, en la posición del aminoácido 91 alanina, en la posición del aminoácido 198 glicina, en la posición del aminoácido 227 alanina o valina, en la posición del aminoácido 261 glicina o en la posición del aminoácido 240 isoleucina. Se prefiere especialmente el uso de los mutantes Asp227Val, Asp261Gly, Phe240Ile o Trp91Ala. En general, son adecuados para un procedimiento correspondiente, todos los genes de la fosfotransferasa de neomicina modificados de acuerdo con la invención, mencionados en esta memoria de patente. Para los genes preferidos de la fosfotransferasa de neomicina, véase el apartado - Genes modificados de la fosfotransferasa de neomicina.

La selección de las células que expresan un gen de interés y un gen de NPT modificado, tiene lugar, p. ej., mediante la adición de G418 como medio de selección. También es posible el uso de otros antibióticos aminoglicosídicos, tales como p. ej., neomicina o kanamicina. Se prefiere en este caso el cultivo y la selección de las células de acuerdo con la invención, en 200 a 800 \mug de G418 por ml de medio de cultivo. Se ha observado como especialmente preferida la adición de 300 a 700 \mug de G418 por ml de medio de cultivo. La adición de aproximadamente 400 \mug de G418 por ml de medio de cultivo representa la forma de realización más preferida. Con un procedimiento correspondiente se pueden seleccionar células recombinantes con tasas de expresión especialmente elevadas. En comparación con el uso de NPTwt como marcador de selección, estas células muestran después de la selección con 400 \mug de G418 por ml de medio de cultivo, en el caso de los mutantes Glu182Gly y Val198Gly, una productividad elevada multiplicada por un factor 1,4-2,4, en el caso del mutante Asp227Ala o Trp91Ala una productividad elevada multiplicada por un factor 2,2 o 4, en el caso del mutante Phe240Ile una productividad elevada multiplicada por un factor 5,7 o 7,3 y en el caso del mutante Asp261Gly o Asp227Val una productividad elevada multiplicada hasta por un factor 9,3 o 14,6. Las productividades específicas para cada gen de NPT modificado se presentan en la Fig. 6.

Los procedimientos correspondientes se pueden combinar con una selección apoyada en FACS, de las células hospedadoras recombinantes que contienen, como marcadores de selección adicionales, una (o varias) proteína(s) fluorescente (p. ej. GFP) o un marcador de la superficie celular. Otros métodos para conseguir una expresión intensificada, pudiendo ser también posible una combinación de distintos métodos, se basan, por ejemplo, en el uso de factores de transcripción (artificiales), tratamiento de las células con agentes naturales o sintéticos para la regulación positiva de la expresión génica endógena o heteróloga, mejora de la estabilidad (semivida) del ARNm o de la proteína, mejora de la iniciación de la traducción del ARNm, aumento de la dosis génica mediante el uso de plásmidos episomales (basándose en el uso de secuencias víricas como origen de replicación, p. ej., de SV40, polioma, adenovirus, EBV o BPV), uso de secuencias que promueven la amplificación (Hemann y col., 1994) o sistemas de amplificación in vitro basados en concatómeros de ADN (Monaco y col., 1996).

Una transcripción acoplada del gen de interés y del gen que codifica la proteína fluorescente, se ha observado como especialmente eficaz junto con el uso de un gen de NPT modificado de acuerdo con la invención como marcador de la selección. A partir de los ARNm bicistrónicos resultantes se expresa tanto la proteína/producto de interés como la proteína fluorescente. Debido a este acoplamiento de la expresión de la proteína de interés y de la proteína fluorescente, es muy fácil identificar y aislar de acuerdo con la invención, células hospedadoras recombinantes de producción elevada a través de la proteína fluorescente expresada, p. ej. mediante clasificación con ayuda de un aparato de citometría de flujo activada por fluorescencia (FACS).

La selección de las células hospedadoras recombinantes que muestran una alta vitalidad y una tasa de expresión elevada del producto génico deseado, es un proceso de etapas múltiples. Las células hospedadoras transfectadas con el vector de expresión de acuerdo con la invención, o eventualmente co-transfectadas con otro vector, se cultivan bajo condiciones que permiten una selección de las células que expresan la NPT modificada, p. ej., cultivando en presencia de un medio de selección, tal como aproximadamente G418 en concentraciones de 100, 200, 400, 600, 800 \mug o más de G418/ml de medio de cultivo. A continuación, se analizan las células correspondientes en tanto a la expresión del gen acoplado con el gen de interés que codifica una proteína fluorescente, para identificar las células/poblaciones celulares y extraer las que muestran las tasas de expresión más elevadas de proteína fluorescente. Preferentemente, sólo se extraen y se siguen cultivando las células que pertenecen al 10-20% de las células con la mayor tasa de expresión de proteína fluorescente. Esto significa en la práctica que se extrae y se sigue cultivando el 10% más luminoso de las células fluorescentes. De forma correspondiente, también se puede extraer y multiplicar el 5% más luminoso, preferentemente el 3% más luminoso o también sólo el 1% más luminoso de las células fluorescentes de una mezcla de células. En una forma de realización especialmente preferida sólo se extrae y se multiplica el 0,5% más luminoso o el 0,1% más luminoso de las células fluorescentes.

La etapa de selección se puede realizar en el grupo de células o con grupos de células/clones celulares clasificados previamente. Se pueden realizar una o varias, preferentemente dos o más y especialmente tres o más etapas de clasificación, cultivando y multiplicando las células entre las distintas etapas de la clasificación, durante un periodo de tiempo determinado, p. ej., aproximadamente dos semanas en el caso de grupos. En las figuras 11 y 12 se presentan productividades específicas después de una clasificación basándose en FACS con y sin etapa de amplificación génica, como ejemplo, para el mutante Asp227Gly.

Por tanto, es un objeto de la invención también un procedimiento para obtener y seleccionar células de mamífero recombinantes que expresan por lo menos un gen heterólogo de interés, caracterizado porque (i) células de mamífero recombinantes se transfectan con un vector de expresión de acuerdo con la invención; (ii) las células transfectadas se cultivan bajo condiciones que permiten una expresión del (de los) gen(es) de interés, del gen que codifica una proteína fluorescente y del gen modificado de la fosfotransferasa de neomicina; (iii) las células de mamífero se cultivan en presencia de al menos un medio de selección, que tiene un efecto selectivo sobre el crecimiento de las células de mamífero y que favorece el crecimiento de las células que expresan el gen de la fosfotransferasa de neomicina modificado; y (iv) se clasifican mediante un análisis de la citometría de flujo las células de mamífero que muestran una expresión especialmente elevada del gen fluorescente. Opcionalmente, se pueden repetir una o varias veces las etapas ii)-iv) con las células obtenidas en la etapa iv).

Se prefiere un procedimiento correspondiente que está caracterizado porque las células de mamífero clasificadas poseen una productividad específica media, sin una etapa adicional de amplificación génica, superior a 0,5 pg del (de los) producto(s) génico(s) deseado(s) por día y célula (0,5 pg/célula/día), preferentemente superior a 1 pg/célula/día, especialmente preferido superior a 2 pg/célula/día, más preferido superior a 3 pg/célula/día, aún más preferido superior a 4 pg/célula/día, por ejemplo superior a 5, 6, 7, 8, 9, 10 etc, superior a 15, 20, 25 pg/célula/día, etc. Tal y como se ha mencionado anteriormente, la productividad de estas células se puede aumentar, mediante una simple etapa de amplificación génica, por ejemplo, con el uso del sistema DHFR/MTX, por lo menos multiplicando por un factor 2 a 10. Esto se muestra a modo de ejemplo en la Figura 12, para la selección con ayuda del mutante de NPT Asp227Gly. Las productividades específicas se encontraban entre 20 y 25 pg/célula/día.

Un procedimiento de acuerdo con la invención también es en el que las células clasificadas correspondientes se multiplican y se emplean para la preparación del producto génico codificador de interés. Para ello, las células seleccionadas con producción elevada se cultivan preferentemente en un medio de cultivo exento de suero y preferentemente en un cultivo en suspensión, bajo condiciones que permiten una expresión del gen de interés. La proteína/producto de interés se obtiene del medio de cultivo preferentemente, como un producto génico secretado. En el caso de expresión de la proteína sin señal de secreción, el producto génico también se puede aislar a partir de lisados celulares. Para obtener un producto homogéneo y puro que esté exento esencialmente de otras proteínas recombinantes y proteínas de la célula hospedadora, se realizan etapas de purificación habituales. Para ello, se eliminan frecuentemente en primer lugar las células y los restos celulares del medio de cultivo o del material lisado. El producto génico deseado se puede liberar entonces de las proteínas, polipéptidos y ácidos nucleicos solubles contaminantes, p. ej., mediante fraccionamiento en columnas de inmunoafinidad y de intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC de fase inversa o cromatografía sobre sephadex, sílice o resinas de intercambio catiónico, como DEAE. Los métodos que conducen a la purificación de una proteína heteróloga expresada por una célula hospedadora recombinante, son conocidos por el experto en la técnica y están descritos en la bibliografía, p. ej., por Harris y col. (1995) y Scopes (1988).

Gen del marcador de selección amplificable

Además, las células de acuerdo con la invención se pueden someter opcionalmente también a una o a varias etapas de amplificación génica, en donde éstas se cultivan en presencia de un medio de selección, que conduce a una amplificación de un gen de marcador de selección amplificable. Esta etapa puede tener lugar con células que expresan una proteína fluorescente y que preferentemente se habían clasificado con FACS una o varias veces (preferentemente de un modo descrito en esta memoria) y también con células que no han sido clasificadas.

La condición es que las células hospedadoras estén transfectadas adicionalmente con un gen que codifique el marcador de selección amplificable. Es imaginable que el gen que codifica un marcador de selección amplificable, esté presente en uno de los vectores de expresión de acuerdo con la invención o, que con ayuda de otro vector, se introduzca en la célula hospedadora.

El gen del marcador de selección amplificable codifica generalmente una enzima que es necesaria para el crecimiento de células eucarióticas bajo determinadas condiciones de cultivo. Por ejemplo, el gen del marcador de selección amplificable puede codificar la reductasa de dihidrofolato (DHFR). En este caso, el gen se amplifica cuando una célula hospedadora transfectada con el mismo, se cultiva en presencia del medio de selección metotrexato (MTX).

En la Tabla 2 siguiente se indican ejemplos de otros genes de marcadores de selección amplificables, utilizables de acuerdo con la invención y los medios de selección pertenecientes a cada uno que están descritos en un resumen de Kaufman, Methods in Enzymology, 185:537-566 (1990).

TABLA 2 Genes de marcadores de selección amplificables

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Como gen del marcador de selección amplificable se prefiere, de acuerdo con la invención, un gen que codifica un polipéptido con la función de DHFR, p. ej., DHFR o una proteína de fusión a partir de la proteína fluorescente y DHFR. DHFR es necesario para la biosíntesis de purinas. Las células en las que falta el gen DHFR no pueden crecer en medio deficiente de purinas. El gen DHFR es, por tanto, un marcador de selección útil para la selección y la amplificación de genes en células que se van a cultivar en un medio exento de purinas. El medio de selección que se utiliza en relación con el gen DHFR es metotrexato (MTX).

La presente invención incluye, por tanto, un método para la preparación y selección de células de mamífero recombinantes que contiene las siguientes etapas: (i) transfectar células hospedadoras con genes que codifican por lo menos una proteína/producto de interés, una fosfotransferasa de neomicina modificada de acuerdo con la invención y DHFR; (ii) cultivar las células bajo condiciones que facilitan una expresión de los distintos genes; y (iii) amplificar estos genes co-integrados cultivando las células en presencia de un medio de selección que permite la amplificación, por lo menos del gen del marcador de selección amplificable, como p. ej., metotrexato. Preferentemente, las células transfectadas se cultivan en este caso en medio exento de hipoxantina/timidina en ausencia de suero y con adición de concentraciones crecientes de MTX. La concentración de MTX es preferentemente, por lo menos 5 nM en la primera etapa de amplificación. La concentración de MTX también puede ser por lo menos 20 nM o 100 nM y se puede aumentar gradualmente hasta 1 \muM. En casos aislados también se pueden utilizar concentraciones de más de 1 \muM, p. ej., 2 \muM.

Si las células correspondientes están transformadas adicionalmente con una proteína fluorescente, estas células se pueden identificar y clasificar con ayuda de un aparato de citometría de flujo activada por fluorescencia (FACS) y a continuación, cultivar y amplificar en una etapa de amplificación génica, en presencia de por lo menos MTX 20 nM, preferentemente en presencia de MTX 50 nM o 100 nM,. De este modo se puede conseguir un aumento considerable de las productividades hasta más de 20 pg de producto génico por célula y día, preferentemente más de 21, 22, 23, 24, 25, etc, 30, 35, 40, etc. Las células hospedadoras se pueden someter a una o varias etapas de amplificación génica, para aumentar el número de copias de por lo menos el gen de interés y el gen del marcador de selección amplificable. De acuerdo con la invención, la productividad elevada obtenible está ligada con una preselección eficaz mediante una resistencia mediada por la fosfotransferasa de neomicina, frente a antibióticos aminoglicosídicos, tales como neomicina, kanamicina y G418. De este modo es posible reducir el número de las etapas de amplificación génica necesarias y, p. ej., realizar sólo una sola amplificación génica.

En otra realización, la presente invención se refiere también a procedimientos para obtener y seleccionar células de mamífero recombinantes que expresan por lo menos un gen heterólogo de interés y que están caracterizadas porque (i) las células recombinantes de mamífero se transfectan con un vector de expresión de acuerdo con la invención, así como con el gen de un marcador de selección amplificable; (ii) las células de mamífero se cultivan bajo condiciones que permiten una expresión del(de los) gen(es) de interés, del gen modificado de la fosfotransferasa de neomicina y del gen que codifica una proteína fluorescente; (iii) las células de mamífero se cultivan en presencia de al menos un medio de selección que tiene un efecto selectivo sobre el crecimiento de las células de mamífero y favorece el crecimiento de las células que expresan el gen de la fosfotransferasa de neomicina; (iv) se clasifican mediante un análisis de citometría de flujo las células de mamífero que muestran una elevada expresión de la proteína fluorescente; (v) las células clasificadas se cultivan en unas condiciones bajo las cuales se expresa el gen del marcador de selección amplificable; y (vi) al medio de cultivo se añade un medio de selección que tiene como consecuencia la amplificación del gen del marcador de selección amplificable.

Se prefiere especialmente un procedimiento correspondiente, en tanto que se empleen los genes modificados de la fosfotransferasa de neomicina descritos en esta invención. Además, se prefiere un procedimiento en el que sólo se realice una etapa de amplificación. También se prefiere un procedimiento correspondiente que conduce a las células de mamífero recombinantes que muestran una productividad específica media superior a 20 pg, preferentemente superior a 21, 22, 23, 24, 25, etc., 30, 35, 40, etc. del(de los) producto(s) génico(s) deseado(s) por célula y por día.

Las células de mamífero, especialmente células de mieloma de ratón y células de hámster, son células hospedadoras preferidas para el uso de DHFR como marcador de selección amplificable. Se prefieren especialmente las líneas celulares CHO-DUKX (ATCC CRL-9096) y CHO-DG44 (Urlaub y col., 1983) ya que por la limitación de la mutación no presentan ninguna actividad DHFR propia. Para poder utilizar la amplificación con la limitación de DHFR también en otros tipos de células, que poseen una actividad DHFR propia endógena, se puede utilizar en la transfección un gen DHFR mutado que codifica una proteína con una sensibilidad reducida frente a metotrexato (Simonson y col., 1983; Wigler y col., 1980; Haber y col., 1982).

El marcador DHFR, cuando se emplean células elementales negativas para DHFR, tales como CHO-DG44 o CHO-DUKX, es muy adecuado para la selección y consiguiente amplificación porque estas células no expresan DHFR endógeno y por ello no pueden crecer en medio exento de purinas. Por eso se puede emplear en este caso el gen de DHFR como marcador de selección dominante y las células transformadas se seleccionan en medio exento de hipoxantina/timidina.

A continuación se describe con más detalle la invención, en virtud de los ejemplos de ejecución no limitantes.

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Ejemplos Abreviaturas

Ala (=A):

alanina

AP:

fosfatasa alcalina

Asn (=N):

asparragina

Asp (=D):

ácido aspártico

bp:

pares de bases

BSA:

seroalbúmina de ternera

CHO:

ovario de hámster chino

dhfr:

reductasa de dihidrofolato

DMSO:

sulfóxido de dimetilo

ELISA:

ensayo inmunoenzimático

FACS:

citometría de flujo activada por fluorescencia

FITC:

isotiocianato de fluoresceína

GFP:

proteína fluorescente verde

Glu (=E):

ácido glutámico

Gly (=G):

glicina

HBSS:

solución salina equilibrada de Hanks

HT:

hipoxantina/timidina

Ile (=I):

isoleucina

IRES:

sitio interno de entrada al ribosoma

kb:

kilobases

mAk:

anticuerpo monoclonal

MCP-1:

proteína-1 quimiotáctica de monocitos

MTX:

metotrexato

MW:

media

NPT:

fosfotransferasa de neomicina

PCR:

reacción en cadena de la polimerasa

PBS:

solución salina tamponada con fosfato

Phe (=F):

fenilalanina

Trp (=W):

triptófano

Val (=V):

valina

WT:

tipo silvestre

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Métodos 1. Cultivo celular y transfección

Las células CHO-DG44/dhfr^{-/-} (Urlaub y col., 1983) se cultivaron de forma permanente como células en suspensión en medio exento de suero y medio CHO-S-SFMII suplementado con hipoxantina y timidina (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, DE) en matraces para cultivos celulares a 37ºC, en atmósfera húmeda y 5% de CO_{2}. El número de células y la viabilidad se determinaron con un CASY1 Cell Counter (Schaerfe System, DE) o mediante tinción con azul de tripano y a continuación se sembraron las células con una concentración de 1-3 x 10^{5}/ml y se dieron pases cada 2-3 días.

Para la transfección de CHO-DG44 se empleó el reactivo Lipofectamina Plus (Invitrogen GmbH). Por cada tanda de transfección, se mezclaron en total 1 \mug de ADN plasmídico, 4 \mul de Lipofectamina y 6 \mul de reactivo Plus, según las instrucciones del fabricante y se añadió en un volumen de 200 \mul a 6 x 10^{5} células CHO-DG44 en crecimiento exponencial, en 0,8 ml de medio CHO-S-SFMII enriquecido con HT. Después de tres horas de incubación a 37ºC en un incubador celular, se realizó la adición de 2 ml de medio CHO-S-SFMII enriquecido con HT. Para la selección basada en NPT, las células se transfirieron 2 días después de la transfección, a un medio CHO-S-SFMII enriquecido con HT con G418 (Invitrogen), cambiándose el medio cada 3 o 4 días. Normalmente se añadieron 400 \mug/ml de G418 para la selección, aunque en algunas series experimentales se redujo la concentración también a 200 \mug/ml o bien se aumentó a 500, 600 o 800 \mug/ml. En una selección basada en NPT y DHFR, en caso de una co-transfección, en la que un vector de expresión contenía un marcador de selección de DHFR y el otro vector de expresión contenía un marcador de selección de fosfotransferasa de neomicina, las células se transfirieron 2 días después de la transfección a un medio CHO-S-SFMII sin adición de hipoxantina ni de timidina y también se añadió al medio G418 (Invitrogen) en una concentración de 400 \mug/ml. Una amplificación génica basada en DHFR del gen heterólogo integrado, se puede conseguir añadiendo el agente de selección MTX (Sigma, Deisenhofen, DE) en una concentración de 5-2000 nM a un medio CHO-S-SFMII exento de HT.

2. Vectores de expresión

Para el análisis de la expresión, se emplearon vectores de expresión eucarióticos que se basan en el vector pAD-CMV (Werner y col., 1998) y que median en la expresión constitutiva de un gen heterólogo mediante la combinación del potenciador de CMV/promotor ubiquitina/S27a de hámster (documento WO 97/15664). Mientras que el vector base pBID contiene el minigen dhfr, que sirve como marcador de selección amplificable (véase, p. ej., el documento EP-0393438) en el vector pBIN se sustituye el minigen dhfr por un gen de resistencia a la fosfotransferasa de neomicina (Fig. 1). Para ello se aisló el marcador de selección fosfotransferasa de neomicina, incluido el promotor temprano de SV40 y la señal de poliadenilación de K, del plásmido comercial pBK-CMV (Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU.) como un fragmento de 1640 pb Bsu36I. Después de una reacción de relleno de los extremos del fragmento mediante la polimerasa de ADN Klenow, el fragmento se ligó con el fragmento de 3750 pb Bsu36I/StuI del vector pBID que, a su vez se había tratado con la polimerasa de ADN Klenow.

En el vector base bicistrónico pBIDG (Fig. 1) se aisló la región del gen IRES-GFP del vector pIRES2-EGFP (Clontech, Palo Alto, CA, EE.UU.) y se mantuvo bajo el control del potenciador/promotor de CMV en el vector pBID, de modo que un sitio de clonación múltiple permanecía entre la región del promotor y el elemento IRES. Para ello se procedió del modo siguiente. En una mutagénesis con PCR, en donde el plásmido pIRES2-EGFP servía como molde, por un lado, el punto de corte de HindIII AAGCTT, dentro de la secuencia IRES se cambió mediante el uso de un cebador mutágeno por la sucesión de la secuencia ATGCTT y se eliminó de este modo. Por otro lado, mediante un cebador complementario con el extremo 5' de la secuencia IRES, se introdujo un punto de corte de XbaI o bien complementario con el extremo 3' de la secuencia GFP, se introdujo un punto de corte de SpeI. El fragmento de PCR resultante que abarcaba la secuencia IRES y GFP completa, se digirió con XbaI y SpeI y se clonó en el punto de corte singular de XbaI en el extremo 3' del sitio de clonación múltiple del vector pBID. Del mismo modo la región del gen IRES-GFP del vector pIRES2-EGFP, bajo el control del potenciador de CMV/promotor ubiquitina/S27a de hámster, se llevó al vector pBIN. De este modo se obtenía el vector base bicistrónico pBING (Fig. 1).

El ADNc humano MCP-1 (Yoshimura y col., 1989) se clonó como un fragmento de 0,3 kb HindIII/EcoRI en los sitios de corte correspondientes del vector pBIN, dando como resultado el vector pBIN-MCP1 (Fig. 2A).

Para la expresión de un anticuerpo monoclonal humanizado IgG2, se clonó la cadena pesada en forma de un fragmento de 1,5 kb BamHI/HindIII en el vector pBID o pBIDG digerido respectivamente, con BamHI y HindIII, dando como resultado el vector pBID-HC o pBIDG-HC (Fig. 2B). La cadena ligera, por el contrario, se clonó como un fragmento de 0,7 kb BamHI/HindIII en los sitios de corte correspondientes del vector pBIN o pBING, dando como resultado el vector pBIN-LC o pBING-LC (Fig. 2B).

3. FACS

Los análisis y las clasificaciones con citometría de flujo se realizaron con un aparato Coulter Epics Altra. La FACS está equipada con un láser de helio y argón, con una longitud de onda de excitación de 488 nm. La intensidad de la fluorescencia se registra en una de las longitudes de onda adecuada para la proteína fluorescente y se procesa mediante el programa incluido Coulter Expo32. La clasificación se realiza convencionalmente con una tasa de 8000-10000 resultados/segundo. Las células suspendidas se pueden separar por centrifugación (5 min a 180 x g) y ajustar a una concentración celular de 1-5 x 10^{7}/ml en HBSS. A continuación, puede tener lugar una clasificación de las células según su señal de proteína fluorescente. Las células se recogen en tubitos con medio de cultivo colocado previamente, se separan por centrifugación y dependiendo del número de células clasificadas, se siembran en recipientes adecuados para cultivo o se colocan directamente en placas de microtitulación.

4. ELISA

El título de MCP-1 en el material sobrenadante de células CHO-DG44 transfectadas de forma estable, se cuantificó mediante ELISA, con el equipo de reactivos OptEIA Human MCP-1 Set, según el protocolo del fabricante (BD Biosciences Pharmingen, Heidelberg, DE).

La cuantificación del mAk IgG2 en el material sobrenadante de células CHO-DG44 transfectadas de forma estable tuvo lugar mediante ELISA, según protocolos convencionales (Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y col., 1994, actualizado) empleándose por un lado un fragmento Fc de IgG de cabra anti-humana (Dianova, Hamburgo, DE) y por otro lado un anticuerpo de cadena ligera kappa de cabra anti-humano conjugado con AP (Sigma). Como patrón servía el anticuerpo IgG2 purificado.

Las productividades (pg/célula/día) se calcularon con la fórmula pg/((Ct-Co)t/In(Ct-Co)), en donde Co y Ct indican el número de células en la siembra o en la cosecha y t la duración del cultivo.

5. Ensayo de mancha para la determinación de la actividad enzimática de NPT

Para la preparación de un extracto celular según un protocolo de Duch y col., 1990, se lavaron dos veces 6 x 10^{6} células con PBS y a continuación se resuspendieron en 600 \mul de tampón de extracción (Tris-HCl 0,135 M, pH 6,8, 20% de glicerina, ditiotreitol 4 mM). Después de congelar y descongelar cuatro veces en hielo seco o baño de agua, se eliminaron los residuos celulares por centrifugación y el material sobrenadante se empleó para el siguiente ensayo enzimático. La concentración de proteínas en los extractos celulares se determinó mediante un ensayo de Bradford empleando el ensayo de proteínas de BIO-RAD (Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, DE), sirviendo BSA como proteína patrón (Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y col., 1994, actualizado). Para determinar la actividad enzimática de NPT, se realizó un ensayo de mancha en base al protocolo de Platt y col. 1987. Para ello se tomaron en cada caso 5 \mug, 2,5 \mug y 1,25 \mug de proteína con tampón de extracción hasta obtener un volumen final de 20 \mul, rellenando con extracto celular de células CHO-DG44 no transfectadas, hasta obtener un contenido en proteínas total, en cada caso, de 5 \mug. Después de añadir respectivamente 200 \mul de tampón del ensayo (Tris-HCl 67 mM, pH 7,1, MgCl_{2} 42 mM, NH_{4}Cl 400 nM) más/menos 40 \mug/ml de G418 y más/menos 5 \muCi de [\gamma-^{33}P]-ATP/ml (NEN), los extractos se incubaron a 27ºC durante 135 minutos. A continuación, los extractos se filtraron en un colector a vacío de 96 pocillos (Schleicher & Schüll, Dassel, DE) mediante un sándwich compuesto de una capa de papel 3MM de Whatman, membrana de fosfocelulosa P81 (Whatman Laboratory Division, Maidstone, GB) y membrana de nitrocelulosa (Schleicher & Schüll). Las proteínas fosforiladas con proteinquinasas así como las proteínas no fosforiladas se unen a la nitrocelulosa, mientras que G418 fosforilada pasa a través de la nitrocelulosa y se une a la fosfocelulosa. Después de lavar posteriormente tres veces con H_{2}O desionizada, se recogieron las membranas del aparato, se lavaron otra vez con H_{2}O y a continuación se secaron al aire. La cuantificación de las señales radiactivas tuvo lugar mediante un Phospho Imagers (Molecular Dynamics, Krefeld, DE).

6. Análisis mediante transferencia tipo Northern

El aislamiento del ARN total de las células tuvo lugar con el reactivo TRIZOL, según las instrucciones del fabricante (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, DE) y la separación en gel de electroforesis de, en cada caso, 30 \mug de cada ARN, así como la transferencia a una membrana de nilon de Hybond N+ (Amersham Biosciences, Freiburg, DE), según el protocolo convencional para ARN desnaturalizado con glioxal/DMSO (Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y col., 1994, actualizado). Como sonda para la siguiente hibridación no radiactiva con el equipo de reactivos de Genelmages CDP-Star Detection Kit (Amersham Biosciences), se utilizó un producto de PCR marcado con FITC-dUTP con el equipo de reactivos de Genelmages random prime labelling Kit (Amersham Biosciences, Freiburg, DE) que abarcaba la región codificadora del gen de NPT, según las instrucciones del fabricante.

7. Análisis de transferencia de mancha

El aislamiento del ADN genómico de las células tuvo lugar empleando un equipo de reactivos para el aislamiento de ADN, según las instrucciones del fabricante (DNA Isolation Kit for Cells and Tissue; Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, DE). Se filtraron distintas cantidades de ADN (10 \mug, 5 \mug, 2,5 \mug, 1,25 \mug, 0,63 \mug y 0,32 \mug) según el protocolo convencional (Ausubel y col., 1994) en un tampón alcalino empleando un colector a vacío de 96 pocillos (Schleicher & Schüll, Dassel, DE) sobre una membrana de nilon de Hybond N+ (Amersham Biosciences, Freiburg, DE). Las células CHO-DG44 que no se habían transfectado servían como testigo negativo. Como patrón se empleó el plásmido pBIN-LC (320 pg, 160 pg, 80 pg, 40 pg, 20 pg, 10 pg, 5 pg, 2,5 pg). Como sonda para la siguiente hibridación no radiactiva con el equipo de reactivos de Genelmages CDP-Star Detection Kit (Amersham Biosciences) se empleó un producto de PCR marcado con FITC-dUTP con el equipo de reactivos de Genelmages random prime labelling Kit (Amersham Biosciences, Freiburg, DE) que abarcaba la región codificadora del gen de NPT, según las instrucciones del fabricante. Las señales quimioluminiscentes se cuantificaron con un ImageMaster VDS-CL (Amersham Biosciences). A continuación, se determinó el número de copias del gen npt en cada célula con ayuda de la serie patrón que se había establecido a partir de las intensidades de la señal calculadas del ADN plasmídico valorado. El número de moléculas plasmídicas se calculó en este caso con la constante del número de Avogadro y el contenido en ADN de una célula CHO se estimó en aproximadamente 5 pg.

Ejemplo 1 Mutagénesis de la fosfotransferasa de neomicina

Las sustituciones de bases necesarias para la preparación de los mutantes de NPT Glu182Gly (SEQ ID NO:3), Trp91Ala (SEQ ID NO:5), Val198Gly (SEQ ID NO:7), Asp227Ala (SEQ ID NO:9), Asp227Val (SEQ ID NO:11), Asp261Gly (SEQ ID NO:13), Asp261Asn (SEQ ID NO:15), Phe240Ile (SEQ ID NO:17), Glu182Asp (SEQ ID NO:19), Asp227Gly (SEQ ID NO:21), Asp190Gly (SEQ ID NO:23) y Asp208Gly (SEQ ID NO:25) en el gen de NPT de tipo silvestre tuvieron lugar mediante PCR empleando cebadores mutágenos (Fig. 3). El vector pBIN (Fig. 1) o pBK-CMV (Stratagene, La Jolla, EE.UU.) servía en este caso como molde para la mutagénesis con PCR. A continuación se prepararon en distintas tandas de PCR los componentes 5' o 3' de los distintos mutantes. Para la preparación de los mutantes Glu182Gly, Glu182Asp, Trp91Ala, Asp190Gly, Val198Gly, Asp208Gly y Asp227Gly, se emplearon para la amplificación las combinaciones de cebadores compuestas por Neofor5 (SEQ ID NO:27) y el respectivo cebador inverso (rev) mutágeno o bien por Neorev5 (SEQ ID NO:28) y el cebador mutágeno respectivo de avance, "forward" (for):

-

En el caso del mutante de NPT Glu182Gly (SEQ ID NO:3) a partir de Neofor5 (SEQ ID NO:27) y E182Grev (SEQ ID NO:32) o bien a partir de Neorev5 (SEQ ID NO:28) y E182Gfor (SEQ ID NO:31);

-

En el caso del mutante de NPT Glu182Asp (SEQ ID NO:19) a partir de Neofor5 (SEQ ID NO:27) y E182Drev (SEQ ID NO:48) o bien a partir de Neorev5 (SEQ ID NO:28) y E182Dfor (SEQ ID NO:47);

-

En el caso del mutante de NPT Trp91Ala (SEQ ID NO:5) a partir de Neofor5 (SEQ ID NO:27) y W91Arev (SEQ ID NO:34) o bien a partir de Neorev5 (SEQ ID NO:28) y W91Afor (SEQ ID NO:33);

-

En el caso del mutante de NPT Val198Gly (SEQ ID NO:7) a partir de Neofor5 (SEQ ID NO:27) y V198Grev (SEQ ID NO:36) o bien a partir de Neorev5 (SEQ ID NO:28) y V198Gfor (SEQ ID NO:35);

-

En el caso del mutante de NPT Asp190Gly (SEQ ID NO:23) a partir de Neofor5 (SEQ ID NO:27) y D190Grev (SEQ ID NO:50) o bien a partir de Neorev5 (SEQ ID NO:28) y D190Gfor (SEQ ID NO:49);

-

En el caso del mutante de NPT Asp208Gly (SEQ ID NO:25) a partir de Neofor5 (SEQ ID NO:27) y D208Grev (SEQ ID NO:52) o bien a partir de Neorev5 (SEQ ID NO:28) y D208Gfor (SEQ ID NO:51);

-

En el caso del mutante de NPT Asp227Gly (SEQ ID NO:21) a partir de Neofor5 (SEQ ID NO:27) y D227Grev (SEQ ID NO:54) o bien a partir de Neorev5 (SEQ ID NO:28) y D227Gfor (SEQ ID NO:52);

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Para la preparación de los mutantes Asp227Ala, Asp227Val, Asp261Gly, Asp261Asn y Phe240Ile se emplearon para la amplificación, combinaciones de cebadores que estaban compuestas de Neofor2 (SEQ ID NO:29) y los respectivos cebadores inversos (rev) mutágenos o bien de IC49 (SEQ ID NO:30) y los respectivos cebadores de avance (for) mutágenos:

-

En el caso del mutante de NPT Asp227Ala (SEQ ID NO:9) a partir de Neofor2 (SEQ ID NO:29) y D227Arev (SEQ ID NO:38) o bien a partir de IC49 (SEQ ID NO:30) y D227Afor (SEQ ID NO:37);

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En el caso del mutante de NPT Asp227Val (SEQ ID NO:11) a partir de Neofor2 (SEQ ID NO:29) y D227Vrev (SEQ ID NO:40) o bien a partir de IC49 (SEQ ID NO:30) y D227Vfor (SEQ ID NO:39);

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En el caso del mutante de NPT Asp261Gly (SEQ ID NO:13) a partir de Neofor2 (SEQ ID NO:29) y D261Grev (SEQ ID NO:42) o bien a partir de IC49 (SEQ ID NO:30) y D261Gfor (SEQ ID NO:41);

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En el caso del mutante de NPT Asp261Asn (SEQ ID NO:15) a partir de Neofor2 (SEQ ID NO:29) y D261Nrev (SEQ ID NO:44) o bien a partir de IC49 (SEQ ID NO:30) y D261Nfor (SEQ ID NO:43);

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En el caso del mutante de NPT Phe240Ile (SEQ ID NO:17) a partir de Neofor2 (SEQ ID NO:29) y F240Irev (SEQ ID NO:46) o bien a partir de IC49 (SEQ ID NO:30) y F240Ifor (SEQ ID NO:45);

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A continuación, la hebra codificadora del componente 5' y la hebra complementaria del componente 3' de los mutantes respectivos, se reunieron mediante hibridación en la región solapante que se había formado por las secuencias de cebador mutágenas, se rellenaron las regiones monocatenarias y todo el producto se amplificó de nuevo en una PCR con el cebador Neofor5 (SEQ ID NO:27) y Neorev5 (SEQ ID NO:28) o con Neofor2 (SEQ ID NO:29) y IC49 (SEQ ID NO:30). Estos productos de la PCR se digirieron con StuI/RsrII (productos de la PCR con Neofor5/Neorev5 de los mutantes Glu182Gly, Trp91Ala y Val198Gly), StuI/BstBI (productos de la PCR con Neofor5/Neorev5 de los mutantes Glu182Asp, Asp190Gly, Asp208Gly y Asp227Gly) o bien DraIII/RsrII (productos de la PCR con Neofor2/IC49 de los mutantes Asp227Ala, Asp227Val, Asp261Gly, Asp261Asn y Phe240Ile). A continuación se eliminó en el vector pBIN-LC (Fig. 2B) o en pBK-CMV (Stratagene, La Jolla, EE.UU.) una parte de la secuencia de NPT de tipo silvestre mediante digestión con StuI/RsrII, digestión con DraIII/RsrII o digestión con StuI/BstBI y se sustituyó por el fragmento correspondiente de los productos de PCR. Mediante un análisis de la secuencia de la cadena complementaria y de la cadena codificadora, se verificaron y aseguraron las sustituciones de bases deseadas en los mutantes respectivos, de modo que la secuencia de ADN restante se correspondía con la secuencia de NPT de tipo silvestre. De este modo se generaron los vectores de expresión pBIN1-LC, pBIN2-LC, pBIN3-LC, pBIN4-LC, pBIN5-LC, pBIN6-LC, pBIN7-LC y pBIN8-LC que contienen los mutantes de NPT Glu182Gly, Trp91Ala, Val198Gly, Asp227Ala, Asp227Val, Asp261Gly, Asp261Asn o Phe240Ile (Fig. 2B).

Los mutantes de NPT restantes se aislaron a partir de pBK-CMV modificado como un fragmento de 1640 pb Bsu361, los extremos de los fragmentos se rellenaron con la polimerasa de ADN Klenow y se ligaron con el fragmento Bsu361/StuI de 3750 pb del vector pBID, que a su vez había sido tratado con la polimerasa de ADN Klenow. De este modo se generaron los vectores de expresión pKS-N5, pKS-N6, pKS-N7 y pKS-N8 que contienen los mutantes de NPT Glu182Asp, Asp190Gly, Asp208Gly o Asp227Gly. En estos vectores de expresión, se clonaron respectivamente el ADNc humano de MCP-1 como un fragmento HindIII/EcoRI de 0,3 kb (Fig. 2A) o la cadena ligera del anticuerpo IgG2 humanizado como un fragmento HindIII/BamHI de 0,7 kb (Fig. 2B).

En las mutaciones introducidas en la fosfotransferasa de neomicina, se trata por un lado de sustituciones de más (Val198Gly, Phe240Ile) o menos (Trp91Ala, Glu182Gly, Glu182Asp, Asp227Ala, Asp227Val, Asp227Gly) aminoácidos conservados que están flanqueando los motivos conservados, como p. ej., los motivos 1, 2 y 3 (Shaw y col., 1993) (Fig. 4). Por otro lado, las mutaciones se encuentran dentro del motivo 1 conservado (Asp190Gly), 2 (Asp208Gly) o 3 (Asp261Gly, Asp261Asn) y se corresponden con un aminoácido conservado.

Ejemplo 2 Influencia de las mutaciones de NPT sobre la selección de células que expresan MCP-1, transfectadas de forma estable

MCP-1 se eligió como ejemplo para la expresión de una proteína monocatenaria en células CHO. Para ello se transfectaron células CHO-DG44 con pKS-N5-MCP1, pKS-N6-MCP1, pKS-N7-MCP1, pKS-N8-MCP1 o pBIN-MCP1 (Fig. 2A). Para ello se llevaron a cabo tandas dobles. Dos días después de la transfección, las células se sembraron en una placa de 96 pocillos (2000 células/pocillo) y se seleccionaron con 400 \mug/ml de G418 en medio CHO-S-SFMII enriquecido con HT. En el caso de las células transfectadas con pBIN-MCP1 se realizó paralelamente también una selección con 800 \mug/ml de G418. Las poblaciones celulares obtenidas se trasladaron sucesivamente desde placas de 24 pocillos a placas con 6 pocillos. Ya durante la fase de selección se podían observar diferencias en las distintas tandas de transfección. En contraposición con las poblaciones celulares en las que se había seleccionado con un gen de NPT de tipo silvestre (SEQ ID NO:1), en las poblaciones celulares que se habían transfectado con un Mutante de NPT, sobrevivían menos células la selección inicial con G418. Estas poblaciones celulares se podían transferir por ello también, sólo aproximadamente 4 días después a las placas de 24 pocillos. Y en las tandas transfectadas con pKS-N6-MCP1 y pKS-N7-MCP1, no se podía seleccionar ninguna célula transfectada de forma estable con una concentración de 400 \mug/ml de G418. Probablemente, en los mutantes de NPT con las mutaciones Asp190Gly o Asp208Gly, la función enzimática está reducida de tal modo que ya no se pueden inactivar suficientes moléculas de G418 para que sea posible un crecimiento de las células transfectadas de forma estable. En caso de una reducción de la concentración de G418 a 200 \mug/ml, aunque algunas pocas células sobrevivían la primera fase de selección, sin embargo todas se mostraban muy perjudicadas en el crecimiento y la vitalidad y no era posible una expansión, quitando algunas excepciones en los mutantes Asp208Gly.

Con las células transfectadas con los mutantes Glu182Asp y Asp227Gly o con NPT de tipo silvestre, se cultivaron respectivamente 18 grupos (9 grupos de la tanda 1 y 9 grupos de la tanda 2) a través de cuatro pases por placas de 6 pocillos y se determinó la concentración de MCP-1 producido en el material sobrenadante del cultivo celular, mediante ELISA. Los grupos de células, en los que se habían utilizado los mutantes de NPT como marcadores de selección, mostraban por término medio 50%-57% (mutante Glu182Asp) o 57%-65% (mutante Asp227Gly) de productividades más elevadas que en los grupos de células en los que la selección se había realizado con el NPT de tipo silvestre con 400 o hasta 800 \mug/ml de G418 (Fig. 5). De este modo, se podía aumentar realmente la proporción de productores elevados en las poblaciones de células transfectadas, mediante el uso de mutantes de NPT como marcadores de selección.

Ejemplo 3 Influencia de las mutaciones de NPT sobre la selección de células que expresan mAk transfectadas de forma estable

En una co-transfección se transfectaron células CHO-DG44 primero con la combinación de plásmidos pBIDG-HC/pBIN-LC (NPT de tipo silvestre), pBIDG-HC/pKS-N5-LC (mutante de NPT Glu182Asp) o pBIDG-HC/pKS-N8-LC (mutante de NPT Asp227Gly) (Fig. 2B). En las configuraciones de vectores utilizadas, ambas cadenas proteicas de un anticuerpo IgG2 humanizado, son expresadas respectivamente por un vector propio que, además, codifica un marcador de selección de DHFR o de neomicina en una unidad de transcripción separada. La expresión de los productos génicos está mediada en este caso por una combinación de potenciador de CMV/promotor ubiquitina/S27a. Se pueden conseguir también datos comparables, por ejemplo, con un potenciador/promotor de CMV, un potenciador de SV40/promotor ubiquitina/S27a u otras combinaciones de promotores.

En total, se realizaron cuatro series de transfecciones con 6 grupos respectivamente por combinación de plásmido. Al contrario que en las poblaciones celulares en las que se había seleccionado un gen de NPT de tipo silvestre, en las poblaciones celulares que se habían transformado con una NPT mutada, sobrevivían menos células la selección inicial con G418. Después de seleccionar durante una, dos o tres semanas los grupos celulares transfectados, en medio CHO-S-SFMII exento de HT, con adición de 400 \mug/ml de G418, se realizó una determinación del título de anticuerpos en el material sobrenadante del cultivo celular, mediante ELISA con varios pases (6-8). En comparación con el uso de un gen de NPT de tipo silvestre como marcador de selección, las células que se habían seleccionado con el mutante Glu182Asp mostraban por término medio un aumento de la productividad y del título en 86% o 77% y las células seleccionadas con el mutante Asp227Gly hasta un aumento de 126% o 107% de la productividad y del título. Con el uso de un mutante de NPT con actividad enzimática reducida se podían enriquecer de forma selectiva células hasta tener una productividad el doble de alta que la productividad base.

En otra serie de transfecciones se sometió a ensayo la influencia de distintas concentraciones de G418 sobre la selección. Para la selección de los grupos célulares, 3 grupos respectivamente, se emplearon 400, 500 o 600 \mug/ml de G418. En el caso de concentraciones más altas, en las poblaciones celulares que se habían seleccionado con NPT de tipo silvestre, sobrevivían la selección inicial claramente menos células, aunque el mayor efecto era sobre el mutante Asp227Gly. Las poblaciones celulares obtenidas, transfectadas de forma estable no mostraban, sin embargo, ninguna reducción en tanto al crecimiento o la vitalidad. Entre las productividades y los títulos obtenidos, no se podía establecer, sin embargo, ninguna diferencia significativa dentro de una combinación de plásmidos utilizada para la transfección. Pero también aquí mostraron las células seleccionadas con mutantes de NPT otra vez, por término medio, las mayores productividades, encabezadas por el mutante Asp227Gly con una productividad cuatro veces superior en comparación con NPT de tipo silvestre, seguida del mutante Glu182Asp con una productividad 2,4 veces más elevada (Fig. 6A).

A continuación, se transfectaron en una co-transfección células CHO-DG44 con las combinaciones de plásmidos pBIDG-HC/pBIN-LC (NPT de tipo silvestre), pBIDG-HC/pBIN1-LC (mutante de NPT Glu182Gly), pBIDG-HC/pBIN2-LC (mutante de NPT Trp91Ala), pBIDG-HC/pBIN3-LC (mutante de NPT Val198Gly), pBIDG-HC/pBIN-4-LC (Asp227Ala), pBIDG-HC/pBIN5-LC (mutante de NPT Asp227Val), pBIDG-HC/pBIN6-LC (mutante de NPT Asp261Gly), pBIDG-HC/pBIN7-LC (mutante de NPT Asp261Asn) o pBIDG-HC/pBIN8-LC (mutante de NPT
Phe240Ile) (Fig. 2B). También con estas configuraciones de vectores utilizadas, ambas cadenas proteicas de un anticuerpo monoclonal IgG2 humanizado, se expresan respectivamente por un vector único que codifica adicionalmente un marcador de selección de DHFR o de neomicina en una unidad de transcripción separada.

Por cada combinación de plásmidos se transfectaron 5 grupos respectivamente. Al contrario que en las poblaciones celulares en las que se había seleccionado con un gen de NPT de tipo silvestre, en las poblaciones celulares que se habían transfectado con una NPT mutada, sobrevivían menos células la selección inicial con G418. Después de seleccionar durante dos a tres semanas de los grupos celulares transfectados en medio CHO-S-SFMII exento de HT, con adición de 400 \mug/ml de G418, se realizó una determinación del título de anticuerpos mediante ELISA a través de 6 pases, en el material sobrenadante del cultivo celular. En la Figura 6B, se resumen los valores medios de los títulos y las productividades calculadas de cada grupo en el ensayo. En comparación con el uso de un gen de NPT de tipo silvestre como marcador de selección, todos los grupos de células que se habían seleccionado con un mutante de NPT, mostraban por término medio un aumento de la productividad y del título de 1,4-14,6 o 1,4-10,8 veces (Fig. 6B). El mejor enriquecimiento selectivo de células con productividad base más elevada, se podía conseguir en este caso con los mutantes de NPT Asp227Val o Asp261Gly, aumentado la productividad media 14,6 o 9,3 veces.

En el vector pBIDG-HC está contenido otro marcador de selección, la GFP. La GFP está ligada a la transcripción a través de un elemento IRES con la cadena pesada. La correlación condicionada de este modo entre la expresión de la proteína diana y el marcador de selección GFP, facilitan así también una rápida valoración del grado y de la distribución del nivel de expresión en las poblaciones celulares transfectadas, en base a la fluorescencia de GFP determinada por análisis FACS. Después de seleccionar durante dos o tres semanas los grupos de células transfectadas en medio CHO-S-SMFII exento de HT, con adición de G418, se midió la fluorescencia de GFP en un análisis FACS (Fig. 7). Las señales fluorescentes de GFP obtenidas se correlacionaban de hecho con los datos del título calculados para el anticuerpo monoclonal IgG2. Con los grupos seleccionados con los mutantes de NPT Asp227Val, Asp261Gly, Asp161Asn y Phe240Ile, se mostró también que la mayor parte de las células tenía fluorescencia de GFP elevada, seguido de las células seleccionadas con los mutantes de NPT Trp91Ala, Asp227Gly, Gly182Asp, Asp227Ala, Glu182Gly y Val198Gly.

Al añadir el agente de selección metotrexato (MTX) al medio de cultivo, se podía elevar aún más la productividad de las células mediante la inducción de una amplificación génica mediada con dhfr. De este modo se podía conseguir, por ejemplo, después de una etapa sencilla de amplificación génica con MTX 100 nM, que la productividad específica en los grupos celulares que habían sido el resultado de una co-transfección con las combinaciones de plásmidos pBIDG-HC/pBIN5-LC (mutante de NPT Asp227Val), pBIDG-HC/pBIN6-LC (mutante de NPT Asp261Gly), pBIDG-HC/pBIN7-LC (mutante de NPT Asp261Asn) y pBIDG-HC/pBIN8-LC (mutante de NPT Phe240Ile), aumentara de 2 a 4 veces y, según cada grupo, se obtuvieran productividades entre 4 y 14 pg/célula/día. En la Figura 8 se muestra a modo de ejemplo en un grupo celular que se había obtenido por la co-transfección de pBIDG-HC/pBIN5-LC (mutante de NPT Asp227Val), los aumentos de la productividad hasta 27 pg/célula/día conseguidos mediante adición de MTX (MTX 100 nM seguido de MTX 500 nM).

Ejemplo 4 Determinación y comparación de la actividad enzimática de NPT

Para comparar la actividad enzimática de los mutantes de NPT con las de NPT de tipo silvestre, se realizó un ensayo de mancha para determinar la actividad de NPT en extractos celulares, en base al protocolo de Platt y col. 1997, y mostrado a modo de ejemplo en la Fig. 9A, para los mutantes de NPT Glu182Asp y Asp227Gly. Para ello se prepararon extractos celulares de dos grupos celulares distintos que expresaban mAk, que se habían transfectado y seleccionado con NPT de tipo silvestre (SEQ ID NO:1) o con los mutantes de NPT Glu182Gly (SEQ ID NO:3), Trp91Ala (SEQ ID NO:5), Val198Gly (SEQ ID NO:7), Asp227Ala (SEQ ID NO:9), Asp227Val (SEQ ID NO:11), Asp261Gly (SEQ ID NO:13), Asp261Asn (SEQ ID NO:15), Glu182Asp (SEQ ID NO:19), Asp227Gly (SEQ ID NO:21), Asp190Gly (SEQ ID NO:23) y Asp208Gly (SEQ ID NO:25) o Phe240Ile (SEQ ID NO:17). Como testigo negativo servían extractos celulares de células CHO-DG44 no transfectadas. Las actividades enzimáticas de los mutantes de NPT estaban significativamente reducidas en comparación con NPT de tipo silvestre. Estos mutantes de NPT mostraban por término medio sólo entre 1,5% y 62% de la actividad enzimática del tipo silvestre, mostrando, sin embargo, los mutantes de NPT Asp261Gly y Asp261Asn con 3,1% y 1,5% respectivamente, la menor actividad restante y los mutantes de NPT Val198Gly y Trp91Ala con 61,9% y 53,2% respectivamente, la mayor actividad restante (Fig. 9B). Las señales obtenidas sobre la fosfocelulosa eran específicas de la fosforilación de G418, provocada por la actividad enzimática de NPT. Sin adición de G418 como sustrato de NPT al tampón del ensayo, no se podía observar ninguna actividad sobre la fosfocelulosa. Las señales obtenidas sobre la membrana de nitrocelulosa que eran el resultado de las proteínas fosforiladas con proteinquinasas, dentro del extracto celular, se tomaron como control interno para cantidades iguales de sonda aportada. La actividad enzimática reducida de los mutantes de NPT, en comparación con la NPT de tipo silvestre, no estaba, por tanto, debida a una expresión génica más reducida. Por el contrario, los análisis de transferencia tipo Northern del ARN total daban como resultado que los grupos de células que se habían transfectado con NPT de tipo silvestre y que mostraban una actividad enzimática elevada de NPT, expresaban menos ARN que con los grupos de células transfectados con mutantes de NPT (Fig. 10). La única excepción eran las células que se habían transfectado con el mutante de NPT Glu182Gly y que expresaban cantidades comparables de ARNm de NPT. En los análisis de transferencia de mancha que se habían realizado sobre ADN genómico procedente de estas poblaciones celulares transfectadas, se pudo mostrar que la expresión elevada de los mutantes de NPT se obtuvo mediante el efecto de la dosis génica y/o mediante integración del ADN exógeno en las regiones genómicas activas en la transcripción (Fig. 10). Por ejemplo, en las células seleccionadas con el mutante de NPT Trp91Ala, en el grupo 1 domina el efecto de la dosis génica, en el grupo 2 por el contrario, el efecto de la integración. De este modo se pueden emplear células transfectadas en las que se emplearon para la selección marcadores con actividad enzimática reducida, que sintetizan una cantidad suficiente de proteína marcadora, para que bajo la misma presión de selección, se iguale la resistencia disminuida frente al agente selectivo.

Ejemplo 5 Aislamiento de células con expresión elevada de un mAk mediante clasificación FACS basada en GFP

En una co-transfección se transfectaron células CHO-DG44 con la combinación plasmídica pBID-HC y pBING-LC que codifican un anticuerpo monoclonal IgG2 humanizado (Fig. 2B). En las configuraciones de vectores utilizadas, ambas cadenas proteicas del anticuerpo, se expresan respectivamente por un único vector, el cual codifica, además, un marcador de selección de DHFR o de fosfotransferasa de neomicina modificada (mutante Asp227Gly; SEQ ID NO:21), en una unidad de transcripción separada. Adicionalmente, en el vector pBING-LC está contenido otro marcador de selección, la GFP. Debido a la asociación transcrpicional de la expresión de la GFP y de la cadena ligera, mediante un elemento IRES, durante la co-transfección de CHO-DG44 con los vectores pBID-HC/pBING-LC se podía aislar en tiempo reducido células con una expresión elevada del anticuerpo monoclonal, de modo que se seleccionaron las células clasificadas por FACS secuencial con un alto contenido en GFP. En total se transfectaron 8 grupos celulares separados, a partir de los cuales se pudieron obtener poblaciones celulares transfectadas de forma estable, después de seleccionar durante dos o tres semanas en medio CHO-S-SFMII exento de HT, con adición de 400 \mug/ml de G418. Mediante ELISA se determinaron los títulos y las productividades de los 8 grupos a través de varios pases (7-8). Por término medio, los títulos eran de aproximadamente 1,4 mg/ml y las productividades aproximadamente 1,3 pg/célula/día. Para la siguiente clasificación secuencial basada en FACS, se eligieron los grupos 5 y 8, mostrando el grupo 5 la productividad más elevada y el grupo 8 una productividad correspondiente a la media de todos los grupos. En cada etapa se separaron por clasificación con FACS, el 5% respectivamente de las células con la mayor fluorescencia de GFP y se continuaron cultivando en grupo. Esta clasificación se realizó en total hasta seis veces, dejando entre cada clasificación un periodo de cultivo de aproximadamente dos semanas. De forma sorprendente, se pudo mostrar una buena correlación entre la productividad de mAk y la fluorescencia GFP (Fig. 13), aunque ambas cadenas proteicas se expresaban respectivamente a partir de un único vector y en la clasificación con FACS basada en GFP, sólo se podía seleccionar la expresión de la cadena ligera, debido a su asociación transcripcional con GFP. Las productividades se pudieron aumentar, sólo con la clasificación basada en FACS, hasta 9,5 pg/célula/día (Fig. 11). Datos comparables se podían conseguir también en el caso de una asociación funcional del promotor de hámster con el potenciador de SV40, en lugar del potenciador de CMV. Mediante una única etapa posterior de amplificación con MTX, partiendo de los grupos 5 y 8 de la primera etapa de clasificación, añadiendo MTX 100 nM al medio de selección, se pudo aumentar todavía la productividad de los grupos por término medio hasta más de 20 pg/célula/día (Fig. 12). Los altos niveles de expresión de la proteína fluorescente no tenían de este modo ningún efecto negativo sobre el crecimiento celular y la vitalidad celular. Durante la amplificación génica, las propiedades del crecimiento de las células están influidas negativamente de forma decisiva también por la adición de MTX, sobre todo por la adición de concentraciones más elevadas. La clasificación previa de los grupos celulares mostraba, sin embargo, un comportamiento claramente más robusto frente a la dosis inicial de MTX 100 nM muy elevada. Resistían la fase de selección mucho mejor, es decir, al cabo de 2 semanas se volvieron a obtener poblaciones celulares con vitalidad elevada y una buena tasa de crecimiento.

Por ello, el tiempo de desarrollo para la selección de células con productividad elevada, en comparación con una estrategia convencional de amplificación génica por etapas, que en general comprende cuatro etapas de amplificación con adición creciente de MTX, se pudo reducir a 6 semanas. Esto se pudo conseguir mediante el uso combinado de un enriquecimiento de las células transfectadas con expresión más elevada de los genes de interés, conseguido mediante el uso de un marcador de selección de NPT modificada con actividad enzimática reducida, seguido de una clasificación con FACS basada en GFP, con una etapa a continuación de amplificación génica.

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<110> BOEHRINGER INGELHEIM PHARMA GMBH & CO KG

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<120> NUEVOS GENES DE LA FOSFOTRANSFERASA DE NEOMICINA Y PROCEDIMIENTO PARA LA SELECCIÓN DE CÉLULAS RECOMBINANTES DE PRODUCCIÓN ELEVADA

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<130> Case 1-1411

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<141>

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<160> 55

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<170> PatentIn Ver. 3.1

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<210> 1

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<211> 795

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<212> ADN

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<213> Escherichia coli

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<212> PRT

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de la Secuencia artificial: Mutante de neomicina E182G

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de la Secuencia artificial: Mutante de neomicina E182G

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de la Secuencia artificial: Mutante de neomicina W91A

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<223> Descripción de la Secuencia artificial: Mutante de neomicina W91A

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<223> Descripción de la Secuencia artificial: Mutante de neomicina V198G

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<223> Descripción de la Secuencia artificial: Mutante de neomicina D227A

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<223> Descripción de la Secuencia artificial: Mutante de neomicina D227A

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<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

13

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 795

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Mutante de neomicina D227V

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

15

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 264

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Mutante de neomicina D227V

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

17

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 795

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Mutante de neomicina D261G

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

19

20

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 264

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Mutante de neomicina D261G

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

21

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 795

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Mutante de neomicina D261N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

23

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 264

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Mutante de neomicina D261N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

25

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 795

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Mutante de neomicina F240I

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

27

28

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<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 264

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Mutante de neomicina F240I

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

29

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 795

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Mutante de neomicina E182D

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 264

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Mutante de neomicina E182D

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

32

33

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 795

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Mutante de neomicina D227G

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 264

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Mutante de neomicina D227G

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

35

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 795

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Mutante de neomicina D190G

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

36

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 264

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Mutante de neomicina D190G

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

37

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 795

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Mutante de neomicina D208G

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 264

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Mutante de neomicina D208G

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

40

41

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<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Oligonucleótido Neofor5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttccagaagt agtgaggagg c

\hfill

21

\newpage

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<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Oligonucleótido Neorev5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atggcaggtt gggcgtcgc

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Oligonucleótido Neofor2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaactgttcg ccaggctcaa g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Oligonucleótido IC49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cggcaaaatc ccttataaat ca

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Oligonucleótido E182Gfor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gacggcgggg atctcgtcgt

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Oligonucleótido E182Grev

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acgacgagat ccccgccgtc

\hfill

20

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Oligonucleótido W91Afor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggaagggac gcgctgctat tgg

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Oligonucleótido W91Arev

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccaatagcag cgcgtccctt ccc

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Oligonucleótido V198Gfor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgaatatca tgggggaaaa tggc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Oligonucleótido V198Grev

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gccattttcc cccatgatat tcgg

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Oligonucleótido D227Afor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctacccgtgc tattgctgaa g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Oligonucleótido D227Arev

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttcagcaat agcacgggta g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Oligonucleótido D227Vfor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctacccgtgt tattgctgaa g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Oligonucleótido D227Vrev

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttcagcaat aacacgggta g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la Secuencia artificial: Oligonucleótido D261Gfor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gccttcttgg cgagttcttc tgag

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la Secuencia artificial: Oligonucleótido D261Grev

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctcagaagaa ctcgccaaga aggc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la Secuencia artificial: Oligonucleótido D261Nfor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gccttcttaa cgagttcttc tgag

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la Secuencia artificial: Oligonucleótido D261Nrev

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctcagaagaa ctcgttaaga aggc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la Secuencia artificial: Oligonucleótido F240Ifor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggctgaccgc atcctcgtgc tt

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

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<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la Secuencia artificial: Oligonucleótido F240Irev

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

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\hskip-.1em\dddseqskip

aagcacgagg atgcggtcag cc

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la Secuencia artificial: Oligonucleotid E182Dfor

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

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\hskip-.1em\dddseqskip

gacggcgatg atctcgtcgt

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Oligonucleotid E182Drev

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

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\hskip-.1em\dddseqskip

acgacgagat catcgccgtc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

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<211> 19

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Oligonucleotid D190Gfor

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catggcggtg cctgcttgc

\hfill

19

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la Secuencia artificial: Oligonucleotid D190Grev

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<400> 50

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\hskip-.1em\dddseqskip

gcaagcaggc accgccatg

\hfill

19

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

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<211> 19

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Oligonucleotid D208Gfor

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gattcatcgg ctgtggccg

\hfill

19

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<210> 52

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<211> 19

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la Secuencia artificial: Oligonucleotid D208Grev

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

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\hskip-.1em\dddseqskip

cggccacagc cgatgaatc

\hfill

19

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Oligonucleotid D227Gfor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

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\hskip-.1em\dddseqskip

ctacccgtgg tattgctgaa g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la Secuencia artificial: Oligonucleotid D227Grev

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<400> 54

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\hskip-.1em\dddseqskip

cttcagcaat accacgggta g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

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<211> 2406

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<212> ADN

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<213> Cricetulus griseus

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<300>

\vskip0.400000\baselineskip

<310> PCT/EP/96/04631

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<311> 1996-10-24

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<312> 1997-05-01

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

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42

43

Claims (41)

1. Gen modificado de la fosfotransferasa de neomicina, caracterizado porque el gen modificado de la fosfotransferasa de neomicina en la posición del aminoácido 91, 198 y/o 240, referida al gen de tipo silvestre, codifica un aminoácido distinto al que codifica el gen de la fosfotransferasa de neomicina de tipo silvestre.

2. Gen modificado de la fosfotransferasa de neomicina según la reivindicación 1, caracterizado porque la fosfotransferasa de neomicina modificada que está codificada por el gen de la fosfotransferasa de neomicina, muestra una actividad enzimática menor que la de la fosfotransferasa de neomicina de tipo silvestre.

3. Gen modificado de la fosfotransferasa de neomicina según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el gen modificado de la fosfotransferasa de neomicina, en comparación con el gen de tipo silvestre, en la posición del aminoácido 91, referida al gen de tipo silvestre, codifica alanina, en la posición del aminoácido 198 glicina y/o en la posición del aminoácido 240 isoleucina.

4. Gen modificado de la fosfotransferasa de neomicina según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el gen modificado de la fosfotransferasa de neomicina codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO:18.

5. Gen modificado de la fosfotransferasa de neomicina según una de las reivindicaciones 1 a 4, que contiene o se compone de una secuencia según SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:17.

6. Gen modificado de la fosfotransferasa de neomicina, caracterizado porque el gen modificado de la fosfotransferasa de neomicina, en comparación con el gen de tipo silvestre, en la posición del aminoácido 182, referida al gen de tipo silvestre, codifica glicina, en la posición del aminoácido 227 alanina o valina y/o en la posición del aminoácido 261 glicina.

7. Gen modificado de la fosfotransferasa de neomicina según la reivindicación 6, caracterizado porque el gen modificado de la fosfotransferasa de neomicina codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12 o SEQ ID NO:14.

8. Gen modificado de la fosfotransferasa de neomicina según una de las reivindicaciones 6 o 7, que contiene o comprende una secuencia según SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:13.

9. Fosfotransferasa de neomicina modificada, codificada por un gen modificado de la fosfotransferasa de neomicina según una de las reivindicaciones 1 a 8.

10. Vector de expresión eucariótico que contiene un gen modificado de la fosfotransferasa de neomicina según una de las reivindicaciones 1 a 8.

11. Vector de expresión eucariótico que contiene un gen heterólogo de interés ligado funcionalmente con un promotor heterólogo y un gen modificado de la fosfotransferasa de neomicina según una de las reivindicaciones 1 a 8, que codifica una fosfotransferasa de neomicina que, en comparación con la fosfotransferasa de neomicina de tipo silvestre, muestra una actividad enzimática menor.

12. Vector de expresión según la reivindicación 11, caracterizado porque el gen modificado de la fosfotransferasa de neomicina codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14 o SEQ ID NO:18.

13. Vector de expresión según una de las reivindicaciones 11 o 12, caracterizado porque contiene uno o varios potenciadores ligados funcionalmente con el promotor o los promotores.

14. Vector de expresión según la reivindicación 13, caracterizado porque el potenciador es un potenciador de CMV o de SV40.

15. Vector de expresión según una de las reivindicaciones 11 a 14, caracterizado porque contiene un promotor ubiquitina/S27a de hámster.

16. Vector de expresión según la reivindicación 15, caracterizado porque el gen heterólogo de interés se encuentra bajo el control del promotor ubiquitina/S27a.

17. Vector de expresión según una de las reivindicaciones 11 a 16, caracterizado porque contiene adicionalmente un gen para una proteína fluorescente que opcionalmente está ligada o se liga funcionalmente con el gen de interés y el promotor heterólogo.

\newpage

18. Vector de expresión según la reivindicación 17, caracterizado porque contiene adicionalmente un sitio de unión al ribosoma (IRES) interno que posibilita una expresión bicistrónica del gen que codifica una proteína fluorescente y del gen que codifica una proteína/producto de interés, bajo el control de un promotor heterólogo.

19. Vector de expresión según una de las reivindicaciones 17 o 18, caracterizado porque el gen que codifica una proteína fluorescente y el gen modificado de la fosfotransferasa de neomicina se encuentran en una o en dos unidades de transcripción separadas.

20. Célula de mamífero que contiene un gen modificado de la fosfotransferasa de neomicina según una de las reivindicaciones 1 a 8.

21. Célula de mamífero que ha sido transfectada con un vector de expresión según una de las reivindicaciones 10 a 16.

22. Célula de mamífero que ha sido transfectada con un vector de expresión según una de las reivindicaciones 17 a 19.

23. Célula de mamífero según una de las reivindicaciones 20 a 22, caracterizada porque ha sido transfectada adicionalmente con un gen para un marcador de selección amplificable.

24. Célula de mamífero según la reivindicación 23, caracterizada porque en el caso del gen del marcador de selección amplificable se trata de la dihidrofolato reductasa (DHFR).

25. Célula de mamífero según una de las reivindicaciones 22 a 26, caracterizada porque, en el caso de la célula de mamífero, se trata de una célula de roedor.

26. Célula de mamífero según la reivindicación 25, caracterizada porque, en el caso de la célula de roedor, se trata de una célula CHO o BHK.

27. Procedimiento para enriquecer células de mamífero, caracterizado porque

(i) un grupo de células de mamífero se transfecta con un gen de una fosfotransferasa de neomicina modificada según una de las reivindicaciones 1 a 8;

(ii) las células de mamífero se cultivan bajo condiciones que permiten una expresión del gen modificado de la fosfotransferasa de neomicina; y

(iii) las células de mamífero se cultivan en presencia de al menos un medio de selección que tiene un efecto selectivo sobre el crecimiento de las células de mamífero y que favorece el crecimiento de las células que expresan el gen modificado de la fosfotransferasa de neomicina.

28. Procedimiento para la obtención y la selección de células de mamífero que expresan por lo menos un gen heterólogo de interés, caracterizado porque

(i) un grupo de células de mamífero se transfecta por lo menos con un gen de interés y un gen de una fosfotransferasa de neomicina modificada, según una de las reivindicaciones 1 a 8;

(ii) las células de mamífero se cultivan bajo condiciones que permiten una expresión del(de los) gen(es) de interés y del gen modificado de la fosfotransferasa de neomicina; y

(iii) las células de mamífero se cultivan en presencia de al menos un medio de selección que tiene un efecto selectivo sobre el crecimiento de las células de mamífero y que favorece el crecimiento de las células que expresan el gen modificado de la fosfotransferasa de neomicina.

29. Procedimiento según la reivindicación 28, caracterizado porque las células de mamífero se transfectan adicionalmente con un gen de un marcador de selección amplificable y las células de mamífero seleccionadas se someten preferentemente por lo menos a una etapa de amplificación génica, tratándose en el caso del gen del marcador de selección amplificable, preferentemente de DHFR y teniendo lugar preferentemente la amplificación génica mediante la adición de metotrexato.

30. Procedimiento para la obtención y selección de células de mamífero que expresan por lo menos un gen heterólogo de interés, caracterizado porque

(i) las células de mamífero recombinantes se transforman con un vector de expresión según una de las reivindicaciones 17 a 19;

(ii) se cultivan bajo condiciones que facilitan una expresión del(de los) gen(es) de interés, del gen que codifica una proteína fluorescente y del gen modificado de la fosfotransferasa de neomicina;

(iii) las células de mamífero se cultivan en presencia de al menos un medio de selección que tiene un efecto selectivo sobre el crecimiento de las células de mamífero y que favorece el crecimiento de las células que expresan el gen modificado de la fosfotransferasa de neomicina; y

(iv) las células de mamífero se clasifican mediante un análisis de la citometría de flujo.

31. Procedimiento según la reivindicación 30, caracterizado porque las células de mamífero se transfectan adicionalmente con un gen de un marcador de selección amplificable y las células clasificadas mediante análisis de la citometría de flujo, se someten por lo menos a una etapa de amplificación génica, tratándose en el caso del gen del marcador de selección amplificable, preferentemente de DHFR y teniendo lugar preferentemente la amplificación génica mediante la adición de metotrexato.

32. Procedimiento para la preparación de por lo menos una proteína de interés en células de mamífero recombinantes, caracterizado porque

(i) un grupo de células de mamífero se transfecta por lo menos con un gen de interés y un gen de una fosfotransferasa de neomicina modificada, según una de las reivindicaciones 1 a 8;

(ii) las células se cultivan bajo condiciones que permiten una expresión del(de los) gen(es) de interés y del gen modificado de la fosfotransferasa de neomicina;

(iii) las células de mamífero se cultivan en presencia de al menos un medio de selección que tiene un efecto selectivo sobre el crecimiento de las células de mamífero y que favorece el crecimiento de las células que expresan el gen modificado de la fosfotransferasa de neomicina; y

(iv) la(s) proteína(s) de interés se obtiene(n) a partir de las células de mamífero o a partir del material sobrenadante del cultivo.

33. Procedimiento para la preparación de por lo menos una proteína de interés en células de mamífero recombinantes, caracterizado porque

(i) las células de mamífero recombinantes se transfectan con un vector de expresión según una de las reivindicaciones 17 a 19;

(ii) se cultivan bajo condiciones que permiten una expresión del(de los) gen(es) de interés, del gen que codifica una proteína fluorescente y del gen modificado de la fosfotransferasa de neomicina;

(iii) las células de mamífero se cultivan en presencia de al menos un medio de selección que tiene un efecto selectivo sobre el crecimiento de las células de mamífero y que favorece el crecimiento de las células que expresan el gen modificado de la fosfotransferasa de neomicina;

(iv) las células de mamífero se clasifican mediante un análisis de la citometría de flujo; y

(v) la(s) proteína(s) de interés se obtiene(n) a partir de las células de mamífero o a partir del material sobrenadante del cultivo.

34. Procedimiento para la preparación de por lo menos una proteína de interés, caracterizado porque

(i) las células de mamífero según una de las reivindicaciones 23 o 24 se cultivan bajo condiciones que permiten una expresión del gen de interés, del gen modificado de la fosfotransferasa de neomicina y del gen del marcador de selección amplificable;

(ii) las células de mamífero se cultivan y se seleccionan en presencia de al menos un medio de selección que tiene un efecto selectivo sobre el crecimiento de las células de mamífero y que favorece el crecimiento de las células que expresan el gen modificado de la fosfotransferasa de neomicina; y

(iii) las células de mamífero seleccionadas se someten por lo menos a una etapa de amplificación génica; y

(iv) la(s) proteína(s) de interés se obtiene(n) a continuación a partir de las células de mamífero o a partir del material sobrenadante del cultivo.

35. Procedimiento según una de las reivindicaciones 32 a 34, caracterizado porque las células de mamífero se transfectan por lo menos con dos genes de interés que codifican una proteína/producto heterómero, y

(i) se cultivan bajo condiciones que facilitan una expresión de la subunidades de la proteína/producto heterómero; y

(ii) la proteína/producto heterómero se aísla del cultivo o del medio de cultivo.

36. Procedimiento según una de las reivindicaciones 32 a 35, caracterizado porque las células de mamífero clasificadas muestran una productividad específica media, superior a 5 pg del(de los) producto(s) génico(s) deseado(s) por día y por célula.

37. Procedimiento según la reivindicación 34 o 35, caracterizado porque las células hospedadoras clasificadas muestran una productividad específica media, superior a 20 pg del(de los) producto(s) génico(s) deseado(s) por día y por célula.

38. Procedimiento según una de las reivindicaciones 27 a 37, caracterizado porque en el caso de la célula de mamífero se trata de una célula de roedor.

39. Procedimiento según la reivindicación 38, caracterizado porque, en el caso de la célula de roedor, se trata de una célula CHO o BHK.

40. Procedimiento según una de las reivindicaciones 27 a 39, caracterizado porque las células de mamífero se cultivan en cultivo en suspensión.

41. Procedimiento según una de las reivindicaciones 27 a 40, caracterizado porque las células de mamífero se cultivan exentas de suero.